DE69332331T2

DE69332331T2 - Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase

Info

Publication number: DE69332331T2
Application number: DE69332331T
Authority: DE
Inventors: Asakura Akira; Hoshino Tatsuo
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1992-12-30
Filing date: 1993-12-20
Publication date: 2003-05-22
Anticipated expiration: 2013-12-21
Also published as: DK0606621T3; US5932463A; EP0606621A3; EP0606621A2; JPH07182A; ES2181681T3; US5916785A; EP0606621B1; US5437989A; JP3590647B2; ATE224949T1; DE69332331D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Alkohol/Aldehyddehydrogenase (im Folgenden als AADH bezeichnet), ein Verfahren zur Herstellung derselben und ein Verfahren, um Aldehyde, Carbonsäuren und Ketone, insbesondere 2-Keto-L- gulonsäure (im Folgenden als 2-KGA bezeichnet) unter Verwendung dieses Enzyms herzustellen.
Die erfindungsgemäß bereitgestellte AADH katalysiert die Oxidation von Alkoholen und Aldehyden und kann daher die entsprechenden Aldehyde und Ketone aus Alkoholen erzeugen und Carbonsäuren aus Aldehyden. Genauer katalysiert die erfindungsgemäß bereitgestellte AADH die Oxidation von L-Sorbose zu 2-KGA über L-Sorboson. 2-KGA ist ein wichtiges Zwischenprodukt zur Herstellung von Vitamin C.
Es ist bekannt, dass es Enzyme gibt, die die Oxidation von Alkoholen und Aldehyden zu Aldehyden bzw. Carbonsäuren katalysieren und ein Pyrrolochinolinchinon (im Folgenden als PQQ bezeichnet) als prosthetische Gruppe haben.
Methanoldehydrogenasen, die Mitglieder von Alkoholdehydrogenasen sind, katalysieren im Allgemeinen nicht nur die Oxidation von Methanol zur Formaldehyd, sondern auch die von Formaldehyd zu Ameisensäure bzw. Formiat (Advances in Microbial Physiology, 27, 113-209, 1986). Diese Enzyme oxidieren einen weiten Bereich an primären Alkoholen, wie Methanol und Ethanol und einige Aldehyde unter Verwendung von Ammoniak oder Methylamin als Aktivator, die meisten können aber sekundäre Alkohole nicht oxidieren. Die von Methylobacterium organophilum, Pseudomonas C, Diprococcus PAR und Rhodopseudomonas acidophile abgeleiteten Methanoldehydrogenasen sind Beispiele für Dehydrogenasen, die die Oxidation von sekundären Alkoholen ebenso katalysieren können. Im Gegensatz hierzu oxidiert die erfindungsgemäß bereitgestellte AADH einen breiten Bereich an primären und sekundären Alkoholen und unterscheidet sich klar von den vorher erwähnten Methanoldehydrogenasen in folgenden Aspekten.
AADH oxidiert kaum Methanol, während Ethanol ein gutes Substrat ist. Sie erfordert weder Ammoniak noch Methylamin als Aktivator. Der isoelektrische Punkt der neuen AADH ist etwa 4,4, während der der meisten Methanoldehydrogenasen größer als 7,0 ist.
Als weitere Beispiele für Alkoholdehydrogenasen mit PQQ als prosthetischer Gruppe sind Chinoproteinalkoholdehydrogenase von Pseudomonas aeruginosa (Biochem. J., 223, 921-924, 1984) und Chinohämproteinalkoholdehydrogenase aus Pseudomonas testosteroni (Biochem. J., 234, 611-615, 1986) bekannt. Ersteres Enzym ist ein Monomer, dessen Molekulargewicht 101.000 ist und Ammoniumsalze oder Amin als Aktivatoren erfordert, während die erfindungsgemäß bereitgestellte AADH aus zwei Untereinheiten besteht und keinen Aktivator erfordert. Letzeres Enzym ist ein Monomer, dessen Molekulargewicht etwa 67.000 ist und eine Häm-c-Gruppe und ein PQQ als prosthetische Gruppe im Molekül aufweist, während die erfindungsgemäß bereitgestellte AADH aus zwei Untereinheiten besteht und keine Häm-c- Gruppe hat.
Wie oben beschrieben, gibt es bis jetzt keine Berichte, die eine erfindungsgemäß bereitgestellte AADH betreffen. Es wurde gefunden, dass das gereinigte Enzym, das aus einer Cytosolfraktion von Zellen spezifischer Mikroorganismen isoliert wurde, die Oxidation von Alkoholen und Aldehyden katalysiert und Aldehyde und Ketone aus Alkoholen erzeugen kann und Carbonsäuren aus Aldehyden. Genauer katalysiert das genannte Enzym die Oxidation von L-Sorbose zu 2-KGA über L-Sorboson. Die vorliegende Erfindung wurde auf Basis dieser Erkenntnis aufgefunden.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der gereinigten Probe von AADH, die in den folgenden erwähnten. Beispielen hergestellt wurde, sind wie folgt:

1) Enzymaktivität

Die AADH der vorliegenden Erfindung katalysiert die Oxidation von Alkoholen und Aldehyden und kann Aldehyde und Ketone aus Alkoholen und Carbonsäuren aus Aldehyden in Gegenwart eines Elektronenakzeptors erzeugen.
Das Enzym verwertet Sauerstoff nicht als Elektronenakzeptor. Jede übliche Verbindung, die die Fähigkeit hat, als Elektronenakzeptor zu wirken, kann jedoch zusammen mit dem Enzym der Erfindung verwendet werden. Als Elektronenakzeptor kann 2,6- Dichlorphenolindophenol (im Folgenden als DCIP bezeichnet), Phenazinmethosulfat (im Folgenden als PMS bezeichnet), Wursters Blau, Eisen-III-cyanid, Coenzym Q oder Cytochrom c verwendet werden.
Der Enzymassay wurde bei 25ºC durchgeführt, indem die Abnahme der Extinktion von DCIP bei 600 nm mit einem Spektrophotometer (UVIKON 810, Kontron K. K.) gemessen wurde. Eine Einheit der Enzymaktivität wurde definiert als die Menge an Enzym, die die Reduktion von 1 umol DCIP pro Minute katalysiert. Der Extinktionskoeffizient von DCIP bei pH 8,0 wurde mit 15 mmol&supmin;¹ genommen. Die Standardreaktionsmischung (1,0 ml) enthielt 0,1 mmol DCIP, 1 mmol PMS, 125 mmol L-Sorbose, 50 mmol Tris-Malat-NaOH-Puffer (pH 8,0) und 3 bis 8 ul Enzymlösung. Eine Referenzküvette enthielt alle obigen Komponenten außer dem Substrat.

2) Substratspezifität

Die Substratspezifität von AADH wurde bestimmt unter Verwendung der gleichen oben unter 1) beschriebenen Enzymassay methode, außer dass verschiedene weitere Substrate anstelle von L-Sorbose verwendet wurden. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 1 gezeigt. Eine Mehrzahl von Verbindungen, wie primäre Alkohole, sekundäre Alkohole, Aldehyde und Alkohole mit hohem Molekulargewicht, wie Polyethylenglycole oder Polyvinylalkohole können Substrate für AADH sein.

3) Optimaler pH

Die Korrelation zwischen der Reaktionsrate von AADH und dem pH wurde bestimmt in Tris-Malat-NaOH-Puffer (pH 6,0 bis 8,5) und dann in Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) unter Verwendung einer Mehrzahl von Substraten, wie in Tabelle 2 gezeigt. Unabhängig von der Art der Substrate zeigte AADH die höchste Aktivität in einem pH-Bereich zwischen 7,0 und 9,0.

4) pH-Stabilität

Gereinigte AADH wurde in Puffern mit verschiedenen pH-Werten über einen bestimmten Zeitraum bei 4ºC stehen gelassen, wie in Tabelle 3 gezeigt. Die Restaktivität wurde bestimmt unter Standardtestbedingungen, wie oben unter 1) beschrieben, unter Verwendung von L-Sorbose und L-Sorboson als Substrate. Die Ergebnisse der Messungen sind in Tabelle 3 gezeigt. Das gereinigte Enzym war relativ stabil bei alkalischem pH und wurde mit zunehmender Acidität instabil.

5) Wärmestabilität

Gereinigte AADH wurde 10 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen in 25 mmol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 0,1 Mol NaCl und 5% Saccharose enthielt, behandelt und dann sofort in Eiswasser gekühlt. Die Restaktivität wurde bei den unter 1) beschriebenen Standardtestbedingungen gemessen unter Verwendung einer Mehrzahl von Substraten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. AADH ist ziemlich stabil bei und unter 30ºC, während sie über 40ºC instabil ist.

6) Optimale Temperatur

Die enzymatische Aktivität von AADH wurde bei Temperaturen von 10 bis 50ºC in dem unter 1) beschriebenen Reaktionssystem gemessen unter Verwendung einer Mehrzahl von Substraten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Das Enzym zeigte sein Optimum bei Temperaturen zwischen 20 und 40ºC.

7) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht der gereinigten AADH wurde durch Gelfiltrationssäulenchromatographie bestimmt. Die Probe wurde auf ein Harz zur Reinigung von Proteinen aufgetragen, z. B. auf eine Sephacryl-S-300HR-(Pharmacia)-Säule, die mit 25 mmol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), der 0,1 Mol NaCl und 5% Saccharose enthielt, equilibriert worden war. Als Molekulargewichtsstandards wurden Thyroglobulin (670.000 Dalton), Ferritin (450.000 Dalton), Katalase (240.000 Dalton), Aldolase (158.000 Dalton), Gammaglobulin (158.000 Dalton), Rinderserumalbumin (66.200 Dalton), Ovalbumin (45.000 Dalton), Chymotrypsinogen A (25.000 Dalton), Myoglobin (17.000 Dalton), Cytochrom c (12.500 Dalton) und Vitamin B&sub1;&sub2; (1.359 Dalton) verwendet. Als Ergebnis wurde das Molekulargewicht von AADH mit 135.000 ± 5.000 Dalton bestimmt. Als Nächstes wurde gereinigte AADH mit Natriumdodecylsulfat (SDS) in Gegenwart von β-Mercaptoethanol versetzt und seine Molekülstruktur mit SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese analysiert. Als Molekulargewichtsstandards wurden Phosphorylase B (92.500 Dalton), Rinderserumalbumin (66.200 Dalton), Ovalbumin (45.000 Dalton), Carboanhydrase (31.000 Dalton), Sojatrypsininhibitor (21.500 Dalton) und Lysozym (14.400 Dalton) verwendet. Es wurde gezeigt, dass das Enzym aus zwei Untereinheiten besteht. Eine (α-Untereinheit) hat ein Molekulargewicht von 64.500 ± 2.000 Dalton und die andere (β-Untereinheit) 62.500 ± 2.000 Dalton.

8) Messung der Km-(Michaelis-Konstante)-Werte

Bei dem unter 1) beschriebenen Verfahren wurden die Geschwindigkeiten der Oxidationsreaktionen bei verschiedenen Konzentrationen verschiedener Substrate gemessen, um die scheinbare Michaelis-Konstante (Km) zu bestimmen. Die Mischung aus DCIP und PMS wurde als Elektronenakzeptor verwendet. Die Km-Werte für L-Sorbose für 1-Propanol wurden mit 230 mmol bzw. 2 mmol berechnet.

9) Wirkung von Metallionen

Unter Verwendung des unter 1) beschriebenen Testverfahrens wurde die Wirkung verschiedener Metallionen auf die Enzymaktivität untersucht. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 6 gezeigt. Von den getesteten Ionen beeinflussten nur Mg²&spplus; und Ca²&spplus; die AADH-Aktivität nicht. Die anderen beeinflussten die Enzymaktivität stark oder mäßig. Cu²&spplus;, Mn²&spplus; und Fe³&spplus; sind starke Inhibitoren für das Enzym.

10) Wirkung von Inhibitoren

Unter Verwendung des unter 1) oben beschriebenen Testverfahrens wurde die Wirkung von Inhibitoren auf die Enzymaktivität untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Ethylenglycolbis-(β- aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure (EGTA) hemmte die Enzymaktivität stark.

11) Prosthetische Gruppe

Das Absorptionsspektrum von gereinigter AADH zeigte ein Absorptionsmaximum bei 280 nm gefolgt von einer Schulter bei 290 nm, wie in Fig. 1. gezeigt. Der zweite Peak wurde bei 340 nm mit einer breiten Schulter bei 380 bis 420 nm nachgewiesen. Dieses Absorptionsspektrum deutet stark darauf hin, dass AADH PQQ als prosthetische Gruppe hat.
Gereinigte AADH (4,5 mg) in 100 mmol NaH&sub2;PO&sub4;·HCl (pH etwa 1,0) wurde zu einem gleichen Volumen Methanol zugegeben und gemischt. Die Probe wurde dann mit 15.000 Upm 10 Minuten lang zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen. Der entstehende Extrakt wurde für die Analyse der prosthetischen Gruppe verwendet. Das Absorptionsspektrum des Extraktes war vollständig identisch mit einer authentischen Probe von PQQ (Mitsubishi Gas Chemical Co.). Weiterhin zeigte eine Analyse mit Hochdruckflüssigchromatographie unter Verwendung einer Reverse-Phase-Säule (TSK-ODS 80 TM, Toyo Soda Co.) des Extraktes von AADH die gleiche Retentionszeit wie authentisches PQQ.

12) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt (pI) von AADH wurde bestimmt. Polyacrylamidgel (4%), das 8,5 Mol Harnstoff, 2% (G/V) nichtionisches Detergenz, z. B. Nonidet P-40 und 2,4% (G/V) eines Ampholits, einer Pufferkomponente für den pH-Gradienten, nämlich Pharmalyte, pH 2,5-5,0 (Pharmacia) enthielt, wurde für die isoelektrische Fokussierung verwendet. Die Elektrodenlösungen waren 0,01 Mol Iminodiacetat für die Anode und 0,01 M N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure-(HEPES)-Puffer für die Kathode. Der isoelektrische Punkt der Probe wurde im Vergleich zu einem Kalibrierungskit mit niedrigem pH, pH 2,5 bis 5,0, der von Pharmacia erworben wurde, abgeschätzt. Als Ergebnis zeigte AADH ein Cluster mit wenigen Banden mit pI-Punkten von etwa 4, 4.

13) Reinigungsmethode

Die Reinigung von AADH kann im Prinzip durch jede Kombination von bekannten Reinigungsmethoden bewirkt werden, wie
Fraktionierung mit Ausfällmitteln, z. B. Ammoniumsulfat, Polyethylenglycol etc.,
Ionenaustauschchromatographie,
Adsorptionschromatographie,
Gelfiltrationschromatographie,
Gelelektrophorese,
Aussalzen und Dialyse.
Die erfindungsgemäß bereitgestellte AADH kann hergestellt werden, indem ein geeigneter Mikroorganismus kultiviert wird, die Zellen aufgeschlossen oder aufgebrochen werden und das Enzym aus dem freien Zellextrakt der aufgeschlossen Zellen isoliert und gereinigt wird, bevorzugt aus der Cytosolfraktion des Mikroorganismus.
Die für die vorliegende Erfindung verwendeten Mikroorganismen schließen alle Stämme ein, die zur Gattung Gluconobacter gehören, die AADH erzeugen können. Subkulturen dieser Mikroorganismen können auch für die vorliegende Erfindung verwendet werden.
Ein bevorzugter Stamm ist Gluconobacter oxydans. Ein spezifischer und bevorzugter Gluconobacter oxydans-Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen (Deutschland) unter der Nummer DSM 4025 am 17. März 1987 hinterlegt.
Außerdem wurde eine Subkultur des Stammes auch bei der Agency of Industrial Science and Technology, Fermentation Research Institute, Japan, nach den Vorschriften des Budapester Vertrags unter der Hinterlegungsnummer: Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 FERM BP-3812 (Hinterlegungsdatum 30. März 1992) hinterlegt.
Weiterhin offenbart die Europäische Patentschrift Nr. 0278 447 (4226/081k) die Merkmale dieses Stamms.
Die Mikroorganismen können in einem wässrigen Medium, das mit geeigneten Nährstoffen ergänzt ist, unter aeoroben Bedingungen kultiviert werden. Die Kultivierung kann bei einem pH zwischen etwa 4,0 und 9,0, bevorzugt zwischen etwa 6,0 und 8,0 durchgeführt werden. Während der Kultivierungszeitraum abhängig von pH, Temperatur und verwendetem Nährmedium variiert, bringen 2 bis 5 Tage gewöhnlich vorteilhafte Ergebnisse. Ein bevorzugter Temperaturbereich zur Durchführung der Kultivierung ist etwa 13 bis 36ºC, bevorzugt etwa 18 bis 33ºC.
Es ist gewöhnlich erforderlich, dass das Kulturmedium solche Nährstoffe, wie assimilierbare Kohlenstoffquellen, verdaubare Stickstoffquellen und anorganische Substanzen, Vitamine, Spurenelemente und andere wachstumsfördernde Faktoren enthält. Als assimilierbare Kohlenstoffquellen können L-Sorbose, Glycerin, D-Glucose, D-Mannit, D-Fructose, D-Arabit und dgl. verwendet werden.
Verschiedene organische oder anorganische Substanzen können auch als Stickstoffquellen verwendet werden, wie Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Casein, Maiseinweichwasser, Harnstoff, Aminosäuren, Nitrate, Ammoniumsalze und dgl. Als anorganische Substanzen können Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat, Eisen-II- und Eisen-III-chloride, Calciumcarbonat und dgl. verwendet werden.
Im Folgenden wird eine Ausführungsform zur Isolierung und Reinigung von AADH aus Mikroorganismen nach Kultivierung kurz beschrieben.
(1) Zellen werden aus der Fermentationsbrühe durch Zentrifugation oder Filtration geerntet.
(2) Die Zellen werden in der Pufferlösung suspendiert und mit Hilfe eines Homogenisators, Sonicators oder durch Behandlung mit Lysozym und dgl. aufgeschlossen, was eine aufgeschlossene Lösung von Zellen ergibt.
(3) AADH wird aus einem zellfreien Extrakt aufgeschlossener Zellen isoliert und gereinigt, bevorzugt aus der Cytosolfraktion der Mikroorganismen.
Das erfindungsgemäß bereitgestellte AADH ist nützlich als Katalysator zur Herstellung von Aldehyden, Carbonsäuren und Ketonen aus Alkoholen und Aldehyden, insbesondere zur Herstellung von 2-KGA aus L-Sorbose über Sorboson.
Die Reaktion sollte bei pH-Werten von etwa 6,0 bis etwa 9,0 in Gegenwart von Elektronenakzeptoren, z. B. DCIP, PMS, Wursters Blau, Eisen-III-cyanid, Coenzym Q, Cytochrom c und dgl. in einem Lösungsmittel, wie Tris-HCl-Puffer, Phosphatpuffer und dgl. durchgeführt werden.
Ein bevorzugter Temperaturbereich zur Durchführung der Reaktion ist etwa 10 bis etwa 50ºC. Wenn pH und Temperatur auf etwa 7,0 bis 8,0 bzw. 20 bis 40ºC eingestellt werden, bringt die Reaktion gewöhnlich die bevorzugtesten Ergebnisse.
Die Konzentration des Substrats in einem Lösungsmittel kann variieren abhängig von anderen Reaktionsbedingungen, ist aber im Allgemeinen wünschenswerterweise etwa 10 bis 100 g/l, am meisten bevorzugt etwa 30 bis 40 g/l.
Bei der Reaktion kann AADH auch in einem immobilisierten Zustand mit einem geeigneten Träger verwendet werden. Jedes Mittel zur Immobilisierung von Enzymen, das allgemein im Stand der Technik bekannt ist, kann verwendet werden. Z. B. kann das Enzym direkt an eine Membran, an Körnchen oder dgl. aus einem Harz mit funktionellen Gruppen gebunden werden oder kann über verbrückende Verbindungen mit funktionellen Gruppen, z. B. Glutaraldehyd, an das Harz gebunden werden.
Zusätzlich zu dem obigen sind Kulturzellen auch nützlich zur Herstellung von Aldehyden, Ketonen und Carbonsäuren aus Alkoholen und Aldehyden, insbesondere zur Herstellung von 2-KGA aus L-Sorbose.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Herstellung von AADH

Alle Arbeitsschritte wurden bei 4ºC durchgeführt, wenn nicht anders beschrieben.

(1) Kultivierung von Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 (FERM BP-3812)

(a) Herstellung des Mediums

Ein Impfkulturmedium, das L-Sorbose, 8% (G/V) (getrennt sterilisiert), Glycerin 0,05%, MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,25%, Maiseinweichwasser 1,75%, Bäckerhefe 5%, CaCO&sub3; 0,5% und Harnstoff 0,5% (getrennt sterilisiert) (pH 7,0 vor der Sterilisierung) enthielt, wurde in Teströhrchen (jeweils 5 ml) gegeben und 20 Minuten lang bei 120ºC sterilisiert.

(β) Impfung, Inkubation

In dieses Impfkulturmedium wurde eine Öse Zellen von Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 (FERM BP-3812), die auf Schrägkulturmedium, das D-Mannit 5% in Wasser, MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,25%, Maiseinweichwasser 1,75%, Bäckerhefe 0,25%, CaCO&sub3; 0,5% und Harnstoff 0,5% (getrennt sterilisiert) und Agar 2,0% (pH 7,0 vor der Sterilisierung) enthielt, bei 27ºC 4 Tage lang ge züchtet worden waren, geimpft und 24 Stunden bei 30ºC inkubiert. Die entstehende Impfkultur (5 ml) wurde in 100 ml des gleichen Impfkulturmediums, wie oben beschrieben, in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben geimpft und 24 Stunden bei 30ºC inkubiert. Die entstehende Saatimpfkultur (5 ml) wurde weiterhin in 100 ml des gleichen Impfkulturmediums, wie oben beschrieben, in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben geimpft und 24 Stunden bei 30ºC inkubiert. 750 ml der so hergestellten Impfkultur wurden für die Impfung von 15 l Hauptmedium in einem 30-l-Fermenter verwendet. Das Medium enthielt L-Sorbose 10,0% (getrennt sterilisiert), Glycerin 0,05%, Harnstoff 1,6% (getrennt sterilisiert), MgSO&sub4;·7H&sub2;O 0,25%, Bäckerhefe 5,0%, Ca CO&sub3; 1,5% und Maiseinweichwasser 3,0%. Die Fermentation wurde bei 30ºC, wobei mit 500 Upm bewegt wurde und mit 7,5 l/min belüftet wurde, durchgeführt. Nach 40 Stunden Fermentation wurde die Kultur durch Zentrifugation (10.000 g, 15 Minuten) geerntet. Der Zellkuchen wurde in 1 l 25 mmol Tris-HCl, pH 7,5, das 0,9% NaCl, 5 mmol MgCl&sub2; und 1 mmol Phenylmethylsulfanylfluorid (PMSF) enthielt, suspendiert. Die Suspension wurde mit 500 g 5 Minuten lang zentrifugiert, um CaCO&sub3; und andere ausfällbare Inhaltsstoffe des Mediums auszufällen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugation mit 10.000 g 15 Minuten lang gesammelt. Der oben erwähnte Arbeitsschritt wurde wiederholt. Als Ergebnis wurden 125 g (Nassgewicht) der Zellen von Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 (FERM BP-3812) erhalten. Die gewaschenen Zellen wurden bei -20ºC 1 Woche vor der nächsten Reinigungsstufe eingefroren.

(2) Herstellung der Cytosolfraktion

Die Zellen von Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 (FERM BP- 3812) (125 g) aus der obigen Stufe (1) wurden in 100 ml 25 mmol Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der 0,5 mmol PMSF enthielt, suspendiert und zweimal einem (French Press) Zellaufschluss unterzogen, um die Zellen aufzubrechen (1500 kg/cm²). In diese homogenisierte Suspension wurden 2 ml 1 mg/ml DNA spalten de DNAse I (Sigma) und 1 ml 0,5 Mol MgCl&sub2; zugegeben, die Mischung 15 Minuten stehen gelassen und mit 6.000 g 15 Minuten lang zentrifugiert, um die Zellbruchstücke zu entfernen. Der so erhaltene zellfreie Extrakt (210 ml) wurde mit 100.000 g 60 Minuten lang zentrifugiert. Der entstehende Überstand wurde als Cytosolfraktion (200 ml) gesammelt.

(3) PEG-(MW 6.000)-Behandlung (Ausfällung der DNA)

Die Cytosolfraktion (200 ml) aus Stufe (2) wurde über Nacht dialysiert gegen 2 l 25 mmol Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der 0,25 mmol PMSF enthielt; dann wurden 40 g PEG 6000 (Nakarai Chemicals Ltd.) und 5 ml 2 n KCl zugegeben und die Mischung 30 Minuten lang gerührt und mit 14.000 g 20 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde auf 400 ml aufgefüllt mit dem gleichen Puffer.

(4) DEAE-Toyopearl-650M-(schwache Ionenaustausch)-Säulenchromatographie [erste Stufe]

Der Überstand (400 ml), der aus der obigen Stufe (3) erhalten wurde, wurde auf eine Diethylaminoethyl-(DEAE)-Toyopearl- 650M-Säule (2,5 cm Durchmesser und 35 cm Länge) aufgetragen, die mit 25 mmol Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der 0,25 mmol PMSF und 5% Saccharose enthielt, equilibriert worden war. Nachdem die Säule mit 600 ml des gleichen Puffers gewaschen worden war, wurde das Enzym mit einem linearen Gradienten von NaCl von 0 bis 0,5 Mol im gleichen Puffer (2.000 ml) eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden zusammengefasst (174 ml) und der nächsten Stufe unterzogen.

(5) Q-Sepharose-(starke Ionenaustausch)-Säulenchromatographie [zweite Stufe]

Die aktiven Fraktionen der vorherigen Stufe wurden auf eine Q-Sepharosesäule (2,5 cm Durchmesser und 35 cm Länge) aufge tragen, die mit 25 mmol Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der 5% Saccharose enthielt, equilibriert worden war. Nachdem die Säule mit dem Puffer bis auf die Grundlinie gewaschen worden war, wurde die Elution des Enzyms mit einem linearen Gradienten von 0,25 bis 0,5 Mol NaCl in dem gleichen Puffer (2.000 ml) durchgeführt. Die Fraktionen, die elektrophoretisch homogene AADH enthielten, wurden vereinigt und durch Ultrafiltration unter Verwendung einer PM-30-(Amicon Corporation)-Membran auf 20 ml eingeengt.
Die Zusammenfassung der Reinigungsstufen von AADH ist in Tabelle 8 gezeigt.

(6) Reinheit der isolierten AADH

Zur Abschätzung der Reinheit der isolierten AADH wurde eine Polyacrylamidgelelektrophorese durchgeführt. Die Probe wurde auf 7,5% Polyacrylamidgel in Tris-HCl-Puffer, pH 9,4, gemäß dem Verfahren von Davis et al. (Ann. N. Y. Acad. Sci. 121: 404, 1969) aufgetragen. Die Proteine wurden mit dem Proteinfarbstoff Coomassie Brilliant Blau R-250 angefärbt. Die Enzymaktivität in dem Gel wurde nachgewiesen, indem sie unter Reduktion von Nitroblautetrazoliumchlorid (Sigma) gekuppelt wurde. Das Gel wurde bei 30ºC im Dunklen in eine Lösung eingetaucht, die 50 mmol Tris-Malat-Puffer, pH 8,0, 0,01 mmol PQQ, 0,1 mmol PMS, 0,4 mmol Nitroblautetrazoliumchlorid und 0,25 Mol L-Sorbose enthielt.
AADH zeigte bei Proteinfärbung drei eng beieinander liegende Banden und alle Banden hatten Enzymaktivität. Das Erscheinen der drei Proteinbanden auf dem Gel beruht auf der Dissoziation der prosthetischen Gruppe von PQQ von dem Enzym während der Elektrophorese.

(7) Identifizierung des Reaktionsprodukts

Eine Reaktionsmischung mit 50 ul gereinigter AADH (1,5 mg Protein), 0,1 ml 10 mmol PMS, 0,5 ml 0,4 Mol Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, 0,25 ml Wasser und 0,1 ml 20%iger Lösung der verschiedenen Substrate wurde 15 Stunden lang bei 30ºC unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Das Reaktionsprodukt wurde mit Dünnschichtchromatographie analysiert. Die Produkte wurden durch direkten Vergleich mit authentischen Proben identifiziert. Das Ergebnis ist in Tabelle 9 zusammengefasst.

Beispiel 2

2-KGA-Produktion mit gereinigter AADH

Eine Reaktionsmischung, die 0,5 ml gereinigte AADH (15 mg Protein, und hergestellt gemäß Beispiel 1), 1 ml einer 20%igen Lösung von L-Sorbose, 1 ml 10 mmol PMS, 5 ml 0,4 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,5 und 2,5 ml Wasser enthielt, wurde bei 30ºC unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Als Ergebnis wurde 2-KGA in einer Rate von etwa 70 mg/h gebildet.

Beispiel 3

2-KGA-Produktion bei einem ruhenden Zellsystem

Die Reaktionsmischung (10 ml): 0,25 g der Zellen von Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 (FERM BP-3812) hergestellt auf gleiche Weise, wie in Stufe (1) von Beispiel 1 beschrieben, 1 ml einer 20%igen Lösung von L-Sorbose, 1 ml 10 mmol PMS, 1 ml 3%ige wässrige Lösung von NaCl, 1 ml 30 uMol PQQ, 0,1 g CaCO&sub3; und Wasser, wurde bei 30ºC unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Als Ergebnis wurde eine 2-KGA-Bildung in einer Rate von etwa 6 mg/h beobachtet. Tabelle 1 Substratspezifität von AADH
* Polyethylenglycol (Hersteller: Nakarai Chemicals Ltd.)
** Polyvinylalkohol (Hersteller: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Tabelle 2 pH-Optimum von AADH Tabelle 3 pH-Stabilität von AADH
Puffer: MC McIlvain-Puffer
AC Acetat-Puffer
TM Tris-Malat-NaOH-Puffer
TH Tris-HCl-Puffer Tabelle 4 Wärmestabilität von AADH Tabelle 5 Optimale Temperatur von AADH Tabelle 6 Wirkung von Metallionen auf die AADH-Aktivität Tabelle 7 Wirkung von Inhibitoren auf die AADH-Aktivität
* N-Ethylmaleimid Tabelle 8 Zusammenfassung der Reinigungsstufen von AADH
(a) Die "Aktivität" wurde gemessen mit der Methode, die in 1) unter Enzymaktivität auf den Seiten 2 und 3 beschrieben wurde.
(b) Der "zellfreie Extrakt" wurde hergestellt mit der Methode, die in Beispiel 1 (2) auf Seite 10 beschrieben wurde.
(c) Die "lösliche Fraktion" wurde hergestellt mit der Methode, die in Beispiel 1 (2) auf Seite 10 beschrieben wurde.
(d) Der "PEG-6000-Überstand" wurde hergestellt mit der Methode, die in Beispiel 1 (3) auf Seite 10 beschrieben wurde.
(e) "DEAE-Toyopearl" wurde hergestellt mit der Methode, die in Beispiel 1 (4) auf Seiten 10 und 11 beschrieben wurde.
(f) "Q-Sepharose" wurde hergestellt mit der Methode, die in Beispiel 1 (5) auf Seite 11 beschrieben wurde. Tabelle 9 Produkte von verschiedenen Substraten mit AADH

Claims

1. Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase, die die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften hat:

a) pH-Optimum: 7,0-9,0

b) Temperatur-Optimum: 20º-40ºC

c) Molekulargewicht: 135000 ± 5000 Dalton, bestimmt durch Gelfiltrationssäulenchromatographie (bestehend aus zwei Untereinheiten in irgendeiner Kombination von solcher α-Untereinheit und β-Untereinheit, die jeweils ein Molekulargewicht von 64500 ± 2000 und 62500 ± 2000 haben)

d) Substratspezifität: aktiv auf primäre und sekundäre Alkohole und Aldehyde

e) Prosthetische Gruppe: Pyrrolchinolinchinon

f) Isoelektrischer Punkt: etwa 4,4

2. Die Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase nach Anspruch 1, die von einem Mikroorganismus erhalten ist, der zur Gattung Gluconobacter gehört und der in der Lage ist, die Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase herzustellen, die die Eigenschaften hat, wie sie in Anspruch 1 angegeben sind.

3. Die Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase nach Anspruch 2, worin der Mikroorganismus Gluconobacter oxydans ist, das die identifizierenden Charakteristika des Stamms Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 (FERM BP- 3812) hat.

4. Die Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase nach Anspruch 3, worin der Mikroorganismus Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 (FERM BP-3812) oder einer Subkultur davon entspricht.

5. Ein Verfahren zum Herstellen einer Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase, die die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften hat:

a) pH-Optimum: 7,0-9,0

b) Temperatur-Optimum: 20º-40ºC c) Molekulargewicht: 135000 ± 5000 Dalton, bestimmt durch Gelfiltrationssäulenchromatographie (bestehend aus zwei Untereinheiten in irgendeiner Kombination von solcher α-Untereinheit und β-Untereinheit, die jeweils ein Molekulargewicht von 64500 ± 2000 und 62500 ± 2000 haben)

d) Substratspezifität: aktiv auf primäre und sekundäre Alkohole und Aldehyde

e) Prosthetische Gruppe: Pyrrolchinolinchinon

f) Isoelektrischer Punkt: etwa 4,4

welches enthält das Kultivieren eines Mikroorganismus, der der Gattung Gluconobacter angehört, der in der Lage ist, die Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase herzustellen, die die oben angegebenen Eigenschaften hat, in einem wässrigen Nährmedium und aeroben Bedingungen, Aufbrechen bzw. Zerstören der Zellen der Mikroorganismen, Isolieren und Reinigen des Enzyms von dem zellfreien Extrakt der aufgebrochenen bzw. zerstörten Zellen des Mikroorganismus.

6. Ein Verfahren nach Anspruch 5, worin der Mikroorganismus Gluconobacter oxydans ist, das die identifizierenden Charakteristika des Stamms Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 (FERM BP-3812) hat.

7. Ein Verfahren nach Anspruch 6, worin der Mikroorganismus Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 (FERM BP-3812), einem funktionellen Äquivalent, Subkultur, Mutanten oder Variante davon entspricht.

8. Ein Verfahren zum Herstellen eines Aldehyds, eines Ketons und/oder einer Carbonsäure aus einem Alkohol oder einem Aldehyd, welches enthält das Kontaktieren des Alkohols und/oder des Aldehyds mit

(i) der Alkohol/Aldehyd-Dehydrogenase, die die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften hat

a) pH-Optimum: 7,0-9,0

b) Temperatur-Optimum: 20º-40ºC

c) Molekulargewicht: 135000 ± 5000 Dalton, bestimmt durch Gelfiltrationssäulenchromatographie (bestehend aus zwei Untereinheiten in irgendeiner Kombination von der α-Untereinheit und der β-Untereinheit, die jeweils ein Molekulargewicht von 64500 ± 2000 und 62500 ± 2000 haben)

d) Substratspeziiität: aktiv auf primäre und sekundäre Alkohole und Aldehyde

e) Prosthetische Gruppe: Pyrrolchinolinchinon

f) Isoelektrischer Punkt: etwa 4,4

in der Gegenwart eines Elektronenakzeptors und Isolieren des resultierenden Aldehyds, Ketons oder Carbonsäure von der Reaktionsmischung.