DE4012319A1 - Verfahren zur herstellung und die verwendung des lektins von chondrilla nucula zur zytoprotektion von nicht-infizierten und virus-infizierten lymphozyten als auch zur zytologischen diagnose - Google Patents

Description

Das Lektin aus Chondrilla nucula wird in der Natur gefunden. Dieses kann nun wie folgt isoliert werden:

Extraktion und Reinigung von Chondrilla-nucula-Lektin

Der Schwamm Chonrilla nucula (Schm.) (Demospongiae, Hadromerida, Chondrosiidae) wird z. B. in der Nähe von Kotor (südl. Adria, Jugoslawien) beim Tauchen gesammelt, und die Exemplare werden entweder sofort extrahiert oder bis zur Weiterverwendung bei -20°C gelagert. Vor der Extraktion werden die frischen Schwämme in kleine Stücke geschnitten und in künstlichem Seewasser homogenisiert (1 : 1, w/v) (Müller et al., 1987; J. Biol. Chem., 262: 9850). Die erhaltene Suspension wird zentrifugiert (20,000 g, 10 min), der Überstand wird gesammelt und bei -20°C aufgehoben. Die Protein-Konzentration des Rohextraktes ist gewöhnlich 6,4 mg/ml.

Der klare Überstand wird über teilweise hydrolysierter Sepharose 4B wie folgt gereinigt (Baldo et al., 1978; Biochem. J., 175: 467): 15 ml des Rohextraktes (Hemagglutinitätsaktivität 2⁸) wird auf eine Säule von teilweise hydrolyierter Sepharose 4B (4×9,5 cm) gegeben und mit 0,01 M Tris/HCl-Puffer (pH 7,5) äquilibriert. Das ungebundene Protein wird durch sorgfältiges Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer eluiert. Das Chondrilla-nucula-Letin (ab jetzt abgekürzt CN-Lektin) wird mit einer 0,2-M-Laktose-Lösung in Äquilibrierungspuffer eluiert. Die Lektin-Fraktionen werden gesammelt, gegen destilliertes Wasser dialysiert und gefriergetrocknet.

Charakterisierung des CN-Lektins

Das Lektin ist ein Protein, das aus vier Polypeptiden mit einem Mol-Gew. von 15,600 aufgebaut ist. Der isolelektrische Punkt liegt bei 4,5. Das Lektin präzipitiert Erythrozyten vom Menschen mit einem Titer zwischen 2⁵ und 2¹⁰ (Schröder et al., 1990; Antivir. Chem. Chemotherapy, im Druck).

Irgendwelche Wirkungen dieses Lektins - als auch das Lektin selbst - waren bisher nicht bekannt.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß das CN-Lektin einen stark zytoprotektiven Effekt auf Lymphozyten in der Zellkultur und auf Lymphozyten aus Mäusen ex vivo ausübt.

Diese Eigenschaften der Substanz läßt erwarten, daß sie einen zytoprotektiven Effekt bei solchen Erkrankungen zeigt, bei denen es zu zytopathischen Effekten besonders auf Lymphozyten kommt. Als ein Beispiel seien die zytopathischen Effekte, die bei der Infektion von Menschen durch Retroviren wie HIV (human immunodeficiency virus) auftreten, erwähnt [Rieber et al.: Grundlagen der Immunologie; in AIDS- und HIV-Infektionen, herg. von H. Jäger; Ecomed. Landsberg, 1989, Seite 1-22 (Kapitel II - 3.1)]. Es wird nun beschrieben, daß das Lektin die Eigenschaft der Zytoprotektion besitzt. Diese Eigenschaft war bisher unbekannt. Die nun beschriebene Erfindung läßt den Einsatz des Lektins auch bei der Behandlung der Immunschwäche AIDS (Aquired Immunodeficiency Syndrome) oder ARC (AIDS-related Complex) als sinnvoll erscheinen.

Es ist bekannt, daß AIDS durch das Human-Immunodeficiency-Virus (HIV), auch Human-T-Cell Leukemia/Lymphotropic-Virus vom Typ III (HTLV-III) oder Lymphadenopathy-Associated-Virus (LAV) genannt, verursacht wird. HIV gehört zum Typ der RNA-Viren. Der Virusbefall ist die Hauptursache für ein Spektrum immunologischer Störungen, von denen AIDS in Form des Kaposi- Sarcoms oder des AIDS-related-Complex sich klinisch am schwersten manifestiert. Bei diser Erkrankung wird ein zytopatischer Effekt auf Lymphozyten beschrieben [Rieber et al.: Grundlagen der Immunologie; in AIDS- und HIV-Infektionen, herg. von H. Jäger; Ecomed, Landsberg, 1989, Seite 1-22 (Kapitel II - 3.1)]. Eine wirksame therapeutische Behandlung der zytopatischen Zerstörung der Lymphozyten z. B. bei AIDS oder ARC war bis jetzt noch nicht möglich.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen erfolgversprechenden Weg zur Zytoprotektion von Lymphozyten aufzuzeigen.

Zum Nachweis der Zytoprotektion wurden folgende Test-Systeme eingesetzt:

Zellkultur-Systeme

Hierzu wurden verwandt:

Einmal:
Nichtinfizierte CEM-Zellen (permanente menschliche Leukämie- Zellen [Sechoy et a., Exp. Cell. Res., 185: 122, 1989])
und zum anderen:
HIV-1-infizierte CEM-Zellen [Avramis et al., AIDS, 3: 4127, 1989].

Tiermodell ex-vivo-System

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß das Lektin einen starken zytoprotektiven Einfluß auf nichtinfizierte und Virus- infizierte Lymphozyten in der Zellkultur und auf Zellen dieser Art ex vivo ausübt.

Die erfindungsmäßig zur Anwendung kommende Verbindung wird im allgemeinen zu pharmazeutischen Mitteln verarbeitet, die als Dosiseinheiten vorliegen und systematisch also oral, rektal oder parenteral (intramuskulär, intravenös und subkutan), verabreicht werden können.

Die Mittel enthalten eine zur Prophylaxe und Behandlung von Lymphozyten, die einem zytopathischen Agenz ausgesetzt sind, wirksame oder Zytopathie-beseitigende Menge des Lektins, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und Hilfsstoffen. Beispielsweise enthalten derartige pharmazeutische Mittel 0,5 bis 98 Gew.-% mindestens einer erfindungsgemäßen Verbindung zusammen mit einem pharmazeutischen Träger.

Wenn das Mittel in einer Form einer Dosiseinheit vorliegt, enthält diese vorzugsweise 50 bis 500 mg der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung.

Die pharmazeutischen Mittel können zur oralen Verarbeichung in fester Form, beispielsweise als Tabletten, Pastillen, Kapseln, Pulver, oder in flüssiger Form, beispielsweise als wäßrige oder ölige Suspension, Sirup, Elixier, Lösung oder mit Flüssigkeit gefüllte Kapseln vorliegen.

Bevorzugte orale Mittel liegen in der Form von Tabletten oder Kapseln vor und können übliche Träger, wie Bindemittel (z. B. Sirup, Akazia, Gelatine, Sorbit, Tragant oder Polyvinylpyrrolidon), Füllstoffe (z. B. Lactose, Zucker, Maisstärke, Kartoffelstärke, Calciumphosphat, Sorbit oder Glycin), Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Talk, Polyethylenglykol oder Siliciumoxid), Disintegrationsmittel (z. B. Stärke) und Netzmittel (z. B. Natriumlaurylsulfat), enthalten.

Mittel zur parenteralen Verarbeitung liegen im allgemeinen in Form einer Lösung oder Suspension der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung zusammen mit üblichen pharmazeutischen Trägern vor, beispielsweise in Form einer wäßrigen Lösung für intravenöse Injektion oder einer öligen Suspension für die intramuskuläre Injektion. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Mittel erhält man, indem man 0,1 bis 10 Gew.-% der erfindungsgemäßen Verbindung in Wasser oder einem Träger, der aus einem aliphatischen Polyalkohol, wie Glycerin, Propylenglykol oder Polyäthylenglykol oder einer Mischung davon besteht, löst. Die Polyäthylenglykole bestehen aus einer Mischung nicht flüchtiger, gewöhnlich flüssiger Polyäthylenglykole, die sowohl in Wasser als auch in organischen Flüssigkeiten löslich sind und deren Molekulargewichte von 200 bis 1500 reichen.

Pharmazeutische Mittel zur rektalen Verabreichung liegen in Form von Suppositorien vor, wobei die erfindungsgemäßen Verbindungen einer geeigneten Suppositoriengrundlage, wie Kakaobutter, gehärtete Fette, Polywachse oder Polyethylenglykole, in einer Menge von 1 bis 10 Gew.-% einverleibt sind.

Die Herstellung der pharmazeutischen Mittel erfolgt anhand üblicher Verfahren, beispielsweise durch Tablettieren, Einverleiben der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in eine Suppositoriengrundlage, Sterilfiltration und Abfüllen in Ampullen oder Tropfflaschen einer Lösung der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen in Injektionswasser zusammen mit üblichen Zusätzen, wie Natriumchlorid, Natriumhydrogenphosphat, Dinatrium-EDTA (Ethylendiaminotetraessigsäuredinatriumsalz), Benzylalkohol oder Natriumhydroxyd zur Einstlelung des pH.

Das Verfahren zur Behandlung von zytopathischen Effekten auf Lymphozyten umfaßt die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge an Lektin davon an einen Patienten, der dieser Behandlung bedarf.

Die Dosierung hängt in erster Linie von der spezifischen Verabreichungsform und vom Zweck der Therapie ab. Die Größe der Einzeldosen sowie das Verabreichungsschema können am besten anhand einer individuellen Beurteilung des jeweiligen Krankheitsfalles durch den Arzt bestimmt werden, wobei das Alter, das Gewicht und der Zustand des Empfängers, der Verabreichungsweg und die Art und die Schwere der Krankheit berücksichtigt werden müssen. Im allgemeinen beträgt die Tagesdosis 2-20, vorzugsweise 3-10, insbesondere 6-7 mg/kg Körpergewicht.

Die Dauer der Behandlung richtet sich nach Art und Schwere der Erkrankung. Sie erstreckt sich im allgemeinen über mehrere Wochen, beispielsweise 4 bis 8 Wochen.

Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommende Verbindung wirkt zytoprotektiv auch auf Lymphozyten, die durch das Human Immunodeficiency Virus (HIV) infiziert wurden. Diese Verbindung ist deshalb auch zur therapeutischen und prophylaktischen Behandlung der durch das AIDS-Virus verursachten Erkrankungen brauchbar.

Die Aktivität der erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindung wird anhand pharmakologischer in-vitro- und ex-vivo- Testsysteme untersucht.

Weiterhin wird gezeigt, daß das Lektin in histologischen Schnitten eine spezifische Anfärbung der Zellen zeigt.

Beispiele Zytoprotektive Wirkung des Lektins

Beispiele:

• 1) Nachweis der Zytoprotektion von nicht-infizierten CEM- Zellen;
• 2) Nachweis der Zytoprotektion von HIV-infizierten CEM-Zellen;
• 3) Nachweis der Zytoprotektion von Lymphozyten ex vivo;
• 4) Einsatz des CN-Lektins in der Histologie.

1) Nachweis der Zytoprotektion von nicht-infizierten CEM- Zellen

Dabei kam die Zellinie CEM zur Anwendung, bei der es sich um eine klonierte menschliche Leukämie-Zellinie handelt (Sechoy et al., Exp. Cell Res., 185: 122, 1989, und Avramis et al., AIDS, 3: 417, 1989].

Versuchsdurchführung Kultivierung von CEM-Zellen

CEM-Zellen [Sechoy et al., Exp. Cell Res., 185: 122, 1989, und Avramis et al., AIDS, 3: 417, 1989] wurden entweder nicht mit Arzneimittel behandelt (Kontrollprobe) oder mit unterschiedlichen Konzentrationen an zu testendem Lektin.

Untersuchungsparameter Zellwachstum

CEM-Zellen wurden in einer Konzentration von 0,2×10⁶ Zellen/ml Kulturmedium zum Beimpfen der Kultur verwendet. Nach 4tägiger Inkubation betrug die Dichte der CEM-Zellen 1,9×10⁶ Zellen/ml. Dieser Wert bildete den Kontrollwert.

Die CEM-Zellen 0,2×10⁶ Zellen/ml wurden 4 Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen von Lektin behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Es ist ersichtlich, daß das Lektin in den Konzentrationen zwischen 0,1 und 1,0 µg/ml siginifikant (P<0,001) die Wachstumsrate von CEM-Zellen bis auf 156% steigert. Die Signifikanz wurde durch den Student's-t-Test ermittelt (Sachs, L.: Angewandte Statistik, Berlin: Springer-Verlag; pp. 209-216; 1984).

2) Nachweis der Zytoprotektion von HIV-infizierten CEM-Zellen

Dabei kam die Zellinie CEM zur Anwendung, bei der es sich um eine klonierte menschliche Leukämie-Zellinie handelt, in der sich das AIDS-Virus der Isolatbezeichnung HTLV-IIIB (zugehörig zu HIV-1) vermehrt [M. Popovic, M. G. Sarnagdharan, E. Reed und R. C. Gallo: Science, 224: 497, 1984, Sechoy et al., Exp. Cell Res., 185: 122, 1989, und Avramis et al., AIDS, 3: 417, 1989].

Versuchsdurchführung HIV-Infizierung von CEM-Zellen

CEM-Zellen [Sechoy et al., Exp. Cell Res., 185: 122, 1989, und Avramis et al., AIDS, 3: 417, 1989, und Popovic et al., Science: 224: 497, 1984] wurden mit Polybren (im Handel erhältliches Hexadimethrinbromid; 2 µg/ml) 30 Min. bei 37°C behandelt, polybrenfrei gewaschen und mit 2×10⁹ HTLV-III-Virusteilchen (isoliert aus CEM-Zellenkulturen nach Popovic, vgl. oben) pro 4 ×10⁵ CEM-Zellen infiziert. Ein nicht mit Arzneimittel behandelter Teil dieser Proben wurde als positive Kontrollprobe verwendet, wohingegen zu den Testproben unterschiedliche Konzentrationen an zu testender Verbindung - dem Lektin - gegeben wurden. Die HTLV-III-Reverse-Transkriptase-Aktivität dieser Kulturen wurde wie folgt analysiert.

Die Versuchsansätze auf Reverse-Transkriptase wurden in einer Reaktionsmischung (50 µl) durchgeführt, die 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM Dithiothreitol, 10 mM MgC12, 100 mM Kaliumchlorid, 0,01 Triton X-100 (C₈H₁₇-C₆H₄-(OCH₂CH₂)9-10-OH) oder NP40 (nicht-ionisches Detergens Nonidet P 40, Produktbezeichnung der Fa. Sigma, d. i- Octylphenyolethylenoxid-Kondensat), 10 µg/ml (dT)₁₅ · (A)_n (Hybridpolymere aus den Oligo- bzw. Polynucleotiden Oligodesoxythymidylsäure und Polyadenylsäure) als Templateprimer und ³H-Desoxythymidintriphosphat (³H-dTTP)enthielt. Die Reaktionsmischung wurde 1 h bei 37°C inkubiert, und die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µg Hefe-tRNA und 2 ml einer 10%igen Trichloressigsäurelösung (TCA), die 1 mM Natriumpyrophosphat enthielt, gestoppt. Die Proben wurden über Milliporefilter (0,45 µm) filtriert, zuerst mit 1%iger TCA- Lösung (5×) und anschließend mit 2 ml 70%igem Ethanol gewaschen. Die Filter wurden unter einer Heizlampe getrocknet, anschließend wurde Scintillationsflüssigkeit zugegeben und die Radioaktivität in einem β-Scintillationszähler bestimmt.

Immunofluoreszenz-Assay

Die Immunofluoreszenz-Assays wurden an Methanol : Aceton (1 : 1)- fixierten Zellen unter Verwendung monoklonaler Antikörper (aus der Maus) gegen HTLV-III p17 (Gag-Protein mit MG=17 000) und p24 (Gag-Protein mit MG=24 000) durchgeführt. Diese beiden Proteine sind Markerproteine, welche die Anwesenheit von Viruspartikeln in den Zellen anzeigen. Die HTLV-III-infizierten Zellen wurden mit oder ohne Arzneimittelbehandlung an Toxoplasmose-Slides fixiert. Nach der Fixierung mit Methanol- Aceton (1 : 1) während 30 Min. bei Raumtemperatur, wurden die Slides in versiegelten Plastikbehältern bei -20°C bis zum Gebrauch aufbewahrt. Die monoklonalen Antikörper wurden auf die Zellen gegeben, bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer 1 h inkubiert mit PBS (Phosphatpuffer), der 0,25% Triton x-100 enthält, 2 h gewaschen. Die Zellen wurden dann 1 h mit Fluorescein (FICT) markiertem Ziege-Antimaus-IgG (Capell Labs.) behandelt, und mit PBS-Puffer, der 0,25% Triton X-100 enthält, über Nacht gewaschen. Auf die Slides wurde 50%iges Glycerin gegeben, und die Zellfluoreszenz wurde mit einem Zeiss- Fluoreszenzmikroskop bestimmt.

Untersuchungsparameter 1. Zellwachstum

CEM-Zellen sowie mit HTLV-IIIB infizierte CEM-Zellen wurden in einer Konzentration von 0,2×10⁶ Zellen/ml Kulturmedium zum Beimpfen der Kultur verwendet. Nach 4tägiger Inkubation betrug die Dichte der nichtinfizierten CEM-Zellen 1,9×10⁶ Zellen/ml, während die Dichte der mit HTLV-IIIB infizierten CEM-Zellen lediglich 0,4×1 000 000 Zellen/ml war, diese beiden Werte bildeten die Kontrollwerte.

Dann wurden Proben von CEM-HTLV-IIIB-Zellen 0,2×10⁶ Zellen/ml 4 Tage mit unterschiedlichen Konzentrationen von Lektin behandelt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Es ist ersichtlich, daß das Lektin in den Konzentrationen zwischen 0,1 und 1,0 µg/ml signifikant (P<0,001) die Wachstumsrate von HIV-infizierten CEM-Zellen bis auf 339% steigert. Die Signifikanz wurde durch den Student's-t-Test ermittelt (Sachs, L.: Angewandte Statistik, Berlin: Springer- Verlag; pp. 209-216; 1984). Zwischen 0,3 und 1,0 µg/ml wird die Wachstumsrate von CEM-HTLV-IIIB-Zellen auf Werte gesteigert, die im Bereich der Kontrolle, nämlich der CEM-Zellen ohne HTLV- IIIB liegen.

2. Inhibierung der Produktion von Reverser Transkriptase durch CEM-HTLV-IIIB-Zellen, die mit dem Lektin behandelt wurden

Es wurde untersucht, ob die 4tägige Zugabe von Lektin zu CEM- HTLV-IIIB-Zellen die Produktion von HTLV-III-Viren einstellt. Als Maß für die Virusmenge im Kulturmedium wurde die Reverse Transkriptase gewählt. Also die Hemmung der Reversen Transkriptase zeigt Hemmung der Virusproduktion an. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt:

Es ist ersichtlich, daß im Überstand der CEM-HTLV-IIIB-Zeilen, die nicht mit Substanz behandelt wurden, eine beträchtliche Aktivität an Reverser Transkriptase vorlag. Die Zugabe der Substanz führt zu einer dosisabhängigen Verringerung der Reversen Transkriptase-Aktivität im Überstand. Bereits bei der Dosis von 0,03 µg/ml wurde eine beträchtliche Inhibierung beobachtet. Die erfindungsgemäß zur Anwendung kommende Verbindung ist deshalb in der Lage, die Zellen gegen eine Virusreplikation beinahe vollständig bei Dosen zu schützen, bei denen verschiedene in-vitro-Parameter, beispielsweise das Zellwachstum, nicht nachteilig beeinflußt werden.

3. Inhibierung der HTLV-IIIB-p15- und -p24-Expression in H9-HTLV- IIIB durch das Lektin

Es hat sich gezeigt, daß das Lektin eine stark inhibierende Wirkung auf die Expression von HIV p24 und p15 in infizierten CEM-Zellen besitzt. Wenn die Target-CEM-Zellen mit dem HTLV- IIIB-Isolat behandelt und ohne die zu testende Verbindung kultiviert wurden, wurden die CEM-Zellen infiziert, und es kam, wie mittels indirekten Immunofluoreszenz-Assays festgestellt, zur Expression des p24- und p15-Proteins. Nach Inkubierung der CEM-HTLV-IIIB-Zellen mit der zu testenden Verbindung wurde ein beinahe vollständiger Schutzeffekt beobachtet. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Es ist ersichtlich, daß das Lektin eine signifikante Reduktion der Expression der HTLV-III-Proteine p15 und p24 verursacht.

) Nachweis der Zytoprotektion von Lymphozyten ex vivo

Lymphozyten aus Milzen von NMRI-Mäusen wurden für die Untersuchungen benutzt. Hierzu wurden die Tiere mit dem Lektin mit den in der Tabelle angegebenen Dosen intraperitoneal für 5 Tage behandelt. Die Versuchsdurchführung wurde wie früher beschrieben [W. E. G. Müller, R. K. Zahn, A. Maidhof, H. C. Schröder, M. Bachmann und H. Umezawa, J. Antibiotics, 37, 239 (1984)] durchgeführt. Anschließend wurden die Tiere getötet und die Milz-Lymphozyten entsprechend unseren füheren Angaben gewonnen. Nachdem sie gewaschen waren, wurden sie in einer Konzentration von 5×10⁶ Zellen/ml in RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Kälberserum in 1-ml-Ansätzen inkubiert [G. Leyhausen et al., Anitmicrob. Agents Chemother., 26: 752, 1984]. Zur Bestimmung des Wachstumsverhaltens von Lymphozyten wurde der Einfluß auf die Inkorporation von radioaktivmarkiertem Thymidin (³H-dThd) in die DNA bestimmt. Die Versuchsbedingungen wurden wie früher beschrieben, durchgeführt [G. Leyhausen et al.; s. o.]. Die aus den Tieren, die mit den Substanzen wie oben angegeben, behandelt wurden, gewonnenen Lymphozyten wurden in Abwesenheit der Substanz ex vivo und in Anwesenheit von ³H-dThd für 24 Std. inkubiert.

Untersuchungsparameter 1) Einfluß von Letin auf die Inkorporationsrate von ³H-dThd in Lymphozyten aus Mäusen ex vivo

In Abwesenheit von Letin wurden in Lymphozyten eine Inkorporationsrate von 1,4×10³ Zerfälle pro Minute × 10⁶ Zellen gemessen.

Behandlung der Tiere mit Substanz (5 Tage) (mg/kg)
Inkorporation der Lymphozyten ex vivo (× 10³ Zerfälle pro Minute × 10⁶ Zellen)
ohne Substanz
27,4±3,9
CN-Lektin: @	1	32,8±4,5
3	49,3±4,9
10	62,9±7,9

Die Mittelwerte wurden aus 6 parallelen Ansätzen ermittelt.

Diese Untersuchungsreihe zeigt, daß nach einer Vorbehandlung der Mäuse mit Dosen von 3 bis 10 mg/kg an Letin für 5 Tage, die dann entnommenen Milz-Lymphozyten ex vivo eine signifikant erhöhte - bei 10 mg/kg auf 229,6% ansteigend [P<0,001] - DNA-Synthese aufweisen. Die Signifikanz wurde durch den Student's-t-Test ermittelt (Sachs, L.: Angewandte Statistik, Berlin: Springer-Verlag; pp. 209-216; 1984].

4. Einsatz des CN-Lektins in der Histologie

Zur histologischen Indentifizierung wurden gefrorene Hautstücke in Paraformaldehyd fixiert, in Tissue Tek eingebettet und mit einem Kryostat geschnitten. Die 2-µm-Schnitte wurden mit Fluoreszein-isothiocyanat-markiertem Lektin behandelt. Nach Waschen in 0,9% NaCl-Lösung wurden die Schnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop begutachtet. Einzelheiten sind in einer früheren Arbeit angegeben (Müller et al., 1987; Comp. Gerontol. Al: 40).

Die Ergebnisse zeigten, daß die Zellen im Stratum germinative selektiv angefärbt waren. Keine Färbung war z. B. im Stratum granulosum nachzuweisen.

Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung Beispiele für pharmazeutische Mittel

In den nachfolgenden Formulierungsbeispielen kann der Wirkstoff im Gemisch mit anderen Verbindungen eingesetzt werden.

Beispiel a
Tablettenformulierung
Wirkstoff
10 mg
Lactose	18 mg
Kartoffelstärke	38 mg
Gelatine	2 mg
Talkum	2 mg
Magnesiumstearat	0,1 mg

Beispiel b
Tablettenformulierung
Wirkstoff
10 mg
Kartoffelstärke	40 mg
Polyvinylpyrrolidon	5 mg

Die Tabletten werden mit einer gefärbten Zuckerschicht überzogen.

Beispiel c
Kapselformulierung
Wirkstoff
10 mg
Maisstärke	90 mg
Lactose	50 mg
Talkum	2 mg

Diese Mischung wird in Gelatinekapseln gefüllt.

Beispiel d
Flüssige orale Formulierung
Wirkstoff
2 g
Saccharose	250 g
Glucose	300 g
d-Sorbit	150 g
Agar-agar	0,15 g
Methylparaben	0,5 g
Propylparaben	0,05 g
Geschmackstoff (Orangengeschmack)	10 g
Tartazin, gelb @	Gereinigtes Wasser auf	1000 ml

Beispiel f
Flüssige orale Formulierung
Wirkstoff
2 g
Tragacanth	7g
Glycerin	50 g
Saccharose	400 g
Methylparaben	0,5 g
Propylparaben	0,05 g
Geschmackstoff (Geschmack von schwarzer Johannisbeere) @	Roter Farbstoff Nr. 2C.E.184	0,02 g
Gereinigtes Wasser auf	1000 ml

Beispiel g
Flüssige orale Formulierung
Wirkstoff
2,4 g
Saccharose	400 g
Tinktur von Bitterorangenschalen	20 g
Tinktur von Süßorangenschalen	15 g
Gereinigtes Wasser auf	1000 ml

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von Lektin aus dem Schwamm Chondrilla nucula.

2. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Lektin in Anspruch 1.

3. Verwendung des Lektines zur zytologischen Charakterisierung von Zellen.