DE3486293T2

DE3486293T2 - Impfstoff-Zubereitung.

Info

Publication number: DE3486293T2
Application number: DE3486293T
Authority: DE
Inventors: William Marshall Acree; John Wesley Black; Bobby Edwards
Original assignee: American Home Products Corp
Current assignee: Wyeth LLC
Priority date: 1983-06-15
Filing date: 1984-06-14
Publication date: 1994-06-30
Anticipated expiration: 2004-06-15
Also published as: EP0345911B1; EP0145783A4; ATE103180T1; DE3486495D1; DE3486293D1; ATE50913T1; EP0345911A1; EP0145783A1; WO1985000014A1; US4567042A; EP0344872B1; ATE280217T1; NL940017I2; EP0145783B1; EP0344872A1; ATE103181T1; EP0329264A3; EP0145783B2; DE3486292T2; DE3486293T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Hundecoronavirusvakzine, das Verfahren zu ihrer Herstellung und Adjuvantien zur Verwendung damit.
Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf inaktivierte Hundecoronavirusvakzinen, die im Darmtrakt sowohl systemische Immunität als auch lokale Immunität bewirken, und auf ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Hintergrund und Gebiet der Erfindung

Hundecoronavirus (CCV)-Enteritis ist eine hoch kontagiöse Krankheit in Hunden mit weltweiter Verbreitung. CCV-Gastroenteritis wurde zuerst im Feber 1970 in einer U.S. Luftwaffen- Hundeausbildungsschule in Wiesbaden, Bundesrepublik Deutschland, festgestellt. Im Jänner 1971 wurde das Wiederauftreten des Gastroenteritiskrankheitssyndroms festgestellt und der Erreger wurde als ein CCV identifiziert. 1972 berichteten Cartwright und Lucas, daß sich Antikörpertiter auf übertragbares Gastroenteritis (TGE)-Virus in Hunden nach einem Ausbruch von Erbrechen und Diarrhoe signifikant erhöht hatten. Es wurde gefolgert, daß TGE und wahrscheinlicher ein serologisch verwandtes Virus, wie CCV, Krankheit in diesen Hunden hervorrief.
Infektion resultiert aus einem Kontakt zwischen infizierten und empfindlichen Hunden. Infizierte Hunde zeigen gewöhnlich Krankheitssymptome. Jedoch können Hunde, die sich von der Krankheit erholen, in ihren Fäkalien Virus ausscheiden und sich als kontinuierliche Infektionsquelle für empfindliche Hunde erweisen.
1978 mit den plötzlichen Ausbrüchen von durch Hundeparvovirus hervorgerufener Enteritis wurde erneute Energie und Interesse an Hundeenterisviren stimuliert. Die ersten Bemühungen waren auf das Finden des Erregers dieses neuen hämorrhagischen Enteritis- Myokarditissyndroms gerichtet, das schwer und tödlich war. Bei Untersuchung entdeckten Forscher zwei verschiedene Viren, Hundecoronavirus (CCV) und Hundeparovirus (CPV). Nach weiterer Untersuchung erwies sich das CPV als das neue Mittel, das am häufigsten die höchste Erkrankungsziffer und Sterblichkeit verursacht. Das CCV rief eine Krankheit hervor, die ungefähr ähnlich, aber weniger oft tödlich ist. Über die gleichzeitige Isolierung von CPV und CCV wurde berichtet. Eine durchgeführte Begutachtung zeigte, daß es sich bei 17% der Fälle von Hundeenteritis um Doppelinfektionen mit CPV und CCV handelte. Verschiedene staatliche Diagnoselaboratorien bestätigen diese Entdeckungen.
Die Differenzierung von parvoviraler und coronaviraler Enteritis ist schwierig. Die wahrscheinlich gleichzeitigen Infektionen mit beiden Viren machen die Differenzierung noch schwieriger. In einer serologischen Begutachtung der Situation in einem Hundezwinger zeigte sich, daß 55% der getesteten Hunde sowohl CCV als auch CPV ausgesetzt waren. Einige getestete Hundezwinger hatten bis zu 87% positive Exposition an beide Mittel. Die Schwere der gleichzeitiger Infektion zuschreibbaren Enteritis ist unbekannt. Jedoch nimmt ein Forschungsexperte auf dem Gebiet an, daß Infektion durch beide Viren die Wahrscheinlichkeit der Erkrankung des Hundes erhöht.
Wie oben angegeben, ist CCV-Enteritis eine hoch kontagiöse Krankheit, die weltweit festgestellt wurde. Das Auftreten von CCV- Erkrankung bei Hunden in Familienbesitz wurde mit 14,8 bis 25% angegeben. Das Auftreten in Hunden von Hundezwingern beträgt bis zu 30%. Das Auftreten von Gastroenteritis, wo sowohl CCV als auch CPV isoliert wurden, ist noch höher. Die Krankheit kann in Hunden jedes Alters auftreten. Die Bedeutung von CCV-Gastroenteritis hat mit dem Ausbrechen von CPV-Gastroenteritis deutlich zugenommen.
CCV-Gastroenteritis ist durch eine Reihe von Krankheitssymptomen gekennzeichnet, die aus der Literatur wie folgt zusammengestellt wurden: Die ersten Anzeichen von Krankheit sind Lethargie, Anorexie und Depression. Das plötzliche Einsetzen von Erbrechen tritt auf, in dem manchmal Blut gefunden werden kann. Diarrhoe kann mäßig bis schwer und der Natur nach stoßweise sein. Diarrhoe kann bis zu 10 Tagen andauern. Das Fäkalienmaterial hat eine gelborange Farbe, wobei gelegentlich darin Blut und Schleim zu finden sind. Außerdem hat das Fäkalienmaterial einen markanten widerlichen Geruch. Der Darmtrakt enthält wässeriges, gelbgrünes Material. Entwässerung, Gewichtsverlust und Tod wurden angegeben. Langwierige oder wiederkehrende Diarrhoe kann 2 bis 3 Wochen später auftreten. Es wird angenommen, daß die Schwere des CCV- Krankheitssyndroms entsprechend dem Alter, dem Streß, den Umgebungsbedingungen, der Rasse und gleichzeitigen Infektionen variiert. CCV war auch mit respiratorischen Krankheitssymptomen von Augen- und Nasenabsonderungen verbunden.
Sowohl respiratorische als auch enterische Symptome der Krankheit wurden von den vorliegenden Forschern experimentell festgestellt. Die festgestellten Symptome umfaßten einen leichten Augenausfluß, einen leichten Nasenausfluß, Diarrhoe, Gewichtsverlust, Anorexie, Entwässerung, erhöhte Temperaturen und leichte Abfälle der Spiegel sowohl der weißen Blutkörperchen als auch der Lymphozyten. Darmproben von infizierten Hunden zeigen, daß ein signifikantes Ausmaß von Virusinfektion nach Reizung auftritt.
CCV ist ein Mitglied der Coronavirusgruppe von Viren. Einige einschlägige Merkmale der Coronavirusgruppe sind:
a) Das Virusteilchen ist sphärisch oder elliptisch mit knopfähnlichen Vorsprüngen an der Außenfläche von 18 bis 20 Nanometern (nm).
b) Die Viren haben sehr anspruchsvolle in vitro-Wachstumserfordernisse.
c) Die Virusteilchengrößen variieren im Durchmesser von 80 bis 200 nm.
d) Das Virus weist ein Einstrang-RNA-Nukleoprotein auf.
e) Das Vitus entwickelt sich im Zytoplasma der Zelle.
f) Es gibt eine komplexe antigene Ähnlichkeit innerhalb der Gruppe.
g) Die Virusdichte in Cäsiumchlorid (CsCl) beträgt 1,24 bis 1,26 g/ml.
Untersuchungen zeigen, daß es keine deutlichen antigenen Unterschiede zwischen verschiedenen CCV-Isolaten zu geben scheint.
Die Veterinärmedizin hat den Bedarf an einer CCV-Vakzine erkannt, doch zeigt die Literatur, daß auf diesem Gebiet wenig erfolgreiche Arbeit geleistet wurde. Experten auf dem Gebiet haben einen oral-intranasalen Weg der Vakzination empfohlen, um nicht nur die Erzielung von systemischer Immunität, sondern auch die Erzielung von lokaler Immunität im Darmtrakt zu gewährleisten.
Die Sicherheit von abgeschwächter Lebendvirusvakzine muß vom Entwickler nachgewiesen und von einer U.S.Regierungsbehörde genehmigt werden. Jedoch kann der Mißbrauch von abgeschwächten Lebendvirusvakzinen oder die Verwendung von abgeschwächten Lebendvirusvakzinen in einem gefährdeten Wirt zu Problemen führen. Der Mißbrauch von Produkten involviert, ohne hierauf beschränkt zu sein, das Kombinieren mehrerer Vakzinen zur gleichzeitigen Verwendung, wenn diese Vakzinen nicht untersucht oder zur Verwendung auf diese Weise empfohlen wurden. Ein gefährdeter Wirt umfaßt, ohne hierauf beschränkt zu sein, das Impfen von Tieren, die einen aktiven infektiösen Prozeß durchmachen, Tiere, die allgemein nicht sehr gesund sind, und Tiere, die immunologisch inkompetent sind.
Die immunologische Inkompetenz kann wegen immunologischer Schwäche auf Grund von ererbten genetischen Merkmalen, wegen eines gleichzeitigen infektiösen Prozesses oder der Behandlung mit bestimmten chemischen Verbindungen, wie Dexamethason, vorhanden sein.
Einige Beispiele von abgeschwächten Lebendvirusvakzinen, die zum Verkauf zugelassen wurden, aber postvakzinale Probleme in Verbindung mit Bereichsmißbrauch oder Verwendung in einem gefährdeten Wirt verursacht haben können, sind "Modified Live Low Egg Pasagge Rabies"-Vakzine, einige "Modified Live Canine Distemper"-Vakzinen und eine "Modified Live High Egg Passage Rabies"-Vakzine. Verbesserte Diagnosetechniken haben zum Feststellen von Problemen, die mit abgeschwächten Lebendvirusvakzinen verbunden sind, beigetragen.
Sicherheitsprobleme auf dem Gebiet auf Grund von Mißbrauch oder auf Grund der Verwendung in einem gefährdeten Wirt können mit einer inaktivierten Virusvakzine minimiert oder eliminiert werden. Obwohl inaktivierte oder abgetötete Virusvakzinen wegen der Sicherheit vorzuziehen werden, waren sie gegenüber abgeschwächten Lebendvirusvakzinen bisher von niedrigerer Effizienz. Obwohl Produktionstechniken und Adjuvanssysteme zur Entwicklung einiger hochwirksamer inaktivierter Virusvakzinen geführt haben, waren die Ergebnisse auf Grund einer besonderen Technik oder eines besonderen Adjuvanssystems nicht vorhersagbar.
Inaktivierte Virusvakzinen wurden größtenteils in den Wirtsbereichen von Landwirtschaftstieren bis zur Katze entwickelt. Die einzigen derzeit von USDA zugelassenen inaktivierten Produkte für den Hund wurden für Hundeparvovirusenteritis und Tollwut verwendet. Obwohl andere inaktivierte Virusprodukte für den Hund hergestellt wurden, haben sie wegen der geringeren Wirksamkeit im Vergleich mit den entsprechenden abgeschwächten Lebendvirusvakzinen am Markt keine Annahme gefunden.
Ein Problem bei der Herstellung einer inaktivierten Hundecoronavirusvakzine war die allgemeine Annahme, daß Darmschutz nicht ohne Vakzinevirusreplikation innerhalb des Zielgewebes des Darmtraktes erzielt werden könnte. Virusreplikation kann mit einer inaktivierten Virusvakzine nicht erzielt werden.
Es wurde erwartet, daß ein oral-intranasaler Weg der Vakzination mit einer Lebendvirusvakzine erforderlich wäre, um nicht nur die Erzielung systemischer Immunität, sondern auch die Induktion von lokaler Immunität im Darmtrakt zu gewährleisten. Unerwarteterweise wurde gefunden, daß eine parenteral verabreichte abgetötete Hundecoronavirusvakzine systemische Immunität und auch lokale Immunität im Darmtrakt induziert.
Appel et al. offenbaren in Canine Practice, Juli-August 1980, 4, 22-34, den Ursprung und Hintergrund von Hundevirusenteritis und beschreiben insbesondere die Wirkungen von CCV und dessen mögliche Verhinderung und Bekämpfung. Die Autoren geben an, daß zum Zeitpunkt des Artikels eine Vakzine zum Schutz gegen CCV nicht verfügbar war.
Andere Autoren, beispielsweise Woods, Veterinary Microbiology, 1982, 7, 427-435, und Gill Diss'n Abs.Intl. 43(8), Microbiology, 2452-B (Feb. 1983), offenbaren die Vermehrung, aber nicht die Abschwächung von CCV in verschiedenen Zellinien.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, sowohl abgeschwächte als auch inaktivierte Hundecoronavirusvakzinen vorzusehen, die bei parenteraler Verabreichung sowohl systemische Immunität als auch lokale Immunität im Darmtrakt bewirken.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, eine inaktivierte Hundecoronavirusvakzine vorzusehen, die so wirksam ist wie abgeschwächte Lebendhundecoronavirusvakzine.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Inaktivieren eines Hundecoronavirus und zum Herstellen einer Vakzine daraus vorzusehen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Vakzinezusammensetzung, die das avirulente antigene Produkt gebildet durch Inaktivieren von in Katzen- oder Hundezellen vermehrtem Hundecoronavirus, wobei das aviruelente antigene Produkt in einer Menge vorhanden ist, die zum Schützen eines Hundes vor Infektion durch virulentes Hundecoronavirus wirksam ist, und einen nicht-toxischen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Die ursprüngliche Isolierung des virulenten CCV erfolgte aus einem Hund, der an Gastroenteritis starb. Dem Isolat wurde die Bezeichnung TN-449 gegeben Virusnachweismethoden einschließlich Elektronenmikroskopie zeigten, daß CCV als das einzige Virus in den vom Hund genommenen Proben vorhanden war. Dann wurde das Virusisolat für Vermehrungs- und Abschwächungszwecke in CRFK- Zellkulturen gegeben.
Das Verfahren zum Vermehren des CCV in Säugerzellen umfaßt die folgenden Schritte: Animpfen von Säugergewebekulturzellen mit CCV, Kultivieren der Zellen in einer einhundertprozentigen (100%) konfluenten dichten Monoschicht vor diesem Animpfschritt oder innerhalb von 24 Stunden dieses Animpfschrittes, Ernten der Zellen 24 bis 96 Stunden nach Animpfung und Sammeln des vermehrten Virus von den geernteten Zellen.
Die Säugergewebekulturzellen werden mit CCV bei einem Verhältnis von CCV-Virus (gemessen nach der FAID&sub5;&sub0;-Methode) zu Zellen von 1 : 500 bis 1 : 1, vorzugsweise 1 : 100 bis 1 : 5, insbesondere 1 : 75 bis 1 : 10, angeimpft. Die Säugergewebekulturzellen sind, ohne hierauf beschränkt zu sein, Crandall-Katzennierenzellen (CRFK), Wood's-Katzenzellinie (FC), eine Hundenierenzellinie (DK), Madin Darby-Hundnieren-(MDCK) und die Hunde A72-Zellinie. Das CCV wird einer Suspension der Zellen zugesetzt oder auf eine Monoschicht der Zellen aufgebracht. Die Menge an Zellen und Virus soll derart sein, daß sich eine konfluente dichte Monoschicht der Zellen innerhalb von 12 bis 48, vorzugsweise 24 bis 36 Stunden nach Animpfung bildet. Optimal sollten zum Zeitpunkt der Animpfung die Zellen im Wachstumsbehälter in einer Menge vorhanden sein, die ausreichend ist, eine Zellenmonoschicht von mindestens 100 000 bis 1 000 000 Zellen pro cm² innerhalb von etwa 12 bis 48 Stunden nach Animpfung, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden nach Animpfung, zu bilden. Jedoch kann eine geringere Zahl von Zellen verwendet werden. Vorzugsweise sind die Zellen in einer Menge anwesend, die ausreichend ist, zwischen 150 000 und 500 000 Zellen/cm² innerhalb von 12 bis 48 Stunden, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden, zu bilden. Das Virus wird an den Zellen während mindestens 60 Minuten, aber gewöhnlich weniger als 300 Minuten, vorzugsweise zwischen 90 und 240 Minuten, bei 28 bis 40ºC, vorzugsweise 35 bis 38ºC, adsorbiert.
Erntbare Virustiter von mindestens etwa 1000 und gewöhnlich mindestens etwa 2000, gemessen nach der FAID&sub5;&sub0;-Methode, können innerhalb von 18 Stunden nach Animpfung erhalten werden, jedoch kann es in manchen Fällen bis zu 120 Stunden oder länger dauern, um maximale Virustiter zu erhalten. Maximale Virustiter werden gewöhnlich etwa 24 bis 96 Stunden nach Animpfung erhalten. Die Zellmonoschicht wird entweder durch Gefrieren-Auftauen oder durch enzymatische Einwirkung zum Erhöhen des Virusgehaltes der geernteten Flüssigkeiten entfernt. Die geernteten Flüssigkeiten werden dann mit einem Virusstabilisator, wie Saccharosephosphatglutamat (SPG), Saccharosephosphatglutamatalbumin (SPGA) oder NZ-Amin- Gelatine zum Abfüllen des Endproduktes vereinigt oder in größerer Menge zum späteren Auftauen und Auffüllen mit Virusstabilisator gefroren. Alternativ können die geernteten Flüssigkeiten inaktiviert werden.
Ein Hauptaspekt dieser Erfindung ist die Verwendung einer inaktivierten Hundecoronavirusvakzine bei der Verhütung des Hundecoronaviruskrankheitskomplexes. Andere Aspekte dieser Erfindung betreffen die Zusammensetzung der Hundecoronavirus (CCV)-Vakzine, das mit dem Hundecoronavirus verwendete Inaktivierungsverfahren und die in Verbindung mit der CCV-Vakzine verwendeten Adjuvantien.
Isolate von Hundecoronavirus, wie der 1-171 Stamm (ATCC VR- 809), das TN-499 (ATCC VR-2068) oder eines der drei von der Cornell Universität erhältlichen Hundecoronaviren (K378-8-, S378-6- und A76-Stämme), können zur Herstellung einer inaktivierten CCV-Vakzine verwendet werden. Die inaktivierte CCV-Vakzinezusammensetzung umfaßt ein oder mehrere Isolate eines inaktivierten Hundecoronavirus mit Präinaktivierungsvirustitern von höher als 4,0 log Virusteilchen/ml (oder Dosis) und vorzugsweise höher als 5,0 log Virusteilchen/ml (oder Dosis), gemessen durch die FAID&sub5;&sub0; (fluoreszierender Antikörper-infektiöse Dosis) -Methode (King et al., Can.Journal of Comparative Medicine and Vet Science 29, S. 85-89, 1965). Die typische Dosis ist 1 ml.
Inaktivierte CCV-Flüssigkeiten können auch durch eine beliebige Zahl von verfügbaren Techniken, wie eine Amicon-Konzentriereinrichtung, Pellicon (Millipore ) Konzentriereinrichtung, Fälltechniken, wie mit Ammoniumchlorid, Konzentrieren mit Carbowax-Flüssigkeit oder -Wachs in Verbindung mit einem Dialyserohr, oder Adjuvans-Konzentriertechniken, wie mit Aluminiumphosphat, konzentriert werden.
So hohe Titer wie 5 bis 7 log FAID&sub5;&sub0; wurden erhalten. Die inaktivierte CCV-Vakzinezusammensetzung umfaßt ein oder mehrere inaktivierte Hundecoronaviren und kann auch ein abgeschwächtes modifiziertes Lebend- oder abgetötetes Hundeparvovirus (CPV) enthalten. Außerdem kann die Vakzine in jeder Kombination oder einzeln zusätzliche abgeschwächte modifizierte Lebendviren oder abgetötete Viren, wie Hundestaupevirus, Hundeparainfluenzavirus, Hundeadenovirus I, Hundeadenovirus II, Hunderotavirus, Masernvirus, Hundecalicivirus und Hundeherpesvirus enthalten. Die inaktivierte CCV-Vakzine ruft eine vollständige immunologische Reaktion auf die Virusinfektion hervor.
Die Vakzinezusammensetzung umfaßt eine ausreichende Menge des Hundecoronavirus-Antigens zum Bewirken einer immunologischen Reaktion in einem Hund und ein nicht-toxisches pharmazeutisch annehmbares Adjuvans oder eine Adjuvanskombination.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft den Verabreichungsweg. Die Induktion von humoral-systemischem Schutz, gemessen durch serumneutralisierende Antikörperspiegel, sowie die Induktion von lokaler Immunität im Darmtrakt sind ein wichtiges Merkmal dieser Erfindung. Die oral-intranasalen Verabreichungswege sollen beide Arten von Schutz bewirken. Jedoch ist die allgemeine Annahme dieses Verabreichungsweges nicht gut und daher würde die Verwendung und der anschließende Schutz, der durch eine CCV-Vakzine geliefert wird, nicht realisiert werden. Eine abgeschwächte Lebendvirusvakzine, die parenteral verabreicht wird, sieht humorale und lokalisierte Immunität vor. Die parenterale Vakzination mit einer inaktivierten CCV-Vakzine induziert sowohl humorale Immunität als auch lokalisierte Immunität. Der Ausdruck "parenterale Vakzination" soll subkutane und intramuskuläre Impfwege einschließen.
Die abgeschwächte Vakzine wird gewöhnlich in einer Dosis von mindestens 2,5 log Virusteilchen pro Dosis, vorzugsweise mindestens 1000 Virusteilchen (3 log Virusteilchen) pro Dosis, insbesondere mindestens 3,3 log Virusteilchen pro Dosis, parenteral verabreicht.
Die inaktivierte Vakzine wird vorzugsweise in einer Dosis von mindestens 10 000 inaktivierten Virusteilchen (4 log Virusteilchen) pro Dosis, vorzugsweise mindestens 5,0 log Virusteilchen pro Dosis, parenteral verabreicht. Die Vakzine kann in einem Ein- oder Zweidosissystem verabreicht werden. Die zweite Dosis sollte nicht mehr als 6 Wochen nach der ersten liegen. Vorzugsweise wird die zweite Dosis 2 bis 3 Wochen nach der ersten Dosis verabreicht.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist die Inaktivierung des Hundecoronavirus. CCV-Flüssigkeiten können mit einer Reihe von Inaktivierungsmitteln inaktiviert werden, wie, ohne hierauf beschränkt zu sein, binäres Äthylenimin, Acetyläthylenimin, β- Propiolacton, Formalin, Phenol, UV-Strahlung oder γ-Strahlung.
Vorzugsweise wird β-Propiolacton in Konzentrationen von 0,01 bis 0,5% verwendet. Konzentrationen von β-Propiolacton von 0,05 bis 0,2% werden am häufigsten verwendet. Das Inaktivierungsmittel wird den in den Vermehrungsbehältern enthaltenen Virusflüssigkeiten, Flüssigkeiten, die aus dem Vermehrungsbehälter geerntet und kombiniert wurden, oder Virusflüssigkeiten, die aus den Vermehrungsbehältern geerntet, kombiniert, gelagert, gefroren und dann aufgetaut wurden, zugesetzt.
β-Propiolacton wird den Virusflüssigkeiten zugesetzt, wobei die nachteilige Verschiebung des pH zu Azidität mit Natriumhydroxid- oder Natriumbicarbonatlösung reguliert wird. Die Kombination Inaktivierungsmittel-Virusflüssigkeiten wird bei Temperaturen von 4 bis 37ºC inkubiert. Inkubationszeiten von 24 bis 72 Stunden werden verwendet.
Ein anderes verwendete Inaktivierungsmittel ist binäres Äthylenimin. Gleiche Volumina einer 0,2 molaren Bromäthylaminhydrobromidlösung und einer 0,4 molaren Natriumhydroxidlösung werden gemischt und 60 min bei etwa 37ºC inkubiert. Das resultierende cyclisierte Inaktivierungsmittel ist binäres Äthylenimin, das den Virusflüssigkeiten mit 0,5 bis 4% V/V zugesetzt wird. Die Inaktivierungsvirusflüssigkeiten werden 24 bis 72 Stunden unter periodischem Rühren bei etwa 4 bis 37ºC gehalten.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist das Adjuvanssystem. Ein einziges Adjuvans oder Kombinationen verschiedener Adjuvantien können zum Erhöhen der Immunreaktion verwendet werden. Adjuvantien, wie Aluminiumphosphat, Äthylenmaleinsäureanhydrid, Neocryl A640 und ein Aluminiumhydroxid können verwendet werden, ohne hierauf beschränkt zu sein. Neocryl ist ein Markenname für eine Latexemulsion eines Copolymers von Styrol und einer Mischung von Acryl- und Methacrylsäure. Neocryl A640 ist ein nicht-koalisiertes wässeriges Acrylcopolymer mit Styrol mit einem pH von 7,5, einer Viskosität von 100 cps (Brookfield 25ºC), das Gewicht pro Gallone beträgt 8,6 Pfund, wie geliefert, mit einem Gehalt von 40 Gew.% Feststoffen und 38 Vol.% Feststoffen. Die Bezeichnung A640 bezeichnet eine Qualität hievon. Andere verwendbare Neocryl- Qualitäten sind 520, 625 und 966. Die Bezeichnung "CSMA" wird im nachstehenden für ein Copolymer von Styrol mit einer Mischung von Acryl- und Methacrylsäure verwendet.
Äthylenmaleinsäureanhydrid (EMA), hergestellt mit einer 5% G/V Konzentration in Wasser wird den inaktivierten Virusflüssigkeiten bei 0,01 bis 6% V/V Konzentration zugesetzt. Der pH der resultierenden Flüssigkeiten wird durch Zusatz von 1 n Natriumhydroxid auf 7,7 eingestellt.
CSMA, hergestellt in einer 50% V/V Suspension in Wasser wird den inaktivierten CCV-Flüssigkeiten in einer Menge von 0,1 bis 10 Vol.% zugesetzt. Gewöhnlich ist es nicht notwendig, den pH einzustellen, da CSMA neutralen pH hat.
Das Kombinieren von zwei oder mehreren Adjuvantien kann wie folgt durchgeführt werden, ist aber nicht auf diese Kombination beschränkt. Äthylenmaleinsäureanhydrid, wie beschrieben, wird bei 0,01 bis 6% V/V den inaktivierten Virusflüssigkeiten zugesetzt. Die Mischung wird durch Zusatz von 1 n Natriumhydroxid auf 7,1 bis 7,7 eingestellt. Der Zusatz von 0,01 bis 10% CSMA, wie beschrieben, wird durchgeführt, ohne daß weitere pH-Einstellungen erforderlich sind.
Eine weitere Hauptentdeckung dieser Erfindung ist, daß unerwarteterweise die inaktivierte Virusvakzine lokalisierten Darmschutz, gemessen durch vakzinations-Reizuntersuchungen, wenn die Vakzine parenteral verabreicht wird, sowie erwarteten humoralen systemischen Schutz, gemessen durch serumneutralisierende Antikörperspiegel, vorsieht. Induktion lokalisierter Immunität war mit anderen Vakzinationswegen als parenteral verbunden und die Möglichkeit, den Darmtrakt durch parenterale Vakzination mit CCV mit lokaler Immunität zu versehen, wurde als unwahrscheinlich erachtet, insbesondere mit einem abgetöteten Antigen. Die systemische Immunität ist wahrscheinlich in erster Linie der Anwesenheit von γ-Immunoglobulin (IgG) zuzuschreiben und die lokale Immunität im Darmtrakt ist wahrscheinlich zumindest teilweise der Anwesenheit von α-Immunoglobulin (IgA) sowie IgG zuzuschreiben.
Die Anwesenheit von IgA wird mit einer abgetöteten Vakzine nicht erwartet.
Vakzinierte Hunde, denen eine Dosis der abgetöteten CCV-Vakzine gegeben wurde, zeigten bei Reizung eine Verminderung von bis zu 95% der Darminfektion im Vergleich mit nicht-vakzinierten Kontrollen. Die Daten unterstützen somit die Einmaligkeit dieses Teiles der Entdeckung, daß parenteral verabreichte inaktivierte CCV- Vakzine systemischen humoralen Schutz sowie lokale Immunität im Darmtrakt vorsieht.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Methode, die zum Bestimmen der Wirksamkeit einer CCV-Vakzine verwendet wird. Die Methode umfaßt die folgenden Schritte: Vakzinieren eines Hundes mit einer modifizierten Lebend-CCV-Vakzine, Entnahme von Blut des vakzinierten Hundes, nachdem dieser eine immunologische Reaktion auf die Vakzine entwickelt hat, Trennen des Serums vom Blut, Reizen des vakzinierten Versuchshundes und eines nichtvakzinierten Hundes mit einer infektiösen Menge eines virulenten CCV auf intranasal-oralem Weg und Prüfen von Darmtraktproben der vakzinierten Hunde und der Kontrollhunde zum Bestimmen des Replikationsgrades der Reizvirus. Das United States Department of Agriculture (USDA) hat Standardtesterfordernisse zum Bestimmen der Wirtstierwirksamkeit einiger Veterinärprodukte. Es gibt weder eine Standardanforderung noch vorgeschlagene Testerfordernisse für CCV- Vakzinen. Weiterhin waren keine Adaptierungen der Standard- oder vorgeschlagenen Testverfahrens möglich, um die Wirksamkeit des Produktes in Wirtstieren gültig zu bestimmen. Daher wurde eine neue Testmethode zum Bestimmen der Wirksamkeit der CCV-Vakzinen entwickelt. Diese Methode beinhaltet das direkte Messen des Schutzes, der im Darmtrakt von vakzinierten Tieren gegen Infektion des Darmtraktes mit virulentem Hundecoronareizvirus erzielt wird. Im allgemeinen wird vakzinierten Hunden mindestens 7, vorzugsweise 7 bis 21 Tage nach Vakzination Blut entnommen, um den gelieferten humoralen Schutz zu bestimmen, indem die Menge an im Serum vorhandenem serumneutralisierenden Antikörper gemessen wird. Diese Hunde zusammen mit nicht-vakzinierten Kontrollhunden werden dann mit virulentem CCV auf intranasal-oralem Weg gereizt. Die Darmtraktproben sowohl der vakzinierten als auch der Kontrollhunde werden untersucht, um den Grad der Reizvirusreplikation, die erfolgt ist, zu bestimmen. Die Probeentnahme kann 2 bis 14, vorzugsweise 3 bis 10 Tage, nach Reizung durchgeführt werden.
Ausstriche, Darmgeschabsel oder behandeltes Darmgeschabsel können für Bestimmungszwecke verwendet werden.
Der Nachweis von Virus in der Darmprobe umfaßt, ohne hierauf beschränkt zu sein, sowohl direkte als auch indirekte fluoreszierende Antikörperanfärbung. Das Ausmaß der Vakzinewirksamkeit zum Vorsehen von lokaler Immunität wird durch den Unterschied im Infektionsgrad zwischen vakzinierten und Kontrollhunden gemessen. Eine Verminderung von 90% ist nicht unüblich.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung beruht auf mehreren Entdeckungen. Eine Entdeckung ist das für das Hundecoronavirus verwendete Vermehrungsverfahren, das ausreichend hoher Titer für Mischzwecke ergibt, wie bei der Vakzineherstellung erforderlich. Die Vermehrung von Hundecoronavirus auf hohe Virusinfektiositätsspiegel kann schwierig sein, so daß dieser Aspekt der Erfindung außerordentlich wichtig ist. Die entwickelten Herstellungsverfahren ergeben Virusinfektiositätstiter von mindestens 3 log Virus pro ml, gemessen durch die direkte FAID&sub5;&sub0;-Methode.
Ein weiterer in Verbindung mit diesem Aspekt der Erfindung zu beachtender Punkt ist, daß die durch die hier beschriebene Methode erzielten CCV-Titer zum Mischen mit Virusstabilisatorkomponenten ausreichend sind, aber auch von ausreichender Menge, um die Kombination von CCV mit anderen Virusmitteln, wie, ohne hierauf beschränkt zu sein, Hundeparvovirus, Hundestaupevirus, Hundeadenovirus I, Hundeadenovirus II, Hundeparainfluenza, Hunderotavirus, Leptospira canicola und Leptospira icterohemorrhagiae, zu ermöglichen.
Einige Hauptfaktoren beim Erzielen eines hohen Coronavirustiters sind das Virus-Zellenverhältnis, die Adsorptionszeit von Virus und Zellen, die erzielte Zellkontaktinhibierung und die Erntezeit von Virusflüssigkeiten nach Animpfung.
Ein abgeschwächtes Lebend-CCV wird in Verbindung entweder mit primären Zellkulturen oder einer etablierten Zellinie entweder von Hunde- oder Katzenursprung verwendet. Inkubationstemperaturen von 28 bis 40ºC werden angewandt, wobei 35 bis 38ºC bevorzugt werden. Ein MEM-Earles-Gewebekulturmedium, ergänzt mit einem Tierserum, wie Rinderserum, wird verwendet. Eine Mindestkonzentration von 5 bis 10% wird für das Zellkulturwachstum verwendet und eine Konzentration von nicht weniger als 1% wird im Aufrechterhaltungsmedium verwendet. Eine minimale Konzentration von 0,5 ml eines Enzyms, wie rohes oder gereinigtes Trypsin, pro 1 Gewebekulturmedium wird verwendet. Zellkulturen werden entweder in stationäre oder Rollkulturflaschen gepflanzt.
Im Fall von Zellmonoschichten wird eine Zellpopulation von nicht weniger als 150 000 Zellen pro cm² verwendet. Die Monoschicht zeigt sich dicht und konfluent, wodurch die erforderliche Kontaktzelleninhibierung gegeben ist. Das Zellkulturwachstumsmedium wird entfernt und Samenvirus zugesetzt. Gefrorener CCV- Samen wird in kaltem Wasser aufgetaut und in zumindest ausreichendem Volumen (wie 50 ml) auf die Zellmonoschicht während einer Adsorptionsperiode von mindestens 90 Minuten bei Temperaturen von 35 bis 38ºC gegeben. Ein Mindestverhältnis von Virus zu Zellen von 1 Virusteilchen pro jeweils 100 Zellen ist wesentlich.
Im Fälle einer Zellsuspension werden ausreichend Zellen pro spezifischem Oberflächenbereich verwendet, um zu gewährleisten, daß eine zusammengedrängte konfluente Monoschicht in 24 Stunden oder weniger erhalten wird. Ein Zellkulturdurchgang von 1 Behälter nicht-angeimpften Zellen bis 1 oder 2 Behältern für infizierte Zellen kann verwendet werden.
Die Erntezeit ist beim Erzielen ausreichender Titer von CCV zum Vakzinemischen kritisch. Ein Infektiositätstiter von mindestens 3,3 log Virus pro ml wird benötigt. Die Erntezeiten, die zum Erzielen von Virustitern dieses Größebereiches erforderlich sind, betragen 24 Stunden nach Infizieren der Zellpopulation bis 96 Stunden nach Zellpopulationsinfektion. Virusinfektiositätstiter sind bei 48 Stunden am Maximum und fallen danach ab. Jedoch bleibt ausreichend infektiöses Virus bis zu etwa 96 Stunden bestehen. Virusinfektiositätstiter können um mindestens das 2-fache durch Entfernen der verbliebenen Zellmonoschicht durch enzymatische Wirkung oder durch Gefrieren-Auftauen und Zusetzen der Zellsuspension zu den vorher geernteten Virusflüssigkeiten erhöht werden.
Eine weitere Hauptentdeckung dieser Erfindung ist, daß das Vakzinevirus humoralen, systemischen Schutz, gemessen durch serumneutralisierende Antikörperspiegel, und lokalisierten Darmschutz, gemessen durch vakzinations-Reizuntersuchungen, wenn die Vakzine parenteral verabreicht wird, vorsieht. Unerwarteterweise wurde gefunden, daß die Induktion von lokalisierter Immunität mit anderen Vakzinationswegen als dem parenteralen assoziiert war, und die Möglichkeit, den Darmtrakt durch parenterale Vakzination mit CCV mit Immunität zu versehen, wurde als unwahrscheinlich angesehen. Die systemische Immunität ist wahrscheinlich in erster Linie auf die Anwesenheit von γ-Immunoglobulin (IgG) und die lokale Immunität im Darmtrakt wahrscheinlich zumindest teilweise auf die Anwesenheit von α-Immunoglobulin (IgA) sowie IgG zurückzuführen.
Versuche mit verschiedenen Dosierungshöhen von CCV-Vakzine, auf parenteralem Vakzinationsweg verabreicht, demonstrierten Vakzinevirusreplikation im Darmtrakt sogar schon 5 Tage nach Verabreichung und eine serologische Reaktion sogar schon 7 Tage nach Verabreichung. Vakzinierte Hunde zeigten bei Reizung eine Verminderung der Krankheitssymptome und bis zu 95%ige Verminderung der Darminfektion im Vergleich mit nicht-vakzinierten Kontrollen. Die Daten unterstützen somit die Einmaligkeit dieses Teiles der Entdeckung, daß parenteral verabreichte CCV-Vakzine systemischen humoralen Schutz sowie lokale Immunität im Darmtrakt vorsieht.
Eine weitere Entdeckung dieser Erfindung umfaßt die Mittel, durch die die Vakzine in Hunden bestimmt wird. Die Vakzine ist dazu bestimmt, durch CCV hervorgerufene systemische und lokalisierte Gastroenteritisinfektionen zu verhindern. Zirkulierende oder humorale Antikörperbestimmungen wurden an Blutproben durchgeführt, die 7 bis 21 Tage nach parenteraler Vakzination mit einer Dosis von 1 ml Vakzine pro Hund genommen wurden. 21 Tage nach Vakzination wurden die vakzinierten Hunde und die nicht-vakzinierten Hunde intranasal-oral mit virulentem Hundecoronavirus gereizt. Das Einsetzen der Krankheit erfolgt rasch und plötzlich. Krankheitssymptome sind bereits 24 Stunden nach Reizung in empfindlichen Hunden zu sehen. Die Dauer der Symptome beträgt gewöhnlich 24 bis 96 Stunden, kann sich aber bis zu 10 Tage erstrecken. Beim Bestimmen der Wirksamkeit der Vakzine werden die Tiere am 5., 6. oder 7. Tage nach der Reizung eingeschläfert. Der Darmtrakt vom Pförtner bis zum Dickdarm wird entfernt. Der Darm wird behandelt und durch Ausstriche untersucht oder es wird abgeschilfertes Darmepithel verwendet.
Die Ausstriche werden durch systematisches Abschaben der Epithelauskleidung an verschiedenen Stellen über den Darm gemacht. Das Geschabsel wird auf Objektträger gegeben und für direkte Fluoreszenzantikörperanfärbung behandelt, um mit CCV infizierte Zellen festzustellen. Das gleiche Epithelgeschabsel kann abgeschilfert werden, indem das Geschabsel in phosphatgepufferte Kochsalzlösung gegeben wird. Die Epithel-Kochsalzmischung wird gerührt, um die einzelnen Zellen in der Kochsalzlösung zu suspendieren. Dann werden Proben der Suspensionen für direkte Fluoreszenzantikörper (FA)-Anfärbung zur Bestimmung von CCV auf Objektträger aufgebracht.
Die Prüfung der Objektträger zeigt das Ausmaß von spezifischer Fluoreszenz als Maß der Virusinfektion. Der Fluoreszenzgrad basierend auf der Zahl von infizierten Zellen pro Feld in Verbindung mit der Zahl von pro Hund geprüften Proben ergibt einen numerischen Infektionswert, der jedem einzelnen Tier zugeordnet werden kann. So wird die Bestimmung als Grad oder Ausmaß von CCV-Infektion im Darmtrakt erhalten. Ein Vergleich der Werte von vakzinierten und nicht-vakzinierten Hunden ergibt ein Mittel zum Bestimmen der Wirksamkeit der Vakzine beim Verhindern von Darminfektion.
Um das Wesen der vorliegenden Erfindung deutlicher zu offenbaren, sind im nachstehenden spezifische Ausführungsbeispiel der Erfindung angegeben. Es sollte jedoch klar sein, daß dies lediglich beispielsweise erfolgt und weder den Umfang der Erfindung genau umgrenzen noch den Bereich der beigefügten Ansprüche beschränken soll. In den Beispielen sind alle Temperaturen in ºC angegeben, log bedeutet log zur Basis 10 und die folgenden Abkürzungen werden verwendet: g für Gramm, mcg für Mikrogramm, ml für Milliliter, min für Minuten und h für Stunden.

Beispiel 1:

Dieses Beispiel illustriert die Vakzineherstellung.
Der Produktionsstamm wurde ursprünglich von einem Hund isoliert, der an CCV-Enteritis gestorben war. Das Virus wurde in Crandall-Katzennierengewebe (CRFK)-Kultur serienmäßig vermehrt. Bei Erhalt wurde das Virus CCV-MSV bezeichnet und einmal zum Grundkeim CCV-MSV(X) durchgeleitet. Die CCV-MSV (Hundecoronavirus- Grundkeimvirus)-Kultur wurde bei American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, hinterlegt und erhielt die ATCC-Hinterlegungsnummer VR 2068. Bei der Vakzineherstellung wurden die Zellkulturen in dynamischen Kulturen gezüchtet. In einigen vorhergehenden Versuchen wurden statische Kulturen verwendet. Zellkulturen wurden in Minimal Essential-Medium (MEM), ergänzt mit Vitaminen, nicht-essentiellen Aminosäuren, Natriumpyruvat, Natriumbicarbonat und L-Glutamin, gezüchtet. Eine Menge von 30 mcg/ml Gentamicin wurde als Konservierungsmittel zugesetzt. Eine 5 bis 10 Gew.% Konzentration von Rinderserum wurde für Zellwachstum zugesetzt. Die Serumkonzentration wurde auf nicht mehr als 1% für ein Aufrechterhaltungsmedium vermindert. Trypsin wurde bei einer Konzentration von 0,5 ml/l Medium zugesetzt, um Virusinfektiosität zu fördern.
Konfluente Kulturen von CRFK-Zellen wurden trypsinisiert und in Rollkulturen gepflanzt, so daß nach 24 h eine Dichte von 150 000 Zellen pro cm² erhalten wurde. Die Kulturen wurden bei 28 bis 40ºC, vorzugsweise 35 bis 38ºC, gezüchtet. Das Wachstumsmedium wurde entfernt.
Das Produktionskeimvirus wurde in kaltem fließenden Wasser aufgetaut. Ausreichend Virus wurde zugesetzt, um ein Mindestinfektionsmultiplizitäts(MOI)-Verhältnis von 1 : 100 zu erzielen. Eine 2000 cm³-Flasche enthielt 300 bis 500 Millionen Zellen. Bei 1 : 50 MOI 300 · 10&sup6; dividiert durch 50 wurde ein infektiöses Mindestvirusinokulum von 6 · 10&sup6; oder 106,8 FAID&sub5;&sub0; pro Rollkultur erhalten. Viruskeime und Produkternten ergaben 105,5 bis 107,0 FAID&sub5;&sub0; pro ml. So wurden gewöhnlich 20 ml unverdünnter Keim bis 1 ml unverdünnter Keim pro Flasche verwendet. Der Keim wurde pro Rollflasche mit Kulturmedium auf ein Volumen von 50 ml gebracht. Das Virus wurde auf Monoschichten oder in Suspension 2 h bei 35 bis 38ºC absorbieren gelassen.
In einem spezifischen Beispiel wurde ein Keim, titriert bei 105,7 FAID&sub5;&sub0; pro ml mit 15 ml pro verwendeter Rollflasche als Inokulum verwendet. 32 Rollflaschen wurden, wie beschrieben, angeimpft. Die Flaschen wurde mit 2 l MEM bei 1% FCS und 0,5 ml Trypsin aufgefüllt. Die Flüssigkeiten wurden zusammen mit dem Zellmaterial 48 h nach Infektion geerntet, verteilt und bei -40ºC oder niedriger gefroren.
Die Flaschen ergaben 66,5 l Virusflüssigkeiten. Der Titer der Flüssigkeiten betrug 105,0 FAID&sub5;&sub0; pro ml. Das Material wurde später aufgetaut und mit Medium und Saccharosephosphatglutamatalbumin (SPGA)-Stabilisator gemischt und gefriergetrocknet.

Beispiel 2:

Dieses Beispiel illustriert Vermehrung im Darm durch parenterale Impfung.
Der Zweck der Untersuchung war, zu bestimmen, ob die CCV- Vakzine das Replikat im Darmtrakt finden würde, wenn sie intranasal oder intramuskulär gesunden empfindlichen Hunden verabreicht wird.
4 Hunde wurden in zwei Gruppen geteilt und isoliert und vor der Vakzination wurde ihnen Blut entnommen. Die Hunde Nr. 63 und 64 wurden intramuskulär mit einer 10 ml Dosis (106,3 FAID&sub5;&sub0;/ Dosis) CCV (x + 1)-Keim (Keim hergestellt durch einen zusätzlichen Durchgang vom Grundkeim) vakziniert. Die beiden anderen Hunde Nr. 62 und 65 wurden intranasal mit einer 2 ml Dosis (105,6 FAID&sub5;&sub0;/Dosis) des gleichen CCV-Keims vakziniert. Am Tag 5 nach Vakzination wurde den Hunden Blut entnommen, von den Fäkalien wurden Abstriche gemacht für Virusisolierung in CRFK- Zellkultur und die Tiere wurden eingeschläfert. Gewebegeschabsel von Trachea, Duodenum, Jejunum und Cöcum wurde auf Objektträger gegeben. Diese Ausstriche wurden dann durch die direkte Fluoreszenzantikörpertechnik auf Virusreplikation beobachtet.

Virusisolierung von Fäkalien

Aus den Fäkalien konnte kein Coronavirus isoliert werden.

Direkte FA-Anfärbung von Abstrichen

Die Ergebnisse von Fluoreszenzantikörperanfärbung von Gewebeabstrichen sind in Tabelle 2-1 gezeigt. Tabelle 2-1 CCV direkte FA von Abstrichen Hund Viruszufuhr /Dosis Vakzinationsweg Abstriche/Zahl genommener Abstriche Gesamtabstriche positiv
IN = intranasal NA = nicht anwendbar
100% der von den intranasal geimpften Hunden genommenen Darmabstriche waren auf Virusreplikation positiv, während 70% der Darmabstriche von den intramuskulär geimpften Hunden auf Virusreplikation positiv waren.
Virusreplikation erfolgte in allen drei Teilen des Darmtraktes. Virusreplikation wurde auch in der Trachea der intranasal vakzinierten Hunde festgestellt.
Der Grad von Virusentwicklung im Darm von intranasal geimpften Tieren und die Tatsache, daß die Trachea ebenfalls Virusreplikation zeigte, kann anzeigen, daß dieser Impfweg die natürliche Eintrittspforte für Infektion ist.

Schlußfolgerung

Virusreplikation im Darmtrakt kann 5 Tage nach intramuskulärer oder intranasaler Verabreichung hoher Dosisspiegel des Virus erzielt werden.

Beispiel 3:

Dieses Beispiel illustriert niedriges Virusinokulum, für Darmreplikation parenteral verabreicht.
Der Zweck dieser Untersuchung war, zu bestimmen, ob die CCV- Vakzine bei intramuskulärer Verabreichung in niedriger Dosishöhe lokalisieren und im Darmtrakt replizieren würde.
Zwei Hunde Nr. 60 und 68 wurden mit 1 ml CCV-MSV (x+3)-Keim verdünnt auf 103,0 FAID&sub5;&sub0;/ml intramuskulär vakziniert. Am Tag 5 nach Vakzination wurde den Tieren Blut entnommen und die Tiere wurden eingeschläfert. Ausstriche von Villigeschabsel wurden vom Duodenum, Jejunum und Cöcum für direkte FA-Beobachtung zum Nachweis von Virusreplikation gemacht. Diese Abstriche wurden behandelt und mit CCV-spezifischem FITC (Fluorisothiocyanat)-gebundenem Konjugat angefärbt und durch FA untersucht.

Direkte CCV-FA von Villigeschabsel

Die Gewinnung von positivem CCV von den Villigeschabselabstrichen ist in Tabelle 3-1 gezeigt. Tabelle 3-1 CCV direkte FA von Villi Hund Viruszufuhr Abstriche/Zahl genommener Abstriche Gesamtabstriche positiv durchschnittl.
CCV-Replikation wurde in allen Bereichen des Darmtraktes beider Hunde 5 Tage nach der intramuskulären Verabreichung von 3 log Virus gefunden. Ein Durchschnitt von 79% der beobachteten Proben war auf Virusreplikation positiv. Dieser Perzentsatz läßt sich günstig mit den 70% positiven Proben vergleichen, die mit Hunden erhalten wurden, denen in einer anderen Untersuchung 5,6 log Virus verabreicht worden war.
CCV-Replikation kann im Darmtrakt von empfindlichen Hunden, die mit 103,0 FAID&sub5;&sub0;/Dosis CCV-Vakzine parenteral vakziniert wurden, 5 Tage nach Vakzination gezeigt werden.

Beispiel 4:

Vorläufige Vakzine- und Reizbestimmung Der Zweck dieser Untersuchung war, ein Hundecoronareizvirus zu bestimmen und festzustellen, ob das Vakzinevirus irgendwelche durch das Reizvirus induzierte Symptome verhindert und Darminfektion durch das Reizvirus vermindert oder verhindert.
Zwei auf Hundecoronavirus empfindlichen Hunden, Nr. 61 und 66, wurde Blut entnommen und sie wurden mit 3 log CCV MSV (x+3)- Keim intramuskulär vakziniert. Diese Tiere wurden bis zum Zeitpunkt der Reizung isoliert gehalten.
21 Tage nach Vakzination wurde den beiden mit CCV vakzinierten Hunden zusammen mit den vier auf CCV empfindlichen Hunden Nr. 75, 79, 74 und 76 Blut entnommen, sie wurden anästhesiert und mit 5 ml/Hund CCV-Reizvirus gereizt. Jeder Hund erhielt 2 ml oral und 3 ml intranasal. Jeder Hund erhielt 105,7 FAID&sub5;&sub0; Reizvirus.
Die Hunde Nr. 74 und 76 wurden 7 Tage nach der Reizung auf Temperaturreaktion, WBC (weiße Blutkörperchen)-Zahl, Lymphozytenzahlreaktion und andere Symptome beobachtet. 5 Tage nach der Reizung wurden die beiden CCV-vakzinierten Hunde Nr. 61 und 66 zusammen mit den beiden Reizkontrollhunden Nr. 75 und 79 eingeschläfert. Darmgeschabselausstriche wurden vom Duodenum, Jejunum und Cöcum jedes Hundes gemacht. Fluoreszenzantikörperanfärbung wurde an diesen Ausstrichen durchgeführt, um das Ausmaß der Virusreplikation im Darmtrakt zu bestimmen. Tabelle 4-1 CCV SN-Untersuchung Serumneutralisierender Antikörper-Titer Hund Gruppe vor Vakzination vor Reizung
* vakzinierter Hund
** Reizkontrolle
Beide vakzinierten Tiere waren vor der Vakzination seronegativ und 21 Tage nach der Vakzination auf einen Grad von 1 : 1122 serokonvertiert.
Durchschnittlich 95,6% aller in den Kontrollen beobachteten Darmproben zeigten eine 4(+) Virusreplikationshöhe. Keines der vakzinierten Tiere zeigte eine 4(+) Virusinfektionshöhe in den Darmproben. Daher wurde eine 100%ige Verminderung der 4(+) Infektionshöhe erzielt.
Insgesamt 17,4% der vakzinierten Proben waren positiv mit einer 1(+) Infektionshöhe, während insgesamt 100% der Reizkontrollproben positiv waren (95,6% bei 4+, 4,4% bei 1+). Eine perzentuelle Gesamtverminderung der Darminfektion von 82,6% wurde in den vakzinierten Tieren erzielt.
Eine weitere Analyse dieser Daten kann durchgeführt werden, die der 4+ Infektionshöhe im Vergleich mit einer 1+ Infektionshöhe Signifikanz gibt. Diese Analyse kann in Tabelle 4-2 gefunden werden. Tabelle 4-2 Hund Infektionsgrad Zahl von Darmproben pro Gruppe Zahl von Proben multipliziert durch den Infektionsgrad Gesamtzahl pro Gruppe oder infektiöser Index Kontrollen vakzinierte Tiere CCV-Reizbestimmungsergebnisse und Diskussion 1. Temperaturreaktion Temperaturreaktion (100ºF) nach CCV-Reizung Tag nach Reizung Hund Nr. Gruppe beobachtete Reizkontrolle Durchschnitt eingeschläferte Reizkontrolle nicht festgestellt, bis in hohe Temp. festgestellt eingeschläfert für Darm-FA Durchschnitt
* kritisch hohes Fieber
Die CCV-Reizung rief ein kritisch hohes Fieber (103,5ºF) in den CCV-empfindlichen Reizkontrollhunden am Tag 3, 4 bzw. 5 hervor. Alle vier Reizkontrollhunde zeigten während zwei aufeinanderfolgenden Tagen Temperaturen von 103,5ºF. Die mittlere Temperatur der Hunde 74 und 76 betrug 103,8 bzw. 104,3ºF am Tag 3 nach der Reizung und 104ºF am Tag 4 nach der Reizung. Hund 75 hatte eine verzögerte Temperaturreaktion von 104 und 103,5ºF an den Tagen 4 und 5 nach Reizung.
Die CCV-vakzinierten Hunde zeigten während der 3 Tage, an denen sie beobachtet wurden, während der kritischen Fieberperiode keine Temperatur über 103ºF. Die CCV-Reizung bewirkte in CCV- empfindlichen Hunden eine signifikante fiebrige Reaktion und die CCV-Vakzine verhinderte diesen Temperaturanstieg. 2. WBC-Reaktion WBC-Zahl nach CCV-Reizung (x100) Tage nach Reizung Hund * kritische Tage WBC-Abfall nach CCV-Reizung Hund
Der kritische Zeitraum für einen WBC-Abfall nach CCV-Reizung war an den Tagen 3, 4 und 5. Diese Daten zeigen, daß WBC- Beobachtung ein kritischer Parameter für das Hundecoronaviruskrankheitssyndrom sein kann. 3. Lymphozytenzahl Lymphozytenzahl nach CCV-Reizung (x100) Tage nach Reizung Hund
* kritische Tage
In den CCV-Reizkontrollhunden entwickelte sich eine Lymphopenie beginnend am Tag 1 mit Hund 76 und am Tag 3 mit Hund 74. Die Lymphopenie hielt bis zum Tag 5 nach Reizung an. Weitere Analyse des perzentuellen Lymphozytenabfalls ist im nachstehenden angegeben. Lymphozyten-Anfall nach CCV-Reizung Tage nach Reizung Hund
* kritische Tage
Lymphopenie mit über 50%iger Verminderung der Lymphozyten trat in 6 von 12 Beobachtungen der Reizkontrollhunde auf mit den schwersten Vorkommnissen an den Tagen 4 und 5 nach der Reizung. Hund 74 hatte mehr als 50% Lymphopenie an den Tagen 4 und 5 nach der Reizung. Hund 76 zeigte eine Lymphopenie von über 50% an den Tagen 3, 4, 5 und 7 nach Reizung und hatte den stärksten Abfall von 78% an den Tagen 4 und 5 nach Reizung. Symptome Hund keine Nasenausfluß Anorexie Entwässerung trockene Fäkalien leichter Nasenausfluß leichter Augenausfluß Anorexie Entwässerung Fäkalien naß weicher Stuhl leichter Nasenausfluß leichter Nasen- und Augenausfluß keine wie oben leichter Nasenausfluß Fäkalien weich wie oben
Symptome von CCV-Infektion begannen am Tag 3 nach Reizung und verliefen gleichzeitig mit der fiebrigen Reaktion und Lymphopenie. Symptome von Nasenausfluß, Anorexie, Entwässerung und Augenausfluß dauerten bis zum Tag 7 nach Reizung, dem letzten Tag der Beobachtung, an. Die CCV-Reizung rief signifikante CCV-Symptome in CCV- empfindlichen Hunden hervor.

Bestimmung von Virusreplikation im Darmtrakt von vakzinierten Tieren und Kontrollen 5 Tage nach Reizung

Insgesamt 8 Stellen in der Trachea für Abstrichpräparate und 23 Stellen längs des Darmtraktes wurden für die Bestimmung gewählt. Darmgeschabsel wurde auf Objektträger gegeben, mit Aceton fixiert und mit spezifischem Hundecoronavirus FA-Konjugat angefärbt. Der Replikationsgrad wurde mit 4+ Infektion, 1+ Infektion oder kein Virus vorhanden bestimmt. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in den Tabellen 4-3 und 4-4 gezeigt. Tabelle 4-3 Probenbestimmung auf Hundecoronavirusreplikation Gruppe Hund Grad von Zahl von Abstrichen total Reizkontrolle kein vakziniertes Tier
In keinem der Hunde wurde Tracheavirusreplikation festgestellt. Weitere Bestimmungen der % positiver Proben schließen die Tracheaproben aus. Tabelle 4-4 Hunde Proben pro Infektionsgrad im Darmtrakt mittlere Gesamt Testgruppe Kontrolle Durchschnitt vakzinierte Tiere Durchschnitt
Ein infektiöse Indexhöhe von 178 für die Kontrollen gegenüber 8 von den vakzinierten Tieren zeigt eine Verminderung der Infektion von 95,5% an.
Die Untersuchung beweist somit, daß die CCV-Reizung schwere meßbare klinische Symptome von CCV-Erkrankung hervorrief und die CCV-Reizung im Darm festgestellt werden kann. Die CCV-Vakzine senkt den Infektionsgrad im Darm des vakzinierten Hundes und eliminiert die klinischen Symptome und das Fieber nach CCV-Reizung im Vergleich mit CCV-empfindlichen Reizkontrollhunden.

Beispiel 5:

Dieses Beispiel illustriert die Wirksamkeit der Vakzine.
Junge Hunde erwiesen sich durch einen Serumneutralisationstest durch FA als seronegativ auf CCV. 22 der Tiere wurden mit einer Mindestdosis der Vakzine vakziniert. Einer Hälfte der Gruppe wurde die Vakzine subkutan und der anderen Hälfte der Gruppe die Vakzine intramuskulär gegeben. Die vakzinierten Hunde wurden dann einzeln untergebracht, aber zusammen mit drei weiteren jungen Hunden, die als Umgebungskontrollen dienten, im gleichen Bereich gehalten. Die Tiere wurden 3 Wochen lang beobachtet. Es zeigten sich keine ungünstigen Wirkungen von der Vakzine und es gab keine Anzeichen von Umgebungsexposition an das Virus.
Jedes vakzinierte Tier wurde so gehalten, um einen direkten Kontakt Hund zu Hund zu verhindern. Dieser Vorgang wurde angewandt, um zu verhindern, daß ein vakzinierter Hund, der für Ausbreitung sorgen kann, unabsichtlich einen anderen vakzinierten Hund exponiert, der zum Zeitpunkt der Vakzination nicht immunisiert sein könnte. Die Umgebungskontrollen wurden im gleichen Bereich untergebracht, aber von den vakzinierten Tieren physisch getrennt gehalten. Diesen Tieren wurde während der Beobachtungszeit periodisch Blut entnommen und sie wurden am Tag 21 eingeschläfert. Darmgeschabselabstriche wurden gemacht und durch direkte Fluoreszenzantikörperanfärbung untersucht. Serologische Bestimmung der entnommenen Serumproben und Bestimmung der Darmgeschabselabstriche stellten fest, ob Umgebungsexposition an ein Hundecoronavirus erfolgt war.
21 Tage nach Vakzination wurden die vakzinierten Tiere und die Kontrollen anästhesiert, Blut entnommen und die Tiere intranasal-oral mit virulentem Reizvirus gereizt. Das Reizvirus wurde titriert, um die Viruszufuhr zu bestimmen. Die vakzinierten Tiere, die Kontrollen und die Reizumgebungskontrollen wurden im gleichen Gebäude untergebracht. Die vakzinierten Tiere und die Kontrollen wurden täglich auf Temperaturerhöhung, Lymphopenie, Leukopenie und andere Symptome von Corona-induzierter Erkrankung beobachtet.
Eine regellose Wahl von vakzinierten Tieren und Kontrollen zum Einschläfern und Bestimmen des Grades von Reizvirusreplikation im Darmtrakt erfolgte an den Tagen 5, 6 und 7 nach Reizung. Die Reizumgebungskontrollen wurden eingeschläfert und Abstriche von Darmtraktgeschabsel an den Tagen 6 und 7 untersucht.
Alle Versuchstiere wurden in Räumen untergebracht, wo die Temperatur nach der Reizung 50 bis 70ºF betrug.

Ergebnisse:

A. Viruszufuhr (siehe Tabelle 2-1)

10 Replikattitrationen wurden an dem zum Vakzinieren der ersten Gruppe von vakzinierten Tieren verwendeten Virus durchgeführt. Ein mittlerer geometrischer Titer von 2,9 log Virus wurde verwendet.

B. Vergleich von Antikörperreaktion und gesamte geometrische Durchschnitte

Ein mittlerer geometrischer Titer von 1 : 138 491 wurde durch den subkutanen Vakzinationsweg erhalten. Der intramuskuläre Impfweg bewirkte eine mittlere geometrische serologische Reaktion von 1 : 113 761. Zwischen den Verabreichungswegen und der erzielten serologischen Reaktion war kein signifikanter Unterschied zu sehen.

C. Vakzineumgebungskontrollen (siehe Tabelle 5-1 und 5-2)

Die drei als Umgebungskontrollen verwendeten Hunde erwiesen sich am Tag 0 und am Ende der Untersuchung als seronegativ.
Diese drei Hunde wurden eingeschläfert und ihre Darmtrakte durch Anfärben von Darmgeschabselabstrichen mit fluoreszierendem Antikörper auf Infektion untersucht. Die für jedes Tier untersuchten 18 Proben waren auf Hundecoronavirus negativ.
Es wurde gefolgert, daß kein Hundecoronavirus vom "Wildtyp" die Einrichtung kontaminierte und die Untersuchung ungültig machte.

D. Titration des Reizvirus

Ein Isolat von Hundecoronavirus wurde für intransal-orale Verabreichung an jeden vakzinierten und Reizkontrollhund erhalten. Ein geometrischer Durchschnitt von 5,47 log pro ml wurde aus 7 Titrationen erhalten. Jedes Tier erhielt 2 ml Virus intranasal und 3 ml oral. Daher wurde jedes Tier mit 6,2 log Virus gereizt.

E. Beobachtungen und Bestimmungen nach Reizung

1. Temperaturreaktion

Es erfolgten 131 Beobachtungen für die subkutan und intramuskulär vakzinierten Gruppen. Es wurde keine Temperaturreaktion von höher als 103ºF festgestellt.
An den Reizkontrollhunden erfolgten 57 Temperaturbeobachtungen. Insgesamt 6 Beobachtungen oder 9,5% der Beobachtungen waren über 103ºF. Diese Temperaturen waren 103,2, 103,2, 103,4, 103,6, 104,0 bzw. 105,0.
Das geringe Ausmaß der in den Reizkontrollhunden festgestellten Temperaturreaktion war in den vakzinierten Tieren nicht vorhanden.

2. Weiße Blutkörperchen (WBC)-Reaktion

Es wurde weder in den vakzinierten Hunden noch in den Reizkontrollhunden ein signifikanter Abfall der WBC festgestellt.

3. Lymphozytenreaktion

Für die Reizkontrollhunde schien es einen signifikanten Abfall an Lymphozyten zu geben. 7 von 10 Reizkontrollhunden oder 70% hatten Lymphozytenabfälle von größer als oder gleich 60%. Nur 3 der gereizten vakzinierten Hunde (13%) hatten einen Lymphozytenabfall von über 60%, der in den vakzinierten Hunden 5,2-mal niedriger war; ein 2,7-mal niedrigerer Abfall an Lymphozyten in den vakzinierten Hunden wurde festgestellt, wenn ein Lymphozytenabfall von 35% oder höher in Betracht gezogen wurde, und ein 2,16-fach geringerer Abfall der Lymphozyten in vakzinierten Hunden wurde festgestellt, wenn ein Lymphozytenabfall von 25% oder höher in Betracht gezogen wurde.
Die Daten zeigten, daß das Reizvirus eine Wirkung auf die Reizkontrollhunde hatte und daß die Vakzination einen derartigen schweren Abfall an Lymphozyten in den immunisierten Tieren verhinderte.

4. Symptome der Krankheit

Die in diesem Reizversuch festgestellten Krankheitssymptome waren nicht so häufig wie in vorhergehenden Versuchen. Jedoch zeigten die Reizkontrollhunde mehr Symptome als die vakzinierte Gruppe. Ein Symptom des Krankheitsindex wurde gefunden durch Dividieren der Zahl von pro Testgruppe beobachteten Symptomen durch die Gesamtzahl von erfolgten Beobachtungen. Beispielsweise wurden 3 Symptome in den intramuskulär vakzinierten Hunden festgestellt. Insgesamt erfolgten 61 Beobachtungen. Daher betrug der Symptomindex 3/61 oder 0,049. In Tabelle 5-1 ist der Symptomindex pro Gruppe zusammengefaßt. Tabelle 5-1 beobachtete Zahl von Testgruppe Symptome Beobachtungen Symptomindex kombinierte vakzinierte Tiere Kontrollen
Eine Verminderung des Symptomindex von 92,8% wurde beim Vergleich der kombinierten vakzinierten Gruppe mit den Reizkontrollhunden erhalten. Obwohl die Krankheitssymptome in den Kontrolltieren nicht reichlich waren, verhinderte die Vakzine viele Symptome in den immunisierten Tieren signifikant.
Jedes der 10 Reizkontrolltiere zeigte Symptome, so daß der Symptomindex ein schweres Krankheitssyndrom in nur wenigen Kontrollhunden nicht reflektiert. 7 der 23 vakzinierten Hunde zeigten jeweils ein Krankheitssymptom.

5. Darminfektion - Bestimmung durch das FA-Ausstrichverfahren

Die Bestimmung des Infektionsgrades des Darmtraktes durch Reizvirus in den Kontrollhunden und den vakzinierten Hunden ist der kritischste Parameter zum Bestimmen der Wirksamkeit einer Hundecoronavirusvakzine. Die Gedärme wurden entfernt und in kaltem Leitungswasser leicht gewaschen. Die Teile wurden mit einem Skalpell geöffnet und Geschabsel entnommen. Das Geschabsel vom Darmepithel der Versuchstiere wurde direkt oder abgeschilfert auf Glasobjektträger gegeben. Die Probeentnahme erfolgte in jedem Tier an ungefähr derselben Stelle. Die Abstriche wurden 30 min bei 25ºC zweimal in 100% Aceton fixiert. Spezifisch markiertes Hundecoronaviruskonjugat wurde zum Anfärben jedes Abstriches während 1 h bei 37ºC verwendet. Die Abstriche wurden in Carbonatpufferwaschflüssigkeit gewaschen und mit einer 50 W Quecksilber (HOB)- Lichtquelle beobachtet. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 5-2 bis 5-6 angegeben. Jedes Feld wurde beobachtet und ein negativer bis 4+ Fluoreszenzwert angegeben. Tabelle 5-2 Beobachtungen von Darmgeschabselabstrichen von Reizkontrollhunden Tage nach Reizung Zahl der Proben Zahl von Proben pro Grad infektiöser Index insgesamt Durchschnitt Tabelle 5-3 Beobachtung von Darmgeschabselabstrichen von Hunden, eingeschläfert 5 Tage nach Reizung Tier Kontrolle Vakzinationsweg Zahl von Proben Grad infektiöser Index Tabelle 5-4 Beobachtung von Darmgeschabselabstrichen von Hunden, eingeschläfert 5 Tage nach Reizung Tier Kontrolle Vakzinationsweg Zahl von Proben Grad infektiöser Index Umgebungskontrolle Tabelle 5-5 Beobachtung von Darmgeschabselabstrichen von Hunden, eingeschläfert 5 Tage nach Reizung Tier Kontrolle Vakzinationsweg Zahl von Proben Grad infektiöser Index Umgebungskontrolle Tabelle 5-6 Vergleich des infektiösen Index, der die Verminderung der Darminfektion anzeigt Testgruppe infektiöser Index pro Einschläferungstag SC-vakzinierte Tiere IM-vakzinierte Tiere kombinierte Gruppen Reizkontrollen % Verminderung kombinierte Gruppe gegenüber Kontrollen
Der infektiöse Index der Reizkontrollen betrug 1,47 bis 3,73 mit einem Durchschnitt von 2,345, während die kombinierte vakzinierte Gruppe von 22 Hunden einen infektiösen Index von 0,103 hatte. Diese Daten zeigen, daß in den vakzinierten Hunden eine Verminderung der Darminfektion von 95,6% erzielt wurde.

Beispiel 6:

Dieses Beispiel illustriert Hundecoronavirus als ein Kombinationsprodukt.
Eine Pilotvakzinereihe wurde mit Hundecoronavirus und Hundeparvovirus als Komponenten wie folgt chargiert:
CCV-Flüssigkeiten 4,5 l
CPV-Flüssigkeiten 2,0 l
Stabilisator 2,2 l
Kalbfötusserum 0,1 l
In NaOH 0,08 l.
Die Materialien wurden unter Kühlen gemischt und aseptisch in einer Dosis von 1 ml in Flaschen gefüllt. Die Vakzineflaschen wurden dann Desikkation unterworfen. Die Virusausbeuten waren wie folgt:
CCV 105,4 FAID&sub5;&sub0;/Dosis
CPV 106,5 FAID&sub5;&sub0;/Dosis
Es ist durchaus möglich, CCV als Kombinationsprodukt routinemäßig herzustellen und zu chargieren.
Dieser Teil der Untersuchung diente dazu, zu bestimmen, ob Antigenbeeinträchtigung auftritt, wenn Hundecoronavirus und Hundeparovirus zur Verabreichung als Kombinationsvakzine kombiniert werden.
Der Versuchsplan kann in Tabelle 6-1 gefunden werden. Drei Gruppen von Hunden wurden verwendet. Gruppe I wurde mit einer vollen Dosis Hundecoronavakzine (1 ml) vakziniert. Gruppe II wurde mit einer vollen Dosis Hundecorona-Parvovirusvakzine (1 ml) vakziniert. Die dritte Gruppe wurde mit einer vollen Dosis Hundeparvovirus (1 ml) vakziniert. Portionen jeder Gruppe wurden intramuskulär (IM) vakziniert, während die übrigen Hunde subkutan (SC) vakziniert wurden. Den Hunden wurde am Tag 0 und auch 21 Tage nach Vakzination Blut entnommen. Umgebungskontrollen wurde am Tag 0 und am Tag 21 ebenfalls Blut entnommen. Tabelle 6-1 Antigenblockierungsuntersuchungs-Versuchsplan Behandlung Gruppe I Gruppe II Gruppe III Blutentnahme 4 vakziniert SC 3 vakziniert SC 3 vakziniert SC vor Vakzination 4 vakziniert IM 5 vakziniert IM 4 vakziniert IM und Vakzination (Tag 0) Blutentnahme nach Vakzination ja Tag (21)
Fünf Replikattitrationen wurden an jeder Virusfraktion durchgeführt. Die Daten zeigten eine Viruszufuhr von 4,5 log Coronavirus für Gruppe I, 5,5 log Hundeparvovirus für Gruppe III und 4,4 log Hundecoronavirus mit 5,5 log Hundeparvovirus für Gruppe II.

1. Testgruppe I - mit Hundecoronavirus vakziniert

Die Daten zeigten, daß ein mittlerer geometrischer Titer von 1 : 6498 gegen Hundecoronavirus erhalten wird.

2. Testgruppe II - mit Hundecorona-Parvovirus vakziniert

Die Hunde in Testgruppe II entsprachen einem mittleren geometrischen Titer von 1 : 87 222 gegen Hundecoronavirus und einem mittleren geometrischen Titer von 1 : 58 579 gegen Hundeparvovirus 21 Tage nach Erhalt 1 Dosis Vakzine.

3. Testgruppe III - mit Hundeparvovirus vakziniert

Ein mittlerer geometrischer Titer von 1 : 65 893 wurde in dieser Testgruppe gegen Hundeparvovirus erhalten.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 6-2 zusammengefaßt. Tabelle 6-2 Postserologische Hundecorona- und Parvoreaktion Zusammenfassung arithmetischer und geometrischer Durchschnitte Antikörper nach Vakzination Gruppe Vakzine
* Arithmetischer Durchschnitt
** geometrischer Durchschnitt

Analyse auf Antigenblockierung

a. Hundecoronavirus (siehe Tabelle 6-2)

Für das Hundecoronavirus wurde keine Antigenblockierung festgestellt. Ein mittlerer geometrischer Antikörpertiter von 1 : 87 222 wurde mit dem Kombinationsprodukt erzielt im Vergleich mit einer mittleren geometrischen Antikörperhöhe von 1 : 6498 mit dem Einzelprodukt gegen Hundecoronavirus. Ein Verstärkungseffekt wird mit dem Hundecoronavirus in Kombination erzielt. Eine 13,4- fache Erhöhung des Hundecoronavirusantikörpertiters wird bei Vergleich des Kombinationsproduktes mit dem Einzelprodukt erhalten.

b. Hundeparovirus

Es gab keinen signifikanten Unterschied der Antikörpertiter gegen Hundeparvovirus, als das Kombinationsprodukt mit dem Einzelprodukt verglichen wurde. Ein mittlerer geometrischer Titer von 1 : 58 579 mit dem Kombinationsprodukt läßt sich gut mit einem mittleren geometrischen Titer von 1 : 65 893 mit dem Einzelprodukt vergleichen. Es wurde keine Antigenblockierung festgestellt.

Beispiel 7:

Dieses Beispiel illustriert ein Inaktivierungsverfahren.
Nicht-gefrorene Hundecoronavirusflüssigkeiten, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden durch binäre Äthylenimininaktivierung (BEI) inaktiviert. Eine Vorratslösung A von 0,2 molarem Bromäthylaminhydrobromid wurde durch Zusetzen von 40,98 g zu entionisiertem Wasser hergestellt und auf 1000 ml gebracht. Die Lösung B war Natriumhydroxid, 0,4 molar. Diese wurde durch Zusetzen von 16 g NaOH zu entionisiertem Wasser und Auffüllen auf 1000 ml hergestellt. Die Vorratslösungen wurden bei Raumtemperatur gelagert, bis sie zur Verwendung fertig waren. Vor der Verwendung wurden gleiche Volumina der Lösung A und B gemischt und zum Cyclisieren bei 37ºC inkubiert. Die cyclisierte Lösung wurde dann bei 2% V/V Konzentration den CCV-Flüssigkeiten zugesetzt. Die Flüssigkeiten wurden gründlich gemischt und 72 h bei 37ºC inkubiert. Am Ende dieser Inkubation wurden 20 ml sterile 1 molare Natriumthiosulfatlösung zugesetzt, um Neutralisation des BEI zu gewährleisten. Verdünnte und unverdünnte Proben der inaktivierten Flüssigkeiten wurden in empfindliche Gewebekultur gegeben, um nicht-inaktiviertes Virus nachzuweisen. Die Gewebekultur wurde dreimal durchgeleitet und durch fluoreszierenden Antikörper unter Verwendung von spezifischem CCV-Konjugat geprüft. Versuche zeigten vollständige Inaktivierung.

Beispiel 8:

Dieses Beispiel erläutert ein anderes Inaktivierungsverfahren.
Nicht-gefrorene Hundecoronavirusflüssigkeiten, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden mit β-Propiolacton (BPL) inaktiviert. Die Virusflüssigkeiten bei einem Volumen von 1 l wurden mit 5 ml 1 n Natriumhydroxid gepuffert, um die aus den von der β-Propiolactonhydrolysierung freigesetzten sauren Produkten resultierende pH-Änderung zu kompensieren. Eine Hälfte von 1 ml konzentriertem BPL wurde den Flüssigkeiten zugesetzt. Die Flüssigkeiten wurden 24 h bei 4ºC ± 1ºC unter periodischem Rühren gehalten. Nach dieser Zeit wurden Proben der Flüssigkeiten entnommen, durch auf Gewebekultur geleitet und durch einen Fluoreszenzantikörpertest auf nicht-inaktivierten Virus getestet. Versuche zeigten vollständige Inaktivierung an.

Beispiel 9:

Dieses Beispiel illustriert die Zugabe von Adjuvans zum inaktivierten Virus.
Adjuvans 9A, Äthylenmaleinsäureanhydrid, wurde auf folgende Weise hergestellt. 150 g EMA 31 von Monsanto Artikel LC07 wurden in 3 l entionisiertem Wasser gelöst und auf 85ºC erhitzt. Die Mischung wurde gerührt, bis das EMA 31 sichtbar gelöst war. Phenolrot, Artikel 7715, ICN Pharmaceuticals, wurde in einer Menge von 0,03 g zugesetzt. Der pH der Zubereitung wurde mit 175 ml 10 n Natriumhydroxid, Eastman Kodak Co., auf 6,8 eingestellt. Das Adjuvans wurde in 6 Glasflaschen mit Schraubverschluß in einer Menge von jeweils 500 ml verteilt und bei 15 psi Druck und einer Temperatur von 121ºC 2 h lang dampfsterilisiert.
Adjuvans 9B, eine wässerige Suspension von CSMA, wurde auf folgende Weise hergestellt. 7,5 1 Neocryl A-640, Artikel RL-414, wurden mit 7,5 l entionisiertem Wasser mit einem Gehalt von 70 g Natriumchlorid, Artikel KMPA, Mallinckrodt, gemischt. Die Zubereitung wurde gemischt und in 30 500 ml-Glasbehälter mit Schraubverschluß verteilt. Diese wurden 2 h bei einem Druck von 15 psi und einer Temperatur von 121ºC dampfsterilisiert.
25 l abgetötetes Hundecoronavirusantigen wurden mit 271,7 ml Adjuvans 9A vereinigt. Es gab eine pH-Verschiebung zu sauer und es erfolgte eine Einstellung mit 21 ml 1 n Natriumhydroxid, was in einem pH von 7,5 resultierte. Der. Mischung wurden 1902,6 ml Adjuvans 4B zugesetzt. Die gesamte Vakzine wurde gemischt und zum Testen und Bestimmen in 18 850 13 mm-Miniampullenvakzinebehälter, Endtyp I, gefüllt.

Beispiel 10:

Dieses Beispiel illustriert einen anderen Adjuvanszusatz zum inaktivierten Virus.
1 l Hundecoronavirusflüssigkeiten, die mit 2% BEI inaktiviert waren, wurden in diesem Verfahren verwendet. Die Adjuvantien wurden auf folgende Weise hergestellt:
Adjuvans 10A: Eine Äthylen-Maleinsäureanhydrid (EMA)-Lösung wurde auf folgende Weise hergestellt. Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) wurde bei 0,01 M in entionisiertem Wasser hergestellt. 8 g Natriumchlorid (NaCl) pro l wurden mit 0,2 g Kaliumchlorid (KCl), 1,15 g dibasischem Natriumphosphat (Na&sub2;HPO&sub4;) und 0,2 g monobasischem Kaliumphosphat (KH&sub2;PO) versetzt. 6300 ml PBS wurden beim Herstellen von EMA verwendet. PBS wurde auf 100ºC erhitzt. 315 g EMA 31 #LCO7329 (Monsanto Co., 800 N. Lindberg Blvd., St. Louis, Missouri 63166) wurden zugesetzt und in PBS gelöst. 0,05 g Phenolrot wurden zugesetzt, um Gesamt-pH- Einstellungen zu erleichtern. Nach dem Lösen wurde der pH der Lösung mit 260 ml 10 n Natriumhydroxid (NaOH) auf 6,8 eingestellt. Die Lösung wurde in 500 ml-Flaschen mit Schraubverschluß verteilt und durch Behandlung im Autoklaven während 2 h bei 121ºC und 15 psi sterilisiert.
Adjuvans 10B: Eine CSMA-Suspension, verdünnt in PBS, wurde auf folgende Weise hergestellt. 5 Gallonen der gleichen PBS, wie oben mit bezug auf Adjuvans 10A beschrieben, wurden mit 5 Gallonen Neocryl A640, Artikel RC-4570 (Polyvinyl Chemical Industries, 730 Main Street, Wilmington, Mass. 01887) gemischt. Die Suspension wurde gründlich gemischt und in 500 ml-Flaschen mit Schraubverschluß und 12 l-Krüge verteilt. Diese Behälter wurden zum Sterilisieren 3 h lang bei 121ºC und 15 psi im Autoklaven behandelt.
1 l der inaktivierten CCV-Flüssigkeiten wurde mit einem Magnetmischer gründlich gemischt. 60 ml Adjuvans 10A wurden zugesetzt. Unmittelbar danach wurden 10 ml 1 n NaOH zugesetzt, um den pH auf 7,34 einzustellen (bestimmt durch ein Orion pH-Meter). 100 ml Adjuvans 10B wurden zugesetzt. Die Mischung wurde 10 min gemischt und dann für Tierversuche in aliquote Teile geteilt.

Beispiel 11:

Dieses Beispiel illustriert die Wirksamkeit verschiedener Adjuvantien mit inaktivierten Hundecoronaviren (CCV) KV.
52 Hunde, seronegativ und auf CCV empfindlich, wurden verwendet, um die Wirksamkeit verschiedener Adjuvanssysteme mit einer abgetöteten Hundecoronavirusvakzine zu demonstrieren. Alle Versuchshunde wurden mit einer Dosis Produkt parenteral geimpft. Es wurde ein 2 Dosis-Vakzinationsschema verwendet. Serumneutralisierende Antikörperspiegel wurden 3 Wochen nach einer Impfung und 2 Wochen nach einer zweiten Impfung bestimmt. Reziproke mittlere geometrische serumneutralisierende Antikörperspiegel Zahl Versuchshunden Antispiegel verwendete Adjuvansarten Vor Vakzination 3 Wochen nach 1. Vakzination 2 Wochen nach 2. Vakzination Minimum voll Neocryl Aluminiumphosphat Aluminiumhydroxid Alhydrogel Aluminiumhydroxid Reheis Neocryl Aluminiumphosphat
Alhydrogel und Reheis sind Markennamen für Aluminiumhydroxid.
Die Daten zeigen, daß jede Zahl klassischer Adjuvanssysteme verwendet werden kann, um mit dem CCV KV-Produkt eine gute systemische Antikörperreaktion zu induzieren. Die Daten zeigen, daß das kombinierte Adjuvanssystem von EMA-31 und Neocryl-A640 hervorragend ist.

Beispiel 12:

Dieses Beispiel erläutert das Verfahren zur Vakzinebestimmung.
Diese Untersuchung war dazu bestimmt, die Eignung und den Grad der Wirksamkeit einer inaktivierten Coronavirusvakzine zu bestimmen. Das in Beispiel 10 beschriebene Produkt mit Adjuvanszusatz wurde für diese Untersuchungen verwendet. Die Untersuchung würde auch bestimmen, ob eine Dosis oder zwei erforderlich wären, um den Hund adäquat zu schützen. 10 Hunde, die durch Serumneutralisationsversuche als CCV-seronegativ getestet wurden, wurden in der zweiteiligen Untersuchung verwendet. 6 der Hunde, Nr. 214, 222, 219, 220, 212 und 213, wurde eine 1 ml-Dosis Vakzine intramuskulär verabreicht. Diesen Hunden wurde an den Tagen 4, 7, 11, 14 und 21 nach der ersten Vakzination Blut entnommen, um die Reaktion auf die Vakzine serologisch zu beobachten. Die Hunde 214 und 222 zusammen mit Reizkontrollen, 244 und 245, wurden intranasal-oral mit 1-171 Virus (ATCC VR-809) gereizt. 5 Tage nach der Reizung wurden die vier Tiere eingeschläfert und auf Beweis von Coronavirusinfektion untersucht. Gesamtpathologie zeigte eine auffallende Entzündung des Dünndarmes in den Reizkontrollen (244 und 245). Die geimpften Tiere zeigten jedoch, wenn überhaupt, nur geringe Entzündungsanzeichen. Das gleiche traf bei Prüfung des Pankreas zu. Proben des Gehirns, der Hirnhäute, der Lunge, der Leber, der Milz, des Mesenteriums, der Mesenteriumlymphknoten, des Pankreas und 10 Proben von gleichem Abstand und Stellen in den Gedärmen wurden von jedem Hund für CCV-Nachweis durch Fluoreszenzantikörper-Exfoliation genommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12-1 angegeben. Tabelle 12-1 CCV-Hundeuntersuchung Eine Dosis abgetötete Hundecoronavirusvakzine CCV-FA-Exfoliationsergebnisse 5 Tage nach Reizung Hund Nr. und Behandlungsgruppe Gewebe Durchschnitt Gehirn Hirnhäute Lunge Leber Milz Mesenterium Mesenteriumlymphknoten Pankreas Darm 1 Gesamtdarm Niere
Bei Vergleich des Infektionsgrades, wie durch Fluoreszenzantikörper-Exfoliation bewiesen, war ersichtlich, daß die Vakzine beim Vermindern von Virusinfektion der Gedärme wirksam war. Ein Gesamtfluoreszenzantikörper (FA)-Durchschnitt von 52 1/4+ wurde in den Reizkontrollen gezeigt. Es zeigte sich, daß die vakzinierten Tiere einen 1/4 + FA Durchschnitt hatten. Dies zeigte eine 99,5%ige Verminderung in den vakzinierten Tieren im Vergleich mit den Reizkontrollen an. Eine modifizierte Lebendvakzine ergab daher eine 95%ige Verminderung, was beweist, daß der durch die inaktivierte Vakzine gelieferte Schutz vergleichbar wäre.
Serumneutralisations (SN)-Versuche am Tag 14 und 21 nach der Vakzination und Blutentnahmen am Tag 5 nach der Reizung wurden durchgeführt. "KV" bezeichnet "abgetötetes Virus". Die Ergebnisse sind in Tabelle 12-2 angegeben. Tabelle 12-2 SN Ergebnisse nach einer Dosis KV CCV und Vergleich mit Reizkontrollen Tierbezeichnung Vakzine Tage nach Vakzination Tag der Reizung Tage nach Reizung keine: Reizkontrolle nicht getestet
Aus Tabelle 12-2 ist ersichtlich, daß ein 1 : 59 SN- Antikörperspiegel zum Schutz ausreichend ist. Beide vakzinierten Tiere reagierten mit einer Dosis Vakzine so, daß sie einen ausreichenden Serumneutralisationsantikörpertiter zusammen mit lokaler Zielimmunität aufwiesen, um Schutz gegen Infektion vorzusehen. Die Reizkontrollen reagierten zur Zeit der Reizung serologisch, was weiter beweist, daß sie gereizt waren. Die vakzinierten Tiere reagierten 5 Tage nach der Reizung in den ersten Stadien einer amnestischen Reaktion.
Die zweite Dosisphase der Untersuchung begann 21 Tage nach der ersten Vakzination. Den vier übrigen Hunden wurde eine zweite 1 ml-Dosis der inaktivierten CCV-Vakzine, intramuskulär verabreicht, gegeben.
Zwei Wochen nach der zweiten Vakzination wurden die vier vakzinierten Hunde 212, 213, 219 und 220 zusammen mit zwei empfindlichen Coronakontrollhunden, 270 und 271, gereizt. Das 1-171 (ATCC VR-809) Coronavirus wurde als Reizvirus verwendet. 5 ml pro Hund wurden intranasal und oral verabreicht. 5 Tage nach der Reizung wurden alle sechs Hunde eingeschläfert und Proben des Darms, der Milz, des Gehirns und der Hirnhäute für Exfoliation- Fluoreszenzantikörperuntersuchung zum Hundecoronavirusnachweis genommen. 10 Proben des Darms wurden genommen, aber nur einzelne Proben der anderen Organe. Die Exfoliationsergebnisse sind in Tabelle 12-3 zusammengefaßt. Tabelle 12-3 Exfoliation CCV FA-Ergebnisse nach Reizung Hund Vakzine PROBEN Darm Milz Hirn Hirnhäute Gesamtinfektiosität Dosen Reizkontrolle
Der Durchschnitt für die beiden Kontrollen auf CCV- Infektiosität betrug 24,3. Der Durchschnitt für die vier vakzinierten Hunde betrug 1,25. Die Gesamtverminderung der Infektiosität war 94,9% im Vergleich von vakzinierten Hunden mit Kontrollen. Es wurde festgestellt, daß CCV-Virusreplikation in den Hirnhäuten in den Kontrollen auftrat. Kein Kennzeichen von Virus wurde in den Hirnhäuten der vakzinierten Tiere nach Reizung gefunden. Daher war den vakzinierten Tieren Schutz gegen Gehirnhautinfektion verliehen.

Beispiel 13:

Dieses Beispiel zeigt die Verträglichkeit von CCV KV mit anderen Virusfraktionen.
Ziel dieser Untersuchung war es, zu zeigen, daß die abgetötete Hundecoronavirusvakzine in Kombination mit Hundestaupevirus-, Hundeadenovirus Typ 2-, Hundeparainfluenza- und Hundeparvovirusvakzinen verwendet werden kann.

Versuchsplan

1. Vakzination

21 seronegative Hunde wurden mit einem 1 ml-Volumen der Immunisierungsfähigkeitsreihe vakziniert. 10 Hunde wurden subkutan vakziniert und 11 Hunde wurden intramuskulär vakziniert.
Den 21 vakzinierten Hunden und den sieben Umgebungskontrollen wurde zur Zeit der Vakzination, 21 Tage nach der Vakzination, zu welcher Zeit die vakzinierten Hunde wieder geimpft wurden, und 14 Tage nach der zweiten Vakzination Blut entnommen.
An allen vakzinierten Hunden erfolgten Antikörperspiegelbestimmungen für alle fünf Virusmittel, um die Höhe der Antikörperreaktion zu zeigen, die mit dem Kombinationsprodukt [DA&sub2;PC(KV)-CPV(MLV)] erwartet werden kann. Der Zweck dieser Daten war es, zu bestimmen, ob Antigenblockierung erfolgt.

Antigenverträglichkeit (siehe Tabelle 13-1)

Tabelle 13-1 ist eine zusammenfassende Tabelle, die die mittleren geometrischen Antikörpertiter für jede der im Kombinationsprodukt enthaltenen fünf Fraktionen angibt.
Die Daten beweisen die erwarteten Antikörpertiter, die mit einer Mindeststärke von KV Kombinationsreihe zu erwarten sind. Die Daten zeigen, daß alle vakzinierten Tiere auf Vakzination reagierten und daß keine Antigenblockierung auftrat. Die Reizdaten beweisen, daß die immunologischen Eigenschaften der KV CCV-Fraktion durch die vier anderen Virusfraktionen (CDV, CAV-2, CPI, CPV), die in der Vakzine vorhanden waren, nicht beeinträchtigt wurden. Tabelle 13-1 Mittlere geometrische Antikörpertiter 3 Wochen nach 1. Vakzination 2 Wochen nach 2. Vakzination Vakzinationsweg gesamt

Beispiel 14:

Dieses Beispiel illustriert Hundecoronavirusquerneutralisation zwischen fünf verschiedenen Isolaten Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Querneutralisationsbeziehungen (Serumneutralisation des Virus) zwischen verschiedenen Isolaten von Hundecoronavirus zu bestimmen. Spezifisches Antiserum auf jedes einzelne Isolat wurde in empfindlichen Hunden hergestellt. Serumneutralisations (SN)-Tests mit den verschiedenen Isolaten bei konstanten Höhen oder Titern wurden gegen Zweifachverdünnungen der spezifischen Antisera gemacht. Mit anderen Worten, der Antikörper, der in den Hunden durch ein spezifisches Isolat induziert wurde, wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit, verschiedene andere Virusisolate sowie das identische Virusisolat, das zum Induzieren des Antikörpers verwendet wurde, zu neutralisieren, bestimmt. Ein Virusisolat, das Antikörper induziert, welcher die meisten Virusisolate neutralisiert, ist der beste Vakzinevirusanwärter. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in der folgenden Tabelle gezeigt. Die spezifischen Antisera sind vertikal gegen die verschiedenen horizontal angegebenen Isolate dargestellt. Die reziproke SN-Höhe ist ausgedrückt. Antisera gebildet durch Antikörperhöhe gegen die virusinduzierende Antikörperbildung Antikörperhöhen gegen andere Viren
Die Daten wurden vom Standpunkt des Antikörpers analysiert, der alle fünf Viren neutralisieren würde. Der durch das ATCC Nr. VR2068 Virusisolat induzierte Antikörper neutralisierte die anderen vier Viren in signifikantem Ausmaß.
Das A76-5 Antiserum und Virus erwiesen sich als am wenigsten querreaktiv mit den fünf getesteten Isolaten. Es erwies sich, daß das ATCC VR 2068 ein signifikantes Ausmaß an Querreaktivität mit diesem Virusisolat hatte.
Die Daten zeigen auch, daß es keine größeren serologischen Unterschiede zwischen diesen fünf Hundecoronaviren gibt. Die
1-171- und ATCC VR 2068-Viren sind als die besten Auswahlen für Vakzinestämme angezeigt; jedoch könnte auf Grund der Querneutralisation zwischen allen Isolaten jedes der Hundecoronaviren als ein Antigen verwendet werden.

Beispiel 15:

Dieses Beispiel illustriert die Wirksamkeit der Vakzine.
28 auf CDV, CAV&sub2;, CPI, CCV und CPV seronegative Hunde wurden als vakzinierte Tiere und als Umgebungskontrollen verwendet. 21 Hunde wurden als geimpfte Tiere und 7 Hunde als Umgebungskontrollen verwendet. Die 7 Umgebungskontrollen zusammen mit 3 weiteren auf CCV seronegativen Hunden wurden als Reizkontrollhunde verwendet. 31 Hunde wurden für die gesamte Untersuchung verwendet.
21 seronegative Hunde wurden mit einem 1 ml Volumen der Immunisierungsfähigkeitsreihe vakziniert. 10 Hunde wurden subkutan vakziniert und 11 Hunde wurden intramuskulär vakziniert. Den 21 vakzinierten Hunde und den 7 Umgebungskontrollen wurde zur Zeit der Vakzination, 21 Tage nach der Vakzination, zu welchem Zeitpunkt die vakzinierten Hunde wieder geimpft wurden, 14 Tage nach der zweiten Vakzination und 28 Tage nach der zweiten Vakzination, was auch den Tag der Reizung darstellt, Blut entnommen.
An allen Umgebungskontrollen wurden für alle 5 viralen Mittel Antikörperhöhebestimmungen vorgenommen, um zu zeigen, daß während des Verlaufes der Untersuchung keine Exposition an Fremdvirus stattfand. Antikörperhöhebestimmungen vor der Reizung wurden vorgenommen, um die Empfindlichkeit der Reizkontrollhunde auf CCV zu zeigen.
Den 21 vakzinierten und den 10 Kontrollhunde wurde Blut entnommen, sie wurden anästhesiert und mit der CCV I-171-Reizvirusidentität gereizt. Jeder Hund erhielt 2 ml pro Nasenloch und 3 ml oral oder 5 ml Reizung pro Hund. 2 Tage vor der Reizung und 6 bis 7 Tage nach der Reizung erfolgten Zählungen der weißen Blutzellenlymphozyten.
Fünf auf subkutanem Weg vakzinierte Hunde, fünf auf intramuskulärem Weg vakzinierte Hunde und fünf Reizkontrollhunde wurden 6 Tage nach der Reizung eingeschläfert. Am 7. Tag nach der Reizung wurden fünf auf subkutanem Weg, sechs auf intramuskulärem Weg und fünf Reizkontrollhunde eingeschläfert.
Der Dünndarm wurde entfernt und 10 bis 13 Zoll Teile von jedem Hund wurden zum Testen verwendet. Die zehn Teile wurden in jedem Hund von den gleichen Bereichen genommen. Der erste Teil (Probe 1) wurde unmittelbar unter dem Magen genommen und der letzte Teil (Probe 10) wurde unmittelbar oberhalb der Verbindung Dünndarm-Dickdarm erhalten. Jeder Teil wurde abgeschabt und die Darmproben wurden in PBS suspendiert. Die die Zellsuspension enthaltenden Rohre wurden insgesamt auf Aussehen beobachtet. Zellproben von jedem Rohr wurden auf Objektträger gegeben, luftgetrocknet, mit Aceton fixiert und mit Hundecoronavirusantikörperkonjugat angefärbt. Diese Objektträger wurden dann untersucht, um das Ausmaß der Virusinfektion zu bestimmen, das in den Zellen bestand.

Ergebnisse und Diskussion

A. Zählungen von weißen Blutzellen nach Reizung

Eine Verminderung der Zahl der weißen Blutkörperchen von mehr als 45% von der Grundlinie wurde zum Zweck der Bewertung dieser Untersuchung verwendet.

Vakzinierte Tiere

Sechs Beobachtungen von WBC-Abfällen von mehr als 45% von der Grundlinie wurden von den 65 WBC-Zählungen, durchgeführt an den subkutan geimpften Hunden, aufgezeichnet. Die WBC-Zahlindexnummer (6 dividiert durch 65) betrug 0,092.
Drei Beobachtungen von WBC-Abfällen von mehr als 45% von der Grundlinie wurden von den 72 WBC-Zählungen, durchgeführt an den intramuskulär geimpften Hunden, aufgezeichnet. Die WBC- Zahlindexnummer (3 dividiert durch 72) betrug 0,042.

Kontrollen

20 Beobachtungen von WBC-Abfällen von mehr als 45% von der Grundlinie wurden von den 65 WBC-Zählungen, durchgeführt an den Reizkontrollhunden, aufgezeichnet. Die WBC-Zahlindexnummer (20 dividiert durch 65) betrug 0,308 für die Reizkontrollen. Ein anderer Weg zum Ausdrücken dieser Daten ist, daß 30,8% der WBC-Zählungen, durchgeführt an den Reizkontrollhunden, 45% unterhalb der Grundlinienzahlen vor der Reizung lagen.

Diskussion

Die perzentuelle Verhinderung der WBC-Abfälle unter 45% bei Vergleich der vakzinierten Tiere mit Kontrollen beträgt 79,6%. Der Großteil der WBC-Abfälle erfolgte an den Tagen 2 und 3.
Tabelle 15-1 vergleicht die WBC-Abfälle von vakzinierten Tieren gegenüber Kontrollen auf täglicher Basis. Tabelle 15-1 Tage nach Reizung Hunde, die einen WBC-Abfall von oder höher unterhalb der Grundlinie zeigen Kontrollen vakzinierte Tiere
Daher verleiht die Vakzine den vakzinierten Tieren einen signifikanten Schutz bei der Verhinderung von Abfällen der WBC- Zahlen.

B. Lymphozytenzellenzahlabfälle nach Reizung

Eine Lymphozytenzellenzahlverminderung von mehr als 50% von der Grundlinie wurde für die Zwecke der Auswertung dieser Untersuchung verwendet.

Vakzinierte Tiere

Sechs Beobachtungen von Lymphozytenabfällen von mehr als 50% von der Grundlinie wurden von 65 Lymphozyten-Zählungen, durchgeführt an den Reizkontrollhunden, aufgezeichnet. Die Lymphozytenzahlindexnummer (16 dividiert durch 65) betrug 0,246 für die Kontrollhunde.
Drei Beobachtungen von Lymphozytenabfällen von mehr als 50% von der Grundlinie wurden von den 72 Lymphozyten-Zählungen, durchgeführt an den intramuskulär geimpften Hunden, aufgezeichnet. Die Lymphozytenzahlindexnummer (3 dividiert durch 72) betrug 0,042 für diese Gruppe.

Kontrollen

16 Beobachtungen von Lymphozytenabfällen von mehr als 50% von der Grundlinie wurden von den 65 Lymphozyten-Zählungen, durchgeführt an den Reizkontrollhunden, aufgezeichnet. Die Lymphozytenzahlindexnummer (16 dividiert durch 65) betrug 0,246 für die Kontrollhunde.
Die Lymphozytenabfälle traten am häufigsten am Tag 4 nach der Reizung mit 7 von 10 Hunden (70%) auf, die einen Abfall der Lymphozyten zeigen. Zwei andere Tage, die eine hohe Frequenz von Lymphozytenabfällen nach Reizung zeigten, waren Tag 3 mit 5 von 10 Hunden (50%) und Tag 2 mit 3 von 10 (30%).

Diskussion

Die perzentuelle Verhinderung von Lymphozytenzahlabfällen unter 50% bei Vergleich der vakzinierten Tiere mit Kontrollen betrug 73,2%.
Der Großteil der Lymphozytenabfälle erfolgte an den Tagen 2, 3 und 4 nach Reizung. Tabelle 15-2 vergleicht die Lymphozytenabfälle von vakzinierten Tieren gegenüber Kontrollen an den Tagen 2, 3 und 4 nach Reizung. Tabelle 15-2 Tage nach Reizung Hunde, die Lymphozytenabfall von oder mehr unterhalb der Grundlinie zeigen Kontrollen vakzinierte Tiere
Die Daten zeigen, daß die abgetötete CCV-Vakzine den vakzinierten Tieren einen signifikanten Schutz bei der Verhinderung von Abfällen der Lymphozyten nach Reizung verliehen hatte.

C. Darminfektion mit Hundecoronavirus nach Reizung

Vakzinierte Tiere

Die 210 Darmproben wurden durch die Technik des Anfärbens mit fluoreszierendem Antikörper auf Anwesenheit von CCV-Virus untersucht.
In den Hirnhäuten keines der vakzinierten Tiere wurde eine Fluoreszenz, die typisch für das CCV-Virus ist, festgestellt.
Die Zahl von positiven Proben pro Infektionsgrad (4+ - 1/8+) wurde zusammengezählt und für jeden Hund die Gesamt-FA+ bestimmt. Der infektiöse Index für jeden Hund wurde nach folgender Methode berechnet.
Eine infektiöser Gruppenindex wurde durch Zusammenzählen des infektiösen Index der einzelnen Hunde und Dividieren durch die Gesamtzahl von Hunden in jeder Gruppe erhalten.
Der infektiöse Index für die subkutan vakzinierten Hunde war 0,0025, während der infektiöse Index für die intramuskulär vakzinierten Hunde 0,0034 war.
Der infektiöse Index für die vakzinierten Tiere, untersucht am Tag 6, gegenüber den am Tag 7 untersuchten variierte nicht signifikant.

Kontrollen

Die 100 Darmproben wurden durch die Technik des Anfärbens mit fluoreszierendem Antikörper auf die Anwesenheit von CCV-Virus untersucht. 81 der 100 Proben (81%) waren viruspositiv. Der Infektionsgrad betrug von 4+ (hochinfizierte Proben) bis negativ. Alle 10 Reizkontrollhunde (100%) zeigten CCV-Infektion des Darmtraktes.
3 der 10 Reizkontrollhunde (30%) zeigten in ihren Hirnhäuten für CCV typische Fluoreszenz.
Die Zahl von positiven Proben pro Infektionsgrad (4+ bis 1/8+) wurde verglichen. Die gleichen oben angewandten Berechnungsmethoden wurden für diese Daten verwendet.
Der infektiöse Index für die Reizkontrollhunde beträgt 1,594. Der infektiöse Index für die Reizkontrollhunde, untersucht am Tag 6, gegenüber den am Tag 7 untersuchten variierte in gewissem Ausmaß. 90% der Proben der am Tag 6 untersuchten Kontrollhunde waren positiv, während 72% der Proben der Kontrollhunde, die am Tag 7 untersucht wurden, positiv waren. Der Infektionsgrad war am Tag 7 gegenüber dem Tag 6 um 36,5% niedriger. Alle Kontrollhunde waren mit CCV infiziert.

Diskussion

Es wurde ein Vergleich der vakzinierten Tiere und der Kontrollen betreffend die Schwere und das Auftreten von Darminfektion gemacht. Die Daten wurden auch zwischen dem 6. und 7. Tag nach den Beobachtungsperioden analysiert. Die Ergebnisse zeigen, daß der verliehene Schutzgrad nicht vom Vakzinationsweg abhängig ist.
Die Vakzine verminderte den Infektionsgrad in den vakzinierten Tieren um mindestens 99,7%. Die Daten basierend auf dem Auftreten von positiven Proben pro Testgruppe unabhängig vom Infektionsgrad zeigen, daß die Vakzine den Infektionsgrad in den vakzinierten Tieren um mindestens 96,5% verminderte. Die von den am Tag 6 und 7 nach der Reizung beobachteten Proben erhaltenen Daten zeigen, daß durch die Vakzine eine 98,1%ige Verminderung der Darminfektion, gemessen durch Schwere und Auftreten, vorgesehen wurde. Eine 97%ige Verminderung der Darminfektion, gemessen durch das Auftreten, wurde durch die Vakzine vorgesehen. Die Testparameter von Temperaturreaktion, Reaktion der weißen Blutkörperchen und Lymphozytenreaktion sowohl für vakzinierte Tiere als auch Kontrollen nach Reizung wurden zusammengefaßt. Es sei darauf verwiesen, daß CCV-Virus in den Hirnhäuten von 30% der Kontrollen festgestellt wurde, während kein CCV-Virus in den Hirnhäuten der vakzinierten Tiere festgestellt wurde.

D. Serologische Daten

Umgebungskontrollen

Antikörperspiegelbestimmungen an den sieben Umgebungskontrollen zeigten, daß keine Exposition an fremdes CDV-, CAV-2-, CPI- oder CPV-Virus im Verlauf des Versuches erfolgte. Diese Antikörperspiegelversuche wurden an Blutproben durchgeführt, die 5 Wochen nach der ersten Vakzination entnommen worden waren, was auch der Zeitraum von 2 Wochen nach der zweiten Vakzination ist.

Antikörperspiegel auf Hundecoronavirus vor und nach Vakzination Vakzinierte Tiere

Die Antikörpertiter der vakzinierten Tiere zum Zeitpunkt der Vakzination, 3 Wochen nach der ersten Vakzination, 2 Wochen nach der zweiten Vakzination, 4 Wochen nach der zweiten Vakzination und 6 oder 7 Tage nach der Reizung zeigen, daß alle vakzinierten Tiere vor der Vakzination seronegativ waren. Die Daten zeigen, daß 20 von 21 vakzinierten Tieren (95,2%) auf die erste Vakzination serologisch reagierten. Der mittlere geometrische Titer betrug 1 : 7,9. Der mittlere geometrische Titer 2 Wochen nach der zweiten Vakzination stieg um das 7,6-fache auf einen Titer von 1 : 59,7. Alle vakzinierten Tiere hatten SN-Titer von höher als oder gleich einem SN-Titer von 1 : 9. Der mittlere geometrische Titer 4 Wochen nach der zweiten Vakzination stieg weiter um das 1,57-fache auf einen Titer von 1 : 93,9. Der niedrigste aufgezeichnete Antikörpertiter 4 Wochen nach der zweiten Vakzination betrug 1 : 34. Der subkutane Vakzinationsweg schien einen etwas höheren Antikörpertiter zu bewirken als der intramuskuläre Vakzinationsweg.
Die SN-Antikörperhöhen nach Reizung zeigen, daß in den vakzinierten Tieren nach Reizung ein niedrigerer Antikörperspiegel festgestellt wurde. Der Blutentnahmezeitpunkt 5 und 6 Tage nach Reizung ist wahrscheinlich zu früh, daß Amnesie erfolgt. Es kann sein, daß die Reizvirus-Antikörperwechselwirkung die beobachteten geringeren SN-Reaktionen erklären könnte.

Kontrollen

7 der 10 Kontrollhunde dienten als Umgebungskontrollen sowie als Reizkontrollhunde. Die Hunde waren zum Zeitpunkt der Reizung seronegativ, was beweist, daß während der Untersuchung keine Umgebungsexposition an CCV-Lebendvirus erfolgte. Dies bewies auch ihre Empfindlichkeit auf das Reizvirus.
Die Antikörperspiegel 6 und 7 Tage nach Reizung blieben niedrig. Dies ist nicht unerwartet. Eine meßbare Antikörperreaktion auf parenterale CCV-Impfung ist 6 bis 9 Tage. Die FA-Beobachtungen der Darmtraktproben zeigen, daß das Virus in den Hunden vorhanden war, doch war keine Seroumwandlung in einem 7 Tage-Intervall zwischen Reizung und Blutentnahme vor dem Einschläfern der Hunde erfolgt.
Die obigen Ergebnisse demonstrieren die zufriedenstellende Immunisierungsfähigkeit einer abgetöteten Hundecoronavirus (CCV)- Vakzine.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Veterinärvakzinezusammensetzung, enthaltend eine ausreichende Menge von Hundecoronavirus(CCV)-Antigen zur Erzeugung einer Immunreaktion beim Hund, einen pharmazeutisch akzeptablen veterinärmedizinischen Träger und mindestens ein Adjuvans, welches Verfahren die Gewinnung des CCV-Antigens durch Inokulieren von Gewebezellkulturen von Säugern mit CCV, die Kultivierung der Zellen in eine dichte konfluente Einzelzellschicht vor dem Inokulationsschritt oder innerhalb von 24 Stunden ab dem Inokulationsschritt, das Ernten der Zellen innerhalb von 96 Stunden ab der Inokulation und die Inaktivierung sämtlicher Viren in den geernteten Zellen, wobei der Präinaktivierungsvirustiter in dem Verfahren mindestens etwa 1000 Virusteilchen pro ml, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, beträgt, und das Formulieren des erhaltenen CCV-Antigens mit dem Träger und dem Adjuvans umfaßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Präinaktivierungstiter etwa 4,0 log Virusteilchen pro ml beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin etwa zur Inokulationszeit die Zellen in einer Menge vorhanden sind, die zur Bildung einer Einzelzellschicht mit mindestens 100.000 Zellen pro cm² ausreicht.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Zellen in einer Menge vorhanden sind, die zur Bildung einer Einzelzellschicht mit etwa 150.000 Zellen pro cm² ausreicht.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Zellen in einem Verhältnis von CCV-Viren, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, zu Zellen von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 500 mit CCV inokuliert werden.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Zellen in einem Verhältnis von CCV-Viren, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, zu Zellen von etwa 1 : 100 mit CCV inokuliert werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das inokulierte Virus vor der Kultivierung kürzer als 300 Minuten in einem Kulturmedium auf den Zellen absorbiert wird.

8. Verfahren zur Herstellung einer Veterinärvakzinezusammensetzung, enthaltend eine ausreichende Menge von Hundecoronavirus(CCV)-Antigen zur Erzeugung einer Immunreaktion beim Hund, einen pharmazeutisch akzeptablen veterinärmedizinischen Träger und mindestens ein Adjuvans, welches Verfahren die Gewinnung des CCV-Antigens durch Inokulieren von Gewebezellkulturen von Säugern mit CCV, das Ernten der Zellen, nachdem Virustiter von mindestens 2.000 Teilchen pro ml, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, erreicht worden sind, das Sammeln des von Lebendvirus freien CCV-Antigens und die Formulierung des erhaltenen CCV-Antigens mit dem Träger und dem Adjuvans umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin die Zellen in einer Menge vorhanden sind, die zur Bildung einer Einzelschicht mit mindestens etwa 100.000 Zellen pro cm² ausreicht, und die Zellen in einem Verhältnis von CCV-Viren, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;- Methode, zu Zellen von etwa 1 : 1 bis etwa 1 : 500 mit CCV inokuliert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, worin die Zellen geerntet werden, nachdem Virustiter von mindestens 4 log Virusteilchen, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, erhalten sind.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, worin die Zellen innerhalb von 96 Stunden oder weniger nach der Inokulierung geerntet werden.

12. Verfahren zur Herstellung einer Veterinärvakzinezusammensetzung, enthaltend einen pharmazeutisch akzeptablen veterinärmedizinischen Träger, zumindest ein Adjuvans zur Förderung der Immunreaktion und eine ausreichende Menge Coronavirusantigen zur Erzeugung einer protektiven Immunreaktion bei Hunden, die bei einer späteren virulenten Hundecoronavirus(CCV)-Exposition eine Reduktion der Darminfektion von mindestens etwa 80% bewirkt, welches Verfahren die Gewinnung des CCV-Antigens durch Inokulieren von Gewebezellkulturen von Säugern mit einem Impfvirus zur Erzeugung von CCV-Antigen, die Kultivierung der Zellen zu einer dichten konfluenten Einzelzellschicht vor dem Inokulationsschritt oder innerhalb von 24 Stunden ab dem Inokulationsschritt in einer Menge, die zur Bildung einer Einzelzellschicht mit mindestens 100.000 Zellen pro cm² ausreicht, gegebenenfalls das Absorbieren des Impfvirus an den Zellen über einen Zeitraum von bis zu 300 Minuten, das Ernten der Zellen, nachdem Virustiter von mindestens 4 log Teilchen pro ml, gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode, erreicht worden sind, das Sammeln des von Lebendvirus freien Antigens und das Formulieren des erhaltenen CCV-Antigens mit dem Träger und dem Adjuvans umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Zellen zum Zeitpunkt der Inokulation in einer Menge vorhanden sind, die zur Bildung einer Einzelzellschicht mit mindestens 100.000 Zellen pro cm² ausreicht.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, worin die Zellen mit ausreichendem Virus inokuliert werden, um ein minimales Infektionsmultiplizitätsverhältnis von etwa 1 : 500 zu erreichen.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, worin das Impfvirus etwa 60 Minuten lang an den Zellen absorbiert wird.

16. Verfahren zur Herstellung einer Hundecoronavirus(CCV)- Vakzine, umfassend die folgenden Schritte:

a) Inokulieren von Gewebekulturzellen von Säugern mit einer CCV-Menge (gemessen durch die FAID&sub5;&sub0;-Methode), die zur Erzielung eines minimalen Infektionsmultiplizitätsverhältnisses (Mol) von etwa 1 : 500 ausreicht;

b) Kultivieren der Zellen zu einer dichten konfluenten Einzelzellschicht vor dem inokulationsschritt oder innerhalb von etwa 12 bis 48 Stunden ab dem inokulationsschritt, wobei die Zellen zur Zeit der Inokulation in einer Menge von mindestens etwa 100,000 Zellen pro cm² vorhanden sind;

c) Ernten der Zellen innerhalb von 96 Stunden ab der Inokulation zur Gewinnung des CCV-Antigens;

d) Inaktivieren des mit den Zellen geernteten CCV-Virus zur Gewinnung einer inaktivierten CCV-Antigenzusammensetzung;

e) Zusetzen mindestens eines Adjuvans zur inaktivierten CCV- Antigenzusammensetzung; und

f) Herstellen der CCV-Vakzine, enthaltend die inaktivierte CCV-Antigenzusammensetzung, einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und zumindest ein Adjuvans.

17. Veterinärvakzinezusammensetzung, umfassend ein von Lebendvirus freies Coronavirusantigen in einer parenteral wirksamen Menge zur Erzeugung systemischer Immunität und lokaler Immunität im Darm von Hunden gegen eine Infektion mit virulentem Hundecoronavirus, einen pharmazeutisch akzeptablen veterinärmedizinischen Träger und zumindest ein Adjuvans.

18. Veterinärvakzinezusammensetzung, umfassend ein von Lebendvirus freies coronavirusantigen in einer zur Erzeugung von alpha-Immunglobulin(IgA)-Antikörpern und zur Induktion von lokaler Immunität im Darm gegen infektiösen Hundecoronavirus, einen pharmazeutisch akzeptablen veterinärmedizinischen Träger und zumindest ein Adjuvans.