DE3486163T2

DE3486163T2 - Plasmide, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende Mikroorganismen und Methoden zur extrazellulären Herstellung von Xylanase durch Züchten dieser Mikroorganismen.

Info

Publication number: DE3486163T2
Application number: DE19843486163
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Honda; Koki Horikoshi; Chiaki Kato; Toshiaki Kudo
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1983-03-08
Filing date: 1984-03-07
Publication date: 1993-10-14
Anticipated expiration: 2004-03-08
Also published as: EP0121138B1; DE3484207D1; DK138984A; EP0121138A1; FI85721C; FI840843A0; CA1226833A; DK138984D0; FI85721B; DE3486163D1; FI840843A

Description

Diese Erfindung betrifft neue Plasmide, Verfahren zu ihrer Herstellung, sie enthaltende transformierte Mikroorganismen und Verfahren zur extrazellulären Herstellung von Xylanase durch Züchten dieser Mikroorganismen. Die neuen Plasmide tragen DNA-Sequenzen, die das Enzym Xylanase codieren, und sind fähig, die extrazelluläre Sekretion der hochmolekularen Xylanase durch die entsprechenden transformierten Mikroorganismen zu induzieren.
Plasmide sind nicht-chromosomale Elemente zirkulärer DNA, die in einer Mikroorganismen-Zelle gefunden werden. Plasmide werden gemeinhin als Mittel zur Rekombination von Mikroorganismen-Genen benutzt und werden auf dem Gebiet der Fermentierungsindustrie immer wichtiger.
In letzter Zeit sind Untersuchungen an Fremd-DNA enthaltenden Plasmiden durchgeführt worden, welche die genetische Information für Stoffwechselprodukte für den spezifischen Wachstumsbedarf von Mikroorganismen enthält, wie an der Herstellung von Aminosäuren oder Peptiden ersichtlich. Einige Plasmide sind zur Gewinnung von Transformanten in Mikroorganismen-Wirte eingeführt worden. Verfahren sind vorgeschlagen worden, relativ niedermolekulare Verbindungen, wie Aminosäuren und Peptide, durch Züchten von Transformanten herzustellen. Der Grad der Vermehrung von Plasmiden, die Gene für die Herstellung hochmolekularer Stoffe enthalten, hängt jedoch von der Art der Mikroorganismen ab und diese Plasmide sind nicht wirksam exprimiert worden. Weiterhin sind keine wirksamen Verfahren zur Züchtung derartiger Transformanten entwickelt worden.
Es ist nicht möglich gewesen, selektiv ein bestimmtes extrazelluläres hochmolekulares Produkt durch Züchten eines mit einem Plasmid transformierten Mikroorganismus, welches ein Fremd-DNA-Fragment mit der genetischen Information zur extrazellulären Herstellung hochmolekularer Stoffe, die Stoffwechselprodukte anderer Mikroorganismen sind, zu gewinnen. Eine solche extrazelluläre Herstellung ist selbst dann nicht erfolgreich gewesen, wenn ein Transformant der meistens als Wirtsmikroorganismus verwendeten Art Escherichia benutzt wird.
Das US-Patent 4,411,994 von W. Gilbert et al. offenbart ein Verfahren zur Herstellung spezifischer Proteine in Bakterien und deren Ausscheidung aus der bakteriellen Zelle. Dieses Verfahren umfaßt die Insertion der das gewünschte nichtbakterielle Protein oder eines Teils eines Proteins codierenden DNA durch rekombinante Techniken in ein Plasmid- oder Phagen-Gen, welches entweder ein periplasmatisches oder ein extrazelluläres Protein codiert, nachstehend als "Trägerprotein" bezeichnet, dann die Transformation eines bakteriellen Wirtes mit der rekombinanten DNA und das Züchten des transformierten Wirtes zur Ausscheidung des Proteins. Das Verfahren dieses Patentes stellt ein Mittel zur Herstellung eines ausgewählten Proteins durch die Verwendung eines Genes für ein Trägerprotein mit einer Leadersequenz hydrophober Aminosäuren an seinem N-terminalen Ende bereit.
Die Zellwand von Escherichia coli , das oft für die Herstellung nützlicher, physiologisch wirksamer Stoffe verwendet wird, besteht aus drei Membranarten: einer inneren Membran, Peptidoglycan und einer äußeren Membran. Der Raum zwischen innerer und äußerer Membran wird als periplasmatischer Raum bezeichnet. Das Verfahren gemäß dem US-Patent 4,411,994 gestattet die Produktausscheidung in den periplasmatischen Raum, aber nicht durch die äußere Membran hindurch in das Kulturmedium oder außerhalb der bakteriellen Zeile. Die vorliegende Erfindung gestattet die Ausscheidung von Xylanase durch die äußere Membran des Wirtsmikroorganismus und seine direkte Gewinnung aus dem Kulturmedium durch die Insertion einer DNA-Sequenz mit der genetischen Information zur extrazellulären Herstellung des Enzyms Xylanase, eines hochmolekularen Stoffes, in ein Plasmid, wobei ein Hybridplasmid erhalten wird, und durch Züchten des mit dem genannten Hybridplasmid transformierten Wirtsmikroorganismus. Auf diese Weise gestattet die vorliegende Erfindung die Massenproduktion des Enzyms Xylanase, die durch Verfahren gemäß dem Stand der Technik niemals möglich gewesen wäre.
Deshalb besteht das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem in der Bereitstellung neuer Plasmide, die eine DNA-Sequenz mit der genetischen Information zur extrazellulären Herstellung von Xylanase enthalten, in Verfahren zu ihrer Herstellung, in transformierten, Plasmide enthaltenden Mikroorganismen und in der Bereitstellung von Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen für die extrazelluläre Xylanase-Herstellung.
Die erfindungsgemäßen Plasmide werden aus einem Vektorplasmid und einem DNA-Fragment mit der genetischen Information zur extrazellulären Xylanase-Produktion hergestellt. Solche DNA-Fragmente werden aus Mikroorganismen der Gattung Bacillus gewonnen. Der Begriff "extrazelluläre Herstellung" bedeutet, daß die vom Wirtsmikroorganismus produzierte Xylanase in das Kulturmedium sekretiert wird.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Plasmide, die fähig sind zur Induktion der extrazellulären Xylanase-Sekretion in Bakterien der Gattung Escherichia, sind durch die Ausführung folgender Schritte erhältlich:
(a) Herstellung eines chromosomalen DNA-Fragmentes von Bacillus sp. C 125 (PERM BP-469), das die extrazelluläre Sekretion von Xylanase codiert, mit einem Restriktionsenzym, vorzugsweise Hind III;
(b) Herstellung der rekombinanten Plasmid-DNA durch Ligierung des in Schritt (a) erhaltenen chromosomalen DNA-Fragmentes in ein Vektorplasmid, das mit einem geeigneten Restriktionsenzym, vorzugsweise Hind III, gespalten wurde;
(c) Isolierung der rekombinanten Plasmid-DNA aus einer transformierten Wirtszelle, die einen Xylanaseproduzierenden Phänotyp zeigt;
Die erfindungsgemäßen transformierten Wirtsmikroorganismen gehören zur Gattung Escherichia. Sie sind fähig, die durch das erfindungsgemäße eingebaute Plasmid codierte Xylanase zu sekretieren.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Züchtung der transformierten Wirtsmikroorganismen bereit, umfassend die Inoculierung des Mikroorganismus in ein Kulturmedium, das ein für den Mikroorganismus zum Wachsen notwendiges anorganisches Salz enthält, oder in ein Kulturmedium, das eine ausgewählte Kohlenstoffquelle zusammen mit dem anorganischen Salz enthält, sowie die Weiterzüchtung des Mikroorganismus, nachdem die Konzentration der Mikroorganismen-Zellen das Maximum erreicht hat und bis die Produktion und Anreicherung von Xylanase im Medium das Maximum erreicht.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 und Fig. 2 zeigen das bakterielle Wachstum und die Xylanase-Produktion des erfindungsgemäßen Escherichia coli HB101 (pCX311).
Fig. 3 zeigt die Xylanase-Produktion von Bacillus sp. C125.
Fig. 4 zeigt die Restriktionskarte des Plasmides pCX311.
Fig. 5 zeigt die Identität der pH-Aktivität der von Escherichia coli HB101(pCX311) produzierten Xylanase mit der von Bacillus sp. C125 produzierten Xylanase.
Der Begriff "hochmolekulare Stoffe", der in der Beschreibung und den Patentansprüchen verwendet wird, bedeutet nützliche, physiologisch wirksame Verbindungen, einschließlich bakterieller Stoffwechsel-Produkte, wie Enzymproteine, Antibiotika und biologisch wirksame, aus Säugetieren abstammende Proteine.
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail erklärt.

(a) Plasmide und ihre Herstellung

Die neuen erfindungsgemäßen Plasmide werden durch die Insertion einer Fremd-DNA in ein Plasmid (extrachromosomale DNA oder Vektor-DNA), wie dem in Escherichia-Zellen gefundenen Col E&sub1;, hergestellt.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendbare Vektor-DNA kann aus natürlichen Quellen isoliert worden sein.
Die für eine Selbstvermehrung nicht notwendigen DNA- Fragmente können deletiert sein.
Spezifische Beispiele für verwendbare Vektoren sind die Plasmide Col E&sub1;, pMB9, pBR322, pSC101, R6K und der Phage Lambda.
Fremd-DNA-Fragmente oder Exogenate, die in die Vektor-DNA eingebaut werden können, sind Gene mit der genetischen Information für die extrazelluläre Herstellung oder Sekretion hochmolekularer Stoffe, wie Enzymproteine, z. B. Xylanase, Penicillinase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase, Amylase, Protease, β-Glucanase, Cellulase.
Exogenate oder DNA-Fragmente, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Gene mit der genetischen Information für die extrazelluläre Produktion oder Sekretion hochmolekularer Stoffe ein. Sie werden aus einem Mikroorganismus, der zum Beispiel zur Gattung Bacillus gehört, gewonnen.
Ein Beispiel für einen Mikroorganismus, der DNA mit der genetischen Information für die extrazelluläre Xylanase- Produktion enthält und der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist Bacillus sp. C125.
Bacillus sp.C125 wurde aus einer in Tsurugashima, Saitama, Japan, gesammelten Bodenprobe isoliert und zeigt die folgenden charakteristischen mikrobiologischen Eigenschaften. Die Untersuchung und Klassifizierung dieses Stammes wurde gemäß "Aerobic Spore-forming Bacteria" (N.R. Smith, R.E. Gordon & F.E. Clark, United State Department of Agriculture, Nov. 1952) und "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (1957)" durchgeführt.

Charakteristische mikrobiologische Eigenschaften

a) Morphologie

1) Stäbchen, 0.5-0.7 u · 3.0-4.0 u
2) Sporenform oval, 0.6-0.8 u · 1.0-1.2 u und das Sporangium angeschwollen
3) gram-positiv b) Wachstum auf Kulturmedium Kulturmedium Wachstum Bouillon wächst gut Bouillon-Agar Glucose-Bouillon schwach wachsend Glucose-Bouillon-Agar Tyrosin-Agar Medium-I Glucose-Nitrat Glucose-Asparagin-Agar Null Medium-I + 5% NaCl c) Physiologische Eigenschaften Nitrat-Reduktion nein fast Null Verwertung von Propionat ja VP-Test negativ Urease-Test neutral Stärke-Hydrolyse positiv Casein-Hydrolyse Wachstumsbedingung wächst unterhalb von einem pH-Wert von 11.0 und unterhalb von 55ºC Wachstum unter anaerober Bedingung (auf Medium-I) schwach wachsend
Aus der Zusammenfassung der obenstehenden Eigenschaften wird deutlich, daß der Mikroorganismus zu der Gattung Bacillus gehört, da er ein aerobes, sporenbildendes Bakterium ist. Der Mikroorganismus Bacillus sp. C125 ist ein neuer Stamm alkalophiler Bakterien. Er unterscheidet sich deutlich von bekannten Bakterien dadurch, daß er bei einem pH-Wert unter 11.0 und bei einer Temperatur unter 55ºC wächst.
Für die Insertion von Fremd-DNA in eine Vektor-DNA kann jedes herkömmliche Verfahren in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel wird chromosomale DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym oder Endonuclease gespalten, um ein Fremd-DNA-Fragment oder Exogenat zu gewinnen, welches dann mit einer mit dem gleichen Restriktionsenzym behandelten Vektor-DNA gemischt wird und das Gemisch wird mit einer geeigneten Ligase ligiert. Wie zuvor beschrieben, können so die neuen erfindungsgemäßen Plasmide durch die Herstellung eines die extrazelluläre Xylanase-Produktion codierenden DNA-Fragmentes mittels eines Restriktionsenzymes, durch die Spaltung einer Plasmidvektor- DNA mit einem Restriktionsenzym, welches die auf dem DNA- Fragment enthaltene genetische Information nicht zerstört, durch die Behandlung des DNA-Fragmentes und des gespaltenen Plasmidvektors mit DNA-Ligase zur Herstellung eines rekombinanten Plasmides und durch die Isolierung des rekombinanten Plasmides in einer herkömmlichen Art und Weise [siehe Bolivar et al., Gene,2,(1977), 95] gewonnen werden.
Das neue Plasmid pCX311 kann aus einem Fragment chromosomaler Bacillus sp. C125- DNA und dem Plasmid pBR322 hergestellt werden. Die Restriktionskarte für das Plasmid pCX311 wird in Fig. 4 gezeigt. Wie aus Fig. 4 ersichtlich, wird das Plasmid pCX311 aus dem Plasmid pBR322 hergestellt, in welches das die extrazelluläre Xylanase-Produktion codierende Fragment chromosomaler Bacillus sp.C125-DNA in die HindIII- Schnittstelle des Plasmides pBR322 eingebaut wird. Dadurch ist das Plasmid pCX311 ein circuläres DNA-Molekül von etwa 9.01 kb, bestehend aus pBR322-DNA und einem Fragment von Bacillus sp. C125-DNA von etwa 4.0 kb.

(b) Herstellung von Mikroorganismen

Die aus den chromosomalen DNA-Fragmenten und DNA- Plasmidvektoren hergestellten rekombinanten Plasmide werden in einen Wirtsmikroorganismus der Gattung Escherichia mit einer herkömmlichen Transformationsmethode eingeführt. Die Züchtung wird weitergeführt, bis ein stabilisierter Genotyp etabliert ist, um einen Transformanten zu gewinnen, der beide Genotypen auf der ausgewählten chromosomalen DNA und auf der Vektor-DNA enthält. Dazu kann ein herkömmliches sogenanntes "Shot gun"-Verfahren verwendet werden.
Ein typischer Wirtsmikroorganismus,der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, ist Escherichia coli HB101, ein Hybridstamm von Escherichia coli K-12 und Escherichia coli B.
Der Transformant Escherichia coli HB101 (pCX311) hergestellt durch die Einführung des Plasmides pCX311 in Escherichia coli HB101, hat außer der Penicillinresistenz und der Xylanaseproduktion die gleichen mikrobiologischen Eigenschaften wie der Wirt Escherichia coli HB101 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982), S.504, Genotyp: F&supmin;, hsd S 20 (rB&supmin;, mB&supmin;), rec A13, ara-14, proA2, lacYI, galK2, rpsL20(Sm'), xyl-5, mtl-1, supE44, Lambda&supmin;]. Escherichia coli HB101 (pCX311) wird weiterhin durch den Besitz des Plasmides pCX311 charakterisiert, das heißt die Fähigkeit zur extrazellulären Produktion von Xylanase.
Wie in den Beispielen gezeigt, erreicht die extrazelluläre Produktion von Xylanase durch Escherichia coli HB101 (pCX311) mehr als 80% der Gesamtproduktion einschließlich der intrazellulären Produktion und verbleibt nach langer Züchtung. Im Gegensatz dazu erreicht die extrazelluläre Produktion oder Aktivität der Xylanase von Bacillus sp.C125 das Maximum langsam und fällt dann schnell, wie in Fig. 3 gezeigt. Daher kann die extrazelluläre Produktion von Bacillus sp. 0125 nicht mit der erfindungsgemäßen Produktion von Escherichia coli HB101 (pCX311) verglichen werden.
Die vorliegende Erfindung, die Escherichia coli HB101 (pCX311) mit der Fähigkeit zur extrazellulären Herstellung von Enzymproteinen wie Xylanase bereit stellt, ist nicht nur neu, sondern auch erfinderisch. E.coli HB101 (pCX311) kann zusätzlich zu den beträchtlichen Mengen von Xylanase beträchtliche Mengen anderer Enzymproteine produzieren und aus den Zellen ins Medium sekretieren, die ebenfalls gewonnen werden können. Insbesondere hat man entdeckt, wie in den Beispielen gezeigt, daß Escherichia coli HB101 (pCX311) beträchtliche Mengen von Penicillinase, alkalischer Phosphatase zusätzlich zu der Xylanase produziert und aus den Zellen ins Medium sekretiert, was vorher nur im periplasmatischen Raum beobachtet wurde.
Eine solche extrazelluläre Produktion durch Escherichia coli HB101 (pCX311) beweist, daß die auf dem Plasmid pCX311 enthaltene DNA von etwa 4000 Nucleotid-Basenpaaren dem Wirt die Fähigkeit zur extrazellulären Herstellung von Stoffwechsel-Produkten schafft.

(c) Züchtung der Mikroorganismen

Für das Züchten der in Schritt (b) hergestellten Transformanten können beliebige Kulturmedien benutzt werden, die für die Herstellung der durch die spezifische genetische Information codierten spezifischen Stoffe geeignet sind und die für das Wachstum von Mikroorganismen der Gattung Escherichia geeignet sind. Bei dem erfindungsgemäßen Vorgang ist es notwendig, den Mikroorganismus in einem Kulturmedium zu züchten, das ein für das Wachstum des Mikroorganismus benötigtes anorganisches Salz oder eine ausgewählte Kohlenstoffquelle zusammen mit dem anorganischen Salz enthält , und den Mikroorganismus weiterzuzüchten, nachdem die Konzentration der Mikroorganismenzellen das Maximum erreicht hat und bis die Produktion und Anreicherung der hochmolekularen Stoffe in den Medien das Maximum erreicht.
Beispiele für das anorganische Salz, das in der vorliegenden Erfindung benutzt werden kann, schließen Natrium- und Kaliumsalze wie Natriumchlorid, Natriumsulfat, Kaliumchlorid und ähnliche ein, wobei von diesen Natriumchlorid bevorzugt wird. Die Medien, die das anorganische Salz oder die ausgewählte Kohlenstoffquelle zusammen mit dem anorganischen Salz enthalten, können solche Kohlenstoffquellen wie Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Glycerin, Kleie, Xylan oder ähnliches, solche Stickstoffquellen wie Ammoniakwasser, Ammoniumsalze, anorganische Ionen und gegebenenfalls solche Nährstoffe wie Aminosäuren, Vitamine enthalten. Für die Escherichia coli HB101 (pCX311) -Kultur ist es wichtig und notwendig, dem Medium die für ein ausgewähltes Produkt geeignete Kohlenstoffquelle hinzuzufügen. Die Kulturmedien, die in der vorliegenden Erfindung benutzt werden können, sind die, welche als Grundmedium, LB-Bouillon (enthaltend Trypton, Hefeextrakt und NaCl), BPB-Bouillon (Difco Laboratories; enthaltend Polypepton, Hefeextrakt und K&sub2;HPO&sub4;), Nähr-Bouillon (Difco 0001), Trypton-NaCl-Bouillon verwenden.
Da in einem Medium, das kein anorganisches Salz enthält, mehr als 80% der Gesamtprodukte in der intrazellulären Fraktion verbleiben, ist es notwendig, ein Medium, das ein anorganisches Salz enthält, zu benutzen, damit die meisten Produkte aus den Zellen in das Kulturmedium sekretiert werden. Die Menge des verwendeten anorganischen Salzes liegt zwischen 0.5-3.0 Gew.%, bezogen auf das Kulturmedium.
Bei der Kultur von Escherichia coli HB101 (pCX311) werden ausgezeichnete Ergebnisse durch die Verwendung von LB- Bouillon, zu der Kleie und/oder Xylan als Kohlenstoffquelle hinzugefügt wurden, erhalten, vorzugsweise in einer Menge von 0.5 Gew.%, bezogen auf das Kulturmedium.
Obwohl die Kulturbedingungen, wie pH-Wert, Temperatur oder Sauerstoffversorgung, für das optimale Wachstum der zur Gattung Escherichia gehörenden Mikroorganismen verändert werden können, ist es in der vorliegenden Erfindung notwendig, den Mikroorganismus weiterzuzüchten, nachdem die Konzentration der Mikroorganismuszellen das Maximum erreicht hat, das heißt nach der letzten logarithmischen Phase und bis die Produktion und Anreicherung der hochmolekularen Stoffe im Medium das Maximum erreicht hat.
Nach der Inoculierung des zur Gattung Escherichia gehörendem Mikroorganismus in das Medium erreicht die Zellkonzentration das Maximum nach 5 bis 20 Stunden und die Produktion und Anreicherung der hochmolekularen Stoffe erreichen das Maximum nach 12 bis 48 Stunden. Obwohl der pH- Wert des Kulturmediums nicht kritisch ist, wird ein Bereich von pH 5-pH 8, besonders pH 7, bevorzugt. Auf diese Weise produziert der Mikroorganismus beträchtliche Mengen extrazellulärer Stoffe, die bequem gewonnen werden können, ohne weitere Zugabe des für das Wachsen des Mikroorganismus notwendigen anorganischen Salzes, von Kohlenstoffquellen und ähnlichem während der Züchtung.
Entsprechend dem erfindungsgemäßen Kulturverfahren können außer den Enzymproteinen solche hochmolekularen Permentierungsprodukte wie Antibiotika, Polysaccharide in einer bedeutsamen Menge produziert werden. Dieses Verfahren kann auch für die Züchtung beliebiger Mikroorganismen angewendet werden, die mit einem Plasmid transformiert sind, welches eine Fremd-DNA trägt, die biologisch wirksame hochmolekulare Stoffe, wie Hormon-Peptide (z. B. Insulin) oder Interferon, codiert, und die DNA, die extrazelluläre Produktion und Sekretion biologisch wirksamer hochmolekularer Stoffe codiert, was zur Massenproduktion der hochmolekularen Stoffe wie Insulin, Interferon und ähnlichem führt.
Wie vorstehend erklärt, trägt die vorliegende Erfindung zur industriellen Herstellung nützlicher hochmolekularer Stoffe bei.
Beispiele von Mikroorganismen, die in dieser Erfindung benutzt werden können, schließen ein (i) Bacillus sp. C125 und (ii) Escherichia coli HB101 (pCX311), die beide am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan, International Depository Authority (nachstehend als "FERM" bezeichnet) unter den folgenden Hinterlegungsnummern FERM BP-469 bzw. FERM BP-470 hinterlegt wurden. Die Hinterlegung bei FERM ist nicht beschränkt und gestattet den vollen Zugang zur Kultur. Die Hinterlegungsstelle und die Hinterlegungsnummern der vorstehend erwähnten Mikroorganismen werden unten gezeigt: Mikroorganismen Hinterlegungsstelle Hinterlegungsnummer Bacillus Escherichia coli
Der Anmelder wird die Hinterlegung von FERM BP-469 und FERM BP-470 bis zum Ende der Dauer eines auf diese Anmeldung erteilten Patentes in einer unbeschränkten Form aufrechterhalten, falls ein Patent auf diese Anmeldung erteilt wird, und die erwähnten Mikroorganismen-Stämme werden bis zum Ende der Dauer eines auf diese Anmeldung erteilten Patentes für jede dritte Partei jederzeit verfügbar sein.
Wir werden nun unter Bezugnahme auf Beispiele Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Plasmide, Verfahren zur Herstellung des Transformanten Escherichia coli HB101 (pCX311) und die extrazelluläre Herstellung von Xylanase durch die Transformanten erläutern.

Beispiel 2

Herstellung und Reinigung des Plasmides pCX311

1. Kulturwachstum bakterieller Zellen unter Verwendung von Escherichia coli HB101 (pCX311) [FERM BP-470]

Vorkultur in LB. Über Nacht bei 37ºC.
Kultur in M-9. Chloramphenicol zugeben nach 130 Klett-Einheiten. 16 h bei 37ºC.
Zentrifugation. 5000 Upm, 20 min bei 4ºC.
Zellpellets. Aufbewahrt bei -80ºC.

2. Reinigung des Plasmid-DNA

Zellpellets 10 ml, 20% Saccharose, 50 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8 suspendiert, auf Eis aufbewahren.
50 ml Polypropylen-Zentrifugenröhrchen 2 ml, 0,25 M EDTA. 1 ml, Lysozym (5 mg/ml von 0.025 M Tris, pH 8.) 0.1 ml, RNasen (10 mg/ml)
Zell-Lyse. Vorsichtig mischen. 15 bis 30 min auf Eis stehen lassen. 5 ml, 3· Triton®. Vorsichtig mischen. Auf Eis 15 bis 45 min stehen lassen.
Zentrifugation 17,000 Upm, 40 min bei 4ºC.
Überstandslösung in Kunststoffzylinder
250 ml Glasflasche 2/3 Vol. 2· dest. H&sub2;O 2/3 Vol. kaltes, gesättigtes Phenol. Vorsichtig mischen.
Zentrifugation. 6500 Upm, 15 min bei 4ºC.
Obere Phase. Gleiches Vol. Phenol; Chloroform
Zentrifugation. 6500 Upm, 15 min bei 4ºC.
Obere Phase in 250-ml-Flasche 1/25 Vol. 5M NaCl. 2 Vol. EtOH bei -20ºC. Über Nacht bei -20ºC.
Zentrifugation. 6500 Upm, 60 min bei -20ºC.
DNA-Pellet. Überschüssige Flüssigkeit trocknen. 5 ml A-50 Pufferr, resuspendiert. 1 ml steriles 80% Glycerin, vorsichtig mischen.
A-50 Säule. (2·35 cm, 1 Fraktion=4 ml.)
DNA-Fraktion. (A&sub2;&sub6;&sub0;-Peak.) 2 Vol. EtOH bei -20ºC. Über Nacht bei -20ºC.
Zentrifugation. 6500 Upm. 60 min bei -20ºC.
DNA-Pellet. 2,1 ml TEN-Puffer in einem 5 ml Cellulosenitrat-Röhrchen 2,2 g CsCl, mischen. (In der Dunkelheit.) 150 ul PdI (2 mg/ml). Gut mischen. 2 ml Mineralöl oben auf das Röhrchen.
CsCl-Gradienten-Zentrifugation. 36,000 Upm, 40 h bei 20ºC. Obere Bande: chromosomale DNA & DNA mit "Nicks" Sichtbar mit UV-Licht. Untere Bande: covalent geschlossene p-DNA.
Tropfenweises Sammeln der DNA aus der unteren Bande.
Dowex 50W-X8-Säule. Überprüfen mit UV. (im Licht.)
Dialyse gegen 2 bis 4 l von 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8. Über Nacht bei 4ºC.
In 30 ml Cortex-Zentrifugenröhrchen. Vol. 1/25 Vol. 5 M NaCl. 2 Vol. EtOH bei -20ºC. Über Nacht bei -20ºC.
Zentrifugation. 6500 Upm, 60 min bei -20ºC.
DNA präzipitiert. 1-2 ml TEN-Puffer.
Gereinigte Plasmid-DNA (1 mg/1 Bouillon). Aufbewahrt bei -20 bis -70ºC.

Beispiel 1

(1) Herstellung chromosomaler DNA mit der genetischen Information zur Produktion von Xylanase

Der alkalophile Bacillus sp. C125 (FERM BP-469) mit der Fähigkeit zur extrazellulären Produktion von Xylanase wurde unter Schütteln bei 30ºC für 19 Stunden in Bouillon (enthaltend 10.0 g Kleie, 5.0 g Hefeextrakt, 5.0 g Polypepton, 0.2 g MgSO&sub4; · 7H&sub2;O, und 10 g Na&sub2;CO&sub3; in einem Liter Wasser und eingestellt auf einen pH-Wert von 9.0) gezüchtet. Die Zellen aus der letzten logarithmischen Phase wurden gesammelt, daraus wurde die chromosomale DNA mit dem Phenolextraktions- Verfahren extrahiert und gereinigt, wobei 5 mg chromosomaler DNA erhalten wurden.

(2) Insertion des chromosomalen DNA-Fragmentes in die Vektor- DNA.

Die in Schritt (1) gewonnene chromosomale DNA (10 ug) wurde mit dem Restriktionsenzym Hind III bei 37ºC für 5, 10, 20, 30 und 60 min gespalten, um DNA-Fragmente zu erhalten.
Das als Vektor benutzte Plasmid pBR322 [Bethesda Research Laboratories, U.S.A. , resistent gegen Tetracyclin (Tetr) und gegen Ampicillin (Ampr)] wurde mit Hind III geschnitten, dann bei 65ºC für 5 min erhitzt und dann mit den DNA-Fragmenten gemischt. Das Gemisch wurde mit T&sub4;-Phagen-DNA-Ligase bei 10ºC für 24 Stunden behandelt und dann für 5 min bei 65ºC erhitzt.
Ein dreifaches Volumen Ethanol wurde dem Gemisch hinzugefügt. Die die chromosomalen DNA-Fragmente enthaltenden Plasmide wurden präzipitiert und gesammelt.

(3) Transformation des Mikroorganismus mit Plasmiden, die das Gen zur extrazellulären Produktion von Xylanase haben.

Escherichia coli HB101, der ein Hybridstamm zwischen Escherichia coli K-12 und Escherichia coli B ist, wurde in 10 ml LB-Bouillon [enthaltend 10 g Trypton (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), 5 g Hefeextrakt, 1 g Glucose und 10 g NaCl in einem Liter deionisiertem Wasser; der pH-Wert wurde auf 7.0 eingestellt] inoculiert und bei 37ºC unter Schütteln bis zur letzten logarithmischen Phase gezüchtet. Die Zellen wurden gesammelt und in einer eiskalten 0.03 M CaCl-Lösung (Endkonzentration) suspendiert, um kompetente Zellen zu erhalten. Die Zellsuspension und die in Schritt (2) gewonnene Plasmid-Lösung wurden vereinigt und für 60 Minuten auf Eis gehalten. Das Gemisch wurde für 1 bis 2 Minuten auf 42ºC erhitzt, um die Plasmid-DNA in die Zellen einzuführen. Diese Zellsuspension wurde in frische LB-Bouillon inoculiert und bei 37ºC für 3 bis 5 Stunden unter Schütteln gezüchtet. Die Zellen wurden gesammelt und gewaschen, wobei Transformanten erhalten wurden, aus denen Escherichia coli HB101 (pCX311) (FERM BP-470) mit der Fähigkeit zur extrazellulären Produktion von Xylanase und Penicillinase isoliert wurde.

Beispiel 3

Escherichia coli HB101 (pCX311) (FERM BP-470), in Schritt (3) des Beispiels 1 erhalten, wurde in 500 ml-Flaschen mit 100 ml LB-Bouillon (enthaltend 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Glucose, 2 g Glycerin, 10 g NaCl und 10 mg Penicillin in einem Liter Wasser), die 0.5% Xylan enthielt, inoculiert und bei 37ºC unter Schütteln gezüchtet. Das Zellwachstum wurde durch die optische Dichte bei 660 nm gemessen. Die Enzymaktivität wurde wie folgt getestet: 0.05 ml Kulturflüssigkeit, 0.1 ml Xylan-Lösung (Seikagaku kogyo, Japan) und 0.1 ml eines 0.2 M Tris-Malat-Puffers mit einem pH-Wert von 8 wurden gemischt und bei 40ºC 10 Minuten erhitzt. 1 ml DNS (3.5-Dinitrosalicylsäure) wurde dem Gemisch hinzugefügt, welches dann bei 100ºC 5 Minuten erhitzt wurde. 4 ml Wasser wurden dem Gemisch hinzugefügt. Die Extinktion bei 510 nm wurde gemessen. Eine Einheit von Xylanase reduziert 1 mg Xylose pro Minute. Fig. 1 zeigt die extrazelluläre Produktion oder Sekretion von Xylanase durch Escherichia coli HB101 (pCX311), der in 0.5% Xylan-haltiger LB-Bouillon gezüchtet wurde.
Wie in Fig. 1 gezeigt, erreichte das Zellwachstum des Transformanten das Maximum nach 9 bis 12 Stunden Züchtung und die extrazelluläre Xylanase-Aktivität begann nach 6 Stunden Züchtung zuzunehmen und erreichte das Maximum (etwa 0.35 Einheiten/ml) nach 13 Stunden Züchtung.
Die hergestellte extrazelluläre Xylanase war sehr stabil und, wie in Fig. 5 gezeigt, die Produktion blieb selbst nach 48 Stunden Züchtung hoch und erreichte mehr als 80% der gesamten Enzymproduktion. Im Gegensatz dazu wurde nur eine geringe intrazelluläre Xylanase-Produktion in einer frühen Phase (nach 9 Stunden Züchtung) entdeckt. Das Maximum betrug nur 0.13 Einheiten/ml oder etwa 10% der gesamten Enzymproduktion und außerdem nahm die intrazelluläre Produktion allmählich ab. Fig. 2 zeigt die Xylanase-Produktion von Escherichia coli HB101 (pCX311), der in LB-Bouillon mit 0.5% Kleie statt Xylan gezüchtet wurde. Fig. 2 zeigt die gleiche Tendenz wie in Fig. 1 beobachtet. Zum Vergleich wurde Bacillus sp. C125 (FERM BP-469), ein DNA-Spender, gezüchtet und die Xylanase-Aktivität wurde getestet.
Bacillus sp. C125 wurde in in 500 ml-Flaschen mit 100 ml Medium (das 10.0 g Xylan, 5.0 g Hefeextrakt, 5.0 g Polypepton, 1.0 g K&sub2;HPO&sub4;, 0.2 g MgSO&sub4; · 7H&sub2;O und 10 g Na&sub2;CO&sub3; in einem Liter Wasser enthielt und auf einen pH-Wert von 6.0 eingestellt war) inoculiert und bei 37ºC unter Schütteln gezüchtet. Die extrazelluläre Xylanase-Aktivität in der Kulturflüssigkeit wurde alle acht Stunden bestimmt. Sie begann nach acht Stunden Züchtung anzuwachsen und erreichte das Maximum (etwa 0.5 Einheiten/ml) nach 48 Stunden, nahm aber schnell ab (Fig. 3).

Feststellung der Identität der Xylanase

Ammoniumsulfat wurde der Kulturflüssigkeit des in Schritt (3) von Beispiel 1 gewonnenen Transformanten hinzugefügt. Das ausgesalzte Präzipitat wurde in Wasser gelöst und die Lösung wurde über Nacht gegen nasser dialysiert. Das Dialysat wurde an eine CM-Gellulose-Säule, die mit 20 mM Phosphorsäure-Mononatriumphosphat-Puffer, pH 4.5, equilibriert war, adsorbiert. Die Elution wurde durch die Anwendung eines linearen Gradienten von 0.1-0.7 M Natriumchlorid durchgeführt. Xylanase wurde mit etwa 0.4 M Natriumchlorid eluiert. Die Fraktionen, die Xylanase-Aktivität zeigten, wurden vereinigt und einer Sephadex G-100 Gelfiltration unterzogen, um gereinigte Xylanase zu gewinnen.
Ähnlich wurde die Kulturflüssigkeit von Bacillus sp.C125 (FERM BP-469) behandelt, um gereinigte Xylanase zu gewinnen.
Zur Feststellung der Identität der Xylanase aus Escherichia coli HB101 (pCX311) mit der Xylanase aus Bacillus sp.C125, wurden die Wirkungen des pH-Wertes auf die Aktivität untersucht, und eine Ultrazentrifugations-Analyse, eine Elektrophorese und eine Bestimmung des Molekulargewichtes für jede Xylanase durchgeführt. Das Ergebnis war, daß beide Enzyme miteinander identisch waren, wie nachstehend gezeigt.
(a) Acetat (pH 4-5), Tris-Malat (pH 5-8), Tris-HCl (pH 7-9) und Glycin-NaOH (pH 9-11) wurden hergestellt. Unter Verwendung dieser Pufferlösungen wurden die Wirkungen des pH- Wertes auf die Aktivität untersucht. Die Ergebnisse werden in Fig. 5 gezeigt, welche die Identität beider Enzyme bezüglich der pH-Aktivität beweist.
(b) Die Ultrazentrifugations-Analyse zeigte, daß beide Enzyme einen einzigen Peak mit einem Sedimentationskoeffizienten von etwa 3.5 S hatten.
(c) Die Desk-Elektrophorese bei einem pH-Wert von 8.3 zeigte, daß beide Enzyme eine einzige Bande hatten. Elektrofocussierung mit Ampholin zeigte einen einzigen Peak. Der isoelektrische Punkt beider Enzyme war pH 6.3
(d) Die Bestimmung des Molekulargewichtes der Enzyme wurde mit dem SDS-Polyacrylamid-Verfahren durchgeführt. Das bestimmte Molekulargewicht beider Enzyme war etwa 40,000.

Beispiel 4

Escherichia coli HB101, Escherichia coli HB101 (pBR322) und Escherichia coli HB101 (pCX311) (FERM BP-470) wurden in der gleichen, Xylan enthaltenden LB-Bouillon, die im Beispiel 3 benutzt wurde, unter Schütteln bei 37ºC 20 Stunden (Penicillinase) oder 15 Stunden (alkalische Phosphatase und β-Galactosidase) gezüchtet. Die Enzymaktivitäten für die alkalische Phosphatase und die β-Galactosidase wurden durch die optische Dichte bei 420 nm gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 wiedergegeben. Tabelle 1 Mikroorganismus Produkte Aktivität (Einheiten/ml) Extrazellulär Intrazellulär Gesamt Alkalische Phosphatase E.coli β-Galactosidase Alkalische Phosphatase E.coli β-Galactosidase Penicillinase

Beispiel 5

Die Wirkungen von anorganischen Salzen in den Medien auf die Xylanase-Produktion von Escherichia coli HB101 (pCX311) (FERM BP-470) wurden untersucht. Das gleiche Medium , das im Beispiel 3 verwendet wurde, wurde als Grundmedium benutzt. Der Mikroorganismus wurde für 14 oder 20 Stunden in dem Grundmedium, dem verschiedene anorganische Salze hinzugefügt worden waren, gezüchtet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 wiedergegeben. Tabelle 2 Zeit anorganisches Salz Konzentration des anorganischen Salzes Xylanase-Aktivität (Einheiten/ml) Extrazellulär Intrazellulär gesamt keines * 0.16 M NaCl entspricht 1 Gew.%

Claims

1. Rekombinantes Plasmid, das die extrazelluläre Sekretion von Xylanase in mit diesem Plasmid transformiertem Escherichia coli induzieren kann und das durch folgende Schritte erhältlich ist:

(a) Herstellung eines chromosomalen DNA-Fragments von Bacillus sp. C 125 (FERM BP-469), das die extrazelluläre Sekretion von Xylanase codiert, mit Hilfe eines Restriktionsenzyms;

(b) Herstellung der rekombinanten Plasmid-DNA durch Ligierung des in Schritt (a) erhaltenen chromosomalen DNA-Fragments in ein Vektorplasmid, das mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten wurde; und

(c) Isolierung der rekombinanten Plasmid-DNA aus einer transformierten Wirtszelle, die einen Xylanase-produzierenden Phenotyp zeigt.

2. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 1, wobei das in den Schritten (a) und (b) verwendete Restriktionsenzym das Restriktionsenzym HindIII ist.

3. Rekombinantes Plasmid nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Vektorplasmid das Plasmid pBR 322 ist.

4. Rekombinantes Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, nämlich das Plasmid pCX 311 (FERM BP-470).

5. Wirtsorganismus der Gattung Escherichia, vorzugsweise der Art Escherichia coli, der mit einem rekombinanten Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 transformiert ist.

6. Wirtsorganismus nach Anspruch 5, nämlich der Stamm Escherichia coli HB101, der zur extrazellulären Sekretion von Xylanase fähig ist.

7. Verfahren zur Konstruktion eines rekombinanten Plasmids nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Herstellung eines chromosomalen DNA-Fragments von Bacillus sp. C 125 (FERN BP-469), das die extrazelluläre Sekretion von Xylanase codiert, mit Hilfe eines Restriktionsenzyms,

(b) Herstellung der rekombinanten Plasmid-DNA durch Ligierung des in Schritt (a) erhaltenen chromosomalen DNA-Fragments in einen Vektor, der mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten wurde;

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das in den Schritten

(a) und (b) verwendete Restriktionsenzym das Restriktionsenzym HindIII ist.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 7 oder 8, wobei das Vektorplasmid pBR 322 ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das rekombinante Plasmid das Plasmid pCX 311 (FERN BP-470) ist.

11. Verfahren zur extrazellulären Produktion von Xylanase, in dem ein Transformant nach Anspruch 5 oder 6 gezüchtet wird, umfassend:

(a) Inoculierung eines Mediums, das eine ausgewählte Kohlenstoffquelle zusammen mit einem anorganischen Salz, nämlich einem Natriumsalz oder einem Kaliumsalz, enthält, mit dem Transformanten;

(b) Weiterzüchtung des Transformanten, nachdem die Konzentration der Transformantenzellen das Maximum erreicht hat, und bis die Produktion und Anreicherung von Xylanase im Medium das Maximum erreicht.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das anorganische Salz Natriumchlorid oder Kaliumchlorid ist.

13. Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, wobei das anorganische Salz in einer Menge von 0,5 bis 3,0 Gew.-% des Mediums verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei die Kohlenstoffquelle Kleie oder Xylan ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei der Transformant 12 bis 48 Stunden gezüchtet wird.