DE69637038T2

DE69637038T2 - D-Sorbitol-Dehydrogenase

Info

Publication number: DE69637038T2
Application number: DE69637038T
Authority: DE
Inventors: Tatsuo Kamakura-shi Hoshino; Setsuko Fujisawa-shi Ojima; Teruhide Yokohama-shi Sugisawa
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1995-02-27
Filing date: 1996-02-17
Publication date: 2007-12-27
Anticipated expiration: 2016-02-18
Also published as: ATE360685T1; ES2284162T3; JP3874032B2; CN1141341A; EP0728840B1; CN1136310C; JPH08242850A; DE69637038D1; US5747301A; EP0728840A2; EP0728840A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue D-Sorbitol-Deghydrogenase, ein Verfahren zur Herstellung davon sowie ein Verfahren zur Herstellung von Ketosen, vor allem L-Sorbose, unter Verwendung des Enzyms.
Wie oben angegeben, katalysiert die durch die folgende Erfindung bereitgestellte neue D-Sorbitol-Deghydrogenase (nachfolgend als SLDH bezeichnet) die Oxidation von D-Sorbitol zu L-Sorbose. L-Sorbose ist eine wichtige Zwischenstufe bei der Herstellung von Vitamin C.
Enzyme, die die Oxidation von D-Sorbitol zu L-Sorbose katalysieren, sind bekannt. Von J.T. Cummins, T.E. King und V.H. Cheldelin (J. Biol. Chem., 224, 323–329, 1957) wird berichtet, daß der zellfreie Extrakt aus Acetobacter suboxydans (syn. Gluconobacter suboxydans) drei Enzyme enthält, die an D-Sorbitol-Oxidationswegen beteiligt sind. Zwei dieser die Oxidation von D-Sorbitol zu L-Sorbose katalysierenden Enzyme wurden gereinigt. Dabei wurde eines als Nikotinamid-Adenindinukleotidphosphat(nachfolgend als NADP bezeichnet)-abhängige L-Sorbose-Reduktase aus der löslichen Fraktion von Gluconobacter melanogenus IFO 3293 durch T. Sugisawa, T. Hoshino und A. Fujiwara (Agric. Biol. Chem., 55, 2043–2049, 1991), und ein weiteres als membrangebundene D-Sorbitol-Dehydrogenase aus Gluconobacter suboxydans var. α IFO 3254 durch E. Shingawa, K. Matsushita, O. Adachi und M. Ameyama (Agric. Biol. Chem., 46, 135–141, 1982) isoliert.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte SLDH unterscheidet sich allerdings deutlich von den beiden oben genannten Enzymen hinsichtlich der Untereinheitsstruktur des Enzyms, des Molekulargewichts, der Substratspezifität sowie des pH-Optimums. Das Molekulargewicht der NADP-abhängigen L-Sorbose-Reduktase beträgt 60000, aber das der durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten SLDH besteht aus einer homologen Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 79000 ± 5000, wobei zur Katalyse der Reaktion kein NADP benötigt wird. Dagegen bestand die von E. Shinagawa et al. isolierte membrangebundene D-Sorbitol-Dehydrogenase aus drei Arten von Untereinheiten mit Molekulargewichten von 63000, 51000 und 17000 und oxidierte spezifisch D-Sorbitol und auch D-Mannitol mit 5% der Reaktionsgeschwindigkeit für D-Sorbitol, jedoch nicht D-Arabitol oder Erythritol.
Weiterhin wurde gezeigt, daß das pH-Optimum des Enzyms bei 4,5 lag, die Enzymaktivität bei pH 5,0 stabil war und daß bei pH 7,0 ein Verlust von 92% der Aktivität auftrat. Die SLDH der folgenden Erfindung oxidiert jedoch nicht nur D-Sorbitol und D-Mannitol, sondern auch D-Arabitol und Erythritol, wobei das pH-Optimum bei 6,0 liegt, und die Aktivität selbst bei pH 8,0 stabil ist.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung des neuen Enzyms SLDH in gereinigter Form, das aus einem zur Gattung Gluconobacter oder Acetobacter gehörenden Mikroorganismus stammt, und auf D-Sorbitol unter Erhalt von L-Sorbose wirkt (d.h. die Oxidation von D-Sorbitol zu L-Sorbose katalysiert), und die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist:

a) Molekulargewicht von 800000 ± 50000 Da;
b) Molekülstruktur bestehend aus 10 homologen Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von jeweils 79000 ± 5000 Da;
c) Substratspezifität: aktiv gegenüber Polyolen;
d) pH-Optimum, bei dem das Enzym D-Sorbitol zu L-Sorbose oxidiert: im Bereich von pH 6,0 bis 7,0;
e) pH-Stabilität im Bereich von pH 7,0–9,0;
f) Temperaturoptimum im Bereich von 20 bis 40°C;
g) Hemmung durch Cu²⁺ und Fe³⁺.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung des neuen Enzyms SLDH durch Kultivierung eines zur Gattung Gluconobacter oder Acetobacter gehörenden Mikroorganismus, der zur Produktion der SLDH in den Zellen fähig ist, vorzugsweise von der Membranfraktion des Mikroorganismus. Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von L-Sorbose unter Verwendung des Enzyms SLDH.
Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der gemäß den nachfolgenden Beispielen hergestellten gereinigten Probe der neuen SLDH sind wie folgt:
1) Enzymaktivität
Die neue SLDH der vorliegenden Erfindung katalysiert die Oxidation von D-Sorbitol zu L-Sorbose in Gegenwart eines Elektronenakzeptors gemäß der folgenden Reaktionsformel: D-Sorbitol + Elektronenakzeptor → L-Sorbose + Reduzierter Elektronenakzeptor
Das Enzym verwendet keinen Sauerstoff als Elektronenakzeptor. Dies wurde dadurch bestätigt, daß bei Verwendung von Sauerstoff als möglichem Elektronenakzeptor keine Katalyseaktivität des Enzyms für die Umsetzung von D-Sorbitol zu L-Sorbose vorlag. Weiterhin wurde im Reaktionsgemisch kein Sauerstoffverbrauch nachgewiesen, wie anhand einer gelösten Sauerstoffsonde festgestellt wurde.
Es kann jedoch jede beliebige herkömmliche Verbindung, die die Fähigkeit besitzt, als Elektronenakzeptor zu fungieren, in Verbindung mit dem Enzym der vorliegenden Erfindung genutzt werden. Als Elektronenakzeptor läßt sich 2,6-Dichlorphenolindophenol (nachfolgend mit DCIP bezeichnet), Phenazinmethosulfat (nachfolgend mit PMS bezeichnet), Ferricyanid oder Cytochrom c verwendet werden.
Der Enzymtest wurde wie folgt durchgeführt. Der basale Reaktionsansatz zum Testen der Aktivität von D-Sorbitol-Dehydrogenase bestand aus 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0), 0,25 mM DCIP und 0,325 mM PMS und wurde unmittelbar vor dem Test hergestellt. Eine Küvette mit einer Schichtdicke von 1 cm enthielt 0,4 ml des basalen Reaktionsansatzes, 0,1 ml an 0,4 M D-Sorbitol und Enzymlösung mit einem Gesamtvolumen von 0,51 ml. Die Referenzküvette enthielt alle Komponenten mit Ausnahme des Substrats. Die Reaktion wurde bei 25°C mit D-Sorbitol gestartet, und die Enzymaktivität wurde als Anfangsreduktionsgeschwindigkeit von DCIP bei 600 nm gemessen. Dabei ist eine Enzymeinheit als diejenige Menge an Enzym definiert, die die Reduktion von 1 μmol DCIP pro Minute katalysiert. Der Extinktionskoeffizient von DCIP bei pH 6,0 betrug 10,8 mM-1.
2) Substratspezifität
Die Substratspezifität des Enzyms wurde unter Verwendung des gleichen Enzymtestverfahrens wie oben unter 10 beschrieben bestimmt, außer daß anstelle von D-Sorbitol die Lösung mit einem jeweils verschiedenen Substrat (100 mM) verwendet wurde. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 1 dargestellt. Unter den getesteten Substanzen wurden D-Sorbitol, D-Arabitol, Erythritol und Glycerin stark oxidiert, wobei D-Mannitol und D-Adonitol ebenso oxidiert wurden, und zwar mit 49,9 bzw. 66,6% der Reaktionsgeschwindigkeit für D-Sorbitol. Tabelle 1. Substratspezifität der gereinigten Sorbitol-Dehydrogenase

^a): Relative Aktivität ist als Prozentanteil der mit dem Substrat D-Sorbitol erhaltenen Reaktionsgeschwindigkeit ausgedrückt.

3) pH-Optimum
Die Korrelation zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit der SLDH und dem pH-Wert wurde unter Verwendung des gleichen Enzymtestverfahrens wie oben unter 1) beschrieben bestimmt, außer daß verschiedene pH-Werte und Puffer verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Das Enzym zeigte pH-Optimum-Werte von 6,0–7,0 und zeigte die höchste Aktivität bei pH 6,0. Tabelle 2. pH-Optimum für die SLDH-Aktivität

^a): Daten sind als Prozentanteil der Aktivität bei pH 6,0 in Kaliumphosphatpuffer ausgedrückt.

4) pH-Stabilität
Man lies das Enzym in Puffern mit verschiedenen pH-Werten 16 Stunden bei 4°C stehen, wonach die Restaktivität unter Verwendung des gleichen Enzymtestverfahrens wie oben unter 1) beschrieben gemessen wurde. Die Ergebnisse der Messung sind in Tabelle 3 dargestellt. Über 60% der Aktivität blieb bei pH-Werten zwischen 7,0 und 9,0 erhalten. Tabelle 3. pH-Stabilität für die SLDH-Aktivität

^a): Daten sind als Prozentanteil der Aktivität bei pH 8,0 in McIlvain-Puffer ausgedrückt.

5) Temperaturstabilität
Die Temperaturstabilität wurde getestet, indem das Enzym 5 Minuten bei verschiedenen Temperaturen in 0,01 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) inkubiert wurde. Die Restaktivität wurde unter Verwendung des gleichen Enzymtestverfahrens wie oben unter 1) beschrieben gemessen, wonach das behandelte Enzym sofort in Eiswasser abgekühlt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Das Enzym war bis zu 35°C stabil und verlor etwa 20,70 bzw. 90% seiner Aktivität, nachdem es bei 40, 50 bzw. 60°C inkubiert worden war. Tabelle 4. Temperaturstabilität für die SLDH-Aktivität

^a): Daten sind als Prozentanteil der Aktivität bei 20°C ausgedrückt.

6) Temperaturoptimum
Die Enzymaktivitäten wurden bei Temperaturen von 20 bis 60°C im gleichen Testverfahren wie oben unter 1) beschrieben gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Das Enzym zeigte ein Temperaturoptimum bei 20 bis 40°C und die höchste Aktivität bei 30°C. Bei 45 bzw. 50°C wurde eine Abnahme seiner Aktivität um 60 bzw. 70% beobachtet, und bei 60°C wurde keine Aktivität mehr nachgewiesen. Tabelle 5. Temperaturoptimum für die SLDH-Aktivität

^a): Daten sind als Prozentanteil der Aktivität bei 30°C ausgedrückt.

7) Wirkungen von Metallionen und Inhibitoren
Die Wirkungen von Metallionen und Inhibitoren auf die SLDH-Aktivität wurden untersucht, indem die Aktivität unter Verwendung des gleichen Testverfahrens wie oben unter 1) beschrieben gemessen wurde. Nach Zugabe von Enzymlösung zum basalen Reaktionsansatz wurde die Metallösung jeweils eingerührt und die Reaktion mit der Zugabe von D-Sorbitol gestartet. Wie in Tabelle 6 dargestellt ist, wurden 8 bis 17% der Aktivität durch Zugabe von 0,91 und 1,79 mM Co²⁺ stimuliert. Allerdings war die Zugabe von 0,91 mM Cu²⁺ und Fe³⁺ in beiden Fällen stark hemmend, und die Zugabe von Zn²⁺ führte zu einer Hemmung von 44 bis 68%. Die Wirkungen verschiedener Inhibitoren auf die Aktivität wurden untersucht. Wie in Tabelle 7 dargestellt ist, führten Chinin-Hydrochlorid bzw. Monoiodacetat zu einer Hemmung von 25% bzw. 75%. Tabelle 6. Wirkungen verschiedener Metalle auf die Aktivität von D-Sorbitol-Dehydrogenase
Relative Aktivität ist als Prozentanteil der ohne die in der Tabelle dargestellten Metallverbindungen erhaltenen Reaktionsgeschwindigkeit ausgedrückt. Tabelle 7. Wirkungen von Inhibitoren auf die Aktivität von D-Sorbitol-Dehydrogenase
Relative Aktivität ist als Prozentanteil der jeweils ohne die in der Tabelle dargestellten Inhibitoren erhaltenen Reaktionsgeschwindigkeit ausgedrückt.
8) Auswirkungen der Substratkonzentration auf die Reaktionsgeschwindigkeit
Die Geschwindigkeit der Oxidationsreaktion bei Variieren der Konzentration von D-Sorbitol von 0,5 bis 80 mM wurde gemessen, um den Km-Wert für D-Sorbitol zu bestimmen. Die scheinbare Michaelis-Konstante wurde zu 18 mM mit DCIP als Elektronenakzeptor für die Reaktion berechnet.
9) Molekulargewicht
Das Molekulargewicht der nativen SLDH wurde mittels HPLC unter Verwendung einer Größenausschlußgelsäule bei 280 nm und einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml pro Minute bestimmt. Die gereinigte SLDH bestand aus einer homologen Untereinheit mit einem Molekulargewicht von 79000 ± 5000 in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS).
10) Reinigungsverfahren
Die Aufreinigung der SLDH wird mit einer Kombination bekannter Reinigungsverfahren, wie beispielsweise Ionenaustauschchromatographie, Flüssigkeitschromatographie, Adsorptionschromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Gelelektrophorese, Aussalzen und Dialyse durchgeführt.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte SLDH läßt sich durch Kultivieren eines entsprechenden Mikroorganismus, Aufschließen der Zellen sowie Isolieren und Auf reinigen des Enzyms aus zellfreiem Extrakt der aufgeschlossenen Zellen, vorzugsweise aus der Membranfraktion des Mikroorganismus, präparieren.
Bei den für die vorliegende Erfindung verwendeten Mikroorganismen handelt es sich um zur Gattung Gluconobacter und Acetobacter gehörende Mikroorganismen.
Am stärksten bevorzugt werden in der vorliegenden Erfindung beispielsweise die Stämme Gluconobacter albidus IFO 3250, Gluconobacter albidus IFO 3251, Gluconobacter albidus IFO 3253, Gluconobacter capsulatus IFO 3462, Gluconobacter cerinus IFO 3263, Gluconobacter cerinus IFO 3264, Gluconobacter cerinus IFO 3265, Gluconobacter cerinus IFO 3267, Gluconobacter cerinus IFO 3270, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3274, Gluconobacter gluconicus IFO 3171, Gluconobacter gluconicus IFO 3285, Gluconobacter gluconicus IFO 3286, Gluconobacter industrius IFO 3260, Gluconobacter melanogenus IFO 3292, Gluconobacter melanogenus IFO 3293, Gluconobacter melanogenus IFO 3294, Gluconobacter nonoxygluconicus IFO 3276, Gluconobacter oxydans IFO 3189, Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus IFO 12467, Gluconobacter roseus IFO 3990, Gluconobacter rubiginosus IFO 3244, Gluconobacter suboxydans IFO 3130, Gluconobacter suboxydans IFO 3172, Gluconobacter suboxydans IFO 3254, Gluconobacter suboxydans IFO 3255, Gluconobacter suboxydans IFO 3256, Gluconobacter suboxydans IFO 3257, Gluconobacter suboxydans IFO 3258, Gluconobacter suboxydans IFO 3289, Gluconobacter suboxydans IFO 3290, Gluconobacter suboxydans IFO 3291, Acetobacter aceti subsp. aceti IFO 3281, Acetobacter aceti subsp. orleansis IFO 3259, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 3288, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13772 und Acetobacter liquefaciens IFO 12388 verwendet. Diese Mikroorganismen, die im Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, umfassen solche, die an einer öffentlichen Hinterlegungsstelle (Kultursammlung) zur allgemeinen Zustellung auf Anfrage aufbewahrt werden, wie beispielsweise beim Institute of Fermentation, Osaka, Japan (IFO). Von diesen wurde ein spezifischer und bevorzugter Mikroorganismus, Gluconobacter suboxydans IFO 3255, bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, am 13. Februar 1995 gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt. Die zugewiesene Hinterlegungsnummer lautet DSM9715.
Der Mikroorganismus kann in einem mit entsprechenden Nährstoffen supplementierten wäßrigen Medium unter aeroben Bedingungen kultiviert werden. Die Kultivierung kann bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8,0, vorzugsweise 5,0 bis 7,5, ausgeführt werden. Die Kultivierungsdauer variiert je nach dem Mikroorganismus und dem zu verwendenden Nährmedium und liegt vorzugsweise bei 6 bis 100 Stunden. Die Temperatur zur Durchführung der Kultivierung liegt bevorzugt in einem Bereich von 20°C bis 40°C, vorzugsweise von 25°C bis 35°C.
Üblicherweise ist es notwendig, daß das Kulturmedium Nährstoffe, wie beispielsweise assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie z.B. Glycerin, D-Mannitol, D- Sorbitol, Erythritol, Ribitol, Xylitol, Arabitol, Inositol, Dulcitol, D-Ribose, D-Fructose, D-Glucose und Saccharose, vorzugsweise D-Sorbitol, D-Mannitol oder Glycerin, verdaubare Stickstoffquellen wie beispielsweise organische Substanzen, z.B. Pepton, Hefeextrakt, Bäckerhefe und Maisquellwasser, sowie anorganische Substanzen, z.B. Ammoniumsulfat, Ammonimumchlorid und Kaliumnitrit, Vitamine sowie Spurenelemente, enthält.
Im folgenden wird eine Ausführungsform zur Isolierung und Aufreinigung der SLDH aus den Mikroorganismen nach der Kultivierung kurz beschrieben.

(1) Zellen werden aus der flüssigen Kulturbrühe durch Zentrifugation oder Filtration geerntet.
(2) Die geernteten Zellen werden mit Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einer Pufferlösung mit einem entsprechenden pH-Wert gewaschen.
(3) Die gewaschenen Zellen werden in der Pufferlösung suspendiert und mittels eines Homogenisators, Ultraschallgeräts, einer French-Presse oder Behandlung mit Lysozym und dergleichen aufgeschlossen, so daß man eine Lösung aufgeschlossener Zellen erhält.
(4) Die SLDH wird isoliert und aus dem zellfreien Extrakt aufgeschlossener Zellen, vorzugsweise aus der Membranfraktion des Mikroorganismus, aufgereinigt.

Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellte SLDH eignet sich als Katalysator für die Herstellung von L-Sorbose aus D-Sorbitol. Die Reaktion sollte bei pH-Werten von 5,5 bis 8,0, vorzugsweise von 6,0 bis 7,0, in Gegenwart eines Elektronenakzeptors, beispielsweise DCIP, PMS, Ferricyanid, Cytochrom c und dergleichen in einem Lösungsmittel, wie z.B. Phosphatpuffer, Tris-Puffer, Zitratpuffer und dergleichen, ausgeführt werden. Die Temperatur zur Durchführung der Reaktion liegt bevorzugt in einem Bereich von 20°C bis 50°C, vorzugsweise von 20°C bis 40°C. Ist der pH-Wert bzw. die Temperatur auf 6,5 bis 7,5 bzw. 30°C eingestellt, so werden durch die Reaktion üblicherweise besonders gute Ergebnisse erhalten. Je nach den anderen Reaktionsbedingungen, wie beispielsweise der Menge an Enzym, D-Sorbitol, Elektronenakzeptor, dem pH-Wert, der Temperatur oder der Lüftungsgeschwindigkeit wird das D-Sorbitol innerhalb von etwa 2 bis 24 Stunden, vorzugsweise innerhalb von etwa 12 Stunden, vollständig zu L-Sorbose umgewandelt. Die Konzentration von D-Sorbitol in einem Lösungsmittel variiert je nach den anderen Reaktionsbedingungen, liegt im allgemeinen und geeigneterweise aber bei etwa 10 bis etwa 300 g/L, am stärksten bevorzugt bei etwa 10 bis etwa 200 g/L.
Zusätzlich zu dem oben genannten eignen sich die kultivierten Zellen auch zur Herstellung von Ketosen aus Polyolen, vor allem für die Herstellung von L-Sorbose aus D-Sorbitol. Aus D-Sorbitol in einem Lösungsmittel produzierte L-Sorbose wird mit einer Kombination aus solch herkömmlichen Verfahren, wie Zentrifugation und Konzentration, isoliert. Allerdings läßt sich das L-Sorbose-haltige Lösungsmittel ohne den Isolierungsschritt auch als Ausgangsmaterial in der großtechnischen Produktion von Vitamin C mit dem Reichstein-Verfahren einsetzen.
In der Reaktion kann das Enzym auch in einem immobilisierten Zustand mit einem entsprechenden Träger verwendet werden. Dabei können alle im Fachgebiet allgemein bekannten Mittel zur Immobilisierung eines Enzyms verwendet werden. So kann das Enzym beispielsweise direkt an eine Membran, ein Granulat oder dergleichen eines Harzes mit funktioneller Gruppe bzw. funktionellen Gruppen gebunden werden oder kann an das Harz über Brückenverbindungen mit bifunktioneller Gruppe bzw. bifunktionellen Gruppen, z.B. Glutaraldehyd, gebunden werden.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiel 1
Präparation von D-Sorbitol-Dehydrogenase
(1) Kultivierung von Gluconobacter suboxydans IFO 3255
Gluconobacter suboxydans IFO 3255 (DSM 9715) wurde vom Institute for Fermentation, Osaka (IFO) zur Verfügung gestellt und während der gesamten vorliegenden Arbeit verwendet. Das Medium bestand aus 20 g D-Sorbitol, 3 g Hefeextrakt, 3 g Rindfleischextrakt, 3 g Maisquellwasser, 10 g Polypepton, 1 g Harnstoff, 1 g KH₂PO₄, 0,2 g MgSO₄7H₂O, und 1 g CaCO₃ in 1 Liter entionisiertem Wasser. Der pH-Wert wurde auf 7,0 mit Natriumhydroxid vor Zugabe des CaCO₃ eingestellt. Die Kultivierung in einem Kolben wurde aerobisch auf einem Rotationsschüttler durchgeführt, bzw. die Kultivierung in einem 30-Liter-Fermentorgefäß wurde über 21,5 Stunden bei 30°C unter Rühren mit 500 iUpM und Belüftung mit 15 L/min durchgeführt. Die Brühe wurde 10 Minuten bei 400 × g zur Abtrennung von Calciumcarbonat, und danach bei 10000 × g zum Sedimentieren der Zellen zentrifugiert. Der Zellkuchen wurde einmal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Auf diese Weise wurden die intakten Zellen (200 g Feuchtgewicht) aus 20 Litern Kultur erhalten. Die Zellen wurden bis zur Verwendung bei –20°C eingefroren.
(2) Präparation der Membranfraktion
Die Zellen (100 g Feuchtgewicht) wurden in 200 ml 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert und durch eine French-Druckzellpresse bei 20000 psi geleitet. Nach der Zentrifugation zur Abrennung intakter Zellen wurde der Überstand (zellfreier Extrakt) eine Stunde bei 80000 × g zentrifugiert, wobei dieses Präzipitat als Membranfraktion bezeichnet wurde (2,28 g Feuchtgewicht).
(3) Solubilisierung
Die SLDH wurde aus der Membranfraktion von Gluconobacter suboxydans IFO 3255 (DSM 9715) isoliert. Dabei wurde zunächst das von E. Shinagawa, K. Matsushita, O. Adachi und M. Ameyama, (Agric. Biol. Chem., 46, 135–141, 1982) angegebene Verfahren zur Solubilisierung der SLDH verwendet. Die Solubilisierung erfolgte durch Behandeln der Membran mit 0,01 M Natriumacetatpuffer (pH 5,0), der 1% Triton X-100, 0,1 M KCl, 0,1 M D-Sorbitol und etwa 10 mg/ml des Membranproteins enthielt, 2 Stunden bei 5°C. Allerdings wurde die SLDH-Aktivität aus der Membranfraktion nicht wiedergewonnen, und die gesamten Aktivitäten sowohl im solubilisierten Überstand als auch in der Restmembranfraktion gingen unter den obigen Bedingungen verloren.
Daher wurden die Auswirkungen der Solubilisierungsbedingungen, wie beispielsweise pH-Wert, Konzentration von Puffer, Detergentien und KCl, auf die SLDH-Aktivität untersucht. Die Wiedergewinnung von SLDH-Aktivität aus der Membranfraktion im solubilisierten Überstand betrug 74%, wenn die Membranfraktion 2 Stunden bei 5°C in 0,05 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 1% Triton X-100 und 0,04 M D-Sorbitol gemischt wurde, wie in Tabelle 8 gezeigt. Das Enzym wurde mit n-Octyl-β-D-glucopyranosid nicht solubilisiert, und die Aktivität ging durch Zugabe von 0,1 M KCl verloren.
Um die aktive Fraktion von SLDH für den Isolierungsschritt {Beispiel 1-(4)} aus der Membranfraktion von Gluconobacter suboxydans IFO 3255 (DSM 9715) zu erhalten, wurden eingefrorene Membranen aufgetaut und im Puffer (pH 7,0) suspendiert, so daß etwa 10 mg/ml Protein erhalten wurden, und anschließend mit 1% Triton X-100 und 0,1 M D-Sorbitol versetzt. Die Suspension wurde 2 Stunden bei 180 UpM geschüttelt und anschließend zur Abtrennung des Präzipitats bei 80000 × g 60 Minuten zentrifugiert. Die SLDH-Aktivität wurde im solubilisierten Überstand (200 ml) wiedergewonnen.
(4) Diethylaminoethyl(nachfolgend als DEAE bezeichnet)-Cellulose-Säulenchromatographie
Der in Beispiel 1-(3) erhaltene solubilisierte Überstand (200 ml) wurde auf eine mit dem 0,05 M D-Sorbitol und 0,1% Triton X-100 enthaltenden Puffer (pH 7,0) equilibrierte und gewaschene DEAE-Cellulose-Säule (2,5 × 30 cm) aufgegeben. Die Elution des Enzyms erfolgte mit 0,1 M NaCl im gleichen Puffer. Die Fraktionen mit Enzymaktivität wurden gesammelt.
(5) DEAE-Sepharose-Säulenchromatographie
Die vereinigten Enzymfraktionen (125 ml) aus dem vorhergehenden Schritt wurden gegen zwei Chargen von jeweils einem Liter des Puffers mit 0,05 M D-Sorbitol und 0,1% Triton X-100 dialysiert und auf eine mit dem gleichen Puffer equilibrierte und gewaschene DEAE-Sepharose-Säule (1,5 × 50 cm) aufgegeben, wobei die SLDH-Aktivität mit einem linearen NaCl-Gradienten (0 bis 0,2 M) eluiert wurde. Die Hauptenzymaktivität wurde bei einer NaCl-Konzentration im Bereich von 0,16 bis 0,18 M eluiert.
6) Hydroxylapatit-Säulenchromatographie
Die vereinigte aktive Fraktion (40 ml) aus dem vorhergehenden Schritt wurde gegen zwei Chargen von jeweils 500 ml des Puffers mit 0,05 M D-Sorbitol und 0,1% Triton X-100 dialysiert. Ein Teil des Enzyms (5 ml) wurde auf eine equilibrierte Hydroxylapatit-Säule aufgegeben. Die Enzymaktivität wurde während des Waschens der Säule eluiert. Nach Wiederholung der gleichen Präparation wurden Fraktionen mit Enzymaktivität gesammelt. Nach Dialyse der aktiven Fraktion gegen den Puffer betrug das Gesamtvolumen 52 ml. Die Fraktion wurde anschließend durch Ultrafiltratioin auf 10 ml eingeengt (PM10, Amicon).
(7) Sephacryl-HR300-Säulenchromatographie
Ein Teil der Enzymfraktion (2 ml) aus dem vorhergehenden Schritt wurde auf eine mit dem 0,05 M NaCl, 0,05 M D-Sorbitol und 0,1% Triton X-100 enthaltenden Puffer (pH 7,0) equilibrierte Sephacryl-HR300-Säule (1 × 120 cm) aufgegeben und entwickelt. Dieser Auftrennungsschritt wurde wiederholt und die aktive Fraktion vereinigt. Die aktive Fraktion wurde gegen den Puffer (13 ml) dialysiert, vereinigt und bei –80°C gelagert.
Eine Zusammenfassung der Aufreinigungsschritte des Enzyms ist in Tabelle 9 dargestellt.
(8) Reinheit des isolierten Enzyms
Das gereinigte Enzym mit einer spezifischen Aktivität von 45,43 Einheiten pro mg Protein (0,2 mg/ml) wurde für die folgende Analyse verwendet.
Das Molekulargewicht der nativen D-Sorbitol-Dehydrogenase wurde mittels HPLC (Nachweis: 254 μm; Fließgeschwindigkeit: 1 ml/min) unter Verwendung einer Größenausschlußgelsäule (TSK-Gel G3000 SW_XL-Säule, 7,8 mal 300 mm), die mit 0,3 M NaCl enthaltendem 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) equilibriert war, bestimmt. Dabei wurden die Molekulargewichtstandards Cyanocobalamin (1,35 K), Myoglobin (17 K), Ovalbumin (44 K), γ-Globulin (158 K) und Thyroglobulin (670 K) verwendet. Das gereinigte Enzym zeigte einen einzelnen Spitzenwert, und das Molekulargewicht wurde zu etwa 800000 + 50000 bestimmt.
In Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) zeigte das Enzym eine Einzelbande mit einem Molekulargewicht von etwa 79000 ± 5000. Nach diesen Ergebnissen bestand die gereinigte SLDH aus zehn homologen Untereinheiten.
(9) Identifizierung des Reaktionsprodukts
Zur Identifizierung des jeweils aus jeder Substanz umgewandelten Produkts wurde der jeweils 0,04 M D-sorbitol, D-Mannitol, D-Arabitol, Erythritol, D-Adonitol und Glycerin, und 8 mM PMS enthaltende Reaktionsansatz (1 ml) 4 Stunden bei 30°C in 0,2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) mit 2,0 Einheiten des gereinigten Enzyms inkubiert. Das Reaktionsprodukt wurde mittels HPLC und Dünnschichtchromatographie analysiert. L-Sorbose, D-Fructose, D-Xylulose, Erythrulose, D-Ribulose bzw. Dihydroxyaceton wurden aus D-Sorbitol, D-Mannitol, D-Arabitol, Erythritol, D-Adonitol bzw. Glycerin hergestellt.
Beispiel 2
Herstellung von L-Sorbose durch gereinigte SLDH
Ein Reaktionsansatz (Gesamtvolumen 1,04 ml) mit 0,2 ml gereinigter SLDH (0,04 mg Protein), 0,04 ml 0,2 M PMS, 0,1 ml 0,4 M D-Sorbitol, 0,4 ml 0,5 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) sowie 0,3 ml Wasser wurde unter leichtem Schütteln bei 30°C inkubiert. Als Ergebnis wurde L-Sorbose bei einer Geschwindigkeit von etwa 1,3 mg/Stunde gebildet.
Beispiel 3
Verteilung membrangebundener D-Sorbitol-Dehydrogenase
Die Verteilung membrangebundener D-Sorbitol-Dehydrogenase in verschiedenen Essigsäurebakterien wurde mit dem immunologischen Blotting-Test unter Verwendung des gegen die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellte SLDH gerichteten Antikörpers beobachtet. Dabei wurde jedes Zellhomogenisat verschiedener Essigsäurebakterien jeweils mit SDS behandelt, so daß jeweils 20 μl der 3 bis 5 μg Protein enthaltenden Lösung auf ein SDS-Polyacrylamid gegegeben werden konnten und anschließend die Elektrophorese durchgeführt wurde. Die im Gel entwickelten Proteinbanden wurden elektrophoretisch auf die Nitrocellulosemembran übertragen und reagierten mit dem Antikörper. Anschließend wurde die Nitrocellulosemembran unter Verwendung des Bio-Rad-Immun-Blot-Kits für Ziege-Anti-Kaninchen behandelt, wobei untersucht wurde, welcher Mikroorganismus die positive Bande in der Position des Molekulargewichts (MW) 79000 ± 1000 zeigt. Wie in Tabelle 10 dargestellt ist, zeigten alle getesteten Gluconobacter-Stämme sowie Acetobacter aceti subsp. orleansis IFO 3259, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 3288 und Acetobacter aceti xylinum IFO 13772 die positive Bande. Das Zellhomogenisat von Acetobacter aceti subsp. aceti IFO 3281 und Acetobacter liquefaciens IFO 12388 zeigte eine schwach positive Bande in der Position von MW 79000 ± 1000. Tabelle 10. Immunoblotting-Analyse unter Verwendung des SLDH-Antikörpers

+: Die kreuzende Bande wurde an der Position für Mw 79000 ± 1000 stark nachgewiesen.

Claims

D-Sorbitol-Dehydrogenase in gereinigter Form, die aus einem zur Gattung Gluconobacter oder Acetobacter gehörenden Mikroorganismus stammt und die Oxidation von D-Sorbitol zu L-Sorbose katalysiert, wobei das Enzym die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften aufweist: a) Molekulargewicht von 800000 ± 50000 Da; b) Molekülstruktur bestehend aus 10 homologen Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von jeweils 79000 ± 5000 Da; c) Substratspezifität: aktiv gegenüber Polyolen; d) pH-Optimum, bei dem das Enzym D-Sorbitol zu L-Sorbose oxidiert, im Bereich von pH 6,0 bis 7,0; e) pH-Stabilität im Bereich von pH 7,0 bis 9,0; f) Temperaturoptimum im Bereich von 20 bis 40°C; g) Hemmung durch Cu²⁺ und Fe³⁺.
D-Sorbitol-Dehydrogenase nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Gluconobacter albidus IFO 3250, Gluconobacter albidus IFO 3251, Gluconobacter albidus IFO 3253, Gluconobacter capsulatus IFO 3462, Gluconobacter cerinus IFO 3263, Gluconobacter cerinus IFO 3264, Gluconobacter cerinus IFO 3265, Gluconobacter cerinus IFO 3267, Gluconobacter cerinus IFO 3270, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3274, Gluconobacter gluconicus IFO 3171, Gluconobacter gluconicus IFO 3285, Gluconobacter gluconicus IFO 3286, Gluconobacter industrius IFO 3260, Gluconobacter melanogenus IFO 3292, Gluconobacter melanogenus IFO 3293, Gluconobacter melanogenus IFO 3294, Gluconobacter nonoxygluconicus IFO 3276, Gluconobacter oxydans IFO 3189, Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus IFO 12467, Gluconobacter roseus IFO 3990, Gluconobacter rubiginosus IFO 3244, Gluconobacter suboxydans IFO 3130, Gluconobacter suboxydans IFO 3172, Gluconobacter suboxydans IFO 3254, Gluconobacter suboxydans IFO 3255 (DSM 9715), Gluconobacter suboxydans IFO 3256, Gluconobacter suboxydans IFO 3257, Gluconobacter suboxydans IFO 3258, Gluconobacter suboxydans IFO 3289, Gluconobacter suboxydans IFO 3290, Gluconobacter suboxydans IFO 3291, Acetobacter aceti subsp. aceti IFO 3281, Acetobacter aceti subsp. orleansis IFO 3259, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 3288, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13772 und Acetobacter liquefaciens IFO 12388.
Verfahren zur Herstellung einer D-Sorbitol-Dehydrogenase nach Anspruch 1 oder 2, bei dem man einen zur Gattung Gluconobacter oder Acetobacter gehörenden Mikroorganismus, der zur Produktion der D-Sorbitol-Dehydrogenase in den Zellen fähig ist, kultiviert und die D-Sorbitol-Dehydrogenase aus den Zellen isoliert.
verfahren nach Anspruch 3, wobei der Mikroorganismus ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Gluconobacter albidus IFO 3250, Gluconobacter albidus IFO 3251, Gluconobacter albidus IFO 3253, Gluconobacter capsulatus IFO 3462, Gluconobacter cerinus IFO 3263, Gluconobacter cerinus IFO 3264, Gluconobacter cerinus IFO 3265, Gluconobacter cerinus IFO 3267, Gluconobacter cerinus IFO 3270, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3271, Gluconobacter dioxyacetonicus IFO 3274, Gluconobacter gluconicus IFO 3171, Gluconobacter gluconicus IFO 3285, Gluconobacter gluconicus IFO 3286, Gluconobacter industrius IFO 3260, Gluconobacter melanogenus IFO 3292, Gluconobacter melanogenus IFO 3293, Gluconobacter melanogenus IFO 3294, Gluconobacter nonoxygluconicus IFO 3276, Gluconobacter oxydans IFO 3189, Gluconobacter oxydans subsp. sphaericus IFO 12467, Gluconobacter roseus IFO 3990, Gluconobacter rubiginosus IFO 3244, Gluconobacter suboxydans IFO 3130, Gluconobacter suboxydans IFO 3172, Gluconobacter suboxydans IFO 3254, Gluconobacter suboxydans IFO 3255 (DSM 9715), Gluconobacter suboxydans IFO 3256, Gluconobacter suboxydans IFO 3257, Gluconobacter suboxydans IFO 3258, Gluconobacter suboxydans IFO 3289, Gluconobacter suboxydans IFO 3290, Gluconobacter suboxydans IFO 3291, Acetobacter aceti subsp. aceti IFO 3281, Acetobacter aceti subsp. orleansis IFO 3259, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 3288, Acetobacter aceti subsp. xylinum IFO 13772 und Acetobacter liquefaciens IFO 12388.
Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, bei dem man den Mikroorganismus kultiviert und anschließend die Zellen aufschließt sowie die D-Sorbitol-Dehydrogenase aus zellfreiem Extrakt aufgeschlossener Zellen isoliert und auf reinigt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, bei dem man die Kultivierung des Mikroorganismus in einem wäßrigen Medium mit entsprechenden Nährstoffen unter aeroben Bedingungen bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8,0 und in einem Temperaturbereich von 20°C bis 40°C ausführt.
Verfahren nach Anspruch 6, bei dem man die Kultivierung des Mikroorganismus bei einem pH-Wert von 5,0 bis 7,5 und in einem Temperaturbereich von 25°C bis 35°C ausführt.
Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose aus D-Sorbitol, bei dem man D-Sorbitol in Gegenwart von D-Sorbitol-Dehydrogenase mit der in Anspruch 1 oder 2 angegebenen Bedeutung und eines Elektronenakzeptors in einem wäßrigen Medium unter aerober Bedingung oxidiert.
Verfahren zur Herstellung von L-Sorbose aus D-Sorbitol nach Anspruch 8, wobei die Oxidation bei pH-Werten von 5,5 bis 8,0 und in einem Temperaturbereich von 20 bis 50°C erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die L-Sorbose weiter zu Vitamin C umgewandelt wird.