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DE2654723C2 - Magnetischer Festphasenträger für immunologische Bestimmungen sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents

Magnetischer Festphasenträger für immunologische Bestimmungen sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung

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DE2654723C2
DE2654723C2 DE2654723A DE2654723A DE2654723C2 DE 2654723 C2 DE2654723 C2 DE 2654723C2 DE 2654723 A DE2654723 A DE 2654723A DE 2654723 A DE2654723 A DE 2654723A DE 2654723 C2 DE2654723 C2 DE 2654723C2
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magnetic solid
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Jean-Luc Paris Guesdon
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Institut Pasteur de Lille
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Description

Die Erfindung betrifft einen magnetischen Festphasenträger für immunologische Bestimmungen, der magnetische Teilchen enthält Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieses Festphasen trägers für die quantitative Bestimmung von Proteinen, wie beispielsweise Antigene oder Antikörper, die in bestimmten biologischen Medien enthalten sind und schließlich ein Verfahren zur Herstellung eines magnetischen Festphasenträgers auf der Basis von Acrylamid, Agarose oder Acrylamid-Agarose.
Magnetische Festphasenträger für Immunoassays, enthaltend magnetische Teilchen, sind bereits bckanni
[Clinica Chimica Acta, fcJ (1975>, S. 69—72]. Bei diesem bekannten Material handelt es sich jedoch um mit einem .< I Silan beschichtete Magneiit-Teilchen. Ferner sind enzymimmunologische Vcrfahrcnsschrittc bekannt (Biomedi-
J5 eine, 1973.19,314-317).
Die Erfassung und Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen mit Hilfe von Enzymen ist bereits bekannt (Bull. Soc. Chim. Biol. 1968. 50. No. 5—6). Es sind auch schon Verfahren zur Darstellung und zur Bestimmung einer Reaktionsverbindung zwischen einem spezifischen fixierenden Protein und der entsprechenden zu fixierenden Substanz mittels Markierung der letzteren mit Hilfe eines Enzyms vorgeschlagen worden. Die Bcstim- AO mung der enzymatischen Aktivität des Reaktionsmediums nach Fixierung der zu fixierenden Substanz am fixierenden Protein erfolgt bei solchen Verfahren durch eine mehrstufige Zentrifugierung. die die Dauer der Bestimmung wesentlich verlängert. Solche Verfahren können eine nichtausreichende Empfindlichkeit besitzen, da die Abtrennung der unlöslichen Teilchen aus dem Reaktionsmedium schwer zu realisieren ist. und zwar insbesondere aufgrund der Natur und des Molekulargewichtes der fixierenden Substanz. Es ist weiterhin ein Verfahren zur Bindung von Enzymen auf magnetischen Trägern bekannt (Biotechnology and Biocngincering, Vol. XV (1973) und Biotechnology and Bioengineering. Vol. XVI. p. 385-396 (1974). Bei diesem Verfahren wird p das Enzym direkt auf den magnetischen Träger fixiert und man kann auf diese Weise industriemäßig hergestellte
•jS Enzyme, beispielsweise aus Fermentationsvorrichtungen, verwenden. Ihre Konservierung, Wiedergewinnung
. und Wiederverwendung ist nicht schwierig.
j-s so Der Erfindung liegt nunmehr die Aufgabe zugrunde, einen magnetischen Festphasenträger /u schaffen, der
h; schnellere und genauere immunologische Bestimmungen bzw. Analysen ermöglicht.
U Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß der Festphasenträger aus einem Gel aus
t'i Polyacrylamid und/oder Agarose besteht, in das die magnetischen Teilchen eingebettet sind.
ji-i Der magnetische Festphasenträger in Form eines Gels kann mit einem Antikörper gekoppelt sein, um eine
: 55 schnelle enzymimmunologische Bestimmung der Antigene zu ermöglichen, die beispielsweise in einer biologi-
; sehen Flüssigkeit enthalten sind. Die Gegenwart der magnetischen Teilchen ermöglicht eine schnelle Abtrcn-
; nung des Gels aus dem Reaktionsmedium mit Hilfe eines Magnetfeldes und verringert dadurch wesentlich die
Dauer der Bestimmung bzw. der Analyse.
Das erfindungsgemäße magnetische Gel eignet sich auch für radioimmunologische Bestimmungen von Aniikörpern oder Antigenen.
• Äcrylamidgele, Agarosegele und gemischte Gele aus Acrylafnid-Agarösc sind fln sich bekannt und sind bereits
als Wanderungsträger für die elektrophorctische Auftrennung von biologischen Substanzen oder für immunnehemisehe Analyscmcthodcn in einem gelierten Medium (französisches Patent FR 14 8J 742) verwendet worden.
Die magnetischen Gele mich der Erfindung werden in bekannter Weise hergestellt, indem die magnetischen
ti'i Teilchen im Verlauf der Bildung des CJcIs eingebaut werden und insbesondere inmitten der Ausgangsmalcrialicn.
die für die I lerstelliing verwendet werden.
Hei einer bevorzugten Ausfiihrungsforrr, des Verfahrens nach der Erfindung kann man ein magnetisches Mischgel au·. /Vrylamid-Agarosc herstellen unter Verwundung des Verfahrens, das von Uriel el a! (CR. Aiad.
Soc. Paris, 273, Seiten 2358—2360, 1971, Serie D) beschrieben wird, bei dem die entsprechend der Erfindung zugesetzten magnetischer. Teilchen dem Acrylamid-Monomer zugesetzt werden. Die entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendeten magnetischen Gele besitzen vorzugsweise eine sphärische bzw. kugelige Form mit einer Korngröße zwischen 50 und 500 μίτι.
Die in dem Gel nach der Erfindung eingebauten magnetischen Teilchen bestehen beispielsweise aus Magnetit-Teilchen, aus Ferriiteilchen oder aus Eisenpulver. Vorzugsweise werden Magnetit-Teilchen verwendet. Die Menge der magnetischen Teilchen, die in die Gele nach der Erfindung eingebaut werden, ist nicht kritisch. Sie muß jedoch ausreichend sein, um eine gute Abtrennung des Gels aus einem flüssigen Reaktionsmedium mitteis eines Magnets zu ermöglichen. Beispielsweise würde eine Menge in der Größenordnung von 20 g Magnetit für 10 g Acrylan.id-Monomer und 0,25 g Bisacrylamid ausreichen, wenn das Gel ein Polyacrylamid-Agarose-Gel ist, das nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist
Das so hergestellte magnetische Gel kann anschließend mit einem Protein gekoppelt werden, und zwar mit HiKe eines auf diesem Gebiet üblichen Kopplungsmittels. Beispielsweise kann als Kopplungsmittel Glutaraldehyd verwendet werden.
Die Kopplung der Proteine mit dem magnetischen Gel nach der Erfindung wird in vorteilhafter Weise erreicht nach dem Verfahren von T. Ternynck und S. Avrameas (F.E.B.S, Briefe 23,24,1972).
Das mit einem Protein, wie beispielsweise einem Antikörper oder einem Antigen gekoppelte magnetische Gel nach der Erfindung kann für eine enzymimmunologische Bestimmung des Antikörpers verwendet werden oder für das entsprechende Antigen. Das magnetische Gel nach der Erfindung wird in der folgenden Beschreibung anhand eines magnetischen Gels erläutert, das mit einem Antigen gekoppelt ist.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Bestimmung des Antiköroers, der in einer biologischen Flüssigkeit enthalten ist, in der folgenden Weise durchgeführt.
Eine bestimmte Menge des mit einem antigen gekoppelten magnetischen Gels wird mit der jiologischen Flüssigkeit in Kontakt gebracht, die den zu bestimmenden Antikörper enthält. Nach einer Inkubierungszeit von etwa '/2 bis zu 1 Stunde wird das Gel mehrere Male mit einem Phosphatpuffer gewaschen, indem man das Gel entlang der Wand des Reagenzglases mittels eines Magnetfeldes festhält. Dies ist möglich aufgrund der Tatsache, daß im Gel magnetische Teilchen enthalten sind. Auf diese Weise werden die bei den herkömmlichen Bestimmungsvcrfahren dieser Art notwendigen Zentrifugierungen nach jeder Auswaschung vermieden. Nachdem diese Waschungen durchgeführt worden sind, wird das Gel etwa 30 Minuten lang in Gegenwart des Antikörpers inkubiert, der mittels eines Enzyms markiert worden ist. Die Markierung des Antikörpers wird in herkömmlicher Weise durchgeführt. Dazu werden Enzyme verwendet, die in bekannter Weise bei er.zymimmunologischen Bestimmungen benutzt werden, wie beispielsweise Glucoseoxydase und Peroxydase.
Nach der Inkubierung des Gels in Gegenwart des mit einem Enzym markierten Antikörpers mißt man die enzymatische Aktivität des Gels, nachdem man den Überstand eliminiert hat. Dies geschieht, indem man das Gel an der Wand des Reagenzglases mittels eines Magnetfeldes festhält. Die enzymatische Aktivität wird bestimmt durch Ablesen der optischen Dichte. Die Bestimmungsdauer liegt bei etwa 2 Stunden. 3ei der Verwendung eines Geis nach der Erfindung können die herkömmlichen enzymimmunologischen Bestimmungen etwa auf ein Viertel der sonst üblichen Zeitdauer reduziert werden.
Die magnetischen Gele nach der Erfindung können insbesondere verwendet werden für die Bestimmung der Immunoglobuline (IgE), die antimedikamentös, antiallergisch und antiparasitär sind, sowie für die Bestimmung 4C der IgM. die spezifische Antirötel-Mittel sind und es ermöglichen, frische Röteln wahrend der Schwangerschaft nachzuweisen. Die magnetischen Gele nach der Erfindung e möglichen ebenfalls die schnelle Bestimmung von Antikörpern, Tetanus-Antitoxine (wie beispielsweise bei Unfällen) oder Anti-ADN-Antikörpcr, (beispielsweise im Falle von Lupuscrythematodus).
F.s ist ebenfalls möglich die Spc/.ifttät bzw. Eigentümlichkeit der Anti-Pollenallergic, wie beispielsweise von Gräsern nachzuprüfen und die Intcnsitäl der humoralen Reaktion zu messen (Menge der starken u.id schwachen spezifischen IgE).
Das magnetische Gel nach der Erfindung kann Teil eines Reaktionssatzes für enzymimmunologische Bestimmungen sein. Ein solcher Reaktionssatz kann ans folgenden Bestandteilen zusammengesetzt sein:
1) Magnetisches Gt-if. gekoppelt mit einem Antigen oder einem Antikörper
2) ein Puffer
J) ein bezüglich des zu untersuchenden Antigens spezifischer Antikörper oder ein bezüglich des zu untersuchenden Antikörpers spezifisches Antigen, jeweils mit einnm Enzym gekoppelt
4) ein Magnet
5) ein Substrat des Enzyms zum Feststellen seiner enzymatischen Aktivität und
b) normales Nachweisserum.
Der Reaktionssatz kann weiterhin Vorrichtungen enthalten, mit denen man eine Serie von Verbindungslösungen des zu untersuchenden Musters herstellen kann. *>o Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung werden in folgenden Beispielen im einzelnen erläutert.
Beispiel I
a) Herstellung eines fcrromagnctischen Polyacrylamid-Agarosc-Gcl
'Man verwendete das von Uriel et al (CR. Acad. Sc. Paris, t. 273, 2358-23bO, 197I Serie Π) beschriebene Verfahren.
Es wurden 50 g FeiO^ für 7.chn Gramm Acrylamidmonomcr und 0.25 y Bis-Acrylamid und 5 g Agarosc verwendet. Das Magnetit wurde zu der Lösung aus Acrylamid und Bisacrylamid zugesetzt, bevor diese mit der Lösung vermischt wurden, die die Agarosc enthielt.
ir,
b) Kopplung der Proteine auf dem so hergestellten magnetischen Gel
Das in der oben beschriebenen Weise hergestellte Gel wurde mit den Proteinen gekoppelt mit Hilfe von Glutaraldehyd mit der von T. Ternynck und S. Avrameas beschriebenen Verfahren (TEBS Letters 23.24,1972).
Folgende Proteine wurden fixiert:
1) Ig Schaf
2) Schafantikörper, Anti-Ig von Hasen
3) Telanus-Anatoxin
4) Rindcralbumin
Die fixierten Mengen dieser Substanzen werden im folgenden als Funktion der Größe der magnetischen Gelteilchen angegeben.
Durchmesser Menge des Menge der Antikörper Menge des Menge de·-·
der ferromagnctischcn am Schaf fixierten Ig vom Schaf Ami-Ig fixierten fixicricn
Polyacrylamid-Agarosc vom Schaf fixiert AnatoxinTeianus Rirulcriilbumin.s
Teilchen
500 250 μπι 1,5 mg/ml
250 125 μπι 3.1 mg/ml
125 63 μηι 3,1 mg/ml 2.1 mg/ml 0.75 mg/ml 1.4 mg/ml
Beispiel 2
Bestimmung der Antikörper
In jedes Reagenzglas, das 50 μΙ des auf dem magnetischen Gel fixierten Antigens enthielt, wurden 1 ml einer Immunoserumlösung oder eines normalen Testserums gegeben.
Nach einer Inkubationszeit nach einer Stunde bei 20°C wird das Gel dreimal mit einem Phosphatpuffer (PBS) gewaschen. Das Gel wird während der Waschungen mittels eines Magnetes an der Wand des Reagenzglases festgehalten.
Anschließend wird das Gel 30 Minuten lang in Gegenwart der Antiimmunoglobulin-Antikörper, die mit Glukoseoxydase markiert sind, inkubiert.
Die enzymatische Reaktion wird mit dem Gel nach drei weiteren Waschungen mit PBS durchgeführt.
Die Ablesung der optischen Dichte wird bei 400 nm durchgeführt und zwar 10 Minuten nach der cnzymatisehen Reaktion bei Raumtemperatur. Die dabei gemessene enzymatische Aktivität wurde mit der cnzymaiischen Aktivität von normalem Serum verglichen.
Als Gel wurde magnetisches Gel verwendet, das mit Schafs-Ig gekoppelt worden war und entsprechend
so Beispiel 1 hergestellt worden war. Dieses Gel wurde nach der oben angegebenen Verfahrensweise mit Kar-'tichen-immunoserum Anti Ig vom Schaf inkubiert und es wurde die optische Dichte des Gels für verschiedene Verdünnungen dieses Immunoserums gemessen. Die dabei erhaltenen Ergebnisse sind in der beiliegenden Grafik dargestellt. Auf der Ordinate ist die bei 400 nm gemessene optische Dichte angegeben und auf der Abszisse die Verdünnungen. Die Kurve (A)bezieht sich auf das Immunoserum und die Kurve f/y bezieht sich auf ein normales Serum, das als Vergleichsserum verwendet wurde.
Man erhielt analoge Ergebnisse, wenn man ein Ge! verwendete, das mit einem nach Beispiel 1 hergestellten Rinderalbumin gekoppelt war und mit einem Kaninchen-Immunoserum — Rinderalbuminantiserum.
Die Empfindlichkeit der nach der Erfindung durchgeführten Bestimmung liegt bei etwa 50 ng Antikörper je ml.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (8)

Patentansprüche:
1. Magnetischer Festphasenträger für immunologische Bestimmungen, enthaltend magnetische Teilchen, dadurchgekennzeichnet, daß er aus einem Gel aus Polyacrylamid und/oder Agarose besteht, in das die magnetischen Teilchen eingebettet sind.
2. Magnetischer Festphasenträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die magnetischen Teilchen aus Magnetitteilchen, Ferritteilchen oder Eisenpulver bestehen.
3. Magnetischer Festphasenträger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel mit Hilfe eines Kupplungsmittels mit einem Protein gekoppelt ist.
ίο
4. Magnetischer Festphasenträger nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet daß das Kupplungsmittel
Gl-J laraldehyd ist.
5. Magnetischer Festphasenträger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Gel ein Polyacrylamid-Agarose-Gel ist, die magnetischen Teilchen aus Magnetit bestehen und das Gel mit einem Protein, wie ein Antigen oder ein Antikörper, mittels Glutaraldehyd gekoppelt isü
6. Verwendung des magnetischen Festphasenträgers nach einem der Ansprüche 3 bis 5 in enzymimmunologischen oder radioimmunologischen Bestimmungen von Antikörpern oder Antigenen.
7. Verwendung des magnetischen Festphasenträgers nach einem der Ansprüche 3 bis 5 zur Bestimmung von Allergenen und Tetanus-Antitoxinen.
8. Verfahren zur Herstellung eines magnetischen Festphasenträgers gemäß einem der Ansprüche I bis 5. dadurch gekennzeichnet, daß 50 g Magnetitteilchen einer Lösung aus 10 g Acrylamid und 0,25 g Bis-Acryla- nud zugesetzt werden, diese Lösung mit einer 5 g Agarose enthaltenden Lösung zur Gelbildung vermischt wird und auf diesem magnetischen Gel Proteine mit Hilfe von Glutaraldehyd gekoppelt werden.
DE2654723A 1975-12-02 1976-12-02 Magnetischer Festphasenträger für immunologische Bestimmungen sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung Expired DE2654723C2 (de)

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