DE69126301T2

DE69126301T2 - Hiv-induzierte synzytien blockierender anti-cd-4-antikörper

Info

Publication number: DE69126301T2
Application number: DE69126301T
Authority: DE
Inventors: Linda C. West Newton Ma 02165 Burkly; Patricia L. Quincy Ma 02169 Chisholm; Joseph J. Winchester Ma 01890 Rosa; Margaret D. Winchester Ma 01890 Rosa; David W. Wellesley Ma 02181 Thomas
Original assignee: Biogen Inc
Current assignee: Biogen MA Inc
Priority date: 1990-11-27
Filing date: 1991-11-27
Publication date: 1998-01-02
Anticipated expiration: 2011-11-28
Also published as: EP0512112A1; CA2073031A1; ATE153536T1; JPH05505112A; GR3024274T3; JP2005041859A; EP0512112B1; AU9154391A; JP2002356499A; CA2073031C; OA10079A; AU662891B2; WO1992009305A1; HK1007686A1; JP2007175055A; US5871732A; JP4642035B2; JP2007151556A; DE69126301D1; DK0512112T3

Description

Technischer Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung betrifft anti-CD4-Antikörper-Homologe diese Homologe codierende DNA-Sequenzen, vorbeugende immuntherapeutische und diagnostische Zusammensetzungen umfassend diese Homologe, und Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Krankheiten in Säugern, einschließlich des Menschen, verursacht durch Infektionserreger, deren primäres Ziel CD4&spplus;-Lymphocyten sind. Solche Krankheiten schließen das Erworbene Immunschwäche-Syndrom (aquired immune deficiency syndrome "AIDS"), den mit AIDS- related Komplex und die menschliche Immunschwächevirus-Infektion ein.

Hintergrund der Erfindung

CD4 ist ein Zelloberflächen-Glycoprotein der CD4&spplus;-T-Lymphocyten (Helfer/Inducerzellen). CD4&spplus;-Lymphocyten sind wichtige regulatorische Zellen des menschlichen Immunsystems. Sie vermitteln die T-Zellvermehrung Lymphokinfreisetzung und die die Immunglobulinfreisetzung beeinflussenden Helferzellwechselwirkungen. Die primären Ziele bestimmter Infektionserreger, einschließlich des menschlichen Immunschwächevirus (human immunodeficiencey virus, "HIV"), sind Zellen, die das CD4-Glycoprotein tragen. Solche Zellen umfassen CD4&supmin;-Lymphocyten Makrophagen und bestimmte Gehirnzellen.
Diese Anmeldung verwendet den allgemeinen Begriff "Menschliches Immunschwächevirus" (human immunodeficiency virus, "HIV") um auf unabhängige Isolate von AIDS-Patienten und daßon abgeleitete Laborstämme zu verweisen. Der Begriff HIV umfaßt Viren die anderswo als menschliches lymphotropes T-Zell-Virus vom Typ III ("HTLV-III") Lymphadenopathie-assoziiertes Virus ("LAV") und AIDS-assoziiertes Retrovirus ("ARV") identifiziert wurden. Die HIV-Terminologie wurde durch das Human Retrovirus Subcommittee of the International Committee on Taxonomy of Viruses eingeführt.
Nach der Infektion mit HIV werden die CD4&spplus;-Lymphocyten funktionsunfähig gemacht und ihre Zahl nimmt ab. Dieser T-Zellschwund wurde sowohl auf rezidivierende Infektionscyclen, die jus der Lyse infizierter Zellen resultieren, als auch auf die Fusion (Syncytienerzeugung) zwischen infizierten und nicht infizierten CD4&spplus;-Zellen zurückgeführt (Sodroski J et al. "Role Of The HTLV-III/LAV Envelope In Syncytium Formation And Cytopathicity". Nature 322 (1986), 470-474). Die Abnahme der CD4&spplus;-Lymphocyten hat eine Immunsuppression zur Folge wodurch der Patient für einen großen Bereich von opportunistischen Infektionen und Malignitätenanfällig wird. Eine solche Immunsuppression wird bei Patienten beobachtet, die am Erworbenen Immunschwäche-Syndrom ("AIDS") leiden. In einigen Fällen wird AIDS von Störungen des Zentralnervensystems begleitet, von denen man annimmt daß sie durch die HIV-Infektion von CD&spplus;-Gehirnzellen direkt verursacht werden. Dem vollständigen klinischen Auftreten von AIDS geht üblicherweise der mit AIDS-related Komplex ("ARC") voraus, ein Syndrom, das durch Symptome wie persistente generalisierte Lymphadenopathie. Fieber und Gewichtsverlust gekennzeichnet ist. Es wird angenommen daß HIV der ätiologis che Erreger für AIDS und dessen Vorstufe ARC ist (Sangadharan M.G. et al., "Detection. Isolation And Continuous Production Of Cytophathic Retroviruses (HTLV- III) From Patients With AIDS und Pre-AIDS". Science 224 (1984), 497-508).
Das wichtigste Oberflächen(Hüll)protein von HIV wird als Vorläuferpolypeptid (gp160) synthetisiert, das in reifer Form gespalten wird in ein großes stark glycosyliertes Protein der äußeren Membran mit etwa 481 Aminosäuren (gp120) und ein kleineres Transmembranprotein von etwa 345 Aminosäuren, das glycosyliert sein kann (gp41) (Ratner L. et al., "Complete Nucleotide Sequence Of The AIDS Virus HTLV-III" Nature 313 (1985). 277-284).
Man nimmt an, daß das HIV-gp120 selektiv an das (die) CD4-Epitop(e) bindet, so daß HIV CD4&spplus;-Zellen zielgerecht angeht (Dalgleish A.G. et al.,"The CD4 (T4) Antigen Is An Essential Component Of The Receptor For The AIDS Retrovirus". Nature 312 (1984). 763-767; Klatzmann D. et al., "T-Lymphocyte T4 Molecule Behaves As The Receptor For Human Retrovirus LAV". Nature 312 (1984), 767-768). Es wird angenommen, daß die Bindung von HIV-gp120 an Zelloberflächen-CD4 die Infektion der CD4&spplus;-Zelle initiiert. Es wird auch angenommen, daß es die Membranfusion von infizierten CD4&spplus;-Zellen mit nicht infizierten CD4&spplus;-Zellen initiiert (d.h. die Syncytienerzeugung), die zur Übertragung des Virus von Zelle zu Zelle und dessen cytopathischen Wirkungen beiträgt (Habeshaw J.A. und Dalgleish A.G., "The Relevance Of HIV env/CD4 Interactions To The Pathogenesis Of Aquired Immune Deficiency Syndrome", J. AIDS 2 (1989), 457-468; Lifson J.D. und Engleman E.G., "Role Of CD4 In Normal Immunity And HIV Infection" Immunol. Rev. 109 (1989), 93- 117).
Das reife CD4 (auch bekannt als T4) ist ein aus 433 Aminosäuren bestehendes Glycoprotein, das ein Molekulargewicht von 55 000 bis 62 000 Dalton aufweist, mit einer extrazellulären Domäne (etwa AA&sub1;-AA&sub3;&sub7;&sub5;), einer Membran-spannenden Domäne (etwa AA&sub3;&sub7;&sub6;-AA&sub3;&sub9;&sub5;) und einem cytoplasmatischem Schwanz (etwa AA&sub3;&sub9;&sub6;-AA&sub4;&sub3;&sub3;). CD4 wird als Präprotein mit einer Signalsequenz von 25 Aminosäuren synthetisiert. Es wurde über die Nucleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosequenz für die das vollständige menschliche CD4 codierende cDNA berichtet (Maddon P.J. et al., "The Isolation And Nucleotide Sequence Of A cDNA Fncoding The T Cell Surface Protein T4: A New Member Of The Immunoglobulin Gene Uamily". Cell 42 (1985), 93-104: Littman D.R. et al., "Corrected CD4 Sequence". Cell 55 (1988), 541). Die extrazelluläre Domäne von CD4 besteht aus vier Tandem-Bereichen mit einer Homologie zu den Immunglobulin V-Bereichen V1 (überspannt etwa AA&sub1;-AA&sub1;&sub0;&sub0;)), V2 (überspanntetwa AA&sub1;&sub0;&sub1;-AA&sub1;&sub8;&sub0;), V3 (überspannt etwa AA&sub1;&sub8;&sub1;-AA&sub2;&sub9;&sub0;) und V4 (überspannt etwa AA&sub2;&sub9;&sub1;-AA&sub3;&sub7;&sub5;) [vgl. Maddon et al., Cell,a.a.O.; Wang J. et al., "Atomic Structure Of A Fragment Of Human CD4 Containing Two immunoglobulin-Like Domains". Nature 348 (1990), 411-418].
Der CD4 V1-Bereich wurde als Bindungsstelle von HIV-gp 120 identifiziert (Arthos J. et al., "Identification Of The Residues In Human CD4 Critical For The Binding Of HIV", Cell 57 (1989), 469-481: Mizukami T. et al., "Binding Region For Human Immunodeficiency Virus (HIV) And Epitopes For HIV-Blocking Monodonal Antibodies Of The CD4 Molecule Defined By Site-Directed Mutagenesis", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 9273-9277: Peterson A. und Seed B., "Genetic Analysis Of Monoclonal Antibody And HIV Binding Sites On The Human Lymphocyte Antigen CD4", Cell 54 (1988), 65-72: Landau N.R. et al., "The Envelope Glycoprotein Of The Human Immunodeficiency Virus Binds To The Immunoglobulin-Like Domain Of CD4", Nature 334 (1988), 159-162: Clayton L.K. et al., "Subsütution Of Murine For Human CD4 Residues Identifies Amino Acids Critical For HIV-gp120 Bindung", Nature 335 (1988), 363-366).
Die mögliche Fähigkeit von anti-CD4-Antikörpern&sub9; eine HIV-Infektion durch die Blockierung der HIV-gp120-Bindung an CD4 zu verhindern oder zu behandeln, veranlaßte eine Anzahl von Forschern, die Fähigkeit bestimmter anti-CD4-Antikörper zu untersuchen, die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen zu blockieren und auch die Immunsuppressivität einiger dieser Antikörper zu studieren.
Es wurde zum Beispiel berichtet daß die CD4 V1-spezifischen Antikörper Leu3A und OKT4A wirksame Blocker der HIV-induzierten Syncytienerzeugung sind (Sattentau Q.J.,"Epitopes Of The CD4 Antigen And HIV Infection" Science 234 (1986) 1120-1123; Jameson B.A. et al., "Location And Chemical Synthesis Of A Binding Site For HIV-1 On The CD4 Protein", Science 240 (1988) 1335-1339; Peterson und Seed, Cell. a.a.O.). Jedoch weisen diese Antikörper bedeutende Nachteile für die Verwendung als Arzneimittel zur Behandlung einer HIV-Infektion auf. Zum Beispiel können sie nicht an ein CD4-Molekül binden oder auf ein CD4-Molekül einwirken, das bereits an HIV-gp120 gebunden ist, da OKT4A und Leu3A CD4-Epitope erkennen, die sich mit der gp120-Bindungsstelle überlappen (vgl. z.B. Bates P.A. et al., "A Predicted Three-Dimensional Structure For The Human Immunodeficiency Virus Binding Domains Of The CD4 Antigen", Prot. Engng. 3 (1989), 13-21 Mcdougal J.S. et al., "Binding Of The Human Retrovirus HTLV-III/LAV/ARV/HIV To The CD4 (T4) Molecule: Conformation Dependence, Epitope Mapping, Antibody Inhibition And Potential For Idoiypic Mimicry", J. Immunol. 137 (1986), 2937-2944; Landau et al., Nature a.a.O.; Dalgleish A.G. et al., "Neutralisation Of HIV Isolates By Anti-Idiotypic Antibodies Which Mimic The T4 (CD4) Epitope: A Potential AIDS Vaccine", Lancet 2 (1987), 1047-1050).
Es wurde auch berichtet, daß OKT4A erheblich immunsuppressiv ist, was keine erwünschte Eigenschaft für ein mögliches AIDS-Behandlungsmittel ist (Lamarre D. et al., "Class II MHC Molecules And The HIV gp120 Envelope Protein Interact With Functionally Distinct Regions Of The CD4 Molecule", EMBO J. 8 (1989), 3271-3277, Biddison W.E. et al., "Possible Involvement Of The OKT4 Molecule In T Cell Recognition Of Class II HLA Antigens", J. Exp. Med. 156 (1982), 1065-1076).
Monoclonale anti-CD4-Antikörper wurden untersucht, die für andere CD4-Epitope oder -Domänen spezifisch sind, jedoch enthalten die veröffentlichten Berichte über diese Antikörper auch Hinweise auf Nachteile für die Verwendung als AIDS-Behandlungsmittel.
Ein solcher Antikörper ist OKT4B, über den berichtet wurde, daß er für die V2- Domäne von CD4 spezifisch ist (Kieber-Emmons T. et al., "The gp120-CD4 Interface: Structural, Immunological And Pathological Considerations", Biochim. Biophys. Acta 989 (1989), 281-300). Es liegen sich widersprechende Berichte im Hinblick darauf vor, ob OKT4B die HIV-gp120-Bindung an CD4 signifikant stört (Mcdougal et al. J. Immunol. a.a.O.: Lundin K. et al., "A Speeifle Assay Measuring Binding Of ¹²&sup5;I-gp120 From HIV To T4&spplus;/CD4&spplus; Cells " J. Immunol. Methods 97 (1987) 93-100; Lamarre et al.,EMBO J., a.a.O.). Und es wurde berichtet, daß OKT4B wesentlich immunsuppressiver ist als OKT4A (Lamarre et al., EMBO J., a.a.O.). Außerdem ist OKT4B ein verhältnismäßig schwacher Blocker der HIV-induzierten Syncytienerzeugung, verglichen mit OKT4A (Sattentau et al., Science, a.a.O.).
Andere anti-CD4-Antikörper über die berichtet wurde, daß sie eine Wirkung auf die HIV-induzierte Syncytienerzeugung haben und über die auch berichtet wurde, daß sie an CD4-Epitope binden, die von den durch OKT4A und Leu3A gebundenen Epitopen verschieden sind umfassen MT151, V1T4 und MT321 (Sattentau et al., Science, a.a.O.). Jedoch weisen mehrere jüngere unabhängige Studien darauf hin, daß diese nah verwandten Antikörper konfbrmationsabhängige CD4-Epitope erkennen, die sich mit dem an der gp120- Bindung beteiligten Epitop überschneiden (Sattentau Q.J. et al., "Structural Analysis Of The Human Immunodeficiency Virus-Binding Domain Of CD4", J. Exp. Med. 170 (1989) 1319- 1334; Bates et al., Prot. Engng., a.a.O.; Landau et al., Nature, a.a.O.; Merkenschlager M. et al., "Functional Epitope Analysis Of The Human CD4 Molecule", J. Immunol. 9 (1990). 2839-2845).
Ein anderer untersuchter anti-CD4-Antikörper ist OKT4, der für die V3V4-Domäne von CD4 spezifisch ist (Berger E.A. et al., "A Soluble Recombinant Polypeptide Comprising The Amino-Terminal Half Of The Extracellular Region Of The CD4 Molecule Contains An Active Binding Site For Human Immunodeficiencv Virus", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 2357-2361), OKT4 weist als Behandlungsmiuel für eine HIV-Infektion sogar größere Nachteile auf als OKT4A, Leu3A, OKT4B und andere bekannte anti-CD4-Antikörper. Beispielsweise wurde berichtet, daß OKT4 ein "Nichtblocker" der HIV-induzierten Syncytienerzeugung ist (Sattentau, Science, a.a.O.).
Vor der Erfindung der Anmelder wurde über keinen anti-CD4-Antikörper berichtet. der befähigt ist, sowohl die Bindung von HIV-gp120 an menschliches CD4 nicht signifikant zu blockieren als auch die HIV-induzierte Syncytienerzeugung wirksam zu blockieren. Ein solcher Antikörper würde deutliche Vorteile für das therapeutische Eingreifen bei AIDS. ARC und HIV-Infektionen bieten, da er zum Eingreifen nach der HIV-Bindung an CD4 oder in Verbindung mit Mitteln verwendet werden könnte, die den HIV-gp120-CD4-Bindungsvorgang blockieren. Folglich besteht die Notwendigkeit für anti-CD4-Antikörper mit einer solch besonders bevorzugten Kombination von Eigenschaften für die Verwendung bei der Behandlung von und der Vorbeugung vor AIDS ARC und HIV-Infektionen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung löst allgemein viele der vorstehend aufgezeigten Probleme, indem sie zum ersten Mal Antikörper-Homologe bereitstellt, vorzugsweise monoclonale Antikörper, die an menschliches CD4 binden ohne die Bindung von HIV-gp120 an menschliches CD4 signifikant zu blockieren, und die eine der folgenden Zusammenstellungen von Kennzeichen zeigen: (1) sie blockieren die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen mindestens so gut wie OKT4A (ein im Handel erhältlicher CD4 V1- spezifischer monoclonaler anti-CD4-Antikörper); (2) sie blockieren die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4-Zellen besser als OKT4 (ein im Handel erhältlicher CD4 V3V4-spezifischer monoclonaler anti-CD4-Antikörper) und sind in einem in vitro Tetanus-Toxoid-spezifischen Vermehrungstest weniger immunsuppressiv als OKT4A; oder (3) sie blockieren die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen mindestens so gut wie OKT4A und sind in einem in vitro-Tetanus-Toxoid-spezifischen Vermehrungstest weniger immunsuppressiv als OKT4A.
Bestimmte anti-CD4-Antikörper-Homologe dieser Erfindung binden an ein aus CD4 AA&sub1;-AA&sub1;&sub8;&sub0; bestehendes menschliches CD4-Fragment (d.h. sie sind V1V2-spezifisch) jedoch nicht an ein aus CD4 AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub3; bestehendes CD4-Fragment (d.h. sie sind nicht ausschließlich V1-spezifisch). Entsprechend inhibieren bestimmte erfindungsgemäße Antikörper-Homologe nicht signifikant die Bindung von CD4 V1-spezifischen Antikörpern an menschliches CD4. Die bevorzugten erfindungsgemäßen anti-CD4-Antikörper-Homologe inhibieren auch die Infektion von CD4&spplus;-Zellen durch HIV.
Andere bevorzugte erfindungsgemäße Antikörper-Homologe zeigen ein oder mehrere Kennzeichen, ausgewählt aus: (a) sie verursachen keine signifikante Abnahme in der Zahl der zirkulierenden CD4&spplus;-Zellen in vivo; (b) sie verursachen keine signifikante Modulation von CD4 auf der Oberfläche von CD4&spplus;-Zellen in vivo: (c) sie verursachen keine signifikante Abnahme in der Zahl der peripheren Leukocyten in vivo; und (d) sie verursachen keine signifikante Abnahme des Antikörpertiters der als Antwort auffremde Antigene in vivo ausgelöst wird.
Die vorliegende Erfindung stellt viele Arten von anti-CD4-Antikörper-Homologen bereit. Diese umfassen monoclonale Antikörper, rekombinante Antikörper rekombinante chimäre Antikörper und rekombinante humanisierte Antikörper. Die bereitgestellten Antikörper-Homologe sind vorzugsweise intakte Immunglobulinmoleküle mit je zwei schweren und leichten Ketten, sie können jedoch aus einer oder mehreren leichten Ketten einer oder mehreren schweren Ketten oder Kombinationen davon bestehen. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen anti-CD4-Antikörper-Homologe in Form von Fab-Fragmenten, Fab'-Fragmenten F(ab)&sub2;-Fragmenten, F(v)-Fragmenten oder irgendeinem anderen Immunglobulinfragment mit den vorstehend beschriebenen Kennzeichen vorliegen.
Die als 5A8, 1F8 und 5F2 bezeichneten monoclonalen Maus-Antikörper werden als bevorzugte erfindungsgemäße anti-CD4-Antikörper-Homologe bereitgestellt. 5A8 wird besonders bevorzugt.
Diese Erfindung stellt DNA-Sequenzen bereit, welche den 5A8-variablen Bereich der schweren Kette und den 5A8-variablen Bereich der leichten Kette codieren. Ebenfalls bereitgestellt werden DNA-Sequenzen, die 5A8-chimäre und 5A8-humanisierte rekombinante Antikörper unter Verwendung dieser DNA-Sequenzen oder Teile davon codieren, sowie die durch diese DNA-Sequenzen codierten Polypeptide. Ebenfalls bereitgestellt werden rekombinante DNA-Moleküle, umfassend diese DNA-Sequenzen und damit funktionell verbundene Expressionskontrollsequenzen.
Diese Erfindung betrifft 5A8-mimetische Mittel die Peptide, haib-peptidische Verbindungen oder nicht-peptidische Verbindungen sind, welche die Bindung des monoclonalen Antikörpers 5A8 an menschliches CD4 signifikant blockieren. Erfindungsgemäße 5A8- mimetische Mittel inhi bieren die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen inhibieren die Infektion von CD4&spplus;-Zellen durch HIV oder beides. Vorzugsweise zeigt ein 5A8-mimetisches Mittel die Eigenschaften eines erfindungsgemäßen Antikörper-Homologs.
Die vorliegende Erfindung stellt auch anti-CD4-Antikörper-Homologe bereit die mit einem oder mehreren Stoffen verbunden sind, ausgewählt aus erfindungsgemäßen Antikörper-Homologen und 5A8-mimetischen Mitteln nachweisbaren Mitteln, cytotoxischen Mitteln und Arzneimitteln.
Ebenfalls bereitgestellt werden Zellen, die die erfindungsgemäßen Antikörper- Homologe produzieren, ein Verfahren zur Herstellung der Antikörper-Homologe durch Züchten dieser Zellen und ein Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Hybridomzellen durch die Immunisierung eines nicht-menschlichen Säugers mit CD4&spplus;-Zellen, die CD4 auf ihrer Oberfläche exprimieren und durch die Transformation von CD4&supmin;-Gewebekulturzellen mit das vollständige menschliche CD4 codierenden DNA hergestellt wurden.
Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen anti-CD4-Antikörper-Homologen und 5A8-mimetischen Mittel machen sie insbesondere beim Nachweis, bei der Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten in Menschen nützlich, verursacht durch Infektionserreger, deren primäres Ziel CD4&spplus;-Zeilen sind, zum Beispiel der mit einer HIV-Infektion verbundenen Krankheiten ARC und AIDS. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung diagnostische und vorbeugende Zusammensetzungen und Arzneimittel bereit, umfassend die vorstehend beschriebenen anti-CD4-Antikörper-Homologe und 5A8-mimetischen Mittel, die zum Nachweis, zur Vorbeugung und Behandlung von Krankheiten in Menschen nützlich sind, verursacht durch Infektionserreger, deren primäres Ziel CD4&spplus;-Zellen sind, zum Beispiel der mit einer HIV-Infektion verbundenen Krankheiten ARC und AIDS, sowie Verfahren, bei denen diese Zusammensetzungen verwendet werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 veranschaulicht Sortierprofile Fluoreszenz-aktivierter Zellen (fluorescence activated ceil sorter ("FACS") profiles) von menschlichen peripheren Blut-Lymphocyten, gefärbt mit dem CD4 V1-spezifischen monoclonalen Antikörper Leu3A, der mit Fluoresceinisothiocyanat markiert wurde ("Leu3A-FITC"), in Gegenwart von Puffer (Figur 1A), nicht markiertem Leu3A (Figur 1B), deni CD4 V1-spezifischen monoclonalen Antikörper OKT4A (Figur 1C), dem CD4 V3V4-spezifischen monoclonalen Antikörper OKT4 (Figur 1D) oder dem erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper 5A8 (Figur 1E). Die Daten sind als Logarithmus der Fluoreszenzintensität (y-Achse) als Funktion der Vorwärtsstreuung (x-Achse) aufgetragen.
Figur 2 veranschaulicht die Immunfluoreszenzfärbung der menschlichen CD4&spplus;- Zellinie H9 mit einem erfindungsgemäßen Antikörper-Homolog (5A8) und den monoclonalen anti-CD4-Antikörpern Leu3A, OKT4A und OKT4, mit und ohne Vorinkubation mit einem Überschuß an IIIV-gp120. Die gestrichelten Linien kennzeichnen die Färbung mit einem monoclonalen anti-CD4-Antikörper und die durchgezogenen Linien kennzeichnen die Färbung mit irrelevant negativen Maus-Kontrollantikörpern in Abwesenheit (linke Profile) oder Gegenwart (rechte Profile) von überschüssigem HIV-gp120.
Figur 3 veranschaulicht die prozentuale Inhibierung der Syncytienerzeugung (quantitativ bestimmt als &sup5;¹Cr-Freisetzung) als Funktion der Antikörperkonzentration (0,026-2000 ng/ml) für einen erfindungsgemäßen Antikörper (5A8) und zwei CD4 V1-spezifische monoclonale Antikörper (Leu3A und OKT4A).
Figur 4 veranschaulicht die prozentuale Inhibierung der Syncytienerzeugung (quantitativ bestimmt als &sup5;¹Cr-Freisetzung) als Funktion der Antikörperkonzentration (3,2-10 000 ng/ml) für einen erfindungsgemäßen monoclonalen Antikörper (5A8) zwei CD4 V1-spezifische monoclonale Antikörper (Leu3A und OKT4A) und einen "OKT4-ähnlichen" monocloonalen Antikörper der für CD4-V3V4 spezifisch ist (2-103-D11).
Die Figuren 5 bis 6 veranschaulichen die Inhibierung der Tetanus-Toxoid ("TT")- induzierten Vermehrung menschlicher peripherer Blut-Lymphocyten (quantitativ bestimmt als ³H-Thvmidin-Einbau und ausgewiesen als "CPM x 10³ (Tausend)" verursacht durch ein erfindungsgemäßes Antikörper-Homolog (monoclonaler Antikörper 5A8) und verschiedene Kontrollantikörper (die CD4 V1-spezifischen Antikörper OKT4A und Leu3A und die im Isotyp übereinstimmenden Kontrollantikörper MOPC 21 und UPC 10), an den Tagen vier (Figur 5) und fünf (Figur 6) des Tests. Die Balken, die die "TT-Kontrolle" markieren, zeigen die Wachstumsbasislinie der Zellen ohne TT-Stimulation (nicht ausgefüllter Balken) und die TT- Antwort ohne irgendeinen Antikörper (ausgefüllter Balken). Die Wirkung des Antikörpers auf die Vermehrung allein, ohne TT-Stimulation, ist durch die Balken mit großen Flecken angegeben. Die Figuren 5 bis 6 zeigen auch die Wirkung auf die Vermehrung nach der TT- Stimulation (d.h. die Inhibierung der TT-Antwort), verursacht durch verschiedene Antikörper bei Konzentrationen von 10 µg/ml (punktierte Balken) (MOPC 21 und 5A8 allein), 1 µg/ml (diagonal gestreifte Balken) (alle Antikörper) und 0,1 µg/ml (Balken mit Kreuzschraffur) (alle Antikörper).
Figur 7 veranschaulicht die Zahl der peripheren Leukocyten von Rhesusaffen zu verschiedenen Zeitpunkten vor während und nach einem Behandlungsverlauf mit 5A8 (durchgezogene Linien, Mn 261-85 und Mn 251-87) oder des im Isotyp übereinstimmenden monoclonalen Kontrollantikörpers MOPC 21 (gestrichelte Linien, Mn 265-85 und Mn 265- 87). Die y-Achsen veranschaulichen die Zahl der Leukocyten (in Tausend) pro Mikroliter Blut. Die x-Achsen veranschaulichen die Tage, wobei 5A8 oder MOPC 21 an den Tagen 0, 2 und 4 injiziert wurde.
Figur 8 veranschaulicht die Anzahl der peripheren CD4&spplus;-Lymphocyten in Rhesusaffen zu verschiedenen Zeitpunkten vor während und nach dem Behandlungsverlauf mit 5A8 (durchgezogene Linien, Mn 261-85 (oberes Bild) und Mn 251-87 (unteres Bild)) oder des im Isotyp übereinstimmenden monoclonalen Kontrollantikörpers MOPC 21 (gestrichelte Linien Mn 265-85 (oberes Bild) und Mn 265-87 (unteres Bild)). Die CD4&spplus;-Zellzahl wird mittels FACS-Analyse nach dem Färben mit dem Fluoreszenz-markierten CD4 -V3V4-spezifischen monoclonalen Antikörper FITC-OKT4 (nicht ausgefüllte und ausgefüllte Kreise) oder mittels FACS-Analyse nach dem Inkubieren von isolierten Zellen mit einem Überschuß an 5A8 in vitro und anschließendem Färben mit einem Fluoreszenz-markierten Ziege-anti-Maus-Ig (nicht ausgefüllte und ausgefüllte Dreiecke) quantitativ bestimmt. Die y-Achsen veranschaulichen die CD4&spplus;-Zellzahl pro Mikroliter. Die x-Achsen veranschaulichen die Tage wobei 5A8 oder MOPC 21 an den Tagen 0 2 und 4 injiziert wurden.
Figur 9 veranschaulicht die anti-Tetanus-Toxoid-Titer von Rhesusaffen zu verschiedenen Zeitpunkten vor, während und nach Behandlung mit 5A8 (durchgezogene Linien Mn 261-85 und Mn 251-87) oder des im Isotyp übereinstimmenden monoclonalen Kontrollantikörpers MOPC 21 (gepunktete Linien Mn 265-85 und Mn 265-87). Die y-Achse veranschaulicht die Einheiten pro Milliliter Blut von anti-Tetanus-Toxoid-Antikörpern die unter Bezug auf ein Standard-anti-Tetanus-Toxoid-Immunserum erstellt wurden. Die x-Achse veranschaulicht die Tage, wobei 5A8 oder MOPC 21 an den Tagen 0 2 und 4 im iziert wurde und das Tetanus-Toxoid an den Tagen 3 und 21 injiziert wurde, Der Balken unterhalb der -Tage 0-9 veranschaulicht den Zeitraum während dem eine Sättigung der Bedeckung von CD4 durch 5A8 in Vivo auftrat.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Definitionen

Der hier verwendete Begriff "CD4" bezieht sich auf jedes CD4-Protein das von eineni natürlich vorkommenden CD4-Gen codiert wird.
Der hier verwendete Begriff "CD4&spplus;-Zellen" umfaßt Zellen die das CD4-Glycoprotein auf ihrer Oberfläche präsentieren. Solche Zellen schließen CD4&spplus;-T-Lymphocyten und CD4&spplus;-Säugergewebekulturzellen ein z.B. H9- und C8166-Zellen.
Der hier verwendete Begriff "CD4-V1" verweist auf den AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub3; umfassenden Bereich von CD4.
Der hier verwendete Begriff "CD4-V1V2" verweist auf den AA&sub1;-AA&sub1;&sub8;&sub0; umfassenden Bereich von CD4.
Der hier verwendete Begriff "CD4-V3V4" verweist auf den AA&sub1;&sub8;&sub1;-AA&sub3;&sub7;&sub5; umfassenden Bereich von CD4.
Der hier verwendete Begriff "rekombinantes lösliches CD4" oder "rsCD4" bezieht sich auf ein Polypeptid, das aus AA&sub1;-AA&sub3;&sub7;&sub5; (d.h. den Bereichen V1-V4) des menschlichen CD4 besteht.
Der hier verwendete Begriff ein "CD4 V1-spezifischer Antikörper" verweist auf einen Antikörper der an ein Epitop im V1-Bereich von CD4 bindet.
Der hier venvendete Begriff ein "CD4 V3V4-spezifischer Antikörper" bezieht sich auf einen Antikörper, der an ein Epitop im V3V4-Bereich von CD4 bindet.
Der hier verwendete Begriff ein "Antikörper-Homolog" bezieht sich auf ein Protein, umfassend eine oder mehrere Polypeptide, ausgewählt aus leichten Immunglobulinketten, schweren Immunglobulinketten und Antigen-bindenden Fragmenten davon, das an ein oder mehrere Antigene binden kann. Die aus mehr als einem Polypeptid zusammengesetzten Einzelpolypeptide eines Antikörper-Homologs können gegebenenfalls durch Disulfidbrücken oder anders kovalent miteinander vernetzt sein. Entsprechend umfassen Antikörper-Homologe intakte Immunglobuline der Typen IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (sowie Subtypen davon). worin die leichten Ketten des Immunglobulins vom Kappa- oder Lambda-Typ sein können. Antikörper-Homologe umfassen auch Teile von intakten Immunglobulinen, die ihre Antigen- Bindungsspezifität beibehalten, z.B. Fab-Fragmente, Fab'-Fragmente F(ab')&sub2;-Fragmente. F(v)-Fragmente Monomere oder Dimere der schweren Kette Monomere oder Dimere der leichten Kette aus einer schweren und einer leichten Kette bestehende Diniere und ähnliches.
Der hier verwendete Begriff ein "humanisiertes rekombinantes Antikörper-Homolog" bezieht sich auf ein anlänglich von einem nicht-menschlichen Säuger abgeleitetes Antikörper-Homolog bei dem die rekombinante DNA-Technik angewendet wurde, um einige oder alle der nicht für die CD4-Bindung erforderlichen Aminosäuren durch Aminosäuren aus entsprechenden Bereichen einer menschlichen leichten oder schweren Immunglobulinkette zu ersetzen.
Der hier verwendete Begriff ein "chimäres rekombinantes Antikörper-Homolog" bezieht sich auf ein anfänglich von einem nicht-menschlichen Säuger abgeleitetes Antikörper-Homolog, bei dem die rekombinante DNA-Technik angewendet wurde, um alle oder einen Teil der hinge-Region und der konstanten Bereiche der leichten Kette der schweren Kette oder beider durch entsprechenden Bereiche aus einer leichten oder schweren Immunglobulinkette eines Säugers einer verschiedenen Art vorzugsweise eines Menschen zu ersetzen.
Der hier verwendete Ausdruck ein Antikörper-Homolog das "die Bindung eines CD4 V1-spezifischen Antikörpers an menschliches CD4 nicht signifikant blockiert", bezieht sich auf eines, das eine Reduzierung von nicht mehr als 30% bei der Bindung des CD4 V1- spezifischen Antikörpers entweder an menschliches rsCD4 (CD4-V1-V4) oder an auf einer CD4&spplus;-Zelle präsentiertes menschliches CD4 verursacht.
Der hier verwendete Ausdruck ein Antikörper-Homolog das "die Bindung von HIV-gp120 an menschliches CD4 nicht signifikant blockiert" bezieht sich auf eines, das eine Reduzierung von nicht mehr als 30% bei der Bindung von HIV-gp120 entweder an menschliches rsCD4 (CD4-V1-V4) oder an auf einer CD4&spplus;-Zelle präsentiertes menschliches CD4 verursacht.
Der hier verwendet Begriff "OKT4" verweist auf den monoclonalen anti-CD4- Maus-Antikörper, der im Handel von Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ, unter der Katalognummer 7042 erhältlich ist.
Der hier verwendet Begriff "OKT4A" verweist auf den monoclonalen anti-CD4- Maus-Antikörper, der im Handel von Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ, unter der Katalognummer 7142 erhältlich ist.
Der hier verwendet Begriff ein "5A8-mimetisches Mittel" bezieht sich auf eine Verbindung, die eine Reduzierung von mindestens 30% bei der Bindung des monoclonalen Antikörpers 5A8 entweder an menschliches rsCD4 (CD4 V1-V4) oder an auf einer CD4&spplus;- Zelle präsentiertes menschliches CD4 verursacht.
Der hier verwendete Ausdruck ein Antikörper Homolog, "verursachend keine signifikante Abnahme in der Zahl der zirkulierenden CD4&spplus;-Zellen in vivo", bezieht sich auf ein Antikörper-Homolog, das innerhalb von 24 Stunden nach der Verabreichung an einen Säuger mit normaler Immunfunktion eine Abnahme von weniger als 50% in der Anzahl der zirkulierenden CD4&supmin;-Zellen verursacht, verglichen entweder mit der Anzahl vor der Verabreichung für diesen Säuger oder mit der Anzahl in einem Kontrollsäuger, dem ein mit dem Isotyp übereinstimmendes Antikörper-Homolog mit irrelevanter Spezifität anstelle eines erfindungsgemäßen Anti körper-Homologs verabreicht wurde.
Der hier verwendete Ausdruck ein Antikörper-Homolog "verursachend keine signifikante Modulation von CD4 auf der Oberfläche von CD4&spplus;-Zellen in vivo", bezieht sich auf ein Antikörper-Homolog, das innerhalb von 24 Stunden nach der Verabreichung an einen Säuger mit normaler Immunfunktion eine Abnahme von weniger als dem Zehnfachen in der Anzahl der CD4-Moleküle auf der Oberfläche der CD4&spplus;-Zellen des Säugers verursacht, verglichen entweder mit der Anzahl vor der Verabreichung für diesen Säuger oder mit der Anzahl in einem Kontrollsäuger dem ein mit dem Isotyp übereinstimmendes Antikörper-Homolog mit irrelevanter Spezifität anstelle eines erfindungsgemäßen Antikörper-Homologs verabreicht wurde.
Der hier verwendete Ausdruck ein Antikörper-Homolog "verursachend keine signifikante Abnahme in der Zahl der zirkulierenden peripheren Leukocyten in vivo", bezieht sich auf ein Antikörper-Homolog, das innerhalb von 24 Stunden nach der Verabreichung an einen Säuger mit normaler Immunfunktion eine Abnahme von weniger als 50% in der Zahl der zirkulierenden peripheren Leukocyten verursacht, verglichen entweder mit der Anzahl vor der Verabreichung für diesen Säuger oder mit der Anzahl in einem Kontrollsäuger, dem ein mit dem Isotyp übereinstimmendes Antikörper-Homolog mit irrelevanter Spezifität anstelle eines erfindungsgemäßen Antikörper-Homologs verabreicht wurde. In diesem Zusammenhang schließen "periphere Leukocyten" B-Lymphocyten, T-Lymphocyten (CD4 oder CD8&spplus;) und Monocyten ein.
Der hier verwendete Ausdruck ein Antikörper-Homolog, "verursachend keine signifikante Abnahme des Antikörpertiters, der als Antwort auffremde Antigene ausgelöst wird", bezieht sich auf ein Antikörper-Homolog das nach Verabreichung an einen Säuger mit normaler Immunfunktion eine Abnahme von weniger als dem Zehnfachen des Antikörpertiters verursacht der als Antwort auf ein später verabreichtes fremdes Antigen ausgelöst wird verglichen mit dem Äntikörpertiter, der durch das fremde Antigen in einem Kontrollsäuger ausgelöst wird, dem ein mit dem Isotyp übereinstimmendes Antikörper-Homolog mit irrelevanter Spezifität anstelle eines erfindungsgemäßen Antikörper-Homologs verabreicht wurde. In diesem Zusammenhang ist "ein fremdes Antigen" ein Molekül (z.B. eine virales oder bakterielles Polypeptid), das nicht vom Genom dieses Säugers codiert wird.

Erfindungsgemäße Antikörper-Homologe

Die Antikörper-Homologe gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung binden (a) an menschliches CD4: blockieren (b) nicht signifikant die Bindung von HIV- gp120 an menschliches CD4: und blockieren (c) die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus; -Zellen wenigstens so gut wie OKT4.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper- Homologe die (a) an menschliches CD4 binden; (b,) nicht signifikant die Bindung von HIV- gp120 an menschliches CD4 blockieren; (c) die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen besser als OKT4 blockieren: und (d) in einem in vitro-Tetanus-Toxoidspezifischen Vermehrungstest weniger immunsuppressiv sind als OKT4A.
Eine weitere Ausführungsform betrifft Antikörper-Homologe die (a) an menschliches CD4 binden: (b) nicht signifikant die Bindung von HIV-gp120 an menschliches CD4 blockieren: (c) die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen wenigstens genauso gut wie OKT4A blockieren: und (d) in einem in vitro-Tetanus-Toxoid-spezifischen Vermehrungstest weniger immunsuppressiv sind als OKT4A.
Bestimmte erfindungsgemäße Antikörper-Homologe binden an ein aus menschlichem CD4-V1V2 bestehendes Polypeptid (d.h. sie sind V1V2-spezifisch), sie binden jedoch nicht an ein aus menschlichem CD4-V1 bestehendes Polypeptid (d.h. sie sind nicht ausschließlich V1-spezifisch). Entsprechend blockieren bestimmte erfindungsgemäße Antikörper-Homologe nicht signifikant die Bindung von CD4 V1-spezifischen Antikörpern, wie OKT4A und Leu3A, an menschliches CD4.
Die bevorzugten Antikörper-Homologe dieser Erfindung inhibieren die Infektion von CD4&spplus;-Zellen durch HIV.
Andere bevorzugte erfindungsgemäße Antikörper-Homologe zeigen ein oder mehrere Kennzeichen, ausgewählt aus: (a) sie verursachen keine signifikante Abnahme in der Zahl der zirkulierenden CD4&spplus;-Zellen in vivo; (b) sie verursachen keine signifikante Modulation von CD4 auf der Oberfläche von CD4 -Zellen in vivo: (c) sie verursachen keine signifikante Abnahme in der Zahl der zirkulierenden peripheren Leukocyten in vivo: (d) sie verursachen keine signifikante Abnahme des Antikörpertiters, der als Antwort auffremde Antigene in vivo ausgelöst wird, und (e) sie verursachen ex vivo keine konstante oder anhaltende Inhibierung der T-Zell-Vermehrungsantworten auf Mitogene und xenogene Zellen.
Die am meisten bevorzugten Antikörper-Homologe dieser Erfindung zeigen alle der vorstehend beschriebenen Kennzeichen.
Spezifische erfindungsgemäße Antikörper-Homologe umfassen die als 5A8 (IgG&sub1;), 1F8(IgG&sub1;) und 5F2 (IgG&sub1;) bezeichneten monoclonalen Maus-Antikörper die nachstehend beschrieben werden, 5A8 wird bevorzugt.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, nehmen die hier genannten Anmelder an daß die erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe für AIDS, ARC und HIV-Infektionen vorbeugend und therapeutisch sind, da sie die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen inhibieren, so daß die Ausbreitung des Virus auf nicht infizierte Zellen verlangsamt wird. Sie nehmen an daß die erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe besonders nützlich sind da sie die Syncytienerzeugung verhindern sollten auch nachdem HIV-gp120 an CD4 gebunden hat, das an der Oberfläche von CD4&spplus;-Lymphocyten präsentiert wird. Die erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe, die auch die Infektion von CD4&spplus;-Zellen mit HIV inhibieren, sind besonders nützlich. Außerdem, da die erfindungsgemäßen Antikörper- Homologe nicht-kompetitive Blocker der Virusbindung sind, nehmen die hier genannten Anmelder an, daß ihre therapeutische und vorbeugende Wirkung von den Virusmengen im Plasma unabhängig ist.

Durchmusterungstests für erfindungsgemäße Antikörper-Homologe

Der Fachmann kann unter Anwendung gut bekannter Verfahren leicht bestimmen. ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog (oder ein ein Antikörper-Homolog umfassendes Präparat) die vorstehend beschriebenen Kennzeichen zeigt, und kann auf diese Weise erfindungsgemäße Antikörper-Homologe identifizieren.
Um festzustellen, ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog an menschliches CD4 bindet kann jeder übliche Bindungstest angewendet werden. Nützliche C D4-Bindungstests umfassen die FACS-Analyse ELISA-Tests, Radioimmuntests und ähnliche Tests die die Bindung von Antikörper-Homologen an menschliches CD4 nachweisen. Vollständige und lösliche Formen von menschlichem CD4, die bei solchen Tests nützlich sind, werden in der PCT-Patentanmeldung PCT/ US88/02940 beschrieben die hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist. Bezug genommen werden sollte auch auf die Veröffentlichung von Littman D.R. et al., Cell 55 (1988), 544, welche die korrekte Signalsequenzspaltstelle von menschlichem Prä-CD4 beschreibt und die nach dem Einreichungsdatum der PCT/US88/02940 veröffentlicht wurde. Die Bindung eines Antikörper-Homologs an CD4 oder an lösliche Fragmente davon, wie rsCD4, kann in einfacher Weise durch die Verwendung eines Sekundärantikörpers nachgewiesen werden, der für Immunglobuline der Art spezifisch ist, von der das Antikörper-Homolog abgeleitet wurde.
Um festzustellen ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog nicht signifikant die Bindung von HIV-gp120 an menschliches CD4 blockiert kann jeder geeignete Kompetitionstest angewendet werden. Nützliche Test umfassen zum Beispiel ELISA-Tests Radioimmuntests und ähnliche, durch die die Fähigkeit des Antikörper-Flomologs quantitativ bestimmt wird. die Bindung von HIV-gp 120 an menschliches CD4 kreuzzublockieren. Vorzugsweise wird die Fähigkeit von überschüssigem HIV-gp120 bestimmt, die Bindung von markiertem menschlichem rsCD4 an ein immobilisiertes Antikörper-Homolog zu blockieren.
Vorzugsweise wird die Fähigkeit eines Antikörper-Homologs, an menschliches CD4 zu binden, bewertet, indem seine Fähigkeit getestet wird, an menschliche CD4&spplus;-Zellen zu binden. Die bevorzugten CD4&spplus;-Zellen zur Verwendung für den Nachweis, ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog an menschliches CD4 bindet, sind Säugergewebekulturzellen. die mit das vollständige menschliche CD4 codierender DNA transformiert wurden und die CD4 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Solche Zellen umfassen zum Beispiel CHO-Zellen, die mit das vollständige CD4 codierender DNA transformiert wurden und die beschrieben werden von Fisher R.A. et al., "HIV Infection Is Blocked In Vitro Bv Recombinant Soluble CD4", Nature 331 (1988), 76-78 ("r-CD4-CHO-Zellen"). Geeignete r-CD4-CHO-Zellen wurden bei der In Vitro International, Inc., Culture Collection in Linthicum, MD, unter der Hinterlegungsnummer LV1-10260 hinterlegt und unter der Hinterlegungsnummer CRL 10884 in die American Type Culture Collection, Rockville, MD, überführt.
Die Bindung des Antikörper-Homologs an die CD4&spplus;-Zelle wird vorzugsweise durch das Färben der Zellen mit einem fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper nachgewiesen, der für Immunglobuline der gleichen Art spezifisch ist, von der das Antikörper- Homolog, das getestet wird, abgeleitet wird. Zum Nachweis und zur Quantifizierung irgendeiner Bindung wird ein Sortiergerät für fluoreszenzaktivierte Zellen (fluorescence activated cell sorter, "FACS") verwendet. Vgl. allgemein Shapiro H.M., Practical Flow Cytometry, Alan R. Liss. Inc., New York, New York (1985).
Am meisten bevorzugt wird die Fähigkeit eines Antikörper-Homologs, die Bindung von HIV-gp120 an menschliches CD4 zu blockieren, nachgewiesen, indem ein Überschuß an HIV-gp120 mit CD4&spplus;-Zellen vorinkubiert und das Ausmaß, in dem das gebundene HIV- gp120 die Bindung des Antikörper-Homologs an die Zellen blockiert, quantitativ bestimmt wird. Die Bindung des Antikörper-Homologs an die CD4&spplus;-Zellen wird durch FACS-Analyse unter Verwendung eines fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpers quantitativ bestimmt, der für Immunglobuline der gleichen Art spezifisch ist, von der das Antikörper-Homolog, das getestet wird, abgeleitet wird.
Das in den vorstehenden Tests verwendete HIV-gp120 kann durch mit HIV infizierte Zellen, durch HIV selbst, durch mit dem Gen für HIV-gp120 transformierte Wirtszellen oder durch isoliertes gp120 bereitgestellt werden. Vorzugsweise wird ein gereinigtes lösliches HIV-gp120 verwendet, das aus einem einzelligen Wirt isoliert wurde, der mit einem verkürzten HIV-gp120 codierenden HIV-gp160-Gen transformiert wurde. Gereinigtes rekombinantes HIV-gp120 ist im Handel zum Beispiel von Repligen (Cambridge, MA) und von Celltecli (Berkshire, United Kingdom) erhältlich. Rekombinantes gp120 produzierende Zellen werden zum Beispiel beschrieben bei Lasky et al, "Neutralization Of The AIDS Retrovirus By Antibodies To A Recombinant Envelope Glycoprotein", Science 233 (1986), 209-212. Geeignete lösliche rekombinante HIV-gp120-Polypeptide werden von Spodoptera frugiperda-Zellen produziert, die mit einem rekombinanten Baculovirus transformiert wurden, der die durch SEQ ID NO:3 definierte DNA-Sequenz trägt.
Um festzustellen, ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen besser als OKT4 oder wenigstens in etwa so gut wie OKT4A blockiert, kann jeder bekannte Syncytientest angewendet werden. Vorzugsweise werden ein HIV-Laborisolat oder HIV-infizierte CD4&spplus;-Gewebekulturzellen (z.B. H9) zu Kulturen von C8166-Zellen zugegeben und zu allen Kulturen außer den Kontrollkulturen werden variierende Mengen des Antikörper-Homologs zugesetzt. Den Kontrollkulturen werden entsprechende variierende Mengen von OKT4 oder OKT4A zugegeben. Einige Kontrollkulturen (negative Kontrollen) werden nicht oder mit einem irrelevanten Antikörper des gleichen Isotyps wie das Antikörper-Homolog ergänzt. Nach dem Inkubieren werden alle Kulturen durch visuelle Überprüfung auf Syncytien beurteilt. Auf diese Weise wird die Fähigkeit des Antikörper-Homologs, die Syncytienerzeugung zu blockieren, mit den Syncytienblockierungseigenschaften von OKT4 und OKT4A verglichen.
Ein anderes Verfahren zum Vergleich der Syncytienblockierungseigenschaften eines Antikörper-Homologs mit denen von OKT4 und OKT4A ist das folgende. Transformierte Gewebekulturzellen die rekombinantes HIV-Hüllglycoprotein auf ihrer Oberfläche exprimieren (d.h. HIV-gp120/gp41 nach posttranslationaler Spaltung von HIV-gp160), werden mit menschlichen CD4 -Zellen, die einen nachweisbaren Stoff enthalten (z.B. mit &sup5;¹Cr markierte Jurkat-Zellen), in Gegenwart von OKT4, OKT4A, des zu testenden Antikörper-Homologs oder ohne Antikörper inkubiert. Nach dem Inkubieren werden die Kulturüberstände auf den nachweisbaren Stoff untersucht (z.B. Messung der τ-Strahlung für &sup5;¹Cr). Die Zellyse ist eine unvermeidliche Folge der HIV-induzierten Syncytienerzeugung. Deshalb ist die Menge des in einen Kulturüberstand als Folge der Zellyse freigesetzten nachweisbaren Stoffes direkt proportional zur Syncytienerzeugung. Auf diese Weise wird das Ausmaß in dem OKT4 und OKT4A und ein bestimmtes Antikörper-Homolog die Syncytienerzeugung blockieren leicht quantifiziert und verglichen.
Die am meisten bevorzugte transformierte Gewebekulturzelle für den vorstehenden Test ist eine CHO-Zelle die ein rekombinantes HIV-Hüllglycoprotein auf ihrer Oberfläche exprimiert ("r-gp160-CHO-Zelle"). Solche r-gp160-CHO-Zellen werden exemplarisch durch Kulturen veranschaulicht. die bei der In Vitro International Inc., Culture Collection Linthicurn MD unter der Hinterlegungsnummer IV1-10261 hinterlegt und unter der Hinterlegungsnummer CRL 10885 in die American Type Culture Collection überführt wurden. Die hinterlegten Zellen wurden mit der hier durch SEQ ID NO: 1 definierten DNA-Sequenz transformiert.
Um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog in einem in vitro Tetanus-Toxoid-spezifischen Vermehrungstests weniger immunsuppressiv ist als OKT4A wird das bei Engleman E.G. et al.,"Activation Of Human T Lymphocyte Subsets: Helper And Suppressor/Cytotoxic T Cells Recognize And Respond To Distinct Histocompatibility Antigens", J. Immunol. 127 (1987) 2124-2129, beschriebene allgemeine Protokoll bevorzugt. In eineni solchen Tetanus-Toxoid-Test wird die Fähigkeit von Antikörper-Homologen und OKT4A quantitativ bestimmt die Tetanus-Toxoid-induzierte T-Zellvermehrung zu verringern. Üblicherweise wird die Zellvermehrung durch ³H-Thymidin-Einbau durch die T-Zellen gemessen.
Um zu bestimmen ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog entweder an ein aus dem menschlichen CD4 V1-Bereich bestehendes Polypeptid nicht bindet oder ob es an ein aus dem menschlichen CD4 V1V2-Bereich bestehendes Polypeptid bindet sind ELISA- Tests Radioimmuntesis (RIAs), die FACS-Analyse oder ähnliches nützlich. In solchen Tests kann die Fähigkeit des Antikörper-Homologs an eines dieser Polypeptide zu binden, durch die Verwendung eines Sekundärantikörpers nachgewiesen werden der für Immunglobuline der Art spezifisch ist, von der das Antikörper-Homolog abgeleitet wurde.
Vorzugsweise wird die Bindung durch Inhibierungsuntersuchungen mit CD4 V1- und CD4 V1V2-Polypeptiden als Konkurrenten um die Bindung des Antikörper-Homologs an auf der Oberfläche einer CD4&spplus;-Zelle präsentiertes menschliches CD4 mittels FACS-Analyse bestimmt um irgendeine Inhibierung quantitativ zu messen.
Alternativ wird die Bestimmung, ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog an ein CD4 V1-Polypeptid oder ein CD4 V1V2-Polypeptid bindet oder nicht mit einem RIA-Kompetitionstest erzielt, bei dem das Antikörper-Homolog an die Platte gebunden ist (direkt oder indirekt) und das CD4 V1-Polypeptid oder CD4 V1V2-Polypeptid gleichzeitig mit nachweisbar markiertem rsCD4 um die Bindung an das Antikörper-Homolog konkurriert. Die Menge des gebundenen rsCD4 wird mit der Menge von in Abwesenheit des CD4 V1- oder CD4 V1V2-Polypeptids gebundenem rsCD4 verglichen, was eine Berechnung der durch das CD4 V1- oder CD4 V1V2-Polypeptid verursachten prozentualen Inhibierung der rsCD4-Bindung erlaubt.
Die bevorzugten Polypeptide, bestehend aus den menschlichen CD4 V1- oder CD4 VlV2-Bereichen, sind CD4 AA&sub3;-AA&sub1;&sub1;&sub5; bzw. CD4 AA&sub3;-AA&sub1;&sub8;&sub2; der in der PCT-Patentanmeldung PCT/US88/02940 oder bei Maddon et al., Cell, a.a.O., angegebenen CD4-Sequenzen. Unter Anwendung des korrigierten Numerierungssystems von Littman et al., Cell a.a.O., entsprechen diese Polypeptide den menschlichen CD4 AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub3; bzw. menschlichen AA&sub1;-AA&sub1;&sub8;&sub0;. Ein geeignetes CD4 V1-Polypeptid wird beschrieben bei Chao B.H. et al., "A 113-Amino Acid Fragment Of CD4 Produced In Escherichia coli Blocks Human Immunodeficiency Virus-Induced Cell Fusion", J. Biol. Chem. 264 (1989), 5812-5817. Ein geeignetes CD4-V1V2-Polypeptid wird beschrieben bei Garlick R.L. et al., "Escherichia coli Expression, Purification, And Biological Activity Of A Truncated Soluble CD4", AIDS Res. Hum. Retroviruses 6 (1990), 465-479.
Um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog die Infektion von CD4&spplus;-Zellen durch HIV inhibiert, kann jedes Anzeichen der HIV-Infektion überwacht werden. Nützliche Indikatoren der HIV-Infektion umfassen zum Beispiel die Sekretion des HIV- Kemantigens p24 durch mit HIV chronisch infizierte Zellen und die HIV-induzierte Syncytienerzeugung. Vorzugsweise wird die Inhibierung der HIV-Infektion durch den Vergleich der HIV-p24-Mengen in Gegenwart und Abwesenheit des Antikörper-Homologs in HIV- infizierten CD4&spplus;-Zellkulturen bestimmt.
Um festzustellen, ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog keine signifikante Abnallme in der Zahl der zirkulierenden CD4&spplus;-Zellen in vivo verursacht, wird die Anzahl der zirkulierenden CD4&spplus;-Zellen quantitativ bestimmt, die aus einem Säuger innerhalb von 24 Stunden nach Verabreichung des Antikörper-Homologs an einen Säuger mit normaler Immunfünktion isoliert wurden, und mit der Anzahl vor der Verabreichung oder der Anzahl in einem Kontrolisäuger verglichen, dem ein mit dem Isotyp übereinstimmendes Antikörper- Homolog mit irrelevanter Spezifität anstelle eines erfindungsgemäßen Antikörper-Homologs verabreicht wurde. Die quantitative Bestimmung der CD4&spplus;-Zellen kann zum Beispiel durch das Färben der Zellen mit fluoreszenzmarkierten anti-CD4-Antikörpern, die die Bindung des Antikörper-Homologs an CD4 nicht kreuzblockieren (z.B. OKT4), gefolgt von einer FACS- Analyse, erreicht werden.
Um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog keine signifikante Modulation von CD4 auf der Oberfläche von CD4&spplus;-Zellen in vivo verursacht wird die Anzahl der CD4-Moleküle auf CD4&spplus;-Zellen quantitativ bestimmt, die aus einem Säuger innerhalb von 24 Stunden nach Verabreichung des Antikörper-Homologs an einen Säuger mit normaler Immunfunktion isoliert wurden, und mit der Anzahl vor der Verabreichung in diesem Säuger oder der Anzahl in einem Kontrollsäuger verglichen, dem ein im Isotyp übereinstimmender Antikörper mit irrelevanter Spezifität anstelle eines erfindungsgemäßen Antikörper-Homobgs verabreicht wurde. Die quantitative Bestimmung von Zelloberflächen-CD4 kann zum Beispiel durch das Färben der Zellen mit fluoreszenzmarkierten anti-CD4-Antikörpem, die die Bindung des Antikörper-Homologs an CD4 nicht kreuzblockieren (z.B. OKT4), gefolgt von einer FACS-Analyse, erreicht werden.
Um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog keine signifikante Abnahme in der Zahl der zirkulierenden peripheren Leukocyten in vivo verursacht, wird eine Blutprobe, die innerhalb von 24 Stunden nach Verabreichung des Antikörper-Homologs an einen Säuger mit normaler Immunfimktion entnommen wurde, durch herkömmliche Verfahren fraktioniert und die Zahl der Leukocyten ermittelt (z.B. durch das Färben von Blutausstrichen). Die Anzahl wird mit der Anzahl vor der Verabreichung für diesen Säuger oder mit der Anzahl in einem Kontrolisäuger verglichen, dem ein mit dem Isotyp übereinstimmender Antikörper mit irrelevanter Spezifität anstelle eines erfindungsgemäßen Antikörper-Homologs verabreicht wurde.
Um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog keine signifikante Abnahme des Antikörpertiters verursacht, der als Antwort auffremde Antigene in vivo ausgelöst wird, wird der durch ein fremdes Antigen in einem Säuger mit normaler Immunfunktion ausgelöste Antikörpertiter nach Verabreichung des Antikörper-Homologs bestimmt und mit dem Titer verglichen der in einem Kontrollsäuger ausgelöst wurde, dem ein im Isotyp übereinstimmendes Antikörper-Homolog anstelle eines erfindungsgemäßen Antikörper-Homobgs verabreicht wurde. Der Antikörpertiter auf das fremde Antigen kann in einfacher Weise bestimmt werden, zum Beispiel durch das Durchführen eines ELISA unter Verwendung von mit dem fremden Antigen beschichteten Mikrotiterplatten.
Um zu bestimmen, ob ein bestimmtes Antikörper-Homolog keine signifikante Inhibierung der T-Zell-Vermehrungsantworten auf Mitogene und xenogene Zellen in vitro verursacht, werden die Vermehrungsantworten von T-Zellen gemessen, die vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach Verabreichung des Antikörper-Homologs isoliert wurden.
Nützliche Mitogene für diesen Zweck schließen Concanavalin A und Phytohämagglutinin ein. Nützliche xenogene Zellen umfassen jegliche Zellen (z.B. Lymphocyten), die von einer anderen Art als der Säugerart abgeleitet sind, dem das Antikörper-Homolog verabreicht wurde. Vermehrungsantworten können zum Beispiel durch den ³H-Thymidin-Einbau in die verschiedenen T-Zellproben nach Inkubation in vitro mit Mitogenen oder bestrahlten xenogenen Zellen gemessen werden, die sich nicht vermehren können.

Erfindungsgemäße Antikörper-Homolog-Typen und ihre Produktion

Die erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe können viele Typen umfassen, wobei das entscheidende Kriterium ist, daß das Antikörper-Homolog eine der vorstehend beschriebenen Kombinationen von Kennzeichen zeigt. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe intakte monoclonale Antikörper, intakte rekombinante Antikörper, intakte chimäre rekombinante Antikörper, intakte humanisierte rekombinante Antikörper oder Antigen-bindende Teile der vorstehenden Antikörper sein.

A. Monoclonale Antikörper

Die am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe sind durch Hybridomzellen produzierte intakte monoclonale Antikörper. Die Technik zur Produktion monoclonaler Antikörper ist gut bekannt (vgl. allgemein Lerner E.A., "How To Make A Hybridoma", Yale J. Biol. Med. 54 (1981), 387-402; Gefter M.L. et al., "A Simple Method For Polyethylene Glycol-Promoted Hybridization Of Mouse Myeloma Cells", Somatic Cell Genet. 3 (1977), 231-236). Kurz zusammengefaßt wird eine unsterbliche Zellinie (üblicherweise Myelomzellen) mit Lymphocyten (üblicherweise Splenocyten) aus einem Säuger flisioniert, der mit einem Präparat immunisiert wurde, umfassend menschliches CD4 oder ein V1V2-enthaltendes Fragment davon, und die Kulturüberstände der so erhaltenen Hybridomzellen werden durchmustert, wie vorstehend für erfindungsgemäße Antikörper-Homologe beschrieben wurde.
Nützliche CD4-umfassende Präparate schließen menschliche CD4-tragende Zellen (z.B. CD4&spplus;-Lymphocyten), CD4 umfassende Fraktionen solcher Zellen, teilweise gereinigtes oder im wesentlichen reines menschliches CD4, isoliert aus natürlichen Quellen, und nicht gereinigtes, teilweise gereinigtes oder im wesentlichen reines menschliches CD4 oder V1V2- enthaltende Fragmente davon ein, die von rekombinanten Wirtszellen abgeleitet wurden. Rekombinante Wirtszellen, die V1 V2-enthaltende Fragmente von CD4 exprimieren, werden zum Beispiel in der PCT-Patentanmeldung PCT/USS88/02940 beschrieben.
Das bevorzugte Immunogen sind CD4&spplus;-Zellen, die durch die Transformation von CD4&supmin;-Säugergewebekulturzellen mit der das vollständige menschliche CD4 codierende DNA hergestellt wurden. Am meisten bevorzugt ist das Immunogen eine CHO-Zelle, die mit der CD4 AA&submin;&sub2;&sub3;-AA&sub4;&sub3;&sub5; codierenden DNA-Sequenz transformiert wurde, welche bei Maddon et al., Cell, a.a.O., angegeben wird (d.h. CD4 AA&supmin;&sub2;&sub5;-AA&sub4;&sub3;&sub3; unter Anwendung des bei Littman et al., Cell, a.a.O., angegebenen korrigierten Numerierungssystems). Eine solche Zelle, hier bezeichnet als "r-CD4-CHO-Zelle", wurde bei der In Vitro International, Inc., Culture Collection, Linthicum, MD, unter der Hinterlegungsnummer IV1- 10260 hinterlegt und unter der Hinterlegungsnumnier CRL 10884 in die American Type Culture Collection überführt (vgl. auch Fisher et al., Nature, a.a.O.).
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, nehmen die hier genannten Anmelder an, daß die Verwendung von r-CD4-CHO-Zellen als Immunogen, eher als "natürliche" CD4&spplus;- Zellen, isoliertes CD4 oder verkürzte Formen von CD4 (z.B. rsCD4), die Wahrscheinlichkeit erhöht, erfindungsgemäße anti-CD4-Antikörper-Homologe aus einer bestimmten Fusion zu gewinnen. Die Anmelder nehmen an, daß diese im Vergleich zu "natürlichen" CD4&spplus;-Zellen erhöhte Wahrscheinlichkeit möglicherweise auf die Tatsache zurückzuführen ist, daß keine anderen natürlich vorkommenden T-Zell-Oberflächenmoleküle als das auf der Oberfläche der r-CD4-CHO-Zellen präsentierte CD4 vorhanden ist, die, falls vorhanden, mit dem CD4 verbunden sein können und auf Grund dieser Verbindung bestimmte CD4-Epitope unzugänglich machen. Die Anmelder nehmen an, daß diese im Vergleich zu isoliertem CD4 oder Fragmenten davon erhöhte Wahrscheinlichkeit möglicherweise auf eine günstigere Konformation zurückzuführen ist, die vom CD4 auf der Oberfläche der r-CD4-CHO-Zellen angenommen wird, als die von isoliertem CD4 und Fragmenten davon angenommene.
Die Immunisierung kann unter Anwendung von Standardverfahren erzielt werden. Die Dosiseinheit und das Immunisierungsschema sind abhängig von der immunisierten Säugerart, deren Immunstatus, vom Körpergewicht des Säugers und dem CD4-Gehalt des verabreichten CD4-Präparats. Üblicherweise wird das CD4-Präparat mit einem Adjuvans verabreicht, wie dem vollständigen oder unvollständigen Freundschen Adjuvans.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält jede Dosis des zur Immunisierung von Mäusen venvendeten CD4-Präparats mindestens etwa 2 x 10&sup5; Zellen, vorzugsweise etwa 3 x 10&sup6; bis 2 x 10&sup7; r-CD4-CHO-Zellen. Besonders bevorzugt enthält eine Dosiseinheit etwa 5 x 10&sup6; r-CD4-CHO-Zellen. Üblicherweise wird die Maus am Tag 0 mit r-CD4-CHO- Zellen in vollständigem Freundschen Adjuvans intraperitoneal immunisiert. Die Maus erhält intraperitoneal eine erste Nachimpfung mit r-CD4-CHO-Zellen ohne Adjuvans 14 Tage bis 6 Monate nach der Erstimmunisierung und vorzugsweise 15 bis 20 Tage nach der Erstimmunisierung Falls gewünscht, können weitere Nachimpfungen verabreicht werden. Drei Tage vor der Fusion wird die letzte Nachimpfung (r-CD4-CHO-Zellen ohne Adjuvans) intravenös verabreicht. Üblichenveise wird diese letzte Nachimpfung 1 bis 6 Monate und vorzugsweise 39 bis 44 Tage nach der Erstimmunisierung verabreicht. Drei Tage nach der letzten Nachimpfüng wird der Säuger getötet, dessen Milz entfernt und die Splenocyten (einschließlich Lymphocyten) werden für die Fusion mit der unsterblichen Zellinie präpariert.
Den immunisierten Säugern kann zwischen den Nachimpfungen Blut entnommen und das Serum aus jeder Blutprobe auf erfindungsgemäße Antikörper-Homologe unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Durchmusterungsverfahren untersucht werden. Die bei der Herstellung von Hybridomzellen verwendeten Lymphocyten werden üblicherweise aus immunisierten Säugern isoliert, deren Seren auf die Gegenwart von erfindungsgemäßen Antikörper-Homologen bereits als positiv getestet wurden.
Ein jedes der vielen gut bekannten Protokolle, die zur Fusion von Lymphocyten und unsterblichen Zellinien verwendet werden, ist ffir die Erzeugung von erfindungsgemäßen Antikörper-Homologen nützlich (vgl. z.B. Galfre G. et al., "Antibodies To Major Histocompatibility Antigens Produced By Hybrid Cell Lines", Nature 266 (1977), 550-552; Gefier et al., Somatic Cell Genet., a.a.O.; Lemer, Yale J. Biol. Med., a.a.O.). Außerdem erkennt der Fachmann daß es viele Variationen solcher Verfahren gibt, die ebenfalls nützlich sind.
Üblicherweise wird die unsterbliche Zellinie (z.B. eine Myelom-Zellinie) von der gleichen Säugerart wie die Lymphocyten abgeleitet. Nützliche Säuger umfassen Mäuse und Ratten.
Am meisten bevorzugt werden sowohl die unsterbliche Zellinie als auch die Lymphocyten von einer durch Inzucht erzeugten Maus des Stamms BALB/c abgeleitet (Jackson Labs, Bar Harbour, ME). Bevorzugte unsterbliche Zellinien sind Maus-Myelom- Zellinien, die für ein Kulturmedium empfindlich sind, enthaltend Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT-Medium"). Die am meisten bevorzugte Maus-Myelom-Zellinie ist P3X63-AGB.653 (ATCC, Rockville, MD, Katalognummer CRL 1580). Üblicherweise werden HAT-empfindliche Maus-Myelomzellen mit Maus-Splenocyten unter Verwendung von Polyethylenglykol ("PEG"), vorzugsweise PEG-3350, fusioniert. Die aus der Fusion resultierenden Hybridomzellen werden dann unter Verwendung von HAT-Medium selektiert, das nicht fusionierte und unproduktiv fusionierte Myelomzellen abtötet (nicht fusionierte Splenocyten sterben nach mehreren Tagen ab, da sie nicht transformiert sind).
Die ein erfindungsgemäßes Antikörper-Homolog (monoclonaler Antikörper) produzierenden Hybridomzellen werden durch das Durchmustern der Hybridomkulturüberstände unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Durchmusterungstests nachgewiesen. Vorzugsweise selektiert die erste Durchmusterung Antikörper, die an auf der Oberfläche von CD4&spplus;-Zellen präsentiertes menschliches CD4 binden. Eine solche Bindung wird durch die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörpern nachgewiesen, die für Maus- Immunglobuline spezifisch sind, und durch eine FACS-Analyse quantitativ bestimmt.
Zur Produktion der erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe, die intakte monodonale Antikörper sind, werden in den vorstehenden Durchmusterungstests als positiv bewertete Hybridomzellen in einem Nährmedium unter Bedingungen und für einen Zeitraum gezüchtet, der (die) ausreichend ist (sind), um den Hybridomzellen die Sekretion der monodonalen Antikörper in das Kulturmedium zu ermöglichen. Gewebekulturtechniken und für Hybridomzellen geeignete Kulturmedien sind gut bekannt (vgl. z.B. Lerner, Yale J. Biol. Med., a.a.O.). Der die Antikörper-Homologe enthaltende konditionierte Hybridomkulturüberstand wird gewonnen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform kann das gewünschte Antikörper-Homolog durch die Injektion der Hybridomzellen in die Bauchfellhöhle einer nicht immunisierten Maus produziert werden. Die Hybridomzellen vermehren sich in der Bauchfellhöhle unter Sekretion des Antikörper-Homologs, das sich als Aszitesflüssigkeit anreichert (vgl. Lerner, Yale J. Biol. Med., a.a.O.). Das Antikörper-Homolog wird durch das Entfernen der Aszitesflüssigkeit aus der Bauchfellhöhle mit einer Spritze geerntet.
Der Fachmann erkennt, daß monoclonale Antikörper, die erfindungsgemäße Antikörper-Homologe sind, aus dem konditionierten Hybridomkulturüberstand oder aus der Aszitesflüssigkeit einfach gereinigt werden können.

B. Rekombinante Antikörper und sie codierende DNA

Erfindungsgemäße Antikörper-Homologe können rekombinante monoclonale Antikörper sein, die von Wirtszellen produziert werden, welche mit die erfindungsgemäßen leichten und schweren Immunglobulinketten codierender DNA transformiert wurden. Rekombinante Antikörper können durch gut bekannte gentechnische Verfahren hergestellt werden. Vgl. z.B. das US-Patent 4,816,397, das hier unter Bezugnahme eingeschlossen ist.
Beispielsweise können rekombinante Antikörper durch die Clonierung von cDNA oder genomischer DNA, welche die leichten und schweren Immunglobulinketten des gewünschten Antikörpers codiert, aus einer Hybridomzelle produziert werden, die ein erfindungsgemäßes Antikörper-Homolog produziert. Die diese Polypeptide codierende cDNA oder genomische DNA wird dann in Expressionsvektoren insertiert, so daß beide Gene mit ihren eigenen Transkriptions- und Translations-Expressionskontrollsequenzen funktionell verbunden sind. Der Expressionsvektor und die Expressionskontrollsequenzen werden so gewählt, daß sie mit der Expression der verwendeten Wirtszelle kompatibel sind. Üblicherweise werden beide Gene in den gleichen Expressionsvektor insertiert.
Diese Erfindung stellt DNA-Sequenzen bereit, codierend den 5A8-variablen Bereich der leichten Kette (SEQ ID NO: 14) und den 5A8-variablen Bereich der schweren Kette (SEQ ID NO:9), Teile davon, die ein erfindungsgemäßes Antikörper-Homolog codieren, und DNA-Sequenzen, die zu einer dieser DNA-Sequenzen degeneriert sind. Ebenfalls bereitgestellt werden rekombinante DNA-Moleküle, umfassend eine oder mehrere der vorstehenden DNA-Sequenzen und eine oder mehrere damit funktionell verbundene Expressionskontrollsequenzen.
Prokaryontische und eukaryontische Zellen können als Expressionswirte verwendet werden. Die Expression in eukaryontischen Wirtszellen wird bevorzugt, da solche Zellen wahrscheinlicher als prokaryontische Zellen einen richtig gefalteten und immunologisch aktiven Antikörper zusammenfügen und sezemieren. Jedoch kann jeder produzierte Antikörper, der auf Grund falscher Faltung inaktiv ist, gemäß gut bekannter Verfahren renaturierbar sein (Kim P.S. und Baldwin R.L., "Specific Intermediates In The Folding Reactions Of Small Proteins And The Mechanism Of Protein Folding", Ann. Rev. Biochem. 51 (1982), 459-489). Es ist möglich, daß die Wirtszellen Teile intakter Antikörper produzieren, wie Dimere der leichten Kette oder Dimere der schweren Kette, die ebenfalls erfindungsgemäße Antikörper-Homologe sind.
Es ist selbstverständlich, daß Variationen des vorstehenden Verfahrens im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind. Beispielsweise kann die Transformation einer Wirtszelle mit einer DNA erwünscht sein, die entweder die leichte Kette oder die schwere Kette (jedoch nicht beide) eines erfindungsgemäßen Antikörper-Homologs codiert. Die rekombinante DNA-Technik kann ebenfalls angewendet werden, um einen Teil oder die gesamte DNA zu entfernen, die entweder die leichten oder schweren Ketten oder beide codiert, die flir die CD4-Bindung nicht erforderlich sind. Die von solchen verkürzten DNA-Molekülen exprimierten Moleküle sind erfindungsgemäße Antikörper-Homologe. Zusätzlich können bifunktionelle Antikörper hergestellt werden, in denen eine schwere und eine leichte Kette erfindungsgemäße Antikörper-Homologe sind, und die andere schwere und leichte Kette sind für ein anderes Antigen als CD4 oder ein anderes Epitop von CD4 spezifisch.

C. Chimäre und humanisierte rekombinante Antikörper und sie codierende DNA

Die vorstehend beschriebene rekombinante Antikörper codierende DNA kann als Ausgangspunkt für die Herstellung von chimären oder humanisierten rekombinanten Antikörpern verwendet werden. Chimäre rekombinante Antikörper werden durch die Transformation einer Wirtszelle mit einem geeigneten Expressionsvektor produziert, umfassend die die gewünschten leichten und schweren Immunglobulinketten codierende DNA, in der die gesamte oder ein Teil der DNA, codierend die hinge-Region und die konstanten Bereiche der schweren und/oder leichten Kette, durch DNA aus dem entspreächenden Bereich einer leichten oder schweren Immunglobulinkette einer anderen Art ersetzt wurde. Wenn der ursprüngliche rekombinante Antikörper nicht-menschlich ist, wird die Substitution der entsprechenden menschlichen Sequenzen bevorzugt. Ein exemplarischer chimärer rekombinanter Antikörper besitzt variable Bereiche der Maus und die hinge-Region und konstante Bereiche des Menschen. Vgl. allgemein US-Patent 4,816,397 und Morrison S.L. et al., "Chimeric Human Antibody Molecules: Mouse Antigen-Binding Domains With Human Constant Region Domains", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 6851-6855.
In den bevorzugten erfindungsgemäßen chimären rekombinanten 5A8-Antikörper- Homologen ist die Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der leichten Kette SEQ ID NO: 15 bzw. die Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der schweren Kette SEQ ID NO:10.
Humanisierte rekombinante Antikörper werden durch die Transformation einer Wirtszelle mit einem geeigneten Expressionsvektor hergestellt, umfassend die die bevorzugten nicht-menschlichen leichten und schweren Immunglobulinketten codierende DNA, in der die gesamte oder ein Teil der DNA, die bei der CD4-Bindung nicht beteiligte Aminosäuren codiert, durch DNA aus dem entsprechenden Bereich einer gewünschten menschlichen leichten oder schweren Immunglobulinkette ersetzt wurde. Vgl. allgemein Jones P.T. et al., "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A Human Antibody With Those From A Mouse" Nature 321 (1986), 522-525.
Die am meisten bevorzugten humanisierten rekombinanten erfindungesgemäßen Antikörper weisen die 5A8-komplementaritätsbestimmenden Bereiche auf (complementarity determining regions, "CDRs"). Diese umfassen humanisierte rekombinante Antikörper, wobei:
(a) die leichte Kette CDR1 AA&sub2;&sub4;-AA&sub4;&sub0; von SEQ ID NO: 15 ist;
(b) die leichte Kette CDR2 AA&sub5;&sub6;-AA&sub6;&sub2; von SEQ ID NO: 15 ist;
(c) die leichte Kette CDR3 AA&sub9;&sub5;-AA&sub1;&sub0;&sub2; von SEQ ID NO: 15 ist;
(d) die schwere Kette CDR1 AA&sub3;&sub1;-AA&sub3;&sub5; von SEQ ID NO:10 ist;
(e) die schwere Kette CDR2 AA&sub5;&sub0;-AA&sub6;&sub6; von SEQ ID NO: 10 ist; und
(f) die schwere Kette CDR3 AA&sub9;&sub9;-AA&sub1;&sub1;&sub1; von SEQ ID NO: 10 ist.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform stellt humanisierte rekombinante Antikörper-Homologe mit 5A8-CDRs bereit, wobei die Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der leichten Kette AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub2; von SEQ ID NO:56 ist, und die Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der schweren Keife AA&sub1;-AA&sub1;&sub2;&sub2; von SEQ ID NO:45 ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform stellt humanisierte rekombinante Antikörper-Homologe mit 5A8-CDRS bereit, wobei die Aminosäuresequenz der leichten Keife AA&sub1;-AA&sub2;&sub1;&sub9; von SEQ ID NO:56 ist, und die Aminosäuresequenz der schweren Kette AA&sub1;- AA&sub4;&sub4;&sub8; von SEQ ID NO:45 ist.
Diese Erfindung stellt DNA-Sequenzen bereit, codierend eine Prä-5A8-humanisierte leichte Kette (SEQ ID NO:55) und eine Prä-5A8-humanisierte schwere Kette (SEQ ID NO:44), Teile der vorstehenden DNA-Sequenzen, die erfindungsgemäße Antikörper-Homologe codieren, und DNA-Sequenzen, die zu den vorstehenden DNA-Sequenzen degeneriert sind. Ebenfalls bereitgestellt werden rekombinante DNA-Moleküle umfassend eine oder mehrere der vorstehenden DNA-Sequenzen und eine oder mehrere damit funktionell verbundenen Expressionskontrollsequenzen. Bevorzugte rekombinante DNA-Moleküle schließen pMDR1007 (Prä-5A8-humanisierte leichte Kette) und pMDR1002 (Prä-5A8-humanisierte schwere Kette) ein, die bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter den Hinterlegungsnummem ATCC 68846 bzw. ATCC 68847 hinterlegt wurden.

D. Erfindungsgemäße Antikörper-Homologe, die keine intakten Antikörper sind

Die vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper-Homologe bereit, die keine intakten Antikörper sind. Solche Homologe können von einem der vorstehend beschriebenen Antikörper-Homologen abgeleitet werden. Beispielsweise sind Antigen-bindende Fragmente sowie von den vorstehend beschriebenen Antikörpern abgeleitete vollständige monomere, dimere oder trimere Polypeptide selbst erfindungsgemäße Antikörper-Homologe. Nützliche Antikörper-Homologe dieses Typs umfassen Fab-Fragmente, Fab'-Fragmente, F(ab')&sub2;-Fragmente, F(v)-Fragmente, Monomere oder Dimere der schweren Kette, Monomere oder Dimere der leichten Kette, aus einer schweren und einer leichten Kette bestehende Dimere und älinliches. Die hier genannten Anmelder glauben, daß die vorstehenden Fragmente, die von Fab- Fragmenten von 5A8 verschieden sind, im allgemeinen nützliche erfindungsgemäße Antikörper-Homologe sind.
Antikörper-Fragmente können durch chemische Verfahren produziert werden, z.B. durch das Spalten eines intakten Antikörpers mit einer Protease, wie Pepsin oder Papain, und wahlweise das Behandeln des Spaltprodukts mit einem Reduktionsmittel. Gemäß einer anderen Ausführungsform können nützliche Fragmente unter Verwendung von Wirtszellen produziertwerden, die mit verkürzten Genen der schweren und/oder leichten Kette transformiert wurden. Monomere der schweren und leichten Kette können durch die Behandlung eines intakten Antikörpers mit einem Reduktionsmittel, wie Dithiothreit, gefolgt von einem Reinigungsschritt zur Trennung der Ketten, produziert werden. Monomere der schweren und leichten Kette können auch von Wirtszellen produziert werden, die mit DNA transformiert wurden, die entweder die gewünschte schwere oder leichte Kette, jedoch nicht beide codiert. Vgl. z.B. Ward E.S. et al., "Binding Activities Of A Repertoire Of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted From Escherichia coli", Nature 341 (1989), 544-546; Sastry L. et al., "Cloning Of The Immunological Repertoire In Escherichia coli For Generation Of Monodonal Catalytic Antibodies: Construction Of A Heavy Cham Variable Region- Specific cDNA Library", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 5728-5732.

Derivatisierte erfindungsgemäße Antikörper-Homologe

Gemäß einer Ausführungsform stellt diese Erfindung derivatisierte Antikörper- Homologe bereit, worin ein beliebiges der erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe flinktionell verbunden ist (durch chemische Kupplung, genetische Fusion oder anders) mit einem oder mehreren Mitgliedern, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe von erfindungsgemäßen Antikörper-Homologen, erfindungsgemäßen 5A8-mimetischen Mitteln, nachweisbaren Mitteln, cytotoxischen Mitteln und Arzneimitteln. Ein Typ eines derivatisierten Antikörper-Homologs wird durch die Vernetzung von zwei oder mehreren Antikörper- Homologen (des gleichen Typs oder verschiedener Typen) hergestellt. Geeignete Vernetznngsmittel umfassen diejenigen, die heterobifunktionell mit zwei verschiedenen durch einen geeigneten Spacer voneinander getrennten reaktiven Gruppen (z.B. m-Maleimidobenzoyl-N- hydroxysuccinimidester) oder homobifunktionell sind (z.B. Disuccinimidylsuberat). Solche Linker sind erhältlich von der Pierce Chemical Company, Rockford, IL.
Nützliche nachweisbare Mittel umfassen fluoreszierende Verbindungen. Exemplarische fluoreszierende nachweisbare Mittel umfassen Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, 5-Dimethylamin-1-naphthalinsulfonylchlorid, Phycoerythrin und ähnliches.
Die erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe können auch mit nachweisbaren Enzymen derivatisiert werden, wie alkalischer Phosphatase, Meerrettichperoxidase, Glucoseoxidase und ähnlichen. Wenn das Antikörper-Homolog mit einem nachweisbaren Enzym derivatisiert wird, wird es durch die Zugabe zusätzlicher Reagenzien nachgewiesen, die das Enzym verwendet, wobei ein nachweisbares Reaktionsprodukt produziert wird. Wenn zum Beispiel das nachweisbare Mittel Meerrettichperoxidase vorhanden ist, ergibt die Zugabe von Wasserstoffperoxid und Diaminobenzidin ein gefärbtes Reaktionsprodukt das nachweisbar ist. Das Antikörper-Homolog kann auch mit Biotin derivatisiert und durch indirekte Messung der Avidinbindung nachgewiesen werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper-Homologe bereit, die mit einem oder mehreren Arzneimitteln verbunden sind. Nützliche Arzneimittel umfassen biologisch aktive Peptide, Polypeptide und Proteine, wie Antikörper-Homologe, die für ein anderes menschliches Polypeptid als CD4 spezifisch sind. Andere nützliche Arzneimittel umfassen nicht-proteinähnliche Arzneimittel, wie HIV-reverse Transkriptase-Inhibitoren (z.B. 3'- Azido-2',3,-didesoxythymidin ("AZT") und 2',3'-Didesoxymosin ("DDI") und andere antivirale Verbindungen oder immunsuppressive Mittel (z.B. Cyclosporin oder FK506).

Erfindungsgemäße Antikörper-Homologe produzierende Zellen

Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zellen und Zellkulturen, welche die erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe produzieren. Solche Zellen umfassen Hybridomzellen, welche monoclonale Antikörper produzieren, die erfindungsgemäße Antikörper-Homologe sind, sowie transformierte Wirtszellen, die erfindungsgemäße rekombinante Antikörper- Homologe produzieren.
Bevorzugte erfindungsgemäße Zellen umfassen diejenigen, die die hier als "5A8", "1F8" und "5F2" bezeichneten monoclonalen Antikörper produzieren. Die am meisten bevorzugte Zellinie produziert den monoclonalen Antikörper 5A8. Die 5A8-, 1F8- und 5F2-produzierenden Hybridom-Zellinien wurden bei der In Vitro International, Inc., Culture Collection in Linthicum, MD, unter den Hinterlegungsnummem IV1-10257, IV1-10258 bzw. IV1- 10259 hinterlegt und unter den Hinterlegungsnummem HB 10881, HB 10882 bzw. HB 10883 in die American Type Culture Collection, Rockville, MD, überführt.
Andere bevorzugte Zellen sind Wirtszellen, die die a.a.O. beschriebenen 5A8- chimären und -humanisierten rekombinanten Antikörper produzieren. Mit pMDR1007 (Prä- 5A8-humanisierte leichte Kette) und pMDR1002 (Prä-5A8-humanisierte leichte Kette) transformierte eukaryontische Wirtszellen werden zur Produktion von 5A8-humanisierten Antikörpern am meisten bevorzugt.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Produktion der erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe durch Züchten der erfindungsgemäßen Zellen bereit, welche die Antikörper-Homologe produzieren. Verfahren für das Züchten solcher Zellen und das Isolieren der von ihnen produzierten Antikörper-Homologe sind gut bekannt. Diese Verfahren umfassen Gewebekulturtechniken sowie die Erzeugung von Aszitesflüssigkeit.
Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Produktion von erfindungsgemäßen Zellen, die Hybridomzellen sind, umfassend den Schritt der Immunisierung eines nichtmenschlichen Säugers mit CD4&spplus;-Zellen, die CD4 auf ihrer Oberfläche exprimieren und durch die Transformation von CD4&supmin;-Säugergewebekulturzellen mit der das vollständige menschliche CD4 codierenden DNA hergestellt wurden. Bevorzugte Zellen, die als Immunogen für dieses Verfahren zu verwenden sind, sind die vorstehend beschriebenen r-CD4-CHO-Zellen.

5A8-mimetische Mittel

Die vorliegende Erfindung stellt 5A8-mimetische Mittel bereit, die Verbindungen sind, die eine Reduktion der Bindung des monoclonalen Antikörpers 5A8 von mindestens 30% entweder an menschliches rsCD4 oder an auf der Oberfläche einer CD4&spplus;-Zelle präsentiertes menschliches CD4 verursachen. 5A8-mimetische Mittel können Peptide, halb-peptidische Verbindungen oder nicht-peptidische Verbindungen sein. Bevorzugte 5A8-mimetische Mittel inhibieren die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen, inhibieren die Infektion von CD4&spplus;-Zellen durch HIV oder beides. Die am meisten bevorzugten 5A8- mimetischen Mittel zeigen die Eigenschaften von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Antikörper-Homologen.
Erfindungsgemäße 5A8-mimetische Mittel können produziert werden durch das Synthetisieren einer Vielzahl von Peptiden (z.B. mit einer Länge von 5-20 Aminosäuren), halb-peptidischen Verbindungen oder nicht-peptidischen organischen Verbindungen und im Anschluß daran durch das Durchmustem dieser Verbindungen auf ihre Fähigkeit (1) die Bindung von 5A8 an menschliches CD4 kreuzzublockieren; (2) die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen zu inhibieren; und (3) die Infektion von CD4&spplus;-Zellen durch HIV zu inhibieren. Vgl. allgemein US-Patent 4,833,092, Scott J.K. und Smith G.P., "Searching For Peptide Ligands With An Epitope Library", Science 249 (1990), 386-390, und Devim J.J. et al., "Random Peptide Libraries: A Source Of Specific Protein Binding Molecules", Science 249 (1990), 404-407.

Erfindungsgemäße Arzneimittel und Verfallren

Die erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe und 5A8-mimetischen Mittel sind in vorbeugenden Zusanrmensetzungen und Arzneimitteln zur Vorbeugung vor und zur Behandlung von Krankheiten nützlich, die durch Infektionserreger verursacht werden, deren primäres Ziel CD4&spplus;-Lymphocyten sind. Solche Krankheiten schließen AIDS, ARC und HIV- Infektionen ein.
Bevorzugte erfindungsgemäße Arzneimittel für die Verabreichung an den Menschen umfassen als Antikörper-Homologe einen oder mehrere der monoclonalen Maus- Antikörper 5A8, 1F8 oder 5F2, 5A8-chimäre rekombinante Maus/Mensch-Antikörper, 5A8- humanisierte rekombinante Antikörper oder Antigen-bindende Teile dieser Antikörper. Arzneimittel, umfassend 5A8-chimäre rekombinante Maus/Mensch-Antikörper oder 5A8- humanisierte rekombinante Antikörper, werden am meisten bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können ferner andere Therapeutika zur Vorbeugung vor und zur Behandlung von AIDS, ARC und einer HIV-Infektion umfassen. Zum Beispiel können die erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe in Verbindung mit antiretroviralen Mitteln verwendet werden, welche die reverse Transkriptase blockieren, wie AZT, DDI, HPA-23, Phosphonoformiat, Suramin, Ribavirin und Didesoxycytidin, oder mit Mitteln, die die HIV-Protease inhibieren. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Arzneimittel außerdem antivirale Mittel umfassen, wie Interferone, einschließlich α:-Interferon, β-Interferon und γ-Interferon, Glucosidase-Inhibitoren wie Castanospermin oder immunsuppressive Mittel, wie Adrenalcorticosteroide, Azathrioprin, Cyclosporin oder FK506. Außerdem können die erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe vorteilhafierweise in Verbindung mit Mitteln verabreicht werden, die die Bindung von HIV-gp120 an CD4 signifikant blockieren. Solche Mittel umfassen zum Beispiel V1-spezifische anti-CD4-Antikörper (z.B. Leu3A), CD4 V1-Polypeptide und für HIV-gp120 spezifische Antikörper (anti-idiotypisch oder anders).
Ferner können ein oder mehrere Antikörper-Homologe oder 5A8-mimetische Mittel in Verbindung mit zwei oder mehreren der vorstehenden Arzneimitteln verwendet werden. Solche Kombinationstherapien können vorteilhafterweise niedrigere Dosen der verabreichten Arzneimittel verwenden, so daß die mit den verschiedenen Monotherapien verbundene(n) mögliche(n) Toxizität oder Komplikationen vermieden werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel umfassen eine immuntherapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer erfindungsgemäßer Antikörper-Homologe oder 5A8-mimetischer Mittel oder (eine) derivatisierte Form(en) davon und vorzugsweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Der hier verwendete Begriff eine "immuntherapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge, die die Ausbreitung, Schwere oder die das Immunsystem schwächende Wirkungen von AIDS, ARC oder einer HIV-Infektion oder von anderen Krankheiten verringern kann, die durch Infektionserreger verursacht werden, deren primäres Ziel CD4&spplus;-Lymphocyten sind. Der hier verwendete Begriff ein "pharmazeutisch verträglicher Träger" verweist auf einen Träger, der keine allergische Reaktion oder eine andere unerwünschte Wirkung bei Patienten verursacht, denen er verabreicht wird.
Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen beispielsweise einen oder mehrere Träger, ausgewählt aus der Gruppe von Wasser, Kochsalzlösung, phosphatgepufferter Kochsalzlösung Dextrose, Glycerin, Ethanol und ähnlichem, sowie Kombinationen davon. Pharmazeutisch verträgliche Träger können außerdem geringe Mengen von Hilfsstoffen umfassen, wie Benetzungs- oder Emulgiermittel, Konservierungsmittel oder Puffer, die die Haltbarkeit oder Wirksamkeit des Antikörper-Homologs oder des 5A8-mimetischen Mittels erhöhen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können in einer Vielzahl von Formen vorliegen. Diese umfassen zum Beispiel feste, halbfeste oder flüssige Dosierungsformen, wie Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Lösungen, Dispersionen oder Suspensionen, Liposomen, Zäpfchen und Lösungen für die Injektion und Infüsion. Die bevorzugte Form hängt von der beabsichtigen Verabreichungsweise und der therapeutischen Anwendung ab. Die bevorzugten Zusammensetzungen liegen in Form von Lösungen für die Injektion oder Infusion vor.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Arzneimittel sind denjenigen ähnlich, die für die passive Immunisierung von Menschen mit anderen Antikörpern verwendet werden. Die bevorzugte Verabreichungsweise ist parenteral.
Der Fachmann erkennt, daß die immuntherapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemäßen Antikörper-Homologs oder 5A8-mimetischen Mittels u.a. abhängig ist vom Verabreichungsprogramm, der Dosiseinheit des verabreichten Antikörper-Homologs oder 5A8-mimetischen Mittels, davon ob das Antikörper-Homolog oder 5A8-mimetische Mittel in Verbindung mit anderen Arzneimitteln verabreicht wird, vom Immunstatus und Gesundheitszustand des Patienten und von der therapeutischen Wirksamkeit des verabreichten speziellen Antikörper-Homologs oder 5A8-mimetischen Mittels.
Bei einer Monotherapie zur Behandlung von oder Vorbeugung vor einer HIV-Infektion, ARC oder AIDS liegen die immuntherapeutisch wirksamen Mengen pro Dosiseinheit eines Antikörper-Homologs, das ein intakter Antikorper ist, im Bereich von etwa 0,1 bis 10 mg/kg Gewicht des Patienten, vorzugsweise 2 mg/kg Gewicht des Patienten. Die Dosiseinheiten sollten zweimal am Tag bis einmal alle zwei Wochen verabreicht werden, vorzugsweise einmal alle zwei Wochen, bis eine antivirale Wirkung beobachtet wird. Die antivirale Wirkung kann durch eine Vielzahl von Verfallren bestimmt werden, einschließlich Virusbelastung, Lymphocytenzahl und klinischen Anzeichen und Symptomen. Man wird jedoch erkennen, daß niedrigere oder höhere Dosen und andere Verabreichungsprogramme verwendet bzw. angewendet werden können.
Die Behandlungsschemata für Antikörper-Homologe, die keine intakten Antikörper sind, und für 5A8-mimetische Mittel können sich in Abhängigkeit von ihrer Größe und ihren pharmazeutischen Eigenschaften unterscheiden.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um diese Erfindung verständlicher zu machen. Diese Beispiel dienen nur der Veranschaulichung und begrenzen den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise.

Beispiele

Herstellung und erstes Durchmustern der erfindungsgemäßen Antikörper-Homologen

Das zur Erzeugung der monoclonalen Antikörper 1F8, 5A8 und 5F2 verwendete Immunogen waren CHO-Zellen, welche mit DNA transformiert wurden, die das auf der Zelloberfläche exprimierte vollständige menschliche CD4 codiert ("r-CD4-CHO-Zellen"). Die zur Transformation der CHO-Zellen verwendete CD4-Sequenz ist bei Maddon et al., Cell, a.a.O., angegeben. Diese Zellen werden beschrieben bei Fisher R.A. et al., "HIV Infection Is Blocked In Vitro By Recombinant Soluble CD4", Nature 331 (1988), 76-78, und wurden bei der In Vitro International, Inc., Culture Collection, Linthicum, MD, unter der Hinterlegungsnummer IV1-10260 hinterlegt und unter der Hinterlegungsnummer CRL 10884 in die American Type Culture Collection, Rockville, MD, überführt.
Die r-CD4-CHO-Zellen wurden bei 37ºC unter 5% CO&sub2; in α&supmin;-MEM-Medien (Gibco, Grand Island, NY) gehalten, die mit 10% dialysiertem fötalem Kälberserum ("FCS") (North American Biologics, Miami, FL, Katalognummer 33189) und 30 nM Methotrexat ergänzt waren. Die Zellen wurden für die Injektion präpariert, indem das vorstehende Kulturmedium durch mit 5 mM EDTA ergänzte, phosphatgepufferte (Ca²&spplus;- und Mg²&spplus;-frei) Kochsalzlösung ("PBS") ersetzt wurde und die Zellen in diesem Puffer geerntet wurden. Die geernteten Zellen wurden durch Zentrifügieren bei 500 x gav etwa 5 Minuten pelletiert, einmal durch Resuspendieren des Pellets in PBS gewaschen und wie vorstehend zentrifügiert, gezälilt und durch Resuspendieren des Zellpellets in PBS auf ein geeignetes Volumen für die Injektion eingestellt.
Zwei weibliche BALB/c J-Mäuse, etwa 4-6 Wochen alt (Jackson Labs, Bar Harbour, ME), wurden mit r-CD4-CHO-Zellen wie folgt immunisiert. Die erste Maus wurde am Tag 0 mit einer 1:1-Emulsion von r-CD4-CHO-Zellen in PBS mit vollständigem Freundschen Adjuvans ("CFA") (Colorado Serum Co., Denver, CO, Katalognummer C51450) intraperitoneal (i.p.) sensibilisiert (primed), am Tag 20 wurde sie mit r-CD4-CHO-Zellen in PBS ohne Adjuvans i.p. und abschließend am Tag 44 mit r-CD4-CHO-Zellen in PBS ohne Adjuvans intravenös nachgeimpft. Die andere Maus wurde am Tag 0 i.p. sensibilisiert (primed), am Tag 15 wurde sie i.p. und abschließend am Tag 39 intravenös nachgeimpft (alle Injektionen mit r-CD4-CHO-Zellen in PBS ohne Adjuvans). Für beide Mäuse enthielt jede Injektion etwa 3 x 10&sup6; bis 2 x 10&sup7; r-CD4-CHO-Zellen in einem Volumen von etwa 250 µl.
Drei Tage nach der letzten Injektion wurden beide Mäuse getötet und eine jede Milz wurde entnommen und in etwa 5 ml serumfreies DMEM (Gibco, Katalognummer 430- 2100) in einer Petrischale überführt. Die Milzkapseln wurden zerschnitten und die Milzzellen wurden durch Herauszupfen in das Medium freigesetzt. Die Milzzellen-Suspensionen wurden in ein 15 ml-Röhrchen mit konischem Boden überführt und man ließ sie sich etwa 5 Minuten absetzen. Der Überstand wurde in ein frisches 15 ml-Röhrchen mit konischem Boden überttffft und bis zur Fusion in einen Brutschrank gestellt (37ºC, 5% CO&sub2;). Die Milzzellen beider Mäusen wurden vereinigt.
Von einer nicht immunisierten Maus wurde eine 5 ml-Einzelzellsuspension von Milznähr(feeder)-Kontrollzellen im wesentlichen so hergestellt, wie vorstehend für die immunisierten Milzzellen beschrieben wurde, und bis zum Gebrauch in einen Brutschrank gestellt (37ºC, 5% CO&sub2;).
Der Fusionspartner für die immunisierten Milzzellen war eine Hypoxanthin/Aminopterin/Thymidin ("HAT")-empfindliche, nicht-sezemierende Maus-Myelom-Zellinie (P3X63-AG8.653) (ATCC, Rockville, MD, Katalognummer CRL 1580). Vor der Fusion wurden die P3X63-AGB.653-Zellen in DMEM/10% FCS gehalten (37ºC, 5% CO&sub2;), um sicherzustellen, daß sie sich am Tag der Fusion in einer logarithmischen Wachstumsphase befanden.
Das angewendete Fusionsprotokoll war eine Mischung aus den bei Lemer, Yale J. Biol. Med., a.a.O., und Gefier et al., Somatic Cell Genet., a.a.O., angegebenen Protokollen. Insbesondere wurden die vereinigten Milzzellen, die wie vorstehend beschrieben hergestellt wurden, direkt vor der Fusion dreimal mit PBS gewaschen, in etwa 10 ml PBS resuspendiert und gezählt. Unmittelbar vor der Fusion wurden auch die sich in der logarithmischen Phase befindlichen P3X63-AGB.653-Zellen dreimal mit PBS gewaschen und gezählt. Die Myelomzellen wurden in einer Konzentration von 1 x 10&sup7; Zellen/ml in PBS resuspendiert. Für jede Fusion wurden 1,5 x 10&sup8; Milzzellen mit 3 x 10&sup7; Myelomzellen in einem 50 ml-Polypropylenröhrchen mit konischem Boden gemischt, und die Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen. Das Verhältnis von Milzzellen zu Myelomzellen betrug 5:1. Die Röhrchen wurden bei 500 x gav 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Nach dem Absaugen der Überstände wurden die Pellets durch Klopfen des Bodens der Röhrchen vorsichtig resuspendiert. Die Röhrchen wurden dann in ein Becherglas mit 37ºC warmen Wasser gestellt. Alle folgenden Fusionsschritte wurden in diesem Becherglas ausgeführt.
Anschließend wurden zu jedem Zelipellet 0,8 ml des 37ºC warmen Fusionsmediums (50% (Gew.Ivol.) Polyethylenglykol 3350 ("Baker"-Grad von J.T. Baker Co., Phillipsburg, NJ) in serumfreiem DMEM) über einen Zeitraum von etwa 1 Minute unter vorsichtigem Schütteln des Röhrchen zugegeben. Zu jedem Pellet wurde 1 ml serumfreies DMEM über einen Zeitraum von einer weiteren Minuten zugetropft und anschließend wurden jedem Pellet 20 mi serumfreies DMEM über einen Zeitraum von weiteren 5 Minuten zugegeben. Beide Röhrchen wurden bei 600 x gav 10 Minuten bei Raumtemperatur zentritugiert, und die Überstände wurden abgesaugt. Jedem Pellet wurden 50 ml "HAT-Selektionsmedium", enthaltend 400 µl der 5 ml-Suspension von Milznähr(feeder)-Kontrollzellen (hergestellt, wie vorstehend beschrieben), unter gelegentlichem Mischen schrittweise zugegeben. Das "HAT-Selektionsmedium" wurde durch Sofaches Verdünnen einer 50x HAT-Stammlösung (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Katalognummer H-0262) in DMEM/10% FCS hergestellt (Endkonzentrationen: 10 µM Hypoxanthin, 0,4 µM Aminopterin und 16 µM Thymidin).
Jede 50 ml-Zellsuspension wurde auf 5 Flachboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 100 µl/Vertiefung auspiattiert. Die Platten wurden in einem Brutschrank bei 37ºcund 5% CO&sub2; gehalten. Am Tag 2 nach der Fusion wurde den Zellen 100 µl HAT-Selektionsmedium pro Vertiefung zugesetzt. Am Tag 10 nach der Fusion wurde das Medium abgesaugt und zu jeder Vertiefung wurden 200 µl HAT-Selektionsmedium zugegeben. Die Überstände wurden für das primäre Durchmustem an den Tagen 12, 14, 16 und 19 nach der Fusion aus Clone enthaltenden Vertiefungen entfernt. Die Fusionseffizienz betrug 34% (in 327 von 960 möglichen Vertiefungen entwickelten sich Clone, die durchmustert wurden).
Das angewendete primäre Durchmusterungsverfahren war ein Radioimmuntest (RIA), der zum Nachweis von an menschliches rsCD4 bindenden Antikörpern entwickelt wurde.
Zur Durchführüng des RIA wurde affinitätsgereinigtes Ziege-anti-Maus-IgG (Fc- Fragment-spezifisch) (Cappell, Cochranville, PA, Katalognummer 22950) in PBS in PVC- Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen eingebracht (50 µl/Vertiefung) und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Das Ziege-anti-Maus-IgG wurde aus den Platten entfernt und die Vertiefungen bzw. die freien Bindungsstellen der Vertiefungen wurden mit 100 µl/Vertiefung 5% FCS/PBS 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Nach der Entfernung der Blockierungslösung wurde der reine Hvbridom-Kulturüberstand zu den Vertiefungen zugegeben (50 µl/Vertiefung) und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS/0,05% Tween-20 gewaschen. Anschließend wurden zu jeder Vertiefung 50 µl ¹²&sup5;I-rsCD4 ( 20 000 CpM) in PBS/5% FCS (hergestellt, wie nachstehend beschrieben) zugegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Veriefungen dreimal mit PBS/0,05% Tween-20 gewaschen. Nach Abklopfen des gesamten Waschpuffers wurden die Vertiefungen durch Zerschneiden der Platten voneinander getrennt und in einem Gammazähler analysiert. Die Vertiefungen, zu denen 5% FCS/PBS anstelle des Kulturüberstands zugegeben worden war, dienten als Hintergrundvertiefungen.
Das für die primäre Durchmusterung verwendete ¹²&sup5;I-rsCD4 bestand aus gereinigtem, ¹²&sup5;I-markiertem, menschlichem CD4-AA&sub3;-AA&sub3;&sub7;&sub7; der bei Maddon et al., Cell, a.a.O., angegebenen CD4-Sequenz (d.h. menschliches CD4-AA&sub1;-AA&sub3;&sub7;&sub5; gemäß dem korrigierten Numerierungssystem von Littman et al., Cell, a.a.O.). Das rsCD4 wurde von transformierten CHO-Zellen im wesentlichen so produziert, wie bei Fisher et al., Nature, a.a.O., beschrieben. Das von diesen Zellen produzierte rsCD4 kann gereinigt werden, wie bei Fisher et al., Nature, a.a.O., beschrieben.
Das gereinigte rsCD4 wurde mit ¹²&sup5;I gemäß dem Bolton-Hunter-Verfahren im wesentlichen so markiert, wie vom Lieferant des Bolton-Hunter-Reagens beschrieben (New England Nuclear, Boston, MA). Die Qualität des I-rsCD4 wurde routinemäßig überwacht, indem bestätigt wurde. daß das Markierungsverfahren nicht die Epitope zerstört hat, die von den im Handel erhältlichen CD4 V1-spezifischen monoclonalen Antikörpern Leu3A (Becton Dickinson, Mountain View, CA, Katalognummer 7326) und OKT4A (Ortho Diagnostic Systems, Raritan, NJ. Katalognummer 7124) und dem CD4 V3V4-spezifischen monoclonalen Antikörper OKT4 (Ortho Diagnostic Systems, Katalognummer 7024) erkannt werden.
Clone wurden beim primären Durchmustern als positiv angesehen, wenn sie im RIA ein etwa um das 10fache über dem Hintergrund liegendes Signal zeigten. Mit Hilfe dieses Kriteriums waren etwa 6% der Clone (21) positiv. Die 21 positiven Clone wurden entnommen und man versuchte, sie zu vermehren; 13 Clone überlebten die Vermehrung und wurden in gefrorenem Zustand gelagert. Viele dieser 13 Clone wurden erfolgreich subcloniert, einschließlich 1F8, 5A8 und 5F2. Das Vermehren, Subclonieren und Einfrieren der Zellen wurde im wesentlichen so durchgeführt, wie bei Lerner, Yale J. Biol. Med., a.a.O., beschrieben wurde.
Die nach dem primären Durchmustern isolierten 13 positiven Clone wurden einer Reihe von nachstehend beschriebenen Tests unterzogen. Unter Zugrundelegung dieser Tests identifizierten die hier genannten Anmelder drei Hybridom-Zellinien, die erfindungsgemäße Antikörper-Homologe -1F8, 5A8 und 5F2- produzierten. Die Ergebnisse der Durchmusterungstests für die Clone 1F8, 5A8 und 5F2 werden nachstehend besprochen. Die Daten für die anderen 10 Antikörper werden nicht angeführt.
Das von den Anmeldem durchgeführte erste Zweitdurchmusterungsverfahren wurde entwickelt, um festzustellen, ob die Antikörper native CD4-Epitope erkennen. Dies wurde mittels FACS-Analyse von auf CD4&spplus;-Jurkat-Zellen gezeigtem Zelloberflächen-CD4 und von mit den monoclonalen Antikörpern gefärbten r-CD4-CHO-Zellen erreicht, wobei die Bindung mit einem fluoreszenzmarkierten Ziege-anti-Maus-Sekundärantikörper im wesentlichen so sichtbar gemacht wurde, wie nachstehend beschrieben wird. Alle 13 Antikörper erkannten das Zelloberflächen-CD4. Zur Lokalisierung der von den erfindungsgemäßen Antikörpern gebundenen CD4-Epitope führten die Anmelder anschließend Kompetitionstests, wie nachstehend beschrieben, mit einem CD4 V1-Polypeptid und einem CD4 V1V2-Polypeptid, mit im Handel erhältlichen CD4 V1-spezifischen und CD4 V3V4-spezifischen Antikörpern und mit HIV-gp120 durch. Viele dieser Antikörper wurden dann auch hinsichtlich ihre Fähigkeit bewertet, die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4T-Zellen und die Infektion von CD4&spplus;-Zellen durch HIV zu inhibieren, sowie in einem in vitro-Tetanus- Toxoid-spezifischen Vermehrungstest auf ihre immunsuppressive Aktivität.
Unter Zugrundelegung der Kompetitionstests stellten die hier genannten Anmelder fest, daß von den 13 positiven Clonen 3 CD4 V1-spezifische Antikörper sezernierten, 5 Antikörper sezernierten, die CD4-V3V4-spezifisch waren, und 5 Antikörper sezernierten, die CD4-V1V2-spezifisch waren. Von den CD4-V1V2-spezifischen Antikörpern blockierten nur drei -1F2, 5A8 und 5F2- die HIV-gp120-Bindung an CD4 nicht signifikant.
Bei einer nach der Immunisierung einer Maus mit menschlichem rsCD4 durchgeführten Einzelfüsion wurde kein Hybridom gefunden, das einen Antikörper produziert, der ein erfindungsgemäßes Antikörper-Homolog ist, obwohl andere monoclonale anti-CD4-Antikörper produziert wurden. Die hier genannten Anmelder glauben, daß erfindungsgemäße anti-CD4-Antikörper-Homologe durch die Immunisierung mit rsCD4 erzeugt werden können; jedoch erhöht die Verwendung von r-CD4-CHO-Zellen als Immunogen die Wahrscheinlichkeit, solche Antikörper zu erhalten.

Spezifität für CD4 V1- und CD4 V1V2-Polypeptide

Um die von den erfindungsgemäßen Antikörper-Homologen erkannten CD4-Epitope zu charakterisieren, bestimmten die hier genannten Anmelder, ob mehrere Antikörper- Homologe ein Epitop im V1V2-Bereich von menschlichem CD4 oder ein nur durch den CD4-V1-Bereich definiertes Epitop erkennen. Insbesondere untersuchten die Anmelder die Fähigkeit von Polypeptiden, bestehend aus AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub3; und/oder AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub1; des menschlichen CD4 ("CD4-V1") und AA&sub1;-AA&sub1;&sub8;&sub0; des menschlichen CD4 ("CD4-V1V2"), die Bindung von menschlichem rsCD4 an drei erfindungsgemäße anti-CD4-Antikörper-Homologe (die monoclonalen Antikörper 1F8, 5A8 und 5F2), zwei CD4 V1-spezifische monoclonale Antikörper (Leu3A und OKT4A) und einen CD4 V3V4-spezifischen monoclonalen Antikörper (OKT4) zu inhibieren.
Kurz zusammengefaßt wurde ein RIA durchgeführt, bei dem jede Vertiefung der Mikrotiterpiatte mit einem anti-Maus-Ig beschichtet wurde, jede Vertiefung bzw. die freien Bindungsstellen blockiert und jede Vertiefling mit einem der getesteten Hybridom-Kultur überstände inkubiert wurde. Anschließend wurde ein Gemisch aus CD4-V1 oder CD4-V1V2 und ¹²&sup5;I-rsCD4 zugegeben. Nach der Inkubation wurden die Vertiefungen gewaschen und das gebundene ¹²&sup5;I-rsCD4 wurde in einem Gammazähler nachgewiesen.
Insbesondere wurden Mikrotiterpiatten (96 Vertiefungen) über Nacht bei 4ºC mit 50 µl/Vertiefung affinitätsgereinigtem Ziege-anti-Maus-IgG (Fc-Fragment-spezifisch) (Campell) beschichtet. Die Vertiefungen wurden dreimal mit PBS/0,05% Tween-20 gewaschen und im Anschluß daran wurden die die Vertiefungen bzw. die freien Bindungsstellen durch das Inkubieren mit 100 µl/Vertiefung 5% FCS/PBS während 1 Stunde blockiert. Nach der Entfernung des Blockierungspuffers wurden die Vertiefungen 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 50 µl/Vertiefung reinem Ilybridom-Kulturüberstand inkubiert (5-20 µg/ml Ig). Die Kontrolivertiefungen wurden mit 50 µl/Vertiefung OKT4 (10 µg/ml in PBS/5% FCS), OKT4A (500 ng/ml in PBS/5% FCS) oder Leu3A (500 ng/ml in PBS/5% FCS) inkubiert. Die Platten wurden dreimal mit PBS/0,05% Tween-20 gewaschen. CD4-V1 und CD4-V1V2 (Endkonzentrationen 5 µg/ml) wurden getrennt mit etwa 20 000 CPM I-rsCD4 (hergestellt, wie vorstehend beschrieben) etwa 35 bis 45 Minuten bei Raumtemperatur vorinkubiert. Diese vorinkubierten Gemische wurden dann in den Vertiefungen 1 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden die Vertiefungen dreimal mit PBS/0,05% Tween-20 gewaschen und im Anschluß daran wurde die Radioaktivität bestimmt.
Das in diesem Experiment verwendete CD4-V1 bestand aus AA&sub3;-AA&sub1;&sub1;&sub5; und/oder AA&sub3;-AA&sub1;&sub1;&sub3; der in Figur 16 der PCT-Patentanmeldung PCT/US88/02940 angegebenen CD4- Sequenz, die gemäß dem korrigierten Numerierungssystem von Littman et al., Cell, a.a.O., CD4 AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub3; bzw. AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub1; entspricht. Diese CD4 V1-Polypeptide wurden hergestellt und gereinigt, wie bei Chao B.H. et al. in "A 113-Amino Acid Fragment Of CD4 Produced In Escherichia coli Blocks Human Immunodeficiency Virus-Induced Cell Fusion", J. Biol. Chem. 264 (1989), 5812-5817, beschrieben.
Das in diesem Experiment verwendete CD4-V1V2 bestand aus AA&sub3;-AA&sub1;&sub8;&sub2; der in Figur 16 der PCT-Patentanmeldung PCT/US88/02940 angegebenen CD4-Sequenz, die gemäß dem korrigierten Numerierungssystem von Littman et al., Cell, a.a.O., CD4 AA&sub1;-AA&sub1;&sub8;&sub0; entspricht.
Das CD4 V1V2-Polypeptid wurde von Bakterien unter Verwendung molekularbiologischer Standardtecbniken in einer Weise hergestellt, die dem bei Chao B.H. et al., J. Biol. Chem., a.a.O., beschriebenen Protokoll zur Herstellung des CD4 V1 -Polypeptids entspricht. Mit einem Plasmid, das die das CD4 V1V2-Polypeptid codierende DNA trägt, wurde der E. coli-Stamm A89 transfiziert (Goff S.A. et al., "Heat Shock Regulatory Gene htpR Influences Rates Of Protein Degradation And Expression Of The lon Gene In Escherichia coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(1984), 6647-6651). Die Zellen wurden unter Standardbedingungen in einem 10 Liter-Fermenter fermentiert, unter Verwendung eines Pelikon-Konzentrationssystems geerntet und anschließend bei 3000 UpM in einer Beckman J-6M-Zentrifuge zentrifugiert. Das Zeilpellet wurde bis zum Gebrauch bei -20ºC gefroren gelagert.
Zur Reinigung von CD4-V1V2 wurden die Zellen aufgetaut und in 8 ml Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,7)/1 mM Na&sub2;EDTA) pro Gramm Zellen, bezogen auf das Naßgewicht, suspendiert. Die Zellen wurden bei 3 Durchgängen durch eine "french press" aufgebrochen. Das CD4-V1V2 enthaltende unlösliche Material wurden durch Zentrifugieren pelletiert. Die Pellets wurden dreimal mit 1 M Hamstoffil 5 mM Natriumacetat, pH 5,5, gewaschen (15-20 ml pro Gramm Zellen, bezogen auf das Naßgewicht), gefolgt von 2 Waschschritten mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,7/1 mM Na&sub2;EDTA. Das so erhaltene gewaschene Pellet wurde über Nacht bei Raumtemperatur mit 25 ml pro Gramm Zellen, bezogen auf das Naßgewicht, unter Verwendung von 6 M Guanidin-HCl/10 mM DTT/20 mM Tris-HCl, pH 7,7, extrahiert. Der Extrakt wurde durch das Zentrifugieren bei 48 000 x gav für 45 Minuten bei Raumtemperatur geklärt.
Zur Renaturierung von CD4-V1V2 wurde der geklärte Extrakt in kaltem (4ºC) 20 mM Tris-HCl, pH 7,7, 1:60 (Vol./Vol.) verdünnt und Rinderserumalbumin ("BSA") wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mg/ml zugegeben. Alle folgenden Schritte wurden bei 4ºC durchgeführt. Der pH-Wert wurde mit 6 N HCl auf 7,0 erniedrigt und die Suspension wurde durch einem Durchgang durch einen hydrophilen 5 µm-Millidisk -Filter (Millipore, Bedford, MA, Katalognummer MCSC 40S 01), gefolgt von einem Durchgang durch einen Durapore 0,2 µm-Filter (Millipore, Katalognummer CVGL 01T P3), geklärt. Mit der geklärten Präparation wurde eine S-Sepharose -Fast Flow -Säule (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Piscataway, NJ), voräquilibriert mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, in einem Verhältnis von 1 Volumenteil S-Sepharose-Fast Flow -Gel pro 100 Volumenteilen Ladung beladen. Die Säule wurde mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,0 gewaschen und die gebundenen Proteine wurden mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,7/300 mM NaCl eluiert.
Der das CD4-V1V2 enthaltende Eluat-Pool wurde mit einem gleichen Volumen von 20 mM Tris-HCl, pH 7,7, verdünnt und eine Affinitätssäule mit monoclonalem anti- CD4-Antikörper (nachstehend beschrieben), die mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,7/150 mM NaCl voräquilibriert wurde, wurde damit beladen. Die Säule wurde mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,7/150 mM NaCl, gefolgt von 20 mM Tris-HCl, pH 7,7/1 M NaCl, gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden mit 50 mM Glycin/250 mM NaCl, pH 3,0, eluiert. Das eluierte Material wurde gegen 20 mM HEPES (pH 6,8) dialysiert und auf einer PM 10-Membran in einer Amicon-Ultrafiltrationszelle konzentriert. Das gereinigte konzentrierte CD4-V1V2 (etwa 0,5-3,0 mg/ml) wurde bis zum Gebrauch bei -70ºC gelagert.
Die Affinitätssäule mit monoclonalem anti-CD4-Antikörper wurde unter Verwendung von einem der CD4 V1-spezifischen monoclonalen Antikörpern hergestellt, die aus den vorstehend beschriebenen Fusionen erhalten wurden. Der monoclonale Antikörper wurde aus der Aszitesflüssigkeit durch Ammoniumsulfatfraktionierung und Anionenaustausch-Chromatographie gereinigt, durch Ultrafiltration konzentriert, gegen 0,1 M Natriumborat (pH 8,0)/0,5 M Natriumchlorid dialysiert und erneut durch Ultrazentrifugation auf eine Konzentration von etwa 5 mg/ml konzentriert. Der gereinigte monoclonale anti-CD4-Antikörper (10 ml enthielten etwa 50 mg Protein) wurde an 4 g CNBr-Sepharosetm gemäß den Anweisungen des Herstehers (Sigma Chemical Co. Katalognummer C9 142) gekoppelt, wobei 12 ml derivatisiertes Harz erhalten wurden.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den Tabellen I und II zusammengefaßt. Tabelle 1
*: Wegen den in Tests dieser Art auftretenden Standardabweichungen ziehen die hier genannten Anmelder in Betracht, daß dieser Wert angibt, daß CD4-V1 keine wirkliche Inhibierung der rsCD4-Bindung an den angegebenen monoclonalen anti-CD4-Antikörper zeigt. Tabelle II
CD4 V1V2-Inhibierung der rsCD4-Bindung: gleichzeitige Kompetition
*: Wegen den in Tests dieser Art auftretenden Standardabweichungen ziehen die hier genannten Anmelder in Betracht, daß dieser Wert angibt, daß CD4-V1 keine wirkliche Inhibierung der rsCD4-Bindung an den angegebenen monoclonalen anti-CD4-Antikörper zeigt.
Die in den Tabellen I und II gezeigten Daten beweisen, daß die monoclonalen Antikörper 1F8, 5A8 und 5F2 nicht an ein aus menschlichem CD4-V1 bestehendes Polypeptid binden und an ein aus menschlichem CD4-V1V2 bestehendes Polypeptid binden.

Kreuzblockierung mit 5A8 und mit Antikörpern, die CD4 V1-spezifisch und CD4 V3V4- spezifisch sind

Zur weiteren Charakterisierung der von den erfindungsgemäßen Antikörper-Homologen erkannten CD4-Epitope führten die hier genannten Anmelder Kreuzblockierungsexperimente für rsCD4 mit dem Antikörper-Homolog 5A8 und zwei CD4-V1-spezifischen Antikörpern (OKT4A und Leu3A) sowie mit einem CD4-V3V4-spezifischen Antikörper (OKT4) durch. Sie führten auch ähnliche Kreuzblockierungsexperimente zwischen 5A8 und anderen erfindungsgemäßen Antikörper-Homologen durch. Zusätzlich führten sie ein Kreuzblockierungsexperiment mit Leu3A und 5A8 für natives CD4 durch, das auf der Oberfläche von menschlichen peripheren Blut-Lymphocyten gezeigt wird. Die Ergebnisse dieser Kreuzblockierungsexperimente sind in den Tabellen III und IV und in Figur 1 gezeigt.
Für das in Tabelle III dargestellte rsCD4-Kreuzblockierungsexperiment wurde ein RIA im wesentlichen so durchgeführt, wie er vorstehend für die CD4-V1- und CD4-V1V2- Kreuzblockierungsexperimente beschrieben wurde. Insbesondere wurde jede Vertiefüng der Mikrotiterplatte mit anti-Maus-Ig beschichtet, die Vertiefungen bzw. die freien Bindungsstellen wurden blockiert und im Anschluß daran wurde die Platte mit 5A8-Kulturüberstand (5-20 µg/ml), OKT4A (500 ng/ml), OKT4 (10 µg/ml) oder Leu3A (500 ng/ml) inkubiert. Die Vertietungen wurden dann gewaschen, und die Vertiefüngen bzw. die freien Bindungsstellen wurden mit 100 µl/Vertielung Maus-Ig (50 µg/ml) in PBS 30 Minuten bis 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Der Kompetitor-Antikörper (d.h. OKT4A, OKT4 oder Leu3A in zweifacher Konzentration der vorstehenden Konzentrationen) wurde mit I-rsCD4 vorinkubiert, und jedes Gemisch wurde zu den Vertiefungen in einer Menge von 50 µl/ Vertiefüng zugegeben. Nach dem Inkubieren für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Vertiefüngen gewaschen und die Menge des gebundenen I-rsCD4 wurde in einem Gammazähler quantitativ bestimmt.
Tabelle III führt die prozentuale Inhibierung der Bindung von I-rsCD4 an die immobilisierten anti-CD4-Antikörper 5A8, OKT4, OKT4A und Leu3A durch die löslichen anti-CD4-Antikörper Leu3A, OKT4A und OKT4 auf. Tabelle III Leu3A-, Okt4a- und OKT4-Kreuzblockierung: monoclonale anti-CD4-Antikörper, vorinkubiert in Lösung mit rsCD4
*: Wegen den in Tests dieser Art auftretenden Standardabweichungen ziehen die hier genannten Anmelder in Betracht, daß dieser Wert angibt, daß der in der Überschrift der Spalte angegebene monoclonale anti-CD4-Antikörper keine wirkliche Inhibierung der rsCD4-Bindung an den angegebenen monoclonalen anti-CD4-Antikörper dieser Reihe verursacht.
Die in Tabelle III gezeigten Daten beweisen, daß Leu3A, OKT4A und OKT4 nicht signifikant die Bindung von rsCD4 an 5A8 inhibieren. Diese Ergebnisse zeigen, daß 5A8 (ein) andere(s) CD4-Epitop(e) erkennt als jene(s), das (die) von Leu3A, OKT4A und OKT4 erkannt werden.
Für das in Tabelle IV dargestellte rsCD4-Kreuzblockierungsexperiment wurde ein RIA im wesentlichen so durchgeführt, wie er vorstehend für das in Tabelle III dargelegte Experimente beschrieben wurde, außer daß nur 5A8 immobilisiert wurde und die löslichen Kompetitor-Antikörper 1F8 (5-20 µg/ml), 5A8 (5-20 µg/ml), 5F2 ( 5 µg/ml), OKT4 (10 µg/ml) und Leu3A (500 ng/ml) waren. Ergänzend hierzu bestand das in diesem Experiment verwendete ¹²&sup5;I-rsCD4 aus gereinigtem ¹²&sup5;I-markiertem menschlichem CD4-AA&sub3;-AA&sub3;&sub7;&sub7; der in Figur 16 der PCT-Patentanmeldung PCT/US88/02940 angegebenen Sequenz (eher als die bei Maddon et al., Cell, a.a.O., angegebene Sequenz), die gemäß dem korrigierten Numenerungssystem von Littman et al., Cell, a.a.O., CD4 AA&sub1;-AA&sub3;&sub7;&sub5; entspricht.
Tabelle IV führt die prozentuale Inhibierung der Bindung von I-rsCD4 an immobilisierten 5A8 durch die löslichen anti-CD4-Antikörper 1F8, 5F2, 5A8, OKT4 und Leu3A auf. Tabelle IV 5A8-Kreuzblockierung: monoclonale anti-CD4-Antikörper, vorinkubiert in Lösung mit rsCD4
Die in Tabelle IV gezeigten Daten beweisen, daß 1F8 und 5F2 die Bindung von rsCD4 an 5A8 blockieren wodurch gezeigt wird, daß 5A8, 1F8 und 5F2 das (die) gleiche(n) sich überlappende(n) oder unmittelbar benachbarte(n) CD4-Epitop(e) erkennt.
Figur 1 zeigt die Ergebnisse des Zelloberflächen-CD4-Kreuzblockierungsexperiments. Menschliche periphere Blut-Lymphocyten ("PBLs") wurden mit Puffer (Figur 1A), Leu3A (Figur 1B), OKT4A (Figur 1C), OKT4 (Figur 1D) oder 5A8 (Figur 1E) inkubiert. Die Zellen wurden dann gewaschen und mit Leu3A inkubiert, der mit Fluoresceinisothiocyanat markiert war ("Leu3A-FITC"). Nach erneutem Waschen wurden die Zellen unter Verwendung eines FACStar-Sortiergeräts für fluoreszenzaktivierte Zellen analysiert. Die Ergebnisse dieser FACS-Analyse werden in Figur 1 veranschaulicht. Die Daten zeigen, daß 5A8 nicht signifikant die Bindung des V1-spezifischen Antikörpers Leu3A an Zelloberflächen-CD4 blockiert. Das Protokoll für dieses Experiment folgt nachstehend.
Insbesondere wurden menschliche PBLs durch das zweifache Verdünnen von 10 ml Blut mit nicht supplementiertem RPMI-1640-Medium und das Schichten des Gemisches über 10 ml Lymphocyten-Trennmedium (Organon Teknika, Durham, NC, Katalognummer 36427) in einem 50 ml-Röhrchen bei Raumtemperatur isoliert. Das Röhrchen wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten bei 400 x gav zentrifugiert. Die PBLs wurden aus der Grenzfläche gewonnen, zweimal mit nicht suppiementiertem RPMI-Medium gewaschen und gezählt. Für jede Probe wurden 3 x 10&sup5; PBLs in 50 µl Färbepuffer (PBS/1% BSA/0,02% Natriumazid) pro Röhrchen suspendiert und einmal mit Färbepuffer gewaschen. Der Färbepuffer wurde von den pelletierten Zellen abgesaugt, und jedem Pellet wurde ein Antikörper- Reagens zugegeben. Für 5A8 war das Antikörper-Reagens 50 µl konditionierter Hybridom- Zellkulturüberstand mit etwa 5-20 µg/ml 5A8. Die Antikörper-Reagenzien für die Kontrollantikörper waren 2,5 µg/ml-Lösungen in Färbepuffer: 60 µl/Röhrchen Leu3A; 30 µl/Röhrchen OKT4A; und 30 µl/Röhrchen OKT4. Als zusätzliche Kontrolle wurden zu einer Zellprobe 50 µl Färbepuffer ohne Antikörper zugegeben.
Die Proben wurden 30 Minuten auf Eis inkubiert und dann dreimal in einem 1 ml- Volumen Färbepuffer gewaschen. Anschließend wurden 66 µl FITC-konjugierter Leu3A (Becton Dickinson, Katalognummer 7323) in einer Verdünnung von 1:10 in Färbepuffer zugegeben; im Anschluß daran wurden die Proben 20 Minuten auf Eis inkubiert, zweimal gewaschen und in einem FACStar-Sortiergerät für fluoreszenzaktivierte Zellen (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA) analysiert.

HIV-gp120-Kreuzblockierung

Die hier genannten Anmelder wendeten zwei Verfahren an, um zu beweisen, daß die erfindungsgemäßen Antikörper-Homologe nicht signifikant die Bindung von HIV-gp120 an menschliches CD4 blockieren, und zwar einen RIA unter Verwendung von menschlichem rsCD4 und die FACS-Analyse mit menschlichen CD4&spplus;-Gewebekulturzellen.
Das in diesen Tests verwendete lösliche rekombinante HIV-gp120 ("r-gp120") wurde unter Verwendung eines Baculovirus-Vektor/Insektenzellen-Kultursystems hergestellt. Der zur Übertragung des verkürzten HIV-gp120-Gens in das Autographa califomica-Kernpolyeder-Virus (Baculovirus) verwendete Vektor war ein Derivat des Vektors pAc373 (Smith G.E. et al., "Modification And Secretion Of Human Interleukin 2 Produced In Insect Cells By A Baculovirus Expression Vector", Proc. Natl. Acad. Sci USA 82 (1985), 8404-8408).
Die das Signalpeptid und das Pro-Peptid des menschlichen Gewebeplasminogenaktivators und ein C-terminales Methionin codierenden DNA-Sequenzen wurden im Leserahmen mit den HIV-1-DNA-Sequenzen, die AA&sub1;&sub3;-AA&sub4;&sub7;&sub1; von gp160 codieren (vgl. SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO:2), gefolgt von Leucin und Serin codierender DNA (SEQ ID NO:3), in den pAc373-Vektor ligiert. Mit dem so erhaltenen Vektor und dem Wildtyp-Baculovirus wurden gemeinsam Spodoptera frugiperda (sf9)-Zellen transfiziert, und das die zwei HIV- r-gp120-Polypeptide exprimierende rekombinante Baculovirus wurde gemäß den von Summers M.D. und Smith G.E. in "A Manual Of Methods For Baculovirus Vectors And Insect Cell Culture Procedures", Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555, beschriebenen Verfahren isoliert. Die rekombinanten Viren wurden durch ihre Fähigkeit identifiziert, ein Protein zu produzieren, das spezifisch durch HIV-1-Antiseren immunpräzipitiert werden kann. Die Expression von SBQ ID NO:3 in den Spodoptera frugiperda Zellen hatte eine Produktion von zwei verschiedenen r-gp120-Polypeptiden zur Folge: 70% der Polypeptide erstreckten sich von AA&sub3;&sub3; bis AA&sub4;&sub9;&sub8; von SEQ ID NO:4 und 30% der Polypeptide erstreckten sich von AA&sub2;&sub3; bis AA4&sub4;&sub9;&sub8; von SEQ ID NO:4.
Alle Reinigungsschritte wurden bei 4ºC durchgeführt. Der konditionierte Insektenzellen-Kulturüberstand wurde mittels Filtration durch eine hydrophile 2 µm-Durapore-Filterpatrone von Millipore geklärt. Das geklärte Filtrat wurde mit einem gleichen Volumen 40 mM MES, pH 5,5 verdünnt und auf eine 5-Sephadose-Fast Flow-Säule (voräquilibriert mit 20 mM MES, pH 5,5) in einem Verhältnis von 1 ml Harz pro 100 ml konditioniertem Kulturüberstand geladen. Die Säule wurde mit 20 mM MES, pH 5,5, gefolgt von 20 mM Tris-HCl, pH 7,0, gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden mit 20 mM Tris-HCl, pH 7,0/300 mM NaCl eluiert. Der das HIV-r-gp120 enthaltende Eluat-Pool wurde mit einem gleichen Volumen von 20 mM Tris-HCl, pH 7,0 verdünnt und auf eine menschliches rsCD4- enthaltende Affinitätssäule aufgetragen. Die Affinitätssäule enthielt gereinigtes menschliches rsCD4 (vorstehend beschrieben), das an Affi-Gel 10-Harz in einer Menge von 5 mg rsCD4 pro ml Harz immobilisiert war, im wesentlichen entsprechend den Anweisungen des Harz-Herstellers (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, Katalognummer 153- 6046). Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumina PBS gewaschen, dann mit 5 Säulenvolumina PBS/500 mM NaCl und anschließend mit 5 Volumina PBS. Die gebundenen HIV-r-gp120- Polypeptide wurden mit 50 mM Natriumcitrat, pH 3,0/250 mM NaCl eluiert. Die eluierten Fraktionen wurden unmittelbar danach durch die Zugabe von einem Zehntel Volumen 1 M Tris-HCl, pH 7 neutralisiert. Die gereinigten HIV-r-gp120-Polypeptide (etwa 0,2-0,3 mg/ml) wurden bis zum Gebrauch bei -70ºC gelagert.
Das RIA-Kompetitionsexperiment wurde im wesentlichen so durchgeführt, wie es vorstehend für die CD4 V1- und CD4 V1V2-Kompetitionsexperimente beschrieben wurde. Insbesondere wurde jede Vertiefling der Mikrotiterplatte mit anti-Maus-Ig beschichtet, die Vertieflingen bzw. die freien Bindungsstellen wurden blockiert, und anschließend wurde die Platte mit Hybridom-Kulturüberstand (1F8, 5A8 oder 5F2), OKT4, OKT4A oder Leu3A inkubiert, wie vorstehend beschrieben. Das gereinigte Baculovirus-r-gp 120 (Endkonzentration 2,5 µl/ml) ¹²&sup5;I-rsCD4 wurden zusammen 0,5 Stunden vorinkubiert, und dann wurde das Gemisch zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach dem Inkubieren wurden die Vertiefungen gewaschen und das gebundene I-rsCD4 wurde unter Verwendung eines Garnmazählers nachgewiesen.
Die Ergebnisse des ELISA-Kreuzblockierungsexperiments sind in Tabelle V aufgeführt, die die durch gereinigtes HIV-r-gp120 verursachte prozentuale Inhibierung der Bindung von menschlichem rsCD4 an drei erfindungsgemäße Antikörper-Homologe (1F8, 5A8 und 5F2), zwei CD4 V1-spezifische monoclonale Antikörper (Leu3A und OKT4A) und einen CD4 V3V4-spezifischen monoclonalen Antikörper (OKT4) auflistet. Tabelle V HIV-r-gp120-Kreuzblockierung: monoclonale anti-CD4-Antikörper vorinkubiert in Lösung mit rsCD4
Die in Tabelle V gezeigten Daten beweisen, daß das Vorinkubieren von menschlichem rsCD4 mit HIV-gp120 nicht signifikant die Bindung des monoclonalen Antikörpers 1F8, 5A8 oder 5F2 an den r-gp120/rsCD4-Komplex blockiert. Im Gegensatz dazu hebt r-gp120 beinahe vollständig die Bindung der CD4 V1 -spezifischen Antikörper OKT4A und Leu3A an menschliches rsCD4 auf.
In ihrem zweiten Verfahren wendeten die hier genannten Anmelder die Immunfluoreszenzfärbung an, um zu bestimmen, ob gereinigtes HIV-r-gp120 mit 5A8, zwei CD4 V1-spezifischen Antikörpern (Leu3A und OKT4A) und einem CD4 V3V4-spezifischen Antikörper (OKT4) um die Bindung an eine menschliche CD4+-Zellinie (H9) konkurriert. Zwei parallele Sätze von Zeliproben wurden gefarbt. Ein Satz wurde nur mit den monoclonalen anti-CD4-Antikörpem gefarbt. Der andere Satz wurde vor der Färbung mit den monoclonalen anti-CD4-Antikörpern mit einer zur Absättigung ausreichenden Menge an HIV-r-gp120 vorinkubiert.
Insbesondere wurden für eine jede Probe 2 x 10&sup5; H9-Zellen (Gabe von Dr. Robert T. Schooley, University of Colorado Medical School, Denver, CO) in 50 µl des Färbepuffers PBS/2% FCS/0,02% Natriumazid suspendiert, und dazu wurden 50 µl Antikörper-Reagens gegeben. Für 5A8 war das Antikörper-Reagens konditionierter Hybridomzellkultur-Überstand mit etwa 5-20 µg/ml 5A8. Die Antikörper-Reagenzien für die Kontrollantikörper waren Lösungen mit einer Konzentration von 10 µg/ml in Färbepuffer von Leu3A, OKT4A oder OKT4. Als negative Kontrollen erhielten zwei Zellproben Antikörper-Reagenzien, die 10 µg/ml eines Antikörpers mit irrelevanter Spezifität in Färbepuffer enthielten, und zwar gereinigte Maus-Myelomproteine aus MOPC 21-Zellen (IgG&sub1;) (Litton Bionetics, Inc., Charleston, SC, Katalognummer 8402-03) oder aus UPC-10-Zellen (IgG2a) (Litton Bionetics, Inc., Katalognummer 8402-24).
Die Proben wurden 30 Minuten auf Eis inkubiert und dann dreimal in einem Volumen von je 1 ml Färbepuffer gewaschen. Anschließend wurden 2 µl FITC-konjugiertes Ziege-anti-Maus-Immungobulin (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA Katalognummer 115-006-062) in einer Endverdünnung von 1:50 in Färbepuffer (30 µg/ml) zugegeben, und die Proben wurden 20 Minuten auf Eis inkubiert zweimal gewaschen und in einem FACStar-Sortiergerät für fluoreszenzaktivierte Zellen analysiert.
In einem parallelen Experiment (auch mit 2 x 10&sup5; H9-Zellen pro Röhrchen) wurden die Zellproben vor der vorstehend beschriebenen Färbung mit den monoclonalen anti-CD4- Antikörpern mit einem Überschuß an r-gp120 inkubiert (Sättigung der Zelloberflächen-CD4- Moleküle). Insbesondere wurden zu jeder Zellprobe 10 µg r-gp120 enthaltender Färbepuffer zugegeben. Nach einer Vorinkubation von 30 Minuten mit r-gp120 auf Eis wurden die vorstehenden Antikörper-Reagenzien zugegeben und das Färbeverfahren wurde weiterhin durchgeführt, wie vorstehend beschrieben. Die Zellen wurden wie vorstehend in einem FACStar-Gerät analvsiert.
Figur 2 zeigt die Ergebnisse dieses Experiments. Jedes Profil zeigt die relative Zellzahl (lineare Skala x-Achse), aufgetragen gegen den Logarithmus der Fluoreszenzintensität der H9-Zellen. Der Logarithmus der Fluoreszenzintensität ist direkt proportional zur Dichte der gefärbten Moleküle pro Zelle. Die Profile in der linken Spalte beziehen sich auf den Satz von Experimenten, bei denen die anti-CD4-Antikörper direkt zu den H9-Zellen zugegeben wurden. Die Profile in der rechten Spalte beziehen sich auf den Satz von Experimenten, bei denen die Zellen mit einem Überschuß an HIV-r-gp 120 vor der Zugabe der anti-CD4- Antikörper vorinkubiert wurden. Die gestrichelten Linien stellen die Färbung mit den monodonalen anti-CD4-Antikörpern dar. Die durchgezogenen Linien stellen die Färbung mit irrelevanten negativen Kontroll-Maus-IgG-Antikörpern dar. Das UPC-10-Immunglobulin (IgG&sub2;) diente als Kontrolle für OKT4A (IgG2a) und OKT4 (IgG&sub2;b) und das MOPC 21- Immunglobulin (IgG&sub1;) diente als Kontrolle für 5A8 (IgG&sub1;).
Die Ergebnisse beweisen, daß die 5A8-Bindung an CD4&spplus;-H9-Zellen durch das Vorinkubieren der Zellen mit einem Überschuß an HIV-r-gp120 nicht beeinflußt wird. Im Gegensatz dazu wurde die Bindung der CD4 V1-spezifischen Antikörper Leu3A und OKT4A durch das Vorinkubieren mit einem Überschuß an HIV-r-gp 120 vollständig blockiert. Wie erwartet, wurde der CD4 V3V4-spezifische monoclonale Antikörper OKT4 durch das Vorinkubieren mit HIV-r-gp120 nicht beeinflußt.

Blockierung der HIV-induzierten Syncytienerzeugung

Die hier genannten Anmelder untersuchten die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Antikörper-Homologen die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4 -Zellen zu blockieren, um ihren potentiellen therapeutischen Vorteil bei der Vorbeugung vor und Behandlung von AIDS, ARC und HIV-Infektionen festzustellen.
In einem ersten Verfahren testeten die Anmelder mehrere erfindungsgemäße Antikörper-Homologe auf ihre Fähigkeit, die Syncytienerzeugung zwischen HIV-infizierten H9- Zellen und nicht infizierten C8166-Zellen zu blockieren, wie bei Walker B.D. et al. in "Inhibition Of Human Immunodeficiency Virus Syncytium Formation And Virus Replication By Castanospermine". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1984), 8120-8124, beschrieben wurde. HIV-infizierte H9-Zellen und C8166-Zellen (vgl. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, a.a.O.) sind menschliche CD4&spplus;-T-Zell-Linien. C8166 ist eine transformierte menschliche CD4&spplus;-Blut-Lymphocyten-Zellinie der Nabelschnur, die beschrieben wird bei Sodroski J. et al., "Role Of The HTLV-III/LAV Envelope In Syncytium Formation And Cytopathicity", Nature 322 (1986), 470-474. Beide Zellinien waren eine Gabe von Dr. Robert T. Schooley, University of Colorado Medical Scholl, Denver, CO, und sind auch erhältlich vom AIDS Reference Reagent Program, National Institutes of Health, Bethesda, MD.
Insbesondere inkubierten die Anmelder für jede Probe 5 x 10³ der chronisch HIV- infizierten H9-Zellen in 100 µl "R-20-Medium" (RPMI- 1 640-Kulturmedium mit 10 mM HEPES (pH 6,8) und 2 mM Glutamin, suppiementiert mit 20% FCS) 30 Minuten bei 37ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre mit 50 µl Hybridomzellkultur-Überstand, der etwa 5-20 µg/ml eines erfindungsgemäßen Antikörper-Homologs enthielt. Die Kulturüberstände wurden in Zweifach-Verdünnungsreihen in R-20-Medium von 1:2 bis 1:256 getestet. Die Anmelder gaben dann 15 x 10³ nicht infizierte C8166-Zellen in 100 µl R-20-Medium zu, um in jeder Vertiefung ein Endvolumen von 200 µl zu erhalten. Die Proben wurden nach Zugabe der C8166-Zellen bei 37ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert, und die Zahl der Syncytien pro Vertiefung wurde dann durch visuelle Überprüfung unter einem Lichtmikroskop ausgewertet.
Die maximale Anzahl von Syncytien pro Vertiefung entwickelte sich in Abwesenheit von jeglichem zugesetzten anti-CD4-Antikörper-enthaltenden Kulturüberstand. In einer Probe wurden 100 µl Kulturüberstand, der etwa 5-20 µg/ml eines im Isotyp übereinstimmenden irrelevanten Maus-Immunglobulins enthielt (Hybridomkulturüberstand), als negative Kontrolle für jegliche unspezifischen Blockierungswirkungen zugegeben. Als positive Kontrolle wurde der CD4 V1-spezifische monoclonale Antikörper Leu3A in einer Reihe von Konzentrationen im Bereich von 2,5 µg/ml absteigend bis 0,04 µg/ml getestet.
Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle V1 veranschaulicht. Die Daten werden als reziproker Wert der Hybridomkulturüberstands-Verdünnung ausgedrückt, die eine 50%ige Blockierung der Syncytienerzeugung ergibt. Tabelle V1 Blockierung der Syncytienerzeugung durch erfindungsgemäße Antikörper-Homologe
* Größer als oder gleich eine(r) 80%ige(n) Blockierung absteigend bis 0,04 µg/ml.
In mehreren voneinander unabhängigen Experimenten unter Anwendung des vorstehenden Tests lag die zur Verursachung einer 50%igen Blockierung der Syncytienerzeugung erforderliche Konzentration von OKT4 (einem CD4 V3V4-spezifischen Antikörper) im Bereich von 1-10 µg/ml.
Der vorstehende Test wurde auch mehrmals mit gereinigtem 5A8, gereinigtem Leu3A und gereinigtem 5A8 zusammen mit gereinigtem Leu3A durchgeführt. Bei der gemeinsamen Verabreichung von Leu3A und 5A8 wurde eine synergistische Inhibierung beobachtet. Beispielsweise inhibierten in einem Experiment sowohl Leu3A als auch 5A8 die Syncytienerzeugung um 50% in einer Konzentration von 0,02 µg/ml wenn sie alleine verwendet wurden. Bei einer Konzentration von 0,008 µg/ml von entweder Leu3A oder 5A8 allein beobachteten die hier genannten Anmelder eine Syncytienblockierung von 30% bzw. 20%. Wurden jedoch Leu3A und 5A8 zusammen verabreicht, war für eine Inhibierung um 50% nur eine Konzentration von 0,004 µg/ml von jedem erforderlich. Ähnliche synergistische Wirkungen wurden bei 3 von 4 weiteren Experimenten beobachtet.
In einem anderen Syncytientest bestimmten die Anmeldern die Fähigkeit von gereinigtem 5A8 die HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen menschlichen CD4&spplus;- Jurkat-Zellen und transformierten CHO-Zellen, die rekombinantes gp 160 auf ihrer Oberfläche exprimieren ("r-gp160-CHO-Zellen"), exakt quantitativ. Die Jurkat-Zellen waren eine Gabe von Dr. Timothy Springer, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, und sind auch erhältlich von der American Type Culture Collection Rockville, MD, Katalognummer T18152. Die r-gp160-CHO-Zellen wurden bei der In Vitro International, Inc., Culture Collection in Linthicum, MD, unter der Hinterlegungsnummer IV1-10261 hinterlegt und unter der Hinterlegungsnummer CRL 10885 in die American Type Culture Collection, Rockville, MD, überführt. Die zur Transformation dieser Zellen verwendete Nucleotidsequenz des HIV-gp160-Gens ist in SEQ ID NO: 1 angegeben, und die von ihr codierte Aminosäuresequenz der gp120/gp41-Polypeptide ist ebenfalls in SEQ ID NO:1 sowie in SEQ ID NO:2 angegeben. Für Vergleichszwecke wendeten die Anmelder diesen Test an, um die Syncytien-blockierende Fähigkeit von zwei CD4 V1-spezifischen monoclonalen Antikörpern (OKT4A und Leu3A) und einem CD4 V3V4-spezifischen monoclonalen Antikörper (2-103-D11, im Verhalten ähnlich wie OKT4) zu untersuchen.
Der in diesem Test verwendete gereinigte 5A8-Antikörper wurde wie folgt hergestellt. 5A8-Hybridomzellen (1 x 10&sup6;) wurden BALB/c-Mäusen (sensibilisiert (primed) mit Pristan) zur Erzeugung von Aszites intraperitoneal injiziert. Die 5A8-Aszitesflüssigkeit wurde bis zum Gebrauch bei -20ºC gefroren gelagert. Nach dem Auftauen wurde die 5A8- Aszitesflüssigkeit bei etwa 500 x gav 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifügiert. Der Überstand wurde durch einen 0,45 µm Millipore Filter gefiltert und anschließend sechsfach verdünnt und gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung einer Affi- Gel Protein A-MAPSII-Säule (Bio-Rad Laboratories, Katalognummer 1536159) gereinigt. Die Probe wurde dann gründlich gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung bei 4ºC dialysiert. Die dialysierte 5A8-Präparation wurde in Aliquote aufgeteilt und bis zum Gebrauch bei -70ºC gelagert.
Insbesondere wurden r-gp160-CHO-Zellen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (mit flachem Boden) in einer Konzentration von 1,5 x 10&sup4; Zellen/Vertiefung in 100 µl Medium (α&supmin;-MEM, suppiementiert mit 10% dialysiertem FCS, 4 mM L-Glutamin und 500 nM Methotrexat) plattiert und über Nacht bei 37ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden die Platten auf Saugpapier ausgeklopft, um das Medium aus den Vertiefüngen zu entfernen, und zu jeder Vertiefung wurden 100 µl Antikörper- Reagens zugegeben (1ede Antikörperkonzentration wurde in dreifacher Ausfertigung getestet); diese Proben ergaben den "Test-CPM"-Wert. Als Antikörper-Reagens gaben die Anmelder gereinigten 5A8, Leu3A, OKT4 oder 2-103-D11 (gereinigt, wie vorstehend für 5A8 beschrieben) in Konzentrationen im Bereich von 0,026 bis 10 000 ng/ml zu. Im Anschluß daran gaben sie 6 x 10&sup4; &sup5;¹Cr-markierte CD4&spplus;-Jurkat-Zellen (hergestellt, wie nachstehend beschrieben) in 100 µl RPMI-Medium zu, supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem FCS, 2 mM Glutamin und 100 U/ml Penicillin G und Streptomycin. Zur Kontrolle von unspezifischer &sup5;¹Cr-Freisetzung aus den Jurkat-Zellen gaben die hier genannten Anmelder zu einer Vertiefung 6 x 10&sup4; &sup5;¹Cr-markierte Jurkat-Zellen in einem Volumen von 200 µl zu; diese Probe ergab den "Hintergrund-CpM"-Wert.
Die Mikrotiterplatten wurden bei 37ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre 17 bis 19 Stunden inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Vertiefungen visuell unter einem Lichtmikroskop auf Syncytienlyse in den positiven Kontrollvertiefungen und Inhibierung der Lyse in den Vertiefungen überprüft, die die anti-CD4-Antikörper enthielten, von denen erwartet wurde daß sie die Syncytienerzeugung blockieren. Die Platten wurden drei bis vier Minuten bei etwa 400 x gav zentrifugiert. Der Überstand (100 µl) wurde ohne den Boden zu berühren aus jeder Vertiefung abgesaugt und in Titertube-Mikroröhrchen (Bio-Rad Laboratories, Katalognummer 223-9390) gegeben. Die Mikroröhrchen wurden dann einzeln in Zählfläschchen überführt und der von jedem Fläschchen emittierte CPM-Wert wurde in einem Gammzähler (Beckman) gemessen.
Zur Bestimmung der zu einem jeden Test zugegebenen Gesamtzahl ("Gesamt- CPM"-Werf) wurden 6 x 10&sup4; der &sup5;¹Cr-markierten Jurkat-Zellen in ein Szintillationsfläschchen gegeben und dann in dem Fläschchen durch Zugabe von 0,2 N NaOH und 1% Natriumdodecylsulfat in PBS lysiert. Der von diesem Kontrollfläschchen emittierte CPM-Wert wurde dann in einem Gammzähler gemessen.
Die &sup5;¹Cr-markierten Jurkat-Zellen wurden wie folgt hergestellt. Jurkat-Zellen aus Flaschen wurden abzentrifugiert, in frischem Wachstumsmedium resuspendiert (RPMI- Medium, supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem FCS, 2 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin G und Streptomycin) und gezählt. Zu sterilen 50 ml-Röhrchen mit konischem Boden wurde frisches &sup5;¹Cr in folgenden Verhältnissen zugegeben: (1)100 µCi &sup5;¹Cr (100 µl) wurden zu 900 ul Medium mit bis zu 5 X 10&sup6; Zellen zugegeben; (2) 200 bis 250 µCi &sup5;¹Cr (200-250 ul) wurden zu 800 bis 750 µl Medium mit 5 x 10 bis zu 10 x 10 Zellen zugegeben. Die Zellen wurden bei 37ºC unter 5% CO&sub2; mit lockeren Verschlüssen 45 Minuten unter gelegentlichem vorsichtigem Schütteln inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden die Zellen dreimal mit ihrem Wachstumsmedium gewaschen (30 ml pro Waschschritt). Die gewaschenen Zellen wurden in 1 ml Wachstumsmedium resuspendiert, gezählt und zu den Syncytientests zugegeben. Die Zellen wurden im Test innerhalb von 30 Minuten nach ihrer Herstellung verwendet.
Die prozentuale Inhibierung wurde wie folgt berechnet:
Test-CpM-Wert - Hintergrund-CpM-Wert/Gesamt-CPM-Weil - Hintergrund-CPM-Wert x 100 = Syncytienlyse in %
Inhibierung in% = (1 -Syncytienlyse in % in Gegenwart des anti-CD4-mAk/ Syncytienlyse in % in Abwesenheit des anti-CD4-mAk) x 100
Die Figuren 3 und 4 zeigen die Ergebnisse dieser Experimente, wobei die prozentuale Syncytieninhibierung (berechnet, wie vorstehend beschrieben) gegen die Konzentration (ng/ml) des Antikörpers aufgetragen wurde. Figur 3 zeigt die Wirkung auf die Syncytienerzeugung von 0,026 bis 2000 ng/ml 5A8, Leu3A und OKT4A. Unerwarteterweise zeigt Figur 3, daß die Wirksamkeit von 5A8 mit der von Leu3A und OKT4A vergleichbar ist, wobei eine Blockierung der Syncytienerzeugung um 50% bei einer Konzentration von etwa 10 ng/ml erzielt wird. Figur 4 zeigt die Wirkung auf die Syncytienerzeugung von 3,2 bis 10 000 ng/ml 5A8, Leu3A, OKT4A und dem "OKT4-ähnlichen" monoclonalen Antikörper 2-103-D11. Figur 4 beweist, daß der CD4 V3V4-spezifische Antikörper (2-103-D11) die Syncytienerzeugung nur in einer Konzentration blockiert, die um mehrere Größenordnungen höher als die für 5A8 erforderliche ist.

Blockierung der HIV-Infektion von CD4±-Zellen

Die hier genannten Anmelder untersuchten die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Antikörper-Homologen die Infektion von CD4&spplus;-Zellen durch HIV zu blockieren, um ihren potentiellen therapeutischen Vorteil bei der Vorbeugung vor und Behandlung von AIDS, ARC und HIV-Infektionen festzustellen. Für diese Messungen verwendeten sie einen Mikrotest unter Zugrundelegung des bei Robert-Guroff M. et al. in "HTLV-III-Neutralizing Antibodies In Patients With AIDS And AIDS-Related Complex", Nature 316 (1985), 72-74, beschriebenen Protokolls.
In einem ersten Experiment wurden 200 TCID&sub5;&sub0; (200mal die niedrigste Verdünnung des Virus, die reproduzierbar die Hälfte der beimpften Kulturen infiziert) des HIV- Isolats HTLV-IIIB (Robert-Guroff et al., Nature, a.a.O.) in R-20-Medium zu 20 µl eines unverdünnten Hybridomkulturüberstands mit monoclonalen anti-CD4-Antikörpem oder eines Kulturüberstands mit irrelevantem Maus-IgG&sub1; (als negative Kontrolle) und 4 x 10&sup4; C8166- Zellen in 10 µl R-20-Mediuni7 zugegeben. HTLV-IIIB war eine Gabe von Dr. Robert T. Schooley, Universitv of Colorado Medical School, Denver, CO, und ist auch erhältlich vom AIDS Reference Reagent Program, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Aliquote eines jeden Gemisches wurden zu drei Vertiefungen zugegeben (15 µl/ Vertiefung) und jede Vertiefung wurde bis zu einem Gesamtvolumen von 200 µl mit R-20-Medium aufgefüllt. In einem zweiten Experiment wurden Zellen vor der Zugabe von 100 TCID&sub5;&sub0; HIV mit dem Hybridomkulturüberstand 30 Minuten bei 37ºC vorinkubiert. Das Vorinkubieren hatte keine erkennbare Wirkung auf die 5A8-Blockierung der Infektion.
Die Vertiefungen aus beiden Experimenten wurden vier bis acht Tage später visuell unter einem Lichtmikroskop auf den Ausbruch der Infektion hin bewertet, was durch das Vorhandensein von Syncytien erkennbar war. Eine Vertiefung wurde als positiv für eine Infektion bewertet, wenn sie mehr als 5 Syncytien enthielt, wobei jedes Syncytium einen Durchmesser von mehr als 3 Zelldurchmesser aufwies.
Die hier genannten Anmelder nahmen an, daß 2 bis 3 positive Vertiefungen auf eine erfolgreiche Infektion hinweisen, während keine oder 1 positive Vertiefung auf eine wirksame Blockierung hinweist.
Die Tabelle V1I zeigt die Wirkungen von 5A8 (5-20 µg/ml), 1F8 (5-20 µg/ml), 5F2 ( 5 µg/ml), dem CD4 V3V4-spezifischen monoclonalen Maus-IgG&sub1; 2-103-D11 ( 5 µg/ml) und einem irrelevanten Maus-IgG&sub1;-Kulturüberstand (5-20 µg/ml) auf die Infektion mit 200 TCID&sub5;&sub0; HIV von CD4&spplus;-C8166-Zellen ohne Vorinkubieren der Zellen und der Antikörper. Tabelle V1II zeigt die Wirkungen der gleichen Antikörper bei den gleichen Konzentrationen auf die Infektion von 100 TCID&sub5;&sub0; HIV bei Vorinkubieren der Zellen und der Antikörper. Tabelle V1I Infektion durch 200 TCID&sub5;&sub0; HIV in Gegenwart von erfindungsgemäßen Antikörper Homologen: keine Vorinkubation Tabelle V1II Infektion durch 100 TCID&sub5;&sub0; HIV in Gegenwart von erfindungsgemaßen Antikörper Homologen: mit Vorinkubation
Die Tabellen V1I und V1II beweisen, daß 5A8 zur reproduzierbaren Blockierung des Zustandekommens der HIV-Infektion in CD4T-Zellen fähig ist. 1F8 und 5F2 weisen ebenfalls Anzeichen dafür auf, daß sie die HIV-Infektion blockieren können.
Die hier genannten Anmelder führten weitere Infektiositätsexperimente unter Verwendung eines neueren HIV-Patienten-Isolats (Isolat 0108E, Massachusetts General Hospital Phase I Reception Clinical Trial: Schooley R.T. et al., "A Phase I/II Escalating Dose Trial Of Recombinant Soluble CD4 Therapy In Patients With AIDS Or AIDS-Related Complex", Aun. Int. Med. 112 (1989), 247-253) anstelle des in den vorstehend beschriebenen Experimenten verwendeten Laborstamms (HTLV-IIIB) durch.
In diesem Experiment wurden 500 µl Antikörper-Reagens zu 250 µl "R-3-Medium,, (R-20-Medium, erganzt mit 25 E/ml rekombinantem T-Zell-Wachstumsfaktor ("r-IL2" oder "r-TCGF"), hergestellt von Biogen, Inc., Canibridge, MA), enthaltend 5 bis 10 TCID&sub5; des HIV-Isolats 0108E und 250 µl R-3-Mediuni, enthaltend 1 x 10 &sup6;Phytohämagglutinin ("PHA")-aktivierte menschliche periphere Blut-Lymphocyten ("PBLs") (wie nachstehend beschrieben hergestellt), zugegeben. Die Antikörper-Reagenzien, die in dem in Tabelle IX dargestellten Experiment verwendet wurden, waren ein 5A8 enthaltender Hybridomkulturüberstand (5-20 µl/ml) und als negative Kontrolle ein Kulturüberstand, der ein im Isotyp übereinstimmendes IgG&sub1; enthielt (5-20 µg/ml), beide verdünnt in R-20-Medium. Die Antikörper- Reagenzien, die in dem in Tabelle X dargestellten Experiment verwendet wurden, waren gereinigtes 5A8 (vorstehend beschrieben), gereinigtes Leu3A als positive Kontrolle und das im Isotyp übereinstimmende, gereinigte Maus-IgG&sub1; MOPC 21 als negative Kontrolle (Litton Bionetics, Katalognummer 8402-031), alle verdünnt in R-20-Medium.
Die mit PHA aktivierten menschlichen PBLs wurden wie folgt hergestellt. Vollblut (Rotes Kreuz) wurde auf Histopaque (Sigma Chemical Co., Katalognummer 1077-1) geschichtet und bei 400 x gav 40 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die PBLs wurden aus der Grenzschicht gewonnen, dreimal in nicht supplementiertem RPMI- 1640-Medium gewaschen und gezählt. Die PBLs wurden dann in einer Konzentration von 4 x 10 Zellen/ml in mit 1 µg/ml PHA-P supplementiertem R-3-Medium (Difco, Springfield, NJ, Katalognummer DF 3110 56 4) resuspendiert und 3 Tage inkubiert. Nach dem Inkubieren wurden die Zellen eingefroren (10% DMSO in R-20-Medium) und bis zum Gebrauch bei -80ºC gelagert. Vor der Verwendung wurden die aktivierten PBLs aufgetaut und in R-3-Medium 5 Tage gezüchtet.
Bei dem Experiment unter Verwendung von gereinigtem 5A8 (Tabelle X) wurden die mit PHA aktivierten PBLs vor Zugabe des Virus mit den Antikörper-Reagenzien 1 Stunde bei 37ºC vorinkubiert. Bei dem anderen Experiment (Tabelle IX) unter Verwendung von 5A8-Hybridomkulturüberstand wurde keine solche Vorinkubation durchgeführt. In beiden Experimenten wurden die Zellen mit den Antikörper-Reagenzien und dem Virus 24 Stunden bei 37ºC und 5% CO&sub2; inkubiert. Jede Zellprobe wurde dreimal mit R-20-Medium gewaschen, in zwei Vertiefungen aufgeteilt und bei 37ºC und 5% CO&sub2; in R-3-Medium inkubiert. Alle 3 bis 4 Tage wurden 450 µl Zellüberstand entnommen und auf die Gegenwart des MIV- Kemantigens p24 (einem Indikator der HIV-Infektion) untersucht. Nach einer solchen Entnahme wurden zu jeder Vertiefung 500 µl R-3-Medium zugegeben.
Die hier genannten Anmelder testeten auf HIV-p24 mit einem Festphasen-ELISA unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits, der einen monoclonalen anti-p24-Antikörper verwendet, immobilisiert in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte, um das in der Probe vorliegende p24-Kemantigen abzufangen (NEN Research Products E.I. DuPont de Nemours and Co., Inc., Boston, MA, "HIV Core Profile ELISA", Katalognummern NEK- 060, NEK-060A, NEK-060B). Der Kit wurde verwendet, wie vom Hersteller angegeben, wobei die umfangreiche Bereichsstandardkurve in Aiihang C der mit dem Kit gelieferten Verfahrensbroschüre angegeben ist.
Eine Vertiefung wurde als "infiziert" eingestuft, wenn sie mehr als 0,1 ng/ml HIV- p24 enthielt.
Die Ergebnisse dieser Experimente sind in den Tabellen IX und X aufgeführt. Tabelle IX Infektion mit 5-10 TCID&sub5;&sub0; eines HIV-Patienten-Isolats in Gegenwart von 5A8- Kulturüberstand Tabelle X Infektion mit 5-10 TCID&sub5;&sub0; eines HIV-Patienten-Isolats in Gegenwart von gereinigtem 5A8- Leu3A und IgG 1 -Kontrollantikörpern
Die Tabellen IX und X beweisen, daß 5A8 ein besonders wirksamer Blocker der Infektion mit einem HIV-Patienten-Isolat ist. Der 5A8 enthaltende Kulturüberstand blockierte die Infektion sogar in einer 1:16-Verdünnung. Gereinigtes 5A8 blockierte die Infektion mit dem HIV-Patienten-Isolat bei einer so geringen Konzentration wie 0,08 µg/ml, die niedrigste getestete Konzentration, die mit Leu3A vergleichbar ist.

Immunsuppressivität

Die hier genannten Anmelder verglichen die Immunsuppressivität eines erfindungsgemäßen Antikörper-Homologs (5A8) mit der von zwei CD4 V1-spezifischen anti- CD4-Antikörpem (Leu3A und OKT4A) unter Anwendung eines T-Zellvermehrungstests, der nach dem bei Engleman E.G. et al., "Activation Of Human T Lymphocyte Subsets: Helper And Suppressor/Cytotoxic T Cells Recognize And Respond To Distinct Histocompatibility Antigens", J. Immunol. 127 (1981), 2124-2129, beschriebenen Protokoll modifiziert wurde ("Tetanus-Toxoid"- oder "TT"-Test). In diesem Test werden menschliche PBLs mit einem Tetanus-Toxoid behandelt, das ihre Vermehrung stimuliert. Wenn bei der Zugabe des Tetanus-Toxoids ein immunsuppressiver Stoff vorhanden ist, wird die Vermehrung behindert. Die Vermehrung wird quantitativ bestimmt als ³H-Thymidin-Binbau durch die Zellen.
Die menschlichen PBLs wurden durch das zweifache Verdünnen von 10 ml Blut mit nicht supplementiertem RPMI- 1640-Medium und das Überschichten des Gemisches über 10 ml Lymphocyten-Trennmedium in einem 50 ml-Röhrchen bei Raumtemperatur isoliert. Das Röhrchen wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten bei 400 x gav zentrifligiert. Die PBLs wurden aus der Grenzschicht gewonnen, zweimal mit nicht suppiementiertem RPMI-1640- Medium gewaschen, gezählt und im Tetanus-Toxoid-Test verwendet, wie nachstehend beschrieben.
Der Tetanus-Toxoid-Test wurde in Flachboden-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen durchgeführt, wobei jede Vertiefung menschliche PBLs und Tetanus Toxoid enthielt. Zu einigen der Vertiefungen wurden Antikörper-Reagenzien zugegeben, wobei das Gesamtvolumen in jeder Vertiefling 200 µl betrug. Vertiefungen, die nur Zellen enthielten (kein Antikörper-Reagens oder Tetanus-Toxoid) stellten den "Hintergrund" für diesen Test dar.
Der Test wurde in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. Die Testkomponenten wurden in der folgenden Reihenfolge zugegeben: (1) 50 µl "Testmedium" (RPMI-1640, supplementiert mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (Hazelton Biologics, Inc., Lenexa, KS, Katalognummer 12-10378P), 2 mM L-Glutamin und 100 Einheiten/ml Penicillin G und Streptomycin); (2) 50 µl Testmedium (für die "Hintergrund"-Vertiefüngen) oder Antikörper-Reagens (die TT-Test-Endkonzentrationen lagen im Bereich von 10 bis 0,1 µg/ml von gereinigtem 5A8, Leu3A, ÖKT4A, MOPC 21 oder UPC-10; (3) 50 µl Tetanus-Toxoid in einer Konzentration von 40 µl/ml, verdünnt in Testmedium (die TT-Test-Endkonzentration betrug 10 µg/ml); und (4)1,5 x 10&sup5; mit PHA aktivierte PBLs, hergestellt, wie vorstehend beschrieben.
Das Tetanus-Toxoid wurde als Konzentrat vom Massachusetts Public Health Biologic Laboratory, Jamaica Plain, MA, erhalten und wurde vor dem Gebrauch bei 4ºC gegen 41 PBS während mehr als 48 Stunden dialysiert. Die CD4 V1-spezifischen Antikörper OKT4A (Isotyp IgG2a) und Leu3A (IgG&sub1;) wurden von Ortho Diagnostic Systems bzw. Becton Dickinson bezogen. Der gereinigte 5A8 (Isotyp IgG&sub1;) wurde hergestellt, wie vorstehend beschrieben. Der gereinigte MOPC 21-Kontrollantikörper (Litton Bionetics) stimmt im Isotyp mit 5A8 und Leu3A überein. Der gereinigte UPC-10-Antikörper stimmt im Isotyp mit OKT4A überein.
Nach Zugabe aller Reagenzien zu den Tests wurden die Platten bei 37ºC in einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre vier und fünf Tage inkubiert. Am vierten und fünften Tag wurden die Platten mit 1 µCi ³H-Thymidin (NEN Research Products, Katalognummer NET-027) während 6 bis 18 Stunden bei 37ºC und 5% CO&sub2; gepulst. Nach der Inkubation mit dem Marker wurden die Zellen in den Platten mit einem PHD-Cell Harvester (Cambridge Technologies, Inc., Cambridge, MA) geerntet und die die radioaktive DNA enthaltenden Filter wurden in Szintillationsfläschchen überführt, zu denen Szintillationsflüssigkeit zugegeben wurde (3 ml pro Fläschchen) (Scintiverse, Fisher Scientific Co., Katalognummer SK12-4). Die Radioaktivität der Fläschchen wurde in einem β-Zähler gezählt (Beckman Modell LS 3801).
Die Ergebnisse der TT-Tests werden in den Figuren 5 (Tag 4) und 6 (Tag 5) gezeigt. Die Figuren 5 und 6 zeigen die Wirkung von 5A8 und den verschiedenen Kontrollantikörpern auf die Vermehrung (ausgewiesen als CpM x 10³). Die Balken, die mit "TT- Kontrolle" bezeichnet sind, zeigen die Wachstumsbasislinie der Zellen ohne TT-Stimulation (nicht ausgefüllter Balken) und die TT-Antwort ohne irgendeinen Antikörper (ausgefüllter Balken). Die Wirkung des Antikörpers auf die Vermehrung allein, ohne TT-Stimulation, ist durch die Balken mit großen Flecken angegeben. Die Figuren zeigen auch die Wirkung auf die Vermehrung nach einer TT-Stimulation (d.h. die Inhibierung der TT-Antwort) der verschiedenen Antikörper bei Konzentrationen von 10 µl/ml (punktierte Balken) (nur MOPC 21 und 5A8), 1 µg/ml (diagonal gestreifte Balken) (alle Antikörper) und 0,1 µg/ml (Balken mit Kreuzschraffür) (alle Antikörper).
Die Daten in den Figuren 5 und 6 beweisen, daß 5A8 sowohl an beiden Tagen vier und fünf des Tests weniger immunsuppressiv als OKT4A war. Die Immunsuppressivität von 5A8 war in diesen Tests mit Leu3A vergleichbar.

5A8-Epitop-Kartierung

Als Teil ihrer Anstrengungen, den 5A8-Wirkungsmechanismus zu beschreiben, führten die hier genannten Anmelder mehrere Untersuchungen durch, um das von 5A8 gebundene Epitop zu kartieren. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden nachstehend zusammengefaßt.
Es wurde festgestellt, daß 5A8 nicht-reduziertes, SDS-denaturiertes CD4 auf einem Westem-Blot erkennt. Jedoch band 5A8 nicht an reduziertes CD4 oder an proteolytische Fragmente von CD4 (es wurden fünf verschiedene Proteasen verwendet). Folglich scheint 5A8 ein Konformationsepitop von CD4 zu erkennen. Dieses Ergebnis stimmt mit der Tatsache überein daß 5A8 eher als gegen denaturiertes CD4 oder CD4-Fragmente gegen r-CD4&spplus;-CHO-Zellen erzeugt wurde, die vermutlich CD4 in dessen nativer Konformation zeigen.
Die hier genannten Anmelder untersuchten die Bindung von 5A8 an eine Reihe von chimären Maus/Mensch-CD4-Molekülen. 5A8 erkennt kein Maus-CD4. Demgemäß hofften die Anmelder durch die Untersuchung der Bindung von 5A8 an verschiedene chimäre Maus/Mensch-CD4-Moleküle die für die 5A8-Bindung erforderlichen menschlichen CD4-Reste zu identifizieren.
Maus/Mensch-CD4-Chimäre codierende Genkonstrukte wurden bereitgestellt von Daniel R. Littman vom Howard Hughes Medical Institute, University of California, San Francisco, CA, und werden beschrieben bei Landau N.R. et al., "The Envelope Glycoprotein Of The Human Immunodeficiency Virus Binds To The Immunoglobulin-Like Domain Of CD4", Nature 334 (1988), 159-162. Die Anmelder transformierten transient COS-7-Zellen mit diese Konstrukte enthaltenden Expressionsvektoren und wiesen die Fähigkeit von 5A8, an die verschiedenen exprimierten Chimären zu binden, mittels FACS-Analyse nach. Als Kontrollen verwendeten sie die monoclonalen anti-Mensch-CD4-Antikörper Leu3A und OKT4 und den monoclonalen anti-Maus-CD4-Antikörper GK1.5. Die Antikörperbindung für jede chimäre Form wurde durch die Titration von 5A8 oder der Kontrollantikörper bei Konzentrationen unter dem Sättigungspunkt quantitativ bestimmt.
Die Ergebnisse der 5A8/Chimäres CD4-Bindungsstudien zeigen, daß: (1) menschliche CD4 V1V2-Reste sowohl für die 5A8-Bindung erforderlich als auch ausreichend sind; (2) daß menschliche V1-Reste (bis Aminosäure 83) nicht für eine effiziente 5A8-Bindung erforderlich sind; (3) daß menschliche Reste des stäbchenförmigen β-Strangs, der V1 und V2 verbindet (AA&sub8;&sub3;-AA&sub1;&sub0;&sub5;), die 5A8-Bindung signifikant beeinflussen (vgl. Wang J. et al., Nature 348 (1990), 411-418, für die Kristalistruktur von menschlichem CD4); und daß (4) die menschlichen CD4 V2-Reste AA&sub1;&sub0;&sub5;-AA&sub1;&sub3;&sub1; (Stränge B und C von V2) für die 5A8-Bindung absolut erforderlich sind.
Die hier genannten Anmelder untersuchten auch die Bindung von 5A8 an verschiedene Maus/Mensch-Punkt- und Cluster-Substitutionsmutanten von rsCD4. Die substituierten Aminosäurepositionen der Mutanten waren die folgenden: AA&sub6;&sub0; (V1), AA&sub1;&sub2;&sub1;-AA&sub1;&sub2;&sub4; (V2), AA&sub1;&sub2;&sub7;-AA&sub1;&sub3;&sub4; (V2) AA&sub1;&sub6;&sub5; (V2), AA&sub2;&sub2;&sub0;-AA&sub2;&sub2;&sub6; (V3) und AA&sub2;&sub4;&sub0;-AA&sub2;&sub5;&sub2; (V3). Insbesondere wiesen die Anmelder die Fähigkeit dieser Mutanten nach, die Bindung von 5A8 an CD4&spplus;-Zellen zu blockieren, im Vergleich zu ihrer Fähigkeit, die Bindung des CD4 V3V4- spezifischen Antikörpers OKT4 an CD4&spplus;-Zellen zu blockieren.
Bei einer Konzentration von 1 µg/ml blockierte jede mutierte Form die OKT4-Bindung in vergleichbarer Weise (etwa 60%). Im Gegensatz dazu, versagten Mutanten mit Mutationen an den Positionen AA&sub1;&sub2;&sub1;-AA&sub1;&sub2;&sub4; (Verbindungsschleife zwischen den Strängen B und C von V2) und AA&sub1;&sub2;&sub7;-AA&sub1;&sub3;&sub4; (Strang C von V2) bei der Blockierung der 5A8-Bindung an CD4&spplus;-Zellen. Diese Daten identifizieren die für die 5A8-Bindung entscheidenden Reste innerhaib des V2-Bereichs, die mit jenen unter Verwendung der Maus/Mensch-Chimären idenifizierten gut übereinstimmen. Zusätzlich wurde festgestellt, daß der Rest 165 zur Erkennung von CD4 durch 5A8 beiträgt, obwohl er bedeutend weniger wichtig als AA&sub1;&sub2;&sub1;-AA&sub1;&sub2;&sub4; und AA&sub1;&sub2;&sub7;-AA&sub1;&sub3;&sub4; war.

Wirkungen von 5A8 auf das Immunsystem in Rhesusaffen

Der monoclonale Antikörper 5A8 oder ein im Isotyp übereinstimmender monodonaler Kontrollantikörper (MOPC 21) wurde an Rhesusmakakenaffen verabreicht, um den Einfluß von 5A8 auf die normale Immunfünktion in vivo nachzuweisen. Mehrere Anzeichhen einer Immunfuktion wurden vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der 5A8- oder MOPC 21 -Infusion untersucht. Insbesondere wiesen die Anmelder nach, ob 5A8 (a) eine Abnähme in der Zahl der zirkulierenden CD4+-Zellen in vivo verursacht; (b) eine Modulation von CD4 auf der Oberfläche von CD4&spplus;-Zellen verursacht; (c) eine Abnahme in der Zahl der zirkulierenden peripheren Leukocyten ün vivo verursacht; oder (d) eine Abnahme des Antikörpertiters verursacht, der als Antwort auf ein fremdes Antigen (Tetanus-Toxoid) in vivo ausgelöst wird.
Die hier genannten Anmelder stellten fest, daß 5A8 keine signifikante Wirkung auf ein beliebiges dieser Anzeichen der Immunsuppression in vivo hatte. Folglich scheint es, daß 5A8 keine ungünstigen Wirkungen auf das Immunsystem in vivo aufweist.

1. Injektions- und Probenentnahme-Protokolle

Zwei erwachsenen Rhesusaffen (Mn 261-85 und Mn 251-87) wurden 3 mg/kg 5A8, wie vorstehend beschrieben gereinigt, oder der Kontrollantikörper MOPC 21 (Mn 265-85 und Mn 265-87) (4 Affen insgesamt) an den Tagen 0, 2 und 4 intravenös infundiert. An den Tagen 3 und 21 wurden 0,5 ml an Alaun adsorbiertes Tetanus-Toxoid (Squibb-Connaught) (Standarddosis für den Menschen) intramuskulär verabreicht. Vor der ersten 5A8-Injektion und an den Tagen 0 bis 4, 6, 9, 14, 21 oder 24, 28, 35 und 42 wurde jedem Affen Blut entnommen und analysiert, wie nachstehend beschrieben.

2. Zahl der peripheren Leukocyten

Die hier genannten Anmelder untersuchten Blutproben aus beiden Affengruppen (5A8-injiziert und MOPC 21-injiziert) auf ihre Leukocytenzahl unter Anwendung der Standardfärbung von Blutausstrichen. Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt.
Wie in Figur 7 gezeigt, gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen der 5A8- injizierten Gruppe und den Kontrollgruppen in bezug auf ihre Leukocytenzahl vor und nach der Injektion der monoclonalen Antikörper.

3. Zahl der zirkulierenden CD4±-Zellen und Modulation von Zelloberflächen-CD4

Die hier genannten Anmelder untersuchten Blutproben aus beiden Affengruppen (5A8-injiziert und MOPC 21-injiziert) auf ihre CD4&spplus;-Zellzahl. Die CD4&spplus;-Zellzahl wurde mittels FACS-Analyse sowohl nach direkter Färbung mit FITC-OKT4 als auch nach indirekter Färbung mit 5A8 bestimmt (d.h. in vitro-Ihkubation mit einem Überschuß an 5A8, gefolgt von FITC-Ziege-anti-Maus-Ig). Die verwendeten Protokolle entsprachen den vorstehend beschriebenen FACS-Protokollen. Die Ergebnisse dieser Experimente werden in Figur 8 veranschaulicht.
Wie in Figur 8 gezeigt, veränderte sich die Zahl der zirkulierenden CD4&spplus;-Zellen in den Tieren, denen 5A8 injiziert wurde, und in den Kontrolltieren nicht signifikant nach der Injektion der Antikörper. Außerdem unterschied sich die Intensität der Färbung für CD4 nicht signifikant zwischen den Affen, denen 5A8 iniziert wurde, und den Kontrollaffen. Alle anderen Blutzellparameter, einschließlich CD2-, CDB- und CD20-Färbung, waren zwischen Tieren, denen 5A8 injiziert wurde, und Kontrolltieren ähnlich (Daten nicht aufgeführt).
Diese Ergebnisse beweisen, daß 5A8 nicht signifikant die Zahl der CD4&spplus;-Zellen verringert und nicht signifikant CD4 auf der Oberfläche der zirkulierenden CD4&spplus;-Zellen moduliert.

4. Bindung von 5A8 an Rhesusaffen-CD4±-Zellen in vivo

Die Sättigung der CD4-Bindungsstellen auf den peripheren Affen-CD4&spplus;-T-Zellen wurde bestimmt durch (1) FAC S-Analyse nach Färbung mit FITC-Ziege-anti-Maus-Ig; (2) FACS-Analyse nach Zugabe von zusätzlichem 5A8 plus FITC-Ziege-anti-Maus-Ig (keine Erhöhung der Färbungsintensität); und (3) die Unlähigkeit von aus Affen, denen 5A8 injiziert wurde, gewonnenen Zellen in meßbaren Mengen an FITC-5A8 zu binden.
Die Sättigung der CD4-Bindungsstellen auf allen zirkulierenden CD4&spplus;-Zellen der Rhesusaffen, denen 5A8 injiziert wurde, wurde am Tag 1 und ständig für mindestens 9 Tage beobachtet. Ergänzend hierzu zeigte eine Lymphknotenbiopsie eines Affens, dem 5A8 injiziert wurde, am Tag 4 eine vollständige Durchdringung und Bedeckung mit 5A8 von CD4&spplus;-Lymphknotenzellen. Bei den Kontrollaffen wurde keine Bedeckung der CD4&spplus;-Zellen beobachtet. Die CD4&spplus;-Zellbedeckung mit 5A8, bestimmt durch indirekte Färbung mit FITC- Ziege-anti-Maus-Ig, konnte nach dem Tag 14 nicht mehr nachgewiesen werden.

5. 5A8- und Anti-5A8-Serummengen

Unter Verwendung eines anti-Maus-Ig-Sandwich-ELISA wurde festgestellt, daß die 5A8-Mengen bis zum Tag 9 hoch waren (etwa 10-100 µg/ml), jedoch zwischen den Tagen 9 und 14 stark abfielen. Umgekehrt traten zwischen den Tagen 9 und 14 Affen-anti- Maus-Ig-Titer auf (nachgewiesen mit ELISA auf mit 5A8 beschichteten Platten). Es ist nicht klar, ob nach dem Tag 9 angelagerter SAS vorlag, da das anti-Maus-Abfang-Ig (anti-mouse Ig trap) ihn vielleicht nicht nachweisen konnte.

6. Antikörperantwort auf das Tetanus-Toxoid

Die hier genannten Anmelder wiesen die mögliche Wirkung von 5A8 auf die Fähigkeit von Affen nach, nach der Infüsion eines fremden Antigens -Tetanus-Toxoid- Antikörper zu erzeugen. Sie immunisierten die Tiere, denen 5A8 injiziert wurde, und die Kontrolltiere mit an Alaun adsorbiertes Tetanus-Toxoid (i.m.) am Tag 3, nachdem eine vollständige Bedeckung von CD4&spplus;-Zellen in den Tieren, denen 5A8 injiziert wurde, erzielt worden war, und am Tag 21. Die mit der Zeit in den Affen ausgelösten Anti-Tetanus-Toxoid- Titer werden in Figur 9 gezeigt.
Wie in Figur 9 gezeigt, beobachteten die Anmelder in allen Affen anti-Tetanus- Toxoid-Serum-Antikörperantworten mit vergleichbaren Kinetiken und Titem. Die anti- Tetanus-Toxoid-Titer wurden mittels eines ELISA unter Verwendung von Tetanus-Toxoidbeschichteten Platten bestimmt, gefolgt vom Nachweis mit einem Enzym-gebundenen Ziegeanti-Mensch/Affe-lgm+G. Folglich beeinflußt 5A8 nicht die B-ZeH- und Helfer-T-Zell- Funktion.

Den variablen Bereich der 5A8-schweren Kette codierende DNA

Von der murinenhybridomzellinie 5A8 (ATCC-Hinterlegungsnummer HB 10881) wurde genomische DNA im wesentlichen so hergestellt, wie bei Sambrook J. et al., Molecular Cloning, Kapitel 9 (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) beschrieben. Aus dieser genomischen DNA-Bank wurde eine den variablen Bereich der 5A8-schweren Kette (5A8-VH) codierende DNA isoliert, wie nachstehend beschrieben.
Die den variablen Bereich der 5A8-schweren Kette codierende DNA wurde von der genomischen DNA durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung von VH01 (SEQ ID NO:5) und VH02 (SEQ ID NO:6) als Primer amplifiziert. Diese Primer sind identisch mit den VH1BACK- bzw. VH 1 FOR-Primem, die beschrieben werden bei Orlandi et al., "Cloning Immunoglobulin Variable Domains For Expression By The Polymerase Cham Reaction", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 3833-3837, außer daß dem VH02- Primer die zwei 3'-Nucleotide von VH1FOR fehlen.
VH01 und VH02 (je 400 pMol) wurden getrocknet und dann in 50 µl 1x Kinase- Puffer (10x Kinase-Puffer entspricht 0,66 M Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM ATP, 10 mM Spermidin, 100 mM MgCl&sub2;, 150 mM Dithiothreit und 2 mg/ml Gelatine) resuspendiert. T4- Polynucleotid-Kinase (1 µl) (New England Biolabs, 10 E/µl) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei 37ºC 30 Minuten und anschließend bei 70ºC 5 Minuten inkubiert.
Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt 50 pmol eines jeden mit Kinase behandelten Primers (VH01 und VH02), 1 µl genomische 5A8-DNA und 1,25 mM eines jeden dXTPs in 1x PCR-Puffer (10x PCR-Puffer entspricht 100 mM Tris-HCl, pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl&sub2; und 0,01% Gelatine). Taq-Polymerase (0,5 µl) (Perkin Elmer-Cetus, 5 E/µl) wurde während der Inkubation bei 72ºC des ersten Inkubationszyklus zugegeben. Die PCR-Reaktionsbedingungen waren: 30 Inkubationszyklen bei 94ºC für 2 Minuten, 65ºC für 2 Minuten und 72ºC für 2 Minuten.
Die PCR-Reaktionsprodukte wurden in einem 1 %igen Agarosegel durch Standardverfahren fraktioniert, und die der erwarteten Größe des variablen Bereichs des Immunglobulins (330 bp) entsprechende Bande wurde ausgeschnitten. Die DNA in dieser Bande wurde mittels der GENECLEAN II -Technik (Biolol Inc., Lalolla, CA) eluiert, mit Ethanol ausgefällt und anschließend in 10 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na&sub2;EDTA) resuspendiert.
Das gereinigte PCR-Fragment wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I (1 µl) (New England Biolabs, 5 E/µl) und mit 0,125 mM eines jeden dXTPs in 1x Ligierungspuffer (10x Ligierungspuffer entspricht 0,5 M Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM Dithiothreit und 500 µl/ml Gelatine) in einem Reaktionsendvolumen von 15 µl inkubiert. Die Umsetzung wurde durch eine 5-minütige Inkubation bei 60ºC beendet.
Anschließend wurde das PCR-Fragment in den Vektor pNN03 ligiert. Der Vektor pNN03 wurde konstruiert, indem die synthetische Polylinkersequenz von pUC8 (Pharmacia Piscataway, NJ) durch Endonudeasespaltung entfernt und durch einen neuen synthetischen Linker (SEQ ID NO:57) ersetzt wurde. Die DNA-Sequenz von pNN03 ist angegeben als SEQ ID NO:7. Der Vektor pNN03 wurde für die Ligierung durch das Linearisieren mit EcoRV, Dephosphorylieren der 5'-Enden mit alkalischer Phosphatase aus dem Kalb, Fraktionieren in einem niedrigschmelzenden Agarosegel und das Ausschneiden der dem linearisierten pNN03-Vektor entsprechenden Bande (2,7 kb) hergestellt. Der linearisierte dephosphorylierte pNN03-Vektor wurde dann mit dem Klenow-behandelten PCR-5A8-VH-Fragment unter Verwendung der T4-DNA-Ligase ligiert.
Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli JA221-Zellen (ATCC 33875) verwendet, wodurch diese ampicillinresistent wurden. Kolonien wurden gezüchtet und es wurde Mini-Präp-DNA hergestellt. Die rekombinanten Plasmide wurden auf die Gegenwart einer etwa 450 bp großen SacII-Insertion durchmustert. Zusätzlich wurde die von dem PCR-Fragment codierte Aminosäuresequenz mit der experimentell bestimmten aminoterminalen Aminosäuresequenz der 5A8-schweren Kette verglichen. Durch diese Verfahren wurde bestätigt, daß die Insertion von Vektor pMDR904 eine DNA-Sequenz enthält, die AA&sub2;-AA&sub1;&sub2;&sub2; des variablen Bereichs der 5A8-schweren Kette codiert. E. coli-Zellen, die den Vektor pMDRgO4 enthielten, wurden unter der Hinterlegungsnummer ATCC 68848 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt.
Die SEQ ID NO:8 gibt die DNA-Sequenz der pMDR904-Insertion an. Die Nucleotide 3 bis 365 der SEQ ID NO:8 codieren AA&sub2;-AA&sub1;&sub2;&sub2; der 5A8-VH-Sequenz. Der Vektor pMDR904 enthält nicht das Codon für AA&sub1; von 5A8-VH. Dieses Codon wird unter Verwendung eines Oligonucleotids "wieder aufgebaut", wenn ein 5A8-VH-Expressionsvektor hergestellt wird.
Obwohl der Vektor pMDR904 kein Codon für AA&sub1; von 5A8-VH besitzt kennen die hier genannten Anmelder die Identität dieser Aminosäure aus Aminosäuresequenzergeb nissen. Die vollständige Aminosäuresequenz von 5A8-VH (AA&sub1;-AA&sub1;&sub2;&sub2;) ist angegeben als SEQ ID NO: 10. Eine die 5A8-VH-Aminosäuresequenz codierende DNA-Sequenz (im Hinblick auf AA&sub1; hypothetisch) ist als SEQ ID NO:9 angegeben.
Durch den Vergleich mit bekannten Sequenzen der komplementaritätsbestimmenden Bereiche (complementarity determining region, CDR) und Rahmenbereiche (framework (FR) sequences) identifizierten die hier genannten Anmelder die folgenden als die CDRs der 5A8-schweren Kette: CDR1 ist AA&sub3;&sub1;-AA&sub3;&sub5;, CDR2 ist AA&sub5;&sub0;-AA&sub6;&sub6;, CDR3 ist AA&sub9;&sub9;- AA&sub1;&sub1;&sub1; alle in bezug auf SEQ ID NO:10.

Den variablen Bereich der 5A8-leichten Kette codierende DNA

Von der murinen Hybridomzellinie 5A8 (ATCC-Hinterlegungsnummer HB 1088) wurde die gesamte RNA gemäß einem herkömmlichen Guanidiniumisothiocyanat-Protokoll hergestellt. Von der gesamten RNA wurde unter Verwendung einer Oligo-(d(T)-Säule (Clontech) Poly(A)&spplus;-RNA hergestellt, ebenfalls gemäß herkömmlicher Verfahren.
Von der Poly(A)&spplus;-RNA wurde wie folgt cDNA hergestellt. Die Oligonucleotide ACE149 (SEQ ID NO:11) und ACE150 (SEQ ID NO:12) (jeweils 200 pMol) wurden getrennt mit 1 µl T4-Polynucleotid-Kinase (New England Biolabs, 10 E/µl) in 100 µl 1x Kinase-Puffer inkubiert. Die 5A8-Poly(A)&spplus;-RNA wurde getrocknet und dann 10 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Gemisch aus 5 µl eines jeden mit Kinase behandelten Oligonucleotids, 2 µl 25 mM Methylquecksilberhydroxid und 10 µl Wasser inkubiert. Nach dieser 10-minütigen Inkubation wurden 2 µl 50 mM Dithiothreit zugegeben) und das Gemisch wurde weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die folgenden Bestandteile zugegeben: 10 µl M-MLV-reverse Transkriptase (BRL 80255B, 200 E/µl), 20 µl 2,5 mM DXTPs, 26 µl Wasser und 20 µl 5x reverse Transkriptase-Puffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,3, 375 mM KCl, 50 mM Dithiothreit, 15 mM MgCl&sub2;). Nach der Inkubation bei 37ºC 1 Stunde wurde die reverse Transkriptase-Reaktion durch Einfrieren beendet.
Die den variablen Bereich der 5A8-leichten Keife codierende DNA wurde von der 5A8-cDNA durch PCR unter Verwendung von ACE149 (SEQ ID NO:11) und ACE150 (SEQ ID NO: 12) als Primer amplifiziert. Das PCR-Reaktionsgemisch enthielt 50 pmol eines jeden mit Kinase behandelten Primers, 5 µl 5A8-cDNA, 8 µl 2,5 mM DXTPS, 0,5 µl Taq-Polymerase (5 E/µl) und 10 µl 10x PCR-Puffer. Die PCR-Reaktionsbedingungen waren die folgenden: 30 Inkubationszyklen bei 94ºC für 1 Minute, 37ºC für 1 Minute und 72ºC für 2 Minuten.
Nach Ablauf der PCR wurde das Reaktionsgemisch einmal mit Ether und einmal mit mit TE-Puffer gesättigtem Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert und anschließend mit Ethanol ausgefällt. Das Ethanol-Präzipitat wurde in 100 µl Puffer mit 0,5 mM dXTPs, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM Na&sub2;EDTA, 100 µl/ml Gelatine und 10 mM Dithiothreit resuspendiert. Das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I (1 µl, 5 E/µl) wurde zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde in einem 2%igen Agarosegel gemäß Standardverfahren fraktioniert, und die der erwarteten Größe des variablen Bereichs des Immunglobulins entsprechende Bande (350 bp) wurde ausgeschnitten. Die DNA in dieser Bande wurde mittels der GENE-CLEAN II -Technik eluiert.
Anschließend wurde das PCR-Fragment in den Vektor pUC19 (New England Biolabs) ligiert. Der Vektor PUC 19 wurde für die Ligierung durch das Linearisieren mit 5mal, Dephosphorylieren der 5'-Enden mit alkalischer Phosphatase aus dem Kalb, Fraktionieren in einem niedrigschmelzenden Agarosegel und Ausschneiden der dem linearisierten pUC19-Vektor entsprechenden Bande (2,7 kb) hergestellt. Der linearisierte dephosphorylierte pUC19-Vektor wurde dann mit dem Klenow-behandelten PCR-5A8-VL-Fragment unter Verwendung der T4-DNA-Ligase ligiert.
Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli JA22 1-Zellen verwendet, wodurch dieseampicillinresistent wurden. Kolonien wurden gezüchtet und Mmi- Präp-DNA wurde hergestellt. Die rekombinanten Plasmide wurden auf die Gegenwart eines etwa 400 bp großen EcoRI/HindIII-Fragments durchmustert. Ergänzend hierzu wurde die durch das PCR-Fragment codierte Aminosäuresequenz mit der experimentell bestimmten aminoterminalen Aminosäuresequenz der 5A8-leichten Kette verglichen. Mit diesen Verfahren wurde bestätigt daß die Insertion von Vektor pMDR927 eine DNA-Sequenz enthält, die AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub1; des variablen Bereichs der 5A8-leichten Kette codiert. Die E. coli-Zellen, die den pMDRg27-Vektor enthielten wurden unter der Hinterlegungsnummer ATCC 68849 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt.
Die SEQ ID NO: 13 gibt die DNA-Sequenz der pMDRg2 7-Insertion an. Die Nucleotide 4 bis 336 von SEQ ID NO:13 codieren AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub1; der 5A8-VL-Sequenz. Der Vektor pMDRg27 enthält nicht das Codon für AA&sub1;&sub1;&sub2; von 5A8-VL. Dieses Codon wird unter Verwendung eines Oligonucleotids "wieder aufgebaut". wenn ein 5A8-VL-Expressionsvektor hergestellt wird.
Obwohl pMDRg27 nicht das Codon für AA&sub1;&sub1;&sub2; von 5A8-VL enthält, kennen die hier genannten Anmelder die Identität dieser Aminosäure aus Aminosäuresequenzergebnissen. Die vollständige Aminosäuresequenz von 5A8-VL ist angegeben als SEQ ID NO: 15. Eine die 5A8-VL-Aminosäuresequenz codierende DNA-Sequenz (im Hinblick auf AA&sub1;&sub1;&sub2; hypothetisch) ist als SEQ ID NO:14 angegeben.
Durch den Vergleich mit bekannten CDR- und FR-Sequenzen identifizierten die hier genannten Annielder die folgenden als CDRS der 5A8-leichten Kette: CDRI ist AA&sub2;&sub4;- AA&sub4;&sub0;, CDR2 ist AA&sub5;&sub6;-AA&sub6;&sub2;, CDR3 ist AA&sub9;&sub5;-AA&sub1;&sub0;&sub2;, alle in bezug auf SEQ ID NO:15.

Humanisierte 5A8-schwere und -leichte Ketten

Die Aminosäuresequenzen der 5A8-VH- und -VL-Bereiche wurden mit den bekannten menschlichen Immunglobulinsequenzen verglichen, um die menschlichen Rahmenbereichs-Sequenzen zu finden, die mit den murinen 5A8- Rahmenbereichs-Sequenzen besonders gut übereinstimmen. Die humanisierten Versionen der variablen Bereiche der 5A8- schweren und -leichten Ketten wurden dann durch das Einbauen der CDRS der 5A8-VH- und -VL-Bereiche in die menschlichen Rahmenbereiche konstruiert. Diese humanisierten variablen Bereiche wurden dann mit DNA ligiert, die die schwere Kette von menschlichem IgG&sub4; bzw. die konstanten Bereiche der leichten Kette vom Kappa-Typ codiert, und in eukaryontische Expressionsvektoren insertiert.

1. Humanisierter variabler Bereich der 5A8-schweren Kette

Der variable Bereich der 5A8-schweren Kette wurde durch PCR-Mutagenese humanisiert. Drei PCR-Reaktionszyklen wurden unter Verwendung von drei verschiedenen Paaren von Oligonucleotid-PCR-Primern ausgeführt: (a) Primer 312-56 (SEQ ID NO:16) und 312-57 (SEQ ID NO:17); (b) Primer 312-58 (SEQ ID NO:18) und 312-59 (SEQ ID NO:19); und (c) 312-60 (SEQ ID NO:20) und 312-61 (SEQ ID NO:21). Jedes PCR-Reaktionsgemisch enthielt 30 pmol eines jeden der entsprechenden Primer, 1 µl pMDR904 (Insertionssequenz ist SEQ ID NO:8), 16 µl 1,25 mM dXTPs, 0,5 µl Taq-Polymerase (5 E/µl) und 10 µl 10x PCR-Puffer. Die Inkubationsbedingungen für die PCR-Reaktion waren 10 Inkubationszyklen für 3 Minuten bei 94ºC, 2 Minuten bei 45ºC und 2 Minuten bei 72ºC. Die PCR-Produkte wurden in einem 2%igen Agarosegel fraktioniert, und die einer Größe von etwa 160 bp, 175 bp und 165 bp entsprechenden Banden wurden ausgeschnitten. Die drei PCR-Fragmente wurden getrennt mit GENECLEAR II in Aliquote von 100 µl TE-Puffer eluiert.
Die drei eluierten PCR-Fragmente (Neweils 10 µl) wurden vereinigt und einem zweiten PCR-Zyklus unter Verwendung der Oligonucleotidprimer 312-56 (SEQ ID NO: 16) und 312-61 (SBQ ID NO:21) fur 20 Inkubationszyklen für 3 Minuten bei 94ºC, 2 Minuten bei 72ºC und 2 Minuten bei 72ºC bei den gleichen wie im ersten PCR-Zyklus angewendeten Reaktionsbedingungen unterzogen. Die PCR-Produkte wurden in einem 2%igen Agarosegel fräktioniert, und die einer Größe von etwa 365 bp entsprechende Bande wurde ausgeschnitten. Das PCR-Fragment wurde mit GENECLEAR II eluiert und das Eluat wurde mit Ethanol ausgefällt. Das Ethanol-Präzipitat wurde in 20 µl TE-Puffer resuspendiert und mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1 behandelt, wie vorstehend beschrieben.
Anschließend wurde das PCR-Fragment in den Vektor pNN03 (SEQ ID NO:7) ligiert. Der Vektor pNN03 wurde für die Ligierung durch das Linearisieren mit EcoRV, Dephosphorylieren der 5'-Enden mit alkalischer Phosphatase aus dem Kalb, Fraktionieren in einem niedrigschmelzenden Agarosegel und Ausschneiden der dem linearisierten pNN03- Vektor entsprechenden Bande (2,7 kb) hergestellt. Der linearisierte dephosphorylierte pNN03-Vektor wurde dann mit dem Klenow-behandelten, humanisierten PCR-5A8-VH-Fragment unter Verwendung der T4-DNA-Ligase ligiert.
Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli JA221 (Iq)-Zellen verwendet, wodurch diese ampicillinresistent wurden. Die E. coli JA221 (Iq)-Zellen wurden unter der Hinterlegungsnummer ATCC 68845 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt. Kolonien wurden gezüchtet und Mini-Präp-DNA wurde hergestellt. Die rekombinanten Plasmide wurden auf die Gegenwart eines etwa 400 bp großen SacII-Fragments durchmustert. Die DNA-Sequenzanalyse zeigte, daß kein Plasmid die richtige Sequenz aufwies, jedoch wies ein Plasmid, pMDR989-15 (Insertionssequenz ist SEQ ID NO:22), etwa 50% der zur Umwandlung der murinen 5A8-VH-Sequenz in die konstruierte humanisierte Sequenz erforderlichen Mutationen auf. Deshalb wurde das Plasmid pMDR989-15 zwei Runden eines zweiten PCR-Zyklus unterzogen, wie er unmittelbar vorstehend beschrieben wurde. Danach wurde durch DNA-Sequenzanalyse festgestellt, daß die Insertion von Vektor pMDR991 die konstruierte humanisierte 5A8-VH-Sequenz aufwies.
SEQ ID NO:23 gibt die DNA-Sequenz der pMDR991-Insertion an. Die Nucleotide 1 bis 357 von SEQ ID NO:23 codieren AA&sub2;-AA&sub1;&sub2;&sub0; der humanisierten 5A8-VH-Sequenz. Der Vektor pMDR991 enthält nicht die Codons für AA&sub1; und AA&sub1;&sub2;&sub1;-AA&sub1;&sub2;&sub2; der humanisierten 5A8-VH-Sequenz. Wie nachstehend beschrieben, wurden diese Codons unter Verwendung von Oligonucleotiden bei der Herstellung des humanisierten eukaryontischen 5A8-VH-Expressionsvektors "wieder aufgebaut".

2. Humanisierter variabler Bereich der 5A8-leichten Kette

Der humanisierte variable Bereich der 5A8-leichten Kette wurde durch das Ligieren von 10 Oligonucleotiden, die zusammen den gesamten humanisierten 5A8-VL-Bereich umfassen, und das Durchinustem auf Konstrukte mit der richtigen Sequenz hergestellt. Das Protokoll wird nachstehend ausführlicher beschrieben.
Die Oligonucleotide 312-62 bis 312-71 (SEQ ID NO:24 bis SEQ ID NO:33) (je 20 pmol) wurden getrocknet und getrennt in 20 µl 1x Kinase-Puffer resuspendiert, der 1 mM ATP und 1 µl T4-Polynucleotid-Kinase (10 E/ul) enthielt. Das Kinase-Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Die Umsetzung wurde durch 5-minütiges Inkubieren bei 70ºC beendet.
Die Kinase-behandelten Oligonucleotide (Neweils 0,4 µl) wurden miteinander und mit 25 µl 10 mM ATP und 2 µl T4-DNA-Ligase (10 Elul) vereinigt, und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 6 Stunden inkubiert. Das Ligierungsreaktionsgemisch wurde mit mit TE-Puffer gesättigtem Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert und dann mit Ethanol ausgefällt.
Das Ethanol-Präzipitat wurde in 50 µl 1x 150 mM Restriktionsenzym-Puffer (10x 150 mM Restriktionsenzym-Puffer entspricht 100 mM Tris-HCl, pH 8,0 1,5 M NaCl, 100 mM MgCl&sub2;, 1 mg/ml Gelatine, 10 mM Dithiothreit) resuspendiert und mit den Restriktionsenzymen BGlII und Asp7 18 16 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Spaltprodukte wurden einer Elektrophorese in einem 2%igen Agarosegel unterzogen, und die einer Größe von 330 bp entsprechende Bande wurde ausgeschnitten. Das Fragment wurde mit GENECLEAR II eluiert und das Eluat wurde mit Ethanol ausgefällt. Das Ethanol-Präzipitat wurde in 20 µl TE-Puffer resuspendiert.
Anschließend wurde das 330 bp große Fragment in den Vektor pNN03 (SEQ ID NO:7) ligiert. Der Vektor pNN03 wurde für die Ligierung durch das Linearisieren mit Asp718 und BGlII. Dephosphorylieren der 5'-Enden mit alkalischer Phosphatase aus dem Kalb, Fraktionieren in einem niedrigschmelzenden Agarosegel und Ausschneiden der dem linearisierten pNN03-Vektor entsprechenden Bande (2,7 kb) hergestellt. Der linearisierte dephosphorylierte pNN03-Vektor wurde dann mit dem 330 bp großen Oligonucleotidfragment, das den humanisierten VL-Bereich codiert, unter Verwendung der T4-DNA-Ligase ligiert.
Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli JA221 (Iq)-Zellen verwendet, wodurch diese amplicillinresistent wurden. Kolonien wurden gezüchtet und Mini- Präp-DNA wurde hergestellt. Die rekombinanten Plasmide wurden auf die Gegenwart eines etwa 400 bp großen SacII-Fragments durchmustert. Die DNA-Sequenzanalyse zeigte, daß der Vektor pMDR1003 die konstruierte humanisierte Sequenz für den variablen Bereich der 5A8- leichten Kette vom Kappa-Typ aufweist.
SEQ ID NO:34 gibt die DNA-Sequenz der pMDR1003-Insertion an. Die Nucleotide 11 bis 343 von SEQ ID NO:34 codieren AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub1; der humanisierten 5A8-VL-Sequenz. Der Vektor pMDR1003 enthält nicht das Codon für AA&sub1;&sub1;&sub2; der humanisierten 5A8-VL-Sequenz. Wie nachstehend beschrieben, wurde dieses Codon unter Verwendung eines Oligonucleotids bei der Herstellung des humanisierten eukaryontischen 5A8-VL-Expressionsvektors "wieder aufgebaut".

3. Expressionsvektor mit der humanisierten 5A8-schweren Kette

Ein die humanisierte 5A8-schwere Kette tragender eukaryontischer Expressionsvektor (pMDR1002) wurde durch das Ligieren der Plasmid-Zwischenprodukte pMDR1001, pBAG101 und pSAB132 konstruiert, wie nachstehend beschrieben.

A. Plasmid-Zwischenprodukt pMDR1001

Das Plasmid-Zwischenprodukt pMDR1001 wurde so konstruiert, daß es die die Signalsequenz der schweren Kette des menschlichen HG3-Immunglobulins codierende DNA (vgl. Kabat, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 460 (4. Auflage)) AA&sub1;-AA&sub1;&sub2;&sub2; des humanisierten variablen Bereichs der 5A8-schweren Kette, gefolgt von einer RNA- 5'-Spleißstelle, trägt. Das Plasmid pMDR1001 wurde aus pLCB7 und pMDR991 konstruiert. Das Plasmid pLCB7 wiederum wurde aus pLCB6 und pMDR904 konstruiert.
Das Plasmid pLCB6 wurde so konstruiert, daß es die die Signalsequenz der schweren Kette von menschlichem Immunglobulin codierende DNA, eine RNA-5'-Spleißstelle und Restriktionsstellen für PstI und BstEII trägt. Zur Herstellung von pLCB6 wurden die Oligonucleotide 312-45 (SEQ ID NO:35) und 312-50 (SEQ ID NO:36) sowie 312-46 bis 312-49 (SEQ ID NO:58 bis SEQ ID NO:61) mit Polynucleotid-Kinase behandelt und miteinander ligiert, wie vorstehend beschrieben. Anschließend wurde das ligierte Oligonucleotid selbst in ein 2701 bp großes Asp718/BamHI-Fragment von Plasmid pNN03 ligiert, wobei pLCB6 erhalten wurde. Die DNA-Sequenz der pLCB6-Insertion ist SEQ ID NO:37.
Das Plasmid pLCB6 wurde mit Psti und BstEII gespalten, und ein 2820 bp großes Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde mit dem 346 bp großen PstI/BstEII-Fragment von pMDR904 ligiert. Das Plasmid pLCB7 wurde durch die Gegenwart eines 397 bp großen StyIRestriktionsfragments identifiziert. Die DNA-Sequenz der pLCB7-Insertion ist SEQ ID NO:38.
Die Plasmide pLCB7 und pMDR991 wurden einzeln mit PstI und BstEII gespalten, und nach getrennter Fraktionierung in niedrigschmelzender Agarose wurden 2820 bp große (Vektor) bzw. 337 bp große (Insertion) Fragmente isoliert. Diese Fragmente wurden dann miteinander ligiert. Das Plasmid pMDR1001 wurde durch das Vorhandensein eines diagnostischen HaeII-Restriktionsmusters identifiziert (1871 bp, 523 bp, 393 bp und 370 bp). Die DNA-Sequenz der pMDR1001-Insertion ist SEQ ID NO:39.
Das Plasmid pMDR1001 wurde mit Noti und HindIII gespalten, und das die Plasmid-Insertion enthaltende 443 bp große Fragment wurde durch Fraktionierung in niedrigschmelzender Agarose isoliert.

B. Plasmid-Zwischenprodukt pSAB132

Das Plasmid-Zwischenprodukt pSAB132 wurde als eukaryontischer Allzweck-Expressionsshuttlevektor konstruiert. Es trägt den sehr frühen (immediate early) Promotor und Enhancer des menschlichen Cytomegalievirus. Die Konstruktion von pSAB132 wird auf den Seiten 55-56 der gemeinsam übertragenen US-Patentanmeldung 07/770,967 beschrieben. Die vollständige Sequenz von pSAB132 ist als SEQ ID NO:40 angegeben.
Der Vektor pSAB132 wurde mit Noti linearisiert. Der 7913 bp große linearisierte Vektor wurde dann dephosphoryliert und durch Fraktionierung in niedrigschmelzender Agarose isoliert.

C. Plasmid-Zwischenprodukt pBAG101

Das Plasmid-Zwischenprodukt pBAG 101 wurde so konstruiert, daß es genomische DNA trägt, die den konstanten Bereich der schweren Kette von menschlichem IgG&sub4; codiert. Genomische DNA wurde aus menschlicher Plazenta im wesentlichen so hergestellt, wie bei Sambrook J. et al. in Molecular Cloning, Kapitel 9 (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) beschrieben wird. Den IgG&sub4;-konstanten Bereich codierende DNA wurde, wie vorstehend beschrieben, von der genomischen DNA durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide 370-38 (SEQ ID NO:41) und 370-40 (SEQ ID NO:42) als Primer amplifiziert.
Das etwa 2109 bp großes PCR-Fragment wurde durch Gelelektrophorese isoliert und in den mit EcoRV linearisierten Vektor pNN03 ligiert. Das Plasmid pBAG101 wurde durch die Gegenwart der 3887 bp und 3896 bp großen BGLII-Restriktionsfragmente identifiziert. Die DNA-Sequenz der pBAG101-Insertion ist SEQ ID NO:43. Die den konstanten Bereich der schweren Kette von menschlichem IgG&sub4; codierende DNA-Sequenz in der pBAG101-Insertion wurde aus der entsprechenden Sequenz mit Genbank-Hinterlegungsnummer K01316-PR:HUMIGCD2 erhalten.
Das Plasmid pBAG101 wurde mit NotI und HindIII gespalten, und das die Plasmid-Insertion enthaltende 2109 bp große Fragment wurde durch Fraktionierung in niedrigschmelzender Agarose isoliert.

D. Abschließende Konstruktion des Vektors pMDR1002

Zur Erzeugung des Vektors pMDR1002 wurden drei Fragmente miteinander ligiert:
(a) das 443 bp große NotI/HindIII-Fragment von pMDR1001; (b) das 7913 bp große mit NotI linearisierte pSAB132-Plasmid; und (c) das 2109 bp große NotI/HindIII-Fragment von pBAG101. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli JA221(Iq)-Zellen verwendet, wodurch diese ampicillinresistent wurden. Kolonien wurden gezüchtet und Mini- Präp-DNA wurde hergestellt. Die rekombinanten Plasmide wurden auf die Gegenwart von etwa 1276 bp und 9160 bp großen EcoRI-Fragmenten durchmustert, die pMDR 1002 auswiesen.
Die DNA-Sequenz der pMDR1002-Insertion ist angegeben als SEQ ID NO:44. Die von dieser DNA-Sequenz codierte Aminosäuresequenz ist dargelegt als SEQ ID NO:45. Die pMDR1002-Insertion umfaßt DNA, codierend, in 5'-3'-Richtung, (1) die Immunglobulin- Signalsequenz Nucleotide 12-68 von SBQ ID NO:44, entsprechend AA&submin;&sub1;&sub9;-AA&submin;&sub1; von SEQ ID NO:45); (2) AA&sub1;-AA&sub1;&sub2;&sub2; der konstruierten humanisierten Sequenz für den variablen Bereich der 5A8-schweren Kette (Nucleotide 69-434 von SEQ ID NO:44, entsprechend AA&sub1;-AA&sub1;&sub2;&sub2; von SEQ ID NO:45), gefolgt von genomischer DNA (Nucleotide 27 bis 2525 der Genbank- Hinterlegungsnunnner K01316), codierend AA&sub1;&sub1;&sub4;-AA&sub4;&sub7;&sub8; (Kabat-Numerierung) der schweren Kette von menschlichem IgG&sub4; (d.h. den konstanten Bereich der schweren Kette) Nucleotide 712-1005, 1396-1431, 1550-1879 und 1977-2296 von SEQ ID NO:44, entsprechend AA&sub1;&sub2;&sub3;- AA&sub4;&sub4;&sub8; von SEQ ID NO:45).
E. coli-Zellen, die den pMDR1002-Vektor enthielten, wurden unter der Hinterlegungsnummer ATCC 68847 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt.

4. Expressionsvektor mit der humanisierten 5A8-leichten Kette

Ein die humanisierte 5A8-leichte Kette tragender eukaryontischer Expressionsvektor pMDR1007) wurde durch das Ligieren der Plasmid-Zwischenprodukte pMDR1006 und pSAB132 konstruiert. Das Plasmid pMDR1006 wurde wiederum durch die Ligierung der Plasmid-Zwischenprodukte pMDR98S, pMDR986 und pMDR1003 konstruiert. Die spezifische Konstruktionsstrategie wird nachstehend diskutiert.

A. Plasmid-Zwischenprodukt pMDR985

Das Plasmid-Zwischenprodukt pMDR985 wurde so konstruiert, daß es DNA trägt, die eine prototypische menschliche Signalsequenz der leichten Kette des Immungobulins vom Kappa-Typ codiert.
Zur Herstellung des Plasmids pMDR985 wurden die Oligonucleotide 360-81 (SEQ ID NO:46) und 360-82 (SEQ ID NO:47) mit Polynucleotid-Kinase behandelt und miteinander ligiert, wie vorstehend beschrieben. Anschließend wurde das ligierte Oligonucleotid selbst in ein 2707 bp großes HinDIII/EcoRV-Fragment von Plasmid pNN03 ligiert, das mit alkalischer Phosphatase aus dem Kalb dephosphoryliert worden war. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli JA221 (Iq)-Zellen verwendet, wodurch diese ampicillinresistent wurden. Kolonien wurden gezüchtet und Mini-Präp-DNA wurde hergestellt. Die rekombinanten Plasmide wurden auf die Gegenwart der etwa 461 bp und 2321 bp großen EcoO109 1-Fragmente durchmustert, die pMDR985 auswiesen.
Die DNA-Sequenz der pMDR985-Insertion ist angegeben als SEQ ID NO:48. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte, daß pMDR985 die richtigen Codons für die Signalsequenz aufweist Nucleotide 9 bis 77 von SEQ ID NO:48); jedoch wurde wegen eines Clonierungsartefakts die konstruierte HindIII-Stelle (5' von der Insertion) in pMDR985 nicht wiederhergestellt.
Das Plasmid pMDR985 wurde mit Antil und EcoRV gespalten, und das die Plasmid-Insertion enthaltende 572 bp große Fragment wurde durch Fraktionierung in niedrigschmelzender Agarose isoliert.

B. Plasmid-Zwischenprodukt pMDR986

Das Plasmid-Zwischenprodukt pMDR986 wurde so konstruiert, daß es genomische DNA trägt, die AA&sub1;&sub0;&sub8;-AA&sub2;&sub1;&sub4; (Kabat-Numerierung) einer menschlichen leichten Kette vom Kappa-Typ codiert (d.h. den konstanten Bereich der leichten Kette).
Die genomische DNA wurde aus menschlicher Plazenta hergestellt [im wesentlichen wie bei Sambrook J. et al. in Molecular Cloning, Kapitel 9 (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989) beschrieben). Die genomische DNA wurde mit EcoRI gespalten, und ein 2,5 kb großes EcoRI-Fragment, umfassend den konstanten Bereich der Kappa-Kette (Genbank- Hinterlegungsnummer J00241-PR:HUMIGKC3), wurde in die EcoRI-Stelle von pUC8 doniert, wobei pAB8 erzeugt wurde.
Den konstanten Kappa-Bereich (AA&sub1;&sub0;&sub8;-AA&sub2;&sub1;&sub4;) codierende DNA wurde, wie vorstehend beschrieben, von pAB8 durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide 370-54 (SEQ ID NO:49) und 370-55 (SBQ ID NO:50) als Primer amplifiziert. Das etwa 1240 bp große PCR-Fragment wurde isoliert und in den mit EcoRV linearisierten Vektor pNN03 ligiert, der dephosphoryliert worden war. Das Plasmid pSAB153 wurde durch die Gegenwart eines 1314 bp großen XmnI-Restriktionsfragments identifiziert. Die DNA-Sequenz der pSAB153-Insertion ist SEQ ID NO:51.
Das Plasmid pMDR986 wurde aus pSAB153 wie folgt konstruiert. Der konstante Kappa-Bereich wurde von pSAB153 durch PCR unter Verwendung der Oligonucleotide 360-83 (SEQ ID NO:52) und 370-55 (SEQ ID NO:50) als Primer amplifiziert. Das etwa 1276 bp große PCR-Fragment wurde mittels GBNECLEAN II -Elution, gefolgt von einer Elektrophorese in Agarose, Ethanolfällung und das Resuspendieren in 20 µl TE-Puffer isoliert. Das gereinigte PCR-Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I behandelt und mit dem mit EcoRV linearisierten Vektor pNN03 ligiert, der mit alkalischer Phosphatase aus dem Kalb dephosphoryliert worden war.
Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli JA221(Iq)-Zellen verwendet. Die DNA wurde aus den Ampicillin-resistenten Kolonien hergestellt und mittels EcoO109 I-Restriktionsspaltung durchmustert. Das Plasmid pMDR986 wurde durch die Gegenwart eines 1122 bp großen EcoO109 I-Restriktionsfragments ausgewiesen. Das Plasmid pMDR986 wurde dann zur Transformation von E. coli GM2929-Zellen verwendet, die ihre DNA nicht methylieren (ein dam-13, dcm-6-Stamm).
Die DNA-Sequenz der pMDR986-Insertion ist SEQ ID NO:53. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte, daß pMDR986 die richtigen Exons enthält, um AA&sub1;&sub0;&sub8;-AA&sub2;&sub1;&sub4; der menschlichen Kappa-Kette zu codieren. Jedoch wurde wegen eines Clonierungsartefakts die konstruierte Noti-Stelle 3 vom konstanten Bereich in pMDR986 nicht wiederhergestellt und statt dessen wurde eine PvuI-Stelle erzeugt.
Das Plasmid pMDR986 wurde mit AAatI und BclI gespalten, mit alkalischer Phosphatase aus dem Kalb behandelt, und das 3443 bp große Fragment wurde durch das Fraktionieren in niedrigschmelzender Agarose isoliert.

C. Plasmid-Zwischenprodukt pMDR1003

Die Konstruktion von Plasmid pMDR1003 wird vorstehend beschrieben. Es trägt DNA, die den humanisierten variablen Bereich der 5A8-leichten Kette vom Kappa-Typ codiert. Die DNA-Sequenz der pMDR1003-Insertion ist angegeben als SEQ ID NO:34.
Das Plasmid pMDR1003 wurde mit EcoRV und BGlII gespalten und das die Plasmid-Insertion enthaltende 326 bp große Fragment wurde durch Fraktionierung in niedrigschmelzender Agarose isoliert.

D. Abschließende Konstruktion des Vektors pMDR1007

Der Vektor pMDR1007 wurde aus PSAB132 (SEQ ID NO:40) und pMDR1006 (die insertierte DNA-Sequenz ist SBQ ID NO:54) konstruiert.
Zur Erzeugung von pMDR1006 wurden drei Fragmente miteinander ligiert: (a) das 572 bp große AatII/EcoRV-Fragment von pMDR985; (b) das 3442 bp große AatII/BclI-Fragment von pMDR986; und (c) das 326 bp große EcoRV/BglII-Fragment von pMDR1003. Das Ligierungsgemisch wurde zur Transformation von E. coli JA22 1 (Iq)-Zellen [Quelle ?] verwendet, wodurch diese ampiciliinresistent wurden. Kolonien wurden gezüchtet und es wurde Mini-Präp-DNA hergestellt. Die rekombinanten Plasmide wurden auf die Gegenwart von diagnostischen EcoO109 I-Restriktionsfragmenten durchmustert (2741 bp, 767 bp und 461 bp, 243 bp und 129 bp), die den Vektor pMDR1006 auswiesen. Die DNA-Sequenz der pMDR1006-Insertion ist angegeben als SEQ ID NO:54.
Das Plasmid pMDR1006 wurde mit NotI gespalten und das 1693 bp große Fragment wurde isoliert. Das NotI-Fragment wurde in das mit Noti linearisierte Plasmid pSAB132 (SEQ ID NO:40) ligiert, das vorher mit alkalischer Phosphatase aus dem Kalb dephosphoryliert worden war. Das dephosphorylierte Reaktionsgemisch wurde in niedrigschmelzender Agarose fraktioniert und dann zur Transformation von E. coli JA221 (Iq)-Zellen verwendet, wodurch diese ampicillinresistent wurden. Kolonien wurden gezüchtet und Mmi- Präp-DNA wurde hergestellt. Die rekombinanten Plasmide wurden auf ein diagnostisches ApaLI-Spaltungsmuster durchmustert (Fragmente mit einer Größe von 6249 bp, 1593 bp, 1246 bp und 498 bp), die den Vektor pMDR1007 auswiesen.
Die DNA-Sequenz der pMDR1007-Insertion ist angegeben als SEQ ID NO:55. Die von dieser DNA-Sequenz codierte Aminosäuresequenz ist als SEQ ID NO:56 dargestellt. Die pMDR1007-Insertion umfaßt DNA, codierend, in 5'-3'-Richtung, (1) die Signalsequenz der Kappa-Immunglobinkette (Nucleotide 35-100 von SEQ ID NO:55, entsprechend AA&submin;&sub2;&sub2;-AA&submin;&sub1; von SEQ ID NO:56) und (2) AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub2; der konstruierten humanisierten Sequenz für den variablen Bereich der 5A8-leichten Kette (Nucleotide 101-436 von SEQ ID NO:55&sub9; entsprechend AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub2; von SEQ ID NO:56), gefolgt von genomischer DNA (Nucleotide 1 bis 1201 der Genbank- Hinterlegungsnurmner J00241-PR:HUMIGKC3) codierend AA&sub1;&sub0;&sub8;-AA&sub2;&sub1;&sub4; (Kabat-Numerierung) der menschlichen leichten Kette vom Kappa-Typ (d.h. den konstanten Bereich der leichten Kette) (Nucleotide 437 und 782-1101 von SEQ ID NO:55, entsprechend AA&sub1;&sub1;&sub3;-AA&sub2;&sub1;&sub9; von SEQ ID NO:56).
E. coli-Zellen. die pMDR1007 enthielten, wurden unter der Hinterlegungsnummer ATCC 68846 bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, hinterlegt.

5. Expression von humanisiertem 5A8

In einem vorbereitenden Experiment wurden COS7-Zellen mit den Expressionsvektoren pMDR1007 und pMDR1002 durch Elektroporation transfiziert, und die Zellen wurden 48 Stunden gezüchtet. Die Zellen wurden dann mit ³&sup5;S-Methionin radioaktiv markiert. Im Anschluß daran wurden die Zellextrakte und die konditionierten Kulturmedien mit Protein A- Sepharose inkubiert. Die Protein A-Sepharose wurde gewaschen und die gebundenen Proteine wurden mit SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)-Ladepuffer eluiert und durch PAGE analysiert. In den konditionierten Medien wurden zusammengelagerte Immunglobulinmoleküle in sehr geringen Ausbeuten nachgewiesen, wie durch eine Protein A-Fällung der leichten Immunglobulinkette gezeigt wurde.

Hinterlegungen

Erfindungsgemäße Zellen und Antikörper-Homologe werden durch Kulturen veranschaulicht, die gemäß dem Budapester Vertrag bei der In Vitro International, Inc., Culture Collection in Linthicum, Maryland, USA, am 20. November 1990 hinterlegt und wie folgt ausgewiesen wurden:
"5A8-2F6";
"7-27-1F8-2B4";
"7-27-5F2-2C5";
"CHO-379 Clon 12.1"; und
"CHO-160".
Diesen Kulturen wurden jeweils die Hinterlegungsnummern IV1-10257 bis IV1- 10261 zugewiesen. Diese Hinterlegungen wurden am 20. Juni 1991 in die American Type Culture Collection Rockville Maryland, übertragen und werden bei der American Type Culture Collection gemäß dem Budapester Vertrag unter den Hinterlegungsnummem HB 10881, HB 10882 HB 10883 CRL 10884 bzw. CRL 10885 aufrechtbehalten.
Erfindungsgemäße DNA-Sequenzen und rekombinante DNA-Moleküle und ein bei der Herstellung derselben nützlicher Mikroorganismus werden durch Kulturen veranschaulicht, die gemäß dem Budapester Vertrag bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, am 21. November 1991 hinterlegt und wie folgt ausgewiesen wurden:
"E. coli K12 JA221(Iq)";
"E. coli K12 JA221(Iq)/pMDR1007";
"E. coli K12 JA221(Iq)/pMDR1002";
"E. coli K12 JA221(Iq)/pMDR904"; und
"E. coli K12 JA221(Iq)/pMDR927".
Diesen Kulturen wurden jeweils die Hinterlegungsnummem ATCC 68845 bis ATCC 68849 zugewiesen.

Sequenzen

Die folgende Liste ist eine Zusammenfassung der in der Sequenzbank angegebenen Sequenzen:
SEQ ID NO: 1 DNA-Sequenz von Prä-HIV-gp160.
SEQ ID NO:2 Aminosäuresequenz von Prä-HIV-gp160.
SEQ ID NO:3 DNA-Sequenz von löslichem HIV-gp120.
SEQ ID NO:4 Aminosäuresequenz von löslichem HIV-gp120.
SEQ ID NO:5 DNA-Sequenz des VH01-PCR-Primers.
SEQ ID NO:6 DNA-Sequenz des VH02-PCR-Primers.
SEQ ID NO:7 DNA-Sequenz von pNN03.
SEQ ID NO:8 DNA-Sequenz der pMDR904-Insertion (5A8-VH).
SEQ ID NO:9 DNA-Sequenz des variablen Bereichs der 5A8-schweren Kette.
SEQ ID NO: 10 Aminosäuresequenz des 5A8-variablen Bereichs der 5A8-schweren Kette.
SEQ ID NO:11 DNA-Sequenz des ACE149-PCR-Primers.
SEQ ID NO:12 DNA-Sequenz des ACE150-PCR-Primers.
SEQ ID NO: 13 DNA-Sequenz der pMDR927-Insertion (5A8-VL).
SEQ ID NO: 14 DNA-Sequenz des variablen Bereichs der 5A8-leichten Kette.
SEQ ID NO: 15 Aminosäuresequenz des 5A8-variablen Bereichs der 5A8-leichten Kette.
SEQ ID NO:16 DNA-Sequenz des 312-56-PCR-Primers.
SEQ ID NO:17 DNA-Sequenz des 312-57-PCR-Primers.
SEQ ID NO:18 DNA-Sequenz des 312-58-PCR-Primers.
SEQ ID NO:19 DNA-Sequenz des 312-59-PCR-Primers.
SEQ ID NO:20 DNA-Sequenz des 312-60-PCR-Primers.
SEQ ID NO:21 DNA-Sequenz des 312-61-PCR-Primers.
SEQ ID NO:22 DNA-Sequenz der pMDR989-15-Insertion.
SEQ ID NO:23 DNA-Sequenz der pMDR991-Insertion.
SEQ ID NO:24 DNA-Sequenz des 312-62-Oligonucleotids.
SBQ ID NO:25 DNA-Sequenz des 312-63-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:26 DNA-Sequenz des 312-64-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:27 DNA-Sequenz des 312-65-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:28 DNA-Sequenz des 312-66-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:29 DNA-Sequenz des 312-67-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:30 DNA-Sequenz des 312-68-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:3 1 DNA-Sequenz des 312-69-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:32 DNA-Sequenz des 312-70-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:33 DNA-Sequenz des 312-71-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:34 DNA-Sequenz der pMDR1003-Insertion.
SEQ ID NO:35 DNA-Sequenz des 312-45-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:36 DNA-Sequenz des 312-50-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:37 DNA-Sequenz der pLCB6-Insertion.
SEQ ID NO:38 DNA-Sequenz der pLCB7-Insertion.
SBQ ID NO:39 DNA-Sequenz der pMDR1001-Insertion.
SEQ ID NO:40 DNA-Sequenz von pSAB132.
SEQ ID NO:41 DNA-Sequenz des 370-38-PCR-Primers.
SEQ ID NO:42 DNA-Sequenz des 370-40-PCR-Primers.
SEQ ID NO:43 DNA-Sequenz der pBAG101-Insertion.
SEQ ID NO:44 DNA-Sequenz der pMDR1002-Insertion (humanisierte Prä-5A8- schwere Kette).
SEQ ID NO:45 Aminosäuresequenz der pMDR1002-Insertion (humanisierte Prä-5A8- schwere Kette).
SEQ ID NO:46 DNA-Sequenz des 360-81-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:47 DNA-Sequenz des 360-82-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:48 DNA-Sequenz der pMDR985-Insertion.
SEQ ID NO:49 DNA-Sequenz des 370-54-PCR-Primers.
SEQ ID NO:50 DNA-Sequenz des 370-55-PCR-Primers.
SEQ ID NO:51 DNA-Sequenz der pSAB153-Insertion.
SEQ ID NO:52 DNA-Sequenz des 360-83-PCR-Primers.
SEQ ID NO:53 DNA-Sequenz der pMDR986-Insertion.
SEQ ID NO:54 DNA-Sequenz der pMDR1006-Insertion.
SEQ ID NO:55 DNA-Sequenz der pMDR1007-Insertion (humanisierte Prä-5A8- leichte Kette).
SEQ ID NO:56 Aminosäuresequenz der pMDR1 007-Insertion (humanisierte Prä-5A8- leichte Kette).
SEQ ID NO:57 DNA-Sequenz des synthetischen pNN03-Polylinkers.
SEQ ID NO:58 DNA-Sequenz des 312-46-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:59 DNA-Sequenz des 312-47-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:60 DNA-Sequenz des 312-48-Oligonucleotids.
SEQ ID NO:61 DNA-Sequenz des 312-49-Oligonucleotids.
Obwohl die genannten Anmelder vorstehend eine Anzahl von erfindungsgemäßen Ausführungsformen beschrieben haben, ist offensichtlich, daß die Grundausführungen der Anmelder so verändert werden können, daß andere Ausführungsformen bereitgestellt werden, die die erfindungsgemaßen Zusammensetzungen und Verfahren verwenden bzw. anwenden. Deshalb ist erkennbar daß der Schutzumfang dieser Erfindung alle anderen Ausführungsformen und Variationen einschließt, die in der vorstehenden Beschreibung und durch die beigefügten Ansprüche definiert werden; und die Erfindung soll nicht durch die spezifischen Ausführungsformen begrenzt werden, die hier durch Beispiele dargelegt wurden.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: Burkly, Linda C. Chisholm, Patricia L. Thomas, David W. Rosa, Margaret D. Rosa, Joseph J.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: HIV-induzierte Syncytien blockierende anti-CD4-Antikörper
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 61
(iv) POSTADRESSE:
(A) EMPFÄNGER: Fish & Neave
(B) STRASSE: 875 Third Avenue
(C) STADT: New York
(D) STAAT: New York
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 10022-6250
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: Floppy-Disk
(B) COMPUTER: IBM-PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentln Release #1,0, Version #1,25
(vi) AKTUELLE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: WO
(B) EINREICHUNGSDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(vi) ANWALT/VERTRETERINFORMATION:
(A) NAME: Haley, JR., James F.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 27,794
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: B148 CIP
(vi) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEPHON: (212) 715-0600
(B) TELEFAX: (212) 715-0673
(C) TELEX: 14-8367

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2571 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Signalpeptid
(B)LAGE: 1...87
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: reifes Peptid
(B) LAGE: 88...2568
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1533...1534
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "gp120/gp41-Spaltstelle"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1...2568
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "Prä-HIV-gp160" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 856 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:2:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:3:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1497 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1.1494
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1 (D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "lösliches HIV-gp120"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:3:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:4:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 498 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:4:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:5:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="VH01-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:5

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:6:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 32 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein

(ix) MERKMAL:

(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="VH02-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:6

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:7:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2755 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pNN03" (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:7

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:8:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 365 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "pMDR904-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:8

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:9:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 366 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1.366
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "variabler Bereich der 5A8-schweren Kette"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:9

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:10:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 122 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:10

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 11:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 27 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="ACE149-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:12:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 22 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "ACE150-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:12

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:13:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 340 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "pMDR927-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:13

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:14:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 336 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIB: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 1.336
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "variabler Bereich der 5A8-leichten Kette"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:14

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:15:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 112 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:15

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:16:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 58 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-56-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:16

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:17:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 49 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-57-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:18:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 47 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-58-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:18
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:19:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-59-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:19

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:20:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 75 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-60-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:20
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:21:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 55 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung "312-61-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:21

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:22:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 331 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pMDR989-15-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:22

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:23:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 358 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) NIERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pMDR991-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:23

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:24:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 66 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-62-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:24

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:25:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 62 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(Ä) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-63-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:25

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:26:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 69 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung "312-64-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:26

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:27:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 72 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-65-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:27

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:28:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 69 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-66-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:28

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:29:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 67 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN:
/Anmerkung ="312-67-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:29

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:30:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 71 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-68-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:30

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:31:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 69 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-69-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:3 1
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:32:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(Ä) LÄNGE: 63 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-70-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:32

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:33:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 68 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKULTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-71-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBLNG: SEQ ID NO:33

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:34:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 344 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pMDR1003-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:34

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:35:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 51 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-45-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:35

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:36:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 44 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="="312-50-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:36

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:37:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 144 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "pLCB6-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:37

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:38:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 461 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pLCB7-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:38

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:39:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 461 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pMDR1001-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:39

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:40:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 7892 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: zirkulär
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL.
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pSAB132-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:40

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:41:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Basenpaare
(13) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "370-38-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:41

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:42:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(13) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkinal
(13) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "370-40-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:42

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:43:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2029 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "pBAG101-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:43

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO :44:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2560 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: eitizeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) NIOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Signalpeptid
(B) LAGE: 12...68
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: reifes Peptid
(B) LAGE: Verbindungsstelle (69..435, 712...1005, 1396...1431, 1550...1879, 1977...2296)
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Intron
(B)LAGE:436...711
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Intron
(B) LAGE: 1006.1395
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Intron
(B) LAGE: 1432.1549
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Intron
(B) LAGE: 1880.1976
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pMDR1002-Insertion; humanisierte Prä-5A8-schwere Kette"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B) LAGE: 12...435
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B)LAGE:712...1005
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B) LAGE: 1396...1431
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B) LAGE: 1550...1879
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B) LAGE: 1977...2296
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: Verbindungsstelle (12...435, 712...1005, 1396...1431, 1550...1879, 1977...2296)
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:44

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:45:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 468 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:45

(2) INFORMÄTION FÜR SEQ ID NO:46:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 77 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="360-81-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:46

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:47:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 73 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="360-82-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:47

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:48:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 77 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pMDR985-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:48

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:49:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 45 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="370-54-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:49

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:50:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) N4£RKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="370-55-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:50

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:51:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1241 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKNAL
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="PSAB153-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:51

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:52:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 20 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="360-83-PCR-Primer"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:52

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:53:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1276 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pMDR986-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:53

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:54:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1701 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL.
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pMDR1006-Insertion"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:54

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:55:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 1701 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: DNA (genomisch)
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Signalpeptid
(B)LAGE:35...100
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: reifes Peptid
(B) LAGE:
Verbindungsstelle (101..437, 782...1101)
(ix) MERKMAL.
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Intron
(B)LAGE:438...781
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="pMDR1007-Insertion; humanisierte Prä-5A8-leichte Kette"
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B)LAGE:35...436
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Exon
(B)LAGE:782...1101
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE:
Verbindungsstelle (35...437, 782...1101) (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:55

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:56:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 241 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:56

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:57:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 115 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="synthetischer pNN03-Polylinker"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:57

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:58:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 44 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-46-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:58

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:59:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 44 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-47-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:59

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:60:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 46 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERIMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-48-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:60

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO:61:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 52 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: einzeisträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
(iii) HYPOTHETISCH: nein
(iv) ANTISENSE: nein
(ix) MERKMAL:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: weiteres Merkmal
(B) LAGE: 1
(D) ANDERE INFORMATIONEN: /Anmerkung ="312-49-Oligonucleotid"
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO:6

Claims

1. Antikörper-Homolog, das

(a) an menschliches CD4 bindet;

(b) nicht signifikant die Bindung von HIV-gp120 an menschliches CD4 blockiert; und

(c) HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen mindestens so gut wie OKT4A blockiert.

2. Antikörper-Homolog, das

(a) an menschliches CD4 bindet;

(b) nicht signifikant die Bindung van HIV-gp120 an menschliches CD4 blockiert;

(c) HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen besser als OKT4 blockiert; und

(d) in einem in vitro-Tetanus-Toxoid-spezifischen Vermehrungstest weniger immunsuppressiv ist als OKT4A.

3. Antikörper-Homolog, das

(a) an menschliches CD4 bindet;

(b) nicht signifikant die Bindung von HIV-gp120 an menschliches CD4 blockiert;

(c) HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen wenigstens so gut wie OKT4A blockiert; und

4. Antikörper-Homolog nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Antikörper-Homolog nicht an ein aus menschlichem CD4-V1 bestehendes Polypeptid bindet.

15. Antikörper-Homolog nach Anspruch 4, wobei das Antikörper-Homolog an ein aus menschlichem CD4-V1V2 bestehendes Polypeptid bindet.

6. Antikörper-Homolog nach einem der Ansprohe 1 bis 3, wobei das Antikörper-Homolog nicht signifikant die Bindung von CD4-V1-spezifischen Antikörpern an menschliches CD4 blockiert.

7. Antikörper-Homolog nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Antikörper-Homolog die Infektion von CD4&spplus;-Zellen mit HIV inhibiert.

8. Antikörper-Homolog nach einem der Anspräche 1 bis 3, wobei das Antikörper-Homolog ein oder mehrere Kennzeichen zeigt, ausgewählt aus:

(a) es verursacht keine signifikante Abnahme in der Zahl von zirkulierenden CD4&spplus;-Zellen in vivo;

(b) es verursacht keine signifikante Modulation von CD4 auf der Oberfläche von CD4&spplus;-Zellen in vivo;

(c) es verursacht keine signifikante Abnahme in der Zahl der zirkulierenden peripheren Leukocyten in vivo; und

(d) es verursacht keine signifikante Abnahme des Antikörpertiters, der als Antwort auffremde Antigene in vivo ausgelöst wird.

9. Antikörper-Homolog, das von einem Hybridom stammt, ausgewählt aus den Hybridomen mit den Hinterlegungsnummern HB 10881 (5A8-2F6), HB 10882 (7-27-1F8-2B4) und HB 10883 (7-27-5F2-2C5).

10. Antikörper-Homolog nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 9, wobei das Antikörper-Homolog ein intakter monoclonaler Antikörper ist.

11. Antikörper-Homolog nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 9, wobei das Antikörper-Homolog ausgewählt ist aus Fab- Fragmenten, Fab'-Fragmenten, F (ab')&sub2;-Fragmenten und F(v)-Fragmenten.

12. Antikörper-Homolog nach einem der Anspruche 1 bis 3, das ein humanisiertes rekombinantes Antiköroer-Homolog ist.

13. Humanisiertes rekombinantes Antikörper-Homolog nach Anspruch 12, wobei die Aminosäuresequenzen der CDRs wie folgt sind:

(a) die leichte Kette CDRI ist AA&sub2;&sub4;-AA&sub4;&sub0; von Seq ID NO:15;

(b) die leichte Kette CDR2 ist AA&sub5;&sub6;-AA&sub6;&sub2; von Seg ID NO:15;

(c) die leichte Kette CDR3 ist AA&sub9;&sub5;-AA&sub1;&sub0;&sub2; von Seq ID NO:15

(d) die schwere Kette CDR1 ist AA&sub3;&sub1;-AA&sub3;&sub5; von Seq ID NO:10;

(e) die schwere Kette CDR2 ist AA&sub5;&sub0;-AA&sub6;&sub6; von Seq ID NO:10; und

(f) die schwere Kette CDR3 ist AA&sub9;&sub9;-AA&sub1;&sub1;&sub1; von Seq ID NO:10.

14. Humanisiertes rekombinantes Antikörper-Homolog nach Anspruch 13, wobei:

(a) die Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der leichten Kette AA&sub1;-AA&sub1;&sub1;&sub2; von SEQ ID NO:56 ist; und

(b) die Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der schweren Kette AA&sub1;-AA&sub1;&sub2;&sub2; von SEQ ID NO:45 ist.

15. Humanisiertes rekombinantes Antikörper-Homolog nach Anspruch 14, wobei:

(a) die Aminosäuresequenz der leichten Kette AA&sub1;-AA&sub2;&sub1;&sub9; von SEQ ID NO:56 ist; und

(b) die Aminosäuresequenz der schweren Kette AA&sub1;-AA&sub4;&sub4;&sub8; von SEQ ID NO:45 ist.

16. Antikörper-Homolog nach einem der Ansdrüche 1 bis 3, das ein chimäres rekombinantes Antikörper-Homolog ist.

17. Chimäres rekombinantes Antikörper-Homolog nach Anspruch 16, wobei:

(a) die Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der leichten Kette SEQ ID NO:15 ist; und

(b) die Aminosäuresequenz des variablen Bereichs der schweren Kette SEQ ID NQ:10 ist.

18. Derivatisiertes Antikörper-Homolog, umfassend ein Antikörper-Homolog nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 9, verbunden mit einem oder mehreren Mitgliedern, unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe von Antikörper-Homologen nach den Ansprüchen 1 bis 3 und 9, 5A8-mimetischen Mitteln nach den Ansprüchen 35 bis 37, nachweisbaren Mitteln, cytotoxischen Mitteln und Arzneimitteln.

19. Derivatisiertes Antikörper-Homolog nach Anspruch 18, wobei das Arzneimittel ausgewählt ist aus Immunglobulinen und Teilen davon, die an menschliche Peptide, Polypeptide oder Proteine binden.

20. Zusammensetzung für die Vorbeugung oder Behandlung einer Krankheit in einem Säuger, verursacht durch einen Infektionserreger, dessen primäres Ziel CD4&spplus;-Zellen sind, umfassend eine immuntherapeutisch wirksame Menge eines oder mehrerer Mitglieder aus der Gruppe Antikörper-Homologe nach den Ansprüchen 1 bis 17, derivatisierte Antikörper-Homologe nach den Ansprüchen 18 bis 19 und 5A8- mimetische Mittel nach den Ansprüchen 35 bis 37, und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger.

21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei der Säuger ein Mensch ist und der Infektionserreger HIV ist.

22. Zusammensetzung nach Anspruch 20 oder 2, weiter umfassend ein oder mehrere Mittel, die sign-fikant die Bindung von HIV-gp120 an CD4 blockieren.

23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei das Mittel ausgewählt ist aus CD4 V1-spezifischen Antikörper-Homologen, CD4 V1-Polypeptiden und anti-HIV-gp120-Antikörper- Homologen.

24. Verwendung der Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 20 bis 23 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Vorbeugung oder Behandlung einer Krankheit in einem Säuger, verursacht durch einen Infektionserreger, dessen primäres Ziel CD4&spplus;-Lymphocyten sind.

25. DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe: SEQ ID NO:14 (5A8-variabler Bereich der leichten Kette), SEQ ID NO:9 (5A8-variabler Bereich der schweren Kette), SEQ ID NO:55 (pre-5A8-humanisierte leichte Kette) und SEQ ID NO:44 (pre-5A8-humanisierte schwere Kette) ; Teile einer der vorstehenden DNA-Sequenzen, die ein Antikörper-Homolog nach den Ansprüchen 1 bis 3 codieren; und DNA-Sequenzen, die zu einer der vorstehenden DNA-Sequenzen degeneriert sind.

26. Rekombinantes DNA-Molekül, umfassend ein oder mehrere DNA-Sequenzen nach Anspruch 25 und eine oder mehrere damit funktionell verbundene Expressionskontrollsequenzen.

27. Rekombinantes DNA-Molekül nach Anspruch 26, das ausgewählt ist aus pMDR1007 (ATCC 68846) und pMDR1002 (ATCC 68847).

28. Zelle, die ein Antikörper-Homolog nach den Ansprüchen 1 bis 17 produziert.

29. Zelle nach Anspruch 28, die eine Hybrizozelle ist.

30. Zelle nach Anspruch 29, die ausgewan ist aus Zellen mit den Hinterlegungsnummern HB 10881 (5A8-2F6), HB 10882 (7-27-1F8-284) und HB 10883 (7-27-5F22-2C5)

31. Zelle nach Anspruch 28, die eine Wirtszelle ist, die mit einem oder mehreren rekombinanten DNA-Molekülen nach Anspruch 26 oder 27 transformiert ist.

32. Verfahren zur Herstellung eines Antikörper-Homologs nach einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend das Züchten einer Zelle nach einem der Ansprüche 28 bis 31.

33. Verfahren zur Herstellung einer Zelle nach Anspruch 29, umfassend den Schritt der Immunisierung eines nichtmenschlichen Säugers mit CD4&spplus;-Zellen, die CD4 auf ihrer Oberfläche exprimieren und durch die Transformation von CD4&supmin;-Säugergewebekulturzellen mit das vollständige menschliche CD4 codierende DNA hergestellt wurden.

34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei die CD4&spplus;-Zellen die Hinterlegungsnummer CRL 10884 haben.

35. 5A8-mimetisches Mittel, das HIV-induzierte Syncytienerzeugung zwischen CD4&spplus;-Zellen inhibiert.

36. 5A8-mimetisches Mittel, das die Infektion von CD4&spplus;-Zellen mit HIV inhibiert.

37. 5A8-mimetisches Mittel, das die Eigenschaften eines Antikörper-Homologs nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zeigt.