DE3433156C2

DE3433156C2 -

Info

Publication number: DE3433156C2
Application number: DE3433156A
Authority: DE
Inventors: Jose Luis Garcia Madrid Es Lopez
Original assignee: Antibioticos SA
Current assignee: Antibioticos SA
Priority date: 1984-02-16
Filing date: 1984-09-10
Publication date: 1988-12-29
Also published as: FR2559781A1; GB8404057D0; US4806480A; FR2559781B3; GB2155935B; DE3433156A1; GB2155935A

Description

Escherichia coli K 12-Stämme sind bekanntlich bevorzugte Mikroorganismen für die Durchführung von Experimenten der Genmanupulation. Die Technologie der rekombinanten DNA wurde im industriellen Bereich für die Herstellung kommerziell interessanter Substanzen entwickelt, wobei das Wirts-Vektor- System Escherichia coli K 12 benutzt wird. Dies geschah haupt sächlich aus zwei Gründen:
Einerseits ist die Genetik dieser Mikroorganismen derzeit am besten bekannt, und andererseits schreiben die Richtlinien für den Umgang mit rekombinanter DNA in verschiedenen Ländern die Benutzung dieses Organismus für die Durchführung von Experi menten mit rekombinanter DNA vor. Doch die Stämme besitzen nicht die Fähigkeit zur Saccharosevergärung, wie sie andere industriell nützliche Mikroorganismen aufweisen wie Bacillus, Corynebacterium, Actinomyceten oder Hefen. Daher können Escherichia coli K 12-Stämme nicht gut wachsen, wenn man Rohmaterialien wie Melasse verwendet, die Saccharose als Hauptkohlenstoffquelle enthalten. Somit wäre es wünschenswert, einen Plasmidvektor zu erhalten, der sich nicht nur dafür eignet, industriell nützliche genetische Informationen zu tragen, sondern der gleichzeitig Bakterien, beispielsweise Escherichia coli K 12, die Fähigkeit der Saccharosevergärung verleihen könnte.

Dieser Plasmidvektor würde einen weiteren Vorteil gegenüber anderen konventionellen Vektoren bieten, der dadurch bedingt ist, daß der Phänotyp zur Saccharosegärung dazu beiträgt, die Stabilität einer diesen Vektor enthaltenden Kultur von Mikro organismen sicherzustellen, wenn man ein Kulturmedium be nutzt, das Saccharose als Kohlenstoffquelle enthält. In einem solchen Medium können nur Zellen mit diesem Plasmid wachsen, da sie allein in der Lage sind, Saccharose zu vergären. Wenn Zellen ihr Plasmid mit kommerziell verwertbaren Genen verlieren, verlieren sie gleichzeitig die Fähigkeit zur Saccharosevergärung, und sie sind nicht mehr in der Lage zu wachsen. Dies erübrigt den Zusatz großer Antibiotikamengen zum Kulturmedium, um auf die Anwesenheit des Plasmids zu selektionieren, ein Verfahren, das wirtschaftlich sehr kostenaufwendig ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Hybridvektoren zur Clonierung und Expression bereitzustellen, die von Plasmiden oder Viren (Bakeriophagen) abgeleitet sind und eine DNA- Sequenz enthalten, die damit transformierten Organismen die Fähigkeit zur Saccharosevergärung verleihen kann. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, transformierte Wirtsor ganismen zu schaffen, die die Fähigkeit zur Saccharosever gärung aufweisen.

Diese Aufgaben werden durch die Bereitstellung der in den An sprüchen gekennzeichneten Gegenstände gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Hybridvektor, der von Plasmiden oder Viren (Bakteriophagen) abgeleitet ist, zur Clonierung und Expression, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA-Sequenz enthält, die das Saacharose-Operon des Plasmids scr 53 (53 Mdal) aus E. coli AB 1281 (scr 53) mit der Hinterlegungsnummer NCIB 11993 enthält und eine Größe von 4,85 kb aufweist.

Außerdem sind Gegenstand der Erfindung ein transformierter Wirtsorganismus bakteriellen Ursprungs, der dadurch gekenn zeichnet ist, daß er mit einem Hybridvektor transformiert ist, der eine Fähigkeit zur Saccharosevergärung ver leihende DNA-Sequenz enthält, sowie das Verfahren zu seiner Herstellung.

Durch Einführung eines Hybridvektors der Erfindung mittels Transformation in einen Mikroorganismus, beispielsweise einen Stamm von E. coli K 12, mit genetischen Methoden wird ein DNA-Fragment übertragen, welches den Zellen die Fähig keit zur Saccharosevergärung verleiht. Die neu hergestellten Mikroorganismen sind in der Lage, in einem Kulturmedium zu wachsen, welches Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle enthält. Wenn der Plasmidvektor den Zellen verlorengeht, können die Mikroorganismen die Saccharose nicht mehr verwerten und sind nicht mehr in der Lage, in einem solchen Medium zu wachsen. Daher können Stämme, welche diesen Plas midvektor tragen, gut in Rohmaterialien wie Melasse wachsen, welche Saccharose als Hauptkohlenstoffquelle enthalten.

Dieser neue Hybridvektor kann dazu benutzt werden, andere Gene von industriellem Interesse einzubauen. In diesem Fall ist die Fähigkeit zur Saccharosevergärung, welche durch den Plasmidvektor verliehen wird, nicht nur insofern nützlich, als sie dem Mikroorganismus das Wachstum in saccharosehaltigem Medium erlaubt, sondern auch dadurch, daß sie die Stabilität des Plasmids auch ohne Zusatz von Antibiotika zur Kultur er höht, wenn in diesen Medien die Gärung erfolgt. Darüber hinaus kann man, falls die Anwesenheit anderer Mikroorganismen vermieden werden soll, dem Medium ein Antibiotikum zufügen, für welches der Hybridvektor Resistenz verleiht. Durch diese zusätzliche Möglichkeit kann die Plasmidstabilität erhöht werden. Folglich sind der Miktroorganismus und das Verfahren zu seiner Herstellung von großem Nutzen in kommer ziellen Gärungsprozessen.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand einer bevorzugten Aus führungsform näher erläutert, bei der der verwendete Mikro organismus der bekannten Stamm Escherichia coli K 12 DH 1 (beschrieben in: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982)) ist, der wegen seiner guten Transformationseigen schaften einer der bevorzugten E. coli K 12-Stämme für Clo nierungsexperimente ist. Jedoch können auch andere E. coli - Stämme sowie andere, insbesondere gramnegative Bakterien mit guten Ergebnissen verwendet werden.

Zur Gewinnung der Saccharosevergärungsgene (Saccharose- Operon) wird die DNA des Stammes E. coli AB 1281 (scr 53) [NICB 11993] benutzt. Dieser Stamm trägt das konjugative Plasmid scr 53 (53 Mdal), von dem man feststellte, daß es in der Lage ist, einem klinisch isolierten Salmonella-Stamm die ungewöhnliche Eigenschaft der Saccharosevergärung zu verleihen (J. Bacteriol. 122, 401 (1975)). Das Plasmid scr 53, welches das Saccharose-Operon enthält, kann dazu benutzt werden, die Eigenschaft der Saccharosevergärung durch Konjugation oder Transduktion auf andere Salmonella - oder Escherichia coli - Stämme zu übertagen (J. Bacteriol. 122, 401 (1975)); es kann jedoch nicht als Plasmidvektor für genetische Clonie rungsexperimente eingesetzt werden. Mit vorliegender Erfin dung ist es erstmals gelungen, das im Plasmid scr 53 ent haltene Saccharose-Operon zu isolieren und in geeignete Hybrid vektoren unzuclonieren, so daß neue genetische Manipula tionen mit diesem Operon ermöglicht werden.

Nach Isolierung der scr 53-Plasmid-DNA durch ein gebräuch liches Verfahren wird die DNA mit einer Restriktionsendo nuklease behandelt. Als Vektor-DNA kann jedes Plasmid oder jeder Phage benutzt werden, welche sich in Mikroorganismen, beispielsweise in Escherichia Zellen vermehren können. Nach Spaltung der Vektor-DNA mit einer Restriktionsendo nuklease braucht man keine spezielle Methode, um das scr 53-DNA-Fragment in den Vektor einzufügen,; es kann jede gebräuchliche Technik zur Herstellung rekombinanter DNA verwendet werden. Das Hybridplasmid, welches man auf diese Weise erhält, kann in einen geeigneten Mikroorganismus, bei spielsweise der Gattung Escherichia mittels gebräuchlicher Transformationstechniken eingeführt werden, obwohl die Aus beute bei diesen Techniken schwanken kann.

Transformanten können selektiert werden, da diese Kolonien auf einem Nährboden mit Saccharose als einziger Kohlenstoffquelle wachsen können, und da auf dem Vektor vorzugsweise zusätzlich mindestens eine Antibiotikaresistenz codiert ist, die als weiteres Markierungsgen dient.

Wenn das Plasmid einer auf diese Weise erhaltenen Transfor mante genetische Information zur Saccharosevergärung trägt, können die Transformanten einwandfrei in saccharosehaltigem Medium wie Melasse wachsen, wodurch das Saccharose-Operon zum Erhalt der Plasmidpräsenz beiträgt.

Das auf diese Weise geklonte Saccharose-Operon kann auch in andere Plasmidvektoren mit bereitem Wirtsbereich umcloniert werden, wie zum Beispiel in das Plasmid RSF 1010, welches durch Transformation die Fähigkeit zur Saccharosevergärung in andere gramnegative Bakterien übertragen kann.

Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung stellt das Vektorplasmid pSP 1 dar, das dadurch gekennzeichnet ist, daß

a) es ein Hybridplasmid ist, das die gesamte Nukleotid sequenz des Plasmids pBR 325 und eine Fremd-DNA-Insertion an der PstI-Schnittstelle von pBR 325 enthält, wobei die Fremd- DNA-Insertion eine Saccharose-Operon von Plasmid scr 53 enthaltende DNA-Sequenz ist;
b) es ein Molekulargewicht von etwa 10,8 kb und die folgenden Schnittstellen für Restriktionsendonucleasen auf weist:
- RestriktionsenzymZahl der Schnittstellen Bgl II0 Xba I0 Xho I0 Sma I1 Hind III1 Cla I2 BamH I2 EcoR I2 Sal I2 Pst I2 Sph I2 Hinc II5 Pvu II5

Beispiel A. Gewinnug der scr 53-Plasmid-DNA mit der genetischen Information für die Fähigkeit zur Saccharosevergärung

Der Stamm Escherichia coli AB 1281 (scr 53) [NICB 11993] mit dem konjugati ven Plasmid scr 53 ist eine Exkonjugante des E. coli-Stamms AB 1281 (CGSC 1281) (J. Bacteriol. 122, 401 (1975)). Dieser Stamm wird bei 37°C 16 Stunden lang unter Schütteln in 500 m L-Medium gezüchtet, das 1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl und 0,1% Saccharose enthält und auf pH 7,2 einge stellt ist. Die Bakterienzellen werden konzentriert und die Plasmid-DNA nach der Methode von Hansen und Olsen (J. Bacteriol. 135, 227 (1978) extrahiert. Das Plasmid scr 53 wird weiter durch Zentrifugation in einem isopykni schen CsCl-Gradienten mit Ethidiumbromid gereinigt. Es werden 10 µm gereinigte DNA erhalten.

B. Gewinnung der Vektor-DNA

DNA des Plasmids pBR 325, einem Vektor mit Genen für Ampicillin-, Tetracyclin- und Chloramphenicolresistenz als Marker (Gene 4, 121 (1978)), wird auf folgende Weise gewonnen: Zellen des Stammes Escherichia coli K 12 DH 1, welcher das Plasmid pBR 325 trägt, werden in 500 ml L-Medium (1% Pepton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, eingestellt auf pH 7,2), die 100 µg/ml Ampicillin enthält, bei 37°C bebrütet. Die Plasmide werden durch Zugabe von 300 µg/ml Spectinomycin zu den Zellen in der exponentiellen Phase amplifiziert. Nach 16 Stunden Bebrütung werden die Zell geerntet und durch Behandlung mit Lysozym und SDS lysiert (Biochim. Biophys. Acta 299, 516 (1973)). Nach Reinigung durch Zentri fugation im CsCl-Ethidiumbromid-Gleichgewichtsgradienten werden 500 µg Plasmid-DNA erhalten.

C. Einführung des scr 53-Plasmid-DNA-Fragments in die Vektor-DNA

1 µg der scr 53-Plasmid-DNA und 2 µg der Vektor-DNA werden jeweils mit der Restriktionsendonuklease Pst I bei 37°C für eine Stunde behandelt, um die DNA-Moleküle zu spalten; anschließend wird für 10 min auf 65°C erhitzt. Die Lösungen mit den gepalteten DNAs des Plasmids scr 53 und des Vektors werden gemischt und die DNA-Fragmente mit T 4-DNA-Ligase in Gegenwart von ATP, MgCl₂ und Dithiothreit bei 14°C 24 Stunden lang ligiert. Die rekombinante DNA wird durch Ethanol fällung gewonnen.

D. Genetische Transformation mit dem Hybridplasmid, welches die genetische Information für die Eigenschaft der Saccharosevergärung enthält

Komponente Zellen des Stammes Escherichia coli DH 1 werden mit der RbC1-Methode gewonnen, die von Hanahan beschrieben wurde (J. Mol. Biol. 166, 557 (1983)). Die im Schritt (C) erhaltene DNA mit den Hybridplasmiden wird der Suspension kompetenter Zellen zugefügt. Die Suspension wird für 20 min im Eis gehalten, dann 2 min auf 37°C erwärmt und schließ lich wieder für 60 s in Eis gestellt.

Mit den Zellen, die nun DNA enthalten, wird L-Medium beimpft und das Medium 1 Stunde bei 37°C geschüttelt, wobei die Transformationsreaktion abgeschlossen wird. Die Zellen werden konzentriert, mit Saline (8,5 g/l NaCl) gewaschen und auf Agarmedium ausplattiert (9 g K₂HPO₄, 4,5 g KH₂PO₄, 2 g (NH₄)₂SO₄, 0,1 g MgSO₄×7 H₂O, 0,01 g FeSO₄×7 H₂O, 1 mg Thiamin-HCl, 5 g Saccharose, 15 g Agar pro Liter und 12,5 µg/ml Tetracyclin).

Die Platten werden bei 37°C bebrütet. Nach 2 Tagen können 8000 Kolonien auf den Platten gezählt werden. 100 Kolonien werden abgenommen, gereinigt und isoliert. Jede auf diese Weise erhaltene Transformate wird auf einem Medium aus 10 g Pepton, 5 g NaCl, 10 g Saccharose, 0,02 g Bromcresol purpur und 15 g Agar pro Liter auf ihre Fähigkeit, Saccharose zu vergären (scr⁺-Phänotyp), geprüft. In diesem Medium erscheinen saccharoseverwertende Transformanten als gelbe Kolonien. Die Transformanten werden auch die Tetracyclin und Chloramphenicolresistenz sowie auf Ampicllinsensitivität geprüft.

Die Plasmide der Zellen, welche den richtigen Phänotyp (scr⁺, Cm^R, Tc^R, Ap^S) zeigen, werden mit einer Minipräpara tionsmethode analysiert (Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory (1982)). Die Hybridplasmide werden mit Pst I gespalten und ein Klon mit einem Plasmid ausgewählt, welches ein Pst I-Insert von 4,85 kb aufweist. Das pBR 325-Hy bridplasmid mit besagtem Insert und als pSP 1 bezeichnet und hat eine Größe von 10,8 kb.

E. Präparation des Plasmids pSP 1

Aus saccharosevergärenden Zellen des Stammes Escherichia coli DH 1 (pSP 1) AM 512), welche das Plasmid pSP 1 besitzen, wird die pSP 1-Plasmid-DNA durch das in Schritt (B) beschriebene Verfahren extrahiert.

F. Spaltstellen für verschiedene Restriktionsendonucleasen im Plasmid pSP 1

In diesem Schritt werden 0,5 µg der pSP 1-Plasmid-DNA aus dem vorangehenden Abschnitt mit folgenden Restriktionsendo nukleasen gespalten:

EcoR IEscherichia coli Hind IIIHaemophillus influenzae Pst IProvidencia stuartii Sal IStreptomyces albus BamH IBacillus amyloliquefaciens Xbar IXanthomonas badrii Pvu IIProteus vulgaris Cla ICaryophanum latum Xhol IXanthomonas holicola Hinc IIHaemophilus influenzae Sph IStreptomyces phaechromogenes Sma IXanthomonas malvacearum Bgl IIBacillus globigii

Die Restriktionsendonukleasen werden unter den für jedes Enzym geeignete Bedingungen eingesetzt. Die daraus hervorgehenden DNA-Fragmente werden durch horizontale Elektrophorese in 0,5% Agarose-Gelen analysiert. Das Mole kulargewicht eines jeden Fragments wird aus seiner elektro phoretischen Wanderungsgeschwindigkeit errechnet. Die Be rechnung erfolgt mittels einer Standardkurve, bei der die elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeiten gegen die bekannten Molekluargewichte von DNA-Fragmenten aufgetragen werden, welche durch Hind III-Spaltung von DNAs der Phagen λ und Φ erhalten werden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle I dargestellt.
RestriktionsendonukleaseAnzahl der Spaltstellen
auf dem Plasmid pSP 1

Bgl II0 Xba I0 Xho I0 Sma I1 Hind III1 Cla I2 BamH I2 EcoR I2 Sal I2 Pst I2 Sph I2 Hinc II5 Pvu II5

Die Restriktionskarte des Plasmids pSP 1 wird durch Einzel und Doppelpaltungen der Plasmid-DNA mit Restriktionsendo nukleasen und Analyse der DNA-Fragmente durch Agarose-Gel elektrophorese erstellt. Die bekannte Restriktionskarte des Plasmids pBR 325 (Gene 14, 289 (1981)) wird ebenfalls für die Erstellung der pSP 1-Restriktionskarte herangezogen. Diese ist in der Zeichnung dargestellt.

G. Analyse des saccharosespaltenden Enzyms

Die Saccharoseaktivität wird durch folgende Methode bestimmt, die auf dem Auftreten von reduzierenden Zuckern nach Saccharosespaltung beruht: Zellen des Stammes E. coli DH 1 mit dem Plasmid pBR 325 oder dem neuen Hybridvektorplasmid pSP 1 werden in L-Medium und in L-Medium mit 10 mmol/l Saccharose kulti viert. Die Zellen werden geerntet und die bakteriellen Pellets mit 50 mmol/l Kaliumphosphat-Puffer pH 6,5 gewaschen, der 200 mml/l KCl und 1 mml/l 2-Mercaptoethanol enthielt. Nach dem Waschen werden die Zellen im gleichen Puffer resuspendiert und mit Ultraschall behandelt. Nach dieser Behandlung wird die Suspension bei 40 000 × g 20 min lang bei 4°C zentrigu giert. Der Überstand wird extrahiert und ohne weitere Be handlung verwendet. Eine Mischung von 0,5 ml dieser Enzympräparation und 0,5 ml von 1 mol/l Saccharose wird 30 min bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 1 ml Dinitrosalicyl- Reagens (Methods in Enzymol. 1, 149 (1955)) wird die Reak tion gestoppt. Die Proben werden für 5 min in ein kochendes Wasserbad gesetellt, in Eis gekühlt und mit 20 ml destl. Wasser verdünnt. Die optische Dichte der Proben wird bei 540 nm gemessen. Standardlösungen von Glucose werden zur Eichung verwendet. Die Proteinkonzentration wird mit einer gebräuchlichen Methode bestimmt.

Wie in Tabelle II gezeigt, wurde in den pSp 1 enthaltenden Zellen von E. coli DH 1 die Saccharaseaktivität konstitutiv experimiert.

Tabelle II

Literatur

- Maniatis T. et al., Molecluar cloning, a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor New York. (1982).
- Wohlhieter, J. A. et al., J. Bacteriol. 122, 401-406 (1975).
- Bolivar F., Gene 4, 121-136 (1978).
- Godson, G. N. and Vapnek, D., Biochim. Biophys. Acta 299, 516-520 (1973).
- Hanahan D., J. Mol. Biol. 166, 557-567 (1983).
- Bernfeld P., Methods in Enzymol. 1 149-159 (1955).
- Hansen, J. B. and Olsen, R. H., J. Bacteriol. 135, 227-238 (1978).
- Prentki, P. et al., Gene 14, 289-299 1981).

Claims

1. Hybridvektor, der von Plasmiden oder Viren (Bakterio phagen) abgeleitet ist, zur Clonierung oder Expression, dadurch gekennzeichnet, daß er eine DNA-Sequenz enthält, die das Saccharose-Operon des Plasmids scr 53 (53 Mdal) aus E. coli AB 1281 (scr 53) mit der Hinterlegungsnummer NICB 11993 enthält und eine Größe von 4,85 kb auf weist.

2. Hybridvektor pSP 1, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

a) er ein Hybridplasmid ist, das die gesamte Nucleotid sequenz des Plasmids pBR 325 und eine Fremd-DNA-Inser tion in der PstI-Schnittstelle von pBR 325 enthält, wobei die Fremd-DNA-Insertion eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 ist,
b) er eine Größe von etwa 10,8 kb hat und die folgenden Schnittstellen für Restriktionsendonucleasen aufweist: RestriktionsenzymZahl der SchnittstellenBgl II0 Xba I0 Xho I0 Sma I1 Hind III1 Cla I2 BamH I2 Ecor I2 Sal I2 Pst I2 Sph I2 Hinc II5 Pvu II5

3. Hybridvektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß er von einem Plasmidvektor mit breitem Wirtsbereich abgeleitet ist.

4. Hybridvektor nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid mit breitem Wirtsbereich das Plasmid RSF 1010 ist.

5. Hybridvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem mindestens eine DNA- Sequenz enthält, die für eine Resistenz gegen ein Anti biotikum codiert.

6. Hybridvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 5 dadurch gekennzeichnet, daß er außerdem eine DNA-Sequenz ent hält, die ein wertvolles Genprodukt codiert.

7. Verfahren, einem Bakterium die Fähigkeit zu verleihen, in einem Saccharose als einzige Kohlenstoffquelle ent haltenden Medium zu wachsen und gegebenenfalls ein wert volles Genprodukt herzustellen, dadurch gekennzeichnet, daß man das Baktertium mit einem Hybridvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 transformiert.

8. Bakertium, das mit einem Hybridvektor nach einem der Ansprüche 1 bis 6 transformiert ist.

9. Bakterium nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es gram-negativ ist.

10. Bakterium nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Art der Gattung Escherichia ist.

11. Escherichia coli DH 1 (SP 1) mt der Hinterlegungs-Nummer NCIB 11940.