JP2782232B2

JP2782232B2 - プロテアーゼ阻害剤

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Publication number: JP2782232B2
Application number: JP1135678A
Authority: JP
Inventors: 俊夫服部; 清高月; 利夫村上
Original assignee: Nitto Denko Corp
Current assignee: Nitto Denko Corp
Priority date: 1989-05-29
Filing date: 1989-05-29
Publication date: 1998-07-30
Anticipated expiration: 2013-07-30
Also published as: JPH032195A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、後天性免疫不全症候群の病原ウイルス（HI
V）の外膜蛋白関連ペプチド及びその誘導体を有効成分
とするプロテアーゼ阻害剤に関するものである。

〔従来技術・発明が解決しようとする課題〕

プロテアーゼ阻害剤は生体内において幅広い酵素系に
影響を与え、たとえば急性膵炎、ショック、出血時の止
血等の治療等に使用されている。

現在用いられている、蛋白性のプロテアーゼ阻害剤で
は抗体産生の可能性などの問題点があった。従って、低
分子性で抗体産生による副作用の少ないプロテアーゼ阻
害剤の出現が待望されているのが実情である。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、HIVの外被蛋白質（gp120）のアミノ酸
配列からなるペプチド等のHIVの外膜蛋白関連ペプチド
について研究を進めた結果、ペプチドにおいて、後記の
式（IV）で表されるアミノ酸配列部位を有しさえすれ
ば、優れたプロテアーゼ阻害作用を有することを見出し
た。

即ち、HIVに対する中和抗体誘導における抗原決定基
としてすでに公知のアミノ酸配列〔Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,88,3198〜3202（1988）〕の中に、タンパク質性
トリプシンインヒビターとして広く知られているダイズ
のトリプシンインヒビターおよびボーマン−バークイン
ヒビターのそれぞれの反応部位である−Arg−Ile−およ
び−Lys−Ser−というアミノ酸配列、並びに哺乳類の血
清中に存在するプロテアーゼインヒビターの一種である
インター−α−トリプシンインヒビターの反応部位のア
ミノ酸配列と高い相同性を示すアミノ酸配列を有するこ
とを見出し、この部分を含む合成ペプチドが生理活性物
質として有効ではないかと考えるに至った。

そこで、この部分を含む新規ペプチドを合成するとと
もに、当該ペプチドをはじめとしてHIVの外膜蛋白関連
ペプチドのプロテアーゼ阻害効果を検討し、先に（１）下式（Ａ）のアミノ酸配列を有するペプチドまた
はその薬理学的に許容される塩。

（２）少なくとも下式（Ｂ）のアミノ酸配列を有するペ
プチドまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分と
するプロテアーゼ阻害剤。

を提案している（特願昭63−310634号）。

本発明者らはこのような状況下に、さらに研究を重ね
たところ、式（Ｂ）のアミノ酸配列の一部である後記式
（IV）で表される、極めて少ないアミノ酸よりなるアミ
ノ酸配列部位を有すれば、プロテアーゼ、就中トリプシ
ンおよびキモトリプシンの活性を極めて有為に阻害する
ことを見出すとともに、後記の式（Ｉ）、（II）および
（III）で表されるペプチドを創製した。

本発明はかかる新知見に基づいて完成されたものであ
り、本発明は下記（１）および（２）に関する。

（１）少なくとも下式（IV）のアミノ酸配列部位を有
し、かつ下式（Ｖ）のアミノ酸配列部位を有しない、プ
ロテアーゼ阻害活性を有するペプチド〔以下、このペプ
チドをペプチド（IV）誘導体という〕またはその薬理学
的に許容される塩（以下、単に塩ともいう）を有効成分
とするプロテアーゼ阻害剤。

（２）プロテアーゼ阻害活性を有するペプチドが、下
記式（Ｉ）〜（III）から選ばれるアミノ酸配列を有す
るペプチド〔以下、各々ペプチド（Ｉ）、ペプチド（I
I）およびペプチド（III）という〕である前記（１）の
プロテアーゼ阻害剤。

本明細書において、薬理学的に許容される塩は、低毒
性であれば特に制限されるものではなく、塩酸塩、酢酸
塩、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩等の有機酸塩、
アルカリ金属塩（ナトリウム塩、カリウム塩等）等の無
機酸塩があげられる。

本発明において式（IV）で表されるアミノ酸配列はHI
Vの外被蛋白質（gp120）における一部のアミノ酸配列に
該当するものである。しかして、ペプチド（IV）誘導体
は少なくとも上記の式（IV）で表されるアミノ酸配列部
位を有するペプチドであれば特に制限はなく、当該アミ
ノ酸配列に付加的に１種以上のアミノ酸がペプチド結合
したもの、その抗原性を減ずるためにこれらペプチドを
ポリエチレングリコールまたはその誘導体（ポリエチレ
ングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール
等）にて修飾したペプチド、その末端「−Gly」または
／および「Arg−」部位に水素が付加されて、当該部分
が各々末端アミノ酸となっているもの等が例示され、上
記ペプチド（Ｉ）、（II）および（III）、HIVの外被蛋
白由来のもの、これらの修飾化合物等のHIVの外被蛋白
質関連ペプチドが例示される。

本願発明におけるペプチド（Ｉ）、（II）および（II
I）を含むペプチド（IV）誘導体はgp120の分解、通常の
ペプチド化学において使用されるペプチド合成法、修飾
法等によって製造される。

ペプチド合成法としては、固相法、液相法のいずれで
もよい。固相法は、たとえば次のようにして行われる。
即ち、まずアミノ基が保護されたＣ末端アミノ酸をカル
ボキシル基によって不溶性担体に結合させる。不溶性担
体としては自体既知のものを使用すればよい。次にアミ
ノ保護基を除去した後、アミノ酸配列に従って順次アミ
ノ基の保護されたアミノ酸をペプチド結合させて一段ず
つ反応させ全アミノ酸配列を合成した後、不溶性担体を
除去することによって製造される。この際、反応性の官
能基はペプチド合成において既知の保護基によって保護
しておくことが好ましい。

かくして製造されたペプチドは、たとえばイオン交換
樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー等のペプチド化学において
通常使用される精製方法によって任意の純度のものとし
て精製することができる。

上記のようにして製造されたペプチドは自体既知の方
法によって塩とすることができ、また塩を自体既知の方
法によって加水分解することによって遊離のペプチドが
製造される。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基等に
関して略号で表示する場合、それらはIUPACIUB Commiss
ion on Biological Nomenclatureによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
次にあげる。

Thr:スレオニン Arg:アルギニン Pro:プロリン Lys:リジン Ile:イソロイシン Gln:グルタミン Gly:グリシン Ala:アラニン Phe:フェニルアラニン Val:バリン His:ヒスチジンｔ−BOC:t−ブチルオキシカルボニル〔作用・効果〕ペプチド（Ｉ）、（II）および（III）を包含するペ
プチド（IV）誘導体およびその塩はヒト、イヌ、ウシ、
ウマ、マウス、ラット等の哺乳動物に対して優れたプロ
テアーゼ阻害活性、特にトリプシン阻害活性、キモトリ
プシン阻害活性を有するものであり、抗炎症剤、抗腫瘍
剤、発癌抑制剤等として、また免疫グロブリン療法用の
抗体作製のハプテン等として有用なものである。

本発明のプロテアーゼ阻害剤は、通常ペプチド（IV）
誘導体、その塩の凍結乾燥品として製剤化されて経口的
または非経口的に投与され、その剤型は投与経路等によ
って異なる。

本発明のプロテアーゼ阻害剤の好ましい剤型として
は、たとえば注射剤、カプセル剤、錠剤、クリーム、軟
膏剤、貼付剤、うめこみ剤等が例示され、これらは自体
既知の方法によって製造される。

たとえば、ペプチド（IV）誘導体およびその塩を抗炎
症の治療剤として使用する場合、その投与量は、たとえ
ば注射剤の場合、ペプチド（IV）誘導体またはその塩と
して１日0.1〜1000mg/人が一般的であり、これを１日１
〜数回に分けて投与される。

実験例１トリプシン活性に対するペプチド（Ｉ）の阻害効果
を、酵素反応の速度論的解析により示した。

市販の精製トリプシン1pg、50mMトリス−塩酸塩緩衝
液pH8.0、0.15塩化ナトリウムおよび基質であるｔ−ブ
チルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−セ
リル−Ｌ−アルギニン４−メチル−クマリル−７−アミ
ドからなる反応液中に、ペプチド（Ｉ）、または対照と
して蒸留水を添加し、螢光セル内で25℃で反応させ、励
起波長380nm、発光波長440nmの螢光強度を測定すること
によって酵素活性を算出した。50μＭのペプチド（Ｉ）
の存在下でのラインウィーバー・バークプロットのパタ
ーンを第１図に示した。ラインウィーバー・バークプロ
ットは、上記の反応液中で基質濃度25、33.3、50、100
μＭにおける酵素活性を、１秒間に酵素が基質と反応し
７−アミノ−４−メチルクマリンを１ピコモル生成させ
る酵素単位を1pKatとして算出し、各々の基質濃度の逆
数に対して、算出した酵素活性の逆数をプロットするこ
とにより得た。

この結果からペプチド（Ｉ）によるトリプシン活性の
阻害が拮抗型であることがわかる。第１図中、○はコン
トロール、●は50μＭのペプチド（Ｉ）存在下での結果
である。

実験例２ α−キモトリプシン活性に対するペプチド（Ｉ）の阻
害効果を、酵素反応の速度論的解析により示した。

市販の精製α−キモトリプシン20ng、50mMトリス−塩
酸塩pH8.0、10mM塩化ナトリウムおよび基質であるサク
シニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリル−
Ｌ−フェニルアラニル４−メチル−クマリル−７−アミ
ドからなる反応液中にペプチド（Ｉ）、または対照して
蒸留水を添加し、実験例１と同様の方法にてラインウィ
ーバー・バークプロットを得た。50μＭのペプチド
（Ｉ）の存在下でのラインウィーバー・バークプロット
のパターンを第２図に示した。

この結果からペプチド（Ｉ）によるα−キモトリプシ
ン活性の阻害が不拮抗型であることがわかる。第２図
中、○はコントロール、●は50μＭのペプチド（Ｉ）存
在下での結果である。

実験例３ペプチド（Ｉ）、ペプチド（Ｉ）のアミノ酸配列の一
部から成るペプチドおよびペプチド（Ｉ）のアミノ酸配
列と異なる配列から成るペプチドについて、トリプシン
およびα−キモトリプシンに対する阻害定数を求めた。

阻害定数は、拮抗阻害を示すトリプシンに対してはデ
ィクソンプロット、不拮抗阻害を示すα−キモトリプシ
ンに対してはラインウィーバー・バークプロットから算
出した。ディクソンプロットは、実験例２と同様の反応
液中で、濃度が０、20、40、60μＭのペプチドを添加し
た場合の酵素活性を算出し、各ペプチド濃度に対して酵
素活性の逆数をプロットすることにより得た。

トリプシンおよびα−キモトリプシンに対する阻害定
数を第１表に示した。この結果から、ペプチド（Ｉ）の
みがトリプシン及びα−キモトリプシンの両方に対して
著しい阻害効果を持つことが示された。また、トリプシ
ンに対しては、アルギニンとリジンの数に依存した阻害
であるのに対し、α−キモトリプシンに対しては、ペプ
チド（Ｉ）が特異的に阻害していることがわかる。

I:イソロイシン R:アルギニン Q:グルタミン G:グリシン P:プロリン A:アラニン F:フェニルアラニン V:バリン実験例４ペプチド（Ｉ）、ペプチド（II）、ペプチド（III）
の、キモトリプシン活性に対する阻害効果を調べた。

実験例１と同様の方法にて基質濃度を100μＭとした
場合のキモトリプシン活性を、ペプチドを加えないコン
トロールの活性を100％とした相対活性で表わした。ペ
プチド（Ｉ）、（II）および（III）の濃度依存性を第
３図に示した。

この結果からペプチド（IV）誘導体であるペプチド
（II）および（III）は、ペプチド（Ｉ）と類似のトリ
プシン阻害効果を示すことがわかる。第３図中、●はペ
プチド（Ｉ）、▲はペプチド（II）、■はペプチド（II
I）の存在下での結果である。

実験例５ペプチド（Ｉ）、ペプチド（II）および（III）のα
−キモトリプシン活性に対する阻害効果を調べた。

実験例２と同様の方法にて基質濃度を100μＭとした
場合のα−キモトリプシン活性を、ペプチドを加えない
コントロールの活性を100％とした相対活性で表わし
た。ペプチド（Ｉ）、（II）および（III）の濃度依存
性を第４図に示した。

この結果からペプチド（II）および（III）は、ペプ
チド（Ｉ）と類似のキモトリプシン阻害効果を示すこと
がわかる。第４図中、●はペプチド（Ｉ）、▲はペプチ
ド（II）、■はペプチド（III）存在下での結果であ
る。

比較例１ペプチド（Ｉ）の阻害効果を、α−キモトリプシンを
特異的に阻害する市販のプロテアーゼ合成阻害剤である
Ｌ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチ
ルケトン（TPCK）の効果と比較した。

実験例２と同様の方法にて、基質濃度を50μＭとし、
ペプチド（Ｉ）の代わりにTPCKを添加したものとの相対
活性を比較した。

ペプチド（Ｉ）およびTPCKの濃度依存性を第５図に示
した。

この結果からペプチド（Ｉ）の方がTPCKよりも阻害効
果が大きいことがわかる。第５図中、●はペプチド
（Ｉ）、○はTPCK存在下での結果である。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する
が、これらは本発明を何ら限定するものではない。

なお、以下の実施例で使用されるアミノ酸は、特に言
及しない限り何れもＬ−体である。

合成例１ペプチド（Ｉ）の合成を行なった。

ペプチド合成は、アプライド・バイオシステムズ社製
ペプチドシンセサイザー430Aを用い、固相法により行な
った。即ち、0.5ミリモルのｔ−Boc−Ｌ−バリン結合フ
ェニルアセトアミドメチル樹脂（スチレン−１％ジビニ
ルベンゼン共重合体）に、Ｎ末端をｔ−Bocで保護した
２ミリモルのｔ−Bocアミノ酸をN,N−ジメチルホルムア
ミド中、１ミリモルN,N−ジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを用いた対称アミノ酸無水分法で縮合し、ペプチド
結合を１個ずつ延長させる逐次延長法にて行なった。た
だし、Gln,Argの縮合については、N,N−ジメチルホルム
アミド中、１ミリモルのヒドロキシベンゾトリアゾール
を用いた活性エステル法で２回縮合した。ｔ−Bocアミ
ノ酸の側鎖の保護基としては、Argでは2,4,6−トリメチ
ルベンゼンスルホニル基、LysではＮ−ｔ−ブトキシカ
ルボニル−Ｎ−２−クロロベンジルオキシカルボニル
基、SerおよびThrではベンジル基をそれぞれ用いた。

ペプチドの標準合成プログラムは、脱保護として60％
トリフルオロ酢酸／ジクロロメタンで１分または15分
間、洗浄としてジクロロメタンで１分間を３回、中和と
して10％N,N−ジイソプロピルエチルアミンで１分間を
２回、洗浄としてN,N−ジメチルホルムアミドで１分間
を６回、縮合としてN,N−ジメチルホルムアミド中でN,N
−ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いた対称アミノ
酸無水物法を20分間、洗浄としてN,N−ジメチルホルム
アミドで１分間を２回およびジクロロメタンで４回行
う。これらの標準合成プログラムは、各アミノ酸に対し
て、反応温度および反応時間等が詳細にマイクロコンピ
ュータにより制御されている。

ペプチド自動合成装置により得られたペプチド樹脂
は、トリフルオロメタンスルホン酸により支持体樹脂お
よびアミノ酸側鎖の保護基を切断した。即ち、合成ペプ
チド樹脂1gおよびチオアニソール1ml、エタンジチオー
ル500μを室温で10分間撹拌し、フラスコを氷水で冷
却しながらトリフルオロ酢酸を10ml加え、10分間撹拌す
る。次に1mlのトリフルオロメタンスルホン酸を加え、
フラスコを氷水から取り出し室温で30分間撹拌する。冷
ジエチルエーテルをペプチドの沈澱が出なくなるまでフ
ラスコに加え、１分間撹拌しテフロンフィルターで結晶
を濾過し、これをさらに少量のトリフルオロ酢酸で溶解
し、冷ジエチルエーテル中に移送し、再びテフロンフィ
ルターで濾過し、これを2N酢酸等にて溶解し粗精製ペプ
チドを得た。

粗精製ペプチドは、オクタデシル基を結合させたシリ
カゲル充填剤から成る逆相カラム（直径2cm、長さ25c
m）による高速液体クロマトグラフィー（カラム:YMC
Ｒ−ODS−５）により精製を行なった。溶出は移動相と
して0.1％トリフルオロ酢酸を用い90％アセトニトリル
を30％〜70％直線濃度勾配させることにより行なった
（流速5ml/min.）。精製標品のクロマトグラムは第６図
（220nmの紫外吸収で検出）に示した通りである。

精製したペプチドは、１ナノモルを気相シーケンサー
により分析した。その結果、分析サイクル１〜12で検出
されたアミノ酸残基は、順に、Ile,Arg,Ile,Gln,Arg,Gl
y,Pro,Gly,Arg,Ala,Phe,Valであり、目的とするペプチ
ド（Ｉ）が得られたことが確認された。精製後のペプチ
ドの収量は110mgであった。

合成例２ペプチド（II）の合成を行なった。

ペプチド合成は、合成例１と同様の方法で行なった。
加えて、ｔ−Bocアミノ酸側鎖の保護基は、Hisではジニ
トロフェニル基を用いた。

合成したペプチド樹脂は、Hisを含むので合成例１と
同様のトリフルオロメタンスルホン酸による切断を行う
前に、次の前処理を行なった。ペプチド樹脂にN,N−ジ
メチルホルムアミド24ml、チオフェノール1mlを加え、
室温で１時間撹拌後、テフロンフィルターにて吸引濾過
し、10mlジクロロメタンで３回洗浄および乾燥させた。
さらに、この樹脂を０℃に保ちながら、ｍ−クレゾール
1ml、ジメチルスルフィド3ml、トリフルオロ酢酸5ml、
トリフルオロメタンスルホン酸1ml中で３時間反応さ
せ、テフロンフィルター上で冷ジエチルエーテルで洗
浄、乾燥後、合成例１と同様の方法にて切断した。

合成例１と同様の方法で高速液体クロマトグラフィー
によって精製した。精製標品のクロマトグラムは第７図
（220nmの紫外吸収で検出）に示した通りである。

合成例１と同様の方法で分析した結果分析サイクル１
〜11で検出されたアミノ酸残基はIle,His,Ile,Gly,Pro,
Gly,Arg,Ala,Phe,Val,Thrであり、目的とするペプチド
（II）が得られたことが確認された。精製後のペプチド
の収量は180mgであった。

合成例３ペプチド（III）の合成を行なった。

ペプチド合成は、合成例１と同様の方法で行った。

合成例１と同様の方法で高速液体クロマトグラフィー
によって精製した。当該クロマトグラムは第８図（220n
mの紫外吸収で検出）に示した通りである。

合成例１と同様の方法で分析した結果、分析サイクル
１〜12で検出されたアミノ酸残基は、Val,Phe,Ala,Arg,
Gly,Pro,Gly,Arg,Gln,Ile,Arg,Ileであり、目的とする
ペプチド（III）が得られたことが確認された。

製剤例１ペプチド（Ｉ）を精製した後、アンプルに注入し凍結
乾燥させ封入して、100mg/アンブルの注射用製剤を得
た。

製剤例２マクロゴール軟膏（第８改正日本薬局方）（マクロゴ
ール4000 50g、マクロゴール400 50gを混合したも
の）に1gの凍結乾燥ペプチド（Ｉ）を混合よく練り均一
として１％軟膏製剤を得た。

製剤例３製剤例１において、ペプチド（Ｉ）に代えてペプチド
（II）を用いて注射用製剤を得た。

製剤例４製剤例２において、ペプチド（Ｉ）に代えてペプチド
（II）を用いて軟膏剤を得た。

製剤例４製剤例２において、ペプチド（Ｉ）に代えてペプチド
（III）を用いて軟膏剤を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図はラインウィーバー・バークプロットによる、本
発明のプロテアーゼ阻害剤（ペプチド（Ｉ）〕のトリプ
シンに対する阻害効果を示すグラフである。第２図は、ラインウィーバー・バークプロットによる、
本発明のプロテアーゼ阻害剤〔ペプチド（Ｉ）〕のα−
キモトリプシンに対する阻害効果を示すグラフである。第３図は、ペプチド（Ｉ）、（III）および（IV）のト
リプシンに対する濃度依存性の阻害効果を示すグラフで
ある。第４図は、ペプチド（Ｉ）、（III）および（IV）のα
−キモトリプシンに対する濃度依存性の阻害効果を示す
グラフである。第５図は、本発明のプロテアーゼ阻害剤〔ペプチド
（Ｉ）〕と、市販の合成プロテアーゼ阻害剤（TPCK）の
α−キモトリプシンに対する阻害効果を比較したグラフ
である。第６図は、精製したペプチド（Ｉ）の高速液体クロマト
グラフィーのチャートである。第７図は、精製したペプチド（II）の高速液体クロマト
グラフィーのチャートである。第８図は、精製したペプチド（III）の高速液体クロマ
トグラフィーのチャートである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/99 Ａ６１Ｋ 37/64 ＡＤＵ (56)参考文献特開平２−69194（ＪＰ，Ａ) 国際公開88／9181（ＷＯ，Ａ１) 欧州公開311219（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開339504（ＥＰ，Ａ２) ＡｃｔａＢｉｏｃｈｅｍ．Ｐｏｌ．，28（３−４）（1981），Ｐ. 241−251 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/155,7/06,7/08 A61K 37/64 C12N 9/99 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも式のアミノ酸配列部位を有し、かつ式のアミノ酸配列部位を有しない、プロテアーゼ阻害活性
を有するペプチドまたはその薬理学的に許容される塩を
有効成分とするプロテアーゼ阻害剤。
【請求項２】プロテアーゼ阻害活性を有するペプチド
が、下記式（Ｉ）〜（III）から選ばれるアミノ酸配列
を有するペプチドである請求項１に記載のプロテアーゼ
阻害剤。