DE3880290T2

DE3880290T2 - Enzym und verfahren zu seiner herstellung.

Info

Publication number: DE3880290T2
Application number: DE8888120985T
Authority: DE
Inventors: Akiko Fujiwara; Tatsuo Hoshino
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1987-12-24
Filing date: 1988-12-15
Publication date: 1993-09-02
Anticipated expiration: 2008-12-16
Also published as: EP0322666B1; DK708988D0; JP2726826B2; JPH01202282A; DE3880290D1; US5085993A; DK708988A; EP0322666A1

Description

Die neue coenzym-unabhängige L-Sorbosondehydrogenase, wie unten definiert, ist ein Enzym, das die Oxidation von L-Sorboson zu 2-Keto- L-gulonsäure (im Folgenden als 2-KGA bezeichnet) katalysiert. 2-KGA ist ein wichtiger Vorläufer für die Herstellung von Vitamin C.
Genauer betrifft die Erfindung die neue coenzym-unabhängige L- Sorbosondehydrogenase, die auf L-Sorboson einwirkt unter Bildung von 2-Keto-L-gluconsäure und die von einem Mikroorganismus stammt, der zur Gattung Pseudomonas gehört und wobei die Molekülstruktur aus einer einzigen homogenen Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 47 000 ± 5000 besteht, gemessen durch Natrium-dodecyl-sulfat/Polyacrylamidgel-Elektrophorese.
Reaktionen zur Umwandlung von L-Sorboson in 2-KGA unter Verwendung von Mikroorganismen sind bekannt. Die 2-KGA Bildung aus L-Sorboson unter Verwendung von zellfreien Extrakten von Mikroorganismen ist in verschiedenen früheren Veröffentlichungen angegeben. In der US-PS 3 907 639 wird berichtet, daß Mikroorganismen, die zur Gattung Acetobacter, Pseudomonas, Escherichia, Serratia, Bacillus, Staphylococcus, Aerobacter, Alcaligenes, Penicillium, Candida und Gluconobacter gehören zu einer solchen Umwandlung fähig sind. Ferner berichtet Kitamura et al., Europ. J. Appl, Microbiol., 2.1 (1975) daß das L-Sorboson oxidierende Enzym, das sich in Gluconobacter melanogenes IF03293 findet, weder ein Coenzym noch einen Elektronenakzeptor zur Entwicklung der Enzymaktivität benötigt. Markover et al., Biotechnol. Bioeng. 17 1485 (1975) berichtet über das Vorhandensein von L-Sorbosondehydrogenase-Aktivität in der teilchenförmigen Fraktion von Pseudomonas putida ATCC 21812, hat jedoch nichts darüber gesagt, daß die L-Sorbosondehydrogenase von Pseudomonas putida in Form eines homogenen Proteins iosoliert wurde. Daher wurden die physikalischchemischen Eigenschaften des Enzyms bisher noch nicht spezifiziert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein solches neues Enzym mit coenzym-unahhängiger L-Sorbosondehydrogenaseaktivität und ein Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms. Es hat sich gezeigt, daß das gereinigte Enzym, das von einer Membranfraktion von Zellen spezieller Mikroorganismen isoliert worden ist, die Oxidation von L-Sorboson zu 2-KGA katalysiert. Die vorliegende Erfindung wurde auf der Basis dieser Feststellung gemacht.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, das neue Enzym mit coenzym-unahhängiger L-Sorbosondehydrogenase-Aktivität zur Umwandlung von L-Sorboson zu 2-KGA zur Verfügung zu stellen. Es ist ein anderes Ziel, ein Verfahren zu entwickeln zur Erzeugung dieser neuen L- Sorbosondehydrogenase durch Züchtung eines Mikroorganismus, der zur Gattung Pseudomonas gehört, oder einer Mutante davon, die in der Lage sind, die neue L-Sorbosondehydrogenase in Zellen zu bilden, und Isolieren des Enzyms in reiner Form aus den Zellen. Diese Isolierung kann erreicht werden durch Aufbrechen der Zellen und Isolierung und Reinigung des Enzyms von dem zellfreien Extrakt der aufgebrochenen Zellen, vorzugsweise aus einer Membranfraktion der Mikroorganismen.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der gereinigten Probe der neuen coenzym-unabhängigen L-Sorbosondehydrogenase, die in den später angegebenen Beispielen hergestellt wurde, sind wie folgt:

1. Enzymaktivität

L-Sorbosondehydrogenase, d.h. das erfindungsgemäße Enzym katalysiert die Oxidation von L-Sorboson zu 2-KGA in Gegenwart eines Elektronenakzeptors, gemäß der folgenden Reaktionsformel:
L-Sorboson + Elektronenakzeptor T 2-KGA + reduzierter Elektronenakzeptor
Das Enzym verwertet keinen Sauerstoff als Elektronenakzeptor. Es kann jedoch irgend eine übliche Verbindung, die die Fähigkeit hat als Elektronenakzeptor zu wirken, zusammen mit dem erfindungsgemäßen Enzym angewandt werden, um L-Sorboson zu 2-KGA zu oxidieren. Als Elektronenakzeptor können 2,6-Dichlorphenolindophenol (im Folgenden als DCIP bezeichnet), Phenazin-methosulfat, Wurster's Blau, Ferricyanid, Coenzym Q oder Cytochrom C usw. verwendet werden.

Bestimmung der Enzymaktivität

Die Enzymbestimmung wurde bei 25ºC durchgeführt durch spektrophotometrische Messung der Abnahme der Absorption von DCIP bei 600 nm. Eine Einheit der Enzymaktivität wurde definiert als die Enzymmenge, die die Reduktion von 1 uMol DCIP pro min katalysiert. Der Extinktionskoeffzizient von DCIP bei pH 7,0 wurde als 9,45 mM&supmin;¹ angenommen.
Das Grundreaktionsgemisch wurde hergestellt durch Vermischen von 6 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,3 % Triton X-100, 0,45 ml 2,5 mM DCIP und 10,35 ml Wasser. Eine Cuvette mit einem Lichtweg von 1 cm enthielt 0,4 ml des Grundreaktionsgemisches,20 ul 10 mM Phenazin-methosulfat, 10 ul Enzymlösung und 20 ul 110 mM L- Sorboson-Lösung. Eine Bezugscuvette enthielt alle Reagenzien mit Ausnahme der Enzymlösung aber stattdessen 10 ul Wasser. Die Reaktion wurde gestaretet durch Zugabe des Substrats.

2. Substratspezifität

Die Substratspezifität des Enzyms wurde bestimmt unter Anwendung der gleichen Enzymsbestimmungsmethode, wie oben unter 1. beschrieben, mit der Ausnahme, daß 20 ul jeder der verschiedenen Substratlösung (100 mM) anstelle von L-Sorboson verwendet wurden. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 1 angegeben. Es wurde festgestellt, daß das erfindungsgemäße Enzym auf eine Vielfalt von Aldehydverbindungen wirkt. Tabelle 1 Substrat-Spezifität der coenzym-unabhängigen L-Sorbosondehydrogenase von P. putida ATCC 21812 Substrat Relative Aktivität (%) L-Sorboson Methylglyoxal Glyoxal Glutaraldehyd Glycerinaldehyd Glykolaldehyd Propionaldehyd Glyoxilsäure Benzaldehyd Acetylaldehyd L-Idose D-Mannose D-Fructose D-Glucose L-Sorbose

3. Optimaler pH Wert

Der Zusammenhang zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit der L- Sorbosondehydrogenase und dem pH Wert wurde in Kaliumphosphat- und Tris-HCl Puffern bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Das Enzym zeigte die höchte Enzymaktivität in einem pH Bereich zwischen etwa 7,0 und etwa 8,0 Tabelle 2 Optimaler pH Wert für coenzym-unabhängige L-Sorbosondehydrogenase von P. putida ATCC 21812 Puffer (0,1 M) Relative Aktivität (%) Kaliumphosphat

4. pH Stabilität

Das gereinigte Enzym wurde zu den Puffern mit verschiedenen pH Werten 24 h bei 4ºC zugesetzt. Die Restaktivität wurde unter den Standardbestimmungsbedingungen bestimmt, wie oben unter 1. angegeben. Die Ergebnisse der Messungen sind in Tabelle 3 angegeben. Das gereinigte Enzym war verhältnismäßig stabil bei alkalischem pH Wert und wurde mit Zunahme der Azidität instabiler. Tabelle 3 pH Stabilität von coenzym-unabhängiger L-Sorbosondehydrogenase von P. putida ATCC 21812* Puffer Relative Aktivität Acetat Kaliumphosphat * Das gereinigte Enzym wurde 24 h bei 4ºC bei dem angegebenen pH Wert gehalten und die restliche Aktivität bei pH 7,0 gemessen.

5. Wärmbestabilität

Das gereinigte Enzym wurde 10 min bei unterschiedlichen Temperaturen in 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) behandelt und dann sofort in Eiswasser gekühlt.
Die noch vorhandene Aktivität wurde unter den Standardbestimmungsbedingungen, wie unter 1. oben angegeben, gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 angegeben. Dieses Enzym war instabil und verlor etwa die Hälfte seiner Aktivität durch 10 min lange Behandlung bei 30ºC. Tabelle 4 Thermostabilität der coenzym-unabhängigen L-Sorbosondehydrogenase von P. putida ATCC 21812* Temperatur (ºC) Relative Aktivität (%) * Das gereinigte Enzym wurde bei der angegebenen Temperatur 10 min behandelt und die verbliebene Aktivität bei pH 7,0 gemessen.

6. Optimale Temperatur

Die Enzymaktivitäten von L-Sorbosondehydrogenase wurden bei Temperaturen von 10ºC bis 40ºC in dem Reaktionssystem wie oben unter 1. angegeben gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 angegeben. Dieses Enzyms zeigte seine optimale Temperatur zwischen etwa 20ºC und 40ºC. Tabelle 5 Optimale Temperatur der coenzym-unabhängigen L-Sorbosondehydrogenase von P. putida ATCC 21812* Temperatur (ºC) Relative Aktivität (%) * Die Abfangsreaktionsgeschwindigkeiten des Enzyms wurden miteinander verglichen.

7. Molekulargewicht

Das gereinigte Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 51,5 Einheiten je mg Protein wurde mit Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt und auf das Molekulargewicht der Untereinheit durch SDS-Polyacrylamid-gel- Elektrophorese untersucht. Es zeigte sich, daß das Enzym aus einer einzigen homogenen Untereinheit besteht mit einem Molekulargewicht von 47 000 ± 5000.

8. Messung des Km-Werts

Bei dem oben unter 1. angegebenen Verfahren wurden die Geschwindigkeiten der Oxidationsreaktionen mit unterschiedlichen Konzentrationen an L-Sorboson gemessen, um die anscheinende Michaelis-Konstante (Km) für L-Sorboson zu bestimmen. Der Km-Wert wurde berechnet zu 13 ± 2 mM mit DCIP und Phenazin-methosulfat als Elektronenakzeptoren.

9. Wirkung von Metallionen

Unter Anwendung des oben unter 1. beschriebenen Bestimmungsverfahrens wurde die Wirkung verschiedener Metallionen auf die Enzymaktivität untersucht. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle VI angegeben. Cu²&spplus; und Mn²&spplus; hemmten das Enzym stark. Tabelle 6 Wirkung von Metallionen auf coenzym-unabhängige L-Sorbosondehydrogenase von P. putida ATCC 21812 Metallion Konzentration (mM) Relative Aktivität (%) keines

10. Wirkung von Inhibitoren

Unter Anwendung des oben unter 1. beschriebenen Bestimmungsverfahrens wurde die Wirkung von Ihibitoren auf die Enzymaktivität untersucht.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 angegeben. Natriumazid und Monoiodacetat hemmten die Enzymaktivität leicht. Tabelle 7 Wirkung von Inhibitoren auf coenzym-unabhängige L-Sorbosondehydrogenase von P. putida ATCC 21812 Inhibitor Konzentration (mM) Relative Aktivität (%) Keines

11. Prosthetische Gruppe

Das Absorptionsspektrum des gereinigten Enzyms zeigte einen Peak bei etwa 350 nm und eine breite Schulter bei 380 bis 420 nm im sichtbaren Bereich. Diese Absorptionsmaxima waren charakteristisch für Chinoproteinenzym, das eine Pyrrolochinolin-chinon-Gruppe (im Folgenden als PQQ bezeichnet) als prosthetische Gruppe enthielt.

12. Wirkung der Zugabe von PQQ auf die Enzymaktivität

Unter Anwendung des oben unter 1. beschriebenen Bestimmungsverfahrens wurde die Wirkung der Zugabe von PQQ auf die Enzymaktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 angegeben. Eine deutliche Zunahme der Enzymaktivität wurde bei dem Zusatz von PQQ beobachtet. Tabelle 8 Wirkung von PQQ auf die Aktivität von coenzym-unabhängiger L-Sorbosondehydrogenase von P. putida ATCC 21812 PQQ-Konzentration (uM) Relative Enzymaktivität (%)

13. Reinigungsverfahren

Die Reinigung von coenzym-unabhängiger L-Sorbosondehydrogenase kann nach bekannten Reinigungsverfahren bzw. durch eine Kombination bekannter Reinigungsverfahren durchgeführt werden, wie Ionenaustauscher- Chromatographie, Absorptions-Chromatographie, Gelfiltration, Gel- Elektrophorese Aussalzen und Dialyse.
Die erfindungsgemäß vorgesehene coenzym-unabhängige L-Sorbosondehydrogenase kann hergestellt werden durch Züchten eines entsprechenden Mikroorganismus, Aufbrechen der Zellen und Isolieren und Reinigen aus dem zellfreien Extrakt der aufgebrochenen Zellen, vorzugsweise von der Mambranfraktion des Mikroorganismus.
Die für die vorliegende Erfindung angewandten Mikroorganismen sind Mikroorganismen, die zur Gattung Pseudomonas gehören oder Mutanten davon, vorzugsweise Pseudomonas putida.
Mikroorganismen die zur Gattung Pseudomonas gehören, die für die vorliegende Erfindung verwendet werden, können isoliert werden aus natürlichen Quellen oder sind in Kultursammlungen erhältlich. Die davon abgeleiteten Mutanten können ebenfalls erfindungsgemäß verwendet werden.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Mutanten können erhalten werden durch Behandlung eines wilden Stammes mit einem Mutagen wie UV-Strahlung, Röntgenstrahlung, γ-Strahlung oder durch Kontakt mit salpetriger Säure oder anderen geeigneten Mutagenen oder durch Isolieren eines Klons, der durch spontane Mutation entsteht. Diese Mutationen eines wilden Stammes oder eines Mutanten-Stammes davon können auf jede an sich bekannte Weise für die dem Fachmann bekannten Zwecke erhalten werden. Viele dieser Methoden wurden in verschiedenen Veröffentlichungen beschrieben z.B. "Chemical Mutagens" hergestellt von Y. Tajima, T. Yoshida und T. Kada, verlegt bei Kodansha Scientific Inc., Tokyo, Japan 1973.
Beispiele der erfindungsgemäß besonders bevorzugten Stamme sind Pseudomonas putida ATCC 21812 und ähnliche. Pseudomonas putida ATCC 21812 ist erhältlich von der American Type Culture Collection (12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA).
Der Mikroorganismus kann in einem wäßrigen Medium gezüchtet werden, das ergänzt ist mit geeigneten Nährstoffen unter aeroben Bedingungen. Die Züchtung kann bei pH 4,0 bis etwa 8,0, vorzugsweise von 5,5 bis 7,5, durchgeführt werden. Die Züchtungszeit variiert in Abhängigkeit von dem Nährmedium und beträgt vorzugsweise etwa 10 bis 100 Stunden. Ein bevorzugter Temperaturbereich zur Durchführung der Züchtung liegt bei etwa 10ºC bis 40ºC, vorzugsweise bei 25ºC bis 35ºC.
Es ist üblicherweise erforderlich, daß das Kulturmedium Nährstoffe enthält, z.B. Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff wie Glycerin, D- Mannit, D-Sorbit, Erythrit, Ribit, Xylit, Arabit, Inosit, Dulcit, D- Ribose, D-Fructose, D-Fructose, D-Glucose, Gluconat, Maltose und Sacharose, vorzugsweise D-Sorbit oder Glycerin, Quellen für verwertbaren Stickstoff, wie organische Substanzen, z.B. Pepton, Hefeextrakt, Soyabohnenmehl und Maiswasser und anorganische Substanzen, z.B. Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Kaliumnitrit, Vitamine und Spurenelemente.
Im Folgenden wird eine Ausführungsform zur Isolierung und Reinigung von L-Sorbosondehydrogenase aus den Mikroorganismen nach der Züchtung kurz beschrieben.
1. Zellen werden von der Fermentationsbrühe durch Zentrifugieren geerntet.
2. Die Zellen werden in einer Pufferlösung suspendiert und mit Hilfe eines Homogenisators, Sonikators oder Behandlung mit Lysozym und ähnlichem aufgebrochen, um eine Lösung von aufgebrochenen Zellen zu erhalten.
3. L-Sorbosondehydrogenase wird aus dem zellfreien Extrakt der aufgebrochenen Zellen, vorzugsweise von der Membranfraktion der Mikroorganismen isoliert und greinigt.
Die erfindungsgemäß vorgesehene L-Sorbosondehydrogenase ist geeignet als Katalysator zur Herstellung von 2-KGA aus L-Sorboson. Die Reaktion sollte bei pH Werten von etwa 5,0 bis etwa 10,0 in Gegenwart eines Elektronenakzeptors, z.B. DCIP, Phenazin-methosulfat, Wurster's Blau, Ferricyanid, Coenzym Q, Cytochrom C und ähnlichem in einem Lösungsmittel wie Phosphatpuffer, Tris-HCl-Puffer und ähnlichem durchgeführt werden. Ein bevorzugter Temperaturbereich zur Durchführung der Reaktion liegt bei etwa 10ºC bis etwa 50ºC. Wenn der pH Wert und die Temperatur auf etwa 7,0 bis 8,0 bzw. 30ºC eingestellt werden, führt die Reaktion üblicherweise zu den besten Ergebnissen.
Die Konzentration an L-Sorboson in einem Lösungsmittel variiert in Abhängigkeit von anderen Reaktionsbedingungen; im allgemeinen ist es jedoch erwünscht, daß sie etwa 10 bis 100 g/l, insbesondere etwa 30 bis 40 g/l beträgt.
Bei der Reaktion kann das Enzym auch in immobilisierter Form mit einem geeigneten Träger verwendet werden. Irgendein allgemein bekanntes Mittel zur Immobilisierung von Enzymen kann angewandt werden. Z.B. kann das Enzym direkt an eine Membran, an Körner oder ähnliches aus einem Harz mit (einer) funktionellen Gruppe(n) gebunden werden oder es kann über Brückenverbindungen mit (einer) bifunktionellen Gruppe(n) z.B. Glutaraldehyd an das Harz gebunden werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung

Beispiel 1

Herstellung von L-Sorbosondehydrogenase

1. Züchtung von P. putida ATTC 21812

Die Agarschrägen-Kulturen von P. putida wurde aufgeimpft auf 5 ml eines Mediums bestehend aus 70 g/l Gycerin, 15 g/l Hefextrakt (Oriental Co., Ltd.) und 2,5 g/l MgSO&sub4;.7H&sub2;O in einem Reagenzglas und 2 Tage bei 30ºC auf einer Schüttelvorrichtung (280 UpM) inkubiert. 2 ml dieser Kultur wurden in 100 ml des gleichen Mediums in einen 500 ml Erlenmeyer-Kolben übertragen und 20 min auf einem Rotationsschüttler (180 UpM) bei 30ºC gezüchtet. Die so hergestellte Kultur (400 ml) wurde als Inokulum für einen 30 l Fermenter, enthaltend 20 l des gleichen Mediums verwendet. Der Glaszylinder-Fermenter wurde bei 30ºC mit 250 UpM gerührt und 20 l/min belüftet. Nach 40stündiger Fermentation wurde die Kultur durch Zentrifugieren (8000 UpM, 10 000 g) geerntet, um die Zellen zu sammeln. Aus 20 l Brühe wurde 920 g (Naßgewicht) Zellen erhalten. Die Zellen wurden bis zur Verwendung bei -20ºC gefroren.

2. Herstellung einer Membranfraktion

Die gefrorenen Zellen von P. putida (760 g Naßgewicht) wurden aufgetaut und in 3800 ml 0,85%iger NaCl-Lösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann mit einem Dyno Mill Homogenisator (Willy A. Bachofen Co., Basel) in Gegenwart von Glasperlen (0,1 mm Durchmesser) 4 min bei 4ºC mit 2000 UpM homogenisiert.
Das so hergestellte Homogenisat wurde 10 min mit 1800 x g zentrifugiert, um die Zelltrümmer und Glasperlenen zu entfernen. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde 60 min mit 80 000 x g zentrifugiert und dann der Niederschlag als Membranfraktion (266 g) gewonnen.

3. Lösen der L-Sorbosondehydrogenase aus der Membranfraktion

Die Membranfraktion (266 g, Naßgewicht) wurde in 1100 ml 5 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0, enthaltend 1 % Triton X-100 suspendiert, 15 h gerührt und 1 h mit 80 000 x g zentrifugiert, um den Überstand zu erhalten. Der so erhaltene Überstand (1000 ml) wurde gegen 20 l 10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0, enthaltend 0,1 % Triton X-100 15 h dialysiert und verwendet zur Säulenchromatographie mit DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia Fine Chemicals).

4. Säulenchromatographie mit DEAE-Sepharose CL-6B (I)

Der dialysierte Überstand wurde auf eine DEAE-Sepharose CL-6B-Säule (Durchmesser 3,8 x 30 cm) aufgebracht, die mit dem gleichen Puffer wie oben unter 3 äquilibriert war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und das Enzym eluiert mit einem linearen Gradienten von NaCl bis 0,5 M.

5. Säulenchromatographie mit DEAE-Sepharose CL-6B (II)

Die aktiven Fraktionen aus der vorigen Stufe wurden zusammengegeben und gegen den gleichen Puffer, wie oben unter 3 beschrieben, 15 h dialysiert und dann auf eine DEAE-Sepharose (Diethylaminoethylagarose) CL-6B Säule (Durchmesser 2,5 x 25 cm) aufgebracht, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und das Enzym eluiert mit einem linearen Gradienten von NaCl bis 0,3 M.

6. Säulenchromatographie DEAE (Diethylaminoethyl-polyvinyl) -Toyopearl 650 s (Toyo Soda)

Die aktiven Fraktionen aus der obigen Stufe wurden zusammengegeben und gegen den gleichen Puffer, wie oben unter 3 beschrieben, 15 h dialysiert und dann auf eine Säule mit DEAE-Toyopearl 650 s (Durchmesser 2,0 x 20 cm) aufgebracht, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und das Enzym dann mit einem linearen Gradienten von NaCl bis 0,1 M eluiert.

7. Säulenchromatographie mit Hydroxyapatit HCA 100S (Mitsui Toatsu)

Die aktiven Fraktionen von der vorigen Stufe wurden zusammengegeben und gegen 1 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) enthaltend 0,1 % Triton X-100 15 h dialysiert und dann auf eine Hydroxyapatit HCA 100S-Säule (Durchmesser 2,0 x 10 cm) aufgebracht, die mit dem gleichen Puffer äquilibiert war. Das Enzym wurde mit dem gleichen Puffer eluiert.

8. Säulenchromatographie mi TSK-GEL (Polyvinyltyp) Toyopearl HW 60 S (Toyo Soda) I und II

Die aktiven Fraktionen der vorigen Stufe wurden zusammengegeben und durch Ultrafiltration unter Verwendung des Membranfilters (Diaflo PM- 30, Aicon; Pulysulfon-Typ; Fraktionierungsgröße: MG 30 000) auf ein kleines Volumen (ca. 2 ml) eingeengt. Dann wurde das Konzentrat auf eine mit TSK-GEL Toyopearl HW 60 S gepackte Säule (Durchmesser 1,5 cm x 80 cm) in 10 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0, enthaltend 0,1 % Triton X-100) aufgebracht. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer entwickelt. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengegeben, eingeengt und erneut auf der gleichen Säule chromatographiert.
Eine Zusammenfassung des Reinigungsverfahrens von L- Sorbosondehydrogenase ist in Tabelle 9 angegeben.

9. Elektrophoretische Analyse

Das genreinigte Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 51,5 Einheiten je ml Protein wurde mit Natriumdodecylsulfat (SDS) behandelt und auf seine Reinheit Durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese untersucht. Es erwies sich, daß das Enzym aus einer einzigen homogenen Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 47 000 ± 5000 bestand.

10. Identifizierung des Reaktionsproduktes

Das Reaktionsgemisch, enthaltend 0,4 ml der gereinigten Enzymlösung, 0,05 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 0,05 ml 0,5 M L-Sorboson und 0,02 ml 0,2 M Phenazinmethosulfat, wurde 60 min bei 30ºC inkubiert. Das Reaktionsprodukt wurde durch Dünnschichtchromatographie und Hochleistungsflüssigkeitschromatographie analysiert. Als Ergebnis davon wurde das Produkt im Vergleich mit einer autentischen Probe als 2-Keto-L-gluconsäure identifiziert. Tabelle 9 Reinigung von L-Sorbosondehydrogenase von Pseudomonas putida
Fraktion Gesamtprotein (mg) Gesamt-Aktivität (Einheiten) Spezifische Aktivität (Einh./mg Protein) Ausbeute (%) Solubilisierte Fraktion DEAE-Sepharose CL-6B DEAE-Toyopearl 650S Hydroxyapatit HCA TSK GEL Toyopearl HW60S

Beispiel 2

Das Reaktionsgemisch, enthaltend 5 ml gereinigte coenzym-unabhähgige L-Sorbosondehydrogenase (Gesamtaktivität 206 Einheiten) wie sie auf die in den Stufen 1 bis 8 des Beispiels 1 beschriebene Weise hergestellt worden war, 1 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 1 ml 1M L-Sorboson-Lösung, 0,2 ml 0,2M Phenazin-methosulfat-Lösung und 2,8 ml Wasser wurde unter leichtem Schütteln bei 25ºC inkubiert. Als Ergebnis wurde 2-KGA mit einer Geschwindigkeit von 350 mg/h gebildet.

Claims

1. Die neue coenzym-unabhängige L-Sorbosondehydrogenase, die aus L-Sorbeson 2-Keto-L-gulonsäure produziert, stammend aus einem Mikroorganismus des Genus Pseudomonas und deren molekulare Struktur aus einzelnen, homogenen Untereinheiten mit dem Molekulargewicht 47,000±5,000 besteht, bestimmt mittels Natrium- dodecyl-sulfat-polyacrylamid-gel-elektrophorese.

2. Die Dehydrogenase gemäss Anspruch 1 mit den folgenden physicochemischen Eigenschaften:

a) prosthetische Gruppe: Pyrrolochinolin-chinon

b) optimaler pH: ca. 7 - ca. 8

c) optiinaie Temperatur: ca. 20ºC - ca. 40ºC

d) Thermostabilität: unstabil bei Temperaturen über ca. 30ºC

e) Hemmung: durch Cu²&spplus; und Mn²&spplus; Ionen.

3. Coenzym-unabhängige L.Sorbosondehydrogenase gemäss Anspruch 1, welche ein membran-gebundenes Enzym von Pseudomonas putida ATCC 21812 oder eine Mutante davon mit derselben Funktion wie der Elternstamm darstellt.

4. Verfahren zur Herstellung einer neuen, coenzym-unabhängigen L-Sorbosondehydrogenase gemäss Anspruch 1, dadurch gezeichnet, dass man in einem Kulturmedium einen Mikroorganismus des Genus Pseudomonas oder eine Mutante davon mit der Fähigkeit der Produktion der neuen coenzym-unabhängigen L-Sorbosondehydrogenase in den Zellen kultiviert, gefolgt vom Zertrümmern der Zellen, Isolierung und Reinigung des Enzyms aus dem zellfreien Extrakts dieser Zellen, vorzugsweise aus der Membranfraktion der Zellen.

5. Verfahren gemäss Anspruch 4, worin der Mikroorganismus Pseudomonas putida ATCC 21812 oder eine Mutante davon mit derselben Funktion wie der Elternstamm ist.

6. Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, dadurch gezeichnet, dass man L-Sorboson in Anwesenheit eines Katalysators oxydiert, wobei dieser Katalysator das Enzym mit L-Sorboson- dehydrogenase-aktivität des Anspruchs 1 darstell.t

7. Verwendung des Enzyms des Anspruchs 1 bei der mikrobiellen Herstellung von 2-Ketogulonsäure.