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Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von
tierischen Zellen, die die Fähigkeit besitzen, menschliches
Erythropoietin herzustellen, das ein erythropoietischer oder ein
die Bildung der Erythrocyten beschleunigender Faktor ist. Die
vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren für die
wirksame Herstellung von menschlichem Erythropoietin mittels
Kultivieren der derart hergestellten Zellen.
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Erythropoietin ist ein die Bildung der Erythrocyten
beschleunigender Faktor, der auf die erythroiden Vorläuferzellen
(CFU-E), die im Knochenmark vorkommen, wirkt, so daß deren
Differenzierung in Erythrocyten beschleunigt wird. Die
Eigenschaften von menschlichem Erythropoietin wird im
Nachfolgenden beschrieben.
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Es ist verschiedentlich berichtet worden, daß menschliches
Erythropoietin ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht
von 35 000 [Yanagawa et al., J Biol. Chem. 259, 2707-2710
(1984)] ist, und daß der Peptid-Anteil ein einzelsträngiges
Polypeptid ist, das aus 166 Aminosäuren besteht [Jacob et
al., Nature 313, 806-810 (1985)].
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Außerdem sind auch die Strukturen der cDNA und der
genomischen DNA des menschlichen Erythropoietin ermittelt worden,
wie es der Veröffentlichung von Jacob et al. entnommen werden
kann.
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Was die klinischen Wirkungen des Erythropoietin betrifft, so
sind die die Bildung der Erythrocyten stimulierenden
Wirkungen des Erythropoietin auf der Grundlage von Tierversuchen
unter Verwendung gereinigter Präparationen von
Erythropoietin, die aus dem Urin anämischer Patienten gewonnen worden
waren, erkannt worden (Masunaga et al., Acta Hematol. Jpn.,
im Druck).
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Dementsprechend kann Erythropoietin möglicherweise eine
klinische Anwendung als Medikament für die Behandlung von
Anämien von Nierenpatienten, für die Prophylaxe von Anämien bei
Patienten, die auf Grund einer Nierendysfunktion oder nach
einer Nephrektomie an der Dialyse hängen, oder auf Grund der
stimulierenden Wirkung bezüglich der Bildung der Erythrocyten
für die Förderung der Erholung postoperativer Patienten
finden.
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Es ist also, wie oben beschrieben, die Erwartung vorhanden,
daß Erythropoietin für die Behandlung von Anämien unter einem
klinischen Gesichtspunkt angewendet werden kann. Auf Grund
des derzeitigen Standes der Technik ist Erythropoietin in
seiner Entwicklung als Medikament jedoch hinter den
Erwartungen zurückgeblieben, was auf der Schwierigkeit beruht, ein
medizinisch reines Produkt in großen Mengen zur Verfügung zu
stellen. Obgleich Erythropoietin in dem Urin von Patienten
mit aplastischer Anämie enthalten ist, ist das
Erythropoietin, das aus dem Urin abgetrennt und gereinigt worden ist,
bisher nur für Tests und für die Zwecke der Forschung
verwendet worden.
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Die vorliegende Erfindung ist mit dem Ziel vollendet worden,
die oben genannten Probleme bei der Herstellung von
Erythropoietin zu lösen. Es ist deshalb eine Aufgabe der
vorliegenden Erfindung, unter Verwendung einer rekombinanten
DNA-Technik ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin
produzierenden Zellen bereitzustellen, die Erythropoietin in einer
großen Menge produzieren können. Es ist weiterhin eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für die
Herstellung von reinem Erythropoietin in großen Mengen und Ausbeuten
zur Verfügung zu stellen, wobei das Verfahren die Schritte
umfaßt, die in der oben beschriebenen Weise hergestellten
Zellen unter Bildung von Erythropoietin zu kultivieren und
das resultierende Erythropoietin mittels eines monoklonalen
Antikörpers, der gegen menschliches Erythropoietin gerichtet
ist, zu isolieren.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für die
Herstellung von Erythropoietin zur Verfügung gestellt, wobei
das Verfahren die Schritte umfaßt: (i) einen Erythropoietin
Expressionsvektor, in dem die Expression des Erythropoietin
unter der Kontrolle des M-MuLV LTR (Moloney murine leukemia
virus) Promotors steht, herzustellen, (ii) diesen
Erythropoietin Expressionsvektor in BHK21 Zellen einzuführen, (iii)
die Zellen zu klonieren, um eine Zellinie zu etablieren, die
Erythropoietin konstitutiv herstellt, (iv) die Zellinie zur
Herstellung von Erythropoietin zu kultivieren und (v) das
Erythropoietin zu isolieren.
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Die vorliegende Erfindung wird nun an Hand der Beschreibung
beispielhaft und näher erläutert.
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Die Erythropoietin produzierenden Zellen werden gemäß der
vorliegenden Erfindung wie folgt hergestellt:
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Als erstes wird mittels der folgenden Techniken ein
Erythropoietin Expressionsvektor hergestellt.
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(1) Herstellung eines Erythropoietin Expressionsvektors, der
das neor Gen als Selektionsmarker aufweist:
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Das Plasmid phEP1404, das durch Insertion des ganzen
Erythropoietin-Gens, das von einer genomischen Bank des Menschen
erhalten worden ist, an den Schnittstellen für die
Restriktions-Endonukleasen EcoR I und Sma I in das Plasmid pUC 8
gebildet worden ist, wird zur Abtrennung des Erythropoietin-
Gens mit den Restriktions-Endonukleasen Bgl II und BamH I
geschnitten. Das Erythropoietin-Gen wird an der Schnittstelle
der Restriktions-Endbnuklease BamH I, die unterhalb der LTR
und oberhalb des neor Gens liegt, in den Shuttle-Vektor pZIP-
NeoSV(X)1 für Säugerzellen eingebracht. Es wird auf einen
Vektor, bei dem das Erythropoietin-Gen richtig eingebracht
worden ist, als den nach dem Mapping mit
Restriktions-Endonukleasen gewünschten Vektor selektioniert.
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Die vorliegende Erfindung erlaubt die Herstellung von Zellen,
die auf Grund der Einbringung des Erythropoietin-Gens in
tierische Zellen die Fähigkeit aufbringen, das Erythropoietin-
Gen stark zu expremieren. Dabei erfolgt das Einbringen in die
tierischen Zellen unter Verwendung der Erythropoietin
Expressionsvektoren, die wie oben (1) beschrieben hergestellt
werden. Das Erythropoietin-Gen wird mittels der folgenden
Technik in die tierischen Zellen eingebracht:
Einbringung des Erythropoietin-Gens in tierische Zellen
unter Verwendung der oben beschriebenen Vektoren
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Im Fall, daß ein Erythropoietin Expressionsvektor mit dem neor
Gen als Selektionsmarker, hergestellt nach dem oben
beschriebenen Verfahren (1), verwendet wird, wird mittels des
Calcium-Phosphat-DNA-Transfektionsverfahrens nur der Vektor in
BHK21 Zellen (die von der Niere von einem neugeborenen
(Syrian) Hamster stammen) eingebracht.
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Die Expression des Erythropoietin-Gens in den tierischen
Zellen durch die Einführung des Erythropoietin-Gens in diese
nach der oben beschriebenen Methode kann durch die Bildung
von gegen G418 resistenten Zellen bestätigt werden.
Insbesondere kann dies dadurch erfolgen, daß die Zellen, die das
eingeführte Erythropoietin-Gen enthalten, verdünnt, dann in ein
Kulturmedium inokuliert und inkubiert werden, dem Medium dann
G418 zugesetzt und wiederum inkubiert wird, so daß die so
gebildeten gegen G418 resistenten Zellen selektiert und unter
diesen dann solche selektiert werden, die auch Erythropoietin
in das Kulturmedium ausschütten.
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Die derart selektierten Zellen werden einer begrenzten
Verdünnung unterworfen, so daß die Zellen, die das
Erythropoietin-Gen expremieren, kloniert werden, wodurch sich auf solche
Zellen selektionieren läßt, die das Erythropoietin-Gen in
großen Mengen expremimieren können. Auf diese Weise wird eine
Zellinie, die Erythropoietin konstitutiv herstellt,
etabliert.
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Die Identifizierung des von der so etablierten Zellinie
produzierten Erythropoietins wird mittels der Verfahren des
Radio-Immuno-Assays und des in vitro Bioassays unter Verwendung
fötaler Leberzellen von der Maus durchgeführt.
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Herstellung von Erythropoietin unter Verwendung von
Erythropoietin produzierenden Zellen
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Die Erythropoietin produzierenden Zellen, die nach dem oben
beschriebenen Verfahren hergestellt werden, werden in einem
synthetischen Medium, das Serum enthält, kultiviert, und der
Überstand des resultierenden Kulturmediums wird der
Ultrafiltration (nominale Ausschlußgröße 13 000) unterworfen, um die
Bestandteile hohen Molekulargewichtes zu konzentrieren und
abzutrennen. Anschließend läßt man den Überstand durch eine
Säule laufen, die einen gegen menschliches Erythropoietin
gerichteten monoklonalen Antikörper enthält. Das aus der
nachfolgend durchgeführten Elution erhaltene Eluat wird zur
Isolierung des Erythropoietin der Gelfiltration unterworfen, so
daß gereinigtes rekombiantes Erythropoietin erhalten wird.
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Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die
folgenden Beispiele näher beschrieben. Es ist jedoch so zu
verstehen, daß der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht auf
oder durch diese Beispiele eingeschränkt wird.
Beispiel 1
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Dieses Beispiel -beschreibt die Herstellung von Erythropoietin
mittels Erythropoietin produzierender Zellen, die unter
Verwendung eines Vektors, der ein Selektionsmarker-Gen und das
Erythropoietin-Gen auf demselben Vektor enthält, hergestellt
worden sind.
(i) Herstellung eines Erythropoietin Expressionsvektors, der
das neor Gen (pZIPNeoSV(X)1EPO) als Selektionsmarker
enthält
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Zu 10 ug des Plasmids phEP1404 (ein Plasmid, das durch
Einbringen eines Fragments, gebildet durch die Spaltung des
Erythropoietin-Gens 2,4 kb unterhalb der Apa I-Schnittstelle am
5'-Ende, an den Schnittstellen für die
Restriktions-Endonukleasen EcoR I und Sma I in das Plasmid pUC 8 gebildet
worden ist; Größe: 5,1 kb), das in 116 ul einer TE-Pufferlösung
(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4) gelöst vorlag, wurden 40
ul einer Bgl II Reaktionspufferlösung der 5 · Konzentration
(50 mM Tris-HCl, 35 mM MgCl&sub2;, 500 mM NaCl, 35 mM
2-Mercaptoethanol) zugegeben. Es folgte die Zugabe von je 20 Einheiten
der Restriktions-Endonukleasen Bgl II und BamH I. Nachdem die
Reaktion 2 Stunden lang bei 37ºC abgelaufen war, wurde das
Reaktionsgemisch auf ein 3,5% Polyacrylamidgel gegeben und
elektrophoretisiert, so daß ein Gelstück entsprechend dem 2,4
kb Bgl II/BamH I Fragment (Erythropoietin-Gen)
ausgeschnitten werden konnte. Nachdem das Gelstück sorgfältig
zerkleinert worden war, wurde 1 ml einer Elutionspuffer-Lösung (0,5
M Ammoniumacetat, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 8) zugesetzt und
über Nacht bei 37ºC inkubiert, um die Extraktion der DNA zu
ermöglichen. Die DNA enthaltende Lösung wurde zentrifugiert,
um das Acrylamid-Gel zu präzipitieren. Der Überstand wurde
aufgenommen und einmal mit Phenol und dreimal mit Ether
extrahiert.
Durch letztere Extraktion wird das in der
Wasserphase enthaltene Phenol entfernt. Die resultierende
Wasserphase wurde zum Ausfällen der DNA mit dem zweifachen Volumen
Ethanol versetzt. Das DNA Fragment (Präzipitat) wurde durch
Zentrifugation ausgefällt, getrocknet und in 20 ul sterilen
Wassers gelöst. Somit war eine Lösung des Erythropoietin-Gens
hergestellt worden.
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Getrennt davon wurden 20 ul einer BamH I
Reaktionspuffer-Lösung der 5 · Konzentration (dieselbe wie die Bgl II-Puffer-
Lösung) und dann die Restriktions-Endonuklease BamH I zu 5 ug
des Shuttle-Vektors pZIP NeoSV(X)1 (gelöst in 5 ul TE Puffer-
Lösung) gegeben. Es folgte die Reaktion bei 37ºC für eine
Stunde, während der der Vektor gespalten wurde.
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Die Reaktionslösung wurde einmal mit Phenol und dreimal mit
Ether extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol gefällt und
getrocknet. Zu 350 ng (ng = 10&supmin;&sup9; g) der mit BamH I geschnittenen
pZIP-NeoSV(X)1-DNA (gelöst in 4 ul Wasser) wurden 200 ng des
Erythropoietin-Gens (16 ul), 2 ul eines
Ligase-Reaktionspuffers der 10 · Konzentration (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl&sub2;, 100
mM DTT, pH 7,6), 2 ul 9 mM ATP und 3 ul T&sub4; Ligase (8,4
Einheiten) gegeben. Dann erfolgte die Reaktion bei 4ºC über Nacht.
Die Reaktionslösung wurde zweimal mit Phenol und dreimal mit
Ether extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol gefällt. Die
erhaltene DNA wurde getrocknet und in 20 ul TE Pufferlösung
gelöst. Es war eine DNA Lösung für die Transformation
hergestellt worden. Unter Verwendung von 10 ul der DNA-Lösung
wurden 200 ul kompetenter Zellen von Escherichia coli DH-1
transformiert (Transformationsfrequenz: 3 · 10&sup6; Zellen/kg pBR
322).
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Durch das oben beschriebene Verfahren wurden 35 Klone von
Transformanden erhalten, die gegen Ampicillin und Kanamycin
resistent sind. Von diesen wurden 11 Klone durch Kartierung
des Plasmids mit Restriktions-Endonukleasen analysiert, wobei
4 herausgefunden werden konnten, die den gewünschten
Erythropoietin
Expressionsvektor enthalten. Mit einem dieser Klone
wurde eine Plasmid-Präparation nach gewohnter Manier
vorgenommen, und es wurde der Erythropoietin Expressionsvektor
pZIP NeoSV(X)1EPO gewonnen.
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Unter Verwendung dieses derart hergestellten Erythropoietin
Expressionsvektors wurde das Erythropoietin-Gen gemäß dem
nachfolgend beschriebenen DNA Transfektionsverfahren wie
folgt in tierische Zellen eingebracht.
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(ii) Einführung des Erythropoietin-Gens in BHK21 Zellen
2 · 10&sup6; BHK21 Zellen wurden einen Tag vor der
DNA-Transfektion in eine 25 cm² T-Flasche ausgesät [Kulturmedium: Basal
Medium Eagle (BME) + 10% CS + 10% Tryptose Phosphat Broth).
Die Transfektion der DNA in die BHK21 Zellen erfolgte unter
Verwendung der oben beschriebenen DNA-Calciumphophat-Lösung.
Nach der Selektion der gegen G418 resistenten Zellen wurden
diese zweimal begrenzt verdünnt, um die Zellen zu klonieren.
Damit wurde eine Zellinie etabliert, die Erythropoietin
konstitutiv herstellt und EPOBX7A genannt wird. Von der Zellinie
hergestelltes Erythropoietin und seine Ausbeute wurden
mittels der Verfahren des Radio-Immuno-Assays und des in vitro
Bioassays unter Verwendung fötaler Leberzellen von der Maus
untersucht. Die mit beiden Verfahren gemessenen Aktivitäten
waren dieselben, nämlich 1 000 Einheiten/10&sup6; Zellen/Tag.
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Die Erythropoietin produzierenden Zellen EPOBX7A, die nach
dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt worden sind,
wurden wie folgt kultiviert, so daß sie Erythropoietin
produzieren konnten, das anschließend isoliert werden konnte.
(iii) Herstellung und Isolation von rekombinantem
Erythropoietin
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In eine Zellkammer 10 (6 000 cm²) (Produkt von Nunc Co.)
wurden 1,5 · 10&sup8; EPOBX7A Zellen ausgesät, die anschließend drei
Tage lang in Gegenwart von 1 l Kulturmedium [Dulbeccos
Modifiziertes Eagle MEM (DME) + 10% Kälberserum (CS)] kultiviert
wurden. Das Kulturmedium wurde alle drei Tage durch frisches
Kulturmedium (2 l) ersetzt. Die Aktivität des Erythropoietin,
die in dem Kulturmedium enthalten war, wurde an Hand des
Radio-Immuno-Assay auf 100-300 Einheiten/ml bestimmt. Die
Isolation des Erythropoietin wurde nach dem in der
Japanischen Offenlegungsschrift 41 614/1985 beschriebenen Verfahren
durchgeführt.
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Dann wurde 11 l dem nach der oben beschriebenen Weise
erhaltenen Kulturmediums (mit einer EPO Aktivität von 2 · 10&sup6;
Einheiten) mit einer Ultrafiltrations-Apparatur behandelt, so
daß eine konzentrierte Fraktion mit einem Molekulargewicht
von 10 000 oder mehr erhalten wurde, während die Temperatur
(bei 5-10ºC) kontrolliert wurde. Es wurde PBS (Phosphat
gepufferte physiologische Salzlösung) zugegeben und weiter
konzentriert, so daß 1,5 l eines Konzentrats von
Erythropoietin erhalten wurden.
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Das Konzentrat wurde mit SDS-Pulver versetzt, so daß eine
Konzentration von 2% erzielt wurde, und 3 Minuten auf 100ºC
erhitzt. Das Gemisch wurde auf 4ºC abgekühlt und über die
Nacht bei 0ºC stehen gelassen. Dann folgte eine
Zentrifugation zur Entfernung des SDS, so daß 1,2 l eines Überstands
erhalten wurden. Dieser wurde mit einer Geschwindigkeit von
60 ml/h durch eine Immunoaffinitätssäule gegeben, die durch
Kopplung eines gegen menschliches Erythropoietin gerichteten
monoklonalen Antikörpers an Affi-Gel 10 (Menge des
gekoppelten Antikörpers: 0,5 g/10 ml Affi-Gel 10; 3,6 cm · 3 cm,
Volumen des Gelbetts: 30 ml) hergestellt worden war. Dann
wurden zum Waschen der Säule in dieser Reihenfolge und mit einer
Geschwindigkeit von 100 ml/h 2 000 ml PBS, 400 ml einer 10 mM
Phosphatpuffer-Lösung, die 0,5 M an NaCl war (pH 7,4), und
400 ml einer 0,15 M NaCl-Lösung durch die Säule gegeben.
Anschließend ließ man eine gemischte Lösung von 0,2 M
Essigsäure und 0,15 M NaCl mit einer Geschwindigkeit von 30 ml/h
durch die Säule laufen, so daß 100 ml eines Eluats
aufgefangen wurden. Das Eluat enthielt 1,2 · 10&sup6; Einheiten
Erythropoietin-Aktivität.
Dann wurde eine Gelfiltration wie folgt
vorgenommen.
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Dem Eluat wurde eine 3,4 M Tris-Lösung zugesetzt, dann
erfolgte die Neutralisation. Nach erfolgter Dialyse gegen
Wasser wurde die erhaltene Lösung durch Gefriertrocknen
konzentriert. Das gefriergetrocknete Pulver wurde in 6 ml 10 mM
Phosphatpuffer-Lösung, die 0,15 M NaCl (pH 7,5) enthielt,
gelöst, und 3 ml der Lösung wurden mit einer Geschwindigkeit
von 6 ml/h durch-eine mit Sephadex G100 gepackte Säule (1,2
cm · 150 cm, Volumen des Säulen-betts: 170 ml) gegeben, die
zuvor mit derselben wie der oben beschriebenen Pufferlösung
equilibriert worden war, so daß das Eluat nach dem
Molekulargewicht fraktioniert wurde. Indem die Fraktionen entfernt
wurden, die hochmolekulare Verunreinigungen enthielten, wurde
eine Erythropoietin-aktive Fraktion erhalten. Auf ähnliche
Weise wurden die restlichen 3 ml des
Erythropoietin-Konzentrats ebenfalls einer Molekulargewichtsfraktionierung
unterworfen, so daß eine weitere Erythropoietin-aktive Fraktion
gewonnen wurde. Das mittels der oben beschriebenen Verfahren
gewonnene Erythropoietin hatte eine Aktivität von 1,08 · 10&sup6;
Einheiten. Die Reinheit der so erhaltenen Präparationen wurde
an Hand der SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
getestet. Es wurden in den Präparationen jedoch keinen
verunreinigenden Proteine gefunden (eine einzelne Bande wurde in
dem Bereich beobachtet, der einem Molekulargewicht von etwa
35 000 entspricht).
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Somit wurde rekombinantes Erythropoietin hoher Reinheit
gewonnen.
(iv) Herstellung eines Erythropoietin cDNA transformierenden
Vektors, der das neor Gen als Selektionsmarker enthält
(pZIPNeoSV(X)EPO cDNA)
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Zu 20 ug des Plasmids, das die oben beschriebene
Erythropoietin cDNA gelöst in 70 ml TE-Pufferlösung enthält, wurden 20
ul einer Sau3A I Reaktionspuffer-Lösung der 5 · Konzentration
(10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl) gegeben. Es
folgte die Zugabe von 50 Einheiten der
Restriktions-Endonuklease Sau3A I (10 ul). Dann erfolgte der Reaktionsumsatz
während 2 Stunden bei 37ºC. Die Reaktionslösung wurde auf ein
3,5% Polyacrylamidgel gegeben und elektrophoretisiert, so daß
ein Gelstück entsprechend einem 800 bp Fragment
(Erythropoietin-cDNA) ausgeschnitten werden konnte. Die DNA wurde aus dem
Gel extrahiert und in 20 ul sterilem Wasser gelöst. Somit
war eine Lösung der Erythropoietin cDNA hergestellt worden.
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Zu 180 ng der Erythropoietin cDNA wurden 330 ng der BamH I
geschnittenen pZIPNeoSV(X)1 DNA gegeben, und es erfolgten die
Fällung mit Ethanol und das Trocknen der DNA. Der
getrockneten DNA wurden 1 ul einer Ligase-Reaktionspuffer-Lösung der
10 · Konzentration, 1 ul 9 mM ATP und 1 ul T&sub4; Ligase (2,4
Einheiten) zugesetzt. Dann erfolgte die Reaktion über Nacht
bei 4ºC. Die Reaktionslösung wurde zweimal mit Phenol und
dreimal mit Ether extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol
gefällt. Die ausgefällte DNA wurde getrocknet und in 10 ul TE
Pufferlösung gelöst. Es war eine DNA Lösung für die
Transformation hergestellt worden. Unter Verwendung von 5 ul der
DNA-Lösung wurden 200 ul kompetenter Zellen von Escherichia
coli DH-1 transformiert.
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Durch das oben beschriebene Verfahren wurden 52 Klone von
Transformanden erhalten, die gegen Ampicillin und Kanamycin
resistent sind. Von diesen wurden 15 Klone durch Kartierung
des Plasmids mit Restriktions-Endonukleasen analysiert, wobei
1 Klon herausgefunden werden konnte, der den gewünschten
Erythropoietin cDNA transformierenden Vektor enthält. Mit diesem
Klon wurde eine Plasmid-Präparation nach gewohnter Manier
vorgenommen, und es wurde der Erythropoietin cDNA
transformierenden Vektor pZIPNeoSV(X)1EPOcDNA gewonnen.
Einführung von Erythropoietin cDNA in BHK21 Zellen
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2 · 10&sup5; BHK21 Zellen wurden in 25 cm² T-Flaschen ausgesät. Am
folgenden Tag wurden sie der Transfektion mit DNA nach der
Calciumphophat-Methode unterworfen. In 50 ul Wasser wurden 25
ug pZIP NeoSV(X)EPOcDNA gelöst, die zuvor mit der
Restriktions-Endonuklease Sal I geschnitten worden waren. Dann wurde
mit 75 ul 2 M Calciumchlorid-Lösung und 525 ul Wasser
gemischt, so daß eine Lösung A hergestellt wurde. Dann wurde
eine Lösung B hergestellt, indem 625 ul 50 mM HEPES,
enthaltend 0,28 mM NaCl (pH 7,1), und 25 ul einer 35 mM NaH&sub2;PO&sub4;/35
mM Na&sub2;HPO&sub4; Puffer-Lösung gemischt wurden. Während Lösung B
heftig gerührt wurde, wurde Lösung A langsam und tropfenweise
zugesetzt, wodurch die DNA mit dem Calciumphosphat gemeinsam
präzipitierte. Das Präzipitat ließ man wachsen, indem es 30
Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde.
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Zu je 4 ml der Kulturmedien (DME-10% CS) der zuvor
hergerichteten BHK21 Zellen wurden 0,3 ml der oben hergestellten DNA-
Calciumphosphat-Lösung gegeben. Die Zellen wurden dann 18
Stunden in einem CO&sub2;-Inkubator inkubiert.
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Die entstandenen Kulturmedien wurden mit 0,6 ml einer 15%
Glycerin enthaltenden PBS-Lösung versetzt und 2 Minuten stehen
gelassen. Die Zellen wurden im Anschluß dreimal mit DME
gewaschen, einzeln mit 4 ml des Kulturmediums von oben versetzt
und wiederum in dem CO&sub2;-Inkubator inkubiert. Ein Tag später
wurden die Kulturmedien gewechselt. Am folgenden Tag wurden
die Zellen getrennt zum Aussäen auf 2 Schalen mit einem
Durchmesser von 9 cm transferiert (1/5 Aufteilung). Am
nächsten Tag wurden die Medien dann ersetzt durch neue Medien,
die 400 ul G418/ml enthielten. Anschließend wurden die Zellen
zwei Wochen lang kultiviert, währenddessen die Kulturmedien
von Zeit zu Zeit gewechselt wurden, so daß gegen G418
resistente Zellen selektiert und nach der Methode der begrenzten
Verdünnung kloniert wurden. Der Vorgang der Klonierung wurde
einmal wiederholt, so daß die Erythropoietin konstitutiv
produzierende Zellinie BXC etabliert wurde. Die von den
Zellinien hergestellten Mengen an Erythropoietin waren nach dem
Verfahren des Radio-Immuno-Assay dieselben 100 Einheiten/10&sup6;
Zellen/Tag.