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Diese Erfindung betrifft die Verwendung von mindestens einer
aromatischen polycyclischen Dionverbindung bei der
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer durch ein Retro-virus verursachten Krankheit.
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Seit vielen Jahren werden auf dem Gebiet der antiviralen
Therapie Medikamente gesucht, die in der Lage sind, die
eindringenden Pathogene zu töten, ohne die Wirtszelle zu
schädigen. Die Fähigkeit von Viren, physisch in eine Zelle
einzudringen und die biochemischen Mechanismen der Zelle in
Anspruch zu nehmen, um ihre Nachkommen fortzupflanzen, weist
wenige einzigartige biochemische Merkmale auf, welche die
Grundlage für die selektive Hemmung solcher Viren bilden
können. Nur wenige Verbindungen sind bekannt dafür, daß sie
eine selektive antivirale Aktivität besitzen. Insbesondere
gibt es eine weite Vielfalt von antiviralen therapeutischen
Mitteln wie etwa Azidothymidin (AZT), Dideoxycytidin,
Acyclovir, Ribavirin und Vibaradin, die ihre selektive Toxizität
der Tatsache verdanken, daß sie virale Funktionen wirksamer
hemmen können, als sie zelluläre Funktionen hemmen können.
Im allgemeinen sind diese Mittel gegen virale Polymerasen,
Phosphorylasen und Nukleotidkinasen gerichtet. Die
Verwendung dieser Wirkstoffe ist begrenzt aufgrund ihres engen
Spektrums an antiviraler Aktivität und ihrer toxischen
Nebenwirkungen, wenn sie systemisch einem Wirtsorganismus über
längere Zeiträume verabreicht werden.
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Interferone sind antivirale Polypeptide, die gegenwärtig bei
Menschen versuchsweise therapeutisch angewendet werden.
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Jedoch erscheint ihr therapeutischer Wert zur Zeit begrenzt.
Die Produktion und Reinigung von menschlichen Interferonen
erfordert mühsame Verfahrensschritte, die verfügbaren Mengen
sind begrenzt und auch das Auftreten von zytotoxischen
Wirkungen ist bekannt.
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In letzter Zeit ist es sehr bedeutsam geworden, Mittel zu
finden, die gegen Retroviren wirksam sind und insbesondere
gegen menschliches Immundefizienzvirus (HIV), welches für
das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) verantwortlich
ist.
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Deshalb werden unablässig neue antivirale Mittel und
insbesondere Mittel, die gegen Retroviren wirksam sind, gesucht,
welche eine hohe Virusabtötungsfähigkeit mit niedriger
Zell-Toxizität aufweisen und sich als resistent gegen
viele herkömmliche antivirale Mittel erwiesen haben.
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Derwent Abstract Nr. 304493, 1984 offenbart die Isolierung
eines antiviralen Mittels, welches wirksam gegen Herpes
simplex-Virus, Grippevirus, vesikuläres Stomatitisvirus,
Tollwutvirus und Hepatitis B-Virus ist, aus der Pflanze
Hypericum erectum.
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Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein
therapeutisches Mittel mit antiviraler Aktivität und niedriger
zellulärer Toxizität zur Behandlung einer durch ein Retrovirus
verursachten Krankheit bereitzustellen.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch die Verwendung von
mindestens einem aromatischen polycyclischen Dion, ausgewählt aus
Hypericin, Pseudohypericin und Salzen davon, zur Herstellung
eines Medikaments zur Behandlung einer durch ein Retrovirus
verursachten Krankheit.
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Es wurde unerwarteterweise entdeckt, daß bestimmte
aromatische polycyclische Dionverbindungen, beispielhaft
dargestellt durch Hypericin und Pseudohypericin, welche in
Pflanzen der Gattung Hypericum (Johanniskraut) vorhanden sind,
und die aus der Pflanze Hypericum triquetrifolium isoliert
worden sind, gegen Retroviren einschließlich von z.B.
Friend-Leukämie-Virus (FV), Strahlungsleukämie-Virus (RadLV)
und menschlichem Immundefizienz-Virus (HIV, auch bekannt als
HTLV III) wirksam sind.
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Die vorliegende Erfindung stellt pharmazeutische
Formulierungen zum Behandeln von Säugern bereit, welche an durch
Retroviren verursachten Krankheiten leiden, welche eine Menge
an Hypericin, Pseudohypericin oder Gemischen davon
enthalten, die wirksam ist, um solche Viren zu hemmen. Die
Formulierungen können auch physiologisch annehmbare Träger und
Salze einschließen.
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Figur 1 ist eine graphische Darstellung, die die chemische
Struktur von Hypericin zeigt.
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Figur 2 ist eine graphische Darstellung, die die chemische
Struktur von Pseudohypericin zeigt.
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Figur 3 ist ein Balkendiagramm, welches die Hemmung der
Aktivität der reversen Transkriptase von mit
Strahlungsleukämie-Virus infizierten Mauszellen nach der Behandlung mit
Pseudohypericin darstellt.
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Es ist nun unerwarteterweise entdeckt worden, daß bestimmte
aromatische polycyclische Dione einschließlich Hypericin
und Pseudohypericin antivirale Mittel sind, die gegen
Retroviren hochaktiv sind. Die anti-retroviralen Mittel sind
Verbindungen,
die aus der winterharten Pflanze Hypericum
triquetrifolium isoliert worden sind.
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So wie er hier verwendet wird bezieht sich der Ausdruck
Retrovirus auf Viren, die ein RNA-Genom und Enzymaktivität von
RNA-abhängiger DNA-Polymerase (reverse Transkriptase)
enthalten. Alle Retroviren haben gemeinsame morphologische,
biochemische und physikalische Eigenschaften, die ihre
Aufnahme in eine einzige Virusfamilie rechtfertigen. Diese
Parameter sind in Tabelle A unten zusammengefaßt.
Tabelle A
Allgemeine physikalische Eigenschaften von
bekannten Retroviren
Nukleinsäure lineare einzelsträngige Plus-RNA (60S-
70S) zusammengesetzt aus identischen
Untereinheiten (30S-35S); 5'-Struktur (m&sup7;G&sup5;ppp&sup5;-
NmpNp); polyadenyliertes 3'-Ende;
wiederholte Sequenzen an 3'- und 5'-Enden; tRNA-Basen
gepaart zu Genomkomplex
Protein etwa 60 Gew.-%; gag, innere Strukturproteine;
pol, reverse Transkriptase; env, Hüllproteine
Lipid etwa 35 Gew.-%; von der Zellmembran
abgeleitet
Kohlenhydrat etwa 4 Gew.-%; mit den Hüllproteinen
assoziiert
Physiochemische Eigenschaften Dichte 1,16-1,18 g/ml in Sucrose, 1,16-1,21
g/ml in Cäsiumchlorid; empfindlich für
Lipidlösungsmittel, Detergenzien und
Wärmeinaktivierung (56ºC, 30 min); hochbeständig gegen
UV- und Röntgenstrahlung
Morphologie kugelförmig eingehüllte Virionen (80-120 nm
Durchmesser), variable
Oberflächenausstülpungen (8 nm Durchmesser), icosaedrisches
Capsid welches einen Ribonukleoproteinkomplex
mit einer Kernhülle (Nukleoid) enthält
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Alle Retroviren haben ähnliche chemische
Gesamtzusammensetzungen. Im allgemeinen umfassen sie etwa 60 bis 70% Protein,
30 bis 40% Lipid, 2 bis 4% Kohlenhydrat und etwa 1% RNA. Die
Hülle von retroviralen Partikeln wird von der
Zelloberflächenmembran abgeleitet und die meisten, wenn nicht alle, der
Lipide in viralen Partikeln befinden sich in der
Einheitsmembranhülle des Virions. Beispiele von Retroviren schließen
Friend-Leukämie-Virus (FV), Strahlungsleukämie-Virus (RadLV)
und menschliches Immundefizienz-Virus (HIV) ein.
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Es ist nun überraschenderweise entdeckt worden, daß die in
der vorliegenden Erfindung verwendeten aromatischen
polycyclischen Dionverbindungen die Replikation von
Friend-Leukämie-Virus und Strahlungsleukämie-Virus sowohl in vivo als
auch in vitro in Mäusen hemmen. Noch überraschender ist, daß
diese Hemmung ohne erhebliche Toxizität für die behandelten
Säuger auftritt, wie in den Beispielen unten gezeigt ist,
worin Leberfunktionstests, wie die Werte der Enzyme
Lactatdehydrogenase (LDH) und Serumglutamylaminotransferase (SGOT)
und die von Bilirubin, die aufgrund der FV-Infektion erhöht
waren (und mit den pathogenen Wirkungen dieses Virus
verbunden sind) auf beinahe normale Werte nach der Verabreichung
der antiviralen Verbindungen der vorliegenden Erfindung
zurückkehrten.
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Der Merck-Index (10. Ausgabe, Seite 710) offenbart, daß
Hypericin ein Antidepressivum ist und daß "kleine Mengen eine
stimulierende und beruhigende Wirkung auf den menschlichen
Organismus zu haben scheinen". Zusätzlich heißt es, daß
Hypericin bei Aufnahme Lichtempfindlichkeit hervorruft;
Oxford, Raistick Biochem. J. 34, 790 (1940).
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Hypericin und Pseudohypericin weisen beide eine antivirale
Aktivität auf, wenn sie Mäusen nach einer retroviralen
Infektion verabreicht werden. Hypericin hemmte wirksam die
RadLV-Infektion und Pseudohypericin zeigte eine hemmende
Wirkung gegen die FV-Infektion in Mäusen wie im Beispiel II
unten gezeigt ist. Darüberhinaus führte ein 50:50-Gemisch
von Hypericin und Pseudohypericin zu einer beinahe
vollständigen Hemmung der reversen Transkriptase-Enzymaktivität von
RadLV-infizierten Mauszellen in Kultur, wie in Beispiel 2
unten gezeigt ist. Das gleiche Maß der Hemmung kann durch
Verabreichung von entweder Hypericin oder Pseudohypericin
allein erreicht werden.
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Die aromatischen polycyclischen Dione scheinen in der Lage
zu sein, die Blut-Hirnschranke zu passieren, da sie zuvor
als Beruhigungsmittel an Menschen verabreicht wurden. Dies
ist von Bedeutung weil im Fall von HIV, die Infektion des
Hirns und zentralen Nervensystems in infizierten Individuen
beobachtet worden ist. Es ist auch bekannt, daß HIV Zellen
des Gehirns und zentralen Nervensystems infizieren kann.
Tatsächlich ist in letzter Zeit gefunden worden, daß gp120,
ein viruskodiertes Polypeptid, direkt zytotoxisch für
Zellen neuronalen Ursprungs ist. Deshalb ist die Behandlung
von Säugern, die an Krankheiten leiden, die von diesen
viralen Agenzien verursacht werden, eine äußerst wichtige
Anwendung der vorliegenden Erfindung.
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Hypericin und Pseudohypericin können zum Behandeln von
Säugern verwendet werden, die an Infektionen leiden, welche
durch Retroviren verursacht sind. Diese antiviralen
Dionverbindungen werden vorzugsweise erhalten, indem sie aus
Pflanzen der Arten Hypericum extrahiert werden, wie es in
Beispiel 1 unten ausführlich beschrieben ist, oder alternativ
dazu können sie chemisch synthetisiert werden unter
Verwendung der Verfahren von Brockmann, M. et al., US-Patent Nr.
2,707,704 und von Brockmann, H. et al., Tetrahedron Letters,
23:1991-1994, 1974. Aufgrund der weiten Verbreitung und
Verfügbarkeit der Johanniskrautpflanze in der ganzen Welt und
dem relativ leichten und billigen Verfahren zur Extraktion
und Reinigung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung
(wie in Beispiel I unten beschrieben) ist das
Extraktionsverfahren bevorzugt, wenn kleine Mengen (d.h. Gramm)
gewünscht werden. Jedoch ist zur Herstellung von Mengen in
großem Maßstab (Kilogramm und größer) die chemische Synthese
bevorzugt.
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Hypericum ist eine Gattung aus der Familie Guttifereae. Es
ist auch mit den Familien Hypericaceae und Clusiaceae in
Beziehung gebracht worden. Die Gattung ist geographisch
ziemlich weit verbreitet. Sie ist für ihren Gehalt an
etherhaltigen Ölen und für das Auftreten von roten fluoreszierenden
Pigmenten in kleinen Drüsen bekannt, die unter anderem durch
die aromatischen polycyclischen strukturellen Verbindungen
Hypericin und Pseudohypericin (Figur 1 und 2) dargestellt
sind. Es wurde berichtet, daß Pflanzen der Gattung Hypericum
in weiten Teilen in Mittel- und Osteuropa, Asien, Nord- und
Südafrika wachsen. Zusätzlich gibt es Berichte von ihrem
Auftreten in bestimmten Teilen des amerikanischen
Kontinents, Australien und Neuseeland. Die Pflanze ist in dem The
Audubon Society Field Guide to North American Wild Flowers,
Eastern Region, Seite 558, Chanticleer Press, Inc., NY.
aufgeführt.
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Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten aromatischen
polycyclischen Dione können zur Behandlung von Säugern
verwendet werden, die an Krankheiten leiden, welche durch
Retroviren verursacht sind, wie etwa erworbenes
Immundefizienzsyndrom (AIDS). Aufgrund ihrer Wirkstärke und dem
Fehlen
einer Zell-Toxizität sind die aromatischen
polycyclischen Dione besonders nützlich als spezifische antivirale
therapeutische Mittel für diese Erkrankungen. Gegenwärtig
stehen keine Breitbandmittel zur Behandlung dieser
retroviralen Infektionen ohne damit einhergehender Zytotoxizität
zur Verfügung.
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Die vorliegende Erfindung schließt weiter die Verwendung von
Salzen oder anderen Derivaten von Hypericin oder
Pseudohypericin ein, welche ihre antivirale Aktivität beibehalten.
Salze, in welchen die Base vom alkalischen oder Amintyp ist,
sind besonders im Umfang der vorliegenden Erfindung
inbegriffen.
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Wenn Säuger behandelt werden, die an durch Retroviren
verursachten Infektionen leiden, kann die Bestimmung der am
meisten wirksamen Verbindung (oder Gemischen davon) zur
Behandlung des für die Infektion verantwortlichen speziellen
Retrovirus durch Routineversuche gewährleistet werden, wobei
geeignete in vitro-Systeme verwendet werden, wie diejenigen,
die in Beispiel IV unten für menschliches
Immundefizienzvirus oder in Beispiel II für FV- und Strahlungsleukämie-Virus
(RadLV) in Versuchstieren beschrieben sind.
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Wenn sie eingesetzt werden, um AIDS, Virämie (d.h. die
Anwesenheit von Virus im Blutstrom) oder Sepsis (virale
Kontamination von Körperflüssigkeiten), welche durch Retroviren
verursacht sind, zu behandeln, können die aromatischen
polycyclischen Dionverbindungen, die in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, oral, topisch oder vorzugsweise
parenteral verabreicht werden, und am meisten bevorzugt durch
eine intravenöse Verabreichung von Dosen, die zwischen 200
g und etwa 12000 ug pro Kilogramm (kg) Körpergewicht pro
Behandlung und vorzugsweise zwischen 400 und 4000 ug pro kg
Körpergewicht pro Behandlung liegen. Die Dauer und Anzahl
der Dosen oder Behandlungen, die erforderlich sind, um die
Erkrankung eines Patienten unter Kontrolle zu bringen,
variieren von Individuum zu Individuum, in Abhängigkeit von der
Schwere und dem Stadium der Erkrankung und dem Zustand des
Patienten. Eine typische Behandlung kann die intravenöse
Verabreichung von 1000 bis 3000 ug pro kg Körpergewicht von
einer oder mehreren der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Verbindungen umfassen. Die gesamte Dosis, die für
jede Behandlung erforderlich ist, kann in verteilten Dosen
oder in einer Einzeldosis verabreicht werden. Die
antivirale Behandlung kann ein- oder zweimal pro Woche oder
öfter verabreicht werden, entsprechend dem Zustand des
Patienten und dem Stadium der Erkrankung des Patienten.
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Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten aromatischen
polycyclischen Dionverbindungen können in herkömmlichen,
festen und flüssigen pharmazeutischen Formulierungen (z.B.
Tabletten, Kapseln, Dragees, injizierbaren und oral
verabreichbaren Lösungen) zur Verwendung bei der Behandlung von
Säugern, welche von Infektionen durch ein eine Hülle
tragendes Virus betroffen sind, eingearbeitet werden. Die
pharmazeutischen Formulierungen umfassen eine wirksame antivirale
Menge der aromatischen polycyclischen Dione (wie oben
offenbart) oder Gemische davon als individuelle Komponenten als
mindestens einer der aktiven Bestandteile. Die Menge der
durch jede Kapsel, Tablette oder Injektion zugeführten Dosis
ist relativ unwichtig, da die Gesamtdosis durch die
Verabreichung von einem oder einer Vielzahl von Kapseln,
Tabletten, Injektionen oder eine Kombination davon erreicht werden
kann. Zusätzlich kann eine solche Formulierung inerte
Bestandteile einschließlich von pharmazeutisch annehmbaren
Trägern, Verdünnungsmitteln, Füllstoffen, Salzen und anderen
in der Technik gut bekannten Materialien in Abhängigkeit von
der verwendeten Dosierungsform umfassen. Die eingesetzten
Kapseln können jedes pharmazeutisch annehmbare Material wie
Gelatine oder Zellulosederivate umfassen. Die Tabletten
können gemäß herkömmlichen Verfahren, welche feste Träger
einsetzen, die in der Technik gut bekannt sind, formuliert
werden. Beispiele von festen Trägern schließen Stärke, Zucker,
Bentonit und andere üblicherweise verwendete Träger ein. Zum
Beispiel kann eine bevorzugte parenterale Dosierungsform
eine sterile isotonische Salzlösung, die zwischen etwa 0,2
(200 ug) mg pro kg Körpergewicht und etwa 12 mg (12000 ug)
pro kg Körpergewicht von einem oder mehreren der
aromatischen polycyclischen Dione, welche in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden, oder Gemische davon enthält,
umfassen. Propylenglykol, Benzylalkohol, Ethanol oder andere
biologisch annehmbare organische Lösungsmittel können als
Verdünnungsmittel, Träger oder Lösungsmittel bei der
Herstellung von festen und flüssigen pharmazeutischen
Formulierungen, welche die in der vorliegenden Erfindung verwendeten
anti-retroviralen Verbindungen enthalten, verwendet werden.
Hypericin und Pseudohypericin können getrennt voneinander
oder kombiniert (gemischt) in einer einzigen Dosierungsform
verabreicht werden oder zur gleichen Zeit zusammen
verabreicht werden. Die Auswahl des speziellen Mittels, welches
eingesetzt werden soll, wird bestimmt durch die Bestimmung
der antiviralen Verbindungen oder des Gemisches, welches bei
einem bestimmten Patienten am besten wirkt.
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Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten aromatischen
polycyclischen Dione können in idealer Weise zur
gemeinsamen Verabreichung mit anderen Mitteln wie Immunsystemzellen,
Faktoren wie T-Zellen oder Interleukin-2, zytotoxischen
Mitteln, Lymphokinen wie Interferone, welche dafür bekannt
sind, daß sie eine gewisse Wirkung gegen Retroviren haben,
geeignet sein.
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Die vorliegende Erfindung wird unten in spezifischen
Ausführungsbeispielen beschrieben, die die Erfindung erläutern
sollen.
Beispiel I:
Extraktion von Hypericin und Pseudohypericin aus
Johanniskraut
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Hypericin (C&sub3;&sub0;H&sub1;&sub6;O&sub8;, Molekulargewicht 504,43), hierin als Hy
bezeichnet, und Pseudohypericin (C&sub3;&sub0;H&sub1;&sub6;O&sub9;, hierin als Ps
bezeichnet, Molekulargewicht 520,43) wurden wie unten
beschrieben erhalten.
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Das Kraut der ganzen Johanniskrautpflanze wurde während
ihrer Blütezeit (Juli bis Oktober in der östlichen
Hemisphäre) geerntet, bei 55ºC getrocknet, geschnitten und vermahlen
und dann mit Aceton (5 bis 10 1/kg) extrahiert. Ein kg des
Materials wurde in einen Soxhlet gegeben (Kimax, erhältlich
von Fisher Scientific, New Brunswick, NJ) und extrahiert,
bis das extrahierende Lösungsmittel farblos war (etwa 5 bis
10 hy. Die Lösung, welche die aromatischen polycyclischen
Dione enthielt, hatte eine rote fluoreszierende Farbe mit
Absorption von Fluoreszenzspektren wie in Scheibe Schentag.
Ber. 75: 2019, 1942, Brockmann H., Natureweiss 38: 47, 1951
beschrieben.
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Das Lösungsmittel (welches die aromatischen polycyclischen
Dione enthielt) wurde unter vermindertem Druck verdampft bis
zur vollständigen Trockne des Rückstands, was zu einer
Ausbeute von 95 g führte. Dieser Rückstand wurde dann weiter
auf einer Chromatographiesäule, die mit Silicagel 60 (0,06
bis 0,20 mm, Malinckrodt, American Scientific Products,
McGaw Park, IL) gepackt war, fraktioniert. Ein
trockenchromatographisches Verfahren wurde verwendet, wodurch 25 g des
oben erhaltenen Rückstands in etwa 500 ml Aceton gelöst
wurde, zu einer gleichen Menge von Silicagel 60 zugegeben wurde
und auf einem Rotavapor (Buchi, American Scientific
Products) unter Umschwenken verdampft wurde, bis das Gemisch
homogen und trocken war. Das Gemisch wurde dann auf eine
Säule aufgegeben, die 1 kg Silicagel 60 enthielt und mit
Chloroform eluiert, bis das Lösungsmittel den Boden der
Säule erreichte. Darauf folgte ein Waschen der Säule mit einem
Lösungsmittelgemisch, welches Chloroform-Aceton-Methanol
75:15:10 (Vol./Vol./Vol.) umfaßte. Als die rote Farbe 1/5
der ursprünglichen Intensität erreichte, wurde die
Konzentration des Chloroforms vermindert und die Säule mit einem
Lösungsmittelgemisch eluiert, welches Chloroform-Aceton-
Methanol im Verhältnis von 55:15:10 (Vol./Vol./Vol.)
umfaßte. Fraktionen von 250 ml wurden gesammelt. Jede Fraktion
wurde auf Dünnschichtchromatographieplatten (VWR, San
Francisco, CA) untersucht und der Rf-Wert der beiden
hauptsächlichen roten Fluoreszenzflecken unter
Ultraviolettlicht von 254 nm wurde bestimmt. Das
Entwicklungs-Lösungsmittelgemisch war Chloroform-Aceton-Methanol 55:15:10, wie
oben. Die Chromatographie war nach etwa 2 Tagen beendet.
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Eine weitere Reinigung und Trennung der zwei
Hauptkomponenten wurde durch zwei Blitzchromatographiedurchgänge unter
Verwendung eines Silicagel 60 (0,04-0,06 mesh (0,10 bis 0,15
mm)) unter Druck, wie in Gas Chromatography. Principles,
Techniques and Applications. A.B. Littlewood, hrsg. Academic
Press, New York 1970 beschrieben, erhalten.
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Zwei Hauptkomponenten wurden identifiziert: Hypericin (Hy),
Rf 0,45, in einer Ausbeute von 0,19 g; und Pseudohypericin
(Ps), Rf 0,35, in einer Ausbeute von 0,73 g. Die Analyse
des NMR-Spektrums der beiden Komponenten war die gleiche
wie die zuvor beschriebene (Brockmann, H., et al.,
Tetrahedron Letters, 1:37 1975).
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Die Verbindungen wurden bei 4ºC in absolutem Ethanol im
Dunkeln bis zur Verwendung gelagert.
Beispiel II:
Antivirale Aktivität in Säugern
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Die Wirkungen der in der vorliegenden Erfindung verwendeten
Verbindungen auf die Infektion von Säugern mit den
Retroviren Friend-Leukämie-Virus (FV) und Strahlungsleukämie-Virus
(RadLV) wurde wie folgt untersucht.
(1) Friend-Leukämie-Virus-Infektion
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Friend-Leukämie-Virus (FV), ein aggressives Retrovirus
führt eine akute Erythroleukämie in empfindlichen Stämmen
von Mäusen wie BALB/c- und NIH SWISS-Mäusen herbei (wie in
Friend, J. Ex-. Med., 105: 307-324, 1957; Friend, C. et al.
Nat. Cancer Inst. Monogr., 22: 505-522, 1966; Friend, C. et
al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 68: 378-383, 1971
beschrieben). Die bösartige Transformation ist das Ergebnis
der kombinierten Aktivitäten des Milzfocus-bildenden Virus
(SFFV) und des ökotropen Mäuse-Friend-Leukämie-Helfervirus
(F-MuLv). Die akute Erythroleukämie ist durch eine
Hepatosplenomegalie (eine deutliche Zunahme der Größe der Milz
und Leber) und eine schwere Anämie gekennzeichnet.
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Friend-Leukämie-Virus wurde hergestellt durch
Homogenisieren der vergrößerten Milz einer Maus, welche zuvor mit FV
infiziert worden war, 10 Tage nach einer intravenösen
Virusinjektion. Die Milz wurde in Phosphat-gepufferter Salzlösung
in einem Volumen, welches dem Zehnfachen des Gewichts der
isolierten Milz gleich war, homogenisiert.
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Die Wirkung von Hy und Ps auf die Zunahme der Milzgröße
(Splenomegalie) von BALB/c-Mäusen (Jackson Labs, Bar Harbor,
ME) wurde untersucht. In diesen Experimenten wurde das Virus
(10&sup6; Focus-bildende Einheiten - FFU) intravenös eingeimpft
und die angezeigten Dosen der antiviralen Verbindungen
dieser Erfindung wurden den BALB/c-Mäusen intraperitoneal 24
Std. später verabreicht. Die Tiere wurden dann 10 Tage
später getötet und ihre Milzen gewogen. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 1 unten zusammengefaßt.
Tabelle 1
Die Wirkung der Verabreichung der Verbindung Ps (verdünnt
in Phosphat-gepufferter Salzlösung mit 1% Ethanol) auf die
Splenomegalie in BALB/c-Mäusen nach einer Einimpfung mit
Friend-Erythroleukämie-Virus
Kontrollmäuse
mit FV geimpfte Mäuse
Milzgewicht (g)
Nettodifferenz zu Kontrolle
Friend-Virus
Injektionen PS 80 ug/Maus
Nettodifferenz zu Kontrolle
% Hemmung
Tabelle 1 (Fortsetzung)
Kontrollmäuse
Friend-Mäuse
Milzgewicht (g)
Nettodifferenz zu Kontrolle
Friend-Virus
Injektionen PS 80 ug/Maus
% Hemmung
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Die Daten in Tabelle 1 zeigen die Hemmung der Splenomegalie
mit einer mittleren Hemmung von 93,8% folgend auf eine
einzige Injektion von 80 ug Ps pro Maus. Eine mittlere Hemmung
von 89,6% der Milzvergrößerung wurde beobachtet, wenn 80 ug
Ps pro Maus in einer einzigen Dosis an Mäuse verabreicht
wurden, die zuvor mit 0,5 ml der Viruspräparation angeimpft
worden war (entsprechend 2 x 10&sup5; FFU Virus). Wenn zwei
täglich aufeinanderfolgende Injektionen von Ps, von denen jede
80 ug der Verbindung pro Maus umfaßte, verabreicht wurden,
betrug die mittlere Hemmung der Splenomegalie 90,7% mit
einer viralen Präparation, welche 10&sup6; FFU enthielt und 81,7%
mit einer viralen Präparation, die 2 x 10&sup5; FFU enthielt
(Tabelle 1).
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Die obigen Ergebnisse zeigen eine deutliche Abnahme der
bösartigen Transformierungsfähigkeit des Friend-Leukämie-Virus
(gemessen durch verminderte Splenomegalie) im Anschluß an
die intraperitoneale Verabreichung von Ps 24 Std. nach der
Infektion.
(2) Gemeinsame Verabreichung mit Friend-Leukämie-Virus
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Eine andere experimentelle Vorgehensweise wurde ebenfalls
untersucht, welche die gleichzeitige intravenöse gemeinsame
Verabreichung von Ps mit dem FV-Komplex einbezog. In diesem
Fall wurde die virale Präparation mit Ps bei verschiedenen
Konzentrationen vermischt und das Gemisch wurde in die
Schwanzvene der Maus in einem Endvolumen von 0,5 ml
injiziert. Die Mäuse wurden 10 Tage später getötet, die Milzen
gewogen und das Maß der Hemmung der Splenomegalie
anschließend bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2
zusammengefaßt.
Tabelle 2
Die Wirkung einer intravenösen gemeinsamen Verabreichung
von Pseudohypericin (verdünnt in PBS mit 1% EtOH) mit FV
auf viral induzierte Splenomegalie.
Milzgewichte (g)
Kontrollen
Experiment
% Hemmung im Vergleich
zu
der Gruppe, welche Ps in
PBS + 1% EtOH erhält
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Wie in Tabelle 2 oben gezeigt wurde eine 100%ige Hemmung der
Splenomegalie gefunden, wenn Ps mit dem viralen Komplex in
Konzentrationen von 20 ug pro Maus und 50 ug pro Maus
verabreicht wurde (durchschnittliches Mausgewicht annähernd 150
g). Eine mittlere Hemmung von 75,44% wurde gefunden, wenn 5
ug pro Maus zusammen mit dem Virus verabreicht wurden.
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Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit der Verbindungen der
vorliegenden Erfindung, insofern als nur 5 ug pro Maus
wirksam die virale Transformation durch dieses aggressive
RNA-Tumorvirus hemmten.
(3) Wirkung von Ps auf die Leberfunktion von FV-infizierten
Tieren
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Als weitere Demonstration der antiviralen Aktivität von Ps
wurde die Wirkung einer FV-Infektion in Gegenwart und
Abwesenheit von Ps auf Leberfunktionen untersucht, indem das
Serum von infizierten Mäusen auf Leber-assoziierte Proteine
hin analysiert wurde.
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BALB/c-Mäuse wurden mit FV in einer Konzentration von 2 x
10&sup5; FFU angeimpft. Jede Gruppe von Tieren enthielt 4 Mäuse,
und Analysen wurden in vereinigten Aliquots vorgenommen.
Tabelle 3
Wirkung von Friend-Virus mit oder ohne Ps (in PBS mit 1%
EtOH) auf Leberfunktionen
Cholesterin
Gesamtprotein
Albumin
PBS = Phosphat-gepufferte Salzlösung
IVFV = Intravenöse Verabreichung von Friend-Virus
IVFVIPPS= Intravenöse Verabreichung von Friend-Virus,
intraperitoneale Injektion der Ps-Verbindung
IPFV = Intraperitoneale Verabreichung von Friend-Virus
IPFVIVPS= Intraperitoneale Verabreichung von Friend-Virus,
intravenöse Injektion der Ps-Verbindung
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In Tabelle 3 ist BU = Gesamtes Bilirubin, AP = alkalische
Phosphatase, LDH = Lactatdehydrogenase, SGOT = Serum
Glutamyl-Aminotransferase, SGPT = Serum Glutamyl
Peptidyltransferase und GGT = Gamma-Glutamyl-Transpeptidase.
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Wie in Tabelle 3 gezeigt, führte die intravenöse Animpfung
mit FV zu einer Zunahme der LDH-, SGOT- und
SGPT-Enzymaktivität und zu einer gesteigerten gesamten
Serumbilirubinakkumulation in
infizierten Mäusen. Solche Zunahmen sind
Indikatoren der Schädigung der Leberfunktion, die gut bekannt
sind. Die Verabreichung von Ps, sowohl intravenös als auch
intraperitoneal, führte zu einer Verminderung dieser viral
induzierten Zunahmen.
(4) Antivirale Wirkung auf
Strahlungsleukämie-Virus-Infektion (RadLV)
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Die Animpfung mit Mäuse-Strahlungsleukämie-Virus in den
Thymus von empfänglichen Mäusestämmen führt zu der bösartigen
Transformation der Thymozyten und der Entwicklung einer
offenen Leukämie (wie in Meruelo, D., et al., J. Ex-. Med.,
147: 470-487, 1978 beschrieben). Es ist gezeigt worden, daß
diese Transformation mit dem
Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) zusammenhängt, welcher die Resistenz oder
Empfänglichkeit für die leukämieerzeugenden Wirkungen des Virus
bestimmt. Unter den frühen Vorgängen, die auf die virale
Infektion in einigen Mäusestämmen folgen, ist eine dramatische
Zunahme der Expression von Klasse I H-2-Antigenen auf der
Zelloberfläche. Auf diese Zunahme folgt eine Verminderung
der Expression dieser Antigene nach der bösartigen
Transformation und der anschließenden Entwicklung der Leukämie. Die
Änderungen der H-2-Antigenexpression sind verwendet worden,
um die virale Infektivität zu beobachten und die Wirkungen
von Hy und Ps auf das Maß der Infektivität dieses Virus zu
bestimmen.
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Mäuse-Strahlungsleukämie-Virus (RadLV) wurde in den Thymus
in B10.T(6R)-Mäuse, wie in Meruelo et al (oben) beschrieben,
eingeimpft. Gruppen von 6 Mäusen wurden 24 Std. später mit
30 ug der Verbindung Hy pro Maus behandelt, welche
intraperitoneal in isotoner Salzlösung verabreicht wurde. Die Mäuse
wurden 10 Tage später getötet und die Expression der Klasse
I H-2-Antigene durch Analyse mit einem
Fluoreszenz-aktivierten Zellsorter (Ortho Cytofluorograph Model 50H, Ortho
Diagnostic Systems, Westwood, MA) (FACS) bestimmt, wobei
X-56 anti-H-2Dd Maus-monospezifische Antikörper verwendet
wurden (wie in Meruelo et al. oben beschrieben; ähnliche
Antikörper sind als ATCC Nr. HB75, American Type Culture
Collection, Rockville, MD erhältlich). Die Ergebnisse sind
in Tabelle 4 unten gezeigt.
Tabelle 4
-
Die Wirkung von Hy und Ps auf die Zunahme der
H-2-Antigenexpression in Thymocyten nach der Animpfung von
Maus-Strahlungsleukämie-Virus in den Thymus in B10.T(6R)-Mäuse.
Tabelle 4
Grundlinie
virusinduziert
30 ug/Maus Hy
30 mg/Maus PS
(unbehandelte Mäuse)
(angeimpfte Mäuse)
(angeimpft mit RadLV und Hy)
% d.Zellen die mit Antikörper gefärbt sind
mittlere Fluoreszenzintensität
in Fluoreszenzeinheiten
(1) % Hemmung = 100 - [(behandelt 30 ug - (Grundlinie)/virusinduziert - Grundlinie] x 100 = 82%
-
Wie aus den Daten in Tabelle 4 ersichtlich ist bewirkte Hy
eine bedeutende Hemmung der Zunahme der H-2-Expression in
vier der sechs untersuchten Mäuse (Tabelle 4), was eine
signifikante Verminderung der Infektionsfähigkeit des Virus im
Anschluß an die intraperitoneale Verabreichung der
Verbindung Hy anzeigte. Dies trat noch 24 Std. nach der
anfänglichen viralen Animpfung ein. Bei der Verbindung Ps wurden
keine Wirkungen auf die von RadLV-infizierte H-2-Expression
gefunden.
Beispiel III:
Wirkungen von Ps und Hy auf die RNA-abhängige DNA-Polymerase
(Reverse Transkriptase)
-
Retroviren (RNA-Tumorviren) tragen in dem Virion das Enzym
Reverse Transkriptase, welches bei der Infektion der Zelle
mit dem Virus sich der zellulären synthetischen Maschinerie
bedient und eine komplementäre DNA (cDNA)-Kopie der Virion-
RNA unter Verwendung des viralen RNA-Genoms als Templat
transkribiert. Die Bestimmung der Höhe der Aktivität der
reversen Transkriptase (RT) in dem Wachstumsmedium von mit
Retroviren infizierten Zellen ist ein bekanntes Verfahren, mit
dem die Freisetzung von infektiösen Virenpartikeln durch
Zellen bestimmt wird und ist verwendet worden, um die
antivirale Aktivität der Komponenten der vorliegenden Erfindung
zu messen. Die Wirkung eines Gemisches aus sowohl Hy als
auch Ps bei einer Konzentration von 10 ug pro ml (von jeder
Verbindung) auf die RadLV-RT-Aktivität wurde untersucht.
-
Das Gemisch aus den beiden Komponenten wurde 2, 4 und 16
Std. nach der Infektion verabreicht und die Überstände
wurden gesammelt und auf RT-Aktivität nach dem Verfahren von
Stephenson et al., Virology, 48:749-756, 1972 und Weissbach
et al, J. Virol., 10:321-327, 1972 untersucht.
-
Der Test wurde wie folgt durchgeführt:
a) Präparation des Virus
-
RadLV-infizierte Lymphoblastoidzellen, Linie B10.T(6R)
wurden durch Zentrifugation bei 4ºC, 3500 Upm während 15 min
pelletiert. Die oberen 2/3 des Überstands (10 ml) wurden für
den Test entfernt. Der Überstand wurde dann bei 40000 Upm 1
Std. lang bei 4ºC in 12 ml Ultrazentrifugenröhrchen unter
Verwendung eines Festwinkel-Ultrazentrifugenrotors (Ti70
Rotor, Beckman Instruments, Fullerton, CA) zentrifugiert. Der
Überstand wurde vorsichtig abgegossen und die Röhrchen
getrocknet. Das Pellet wurde in 200 ul eines Puffers
resuspendiert, welcher 0,02M Tris/HCl, pH 7,8, 0,1M NaC1, 0,001M
Dithiothreitol und 0,2% Triton X-100 enthielt. Das Gemisch
aus dem Puffer und dem virushaltigen Pellet wurde mit einem
Vortex verwirbelt und auf Eis 30 min lang vor der Verwendung
inkubiert.
-
Der Reverse Transkriptase-Test wurde in einem Volumen von
100 ul durchgeführt, welches die folgenden Bestandteile
enthielt:
Tabelle 5
Reagensstammlösung
ul Stammlösung pro Assay
Endkonzentration pro Assay (100ul)
Lösung
Mn-Acetat
Dithiothreitol (DTT)
Triton X-100 (10%)
¹ von Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ
² von New England Nuclear, Boston, MA
-
50 ul des Reaktionsgemisches wurden mit 50 ul des oben
erhaltenen Überstands vermischt und 1 Std. lang bei 30ºC
inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 0,1 ml 0,06 M
Natriumpyrophosphat angehalten, mit einem Vortex
aufgewirbelt und auf Eis inkubiert. 2 ml 10%ige Trichloressigsäure
(TCA), welche 0,3 M Natriumpyrophosphat enthielt, wurden
zugegeben, das Gemisch mit einem Vortex verwirbelt und auf Eis
10 bis 20 min inkubiert. TCA-fällbare Radioaktivität wurde
nach Filtrationen von Proben unter Verwendung von
Glasfaserfiltern (2,4 cm Whatman GFC, Whatman, Clifton, NJ) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Figur 2 gezeigt.
-
Die Daten in Figur 2 zeigen, daß die Inkubation von mit
Viren infizierten Zellen mit dem 50:50 Gemisch aus Hy und
Ps zu einer mindestens 50%igen Abnahme der nachweisbaren
RT-Aktivität bei 2 und 4 Std. nach der Infektion führte
und weiter dieses Enzym um annähernd 75% hemmte, wenn 16
Std. nach der Infektion gemessen wurde.
Beispiel IV:
Hemmung von HIV durch die in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Verbindungen
-
Die Aktivität von Ps, Hy und Gemischen dieser gegen das
menschliche Immundefizienz-Virus (HIV) kann in der folgenden
Weise untersucht werden. HIV-infizierte OKT4+
-Lymphoblastoidzellen wie der Klon H9 (beschrieben in Popovic, M., et
al., Science, 224:497-500, 1984) werden in RPMI-1640-Medium
(Gibco, Grand Island, New York), welches 20% fötales
Kälberserum (Flow Laboratories, Inglewood, CA) enthält, gehalten.
Dreifache Kulturen von Zellen, die bei einer Konzentration
von etwa 4 x 10&sup5; Zellen pro ml ausgesät wurden, werden
Polybrene (2 ug pro ml, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)
ausgesetzt, mit 2 x 10&sup8; HTLV III-Partikeln pro 4 x 10&sup5;
H9-Zellen infiziert und in Gegenwart oder Abwesenheit von
Ps, Hy und Gemischen dieser, wie in Beispiel 2 oben,
kultiviert.
-
Die antivirale Aktivität der in der vorliegenden Erfindung
verwendeten Verbindungen wird bestimmt durch Verfolgen der
Aktivität der Reversen Transkriptase und der Expression von
HIV-Proteinen p24 und p17 wie in Sarin, P.S. et al., J.
Nat. Cancer Inst 78:663-665, 1987 beschrieben.
Beispiel V:
Expression der HTLV III gag-Proteine p24 und p17
-
H9-Zellen (2 x 10&sup5;), entweder nicht-infiziert oder mit HTLV-
III infiziert, werden kontinuierlich verschiedenen
Konzentrationen von Ps, Hy und Gemischen dieser bei
Konzentrationen zwischen 5 und 100 ug pro ml 4 Tage lang ausgesetzt. Der
Prozentsatz von Zellen, die p24 und p17 gag-Proteine von
HTLV-III exprimieren, wird bestimmt durch indirekte
Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von monoklonalen
Mausantikörpern gegen HTLV-III p17 und p24 (erhältlich aus
zahlreichen kommerziellen Quellen, wie denjenigen in HIV-
Serum-Antigennachweiskits von Abbott Labs, North Chicago,
IL, und von Du Pont, Wilmington, DE). Die positiven Zellen
werden durch die Behandlung mit Fluorescein-markierten
Ziegen-anti-Maus-IgG (Cappell Laboratories, Cochranville,
PA) sichtbar gemacht. Die Experimente werden zweifach
ausgeführt (mindestens dreimal).
Beispiel VI:
Bestimmung der Aktivität der Reversen Transkriptase
-
Uninfizierte H9-Zellen oder H9-Zellen, die mit HTLV-III
infiziert sind (500 Viruspartikel/Zelle) werden verschiedenen
Konzentrationen von Ps, Hy und Gemischen dieser, wie oben,
ausgesetzt. Am Tag 4 werden Überstände der Kulturen
gesammelt und Viruspartikel werden mit Polyethylenglykol gefällt
und durch Zentrifugation, wie oben in Beispiel 2 für FV
beschrieben, erhalten. Das Viruspellet wird in 300 ul Puffer,
welcher 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM Dithiothreitol, 250 mM
KCl und 0,25% Triton X-100 enthält, suspendiert. Die
Aktivität der Reversen Transkriptase in diesen Proben wird in
einem 50 ul-Reaktionsgemisch, welches 50 mM Tris-HCl (pH
7,5), 5 mM Dithiothreitol, 100 mM KCl, 0,01% Triton X-100,
10 ul dT&sub1;&sub5;rAn als Templatprimer, 10 mM MgCl&sub2;, 15 uM
[³H]dTTP (New England Nuclear, Boston, MA) und 10 ul
aufgebrochene Virussuspension enthält, analysiert. Nach der
Inkubation während 1 Std. bei 37ºC und nachfolgender Zugabe
von 50 ug Hefe-tRNA (Sigma Chemical, St. Louis, MO) wird
der Einbau in die in kalter Trichloressigsäure unlösliche
Fraktion wie in Beispiel 2 oben untersucht. Die Assays
werden zweifach durchgeführt und dreimal wiederholt.