DE4107334A1

DE4107334A1 - Serum-diagnoseverfahren und dafuer geeigneter diagnosesatz

Info

Publication number: DE4107334A1
Application number: DE4107334A
Authority: DE
Inventors: Shuichi Hashizume; Masatoshi Kato; Masanori Kamei
Original assignee: Morinaga and Co Ltd
Current assignee: Morinaga and Co Ltd
Priority date: 1990-03-08
Filing date: 1991-03-07
Publication date: 1991-09-12
Also published as: KR910017189A; FR2659449A1; GB2241782A; GB2241782B; GB9104915D0

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Serum-Diagnoseverfahren zum Nachweis und zur Bestimmung von Krebserkrankungen sowie ein dafür geeigneter Serum- Diagnosesatz.

Die bislang für die Serumdiagnose von Krebserkrankungen verwendeten Tumor- Marker schließen carcinoembryonische Proteine, wie α-Fetoprotein (AFP), und carcinoembryonisches Antigen (CEA), Blutgruppensubstanzen, Tumor- spezifische Antigene, Hormone und Isobenzyme ein. Für die Serumdiagnose von Lungenkrebs wurden CEA, das Schuppenzellenkarzinom-spezifische Antigen (SCC) und neuronenspezifische Enolase (NSE) fast ausschließlich eingesetzt. Einer der Vorteile der Serumdiagnose ist, daß zur gleichen Zeit eine Vielzahl von Proben in einfacher Weise bestimmt werden kann. Ein weiteres wichtiges Merkmal der Serumdiagnose ist darin zu sehen, daß sie nicht nur zur Vorsorgeuntersuchung von Krebserkrankungen (screening), sondern auch zur Überwachung von therapeutischen und postoperativen Effekten eingesetzt werden kann.

Wenngleich die oben angesprochenen üblichen Tumor-Marker mit Erfolg für den Nachweis von Krebserkrankungen eingesetzt worden sind, ist der Prozentsatz von Krebspatienten, die solche Tumor-Marker aufweisen, nicht hoch genug. Was den derzeitigen Nachweis von Lungenkrebs anbelangt, ist festzuhalten, daß lediglich 30 bis 50% der Lungenkrebs-Population mit den potentiellen Markern, wie CEA, SCC und NSE nachgewiesen werden können und daß unvermeidbar relativ hohe Prozentsätze (10 bis 20%) von falsch-positiven Ergebnissen auftreten. Diese Schwierigkeiten können der Tatsache zugeschrieben werden, daß alle diese Tumor-Marker aus menschlichen Geweben stammen und daß man sie auch in mehr oder weniger großen Mengen in gesundem Gewebe antrifft. Daher benötigen alle diese Nachweismethoden einen gereinigten Tumor- Marker bekannter Konzentration als Standardmaterial für die Bestimmung. Es ist jedoch nicht einfach, eine ausreichend große Menge der Tumor- Marker menschlichen Ursprungs für routinemäßige diagnostische Untersuchungen zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, ein Serum-Diagnoseverfahren und einen dafür geeigneten Serum-Diagnosesatz zum Nachweis und zur Bestimmung von Krebserkrankungen anzugeben, mit denen eine empfindliche und wirtschaftliche Krebsdiagnose in frühem Stadium der Krebserkrankung durchgeführt werden kann.

Es hat sich gezeigt, daß diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß man bei dem Serum-Diagnoseverfahren mindestens ein Cytochrom c oder mindestens ein Histon einsetzt, vorzugsweise Cytochrom c von niedrigen Organismen und Histone tierischen Ursprungs, wie beispielsweise von Mikroorganismen, wie Candida oder Saccharomyces, und die Histone H1, H2A, H2B, H3 und H4.

Gegenstand der Erfindung sind daher das Serum-Diagnoseverfahren der Ansprüche 1 und 5 und der Serum-Diagnosesatz nach Anspruch 9. Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen dieser Erfindungsgegenstände.

Ein wesentliches Merkmal der vorliegenden Erfindung ist darin zu sehen, daß die Serumdiagnose auf der Bestimmung von Antikörpern beruht, die in dem Patienten als Antwort auf das Auftreten eines mit dem Tumor verknüpften (Tumor- spezifischen) Markers gebildet werden statt auf die Bestimmung des Tumor- Markers selbst. Dieses Merkmal der vorliegenden Erfindung eröffnet einen einzigartigen Vorteil für die Serumdiagnose dadurch, daß selbst dann, wenn nur eine begrenzte Menge des Tumor-Markers vorhanden ist, der mit herkömmlichen Verfahren zur Bestimmung der Tumor-Marker nicht nachgewiesen werden kann, es möglich ist, den Lungenkrebs dadurch nachzuweisen, daß der durch den Tumor-Marker induzierte Antikörper verstärkt wird und nachgewiesen werden kann, so daß das erfindungsgemäße Verfahren eine empfindliche Methode zum Nachweis von Krebserkrankungen in einem frühen Stadium ermöglicht. Wenngleich ein starkes Bedürfnis für neue Methoden zur Diagnose von Krebs in einem frühen Entwicklungszustand besteht, ist bislang kein solches Verfahren bekanntgeworden, welches eine zufriedenstellende Wirksamkeit besitzt. Das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem Krebs-spezifische Substanzen, die aus Tieren oder Mikroorganismen gewonnen worden sind, eingesetzt werden, eröffnet ein neues Feld der Serumdiagnose für den empfindlichen Nachweis von Krebserkrankungen in frühem Stadium. Dieses neue erfindungsgemäße Konzept der Anwendung von auf den Krebs bezogenen (Krebs-spezifischen) Substanzen aus Tieren oder Mikroorganismen bei der Serumdiagnose von menschlichem Krebs eröffnet eine in breitem Umfang und routinemäßig anwendbare Methode mit hoher Empfindlichkeit und ausgezeichneter Reproduzierbarkeit bei vernünftigen Kosten.

Die Erfindung sei im folgenden näher anhand der nachfolgenden Beispiele erläutert.

(1) Identifizierung von Tumor-Markern oder Antigenen

Man identifiziert ein tumor-spezifisches Antigen in menschlichem Lungenkrebsgewebe mit der unten beschriebenen Methode unter Verwendung des Lungenkrebs-spezifischen menschlichen monoklonalen Antikörpers HB4C5 (IgM in Immunoglobulinklassfikation) (In Vitro Cellular and Developmental Biology, 21 (1985), 593).

Der Antikörper HB4C5 wurde am 12. Mai 1988 beim Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer FERM BP-1879 erhalten. Diese Hinterlegung erfolgte gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren.

Das Gewebe von menschlichem Lungenkrebs wurde mit einem oberflächenaktiven Mittel extrahiert und einer Gelelektrophorese auf einem Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid- Gel-Gradienten (4 bis 20%) unterworfen (Laemmli, Nature 227 (1970), 680). Nach der Elektrophorese wurden die auf dem Gel vorliegenden Materialien auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und in der nachfolgend beschriebenen Weise mit dem Antikörper HB4C5 immuno-gefärbt.

Vor der Immunoreaktion wurden die möglichen nichtspezifischen Adsorptionsstellen der Nitrocellulose-Membran blockiert durch Eintauchen der Membran während 1 Stunde in eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS)/0,05% Tween 20 (oberflächenaktives Mittel)/1% Rinderserumalbumin. Die Membran wurde dann während 1 Stunde in eine Lösung des Antikörpers HB4C5 eingetaucht, mit PBS/0,05% Tween 20 während 30 Minuten gewaschen und dann während einer Stunde mit einem Peroxidase-konjugierten Anti-Human IgM- Antikörper umgesetzt. Nach dem Waschen mit PBS/0,05% Tween 20 während 30 Minuten wurde die Membran mit 3,3′-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB), einem Substrat für die Peroxidase, während 15 Minuten inkubiert und dann wurde das mit dem Antikörper HB4C5 umgesetzte Antigen-Band sichtbar gemacht.

Die Aminosäuresequenzanalyse des Proteins, welches mit Hilfe des oben beschriebenen Immuno-Blotting-Verfahrens als ein für den Antikörper HB4C5 spezifisches Antigen identifiziert worden ist, hat gezeigt, daß das Antigen-Protein in dem Extrakt des Lungenkrebsgewebes bezüglich der zehn Amino-terminalen Reste identisch ist mit Histon H2B.

Hierdurch ist bewiesen, daß Histon H2B ein Antigen ist für den Lungenkrebs- spezifischen menschlichen monoklonalen Antikörper HB4C5. Auf dieser Basis wurde unter Verwendung von Histon H2B als Antigen eine Serumdiagnose entwickelt, mit dem der Gehalt an Anti-Histon H2B-Antikörper im Serum gemessen werden kann. Es wurden auch Möglichkeiten ähnlicher Serumdiagnosen mit anderen bekannten Vertretern der Histon-Familie untersucht, einschließlich der Histone H1, H2A, H3 und H4, wobei sich gezeigt hat, daß von den untersuchten Histonen mit Histon H3 der beste Nachweiseffekt für Lungenkrebs erzielt werden kann. Somit können Histone tierischen Ursprungs, wie jene aus der Kalbs-Thymusdrüse gewonnenen, in der Tat als geeignete Materialien für das erfindungsgemäße Serum-Diagnoseverfahren verwendet werden, da sie abgesehen von geringfügigen Heterogenitäten im wesentlichen die gleichen Strukturen besitzen wie die Histone menschlichen Ursprungs. Somit wird die Routine-Serumdiagnose von Lungenkrebs unter Verwendung von Histonen in wirtschaftlicher Weise möglich.

Unabhängig davon hat sich auf der anderen Seite gezeigt, daß eine weitere Gruppe von Substanzen spezifisch mit dem Antikörper HB4C5 reagiert, d. h. aus Mikroorganismen, wie Candida krusei und Saccharomyces cerevisiae gewonnene Cytochrome c. Diese Cytochrome c aus Mikroorganismen haben sich bei dem erfindungsgemäßmen Serumdiagnose-Verfahren als besonders reaktiv gegenüber Serum-Antikörpern von Lungenkrebspatienten erwiesen und führen zu ausgezeichneten Ergebnissen mit einem hohen Prozentsatz des Nachweises von Lungenkrebs. Somit sind auch die aus Mikroorganismen gewonnenen Cytochrome c, die mit geringen Kosten in großen Mengen zugänglich sind, für die routinemmäßige Serumdiagnose von Lungenkrebs geeignet.

(2) Serum-Diagnoseverfahren

Die erfindungsgemäß verwendeten Krebs-bezüglichen Substanzen tierischen oder mikroorganismellen Ursprungs werden mit 50 mM Natriumcarbonatpuffer (pH-Wert 9,5)/0,05 bis 0,1% fetales Rinderserum (FCS)/0,02% Natriumazid auf eine Endkonzentration von 50 µg/ml verdünnt. Dann gibt man in jedes Näpfchen einer Immunoplatte mit 96 Näpfchen 100 µl eines aliquoten Anteils der oben beschriebenen Lösung der Krebs-spezifischen Substanz und inkubiert während 1 Stunde bei 37°C, um die Näpfchen mit den Proteinen zu beschichten. Kontrollnäpfchen, welche routinemäßig herangezogen werden, um die Histon-Abhängigkeit des Nachweises sicherzustellen, werden in ähnlicher Weise mit der oben beschriebenen Lösung behandelt, die jedoch kein Histon enthält. Die Kontroll-Näpfchen sind für die Bestimmung mit Cytochrom c unnötig. Die Platte wird zweimal mit PBS gewaschen und dann während 1 Stunde bei 37°C mit 10% FCS/PBS inkubiert, um eine Blockierung der nichtspezifischen Absorptionsstellen zu bewirken.

Dann werden sofort jeweils 50 µl aliquote Anteile der Seren von Patienten und normalen Individuen, welche um den Faktor 1 : 200 (mit PBS/0,05% Tween 20/0,1% Rinderserumalbumin (BSA) für die Untersuchung mit Histon) oder 1 : 500-5000 (mit 10% FCS/PBS für die Untersuchung mit Cytochrom c) verdünnt worden sind, in die Näpfchen eingebracht und während 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Antikörper in dem Serum werden über das in der Schicht vorliegende Histon oder Cytochrom c an die immobile Phase gebunden.

Die Näpfchen werden dreimal mit PBS/0,05% Tween 20 gewaschen, wonach 100 µl aliquote Anteile eines Peroxidase-konjugierten Anti-Human IgG oder IgM (1-20 µg) in PBS/0,05% Tween 20/0,01% BSA zugegeben werden. Die Platte wird dann während 1 Stunde bei 37°C inkubiert.

Nach dem dreimaligen Waschen der Näpfchen mit PBS/0,05% Tween 20 wird ein 100 µl aliquoter Anteil der Substratlösung, welche 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazolin- 6-sulfonsäure)-diammoniumsalz (ABTS) enthält, in jedes Näpfchen eingebracht und während 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Enzymreaktion wird durch die Zugabe eines 100 µl aliquoten Anteils von 1,5% Oxalsäure in jedes Näpfchen beendet, wonach die Extinktion bei 415 nm spektrophotometrisch gemessen wird. In Probeseren beobachtet man bei 415 nm mit den Antikörpern lineare Dosisabhängigkeiten bis zu einer Extinktion von 1,5. Man berechnet die auf den Krebs bezogene, substanzabhängige Reaktion der Nachweismethode durch Subtrahieren der Extinktion der Kontrollnäpfchen von jener des entsprechenden Probenäpfchens.

Das erfindungsgemäße Serum-Diagnoseverfahren kann vorzugsweise mit Hilfe beispielsweise des folgenden Serum-Diagnose-Satzes durchgeführt werden.

Serum-Diagnose-Satz

Dieser Satz ist zur Bestimmung von 48 bis 96 Proben geeignet.

Bestandteile

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Man untersucht die Reaktivität von aus Candida krusei gewonnenem Cytochrom c bei dem erfindungsgemäßen Verfahren anhand von Seren von gesunden Individuen und von Lungenkrebspatienten. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 zusammengestellt.

Tabelle 1

Ein ähnliches Experiment wird in der oben beschriebenen Weise durchgeführt, wobei aus Saccharomyces cerevisiae gewonnenes Cytochrom c eingesetzt wird. Diese aus Mikroorganismen gewonnenen Cytochrome c sind im Handel erhältlich. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2

Beispiel 2

Man bewirkt die Serumdiagnose anhand der Seren von Patienten, welche unterschiedliche Gewebetypen von Lungenkrebs aufweisen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung von aus Candida krusei gewonnenem Cytochrom c. Die Seren mit einem A₄₁₅-Wert mit einer doppelten Standardabweichung oberhalb des Durchschnittswerts der Kontrollwerte der gesunden Seren wurden als positiv angenommen. Die in der nachfolgenden Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Serum-Diagnoseverfahren höhere Nachweisraten und niedrigere Prozentsätze von falsch-positiven Ergebnissen zeigt (weniger als 5%, d. h. als 5 von 110) als die bisher üblichen Methoden, bei denen CEA, SCC oder NSE verwendet werden.

Tabelle 3

Beispiel 3

Man wiederholt das erfindungsgemäße Serum-Diagnoseverfahren unter Verwendung von aus Candida krusei gewonnenem Cytochrom c und Seren von Patienten mit Krebsen unterschiedlicher Organe. Die in der folgenden Tabelle 4 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die aus Lungenkrebs, Gallengangkrebs und Speiseröhrenkrebs gewonnenen Seren mit hoher Wahrscheinlichkeit diagnostiziert werden können.

Tabelle 4

Beispiel 4

Man führt das erfindungsgemäße Serum-Diagnoseverfahren unter Verwendung von aus Kalbs-Thymusdrüse gewonnenem Histon H2B an Seren von Patienten durch, welche an Krebsen unterschiedlicher Organe und gutartigen Störungen leiden, als auch an jenen von normalen gesunden Individuen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 5 angegeben. Die Seren von Patienten, die an Gebärmutterkrebs, Lungenkrebs, Pankreaskrebs und Mastdarmkrebs leiden, lassen eine hohe Nachweisgenauigkeit erkennen.

Tabelle 5

Beispiel 5

Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 4 mit dem Unterschied, daß man Seren von Patienten unterschiedlicher histologischer Typen von Lungenkrebs einsetzt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 angegeben.

Tabelle 6

Beispiel 6

Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 5, wobei man jedoch anstelle von Histon H2B Histon H3 verwendet. Die in der nachfolgenden Tabelle 7 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß im Vergleich zu Histon H2B mit Histon H3 höhere Nachweisraten erzielt werden (vgl. Tabelle 6).

Tabelle 7

Beispiel 7

Man führt eine Serum-Diagnose durch mitjedem der fünf aus Kalbsthymusdrüsen gewonnenen Histone einschließlich H1, H2A, H2B, H3 und H4, wobei man diese Histone getrennt verwendet unter Einsatz des gleichen Serums. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 8 angegeben, aus der hervorgeht, daß die Histone H1, H2A und H4 in wirksamer Weise bei dem erfindungsgemäßen Serum-Diagnoseverfahren eingesetzt werden können.

Tabelle 8

Claims

1. Serum-Diagnoseverfahren zum Nachweis von Krebs, gekennzeichnet durch die Verwendung von Cytochrom c.

2. Serum-Diagnoseverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß von Mikroorganismen einschließlich Candida und Hefen abgeleitetes Cytochrom c verwendet wird.

3. Serum-Diagnoseverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem Blut vorhandenen, mit Cytochrom c reagierenden Antikörper nachgewiesen werden.

4. Serum-Diagnoseverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Enzym markierte Antikörper verwendet werden.

5. Serum-Diagnoseverfahren zum Nachweis von Krebs, gekennzeichnet durch die Verwendung von Histonen.

6. Serum-Diagnoseverfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Histone aus der Gruppe der die Histone H1, H2A, H2B, H3 und H4 umfassenden Gruppe eingesetzt wird.

7. Serum-Diagnoseverfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die in dem Blut vorhandenen, mit den Histonen reagierenden Antikörper nachgewiesen werden.

8. Serum-Diagnoseverfahren nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Enzym markierte Antikörpe verwendet werden.

9. Serum-Diagnose-Satz zur Verwendung bei dem Serum-Diagnoseverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend mindestens ein Cytochrom c und/oder Histon als Nachweisreagens.