DE3688418T2

DE3688418T2 - Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen.

Info

Publication number: DE3688418T2
Application number: DE8686901613T
Authority: DE
Inventors: Claire Cofer; Jeffrey FRIEDMAN; Peter Kushner; Karen Talmadge
Original assignee: Scios Nova Inc
Current assignee: Scios LLC
Priority date: 1985-02-13
Filing date: 1986-02-11
Publication date: 1993-08-26
Anticipated expiration: 2006-02-12
Also published as: ES8707564A1; DE3688418D1; ATE89314T1; EP0217822A1; US5089397A; CA1338829C; ES551913A0; EP0217822B1; DK488386A; AU580145B2; AU5513586A; WO1986004920A1; EP0217822A4; DK488386D0

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft die Expression gewünschter Gensequenzen in einem Säugetier-Expressionssystem. Zum Teil betrifft sie ein System, das den menschlichen MetallothioneinII Promoter, Eierstockzellen des chinesischen Hamsters als Wirt (CHO), die auf einem proteinfreien Medium lebensfähig sind, gebraucht, und eine Induktion in Gegenwart eines Induktionsmediators, bei der relativ untoxische Metalle, wie Zinkionen, verwendet werden. Weitere Verbesserungen der auf Säugetierzellen beruhenden Expression Umfassen die Selektion transformierter Wirtszeilen auf Kadmiumresistenz und/oder die Anwendung von Genamplifikationstechniken und umfassen einen Enhancer der mit den Regulationssequenzen für die Genexpression funktionsfähig verknüpft ist.
Das Expressionssystem liefert Genprodukte, die durch eine Vielzahl von DNA-Sequenzen codiert werden. Die Genprodukte sind denjenigen aus natürlichen Quellen ähnlich. Diese Ähnlichkeit zeigt sich am deutlichsten beim menschlichen Wachstumshormons (hGH), beim menschlichen alveolären Lungensurfaktans (hASP) und beim Apolipoproteins AI (apoAI).

Stand der Technik

Die Expression fremder Gensequenzen unter Verwendung von Säugetierwirten ist inzwischen in der Fachwelt wohlbekannt. Säugetier-Expressionssysteme werden oft bevorzugt, weil diese Wirtzellen anders als Bakterien- oder sogar Hefesysteme die Fähigkeit für eine Prozessierung aufweisen, die die Modifizierung von Genprodukten z. B. durch Glykosylierung oder Hydroxylierung gestattet.
Auch hat die Fähigkeit des Säugetiersystems, bestimmte Genprodukte wirksam in das Medium zu sekretieren, eine leichtere Ernte und Reinigung zur Folge. Weil die sekretierten Produkte von anderen Proteinen in dem Medium gereinigt werden müssen, ist es natürlich wünschenswert, Wirte zu verwenden, die in definierten Medien wachsen können - d. h. Medien, die frei von zugesetzten Proteinen sind. Während die meisten Zellinien von Säugetieren Zusätze, wie Serumproteine benötigen, können die Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) in einem definierten, serumfreien und proteinfreien Medium gehalten werden. (Siehe Hamilton, W.G. und Ham, R.G. in Vitro (1977) 13:537-547). CHO-Zellen sind schnell wachsend und auch gut charakterisiert, frei von erkennbaren Gefahren, und sind deshalb, zusätzlich zu ihrer Eigenschaft, serumfrei gehalten werden können, ideale Wirte für rekombinante Proteingewinnung.
Die Expression in Säugetierzellen benötigt natürlich kompatible Kontrollsequenzen. Die am häufigsten verwendete Kontrollsequenz, im besonderen Promotoren, waren virale Promotoren, und zwar am häufigsten der SV40-Promoter (siehe z. B. EP-A 108,667 veröffentlicht am 16. Mai 1984, McCormick et al, Molec Cell Biol (1984) 4:166-172) oder der eigene Promoter des Gens, sofern er kompatibel ist (US-Patent 4,399,216 Axel et al). Im allgemeinen sind solche Promotoren nur wenig zufriedenstellend, da diese nicht durch äußere Einflüsse reguliert werden können. Ohne eine solche Kontrolle können die verknüpften Codesequenzen im Wirtsorganismus zu stark oder zu gering exprimiert werden oder zu einem ungewünschten Zeitpunkt, wobei der Fachmann keine Möglichkeit hat, diese Aspekte bei der Expression zu kontrollieren. Aus diesem Grunde wurden Versuche durchgeführt, säugetierverträgliche Promotoren zu verwenden, die gegenüber einer Kontrolle durch äußere Einflüsse empfindlich sind. Zu diesen Promotoren gehören auch die Metallothionein-Promotoren, welche die natürliche Expression von Metallothioneinproteinen kontrollieren, also Proteine, die Schwermetalle fest binden. Im nativen Zustand werden die Metallothionein-Promotoren sowohl durch Gegenwart von Schwermetallen, wie beispielsweise Kadmium oder Quecksilber, als auch durch Stereoidhormone und damit verwandte Substanzen, wie Dexamethason oder andere Glucocorticoide, induziert. Es war jedoch bislang nicht möglich die Induktion bei Abwesenheit von mit Protein versetzten Medien durchzuführen, wodurch die Verwendung solcher Promotoren auf Bedingungen beschränkt war, bei denen die Reinigung des produzierten Proteins durch die Gegenwart von großen Mengen zugesetzter Verunreinigungen kompliziert ist.
Verschiedene Mitglieder der Familie der Metallothionein- Promotoren wurden zur Kontrolle der Expression in Säugetiersystemen verwendet. Z.B. beschreibt die PCT-Anmeldung WO 84/02534, veröffentlicht am 05. Juli 1984, Hamer et al, die Verwendung eines Mausmetallothionein-I (mMT-I)-Promoters um die Expression von menschlichem Wachstumshormon in C127-Zellen der Mausniere zu kontrollieren (siehe ebenso Pavlakis, G.N. et al, Proc Natl Acad Sci (U.S.A.) (1983) 80:397-401). Brinster et al, Nature (1982) 296:39-42 erhielt eine Thymidinkinaseproduktion an injizierten Mausembryonen unter Kontrolle des Maus-MT-I- Promoters. Karin, M., et al, DNA (1984), 3:319-325, Nature (1984) 308:513-519 haben die vorübergehende Expression unter Kontrolle des Humanmetallothionein-IIA-Systems (hMT-IIA) in NTH-3T3-Zellen untersucht, in dem der hMT-IIa-Promoter mit der Codesequenz von Thymidinkinase unter Bildung eines chimeren hMT-TK-Genes fusioniert wurde und in dem die Expression von TK nach Deletionen in der Promotersequenz aufgezeichnet wurde. Eine Induktion wurde sowohl durch Verwendung des Kadmiumions oder in einigen Fällen durch Dexamethason erhalten und die Lage dieser Regulationsstellen wurde durch Deletionsstudien bestimmt.
Keines dieser beschriebenen Expressionssysteme, einschließlich denjenigen, die irgendeine Form des MT-Promoters verwenden, ermöglichen eine befriedigende Züchtung und Induktion im Wirt um das gewünschte Genprodukt in fortlaufend hoher Ausbeute und in leicht erhältlicher Form zu erhalten, die frei von hinzugesetztem Serum oder anderen Proteinen ist. Das Expressionssystem der vorliegenden Erfindung erlaubt die kontinuierliche Induktion von hohen Expressionsspiegeln in Wirten, die in einem serumfreien Medium gezüchtet werden und ermöglicht so die Produktion hoher Proteinspiegel sowie eine leichte Reinigung der sekretierten Produkte.
Zusätzlich zur Bereitstellung von nichttoxischen Induktions- und Züchtungsbedingungen, die zur Reinigung des gewünschten Proteins vom Medium geeignet sind, ist es auch wünschenswert, das Produktionsniveau dieses Proteins zu erhöhen. Zwei, auch für die vorliegende Erfindung relevante Techniken wurden in der Vergangenheit angewendet um die Proteinproduktion zu erhöhen: Das Einschließen von viralen Enhancern in das Expressionssystem und die Amplifikation des Expressionssystems um die Kopienzahl zu erhöhen.
Enhancer sind cis-wirkende DNA-Elemente, die die Transkription stimulieren. Ihre Aktivität ist von ihrer 5'-3'-Orientierung relativ unabhängig und obwohl zum geringen Ausmaß abhängig von der Position, wirken sie über fange Distanzen bis zu mehreren tausend Nucleotiden hinweg. Enhancer wurden in einer Vielzahl von viralen Genomen identifiziert, sowie in spezialisierten Zellgenen wie solchen, die für die Herstellung von Immunglobulinen verantwortlich sind. Die im folgenden verwendeten Enhancer, die vom Affenvirus SV40 abgeleitet sind, sind bereits bis zum gewissen Grad charakterisiert (Gruss, P. et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1981) 78:943-947; Benoist, C. et al, Nature (1981) 290:304-310; Mathis, D.J. et al, ibid, 310-315). Wasylyk, B. et al, Nucleic Acids Res (1984) 12:5589-5608 zeigte, daß die 72 bp-Wiederholung (repeat), welches als das wesentliche Element des SV40-Enhancers angesehen wird, eine biphasische Abhängigkeit von der Entfernung der Tandem- Conalbumin-Promotoren haben, die an die Codesequenz des frühen T-Antigens legiert sind, die zur Diagnose der Transkriptionsverstärkung verwendet wird. In einigen Aspekten verwendet die vorliegende Erfindung die stimulierende Wirkung von Enhancer- Sequenzen, um die Menge an gebildeten Genprodukten zu erhöhen.
Die Verwendung der Fähigkeit von DHFR zur Selektion von Transformanden und zur Amplifikation der Reaktion auf verschiedene Drogen bzw. Stoffe um die Proteinproduktion durch ein co-transformierendes Expressionssystem zu erhöhen, wird bereits seit mehreren Jahren durchgeführt. Siehe beispielsweise Kaufman, R.J. et al, Mol Cell Biol (1985) 5:1750-1759. Es wird angenommen, daß eine relevant hohe Produktion des gewünschten Genes durch Selektion auf erhöhte Drogen- bzw. Arzneistoffresistenz, die durch Co-Amplifikation des gewünschten Genes zusammen mit DHFR bewirkt wird, deswegen stattfindet, weil das DHFR-Gen und das co-transformierte Gen in nahe zueinanderliegenden Positionen in das Chromosom des Wirtes integriert sind. Darüberhinaus findet eine Amplifikation als Reaktion auf den Arzneistoff bzw. die Droge über weite Entfernungen von annähernd 200 kb hinweg- statt, wodurch das co-transformierende Gen zusammen mit DHFR mittransportiert wird und mehrfache Kopien angefertigt werden.
Das MT-Gen wurde noch nicht auf analoge Weise verwendet. Obwohl es bekannt ist, daß das MT-Gen als Reaktion auf Kadmium amplifiziert wird, dies wurde unter Verwendung des Rinderpapillomvirus (BPV) untersucht, wurde ein selbstreplizierendes transformierendes System und damit die Verwendung dieser Amplifikation zum gleichzeitigen Mit-Amplifizieren eines gewünschten Expressionssystemes bislang noch nicht vorgeschlagen (Karin, M. et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1983) 4040-4044)
Weder das MT-Gen noch irgendein anderes Gen wurden bislang als selektierbares Markergen verwendet, das, wenn es in das Chromosom integriert ist, nicht nur Transformanden erfolgreich identifiziert, sondern auch hohe Expressionsspiegel bewirkt. Kadmium ist dermaßen toxisch, daß nur solche Zellen überleben können, die eine hohe Anzahl an Kadmium-Resistenz verleihenden MT-Genen aufweisen. Zellen, die einen hohen Spiegel der mittransformierten Sequenz exprimieren, korrelieren bezüglich ihrer Resistenz, weil aufgrund der Nähe in den Chromosomen beide Gene durch die lokalen Bedingungen beeinflußt werden, welche die Genexpression begünstigen. In einigen Aspekten wird erfindungsgemäß ein Expressionssystem verwendet, bei dem davon Gebrauch gemacht wird, daß das MT-Gen mit dem Expressionssystem mit- bzw. co-transformiert wird, und zwar entweder um Transformanden zu selektieren, die eine Fähigkeit zur hohen Exprimierung der gewünschten Sequenz aufweisen oder um das MT-Gen und die zu exprimierende Sequenz gleichzeitig zu amplifizieren oder auch beides zusammen.
Die verschiedenen Aspekte der Erfindung zur Verbesserung der Qualität und Quantität der Expression in CHO-Zellwirten wird im folgenden für die Produktion einer Vielfalt von Proteinen veranschaulicht. In einer dieser Veranschaulichungen wird das Gen für menschliches Wachstumshormon verwendet, da dieser Stoff von praktischem Interesse und von therapeutischem Nutzen ist und weil dieser bisher noch nicht nach den vorliegenden Verfahren in natürlicher Form hergestellt worden ist. Rekombinante Herstellung von hGH ergibt, obwohl sie allgemein durchgeführt wird, kein Produkt, welches derjenigen Stoffmischung entspricht, die von der Hypophyse produziert wird. Natives hGH ist eine Mischung, die ca. 10% einer kleineren Form von etwa 20 kD hGH zusätzlich zu ca. 90% der größeren Hauptart von 22 kD enthält. Beide Arten werden durch ein einziges Gen codiert und resultieren aus einer Translation von zwei unterschiedlichen mRNAs, die durch ein verschiedenes Spleisen des zweiten Introns von dem ersten Transkript herrühren (DeNoto et al, Nucleic Acids Res (1981) 9:3719). Die Produktion von hGH unter Verwendung von cDNA (EPA-Anmeldung 108,667 (Supra)) oder die Produktion unter Verwendung einer Kombination von cDNA und Gensequenzen, die jedoch das zweite Intron nicht aufweisen (Hamer, WO84/02534; Pavlakis, Proc Natl Acad Sci (Supra)) ist unter diesem Gesichtspunkt nicht zufriedenstellend, da nur die 22 kD-Form hergestellt wird. Noch weniger zufriedenstellend sind bakteriell produzierte rekombinante hGH-Präparationen (Goeddel, D.V. et al, Nature (1979) 281:544-548; Martial, J.A. et al, Science (1979) 205:602-607) , weil das so hergestellte hGH nicht in das Medium sekretiert wird und weil mindestens ein Hauptteil des so produzierten hGHs als Ergebnis der rekombinanten Konstruktion ein N-terminales Methionin enthält und schließlich auch weil die Wirtzelle unfähig ist, das resultierende Protein in einem "Prozessing" weiterzuverarbeiten.
Signifikante Vorteile, beispielsweise gegenüber bakterieller Expression, werden auch bei hASP festgestellt. Die Isolierung von hASP von einem Patienten mit alveolärer Proteinose ergibt eine Mischung, in der die Hauptspezies ein 32 kD-Protein ist, was zeigt, daß die vermeintliche native Form glycosyliert ist (White, R.T. et al, Nature (1985) 317:316-363). Dies trifft auch auf das Hunde-ASP zu, für das eine ähnliche Heterogenität (28 kD-36 kD) gefunden wird. Menschliches cDNA zeigt ein offenes Leseraster, das 248 Aminosäuren codiert, wobei die Sequenz, die bei Aminosäure 21 beginnt, welche durch diese cDNA codiert wird, der 22 N-terminalen Aminosäure des 32 kD-Proteins entspricht, das aus der Spülflüssigkeit isoliert wird. Die cDNA erlaubt auch die Lokalisierung der Exon-Regionen des Genes. Die cDNA-Sequenz codiert auch eine Anzahl von collagenähnlichen Gly-X-Y-Repeats, die eine Prolingruppe enthalten. Das Auftreten von Hydroxyprolin in den nativen Sequenzen zeigt, daß diese hydroxyliert sind. Die Rekonstruktion von "nativen" ASP benötigt daher zumindest 2 Schritte nach der Translation, die nur in Säugetiersystemen zur Verfügung stehen, nämlich die Hydroxylierung von Prolingruppen und die Glycosylierung.
Apolipoproteine AI und AII, die in Zusammenhang mit Lipiden als Träger im Blutkreislauf aufgefunden werden, werden als Präproproteine codiert und in der "Pro"-Form sekretiert. Das Protein, das mit Phospholipiden assoziiert ist, um die gestapelte Disc-Struktur der Lipoproteinfraktionen zu bilden, ist üblicherweise reifes Protein (Boganouski, D. et al, J Lipid Res (1985) 26:185). Auch in diesem Fall sind Modifikationen nach der Translation, zu denen nur Säugetierzellen fähig sind, wünschenswert um die native funktionelle Form zu erzeugen.
Die vorliegende Erfindung stellt daher nicht nur Präparationen von menschlichem Wachstumshormon bereit, die denen entsprechen, die von der Hypophyse produziert werden, und menschliche ASP- Präparationen, die denjenigen ähnlich sind, die in der Spülflüssigkeit der Lunge gefunden werden und Apolipoproteine, die mit Phospholipiden funktionsfähig assoziiert sind, sondern sie stellt auch Mittel zur wirksamen Herstellung und Isolierung von einem beliebig gewünschten fremden Protein unter günstigen Bedingungen bezüglich hoher Produktionsrate und leichter Reinigung bereit.

Beschreibung der Erfindung

Es wird ein Expressionssystem bereitgestellt, welches die äußere Kontrolle der Expression von fremden Gensequenzen in einem Säugetierwirt gestattet, der zum Prozessierung der Genprodukte fähig ist, um ein Material in hoher Ausbeute zu erhalten, das mit den natürlich hergestellten Substanzen praktisch identisch ist. Die verwendeten Wirtsysteme sind zur Prozessierung der Intronsequenzen fähig, so daß codierende Geneinheiten direkt verwendet werden können. Sie sind auch zur Glycosylierung, Hydroxylierung, "Pro"-Sequenzspaltung oder einer anderen Proteinmodifizierung nach der Translation fähig sowie zur Prozessierung von normalerweise assoziierten Signalsequenzen, so daß, sofern gewünscht, diese Stoffe direkt in das Medium sekretiert werden können, und zwar unter Bedingungen, in denen das Medium im wesentlichen frei von kontaminierendem Protein ist. Die Kontrollsequenzen reagieren auf Induktoren von geringer Toxizität in Gegenwart nichtproteininduzierender Mediatoren. Darüberhinaus ist das Expressionssystem bei einigen Ausführungen auch zur Selektion auf hohe Expression und zur Amplifikation fähig und kann mit Enhancern weiter modifiziert werden um die Produktionsspiegel zu erhöhen. Das erfindungsgemäße Expressionssystem stellt daher einen Wirt bereit, der zum Prozessing nach der Translation, zur Kontrolle der Expression, zur Expression bei hohen Spiegeln fähig ist und bei dem das gebildete Protein leicht gereinigt werden kann. Diese Kombination aller oder auch nur einiger dieser Vorteile sind mit dem bislang bekannten Expressionssystemen nicht möglich.
Die vorliegende Erfindung stellt daher ein Verfahren bereit mit dem eine gewünschte Codesequenz in einer Kultur von Säugetierwirtszellen exprimiert werden kann, wobei die Säugetierwirtszellen in dieser Kultur mit einer DNA-Sequenz transformiert wurden, die den Metallothionein-II (MT-II)-Promoter enthält, der mit der gewünschten Codesequenz in funktionsfähiger Weise verknüpft ist und in dem diese Kultur frei von Serum ist, wobei die Methode die Induktion dieser Zellen mit einer wirksamen Menge eines Induktionsmediators und einer wirksamen Menge eines nichttoxischen Metallions umfaßt. Die Säugetierwirtszellen können CHO-Zellen sein. Ggfs. enthält die DNA-Sequenz darüberhinaus einen funktionsfähig verknüpften Enhancer, der den Produktionsspiegel erhöht und/oder ein Resistenz-verleihendes Gen, das die Amplifizierung dieser gesamten DNA-Sequenz bewirkt.
Das erfindungsgemäß Verfahren kann dazu verwendet werden, rekombinante Zellen zu selektionieren, die zur Expression von hohen Spiegeln und zur Amplifizierung des gewünschten Expressionssystems fähig sind, indem von einer Co-Transformation mit einer zweiten DNA-Sequenz Gebrauch gemacht wird, die zur Expression des MT-Proteins fähig ist. Solche co-transformierten Zellen können einer Behandlung mit Schwermetallionen unterzogen werden und die auf Schwermetallionenresistenz, beispielsweise gegen Kadmium, selektioniert werden können. Zellen, die zur Resistenz gegenüber Schwermetallionen ausgewählt werden, können ein solches System in serumfreiem Medium ohne Zugabe eines Induktionsmediators exprimieren.
Die Erfindung findet bei der Produktion von Proteinen Anwendung, die ihren nativen funktionellen Formen entsprechen. Im besonderen umfassen diese Proteine menschliches Wachstumshormon, das in einer Form rekombinant produziert wird, welche die Form nachahmt, die nativ von der Hypophyse erhalten wird, hASP, das genauso hydroxyliert wird, wie dasjenige, das aus dem Waschfluid erhalten wird, Apolipoproteine z. B. AT und All, die in reifer Form frei von Prosequenzen erhalten werden, atrionatriuretischer Faktor, Erythropoietin und Renin. Diese und andere Präparate, die mit den nativen Proteinen übereinstimmen, können unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt werden.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die Herstellung von menschlichem Wachstumshormon durch CBT-37-Zellen in Abhängigkeit von der Zeit bei verschiedenen induzierenden Zink-Ion-Spiegeln.
Fig. 2 zeigt die Konstruktion von pHS1, einem Wirtsexpressionsvektor, der die Insertion einer Code-Sequenz unter Kontrolle des hMT-II-Promoters und 2 zusätzlichen Wirtsvektoren ermöglicht: pHS1-MT, der ein exprimierbares Metallothioneingen zur Amplifikation enthält und pHS1-SV40, welches einen in wirksamer Weise ligierten SV40-Enhancer enthält.
Fig. 3 zeigt die Konstruktion von pMT-hGH, eines Expressionsplasmides für menschliches Wachstumshormon und des korrespondierenden Expressionsvektors, der das exprimierbare Metallothioneingen (phGH-MT) und den SV40-Enhancer (phGH-SV40) enthält.
Fig. 4 ist die davon abgeleitete Aminosäuresequenz einer Konstruktion umfassend die Gensequenz, die menschliches alveoläres Surfaktansprotein (hASP) codiert.
Fig. 5 zeigt die DNA-Sequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz für eine Konstruktion umfassend die hASP- codierende cDNA.
Fig. 6 zeigt das Insert, das hASP enthält und das die Sequenzen codiert, die zum Erhalten von pASPcg-SV(10) verwendet werden.
Fig. 7 zeigt die Sequenz des Genes, das menschlichen atrialen natriuretischen Faktor (hANF) codiert.
Fig. 8 zeigt die Konstruktion des modifizierten Epogenes.
Fig. 9 zeigt die DNA-Sequenz, die Präprorenin codiert.
Fig. 10 zeigt die Verteilung der Fähigkeit zur hGH-Produktion von verschiedenen Kolonien, die aus Pools von mit pMT-hGH, phGH-MT und phGH-SV40 transformierten CHO-Zellen abgeleitet sind.
Fig. 11 zeigt die Ergebnisse einer Gelelektrophorese auf Polyacrylamid mit radiomarkierten Proteinen, die von CBI-25 und CBI-37 sekretiert wurden.
Fig. 12 zeigt einen Vergleich von SDS-PAGE von Hypophysensekretiertem hGH mit hGH-Präparationen aus CBT-37-Zellen.
Fig. 13 zeigt die mit SDS-Gel erhaltenen Ergebnisse für Endo-F behandelte und unbehandelte Überstände von dem ASP- produzierenden Transformanden A-38.
Fig. 14 zeigt die Ergebnisse auf SDS-Gel für Endo-F behandelte und unbehandelte Überstände des ASP-produzierenden Transformanden D-4.
Fig. 15 zeigt ein Polyacrylamidgel von Extrakten von CHO- Zellen, die mit verschiedenen Apolipoprotein AI- (ApoAI) Expressionsvektoren transformiert sind.
Fig. 16 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme des Komplexes der aus apoAI von Transformanden und endogenem Lipid gebildet wird.
Fig. 17 ist eine elektronenmikroskopische Aufnahme des Komplexes der aus apoAI von Transformanden und Phosphatidylcholin gebildet wird.
Fig. 18 zeigt ein SDS-Gel von CHO und AtT-20 pMT-PPPRen transfektierten Zellüberständen.

Verschiedene Modi zur Durchführung der Erfindung

A. Definitionen

Im folgenden bedeutet "funktionsfähig verknüpft (ligiert)" eine derartige Nebeneinanderstellung, daß die normalen Funktionen der funktionsfähig verknüpften Materialien durchgeführt werden können. D.h., daß ein Promoter, der "funktionsfähig mit einer Code-Sequenz verknüpft ist", sich auf eine Konfiguration bezieht, in der die Code-Sequenz unter Kontrolle des Promoters in einem kompatiblen Wirt exprimiert wird.
"Expressionssystem" bezieht sich auf eine Sammlung bzw. Kollektion von Komponenten, die im folgenden angegeben sind und die folgendes umfassen können: nur eine Code-Sequenz, die funktionsfähig mit Kontrollsequenzen verknüpft ist, auf die Sequenzen, die darüberhinaus mit einem Enhancer verknüpft sind, auf einen Vektor, der solche enthält, auf Zellen, die mit dem Vektor transformiert sind oder auf Kulturen, die solche Transformanden einschließlich Mediumkomponenten enthalten.
"Definiertes Medium" bezieht sich auf ein Kulturmedium, das keine Protein enthaltende Ergänzungsstoffe bzw. Zusätze enthält; die meisten Säugetierzellkulturen benötigen solche Zusatz- oder Ergänzungsstoffe. Üblicherweise werden Serumpräparationen wie Kalbsfötenserum in einer Größenordnung von 10% eingesetzt.
"Induktionsmediator" ist ein Stoff, der zusätzlich zu dem Metallion, das den MT-Promoter induziert, zugesetzt wird, dessen Gegenwart es erlaubt, daß diese Induktion in dem definierten Medium abläuft. Im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Expressionssystem wurde gefunden, daß Eisen (Ion) in einer Konzentration von 1-3·10&supmin;&sup5; M oder Transferrin bei 5 um/ml oder mehr als Induktionsmediatoren wirken. Eisenionen werden am einfachsten als Eisen (II) bereitgestellt, da Eisen (III) dazu neigt, auszufallen. Eisen (III) kann auch als Induktionsmediator wirken. Obwohl Transferrin ein Eisen enthaltendes Protein ist, sind die Mengen, die benötigt werden um als Induktionsmediator zu wirken, wesentlich geringer als die Mengen, die als Proteinzusätze verwendet werden. Sie stören daher nicht bei der Reinigung und werden nicht als ein "Proteinzusatz" angesehen, was zur Folge hätte, daß das Medium kein "definiertes" Medium mehr ist. Darüberhinaus muß es nicht eher zugesetzt werden als bis die Induktion eingeleitet wird.
"Menschlicher Metallothionein-II"-Promoter (hMT-II) bezieht sich auf Kontrollsequenzen, die von menschlichem MT-II-Gen abgeleitet sind oder auf ihre funktionellen Äquivalente. Die Kontrollsequenzen dieses Genes sind detailliert in Karin, M. et al, Nature (1982) 299:797-802 beschrieben.
"Wirtszellen", "Transformandenzellen", "Zellkulturen", "Zelllinien" usw. werden hierbei synonym verwendet was sich aus dem Zusammenhang ergibt. Wirtszellen, die zur rekombinanten Transformation geeignet sind, sind Zellen, die bereits neue DNA- Sequenzen, üblicherweise in Form von Plasmiden einschließlich anderer transferierbarer DNA-Formen, erhalten haben oder die solche Sequenzen erhalten sollen. Dementsprechend beziehen sich diese Ausdrücke nicht nur auf die unmittelbaren Empfängerzellen sondern auch auf deren Nachkommen. Der Begriff Nachkommen oder Tochterzellen umfaßt die durch Zellteilung entstandenen Zellen ebenso, wie solche, die durch andere reproduktive Mechanismen erhalten werden. Nachkommen oder Tochterzellen umfassen Zellen, die einen im wesentlichen identischen Gehalt an DNA-Sequenz enthalten sowie solche in denen die DNA durch zufällige oder gewollte Mutation verändert wurde. Solche Mutationen können im Verlauf der Produktion von Nachkommen entstehen. Jegliche Nachkommenschaft, welche die Funktionalität des ursprünglichen Transformanden aufrechterhält, was üblicherweise die Fähigkeit bedeutet ein spezifisches gewünschtes Protein zu produzieren, wird von dieser Definition umfaßt.
Zellen aus "Ovarien des chinesischen Hamsters" (CHO-Zellen) umfassen die Standardlinie ATCC CCL-61 und dessen verwandte Zellinien, die aus der gleichen Gewebsquelle erhalten werden sowie Derivate davon. Derivate sind Mutanten der Zellinie, die sich genotypisch oder auch phänotypisch von der ursprünglichen Zellinie unterscheiden, die jedoch aus dieser durch zufällige oder gewollte Mutationen erhältlich sind. Auf ähnliche Weise umfassen AtT-20-Zellen die ATCC-Zellinie CCL-89 sowie dessen Verwandte und Abkömmlinge wie zuvor beschrieben.
"Erhalten von" oder "abgeleitet von" bedeutet, wenn es sich auf beispielsweise DNA- oder Proteinsequenzen bezieht, eine Ahnlichkeit in Struktur und nicht notwendigerweise eine physikalische Darstellung.
"Amplifizierbares Toxin-Resistenz verleihendes Gen" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die (in geeigneten Wirten) zur Produktion eines Proteins fähig ist, das dem Wirt eine Resistenz gegen ein sonst toxisches Element verleiht, das in die Umgebung des Wirtes gebracht wird, wobei das Gen in Gegenwart dieses toxischen Elementes in multiplen Kopien hergestellt werden kann.
"Toxin" bezeichnet jegliches Material welches bei den zugeführten Konzentrationen für den Wirt schädlich :ist. Geeignete beispielhafte Toxine sind Arzneistoffe wie Methotrexat, gegenüber welchem DHFR Resistenz verleiht und Cd&spplus;² gegenüber welchem das MT-Protein Resistenz verleiht. Sowohl die DHFR als auch die MT-Gene können auf das geeignete Toxin durch Amplifizierung, d. h. die Bildung mehrfacher Kopien, reagieren.

B. Allgemeine Beschreibung

Die vorliegende Erfindung bietet eine wesentliche Verbesserung bei der rekombinanten Proteinherstellung durch die Verbindung von besonders vorteilhaften Bedingungen zur Expression in Säugetierzellen. Die Metallothionein-II-Kontrollsequenzen werden vorzugsweise wegen ihrer Fähigkeit verwendet, durch Zinkionen induzierbar zu sein, im Gegensatz zu der Quecksilber- oder Kadmiumioneninduktion, die für MT-I benötigt wird. Die letzteren Metalle sind gegenüber Zellen wesentlich stärker toxisch und erlauben daher keine Feinregulation der Expression, die auf eine Regulation der Konzentration des induzierenden Ions beruhen. Zusätzlich zu der weiter hinten dargestellten hMT-II-Sequenz können auch MT-II-Kontrollsequenzen verwendet werden, die aus anderen Säugetierarten isoliert wurden. Während hMT-II bevorzugt ist, so ist MT-II aus anderen Quellen, wie Rind, Pferd, Affe, Hamster, Schwein oder Maus in zufriedenstellender Weise ausreichend. Die MT-II-Gene von Maus, Hamster und Affen wurden bereits isoliert. Siehe z. B. Searle, P.F. et al, Mol and Cell Biol (1974) 4:1221-1230.
In dem erfindungsgemäßen Expressionssystem werden diese Kontrollsequenzen in Zellen verwendet, die in einem definierten Medium gehalten werden. Ein integrales Merkmal des Systems ist die Zugabe von 1-3·10&supmin;&sup5; M Eisensalze oder von 5 um/ml oder mehr Transferrin zum definierten Medium als Induktionsmediator. Diese Zusätze ermöglichen die Induktion der Kontrollsequenzen unter den definierten Bedingungen des Mediums. Die Verwendung eines definierten Mediums ist ein außergewöhnlicher Vorteil bei der Herstellung des gewünschten Proteins, weil dadurch Kulturbedingungen erhalten werden, in denen das Medium keine äußerlich zugesetzten Proteine enthält wie sie gewöhnlicherweise durch das Serum bereitgestellt werden, wodurch das gewünschte Protein in eine nichtverunreinigte Umgebung freigesetzt werden kann.
Ein geeigneter Wirtsexpressionsvektor als Komponente im Expressionssystem enthält Restriktionsstellen stromabwärts von den MT-Kontrollsequenzen, um die Insertion einer gewünschten Code-Sequenz zu ermöglichen. Ein solcher Vektor, der weiter als pHS1 beschrieben wird, enthält Replikationsstellen, die in Bakterien handhabbar sind um die Amplifikation des Wirtsvektors und der eingeschobenen Code-Sequenzfragmente zu ermöglichen. Die Code-Sequenzen, die in Restriktionsstellen ligiert werden, können entweder cDNA-Sequenzen oder Genfragmente sein, welche Introns enthalten, wenn die resultierenden Vektoren mit Wirten, kompatibel sind, die zur Prozessierung der Introns fähig sind.
Zusätzliche Verbesserungen können dadurch dem Expressionssystem verliehen werden, daß ein Enhancer und/oder ein Toxin-Resistenz verleihendes Gen in funktionsfähiger Weise einligiert wird, mittels welchem auf wirksame Expression selektioniert werden kann und welches die Amplifizierung der assoziierten Sequenzen stimulieren kann.
Enhancer wirken in einem "Cis"-Mechanismus und müssen daher auf der gleichen DNA vorliegen wie der verbleibende Teil des Expressionssystems. Es kann jede Enhancersequenz von viralem Ursprung oder von spezialisierten Zellen höherer Organismen verwendet werden. Es wurden bereits virale Enhancer beschrieben, die von retroviralen langen terminalen Repeats, Polyoma-Viren, Bk-Viren und Adeno-Viren sowie von SV40 abgeleitet sind, wie weiter unten beschrieben ist. Verschiedene spezialisierte zelluläre Expressionssysteme, wie beispielsweise dasjenige für Ovalbumin und Immunglobuline, können ebenfalls Enhancer-Sequenzen enthalten. Diese Enhancer scheinen ihre am stärksten ausgeprägten Wirkungen auf relativ schwache Promotoren auszuüben und ihre Fähigkeit auf die durch den starken MT-II-Promoter kontrollierte Expression einzuwirken, ist überraschend. Im erfindungsgemäßen System wird die Enhancer- Sequenz derart verwendet, daß sie innerhalb mehrerer kB des Promoters, der die Expression der gewünschten Code-Sequenz reguliert, ligiert und in irgendeiner der möglichen Orientierung dazu angeordnet ist. Bevorzugte Orientierungen und Abstände für den SV40-Enhancer sind weiter unten im Zusammenhang mit dem dargestellten Systemen beschrieben. Diese bevorzugten Orientierungen sind variabel und abhängig vom Enhancer und dem ausgewählten reguliertem System. Es wird angenommen, daß für die meisten Systeme der SV40-Enhancer am günstigsten 250-400 bp stromaufwärts vom Anfang der Transkription lokalisiert ist.
Gene, die Resistenz gegenüber Toxinen verleihen, können zur Selektion von Transformanden verwendet werden, die eine effektive Expression von fremder transformierter DNA bewirken. Die DNA des Expressionssystems für ein gewünschtes Protein kann natürlich mit dem Resistenzgen dadurch assoziiert sein, daß es in den gleichen Transfervektor ligiert wird. Dies ist jedoch nicht in allen Fällen nötig. Da beim Transformieren DNA, selbst von multiplen Vektoren, oft in das Genom seines Säugetierwirts hineinintegriert wird, um diese in proximale Position zu bringen, können selbst Resistenzgene auf co-transformierten Plasmiden verwendet werden, um auf erhöhte Expression des gewünschten Genes zu selektionieren. Tatsächlich ist bei Zellen, die mit modifizierten pHSl-Vektoren transformiert sind, eine Integration notwendig, da der Vektor in Säugetierwirten sich nicht selbst repliziert. Es kann jedes Toxin-Resistenz verleihendes Gen verwendet werden, wie die Gene die DHFR oder MT codieren. Das bevorzugte Resistenzgen im vorliegenden verbesserten Expressionssystem ist das Metallothioneingen, das Resistenz gegenüber den toxischen Wirkungen von Schwermetallen, wie Kadmium verleiht. Beim Auswählen von Transformanden in einem Medium, das geringe Konzentrationen von Kadmium enthält, d. h. bis zu etwa 5 uM, können individuelle Clone selektioniert werden, welche die benötigte Resistenz gegenüber dieser Toxinkonzentration erworben haben und zwar vermutlich durch die Synthese von multiplen Kopien des MT-Genes, auf alle Fälle jedoch durch eine effektivere Produktion des Metallthioneinproteins. In solchen Clonen gibt es eine hohe Wahrscheinlichkeit, daß mit-transformierte Sequenzen ebenfalls amplifiziert wurden oder sich darüberhinaus in einer zur Expression günstigeren Umgebung befinden und dadurch eine erhöhte Fähigkeit aufweisen, die durch diese Sequenzen codierten Proteine zu produzieren. Die Zellinien, die auf dieser Basis, wie weiter unten veranschaulicht, selektioniert wurden, scheinen die Toxin-Resistenz auch bei späterer Abwesenheit des Selektionsdruckes beizubehalten.
Verschiedene Resistenz verleihende Gene, einschließlich des MT-Genes, reagieren auf die Gegenwart des Toxins mit der mehrfachen Bildung von Kopien und zwar sowohl von sich selbst als auch von der assoziierten DNA. Daher wird zusätzlich zur Verwendung von MT-Sequenzen zur Selektion auch ihre Fähigkeit ausgenützt, in den selektionierten Zellen eine Genamplifikation zu erreichen. Dieses Verfahren, das beispielsweise in Kaufman et al (Supra) aufgeführt ist, besteht in einem verlängerten Züchten in Subkultur bei zunehmend höheren Konzentrationen des toxischen Agens um progressiv ein höheres Niveau der Anzahl von Genkopien zu erhalten. Aufgrund der Assoziation zwischen dem MT-Gen und dem gewünschten Expressionssystem in den Transformanden, werden durch Verwendung dieser Technik mehrfache Kopien des Expressionssystems erhalten.
Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren werden in die Wirtszellen transformiert, die auf einem definierten Medium erhalten werden können, obwohl sie auch in Gegenwart eines Serums gezüchtet werden können. Geeignete Zellen umfassen CHO-Zellen und ihre Derivate, obwohl jede beliebige Zellinie verwendet werden kann, die in einem solchen serumfreien Medium gehalten werden. Die Transformation kann unter Verwendung eines cotransformierten Antibiotika-resistenten Markerplasmids durchgeführt werden, entweder mit oder anstatt des amplifizierbaren Toxin-Resistenz verleihenden Genes, das ebenfalls als Marker für die gesuchten gleichzeitig selektionierten höher exprimierenden Zellen verwendet werden kann. In den folgenden Darstellungen beruht die Replikation in dem Wirt auf einer Integration der geeigneten Sequenzen im Wirtsgenom; es können jedoch auch selbstreplizierende Vektoren verwendet werden.
Die transformierten Zellen werden entweder auf cotransformierte Antibiotika-Resistenz oder auf Toxin-Resistenz selektioniert, die durch ein co-transformierendes, amplifizierbares, Toxin-Resistenz verleihendes Gen erzeugt wird oder auch auf beides gleichzeitig. Die selektionierten Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und dieses Wachstumsmedium kann, sofern gewünscht, vor der Induktion Serum oder andere Proteinzusätze enthalten. (Wenn ein amplifizierbares Resistenz verleihendes Gen in das System eingeschleust wird, können die transformierten Zellen ebenfalls dadurch zu einer höheren Anzahl von Kopien amplifiziert werden, in dem man die Transformanden, wie zuvor beschrieben, bei zunehmenden Konzentrationen des Toxins züchtet.) Da die Induktion des MT-II- Promoters kontrollierbar ist, kann und wird das Medium während der Induktion gegen ein definiertes Medium ausgetauscht. Dadurch wird ein effizientes Wachstum ermöglicht, wobei gleichzeitig die Vorteile für eine vereinfachte Reinigung des ausgeschiedenen Proteins beibehalten werden.
Es ist natürlich möglich, die Zellen direkt in dem Medium dadurch zu induzieren, daß diese unter Verwendung von Zinkionen in einem Konzentrationsbereich von annähernd 1-5·10&supmin;&sup4; M gezüchtet werden. (Dieser Konzentrationsbereich hat keine definierten Grenzen, jedoch sind Mengen in den zuvor genannten willkürlich gesetzten Grenzen anwendbar, wobei offensichtlich ein Optimum bei einer Konzentration von 3·10&supmin;&sup4; M Zinkionen liegt.) Eine solche direkte Induktion ist jedoch unter Berücksichtigung der nachfolgenden Proteinreinigung nachteilig, und es ist daher bevorzugt, das Serum enthaltende Medium gegen ein Basismedium auszutauschen, das keinen Proteinzusatz enthält.
In dem bevorzugten Verfahren, das für die vorliegende Erfindung charakteristisch ist, wird dieser Mediumaustausch durchgeführt. Das induzierende Zinkion (in einem Bereich von etwa 2·10&supmin;&sup5;- 2·10&supmin;&sup4; M) wird zusammen mit einem Induktionsmediator zugesetzt, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Eisenionen und Transferrin, einem Eisen enthaltenden Protein. Wenn der Induktionsmediator Transferrin ist, sollte die zugesetzte Menge etwa 5 ug/ml betragen. Es können auch höhere Mengen verwendet werden, diese sind jedoch nachteilig, da sie dem Medium Verunreinigungen zufügen, wenn die Proteinreinigung durchgeführt wird. Die Menge von benötigten Eisenionen, vorzugsweise als Eisen (II), liegt zwischen 1-3·10&supmin;&sup5; M Eisen. Das Basismedium selbst enthält ungefähr 3·10&supmin;&sup6; M Eisen. Dies ist jedoch nicht ausreichend um eine Induktion in Abwesenheit von Serum zu ermöglichen. Höhere Eisenkonzentrationen von etwa 3·10&supmin;&sup5; M führen bei dem pH, bei dem die Zellen gezüchtet werden, zu einem Ausfallen des Eisen. Transformation mit dem MT-Genen und anschließende Selektion mittels Resistenz gegenüber Schwermetallen führt zu Kulturen, die keine Zugabe eines Induktionsmediators benötigen.
Geeignete Daten, welche die zweckmäßigen Bereiche der Zinkionenkonzentration angeben, sind in Fig. 1 dargestellt, worin die Wirkung von verschiedenen Konzentrationshöhen auf die hGH-Produktion gemäß der Beschreibung des folgenden Beispieles D. 5. a veranschaulichen.
Nach Induktion wird die gewünschte Code-Sequenz unter Kontrolle des MT-II-Promoters in Mengen exprimiert, die der Anzahl der Kopien entspricht und wenn diese mit einer geeigneten "Leader"-Sequenz versehen sind, die mit der reifen Protein-Sequenz in Säugetierzellen funktioniert, wird dies in das Medium sekretiert. Obwohl es möglich ist, die Proteine innerhalb der zellulären Umgebung mit dem erfindungsgemäßen Expressionssystem zu produzieren, ist dies jedoch nicht besonders günstig, und es wird daher üblicherweise die "Leader"-Sequenz, die üblicherweise mit den meisten sekretierten Säugetierproteinen assoziiert ist, in die gewünschte Code-Sequenz miteingeschleust. Während cDNA-Sequenzen ebenfalls in den Expressionssystemen verwendet werden können, ist die Fähigkeit dieses Wirts, Gen-Sequenzen zu verwenden, die Introns enthalten, von Vorteil und kann manchmal sogar von besonderer Bedeutung sein, wenn die Produktion von Proteinen ermöglicht werden soll, welche die natürlich produzierten Proteine nachahmen.
Jegliche gewünschte Code-Sequenz kann auf diese Weise unter Verwendung des erfindungsgemäßen Systems exprimiert werden. Nativ sekretierte Proteine, die ihre nativen "Leader"-Sequenzen enthalten, können produziert werden um die Sekretion der rekombinanten Form zu bewirken. Es können jedoch auch Proteine erzeugt werden, die üblicherweise nicht sekretiert werden, wenn Rekombinationstechniken mit "Leader"-Sequenzen verwendet werden, die mit Säugetierzellen und mit ihren eigenen Aminosäuresequenzen kompatibel sind oder diese können auch intrazellulär produziert werden.
Beispiele von Proteinen, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt werden können, sind Hormone, wie das menschliche Wachstumshormon oder andere Säugetierwachstumshormone, Insulin, Auriculin und dergleichen, die zur Korrektur von Stoffwechseldefekten verwendbar sind, virale Proteine, wie diejenigen, die die Capsidproteine für Hepatitis oder des Maul- und Klausenseuche-Virus codieren und die zur Herstellung von Impfstoffen verwendbar sind, Lymphokine, wie Lymphotoxin, die Interleukine oder die Interferone, die in der Therapie verwendbar sind oder andere vielzählige Proteine wie Urokinase, Gewebsplasminogenaktivato oder das alveoläre Surfaktansprotein, das bei der Behandlung von besonderen Zuständen verwendbar ist.
Das Vorgenannte dient selbstverständlich lediglich der Veranschaulichung und ist nur eine partielle Auflistung. Die Code- Sequenz für irgendein gewünschtes Protein ist auf das erfindungsgemäße System anwendbar.

C. Standardverfahren

Die Methoden zum Erhalten von Code-Sequenzen von cDNA oder Genbanken sind dem Fachmann allgemein bekannt und Details sind aus Standardquellen erhältlich. Diese Techniken werden dazu verwendet, die gewünschten Code-Sequenzen zur Insertion in die erfindungsgemäßen Vektoren zu erhalten. Darüberhinaus wurden bereits viele gewünschte Code-Sequenzen cloniert oder entweder durch Oligonucleotid-Synthesetechniken oder von existierenden Vektoren erhalten. Für solche Sequenzen, die nicht auf diese Weise erhältlich sind, können die Verfahren von πs C.1 und C.2 verwendet werden.

C.1. Gewinnung von cDNA oder einer Genbank

Menschliche Genbanken werden in Lamda-Phagen auf bekannte Art und Weise konstruiert. Siehe zum Beispiel Maniatis, T. et al Cell (1978) 15:687-701. Wahlweise kann auch doppelsträngige cDNA aus unter Verwendung von herkömmlichen Techniken isolierter mRNA synthetisiert werden und zur Insertion in einen Plasmidvektor, wie pBR322, mittels homopolyinerem Tailing, das durch Terminale Transferase aus dem Kalbsthymus vermittelt wird, hergerichtet werden (Sutcliffe, J. G., Nucleic Acid Res (1978) 5-2721-2732. Zuerst wird ei.ne Primärstrang cDNA durch die RNA-abhängige DNA-Polymerase von Affenmyeloblastosis-Virus dadurch synthetisiert, daß mit Oligo (dT) 12-18 auf 5 ug RNA geprimed wird. Die RNA-Matrize wird dann von dem frisch gebildeten DNA-Strang dadurch freigesetzt, daß bei 100ºC für 5 Min. denaturiert wird, gefolgt von einem Abschrecken auf Eis. Der zweite DNA-Strang wird dann unter Verwendung des großen Fragmentes der DNA-Polvmerase I von E. coli. synthetisiert, was auf dem Selbstprimen am 3'-Ende des Erststrangmoleküls beruht, wobei eine Doppelstranghaarnadel DNA entsteht. Diese Moleküle enden an ihren offenen Termini stumpf und die Haarnadelschleife wird mittels S1-Nuclease von Aspergillus oryzae gespalten. Die Verdauung der doppelsträngigen cDNA mit S1-Nuclease findet in 300 mM NaCl, 30 mM NaOAc, pH 4,5, 3 mM ZnCl&sub2; für 30 Min. bei 37ºC mit 600 Units des Enzyms statt. Die cDNA wird mit Phenol:Chloroform extrahiert und kleine Oligonucleotide werden mittels dreimaligem Ausfällen durch Ethanol in Gegenwart von Ammoniumacetat entfernt. Dies wird wie folgt durchgeführt: ein halbes Volumen von 7,5 M Ammoniumacetat und zwei Volumen Ethanol werden der cDNA-Lösung zugesetzt, die dann bei -70ºC ausgefällt wird. Die stumpfendige Doppelstrang-cDNA wird dann durch Gelfiltration mittels einer Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) Säule (0,3·14 cm) fraktioniert oder sie wird durch Ultrazentrifugation in einem 5-20%igen Glyceringradient, gefolgt von einer Fraktionierung des Gradienten, abgetrennt. cDNA, die größer ist als die gewünschte Länge, d. h. 300 Basenpaare, wird zurückgehalten und durch Ausfällen mit 70%igem Ethanol wiedergewonnen. Kurze (10-30 Nucleotide) polymere Schwänze von Deoxycytosin werden an die 3'-Enden von cDNA unter Verwendung eines Reaktionsmediums addiert, das 0,2 M Kaliumcacodylat, 25 mM Tris, pH 6,9, 2 mM Dithiothreitol, 0,5 mM CaCl&sub2;, 200 mM cDTP, 400 pm/ml BSA und 40 Units Kalbsthymus Terminale-Deoxynucleotid-Transferase für 5 Min. bei 22ºC. Die Reaktionslösung wird mit Phenol:Chloroform extrahiert und kleine Oligonucleotide werden mit dreimaligem Ausfällen mit Ethanol in Gegenwart von Ammoniumacetat entfernt.
Die mit einem Schwanz versehene cDNA wird mit einem Wirtsvektor, wie pBR322, verknüpft, der zuvor mit beispielsweise PstI gespalten und einem Tailing mit Oligo dG unterzogen wurde. In einer funktionsfähigen Ausführung werden 2,5 ug pBR322-dG DNA mit der cDNA bei einer Vektorkonzentration von 5 ug/ml verbunden und die Hybride werden in E. coli. MC1061 mittels CaCl&sub2;-Behandlung eingeschleust, wie bei Casadaban, M. et al, Mol Biol (1980) 138:179-207 beschrieben.

C.2. Verwenden von cDNA oder Genbanken als Sonde

cDNA oder Genbanken werden unter Verwendung des Koloniehybridisationsverfahrens gescreent. Jede Mikrotiterplatte wird auf doppelten Nitrozellulosefilterpapieren (S & S Typ BA-85) repliziert und die Kolonien läßt man bei 37ºC 14-16 Std. lang auf L Agar wachsen, das 15 ug/ml Tetracyclin enthält. Die Kolonien werden mit 10% SDS lysiert und die DNA an dem Filter mittels sequenzieller Behandlung für 15 Min. mit 500 mM NaOH/1,5 M NaCl fixiert und dann mit 0,5 M Tris HCl(pH 8,0) 1,5 M NaCl gefolgt von 2·Standard Salzcitrat (SSC) behandelt. Die Filter werden luftgetrocknet und 2 Std. lang bei 80ºC gebacken.
Für nick-translatierte Proben werden die doppelten Filter bei 42ºC 16-18 Std. lang pro Filter mit 10 ml eines DNA- Hybridisierungspuffers prähybridisiert (50% Formamid (40% Formamid bei verringerter Härte), 5·SSC, pH 7,0, 5·Denhardts's Lösung (Polyvinylpyrrolidon, Plus Ficoll und Rinderserumalbumin, 1· = 0,02% von jedem), 50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0, 0,2% SDS, 50 ug/ml Hefe tRNA und 50 ug/ml denaturiertem und einer Scherung unterzogenem Lachssperma DNA).
Proben werden mit nick-translatierten DNA-Sonden für homologe Arten bei 42ºC 12-36 Std. hybridisiert und bei 37ºC für heterologe Arten, die in 5 ml dieses gleichen DNA- Hybridisationspuffers enthalten sind. Die Filter werden 2·30 Min. lang jeweils bei 50ºC gewaschen und zwar in 0,2·SSC, 0,1% SDS für die Hybridisation von homologen Arten und bei 50ºC in 3·SSC, 0,1% SDS zur Hybridisation von heterologen Arten. Die Filter werden an Luft getrocknet und bei -70ºC 1-3 Tage lang einer Autoradiographie unterworfen.
Für synthetische (15-30 gliedrige) Oligonucleotidproben werden die doppelten bzw. Duplikatfilter 2-8 Std. bei 42ºC prähybridisiert und zwar pro Filter mit 10 ml eines Oligo- Hybridisationspuffers (6·SSC, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 5·Denhardt's, 0,05% Natriumpyrophosphat und 5 um/ml denaturierte und gescherte Lachssperma DNA).
Die Proben werden mit Kinase behandelten Oligonucleotidsonden von 15-30 Nucleotiden unter Bedingungen hybridisiert, die von der Zusammensetzung der Oligonucleotide abhängen. Typische Bedingungen umfassen eine Temperatur von 30-42ºC für 24-36 Std. pro Filter, mit 5 ml der den gleichen Oligohybridisationspuffer enthaltenden Sonde. Die Filter werden 2·15 Min. lang bei 23ºC gewaschen und zwar jedesmal mit 6·SSC, 0,1% SDS und 50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7 und dann 1· für 2 Min. bei der berechneten Hybridisierungstemperatur mit 6·SSC und 0,1% SDS, an Luft getrocknet und bei -70ºC für 2-3 Tage einer Autoradiographie unterworfen.
Wenn die Aminosäuresequenz des gewünschten Proteins oder die Nucleotidsequenz, die es in mRNA codiert, bekannt ist, kann die für die Insertion in den erfindungsgemäßen Vektor bestimmte DNA entweder auf synthetischem Wege erhalten werden oder wenn Vektoren bereitstehen oder zur Verfügung stehen, die solche Sequenzen enthalten, durch Clonieren solcher Vektoren. Für die Synthese solcher Code-Sequenzen werden Wechselsense (alternating sense) und Anti-Sense überlappende Einzelstrangoligonucleotide hergestellt, und die Wechselsense- und Anti-Sense-Einzelstrangstücke durch Behandung mit DNA- Polymerase und dNTPs enzymatisch aufgefüllt. Die Oligomere werden mittels dem Verfahren von Efimov, V.A. et al (Nucleic Acids Res (1982) 6875-6894) hergestellt und können unter Verwendung im Handel erhältlicher automatisierter Oligonucleotid-Syntheseapparaturen hergestellt werden. Kinasebehandlung von Einzelsträngen vor dem Verknüpfen oder zum Markieren wird unter Verwendung eines Überschusses durchgeführt, z. B. annähernd 10 Units Polynucleotidkinase zu 1 nM Substrat in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM Dithiothreitol, 1-2 mM ATP, 1,7 pM gamma-32P-ATP (2,9 mCi/mM), 0,1 mM Spermidin, 0,1 mM EDTA.

C.3. Modifizierung von zur Verfügung stehenden Code-Sequenzen

Für Sequenzen von cDNA oder genomischer DNA, die Modifikationen benötigen um die gewünschten Mutantenproteine zu erhalten, wird beispielsweise eine situspezifische Primermutagense angewendet. Dies wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotidprimers durchgeführt, der zu einem zu mutagenisierenden Phagen-DNA-Einzelstrang komplementär ist, ausgenommen für eine begrenzte Fehlpaarung, die die gewünschte Mutation darstellt. Das synthetische Oligonucleotid wird als ein Primer verwendet, um die Synthese eines Stranges zu bewirken, der komplementär zu dem Phagen ist und die resultierende Doppelstrang-DNA wird in ein phagentragendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen des transformierten Bakteriums werden in Top Agar gebracht, wodurch die Plaqueformation aus Einzelzellen ermöglicht wird, die den Pagen verbergen.
Theoretisch enthalten 50% der neuen Plaques den Phagen, der als Einzelstrang die mutierte Form enthält und 50% werden die Original-Sequenz enthalten. Die resultierenden Plaques werden mit Kinase behandelten synthetischem Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die eine Hybridisierung bei exakter Paarung ermöglicht, bei der jedoch die Fehlpaarungen mit dem Originalstrang ausreichen, um eine Hybridisierung zu verhindern.
Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden dann aussortiert, in Kultur gezüchtet und die DNA gewonnen.

C. 4. Vektorkonstruktion

Bei der Konstruktion von geeigneten Vektoren, die die gewünschten Code- und Kontroll-Sequenzen enthalten, werden Standard Ligierungs- und Restriktionstechniken verwendet, die dem Fachmann gut bekannt sind. Isolierte Plasmide, DNA- Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, maßgeschneidert und wieder in die gewünschte Form ligiert.
Situsspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym (oder Enzymen) unter Bedingungen durchgeführt, die vom Hersteller dieser im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme angegeben sind. Siehe z. B. New England Biolabs, Produkt Katalog. Im allgemeinen werden etwa 1 ug des Plasmids oder DNA-Sequenz von einem Unit-Enzym in etwa 20 ul Pufferlösung gespalten, bei den vorliegenden Beispielen wird typischerweise ein Überschuß an Restriktionsenzym verwendet um eine vollständige Verdauung des DNA-Substrates sicherzustellen. Inkubationszeiten von etwa 1 Std. bis 2 Std. bei etwa 37ºC sind anwendbar, obwohl auch Änderungen toleriert werden. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, worauf eine Ätherextraktion folgen kann und die aus den wässrigen Fraktionen gewonnene Nucleinsäure kann mittels Ethanol ausgefällt werden. Wenn gewünscht, kann eine Abtrennung nach Größe von den gespaltenen Fragmenten unter Verwendung von Standardtechniken mittels Elektrophorese auf Polyacrylamid oder Agarosegel durchgeführt werden. Eine allgemeine Beschreibung dieser Auftrennung nach Größe ist in Methods in Enzymology (1980) 65:499-560 beschrieben.
Restriktionsgespaltene Fragmente können dadurch glatt gemacht werden, daß sie mit dem großen Fragment von E. coli. DNA- Polymerase I (Klenow) in Gegenwart von den vier Deoxynucleotidtriphosphaten (dNTPs) behandelt werden, wobei Inkubationszeiten von etwa 15-25 Min. bei 20-25ºC in 50 mM Tris, pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl&sub2;, 6 mM dTT und 5-10 uM dNTPs verwendet werden. Die Klenow-Fragmente füllen die 5' kohäsiven Enden auf, spalten jedoch die überstehenden 3'-Einzelstränge ab, obwohl die vier dNTPs vorhanden sind. Wenn gewünscht, kann eine selektive Reparatur dadurch durchgeführt werden, daß nur eines oder nur ausgewählte dNTPs innerhalb der Grenzen zugesetzt werden, die durch die Natur der kohäsiven Enden festgelegt sind. Nach Behandlung mit Klenow, wird die Mischung mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Behandlung unter geeigneten Bedingungen mit Sl- Nuclease oder Exonuclease Bal-31 ergibt eine Hydrolyse von jedem Einzelstrangteil.
Das Ligieren wird in 15-50 ul Volumen unter den folgenden Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM dTT, 33 ug/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, und entweder 40 uM ATP, 0,01-0,02 (Weiss) Units T4 DNA Ligase bei 0ºC (zum Ligieren von kohäsiven bzw. klebrigen Enden) oder 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) Units T4 DNA Ligase bei 14ºC (zum Ligieren von stumpfen bzw. glatten Enden). Intermolekulares Ligieren von klebrigen Enden wird üblicherweise bei Gesamt-DNA-Konzentrationen von 33 0 ug/ml durchgeführt (Konzentration von 5-100 nM an gesamten Enden). Intermolekulare Ligierungen stumpfer Enden (im allgemeinen unter Verwendung eines 10-30-fachen molaren Überschuß des Linkers) werden so durchgeführt, daß alle Enden in einer Konzentration von 1 uM vorliegen.
Bei der Vektorkonstruktion unter Verwendung von "Vektorfragmenten" wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) oder alkalischer Phosphatase (CIP) aus dem Kälberdarm durchgeführt, im das 5'-Phosphat zu entfernen und eine Religierung des Vektors zu verhindern. Verdauungen werden bei pH 8 in annähernd 150 mM Tris, in Gegenwart von Na&spplus; und Mg&spplus;² unter Verwendung von 1 Unit BAP oder CIP pro ug des Vektors bei 600 für etwa 1 Std. durchgeführt. Um die Nucleinsäurefragmente zu gewinnen, wird die Präparation mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Alternativ kann eine Religierung in Vektoren verhindert werden, die durch eine zusätzliche Behandlung von ungewünschten Fragmenten mit Restriktionsenzymen doppelt verdaut wurden. Die gewünschten Sequenzen werden auf diese Weise von Kolonien gewonnen, die mit der Sonde reagieren.

C.5. Verifizierung der Konstruktion

In den unten angeführten Konstruktionen wird das korrekte Ligieren der Plasmidkonstruktion dadurch nachgewiesen, daß mit der Ligierungsmischung zuerst der E. coli.-Stamm MC1061, der von Dr. M. Casadaban (Casadaban, M. et al, J Mol Biol (1980) 138:179-207) erhalten wurde oder ein anderer geeigneter Wirt transformiert wird. Erfolgreiche Transformanden werden durch Ampicillin-, Tetracyclin- oder einer anderen Antibiotika-Resistenz oder unter Verwendung eines Markers selektioniert, je nach Art der Plasmidkonstruktion, was dem Fachmann bekannt ist. Plasmide von den Transformanden werden dann nach dem Verfahren von Clewell, D. B. et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1969) 62:1159, hergestellt, worauf ggfs. eine Chloramphenicolamplifikation (Cleweli, D. B., J Bacteriol (1972) 110:667) folgt. Die isolierte DNA wird mittels Restriktion und/oder mittels dem Dideoxyverfahren von Sanger, F. et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1977) 74:5463 wie näher beschrieben bei Messing et al Nucleic Acids Res (1981) 9:309 oder dem Verfahren von Maxam et al, Methods in Enzymology (1980) 65:499 analysiert.

C.6. Beispiele von Wirten

Die in der vorliegenden Anmeldung zum Clonieren und zur Expression verwendeten Wirtstämme sind wie folgt:
Zum Clonieren und Sequenzieren wurden die E. coli-Stämme MC1061 oder HB101 verwendet.
Für die Expression wurden Zellen von Ovarien des chinesischen Hamsters verwendet, die unter den hier beschriebenen Bedingungen in einem definierten Medium erhalten werden können.

D. Beispiele

Die folgenden Beispiele sollten die Erfindung erläutern, diese jedoch nicht beschränken.

D.1. Konstruktion von Wirts-Expressions-Vektoren

pHS1

Das Plasmid pHS1 enthält 480 bp der hMT-II-Sequenz von p84H (Karin, M. et al, Nature (1982) 299:297-302), die von der HindIII-Stelle bei Position -765 des hMT-II-Gens bis zur BamHI-Spaltstelle bei Base +70 reicht. Plasmid p84H wurde vollständig mit BamHI verdaut, mit Exonuclease Bal-31 behandelt um endständige Nucleotide zu entfernen und dann mit HindIII verdaut. Das gewünschte 840 bp HindIII/glatte Fragment wurde in pUC8 ligiert (Vieira, J. et al, Gene (1982) 19:259-268), das mit HindIII- und mit HincII-Verdauung geöffnet wurde. Die Ligierungsmischung wurde in E. coli HB101 zu Amp® transformiert und ein Plasmid, das als pHS1 bezeichnet wurde, wurde isoliert und mittels dem Dideoxyverfahren sequenziert. Wie in Fig. 2 dargestellt, enthält pHS1 die hMT-II-Kontrollsequenzen stromaufwärts eines Polylinkers, der geeignete Restriktionsstellen enthält.

pHS1-SV40

Ein Paar von Wirts-Expressions-Vektoren, die den SV40-Enhancer in funktionsfähiger Verknüpfung zu dem MT-II-Promoter enthalten, wurde dadurch konstruiert, daß ein 1120 bp SV40 DNA- Fragment in die HindIII-Stelle eingesetzt wurde, die den MT-II-Promotersequenzen in pHSl vorstehen. Das SV40 DNA- Fragment umfaßt den SV40-Replikationsursprung und enthält Nucleotid 5171 bis Nucleotid 5243 (am Ursprung), das duplizierte 72 bp Repeat von Nucleotid 107-250 und setzt sich durch Nucleotid 1046 auf der Seite des Ursprungs, der das 5'-Ende der späten viralen mRNAs enthält, fort. Dieses HindIII 1120 bp Fragment wird aus einer HindIII-Verdauung von SV40 DNA erhalten (Buchman, A. R. et al, DNA Tumor Viruses, 2d ed (J. Tooze, ed.), Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1981), pp. 799-841) und zur Amplifizierung in pBR322 cloniert. Der Clonierungsvektor wird mit HindIII geschnitten und das 1100 bp SV40 DNA-Fragment durch Gelelektrophorese isoliert und in HindIII verdauten, CIP-behandelten pHS1 ligiert. Die resultierenden Vektoren, die als pHS1-SV(9) und pHS1-SV(10) bezeichnet werden, enthalten das Fragment in entgegensetzten Orientierungen, die dem MT-II-Promoter vorausgehen wie in Fig. 2 angegeben. In pHS1-SV(9) befindet sich der Enhancer etwa 1600 bp von der 5'-mRNA-Startstelle. In der entgegengesetzten Orientierung befindet er sich etwa 980 bp von der 5'-mRNA- Startstelle. Beide Orientierungen sind wirksam, jedoch bewirkt diejenige Orientierung, in der die Enhancer-Sequenz nahe an der Startstelle liegt, eine höhere Expression. Es wird angenommen, daß Delektionen, die den Enhancer 250-400 bp stromaufwärts des Transkriptionsstarts plazieren, optimal sind.
Es wurden zusätzliche Vektoren konstruiert, die den SV40-Enhancer 190 bp, 250 bp und 360 bp 3'-Terminus jeweils stromaufwärts des 5'-Endes der TATA-Box plazieren. Die Konstruktionen beruhten auf der Katalogisierung der Stromaufwärts-Regulations-Regionen des menschlichen MT-Promoters, der in Karin, M. et al, Nature (1984) 308:513-519 beschrieben ist. Alle Konstruktionen behalten die Sequenzen bei, die die duplizierten Stellen für die Regulation durch Schwermetalle enthalten, jedoch die Konstruktionen mit den 190 bp und 250 bp Separationen behalten nicht die Sequenzen für die Glucocorticoidregulation bei, die weiter stromaufwärts von diesen Stellen liegt.
Diese Vektoren, die als pHS'-SV190, pHS'-SV250 und pHS'-SV360 bezeichnet werden, werden wie folgt hergestellt. Alle Konstruktionen sind identisch mit der Ausnahme der Länge der Sequenzen, die den Metallothioneinpromoter enthalten und die Stromaufwärtsregion, die als ein Fragment bereitgestellt wird, das von pHS1 ausgeschnitten wurde.
Für pHS'-SV190 wird pHS1 mit SacII verdaut, glattgemacht und mit KpnI-Linkern ligiert. Die DNA wird dann mit EcoRI und KpnI verdaut um die geeigneten Teile der MT-II-Kontrollsequenzen freizusetzen. Für pHS'-SV250 wird pHSl auf ähnliche Weise mit HgaI verdaut, abgestumpft, an KpnI-Linker ligiert und mit EcoRI und KpnI verdaut. Für pHS'-SV360 wird DdeI für die Initialverdauung verwendet.
Ein Zwischenvektor, der den SV40-Enhancer enthält, wird durch Insertion des HindIII/KpnI-Fragmentes von SV40 (das von Position 5171 bis Position 294 reicht und das das Enhancerelement 50 bp von der KpnI-Stelle enthält) in KpnI/HindIII verdautem pUC19 hergestellt, um pUC-SV zu erhalten (pUC19 enthält 3 geeignete Restriktionsstellen in der Polylinkerregion in der Reihenfolge HindIII, KpnI und EcoRI). Die fertigen Vektoren werden durch Insertion der KpnI/EcoRI-Fragmente, die wie zuvor beschrieben hergestellt wurden, in dem KpnI/EcoRI verdauten pUC-SV erhalten.

pHSl-MT

Wirts-Expressions-Vektoren, die sowohl den MT-II-Promoter (zu welchem die gewünschte Code-Sequenz ligiert wird) und das gesamte MT-Gen enthalten, wurden dadurch konstruiert, daß das 3 kb HindIII-Fragment, das das gesamte menschliche Metallothionein-II-Gen enthält (Karin, M. et al, Nature (1982) 299:297-802) in HindIII verdautes pHSl eingebaut wird. Die so erhaltenen Plasmide, pHSl-MT(9) und pHSI-MT(10) enthielten das vollständige Metallothioneingen 5' vom Promoter in jeder der beiden möglichen Orientierungen. Siehe Fig. 2.
Diese Vektoren sind als Wirtsvektoren zur Konstruktion von Expressionsvektoren für jedes geeignete Gen verwendbar, es können jedoch auch andere Konstruktionen der gewünschten Expressionsvektoren verwendet werden, wie dies weiter unten beispielsweise für die hGH codierenden Sequenzen beschrieben ist.

D.2. Konstruktion des MT-Vektors zur Co-Transformation

Um eine Selektion oder Amplifizierung unter Verwendung von verschiedenen Ausgangsniveaus des Expressionssystems und des MT-Genes, das Kadmium-Resistenz verleiht, zu ermöglichen, wurden generell Shuttle-Vektoren, die als pUC9/MT bezeichnet wurden, durch Einligieren des MT-II-Genes, das als ein HindIII-Fragment von p84H (Supra) erhalten wurde, in HindIII verdauten, mit alkalischer Phosphatase behandelten pUC9 konstruiert.

D.3. Konstruktion von Expressionsvektoren

Der Basisexpressionsvektor für ein DNA codierendes Protein X unter der Kontrolle des MT-II-Promoters wird als pMT-X bezeichnet. Diese Vektoren, in die pMT-X auch modifiziert wird um funktionsfähig ligierte SV40-Enhancer zu enthalten, werden allgemein als pX-SV40 bezeichnet. Wenn die Enhancer-Sequenzen in ihrer Lage denjenigen in pHS1-SV(9) und pHS1-SV(10) entsprechen, d. h. 1600 bp oder 980 bp von der Stelle des Transkriptionsstartes, werden die Vektoren jeweils als pX-SV(9) oder pX-SV(10) bezeichnet. Diese Vektoren, in denen pMT-X modifiziert wird um das komplette MT-Gen zu enthalten, werden allgemein als pX-MT bezeichnet und pX-MT(9) und pX-MT(10) zeigen Analogie zu pHS1-MT(9) und pHS1-MT(10). In allen Fällen, in denen nach "X" in der Bezeichnung Zusätze angeführt sind, dann bezeichnet "c" ein cDNA-Insert und "g" bezeichnet ein Gen.

D.3.a. Vektoren zur Expression des Wachstumshormons

pMT-hGHg

Die Gensequenz, die hGH codiert, wurde aus dem p2.6-3 (DeNoto, et al, Nucleic Acids Res (1981) 19:3719) durch Verdauung mit BamHI, das am 5'-Ende des ersten Exons schneidet und EcoRI, das 3' des funktionellen Genes schneidet, mit anschließender Reinigung auf Polyacrylamidgel isoliert. Das isolierte Fragment wurde in BamHI/EcoRI verdautes pHSl ligiert und die Ligierungsmischung in E. coli MC1061 zu Amp® transformiert. Erfolgreiche Transformanden wurden durch Restriktionsanalyse gescreent und ein Strang, der das gewünschte Plasmid, pMT-hGHg (siehe Fig. 3) enthielt, wurde weiter vermehrt um eine größere Menge der Plasmid-DNA herzustellen.

phGHg-SV40

Auf ähnliche Art und Weise wie zuvor für die Konstruktion von pHSl-SV(9) oder pHSl-SV(10) beschrieben wurde, wobei jedoch pHSl durch pMT-hGHg substituiert wurde, wurde ein Vektorenpaar erhalten, das das hGH-Gen unter Kontrolle des MT-Promoters enthielt und das funktionsfähig zu dem SV40-Enhancer ligiert war und das entsprechend als phGHg-SV(9) und phGHg-SV(10) bezeichnet wurde. Die Ligierungsmischungen wurden verwendet um E. coli 1061 zum Amp® zu transformieren und die korrekten Konstruktionen wurden nachgewiesen.

phGHg-MT

Expressionsvektoren, die das vollständige hMT-Gen zur Selektion und Amplifizierung enthielten, wurden durch Verdauung der pMT-hGHg-Vektoren erhalten, die wie oben mit HindIII, Behandeln mit alkalischer Phosphatase und Insertion des 3 kb HindIII- Fragmentes, das das hMT-Gen enthält, in einer analogen Art und Weise hergestellt wurde, wie sie auch zur Konstruktion des pHS1-MT angewendet wurde. Diese Konstruktion ist ebenfalls in Fig. 3 dargestellt.

D.3.b. Vektoren für die Expression von alveolarem Surfaktansprotein (ASP)

pMT-ASPg

Für den ASP-Gen-Vektor pMT-ASPg wurden die Code-Sequenzen vom Phagenvektor Lambda:gHS-15 erhalten, der am 7. Dezember 1984 bei der ATCC hinterlegt wurde und der die Hinterlegungsnummer ATCC 40146 erhalten hat. Um Lambda:gHS15 zu erhalten, wurde eine menschliche Genbank, die in den Bakteriophagen Charon 28 cloniert ist (Rimm, D. L. et al, Gene (1980) 12:301-310) von Dr. T. Maniatis, Harvard University erhalten. Ungefähr wurden 1,5·106 Phagen in E. coli K803 gezüchtet und Plaquelysate wurden auf Nitrozellulosefilter übertragen, wie von Benton, W. D. et al, Science (1977) 196:180-182 beschrieben. Die Filter wurden mit einer DS-1 cDNA-Probe getestet, die mittels dem Nick-Translationsverfahren von Rigby, P. W. J. et al, J Mol Biol (1977) 133:237-251 mit Kinase behandelt war. Die Filter wurden im Hybridisationspuffer vorgewaschen (0,75 M NaCl, 0,75 M Natriumnitrat, 40% Formamid, 0,05% SDS, 0,02% Rinderserumalbumin, 0,02% Ficoll - 400.000, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Natriumpyrophosphat, 50 ug/ml Hefe tRNA, 50 ug/ml denaturierte einem Scherungsprozeß unterzogener Lachssperma-DNA) bei 42ºC für 1 Std. Eine 5·10&sup5; cpm-Sonde wurde pro ml frischem Hybridisationspuffer zugesetzt und die Filter wurden in diesem Puffer bei 37ºC 16 Std. lang inkubiert.
Diese wurden dann in 0,45 M NaCl und 0,045 M Natriumcitrat und 0,1% SDS zweimal bei 50ºC gewaschen und über Nacht einer Autoradiographie ausgesetzt. Sechs potentielle Clone, die Sequenzen enthielten, welche mit DS-1 cDNA hybridisierten, wurden gereinigt. Der am stärksten hybridisierende Clon gHS-15 wurde charakterisiert.
Ein 700 bp EcoRI-Fragment von gHS-15 hybridisierte mit der DS-1-Sonde und wurde zur Sequenzanalyse ausgewählt. Dieses EcoRI-Fragment wurde gereinigt, in M13mp9 eingebaut, sequenziert und es wurde gefunden, daß es äußerst homolog mit der entsprechenden Hundesequenz ist.
Die vollständige menschliche Code-Region war in zwei benachbarten BamHI-Fragmenten enthalten: einem 5' 1,2 kb und einem 3' 3,5 kb Fragment. Beide BamHI-Fragmente wurden einzeln in die BamHI-Stelle von M13mp8 subcloniert und sequenziert. Zusätzliche Fragmente wurden auf ähnliche Weise entsprechend der in Fig. 3 angegebenen Strategie sequenziert. Die Sequenzinformation wurde unter Verwendung verschiedener Intelligenetics Computerprogramme (Palo Alto, CA) gemäß den Anleitungen der Hersteller analysiert. Die Regionen, die das Signalpeptid, die Precursor-Sequenz und das reife Apoprotein enthalten, wurden durch Vergleich mit der Hunde-ASP cDNA identifiziert. Gemäß' Sequenzanalyse wird der 5'-Terminus des Genes innerhalb des 1,2 kb BamHI-Fragmentes und der 3'-Terminus innerhalb des 3,5 kb BamHI-Fragmentes codiert. Das Gen wird durch drei Introns bei den Positionen 1218 bp, 1651 bp und 2482 bp unterbrochen, wobei die Position 1 das erste bp des 1,2 kb BamHI-Fragmentes ist.
Die vollständige ASP codierende Sequenz ist aus Lambda:gHS-15 durch Verdauung mit BamHI als zwei Fragmente mit 1,2 kb und 3,5 kb ausschneidbar. pHS-1 wurde mit BamHI gespalten und die zwei vorgenannten BamHI-Fragmente von Lambda:gHS-15 wurden in diese Stelle ligiert. Die Ligierungsmischung wurde in E. coli MC1061 zum Amp® transformiert und erfolgreiche Transformanden wurden mittels Restriktionsanalyse gescreent. Der Stamm, der die gewünschte Konstruktion mit der Code-Sequenz von ASP unter der Kontrolle des hMT-II-Promoters enthielt, wurde pMT-ASPg genannt und vermehrt, um größere Mengen von Plasmid DNA herzustellen.

pMT-ASPg-Apo

Für den die genomische DNA enthaltenden Vektor pMT-ASPg-Apo, der stromabwärts eine Apo-Sequenz aufweist, wurden die Code- Sequenzen als ein HinfI/EcoRI-Fragment des Genes erhalten, das von Nucleotid 950 bis Nucleotid 3432 reicht und die Exons 2, 3 und 4 und einen Teil des Exons 5 enthält (White, R. T. et al, Nature (1985) 317:361-363). Dieses Fragment wurde zu einem 500 bp Fragment von dem 3'-Ende des menschlichen ApoAI-Genes (Shoulders, C. C., Nucleic Acids Res (1983) 11:2827-2837) ligiert, das das Polyadenylierungssignal und die Polyadenylierungsstelle enthält. Die Konstruktion wird wie folgt durchgeführt:
pMT-Apo, ein pMT-Derivat, das C-terminale Regulationssignale enthält, wurde hergestellt. pMT-Apo enthält einen Teil des menschlichen Leberprotein ApoA&sub1;-Genes (Shoulders, C. C. et al, (Supra)), das die 3'-terminale Regulationssignale enthält. Ein PstI/PstI 2,2 kb Fragment des ApoA&sub1;-Genes (stumpfendig) wurde in die SmaI-Stelle der pMT-Polylinkerregion cloniert und der Hauptteil des ApoA&sub1;-Genes wurde durch Verdauung mittels BamHI, dem Glattmachen der Enden mit Klenow, Verdauung mit StuI und Religieren entfernt. Der resultierende Vektor enthält in etwa 500 bp des ApoA&sub1;-Genes vom 3'-Terminus, was durch die Deoxy- Sequenzanalyse bestätigt wurde.
Das 315 kb BamHI-Fragment (oben) wurde am 3'-Terminus durch Verdauung mit EcoRI (Position 3434) glattgemacht und mit Klenow aufgefüllt. Dieses glattgemachte Fragment wurde zusammen mit dem 1,2 kb Fragment (oben), das zuvor mit HinfI gestutzt wurde, in die BamHI-Stelle von pMT-Apo cloniert und so pMT-ASPg-Apo erhalten. Das vollständige ASP codierende Gen-Insert, das durch Apo terminiert ist, ist in Fig. 4 in zum MT-II-Promoter ligierter Form dargestellt.
Es wird angenommen, daß dieser Vektor ein Protein produziert, das 23 Aminosäuren länger ist als das native Präprotein (welches die Signalsequenz enthält). Dieser Konstruktion fehlt Exon 1 und die Translation beginnt wahrscheinlich am ATG-Start bei Nucleotid 987 der Gensequenz, die zu der nativen Präprotein mRNA komplementär ist, wobei das zuvor genannte Nucleotid normalerweise im ersten Intron liegt. Bei der Bildung von nativen Präprotein, wird Exon 1 zu Exon 2 bei Nucleotid 1022 gespleißt, wodurch dieses Startcodon entfernt wird und wodurch ermöglicht wird, daß die Translation bei Nucleotid 1046 initiiert wird. Diese zusätzlichen Gruppen scheinen jedoch nicht die Sekretion zu stören und das normale reife Protein wird von Zellen, die diese modifizierte Genform exprimieren, sekretiert.

pASPc-SV (10)

Die Code-Sequenzen für ASP wurden in eine modifizierte Form des Wirtsvektors pHS1-SV(10) eingefügt, der die Enhancer-Elemente neben der MT-II-Promoterregion enthält. Zuerst wurde das 500 bp ApoAI-Fragment in pHSl-SV(10) dadurch eingefügt, daß dieses Fragment, welches durch Verdauung von pMT-Apo (zuvor beschrieben) erhalten wurde, isoliert wird und dieses Isolat in EcoRI/BamHI verdautem pHSl-SV(10) ligiert wird. pMT-Apo wurde mit BamHI verdaut, stumpf gemacht und in die cDNA-Sequenzen ligiert, die von pHS10-5 (White, R. T. et al, Nature (1985) 317:361-363) als ein stumpfes EcoRI-Verdauungsprodukt erhalten wurden. Das cDNA-Fragment reicht von dem an die 5' nichttranslatierte Region verbundenen EcoRI-Linker zu der natürlich auftretenden EcoRI-Stelle in der 3' nichttranslatierten Region (900 bp). Die relevanten Nucleotidsequenzen sind in Fig. 5 angegeben, worin die mit * versehene Aminosäuren die Unterschiede in der Primäraminosäuresequenz gegenüber derjenigen angeben, die das Protein aufweist, das von pMT-ASPg-Apo erhalten wird. (Die Unterschiede rühren von Basenänderungen zwischen menschlicher cDNA und genomischen Sequenzen her). Die Initiation der Translation liegt bei Nucleotid 56 wie in der nativen Sequenz.

pASPcg-SV (10)

Eine zusätzliche Modifizierung wurde durch Integrieren von pASPc-SV(10) und pMT-ASPg-Apo-Sequenzen hergestellt. Plasmid PASPc-SV(10) wurde mit BamHI und EcoRI verdaut und die größeren Fragmente in den 3'-Teil des ASP-Genes ligiert, das durch BamHI/EcoRI (Teil) Verdauung von pMT-ASPg-Apo erhalten wurde. Dies stellt den Teil des menschlichen ASP-Genes dar, das bei Nucleotid 1154 beginnt und bis zu Nucleotid 3432 reicht, und das zu dem ApoAI-Genfragment von oben ligiert wird. Diese Konstruktion ergibt ein Protein, das identisch mit demjenigen ist, das von pMT-ASPg-Apo erhalten wird, sich jedoch in den Aminosäuren der Positionen 25, 30 und 34 von dem aus pASPc- SV(10) unterscheidet. Die Nucleotid-Sequenz des relevanten Inserts ist in Fig. 6 angegeben.

D.3.c. Vektoren zur Expression von Apolipoproteinen

pMT-AIg und pMT-AIIC

Das Gen von Apolipoprotein AI (ApoAI) wurde von pSA1.2, das die gesamte Code-Sequenz des ApoAI-Genes als ein Insert in die PstI-Stelle von pBR322 enthält, durch Verdauung mit PstI gefolgt von einer Reinigung auf Polyacrylamidgel isoliert. Dieses Fragment wurde ursprünglich aus dem rekombinanten Phagen Lambda-AI-12 als ein 2,2 kb PstI-Fragment abgeleitet (Seilhamer, J. J. et al, DNA (1984) 3:309) und es erstreckt sich von der 5' nichttranslatierten Region über die gesamte Code-Sequenz einschließlich der Introns und endet nach der PolyA-Additionsstelle. Das PstI-Insert wurde durch Behandlung mit T4 DNA Polymerase in Gegenwart von dCTP glattgemacht, in das SmaI verdaute, BAP behandeltes pHS1 ligiert und die Ligierungsmischung in E. coli 1061 zu Amp® ligiert. Die korrekte Konstruktion des daraus resultierenden Vektors pMT-AIg wurde durch Analyse der Verdauung mit Restriktionsenzymen bestätigt.
Auf ähnliche Weise wurde eine cDNA-Sequenz, die menschliches ApoAII codiert, in EcoRI verdautes pHSl cloniert und so ein Expressionsvektor für ApoAII erhalten, der als pMT-ATIc bezeichnet wird. Das EcoRI-Insert, das ApoAII codiert, wurde aus einer menschlichen Föten-Leber-cDNA-Bank in Lambda-gt10 erhalten, der wie von Huynh, V. T. et al, DNA Cloning Technigues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984) beschrieben hergestellt wurde und die mit einem 45 bp Oligonucleotid sondiert wurde, das die Aminosäuregruppen 140-164 des menschlichen ApoAII codiert (Sharpe, C. R. et al, Nucleic Acids Res (1984) 12:3917-3932). Aus 750.000 Rekombinanden wurden 10 positive Kolonien erhalten und eine davon, die als Lambda-AII bezeichnet wurde, hatte ein 440 Basen EcoRI-Insert, das der vollständigen Sequenz von ApoAII cDNA entspricht plus etwa 20 Basen 5' der nichttranslatierten Region. Dieses EcoRI-Insert wurde zur Insertion in pHSI verwendet um so pMT-AII zu erhalten.

pAIg- SV40

Expressionsvektoren, die den SV40-Enhancer in beiden Orientierungen funktionsfähig mit den genomischen Sequenzen verknüpft enthalten, die ApoAI codieren, wurden unter Verwendung von SmaI verdauten, mit alkalischer Phosphatase behandelten pHS1-SV(9) und pHS1-SV(10) und insertieren eines 2,2 kb PstI-Fragmentes konstruiert, das den größten Teil des ApoAI-Genes enthält, das als ein PstI Verdauungsprodukt von pPSA1.3 erhalten wurde (beschrieben von Seilhamer et al, DNA (1984) 3:309 und von Protter, A. et al, DNA (1984) 3:449). Das durch die Verdauung erhaltene 2,2 PstI-Fragment wurde isoliert und unter Verwendung von Klenow für die Insertion in die SmaI gespaltenen Wirtsvektoren glattgemacht. Die resultierenden Ligierungsmischungen wurden in E. coli zu Amp® transformiert und die korrekten Konstruktionen von pAIg-SV(9) sind pAIg-SV(10) wurden bestätigt.

D.3.d. Vektoren zur Expression des Atrio-natriuretischen Faktors (ANF)

Atrio-natriuretischer Faktor ist ein Protein, das die Expression von Natrium durch die Nieren reguliert und auf diese Weise einen der Faktoren kontrolliert, die zur Aufrechterhaltung der richtigen Flüssigkeitsbalance verantwortlich sind. Dieser wird in den Atriumzellen des Herzes als ein Präprotein gebildet und dann sekretiert und weiterverarbeitet.
Zur Insertion in die genomische Sequenz, die menschliches Präpro-ANF codiert, wird pHSl zuerst dadurch modifiziert, daß ein, aus M13mp7, das geeignete Restriktionsstellen einschließlich einer AccI-Stelle enthält, isoliertes 24 Basen BamHI- Linker-Fragment in die BamHI-Stelle modifiziert wird. Das modifizierte pHS1 wird pHS1' bezeichnet und enthält dadurch geeignete Accl-Stellen, die die Insertion der ANF-Code- Sequenzen ermöglichen.
Der gewünschte Expressionsvektor, der als pMT'-ANF bezeichnet wird, wird dermaßen konstruiert, daß pHS1' mit AccI und EcoRI und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt wird und daß ein 2016 bp AcyI (teilweise, glatt)/EcoRI-Fragment eingesetzt wird, das aus pHGRB-1 gereinigt wurde, was in U.S. Serial Nr. 622,639 der gleichen Anmelderin, eingereicht am 20. Juni 1984, beschrieben ist und das hiermit ausdrücklich in die Beschreibung aufgenommen wird. Dieses Insert enthält das vollständige ANF-Gen. Die relevante DNA-Sequenz ist in Fig. 7 dargestellt.

D.3.e. Vektoren zur Expression von Erythropoietin

Die Gensequenz, die Erythropoietin (Epo) codiert, wurde wie folgt hergestellt: die menschliche Genbank, hergestellt nach Lawn, R. M. et al, Cell (1978) 15:1157-1174 in Lambda-Charon 4A wurde mit den beiden 24-gliedrigen 5'-TCTGTCCCCTGTCCTGCAGGCCTC-3' und 5'-CTGGGCTCCCAGAGCCCGAAGCAG-3' sondiert, die so konstruiert wurden, daß sie zu den Exons des Epo-Genes komplementär sind (nach Jacobs et al, Nature (1985) 313:806-810). Auf diese Weise wurde ein hybridisierender Phage, der ein 15 kb Insert enthält, erhalten und mit BamHI und EcoRI verdaut und so ein 4,8 kb- Fragment erhalten, welches die vollständige Code-Region des Epo-Genes zusätzlich zu 200 bp der 5' untranslatierten Region und die vollständige 3' untranslatierte Region enthält. Dieses Fragment wurde auf einem Polyacrylamidgel isoliert, glatt gemacht und in die SmaI-Sequenz von SmaI verdautem, CIP behandelten, pUC9 zur Amplifizierung ligiert. Das BamHI/EcoRI-lnsert aus diesem Clonierungsvektor wurde dann isoliert und dazu verwendet, die Epo-Code-Sequenzen in den folgenden Vektoren zu versorgen:

pMT-Epo

pMT-Epo wurde durch Spalten von pHS1 mit BamHI und EcoRI und Insertion der Epo codierenden Sequenzen als ein BamHI/EcoRI-Fragment wie oben erhalten.

pEpo-SV(10)

Auf ähnliche Weise wurde pHS1-SV(10) mit BamHI und EcoRI verdaut und das Epo codierende Fragment insertiert um den SV40-Enhancer in benachbarter funktionsfähiger Verknüpfung zum MT-Promoter bereitzustellen.

pEpo-MT

Auf ähnliche Weise, jedoch unter Austausch von pHSI-SV(10) zu pHS1-MT wurde der gewünschte Vektor pEpo-MT erhalten, der das vollständige Metallothionein-Gen als einen Amplifikationsregulator enthält.

pEpo'-SV(10)

pEpo-SV(10) wurde modifiziert um, sofern es die gewünschte Code-Sequenz erlaubt, ein Gen bereitzustellen, das eine "Kozak Concensus Sequenz" am 5'-Ende und eine Polyadenylations-Sequenz am 3'-Ende aufweist. Dem oben beschriebenen Epo-Gen fehlt die Concensus-Polyadenylations-Sequenz, von der angenommen wird, daß sie für eine wirksame Transkription benötigt wird.
pEpo-SV(10) wurde mit ScaI verdaut, das 7 Basen schneidet, die dem Exon 1 im ersten Intron folgen. Die resultierenden glattendigen Sequenzen werden in das Oligomer
5'-GATCCAAGATGGGGGTGCACGGTGAGT-3' TTCTACCCCCACGTGCCACTCA
ligiert um die fehlenden Teile des N-Terminus des Genes zu ersetzen, die Concensus-Sequenz bereitzustellen und eine BamHI-Sequenz am stromaufwärtigen Ende bereitzustellen. Die Ligierungsmischung wird mit BamHI behandelt (wodurch die 5' nichtranslatierten Regionen des Genes vom Ende des Vektors entfernt werden) und religiert um einen Zwischenvektor zu erhalten, der das Epo-Gen mit einem modifizierten 5'-Terminus enthält.
Für die Modifizierung am 3'-Ende wird phGHg-SV(10) mit BamHI und SamI verdaut und mit CIP behandelt um so einen Vektor bereitzustellen, dem die Code-Sequenz für hGH fehlt. Dieser linearisierte Vektor wird zu dem BamHT/NcoI-Fragment des oben hergestellten Zwischenvektors ligiert, der das 51 modifizierte Epo-Gen enthält, dem der größte Teil der nichttranslatierten 3'-Region fehlt, um so pEpo'-SV(10) bereitzustellen, das das gewünschte modifizierte Gen enthält. Die Konstruktion ist in Fig. 8 angegeben.

D.3.f. Vektoren zur Expression von Renin

Die Herstellung eines Präprorenin-Expressionsvektors, in dem sich die Präprorenin-Sequenzen unter Kontrolle des MT-II- Promoters befinden, ist in der U.S.-Anmeldung mit der Serial Nr. 719,414 enthalten, die am 03. April 1984 eingereicht wurde und die hiermit ausdrücklich in die Beschreibung aufgenommen wird. Die darin beschriebene Vorgehensweise ist wie folgt: Die DNA, die Präprorenin codiert und dessen prozessierte Produkte, wird durch Sondieren einer cDNA Genbank erhalten, die aus mRNA von Nierenzellen konstruiert wurde. Es ist jedoch nicht notwendig, dieses Verfahren zu wiederholen, da die Sequenz nun bekannt ist (siehe Fig. 9) und Zellen, die einen Vektor enthalten, der die vollständige Code-Sequenz für menschliches Prorenin enthält, dem wiederum eine modifizierte menschliche Signal-Sequenz vorausgeht, sind bei der American Type Culture Collection hinterlegt. CBI-2B5, das pPP14 enthält, wurde bei der ATCC am 26. März 1985 hinterlegt und hat die Hinterlegungsnr. CRL 8758 erhalten. Methoden um die vollständigen Gen-Sequenzen zu erhalten, nachdem die gewünschte Sequenz bekannt ist, stehen-nunmehr zur Verfügung. Siehe Edge, M. D. et al, Nature (1981) 292:756, Nambiar, K. P. et al, Science (1984) 223:1299 oder Jay, E. et al, J Biol Chem (1984) 259:6311.
Eine cDNA Genbank wurde aus Oligo dT geprimter PolyA&spplus; RNA hergestellt, die aus der Niere eines menschlichen Unfallopfers gereinigt wurde. Die cDNA Genbank wurde in den bakteriophagen Vektor Lambda-gt10 konstruiert und mit geeigneten Fragmenten von Charon-4 Humanrenin-genomischen Clonen sondiert, die aus einer menschlichen genomischen Genbank durch Sondieren mit cDNA-Fragmenten des Unterkieferdrüsen-Renins der Maus. Die Genbank wird mittels Standardverfahren unter Bildung von Doppelstrang cDNA von der mRNA, mittels Glattmachen der cDNA mit DNA-Polymerase I (Klenow), Addition eines handelsüblichen EcoRI-Linkers, Spalten mit EcoRI und Ligieren der Fragmente in EcoRI verdaute Lambda-gt10-Vektoren hergestellt. Bei zwei positiv reagierenden cDNA-Clonen konnte durch Sequenzieren mittels dem Dideoxyverfahren von Sanger (Supra) gezeigt werden, daß sie die vollständige Renin codierende Sequenz und die 3' nichttranslatierte Region, ausgenommen von 7 fehlenden Basenpaaren, am 5'-Ende der Signal-Sequenz enthielten. Die zwei Clone enthielten 1211 bp der Code-Region, gefolgt von der vollständigen 3' 198 bp nichtranslatierten Region, der wiederum ein PolyA-Ende folgt. Die Zuordnung der Sequenz zu den geeigneten Präprorenin-Codons und dem Leseraster wurde durch Vergleich mit der Sequenz durchgeführt, die von Imai et al (siehe Fig. 9) publiziert wurde. Aufgrund der einheitlichen EcoRI- Sequenz bei Position 742, wie in Fig. 9 gezeigt ist, werden zwei clonierte Fragmente erhalten.
Die cDNA-Sequenzen, die Präproreninprotein codieren, werden in pUC9 als die beiden EcoRI-Inserts transferiert um die clonierten Vektoren pHR1 und pHR2 zu erhalten. pHR1 enthält den 5'-Teil und pHR2 enthält den 3'-Teil. pHR1 und pHR2 werden durch Ausschneiden der cDNA aus Lambda-gt10 unter Verwendung von EcoRI und dem Ligieren von jedem der resultierenden Fragmente in EcoRI gespaltenem pUC9 erhalten.
Um pPP14 zu konstruieren, wurde pMT.PRO als Expressionsvektor verwendet. pMT.PRO ist ähnlich wie pHS1 und enthält 840 bp der hMT-II-Sequenz von p84H (Karin, M. et al, Nature (1982) 299:297-802), die von der HindIII-Sequenz bei Position -765 des hMT-II-Genes bis zur Base +70 reicht. pMT.PRO enthält dieses hMT-II-Fragment, schließt jedoch darüberhinaus das ATG Startcodon mit ein, wenn es in pUC8 ligiert wird (Vieira, J. et al, Gene (1982) 19:259-268). Daher wird um pMT.PRO zu konstruieren, die hMT-II-Sequenz von pMT-II-BPV (Karin, M. et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1983) 80:4040-4044) als ein HindIII/HindIII-Fragment ausgeschnitten, das dann mit BamHI verdaut wird um so den Promoter und den 5' Transkriptionsteil zu erhalten. Das HindIII/BamHI-Fragment, das die hMT-II- Sequenzen enthält, wird dann in HindIII/BamHI verdautes pUC8 eingesetzt um so pMT.PRO zu erhalten.
Um pPP14 zu konstruieren wurde pMT.PRO mit BamHI verdaut unter Verwendung von DNA-Polymerase (Klenow), in Gegenwart der vier dNTPs aufgefüllt und dann mit EcoRI verdaut. EcoRI schneidet unmittelbar stromabwärts der einzigen BamHI-Sequenz, die dem ATG-Startcodon folgt. Der 5'-Teil des Präprorenin-Genes wurde von pHR1 mittels EcoRI-Verdauung ausgeschnitten und unter Bedingungen mit kohäsiven Enden an den EcoRI-Schwanz des offenen pMT.PRO-Vektors ligiert. Ungefähr 50% des Inserts liegen in der korrekten Orientierung vor. Die Ligationsmischung wurde dann mit DNA-Polymerase I (Klenow) in Gegenwart der vier dNTPs behandelt um die verbleibende nicht ligierte EcoRI- Sequenz zu glätten. Schließlich wurde der Vektor durch Ligieren rezirkularisiert und die Mischung in E. coli MC1061 zu Amp® transformiert. Kolonien, welche die korrekte Konstruktion mit dem 5'-Teil der Präprorenin-Code-Sequenz im Leseraster mit dem durch die hMT-II-Promoter-Region und dem 5' Transkript enthalten, wurden aufgesammelt und in Kultur gezüchtet. Die Konstruktion des Zwischenplasmides wurde durch Restriktionsanalyse und Sequenzieren bestätigt.
Das resultierende Zwischenplasmid war offenbar nicht in der Lage den EcoRI ausgeschnitten 3'-Teil, der vom pHR2 erhalten wurde, in der korrekten Orientierung aufzunehmen. Dieses Problem wurde dadurch überwunden, daß der Rückgratvektor des Zwischenproduktes, das von pUC8 abgeleitet ist, gegen die korrespondierenden Sequenzen von pUC9 ausgetauscht wurde. Um dies zu erreichen, wurde der Zwischenvektor mit HindIII und EcoRI behandelt und das Fragment, das den hMT-II- Promoter/Präprorenin 5'-Teil enthielt, wurde in HindIII/EcoRI verdautes pUC9 eingebaut. Das resultierende modifizierte Zwischenprodukt wurde dann mit EcoRI verdaut und mit dem EcoRI/EcoRI-Fragment, das von pHR2 isoliert wurde, ligiert um pPP14 zu bilden, das die vollständige Präprorenin-Code-Sequenz enthält.
Da die Verbindungsregion zwischen dem ATG Startcodon von pMT.PRO und dem 5'-terminalen Bereich der Präprorenin codierenden Sequenzen nach der Reparatur der BamHI und EcoRI gespaltenen Stellen durch Ligation mit glatten Stellen verknüpft wurden, ist die Sequenz in der Verbindungsregion
5'-CCATGGATCAATTCCGATGG
wodurch das unterstrichen gezeigte ATG Startcodon in das Leseraster mit der verbleibenden Code-Sequenz gebracht wird. Der überstrichene Bereich zeigt die Verbindung der aufgefüllten BamHI und EcoRI-Stellen an. Die Code-Sequenz des N-Terminus des Präprorenins der Signal-Sequenz ist daher Met-Asp-Gln-Phe- Arg-Trp ist, was zwei zusätzliche Aminosäuren im Vergleich zur entsprechenden nativen N-terminalen Sequenz aufweist, die Met-Asp-Gly-Trp ist.
Dieser Vektor, der als pPP14 bezeichnet wird, wird zur Wahrung der einheitlichen Nomenklatur im Rahmen der vorliegenden Anmeldung in pMT-PPRen umbenannt.

D.4. Bildung von Säugetiertransformanden

Jeder der zuvor beschriebenen Vektoren wurde in CHO-Zellen wie im folgenden beschrieben transformiert: Chinesenhamsterovarien (CHO)-K1-Zellen wurden in einem Medium gezüchtet, das aus einer 1:1 Mischung von Coon's F12 Medium und DME21 Medium mit 10% Kälberfötenserum zusammengesetzt ist. Die geeigneten Zellen wurden mit den jeweiligen Vektoren und pSV2:NEO cotransformiert (Southern, P. et al, J Mol Appl Genet (1982) 1:327-341). pSV2:NEO enthält ein funktionsfähiges Gen, das Resistenz gegen das Neomycinanalog G418 verleiht. In einer typischen Transformation werden 0,5 ug von pSV2-NEO und 5 ug oder mehr der Expressionsvektoren DNA an Zellen in eine 100 ml Schale appliziert. Die Kalziumphosphat-DNA Co-Präzipitation gemäß dem Protokoll von Wigler, M. et al, Cell (1979) 16:777-785, wurde zusammen mit einem 2-minütigem Schock mit 15% Glycerin in PBS nach 4-stündiger Einwirkung auf die DNA verwendet.
Die Zellen werden in einer 1/10 Konfluenz ausgesät, über Nacht wachsen gelassen, 2· mit PBS gewaschen und 15 Min. lang in 0,5 ml einer Hepes gepufferten Salzlösung gegeben, die das CaPO&sub4;·DNA Co-Präzipitat enthielt und mit 10 ml Medium ernährt. Das Medium wird durch Beatmen entfernt und 1,5-3 Min. lang durch 15% Glycerin in PBS ersetzt. Die schockbehandelten Zellen wurden gewaschen und mit Kulturmedium ernährt. Bis zur Induktion der MT-II kontrollierten Expression enthält das Medium F12/DMEM21 1:1 mit 10% FBS. Einen Tag später werden die Zellen 1 mg/ml G418 ausgesetzt um einen Pool von G418 resistenten Kolonien zu erzeugen. Erfolgreiche Transformanden, die ebenfalls eine stabile Vererbung des gewünschten Plasmides aufweisen, werden dann bei geringer Dichte zur Reinigung von Clonisolaten auf eine Platte übertragen.

D.5. Test auf Produktionsniveaus des gewünschten Proteins

Die Transformanden werden auf Bildung des gewünschten Proteins getestet und zwar erst als Pools und dann als isolierte Clone in Tüpfelplatten bzw. Multinäpfchenplatten. Die Niveaus der Plattentests hängen etwas von der Näpfchengröße ab, d. h. die Ergebnisse von einer Platte mit 24 Näpfchen sind nicht direkt vergleichbar mit einer Platte mit 96 Näpfchen. Clone, bei denen im Plattentest gefunden wurde, daß sie das Protein in ausreichender Menge bilden, können dann in Produktionsläufen in Rollerflaschen gezüchtet werden. Üblicherweise sind die Produktionsmengen bzw. Produktionsspiegel höher wenn die Maßstäbe vergrößert werden. Es gibt jedoch keine vollständige Korrelation zwischen der Verhaltensweise im Plattentest und in den Rollerflaschen - d. h. Kulturen, die im Plattentest die besten Bildner waren, sind nicht notwendigerweise auch die besten nach einer Vergrößerung des Maßstabes. Aus diesem Grunde werden typischerweise 100-200 oder noch mehr individuelle Clone durch verschiedene Screening-Verfahren auf Platten getestet und 5-10 der am meisten bildenden Clone werden dann unter Produktionsbedingungen (Rollerflasche) weitergetestet.

D.5.a. Bildung von hGH

Plattentests

Geringe Mengen der Isolate aus Zellen, die mit dem hHG codierenden Plasmid transformiert wurden, werden auf Tüpfel- oder Mehrfachnäpfchenplatten nach Einwirkung von 10&supmin;&sup4; M Zinkchlorid zum geeigneten Test auf Bildung von Wachstumshormon gezüchtet. Die Bestimmung des Wachstumshormons wurde durch Standard Radioimmunoassays unter Verwendung handelsüblich erhältlicher Reagenzien (Hybritech, Inc.) durchgeführt. Zwei von 60 Clonisolierungen von pMT-hGH Transformanden (CBT-25 und CBI-37) bildeten große Mengen des gewünschten hGHs. CBT-37 wurde am 07. Februar 1985 bei der ATCC hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnr. CRL-8721.
Für Zellen, die mit phGH-MT(9) oder phGH-MT(10) transformiert wurden, wurden zusätzliche Schritte zur Selektion auf Kadmium-Resistenz angewendet, um geeignete Transformanden zu selektionieren. Ein Pool von G418 resistenten Zellen wurde bei einer 1:10 Konfluenz ausgesät und in Gegenwart von 510w5 M Zinkchlorid und verschiedenen Mengen an Kadmiumchlorid gezüchtet. Ein ähnlicher Pool von Transformanden, der das pMT-hGH trug, wurde als Kontrolle verwendet. Es wurden selbst bei niedrigen Konzentrationen wie 2,5 uM Cd&spplus;² keine überlebenden Kolonien erhalten, wenn der pMT-hHG Pool für die Aussaat verwendet wurde. Es überlebten jedoch mehr als 500 Kolonien in einem Medium, in das ein phGH-MT-Transformand bei 2,5 uM Cd&spplus;² ausgesät wurde, etwa 100 Kolonien bei 5 uM Cd&spplus;² und 2 Kolonien bei 10 uM Cd&spplus;². Keine Kolonien überlebten bei 20 oder 50 uM Cd&spplus;². Die 10 pM Cd&spplus;² resistenten Kolonien wurden verworfen, da sie eine abnormale Morphologie zeigten, jedoch wurden die Kolonien aus 2,5 uM und 5 uM Cd&spplus;² bis zur Konfluenz gezüchtet, um neue Pools für den Vergleich der hGH-Bildungsniveaus mit nicht amplifizierten Transformanden zu schaffen.
Pools von Transformanden wurden zur hGH-Bildung induziert, um Vergleichswerte für die Produktionsmenge mit und ohne Enhancer oder bei Cd&spplus;² Selektion zu erhalten. Die Zellen wurden in ein 5%iges Serum mit G418 in Platten mit 6 Näpfchen gesät, wobei 25ul Zellen von konfluenten 100 mm Platten verwendet wurden. Zwei Tage später wurden die Zellen mit PBS gewaschen und wieder mit serumfreiem Puffer ernährt, der 3·10&supmin;&sup5; M FeSO&sub4; und 7·10&supmin;&sup5; M Zn&spplus;² enthielt.
Transformanden mit pMT-hGHg zeigten Produktionsspiegel von 1,4 ug/ml genauso wie Clone, die mit phGHg-MT transformiert und nicht auf Kadmiumionen-Resistenz selektioniert wurden. Jedoch phGHg-MT-Transformanden, die in 2,5 uM oder 5 uM Cd&spplus;² selektioniert wurden, produzierten jeweils 6,5 und 17,5 ug hGH/ml respektive. Zellen, die mit phGHg-SV(9) oder phGHg- SV(10) transformiert wurden, produzierten respektive 7,0 ug/ml und 17,0 ug/ml hGH. Fig. 10 zeigt eine graphische Darstellung der Verteilung der hGH-Produktionsspiegel für einzelne Clone in verschiedenen Pools. Es ist offensichtlich, daß phGHg- SV40-Transformanden überragende Eigenschaften aufweisen gegenüber Transformanden mit pMT-hGHg oder mit phGHg-MT in Abwesenheit von Kadmiumionen. Die Konstruktion, in der das Enhancer- Element näher am Transkriptionsstart liegt, scheint höhere Ausbeuten zu ergeben.
Clone werden aus dem Pool isoliert, der resistent gegenüber 5 uM Kadmiumionen ist und drei der besten Kolonien werden isoliert. Cd-5-4, Cd-5-12 und Cd-5-15 ergaben, wenn sie unter Produktionsbedingungen (siehe unten) gezüchtet werden, annähernd 120 ug/ml hGH. Wenn sie unter Plattentestbedingungen ausgetestet wurden, ergab Cd-5-12 21,5 ug/ml und Cd-5-15 27,8 ug/ml hGH. Andere Clone, die unter Produktionsbedingungen weniger erfolgreich arbeiten, gaben 50-70 ug/ml. Southern Blots bestätigten, daß die Zellen, die aus 5 uM Kadmium-Resistenz ausgewählt wurden, etwa 20 Kopien des Expressionsvektors enthielten, wohingegen der Pool, der nicht mit Kadmium selektioniert wurde, im Durchschnitt 1-3 Kopien enthielt.
Der Cd-5-15 Clon wurde gezüchtet und bei höheren Konzentrationen auf Kadmium-Resistenz selektioniert. Die Zellen wurden in 15 ml eines Mediums ausgesät, das DME21/Coon's F12, 10% FCS, Pen/Strep, G418, 50 uM Zinkionen und 25 uM Kadmiumionen in einem T-75 Kolben enthielt und bis zur Konfluenz wachsen gelassen. Die Zellen wurden dann verwendet um eine 10 cm Platte zu inokulieren, die 10 ml des gleichen Mediums bei geringer Dichte enthielt und einzelne Zellen wurden mikroskopisch identifiziert, markiert und 2 Wochen später in einzelne Näpfchen einer 6-Näpfchenplatte gegeben, die das gleiche Medium enthielt. Die Fähigkeit dieser 6 Kolonien hGH zu produzieren, wurde durch Aussäen bei 1/10 Konfluenz in 24 Näpfchenplatten getestet und das Wachstum wurde an den Tagen 2 und 3 nach dem Transfer getestet. Eine der 6 Kolonien, die als CB515-25A bezeichnet wird, zeigte normales Wachstum und produzierte hGH zu Konzentrationen von 13 ug/ml und 22 ug/ml nach jeweils 2 und 3 Tagen Wachstum. CB515-25A wurde für die weiter unten beschriebene Produktion von hGH in Rollerflaschen verwendet.
Es wurde ebenfalls gezeigt, daß CB515-25A kein Kadmium im Medium benötigt, um das Produktionsniveau aufrechtzuerhalten. 5 gleiche Aliquots von gefrorenen CB515-25A-Zellen wurden dadurch expandiert, daß die Zellen 1:20, dann 1:7 und dann 1:10 in Rollerflaschen (das Äquivalent des 700fachen der Level, die in der Produktion benötigt werden) unter den weiter unten gezeigten Modifizierungsbedingungen des Mediums plattiert und am 1. oder 2. Tag nach dem Austausch zu serumfreien Medium und Induktion in Gegenwart von Zink wie zuvor beschrieben, auf hGH-Produktion getestet. Alle Expansionen enthielten 125 DME121/F12, 10% FCS plus 15 mM Hepes und Pen/Strep. Aliquot Zusätze hGH als % des sekretierten Proteins Tag Keine Präinduktion (nur die ersten beiden Transfers)
Diese Werte zeigen, daß keine Selektion benötigt wird um die Fähigkeit der Zellen, hohe Konzentrationen von hGH zu produzieren, aufrechtzuerhalten.
Ein zusätzlicher Satz von Transformanden wurde durch Behandeln der Zellen mit einer DNA-Mischung erhalten, die 1 ug PsvII-Neo, 10 ug phGHg-SV(10) und 10 ug pUC9-MT enthielt, wobei Ergebnisse erzielt werden, bei denen gleichzeitig von den Vorteilen der Kadmiumselektion und der Enhancer-Aktivität des SV40-Segmentes Gebrauch machen. Die Transformanden werden in 20 uM Kadmiumionen selektioniert und 10 individuelle Clone ausgewählt und in einer 96 Näpfchenschale gezüchtet. Die besten von diesen 10 Clone produzierten hGH bei 150 ug/ml.

Produktionsläufe

Standardinduktion

Die CBT-25 und CBT-37-Zellen, von denen gezeigt werden konnte, daß sie hGH unter geeigneten Bedingungen produzieren, wurden in Rollerflaschen bei 1/10 Konfluenz in ein Basismedium ausgesät bzw. geimpft, dem 10% Kälberfötenserum zugesetzt war, über Nacht inkubiert und dann durch Zugabe von Zinkchlorid in einem Konzentrationsbereich von 1·10&supmin;&sup4; M bis 3·10&supmin;&sup4; M die Produktion von Wachstumshormon induziert. Die hGH-Konzentrationen stiegen 7-10 Tage lang an, wobei schließlich unter optimalen Induktionsbedingungen, 2·10&supmin;&sup4; M ZnCl&sub2;, die Endkonzentration zu 35 mg/l akkumulierte (siehe Fig. 1).
Fig. 11 zeigt das Verhalten auf Gelen gegenüber ³&sup5;S-Methionin markierten Proteinen, die von CBI-25 und CBI-37 sekretiert werden. Nach 6 Std. Inkubation mit 1·10&supmin;&sup4; M Zinkchlorid wurde ³&sup5;S-Methionin der Kultur zugesetzt und die in das Medium sekretierten Proteine wurden mittels Elektrophorese auf 15% SDS Acrylamidgelen gefolgt von einer Autoradiographie analysiert. In Fig. 9 zeigen die Reihen 1, 2 und 3 die gesamten sekretierten Proteine von jeweils in der Reihenfolge CBI-37, CBT-25 sowie von nichttransformierten CHO-K1-Zellen. Die Medien der transformierten Zellen zeigen das Auftreten einer Hauptbande von ungefähr 22 kD, die in den nichttransformierten Zellen nicht auftritt. Die Spalten 4, 5 und 6 zeigen entsprechende Ergebnisse für Proteine, die mit Kaninchen hGH-Antiserum immunpräzipitiert wurden. Aus den Ergebnissen im Immunpräzipitat geht hervor, daß zwei Hauptproteinbanden auftreten, die 22 kD und 20 kD entsprechen. Der Anteil der 20 kD Bande beträgt ungefähr 10% der Gesamtmenge entsprechend der zweiten (20 kD) Variante, die im Wachstumshormon gefunden wird, das von der menschlichen Hypophyse produziert wird.
Verlängerte Belichtung bei der Autoradiographie zeigt auch zwei weniger verwandte Arten mit höherem Molekulargewicht, die mit dem Präwachstumshormon und dem Prä-20 kD Wachstumshormon übereinstimmen. Die Identität der 22 kD Spezies mit dem reifen hGH wurde durch Vergleich mit Hypophysen-hGH in reduzierter und nicht reduzierter Gelelektrophorese bestätigt, sowie durch die Fähigkeit mit radiomarkiertem hGH an Wachstumsrezeptoren bei IM9 menschlichen Lymphozyten kompetitiv in Wechselwirkung zu treten (Rosenfeld, R. G. et al, Biochem Biophys Res Comm (1982) 106:202)

Produktion in serumfreien Medium

CBI-37-Zellen wurden ebenfalls unter Bedingungen einer Pilotproduktion wachsen gelassen und in Abwesenheit eines Serums induziert. Die Zellen wurden in eine 490 cm² Rollerflasche mit Coon's F12/DME21, 1/1 Medium mit 10% Kälberfötenserum und 15 mM Hepes ausgesät. Wenn die Zellen beinahe Konfluenz erreicht hatten (3-5 Tage) wurden die Zellen 2· mit Ca&spplus;² und Mg&spplus;² enthaltenden PBS gewaschen und das Medium wurde gegen das gleiche Basismedium ausgetauscht (serumfrei und einschließlich 15 mM Hepes), das 6-8·10&supmin;&sup4; M Zinkchlorid und 3·10&supmin;&sup5; M Eisen (II) Ionen anstatt des zugesetzten Kälberfötenserums enthielt. (Es wurde gefunden, daß anstelle der Eisenionen menschliches Transferrin bei mindestens 5 ug/ml eingesetzt werden konnte). Das Wachstum wurde unter diesen Bedingungen dadurch fortgeführt, daß das Medium 2-3· wöchentlich geerntet wurde und durch frisches serumfreies Medium ersetzt wurde. Das sekretierte hGH wurde mit einer Rate von 2,5 mg/Tag geerntet. Proportional größere Mengen an hGH wurde durch Produktion in Flaschen erhalten, die 2-4· so groß waren. Die Produktion kann beliebig lange ausgedehnt werden und wurde bis zu 8 Wochen fortgesetzt.
Fig. 12 zeigt die Ergebnisse auf SDS-PAGE mit den Proteinen des zuvor erhaltenen Mediums, die mit Coomassie-Blau gefärbt wurden. Das CBT-37 Zellmedium zeigt die Gegenwart von hGH- Arten, die nicht in den Vergleichen auftreten und eine Reinigung der Mediumproteine mit einer einzigen Gelpermeationssäule ergibt hGH, das ungefähr 90% rein ist, wie dort gezeigt ist.
Zusätzliche ähnliche Produktionsläufe wurden unter Verwendung eines Kadmium resistenten Transformanden, der phGHg-MT (Cd-5-15) enthielt und mit einem Transformanden, der phGHg- SV(10) (V-18) enthielt, zu Vergleichszwecken durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt. Als Tag 0 wird derjenige Tag gezählt, an dem das Präinduktionsmedium verworfen wird und die Zellen wieder mit einem Medium ernährt werden, das 6-8·10&supmin;&sup5; M Zinkionen, 3·10&supmin;&sup5; M Eisen (II) und 15 mM Hepes enthält. Tabelle 1 Tag hGH akkumuliertes hGH (mg/Roller)* *Jede Rollerflasche enthält 250 ml Medium.
Wie zuvor gezeigt, beträgt die durchschnittliche pro Tag akkumulierte hGH-Menge in der Rollerflasche bei CBI-37 1,9 mg/Tag (7,6 ug/ml/Tag), für Cd-5-15 4,4 mg/Tag (17,6 ug/ml/Tag) und für V-18 4,1 mg/Tag (16,4 ug/ml/Tag).
Zusätzliche Produktionsläufe wurden durchgeführt um nachzuweisen, daß für die Cd-5-15-Zellen die Zugabe eines Induktionsmediators nicht notwendig war. Die cd-5-15-Zellen wurden in 3 separate Flaschen, zwei 1750 cm² und eine 490 cm², ausgesät, bis zur Konfluenz wachsen gelassen und dann wie zuvor beschrieben, induziert, wobei jedoch in dem Induktionsmedium der 490 cm² Flasche und einer der 1750 cm² Flaschen kein Eisen zugesetzt wurde. Alle zeigten eine gleichförmige lineare Produktion von hGH bei annähernd der gleichen Rate für einen Zeitraum von 11 Tagen nach Induktion. Nach 11 Tagen betrugen die Vergleichsmengen des gesamten akkumulierten hGHs (normalisiert auf die 1750 cm² Flaschen) 93 mg für die Flasche, die Eisen enthält und 70 mg sowie 95 mg jeweils für die 1750 cm² und für die 490 cm² Flaschen, in denen kein Eisen vorhanden war. Diese Werte zeigen, daß beim Vorliegen des vollständigen Metallothionein-Genes kein Induktionsmediator vorliegen muß.

D. S.b. Alveoläres Surfaktansprotein

Plattentest

Zellpools, die mit verschiedenen ASP codierenden Plasmiden transformiert waren, wurden in Mehrfachnäpfchenplatten gezüchtet und dann einer Zinkionkonzentration von 5·10&supmin;&sup5; bis 1·10&supmin;&sup4; ausgesetzt um die Bildung von ASP zu induzieren. ASP-Tests wurden unter Verwendung der Western Blot Technik durchgeführt, wobei eine Immunopräzipitation mit einem polyclonalen Kaninchen-Anti-Human-ASP-Antiserum durchgeführt wurde, gefolgt von ¹²&sup5;I Protein A und einer Autoradiographie.
Genauer gesagt wurden semi-konfluente Monoschichten von einzelnen Zellinien in McCoy's 5A Medium mit 10% FBS wachsen gelassen und mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und nochmals mit einem McCoy's Medium ernährt, das 10% FBS, 1·10&supmin;&sup4; Zinkchlorid und 0,25 mM Natriumascorbat enthielt. (Ascorbat kann darin helfen, die Hydroxylierung von Prolinresten zu unterstützen.) 24 Std. nach der Induktion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und wieder mit serumfreien McCoy's Medium ernährt, das das Zinkchlorid und Ascorbat enthielt. Nach 12 Std. wurden die konditionierten Medien geerntet, mit Tris, pH 8 auf 20 mM eingestellt und durch Nitrozellulose in einem BRL "Dot-Blot"-Apparat filtriert. Die Nitrozellulosefilter wurden in 50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl (Tris/Salz), das 5% nichtfette Trockenmilch enthielt, blockiert und dann mit einer 1:5000 Verdünnung eines polyclonalen Kaninchen Anti-Human ASP Antiserums in der Blockierungslösung inkubiert, mehrfach in dem zuvor genannten Tris/Salz gewaschen und mit 25 uCi ¹²&sup5;I Protein A in der Blockierungslösung inkubiert, gewaschen und einer Autoradiographie unterzogen.
Die meisten mit dem ASP codierenden Vektor transformierten Pools bildeten kein in diesem Test nachweisbares ASP. Es wurde jedoch eine ASP sekretierende Zellinie, die als A-38 bezeichnet wird, von den pMT-ASPg-Apo-Transformanden selektioniert. Darüberhinaus bildeten verschiedene Pools der mit pASPc-SV(10) transformierten Zellen, die als ASP-I bezeichnet wurden, (der mit pASPcg-SV(10) transformierten Zellen, die als ASP-F und als ASP-G bezeichnet wurden, ASP in Mengen die zu denjenigen der Zellinie, die als D-4 bezeichnet wird und weiter unten beschrieben ist, vergleichbar waren (ungefähr 2-5 ug/ml).

Charakterisierung von ASP Protein

Die A-38-Zellen (Supra) wurden bis zu 25%iger Konfluenz in McCoy's 5A Medium wachsen gelassen, das 10% FBS enthielt und dann mit 10&supmin;&sup4; M Zinkchlorid in einem 10% FBS und 25 mM Natriumascorbat enthaltenden McCoy's Medium induziert. (Die Hälfte der Zellen wurden auch mit 10&supmin;&sup6; M Dexamethason behandelt.) 24 Std. später wurden die Zellen mit PBS gewaschen und wieder mit einem RPMT Medium ernährt, das 10% dialysiertes FBS, 1·10&supmin;&sup4; M Zinkchlorid, 0,25 mM Natriumascorbat und 0,5 mCi/ml ³&sup5;S-Methionin enthielt.
18 Std. später wurde der Zellüberstand auf 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid eingestellt und mit einem Kaninchen Anti-Hund ASP-Antiserum unter Verwendung von Protein A als Carrier immunpräzipitiert. Die Hälfte des präzipitierten Proteins wurde in einen SDS-PAGE Probenpuffer gekocht und die andere Hälfte in 0,5% Triton X-100, 0,075% SDS, 0,75% 2-Mercaptoethanol, 30 mM EDTA, 75 mM Natriumphosphat, pH 1 eluiert und 1 Std. lang bei 370C mit 0,5 Units von Endoglycosidase-F (Endo-F) inkubiert. Die Endo-F behandelten und die unbehandelten Proteinfraktionen wurden einer SDS-PAGE unterzogen und die Ergebnisse sind in Fig. 13 dargestellt. Die Endo-F behandelten Fraktionen zeigten ein 30 kD Protein (Spalte F) im Vergleich zu einem 38 kD Protein für die unbehandelte Fraktion (Spalte E). (Spalte M enthält Größenmarker, Spalten A und B die Überstände der nichttransformierten CHO-Zellen und Spalten C und D die Überstände von A-38-Zellen, die unbehandelt oder mit Dexamethason, respektive, behandelt waren.)

Supertransfektion zur Herstellung von D-4

Eine zusätzliche Zellinie, die als D-4 bezeichnet wird, wurde durch Supertransfektion von A-38 mit einer Mischung von pMT- ASPg-Apo (20 ug) und pSV2:GPT (1 ug) erhalten. Semi-konfluente Monoschichten von A-38, die in F12/DMEM21 mit 10% FBS wuchsen, wurden wie zuvor beschrieben, co-transfektiert. Nach 48 Std. wurden die Zellen 1:5 in 10% FBS enthaltendes F12/DMEM21 aufgespalten und eine HAT Selektion mit Drogen durchgeführt. Nach 17 Tagen einer. HAT Selektion wurde der Pool von überlebenden resistenten Clonen auf individuelle Clone, die hohe Mengen an ASP bilden, mittels dem Immunofilterscreenverfahren von McCracken, A. A. et al, Biotechnigue (März/April 1984) 82-87, gescreent. Genauer gesagt, die Zellen wurden auf Platten zu 100 Zellen pro 100 ml Schale in F12/DMEM21, 10% FBS ausgesät. Nach 5 Tagen (wenn die Kolonien jeweils 50-200 Zellen enthielten) wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit einem serumfreien F12/DMEM21 wieder ernährt und mit einem sterilem Teflonnetz überschichtet. Auf die Oberseite des Netzes wurde ein Nitrozellulosefilter gelegt, der dort 8 Std. lang liegengelassen wurde. Die Nitrozellulose wurde entfernt und mit einem Immuno Blot behandelt, zuerst mit polyclonalem Kaninchen Anti-Hund ASP Antiserum, dann mit ¹²&sup5;I Protein A gefolgt von einer Autoradiographie. Von den ungefähr 2000 gescreenten Kolonien zeigten 2 ein nachweisbares Signal und bei einem, das als D-4 bezeichnet wurde, konnte gezeigt werden, daß es das ASP-Gen in einer 10-20x höheren Zah) als A-38 enthält oder in einer Menge, die schätzungsweise 2-5 ug/ml ASP entspricht.

Charakterisierung

Das sekretierte ASP von der D-4 Zellinie wurde aus dem serumfreien Medium mittels Affinitätschromatographie isoliert und mit einem Gasphasenmikrosequenzapparat am N-Terminus sequenziert. Die Bestimmung einer 16 Aminosäuren langen Sequenz zeigte vollständige Homologie mit dem N-terminalen Teil des Proteins, das aus der Lungenspülung isoliert wurde; 70% der Gesamtmenge enthielt am N-Terminus einen Glu-Rest; die verbleibenden 30% waren gestutzt, so daß sie ein N-terminales Val enthielten (Position 2 bezogen auf das Glu). Dies ist die gleiche Zusammensetzung wie das isolierte Protein der Lungenwaschung. Hydroxyproline lagen an den Positionen 10, 13 und 16 vor, was die Fähigkeit der Zellen anzeigte, ein posttranslationales Prozessing durchzuführen.
Zusätzlich wurde das Protein, das von D-4 zusammen mit der sekretierten Proteinfraktion von Pool ASP-I (Supra) und von Pool ASP-G (Supra) mit den Proteinen einer menschlichen Proteinose Lungenwaschung verglichen, wobei die Western Plot Technik verwendet wurde. Serumfreies Medium von induzierten Zellen wurde mit TCA ausgefällt, mit Endo-F behandelt (oder nicht) und einem SDS-PAGE in 12%igen Gelen unterzogen. Das Gel wurde einem Elektroplotting unterworfen und mit polyclonalen Kaninchen Anti-Human ASP Antiserum "Dot inkubiert", gefolgt von ¹²&sup5;I Protein A. Die Ergebnisse sind in Fig. 14 dargestellt.
Die Spalten A und F enthielten 1 ug alveoläres Proteinosis- Protein, und zwar respektive vor und nach Endo-F Verdauung, die Spalten B, C und D zeigen Medium von D-4, ASP-1 Pool und ASP-G Pool, jeweils unbehandelt mit Endo-F, Spalten G, H und I zeigen Proteine von diesen Überständen, die mit Endo-F behandelt wurden. Es ist offensichtlich, daß die Endo-F Behandlung das scheinbare Molekulargewicht von sämtlichen Proteinen vermindert und sich dadurch mehrere diskrete Banden ergeben.

Produktionsläufe

Die supertransfektierten Zellen, die mehrere Kopien von pMT- ASPg-Apo enthielten (Zellinie D-4) wurden für einen Produktionslauf in Rollerflaschen verwendet. In ein 850 cm² Rollerflasche wurde mit einer 10 cm Schale, die 2·10&sup6; Zellen in 10% FCS, 15 mM Hepes, Pen/Strep und Glutamin enthielt, ausgesät. Nachdem die Zellen Konfluenz erreicht hatten (2-3 Tage), wurden sie 2· mit PBS gewaschen und gegen 250 ml F12/DMEM21, 10 mM Hepes ohne FCS ausgetauscht. Am folgenden Tag wurden die Zellen mit 250 ml F12/DMEM21, 10 mM Hepes, 5·10&supmin;&sup5; Zinkchlorid, 10&supmin;&sup6; M Dexamethason und 0, 25 mM Ascorbat wieder ernährt. Die Zellen wurden jeden 2. Tag geerntet, 10 Min. bei 1000 rpm zentrifugiert und bei -20ºC eingefroren. Die Produktion betrug 1-5 ug/ml/Tag gemäß einem "Dot Blot Western" -Test unter Verwendung von polyclonalem Anti-Hund ASP Antiserum bei 1:5000 Verdünnung wie zuvor beschrieben. Die Produktion fällt nach etwa 14-17 Tagen ab.

D.5.c. Apolipoproteine

Plattentest

Bei Zellen, die mit Apolipoprotein-Expressionsvektoren transformiert waren, wurde die Produktion von Apolipoprotein durch Nachweis eines Proteins bestätigt, das das korrekte Molekulargewicht aufweist, wenn man die Zellen ³&sup5;S Methionin aufnehmen ließ.
Transformanden mit entweder pHS1' (als Kontrolle) oder pMT-AI wurden zu 70%iger Konfluenz in 9,6 cm² Näpfchen in Standard Medium (RPMT plus 10% dialysiertes FBS) wachsen gelassen. Die Zellen wurden mit 1,5·10&supmin;&sup4; M Zinkchlorid 7 Std. lang präinkubiert, wonach 0,15 ug/ml L-[³&sup5;S] Methionin zugesetzt wurde. Die Zellen wurden in Gegenwart des Markers über Nacht inkubiert und das Medium geerntet. Ein Teil des Mediums der 1·10&sup5; cpm enthielt, wurde auf SDS Gelprobenpuffer gegeben und 2 Min. lang bei 100ºC inkubiert, ein zweiter Teil (5·10&sup5; cpm) wurde unter Verwendung von 50 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,15 M NaCl, 0,1 mM EDTA und 2% (V/V) Triton-X 100 auf ein Endvolumen von 1 ml eingestellt. 2 ml Kaninchen Anti-Human ApoAI wurde der Suspension zugegeben, die dann inkubiert, mit Protein A Sepharose umgesetzt und gewaschen wurde.
Pools von Zellen, die mit pMT-AT transformiert waren, in Gegensatz zu mit pHS1' Transformanden, zeigten die erwartete 25 kD Bandencharakteristik des reifen nativen ApoAIs, wenn es auf Gelen chromatographiert wurde, wobei diese Bande speziell gegen Human ApoAI immunreagiert.
Auf ähnliche Weise wurden CHO-Zellen mit pMT-AII transformiert und die Produktion von ApoAII Protein nachgewiesen.
Um einzelne Kolonien aus dem AI produzierenden Pool zu erhalten, wurden die Zellen bei geringer Dichte (100-200 Zellen/ml) in F12/DMEM21 mit 10% FBS plattiert um nach 4-7 Tagen bei 37ºC einzelne Kolonien zu bilden. Die Kolonien wurden aufgesammelt und man ließ sie bis zu einer Zelldichte von 106 Zellen/ml wachsen um sie dann einzeln mittels "Dot Blot Western Technik" unter Verwendung des Verfahrens von Jahn et al, Proc Natl Acad Sci (USA) (1984) 81:1684-1687 auf ApoAI Expression zu testen.
Zur ApoAI Produktion wurden die einzelnen Kolonien bei 25%iger Konfluenz in 12 Napfschalen in 1,5 ml F12/DMEM21 plus 10% FBS ausgesät. Nach 24 Std. wurden die Zellen mit 1 ml PBS gewaschen und frisches Medium, das 1·10&supmin;&sup4; M Zinksulfat enthält, wurde zu Beginn der Präinduktion zugesetzt. 16 Std. später wurden die Zellen 2· mit 1 ml PBS gewaschen und wieder mit 0,65 ml serumfreien Medium ernährt, das 3·10&supmin;&sup5; M Zinksulfat und 3·10&supmin;&sup5; M Eisen (II) Sulfat enthielt. Nach 48 Std. serumfreier Induktion wurde das Medium geerntet, bei 1000 rpm 5 Min. zentrifugiert um alle Bruchstücke zu entfernen und 0,5 ml des Überstandes wurde auf einen Nitrozellulosefilter zum Austesten, wie von Jahn et al (Supra) beschrieben, aufgebracht.
An einer hochproduzierenden ApoAI Zellinie, die als Clon 104 bezeichnet wird, wurde außerdem nachgewiesen, daß sie ApoAI produziert, welches ³&sup5;S Methionin inkorporiert enthält. ApoAI von diesen Zellen wird in einem 30· höheren Level produziert als in den Poolzellen und ist allein durch die Gesamtmenge an in das Medium sekretierten Protein ohne eine Immunpräzipitation zu identifizieren. Clon 104 wurde bei der Amercian Type Culture Collection am 03. Oktober 1985 hinterlegt und hat die ATCC Nr. 8911.

Wirkung des Enhancers

Pools von transformierten Zellen wurden selektioniert und unter Verwendung mit pAIg-SV(9) und pAIg-SV(10) transformierten Zellen auf ApoAI Produktion gescreent. Es wurden einzelne Kolonien von diesen Pools, wie zuvor beschrieben, erhalten und diese wurden in Kultur gezüchtet und zur Produktion von ApoAI induziert.
Zum Vergleich der Expressionsniveau mit demjenigen der Kontrollen (pHS1' und pMT-AI) wurden die einzelnen Kolonien einer Analyse auf ApoAI im Medium wie folgt unterzogen: Nach 48 Std. einer serumfreien Induktion und Zentrifugation um alle Zellbestandteile zu entfernen, wurde das Protein aus 0,4 ml Proben des Mediums durch Zugabe von TCA auf 10% ausgefällt und 20 ul Rinderinsulin wurde als Carrier-Protein zugegeben. Die Proben wurden 30 Min. lang auf Eis inkubiert, worauf eine Zentrifugation bei 3000 rpm für 30 Min. bei 4ºC folgte. Die Niederschläge wurden 1· mit 0,5 ml eiskaltem Aceton gewaschen und dann in 40 ul SDS Gelprobenpuffer gelöst und einem 10-20% Gradienten SDS-PAGE Gel gemäß dem Verfahren von Laemmli unterzogen (Nature (1970) 227:680). Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt, wobei die Ergebnisse erhalten wurden, die in Fig. 15 angegeben sind. Spalte 1 ist die pHS1' Kontrolle, Spalte 11 sind die Zellen, die mit pMT-AI transformiert sind, Spalten 18 und 19 sind die Zellen, die mit pMT-AI transformiert sind, jedoch in Kulturen von Rollerflaschen wuchsen (was sich durch eine höhere Produktion ausdrückt) und Spalte 20 enthält Molekulargewichtsmarker. Die Spalten 2-10 sind verschiedene einzelne Kolonien von pAIg-SV(9) Transformanden. Spalten 12-17 sind individuelle Kolonien von pAIg-SV(10) Transformanden, Spalten 2 und 12 sind Pools, die pAIg-SV(9) und pAIg-SV(10) respektive enthalten.
Aus Fig. 15 ist ersichtlich, daß die meisten der einzelnen Kolonien ApoAI in Mengen produzieren, die höher sind als die nicht durch einen Enhancer verstärkten Vektortransformanden. Die Produktionsspiegel werden auf ungefährt 30 ug/ml bestimmt.

Produktionsläufe

Die pMT-AI transformierten Zellen, die als Clon 104 bezeichnet werden, wurden in 850 cm² Rollerflaschen wachsen gelassen, wie zuvor für pMT-ASPg-Apo beschrieben. Nach 2 Tagen Inkubation in dem Originalserum enthaltenden Medium bei 37ºC wurde Zinksulfat zu einer Konzentration von 1·10&supmin;&sup4; M zugegeben und 1 Tag später wurden die Zellen in ein serumfreies F12/DMEM21 Medium gebracht, das 6·10&supmin;&sup5; M Zinksulfat zur Induktion von ApoAI Produktion enthält. Dieser Tag wird als "Tag 0" bezeichnet. Nach dem Tag 0 wurde das Medium periodisch auf ApoAI Produktion getestet, indem man einen Teil des Mediums zum Abtrennen der Zellbestandteile zentrifugiert, worauf ein Fraktionieren des Mediums auf SDS Gelelektrophorese und Anfärben mit Coomassie- Blau folgte. Die gefärbten Gele wurden gescannt, um die Menge von ApoAI Protein quantitativ zu bestimmen, wobei ein gereinigter ApoAI Standard, der von Calbiochem (La Jolla, CA) erhältlich ist, verwendet wurde. Die Zellen wurden, wie zuvor beschrieben, periodisch wieder ernährt. Die ApoAI Expression nahm während der ersten 6 Tage von etwa 10 ug/ml/Tag bei Tag 2, auf 20 ug/ml/Tag bei Tag 5 zu und erreichten ein Platteau bei 30 ug/ml/Tag.

Charakterisierung und Komplexierung von ApoAI}0

Es wurde gezeigt, daß die Kulturüberstände von den Produktionsläufen der vorhergehenden Abschnitte ein korrektes Prozessing durchliefen und daß sie Lipoproteinkomplexe bilden, die den natürlich gefundenen ähnlich sind.
Die Fähigkeit des ApoAI mit endogen Lipiden in den CHO-Zellen zu komplexieren, wurde wie folgt nachgewiesen: Das Medium wurde durch Zugabe von festem Kaliumbromid auf eine Dichte von 1,125 g/ml eingestellt, dann 18 Std. lang in einem Ausschwingrotor bei 38 K rpm zentrifugiert. Die oberste Fraktion wurde durch herkömmliche Slicing-Technik entfernt und extensiv gegen Salz dialysiert. Das Material ergab auf einer SDS Gelelektrophorese eine vorherrschende Bande im 25 kD Bereich, die dem ApoAI entspricht. Etwa 10-20% des gesamten ApoAI wurde in der oberen Fraktion gefunden, was durch die relativen Farbintensitäten der 25 kD Banden auf den SDS Gelen bestimmt wurde.
Eine elektronenmikroskopische Aufnahme des Materials der Top- Fraktion zeigt das Vorliegen von unzähligen Disc-förmigen Strukturen, die für die im Serum vorliegenden ApoAI/Phospholipidkomplexe charakteristisch sind (beschrieben von Hamilton, R. L. et al, J Clin Invest (1976) 58:667-680) wie dies in Fig. 16 gezeigt ist.
Die Fähigkeit des ApoAI mit INTRALIPID (Cutter Labs, Berkeley, CA) zu komplexieren, wurde in einem weiteren Versuch nachgewiesen. INTRALIPID ist eine künstliche Lipidemulsion, die aus Sojabohnen Triacylglycerin und Eilecithinen zusammengesetzt ist. Die Mesophase oder der phospholipidreiche Teil der Emulsion wurde durch eine Ultrazentrifugationsflotation in einem kontinuierlichen Sucrosegradient entfernt. Die Bodenschicht enthielt 2 ml der Emulsion, 0,6 g Sucrose und Kochsalz in einem Endvolumen von 4 ml und einer Dichte von 1,06 g/ml. Diese Schicht wurde in einem Polyallomerröhrchen eines Beckman SW41 Rotors mit 6 ml einer NaCl-Lösung mit d=1,02 g/ml überschichtet. Schließlich wurde noch eine dritte Schicht von 2 ml einer Salzlösung mit d=1,006 g/ml hergestellt. Die Zentrifugation wurde 60 Min. lang bei 28,000 rpm bei 10ºC durchgeführt.
Nach der Zentrifugation wurde die Triglycerid-reiche Emulsion, die oben auf dem Gradienten lag, von der darunter schwimmenden Lösung unter Verwendung eines Beckman Slicers mittels einer Röhren-Slicing-Technik abgetrennt.
Das Kulturmedium wurde durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Amicon YM 10 Membran zum 100-fachen aufkonzentriert. Das konzentrierte Medium wurde mit gereinigtem INTRALIPID inkubiert und, wie zuvor für das INTRALIPID beschrieben, zentrifugiert mit der Ausnahme, daß nur ein Zentrifugationsschritt verwendet wurde. Dabei wurden Lipid-zu-Protein Verhältnisse von jeweils 0,1, 0,3 oder 0,6 ml von konzentriertem Medium pro ml INTRALIPID verwendet.
Von jeder Top-Fraktion wurde eine Probe einer Lipidentfernung unterworfen, auf SDS-PAGE fraktioniert und die Gele mit Coomassie-Blau angefärbt. ApoAI ist das einzige Hauptprotein, das sich mit der weniger dichten INTRALIPID Fraktion abtrennen läßt und erhöhte Mengen des Mediums ergaben auch erhöhte Mengen von gereinigtem ApoAI. Die Reinheit von ApoAI betrug etwa 95% und wurde durch die Farbdichte des Gels bestimmt. Die Fraktion, die nicht mit INTRALIPID behandelt wurde, enthält etwas ApoAI und andere verunreinigende Proteine, die von den CHO-Zellen sekretiert werden.
Das ApoAI von den obigen Produktionsläufen wurde für weitere Komplexierungsstudien wie folgt weiter aufgereinigt: Der ApoAI angereicherte, von Lipiden befreite Proteinniederschlag wird in 0,01 M Tris-HCl, pH 8,3 Puffer gelöst, der dem Harnstoff zu einer Konzentration von 6 M zugegeben wurde. Ein 50 ul Aliquot wurde in ein "High Performance Liquid" Chromatographie System (HPLC) mit einer C&sub1;&sub8;-Säule eingespritzt, die mit einer 20%igen Acetonitrillösung, die 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) enthielt, equilibriert war. Nach einem Einspritzen der Probe wurde mit einem Acetonitrilgradienten von 20%-70%, der 0,1% TFA enthielt, mit einer Elutionsgeschwindigkeit von 2 ml/Min. eluiert, wobei ein einziger Hauptpeak erhalten wurde. Die Fraktionen, die zu diesem Peak gehörten, wurden vereinigt und das Acetonitril wurde im Vakuum entfernt. Der getrocknete Rückstand wurde in Phosphatpuffer gelöst und auf SDS-PAGE analysiert, wobei nur eine einzige 25 kD Bande erhalten wurde.
Ein 39-aminosäurelanges N-terminales Segment des gereinigten Proteins wurde sequenziert und es wurde gefunden, daß 95% des Gesamtproteins das reife Protein ist. Die verbleibenden 5% enthielten die zusätzlichen 6 Aminosäuren der ProApoAI-Sequenz.
Das gereinigte ApoAI wurde zum Komplexieren mit wiederaufgereinigtem Eiphosphatidylcholin (PC) verwendet, das von Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO) erhältlich ist. Das PC wurde in Ethanol gelöst (4 mg/ml). Die Lipidlösung (4 ml) wurde unter Vakuum zu einem dünnen Film getrocknet und mit 2 ml PBS, pH 7,4 hydratisiert. Die trübe Suspension wurde 1 Std. lang bei 15ºC unter einem Stickstoffstrom ultraschallbehandelt. Die ultraschallbehandelte Suspension wurde 1 Std. lang mit 38 K rpm zentrifugiert und der Überstand, der unilamellare und multilamellare Liposomen enthält, wurde sorgfältig entfernt.
Das ApoAI wurde mit den PC Liposomen in einem Gewichtsverhältnis von 1:5 bei 37ºC 1 Std. lang inkubiert. Nach Inkubation wurde an die Liposomen gebundene ApoAI von freiem ApoAI durch Gelfiltration auf einer 10% Agarosesäule abgetrennt. Das Material wurde dann mittels einer Negativfärbung im Elektronenmikroskop analysiert.
Fig. 17 zeigt (a) die vielen Disc-artigen Strukturen, die sich in Gegenwart von AI gebildet haben und (b) das Fehlen von nachweisbaren lamellaren Vesikelstrukturen. Die Disc-artigen Strukturen sind in ihrer Erscheinung ähnlich den nascenten HDL-artigen Partikeln, die aus dem Leberperfusat isoliert werden (siehe Hamilton, R. L. et al, Supra)
Die Fähigkeit des gereinigten ApoAI Emulsionen im Serum zu stabilisieren, wurde wie folgt nachgewiesen. Die Emulsion wurde mit Protein Al, das wie zuvor beschrieben gereinigt wurde, in einem Gewichtsverhältnis von 100:2 mg Emulsion Lipid/mg AI gemischt. Die Mischung wurde 1 Std. lang bei 37ºC unter Schütteln inkubiert um ApoAI an die Emulsion zu binden. Ungebundenes ApoAI wurde durch Zentrifugation entfernt.
Es wurde ein Serum von Ratten verwendet, die mit Turpentin (5 ml/kg) behandelt wurden sowie wie von Kontrollratten, die mit Kochsalz behandelt waren. In jedem Test wurden 180 ul Serum mit 20 ul der Lipidemulsion 2 Std. lang bei 37ºC unter leichtem Schütteln inkubiert. Nach Inkubation, wurden die Lipid- Partikeldurchmesser mittels Laserlichtstreuung unter Verwendung eines "sub-Micron-Partikel" Analysators mit wahlweiser Größenverteilungsprozessanalyse und multiplem Streuungswinkelnachweis bestimmt (Coulter Model N4, Hialeah, FL)
Die Lipidemulsion ohne ApoAI war in dem Serum von Ratten, die mit Turpentin behandelt waren, nicht stabil und zeigte eine bimodiale Größenverteilung um 200 nm herum und um 500 nm herum. Im Gegensatz dazu zeigte die Emulsion, die ApoAI enthielt, keine signifikante Größenänderung durch die Einwirkung von Serum, das von Turpentin behandelten Tieren erhalten wurde. Beide Emulsionen zeigten stabile Größen in Seren von Kontrollratten.

D. 5.d. Ntrio-natriuretischer Faktor

An CHO-Zellen, die mit pMT'-ANF in einer wie zuvor beschriebenen Art und Weise transformiert wurden, wurde nachgewiesen, daß sie ANF bildeten, wenn sie in Harris F-12 Medium gezüchtet wurden, dem 10% Kälberfötenserum zugesetzt wurde, wobei ein Radioimmunoassay und ein Radiomarkieren mit ³&sup5;S Methionin verwendet wurde. In den ³&sup5;S-Methionintests erschienen Banden bei 18 kD und 10 kD, die dem Pro-ANF und einem Fragment davon entsprechen. Eine isolierte Kolonie zeigte eine solche Produktion und diese wird als CHO-8/2-81 bezeichnet und wurde bei der ATCC am 09. April 1985 hinterlegt und hat die Hinterlegungsnr. CRL-8782 erhalten.
Das ANF selbst kann aus dem 18 kD Pro-ANF dadurch hergestellt werden, daß man eine begrenzte Proteolyse unter Verwendung von Trypsin oder Kallikrein durchführt wie dies in Currie et al (Proc Natl Acad Sci (USA) (1984) 81:1230-1233) beschrieben ist.

D.5.e. Erythropoietin

Plattentests

Jedes der Plasmide pMT-Epo, pEpo-SV(10), pEpo'-SV(10) und pEpo-MT wurde verwendet um CHO-Zellen, wie zuvor für die wechselnden Konstruktionen in den vorhergehenden Paragraphen beschrieben, zu transformieren. Die Epo Produktionsspiegel wurden durch Testen des Mediums gemäß dem Verfahren von Krystal, G., Exp Hematol (1983) 11:649-660 festgestellt, bei dem die Tritium markierte Thymidinaufnahme in Milzzellen von mit Phenylhydrazin behandelten Mäusen angewendet wird. (Es wird angenommen, daß 1 mg gereinigtes Standard Erythropoietin eine Aktivität von 70.000 internationalen Units aufweist.)
Pools, die pEpo-SV(10) Transformanden enthielten, produzierten unter den gleichen Bedingungen die etwa 10-fache Menge als solche, die mit pMT-Epo transformiert wurden, obwohl beide schwache Produzenten waren: 8 IU/ml (0,1 ug/ml) im Gegensatz zu 0,5 IU/ml (0,01 ug/ml). Pools dieser Zellen, die mit dem das veränderte Gen enthaltenden Plasmid pEpo'-SV(10) transformiert wurden, bildeten 2080 IU/ml (30 ug/ml)
Zellen, die mit pEpo-MT transformiert, jedoch nicht auf Kadmium-Resistenz selektioniert wurden, produzierten Epo in der gleichen Menge wie diejenigen, die mit pMT-Epo transformiert wurden, wenn diese jedoch auf Resistenz gegenüber 5 uM Cd&spplus; präselektioniert wurden (wie zuvor für hGH in D.5.a beschrieben), wurde eine 5-fache Zunahme an Expression erhalten. Zusätzlich konnte die Cd&spplus;² Resistenz verwendet werden, um erfolgreiche Transformanden in Verbindung mit pSV2-NEO zu selektionieren. Zellen, die mit jeweils 2 ug oder 10 ug von pUC9-MT mit 15 ug pEpo-SV(10) und 1,5 ug pSV2-NEO behandelt wurden, konnten direkt auf Cd&spplus;² resistente Clone selektioniert werden.

Produktionsläufe

Ein Clon, der besonders wirksam Erythropoietin produziert, ein pEpo'-SV10 Transformand, der als Epo-E bezeichnet wird, wurde bei einem Screening des Epo'-SV10 Pools in 96-Näpfchenplatten unter Verwendung eines Immunoblots ausgewählt, wobei die 12 besten Clone ausgewählt wurden und diese Clone in eine 12- Näpfchenplatte übertragen wurden, dann wurde auf Erythropoietinproduktion induziert und mittels Immunoblot getestet und einer von 4 Clonen, die etwa 10.000 Units/ml bildeten zum Wachstum und zur Induktion in Rollerflaschen ausgewählt. Dieser Clon, der als Epo-E bezeichnet wird, wurde verwendet um damit fünfzehn 1750 cm² Rollerflaschen mit jeweils 500 ml Medium bei 1/10 Konfluenz anzusäen. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz 4 Tage lang wachsen gelassen, 2· mit PBS gewaschen und mit einem serumfreien Medium, das 60 uM Zink und 30 uM Fe&spplus;² enthielt, ernährt um die Produktion des gewünschten Proteins zu induzieren. 4 Tage nach der Induktion enthielten die Zellen den 10.000 Unit/ml Produktionsspiegel, der in der Produktion 75 Millionen Units Erythropoietin in einem 7,5 l Ansatz ergab.

D.5.f. Renin

Plattentest

Pools von CHO-Zellen, die auf G418 Resistenz nach der Transformation mit pMT-PPRen selektioniert wurden, bildeten Renin nach Induktion mit 5·10&sup5; Zinksulfat und 10&supmin;&sup6;6 M Dexamethason in Mengen von 0,02-0,2 ug/ml. Durch Vergleich auf SDS Gelen mit ³&sup5;S Methionin markierten sekretierten Renin mit und ohne Behandlung mit Endo-F, konnte gezeigt werden, daß das so produzierte Renin glycosyliert war.
Durch geeignete Selektion können wesentlich höhere Spiegel der Reninproduktion erreicht werden. Gemäß einer Vorgehensweise werden Zellen des Transformandenpools in Gegenwart von 5·10&supmin;&sup5; M Zinksulfat in serumfreies Medium plattiert und Kolonien, die unter diesen Bedingungen wuchsen, wurden ausgewählt, in Serum enthaltendem Medium expandiert und dann auf Reninproduktion unter Standardinduktionsbedingungen, wie zuvor beschrieben, getestet. Die höchsten reninbildenden Clone, die nach dieser Vorgehensweise erhalten wurden, produzierten durchschnittlich 0,8 ug/ml und 1 Clon dieser Klasse, der als CBI-2B5 (Supra) bezeichnet wird, wurde bei der ATCC mit der Hinterlegungsnr. CRL 8758 hinterlegt.
In einem zweiten Versuch wurden die Zellen von diesem Pool plattiert und auf einem Polyesterblatt repliziert. Das Replikablatt wurde dann gegen einen Nitrozellulosefilter zum Binden der sekretierten Zellproteine gelegt. Die Filter wurden mit Anti-Prorenin Antiserum umgesetzt, gefolgt von Behandlung mit ¹²&sup5;I Protein A. Clone, die gemäß diesem Test die höchsten Produktionsspiegel an Reninsekretion zu bilden schienen, wurden ausgewählt, in einem Serum enthaltenden Medium expandiert und unter Standardbedingungen auf Aktivität nochmals getestet. Es wurden Clone erhalten, die bis zu 1-4 ug/ml Renin bildeten und einer dieser Clone, CBI-AA2, wurde willkürlich ausgewählt, und zur Studie unter Produktionsbedingungen, wie unten beschrieben, selektioniert.

Produktionsläufe

Die CHO-Transformandenzellen, die als CBI-AA2 bezeichnet wurden, wurden zum Wachstum in Rollerflaschenkulturen in 100 mm Gewebskulturschalen hergerichtet, die 10 ml des vollständigen Mediums (10% FCS in F12/DMEM21) enthielten und die darüberhinaus 50 U/ml Penicillin, 50 ug/ml Streptomycin oder 40 ug/ml G-418 enthielten. Die Zellen wurden wachsen gelassen bis sie sich anhefteten (30 Min.), das Medium entfernt und die Zellen mit frischem kompletten Medium wieder ernährt. Die Zellen wurden bis zur Konfluenz wachsen gelassen und durch Trypsin unter Verwendung Standardprotokolle bis zur Expansion laufengelassen. 850 cm² Rollerflaschen wurden mit Zellen eines konfluenten Kolbens (4·10&sup7; Zellen) in 200 ml kompletten Medium ausgesät, das mit 10 mM Hepes, pH 7,2 versetzt war. Die Zellen wurden bei 37ºC unter Rotation bis zur Konfluenz wachsen gelassen.
Um Produktion von Renin in serumfreiem Medium zu induzieren, wurde das komplette Medium der Rollerflaschen beatmet und die Zellen wurden mit 200 ml DMEM21 gewaschen. Die Zellen wurden dann mit annähernd 100-200 ml serumfreiem Induktionsmedium (SFIM) ernährt. SFIM besteht aus F12/DMEM21 (1:1), das 1 mM Hepes, 3·10&supmin;&sup5; M FeSO&sub4;, 5·10&supmin;&sup5; M ZnSO&sub4; und 10&submin;&sub6; M Dexamethason enthält. Die Zellen werden mit SFIM bei einem Zyklus wieder ernährt, der durch die Menge an sekretiertem Protein bestimmt wird, d. h. wenn annähernd 100 ug/ml Gesamtprotein sekretiert wurde, was durch den Bradford-Test bestimmt wird. Im allgemeinen wird dieser Spiegel an Gesamtproteinproduktion nach annähernd 2 Tagen erreicht. CBI-AA2 zeigte Reninproduktionsspiegel von 1 ug/ml oder annähernd 0,5 ug/ml/Tag.

AtT-20 Transformanden

AtT-20-Zellen wurden wachsen gelassen, wie zuvor für CHO-Zellen in Vorbereitung zur Transformation beschrieben, mit der Ausnahme, daß eine 15%ige CO&sub2;-Atmosphäre anstatt einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre verwendet wurde. Transformation und Selektion von erfolgreichen Transformanden durch G418 Resistenz wurde wie bei den CHO-Zellen beschrieben, durchgeführt und die selektionierten Zellen wurden auf Reninbildung in der Überstandsflüssigkeit gescreent, wobei ein Plattentest, wie er für die reninbildenden CHO-Zellen zuvor beschrieben ist, verwendet wurde mit der Ausnahme, daß nur ein Serum enthaltendes Medium verwendet wurde.
Stark produzierende Linien sekretierten sowohl Renin als auch Prorenin in das Medium. Ein Vergleich des sekretierten Materials, der mit menschlichem Renin Antiserum ausfällbar ist, ist in Fig. 18 dargestellt. Fig. 18 zeigt ein SDS Gel von immunopräzipitierten Proteinen des Überstands von ³&sup5;S-Methionin markierten Zellen: untransfektierte AtT-20-Zellen, AtT-20-Zellen, die mit pMT-PPRen transfektiert wurden und CHO-Zellen, die mit diesem Plasmid transformiert wurden. Die Zellen wurden 15 Std. lang mit ³&sup5;S-Methionin nach Induktion, wie zuvor beschrieben, markiert. Das Medium wurde aufgefangen und der Überstand immunopräzipitiert und einem SDS-PAGE unterzogen.
Spalte 1 sind die Immunopräzipitate von diesen ursprünglichen Überständen von nichttransformierten Zellen, Spalte 2 von transformierten AtT-20-Zellen und Spalte 3 von transformierten CHO-Zellen. Wie dargestellt, sekretieren die transfektierten AtT-20-Zellen sowohl Prorenin als auch Renin, transfektierte CHO-Zellen sekretieren nur die Prorenin-Form.
Kulturen, die erfolgreiche Transformanden enthalten, werden einer Selektion auf Zellen unterzogen, die unter serumfreien Bedingungen erhalten werden können. Die Kulturen werden in 10% FCS bis zu 1/2 Konfluenz wachsen gelassen und dann wird in ein serumfreies Medium übergegangen. Die Kulturplatten werden mit serumfreien Medium solange ernährt, bis die meisten, jedoch nicht alle Zellen, abgestorben sind, wobei ein Medium, das 10% FCS enthält, zugesetzt wird um die Teilung der überlebenden Zellen zu ermöglichen. Die überlebenden Zellen werden passagiert, replattiert und nach einem Tag auf 10% FCS wird wiederum auf serumfreies Medium übergegangen. Zellen, die 2 Wochen überlebten, werden durch Addition eines Mediums, das 10% FCS enthält, expandiert und bei begrenzter Verdünnung cloniert und auf Reninproduktion nach Induktion unter Verwendung von Zinkionen und Eisen als Induktionsmediatoren, wie zuvor beschrieben, getestet.

Claims

1. Verfahren zum Exprimieren einer gewünschten Codesequenz in einer Kultur von Säugetier-Wirtszellen, wobei die Säugetier-Wirtszellen in dieser Kultur mit einer DNA-Sequenz transformiert worden sind, die den Metallothionein II- (MT-II) Promoter enthält, der mit dieser gewünschten Codesequenz funktionsfähig verknüpft ist, und wobei die Kultur serumfrei ist, umfassend das Induzieren dieser Zellen mit einer wirksamen Menge eines Induktionsmediators und einer wirksamen Menge eines nichttoxischen Metallions.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Induktionsmediator > 5 ug/ml Humantransferrin oder 1-3·10&supmin;&sup5; M Eisenionen ist und in dem die nichttoxischen Metallionen Zinkionen in einem Konzentrationsbereich von 2·10&supmin;&sup5; bis 2·10&supmin;&sup4; M sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die DNA-Sequenz darüberhinaus einen Enhancer enthält, der funktionsfähig mit dem Promoter verknüpft ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, In dem die Zellen mit einem amplifizierbaren, Toxinresistenz verleihenden Gen cotransformiert sind.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das die Toxinresistenz verleihende Gen das MT-Gen ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in dem die Codesequenz ein Protein codiert, welches alveoläres Surfactant-Protein (ASP) , menschliches Wachstumshormon (hGH), die Apolipoproteine AI und AII (apoAI und apoAII) atrialer natriuretischer Faktor (ANF), Erythropoietin (Epo), oder Renin ist.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, in dem die Säugetier-Wirtszelle zusätzlich mit einer zweiten DNA- Sequenz cotransformiert ist, die zur Exprimierung des MT-Proteins fähig ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die cotransformierte Wirtszelle für Cadmiumionen-Resistenz ausgewählt ist.