FI85721B - Foerfarande foer extracellulaer produktion av penicillinas, plasmid anvaend vid foerfarandet och foerfarande foer konstruktion av plasmiden. - Google Patents

Description

[)5721

Menetelmä solun ulkopuolisen penisillinaasin tuottamiseksi, menetelmässä käytetty plasmidi Ja menetelmä plasmidin rakentamiseksi 5 Keksintö koskee menetelmää solun ulkopuolisen peni sillinaasin tuottamiseksi, menetelmässä käytettyä plasmi-dia ja menetelmää plasmidin rakentamiseksi. Erityisesti keksintö koskee rekomblnanttiplasmldia, joka pystyy indusoimaan penisillinaasin solun ulkopuolisen erityksen 10 Escherichia colissa, joka on transformoitu mainitulla plasmidilla, sekä menetelmää solun ulkopuolisen penisillinaasin tuottamiseksi viljelemällä rekombinanttiplasmi-dilla transformoitua E. colia.

Plasmidi on mikro-organismin solussa esiintyvä, ei-15 kromosomaalinen geeni, joka on rengasmaista DNA:ta. Plas-midia käytetään yleisesti mikro-organismigeenin rekombi-naatioon, ja se on tulossa yhä tärkeämmäksi käymisteollisuuden alueella.

Viime aikoina on tehty tutkimuksia plasmideilla, 20 jotka kantavat vierasta DNA:ta, jolla on metabolisia tuotteita koskevaa geneettistä informaatiota tai jota spesifisesti tarvitaan mikro-organismin kasvuun, kuten on osoitettu aminohappojen ja peptidien valmistuksen yhteydessä. Jotkut plasmidit on siirretty isäntämikro-organismeihin 25 transformanttien saamiseksi. On suunniteltu menetelmiä suhteellisen pienimolekyylisten yhdisteiden, kuten esimerkiksi aminohappojen Ja peptidien valmistamiseksi transfor-mantteja viljelemällä. Kuitenkin plasmidien, jotka kantavat suurimolekyylisten aineiden valmistamiseen tarvittavia 30 geenejä, lisääntymisaste riippuu isäntä-mikro-organismien luonteesta, eikä näitä plasmideja ole tehokkaasti ekspres-soitu. Sitä paitsi sellaisten transformanttien viljelemi-. . seksi ei ole saatu aikaan mitään tehokkaita menetelmiä.

Ei ole ollut mahdollista selektiivisesti saada 35 tiettyä solunulkoista, suurimolekyylistä tuotetta viljele- G 3 721 2 mällä mikro-organismia, joka on transformoitu plasmidilla, jossa on vieras DNA-fragmentti, joka sisältää suurimole-kyylisten aineiden, jotka ovat toisten mikro-organismien metabolisia tuotteita, solunulkoista tuottamista koskevaa 5 geneettistä informaatiota. Sellaista solunulkoista tuotta mista ei ole menestyksellisesti toteutettu, vaikka on käytetty tavallisesti isäntä-mikro-organismina käytettyjen Escherichia-lajien transformanttia.

W. Gilbert et alsn US-patentti 4 411 994 julkaisee 10 spesifisten proteiinien valmistusmenetelmän bakteereissa sekä niiden erittymisen bakteerisolusta. Tässä menetelmässä toivottua ei-bakteeriperäistä proteiinia tai proteiinin osaa edustava DNA kiinnitetään yhdistelmätekniikan avulla plasmidiin tai faagigeeniin joko periplasmaan sisältyvän 15 tai solun ulkopuolisen proteiinin, tässä yhteydessä myöhemmin "kantaja-proteiiniksi" mainitun proteiinin saamiseksi transformoimalla bakteeri-isäntä yhdistelmägeenillä sekä viljelemällä transformoitua isäntää proteiinin erit-tämiseksi. Tämän patentin mukainen menetelmä tarjoaa kei-20 not valikoidun proteiinin tuottamiseksi käyttämällä geeniä kantajaproteiinin valmistamiseksi, jolla on amino-päässään hydrofobisten aminohappojen muodostama johtosekvenssi.

Escherichia colin solunseinämä, jota usein on käytetty käyttökelpoisten, fysiologisesti aktiivisten ainei-25 den valmistukseen, käsittää kolme membraanityyppiä: sisä-membraanin, peptidoglykaanin sekä ulkomembraanin. Sisä- ja ulkomembraanin välinen tila on nimeltään periplasminen tila. US-patentin 4 411 994 mukaisessa menetelmässä on onnistuttu erittämään tuotteita periplasmiseen tilaan mut-30 ta ei elatusaineeseen ulkomembraanin kautta eli bakteeri-solun ulkopuolelle. Kyseessä olevan keksinnön mukaisesti, liittämällä plasmidiin DNA, joka sisältää suurimolekyylis-ten aineiden solunulkoista valmistusta koskevaa geneettistä tietoa, siten että saadaan hybridiplasmidi, sekä vilje-35 lemällä hybridiplasmidilla transformoitua isäntää on mah- s 5 721 3 dollista erittää käyttökelpoisia fysiologisesti aktiivisia aineita ulkomembraanin läpi sekä saada ne suoraan takaisin elatusaineesta. Täten kyseessä oleva keksintö tekee mahdolliseksi käyttökelpoisten, fysiologisesti aktiivisten 5 aineiden massatuotannon, joka ei ole koskaan ollut mahdollista aiempien menetelmien avulla.

Sentähden kyseessä olevan keksinnön eräänä kohteena on rekombinanttiplasmidi, jolle on tunnusomaista, että se käsittää 10 a) Bacillus sp. n:o 170 (FERM BP-467) -kannan kro- mosomaalisen DNA:n restriktiofragmentin, joka on valmistettu ensimmäisellä restriktioentsyymillä, edullisesti Hind III-fragmentin, jonka pituus on noin 4 kb ja joka restriktiofragmentti koodaa penisillinaasin solun ulko- 15 puolisen erityksen; ja b) vektoriplasmidi-DNA-fragmentin, edullisesti pMB9:n DNA-fragmentin, joka on valmistettu toisella restriktioentsyymillä, joka ei sekaannu kohdan a) restriktiofragmentin sisältämään geneettiseen informaatioon.

20 Näitä plasmideja voidaan valmistaa menetelmällä, jolle on tunnusomaista, että se käsittää seuraavat vaiheet: a) valmistetaan ensimmäisellä restriktioentsyymillä Bacillus sp. n:o 170 (FERM BP-467) -kannan kromosomaalinen 25 DNA-fragmentti, joka koodaa penisillinaasin solun ulkopuo lisen erityksen; b) pilkotaan vektoriplasmidi-DNA toisella restriktioentsyymillä, joka ei sekaannu kromosomaalisen DNA-frag-mentin sisältämään geneettiseen informaatioon; 30 c) käsitellään mainittu kromosomaalinen DNA-frag- mentti ja mainittu pilkottu vektoriplasmidi-DNA DNA-ligaa-silla rekombinanttiplasmidi-DNA:n muodostamiseksi; ja . . d) eristetään rekombinanttiplasmidi-DNA transfor- • 4 « " moidusta isäntäsolusta, joka ilmentää penisillinaasia 35 tuottavan fenotyypin.

4 e f 721

Kyseessä oleva keksintö tarjoaa myös menetelmän solun ulkopuolisen penisilllnaasln tuottamiseksi, jossa viljellään rekomblnanttlplasmldllla transformoitua E. colla. Menetelmälle on tunnusomaista, että 5 a) siirrostetaan alusta, joka sisältää epäorgaani sen suolan, joka on natriumsuola tai kaliumsuola, transformant il la; ja b) jatketaan transformantin viljelyä sen jälkeen, kun solukonsentraatio on saavuttanut huippunsa ja kunnes 10 penisillinaasin tuotto ja akkumulaatio alustassa on saavuttanut huippunsa.

Piirustukset

Kuvio la kuvaa bakteerin kasvua sekä penisillinaasin tuottoa Eschrichia colilla HB101(pEAP2).

15 Kuvio Ib esittää solunulkoisen, solunsisäisen sekä periplasmlsen penisillinaasin tuoton prosentuaalisia määriä Escherichia colilla HB107(pEAP2).

Kuvio 2 kuvaa bakteerin kasvua sekä penisillinaasin tuottoa Bacillus sp. no 170:llä.

20 Kuvio 3a kuvaa bakteerin kasvua sekä penisillinaa sin tuottoa Escherichia colilla HB101(pBR322).

Kuvio 3b esittää solunulkoisen, solunsisäisen sekä periplasmisen penisillinaasin tuoton prosentuaalisia määriä Eschrichia coli HBlOlrlla (pBR322).

25 Kuvio 4 esittää plasmidi pEAP2:lle karttaa, jonka mukaisesti restriktioentsyymi pilkkoo plasmidin.

Kyseessä olevaa keksintöä selitetään seuraavassa yksityiskohtaisesti.

(a) Plasmidin sekä keksinnön mukaisten uusien plas-30 mldien konstruktio on sellainen, että ne on muodostettu liittämällä vierasta DNA:ta plasmldiin (ekstrakromosomaa-lista DNA:ta tai vektori-DNA:ta), kuten esimerkiksi col Ex, . : joka esiintyy Escherichia-soluissa.

Vektori-DNA:hän, jota kyseessä olevassa keksinnössä 35 voidaan käyttää, sisältyy luonnonlähteistä eristetty vek- Π721 5 tori tai vektori, josta lisääntymiselle tarpeeton DNA-fragmentti on poistettu, kuten esimerkiksi ColE^ pMB9, pBR322, pSCIOI, R6K sekä lambda-faagi.

Mikro-organismi, joka sisältää solunulkoisen peni-5 sillinaasin tuoton geneettistä informaatiota ja jota käytetään kyseessä olevassa keksinnössä, on Bacillus sp. no 170 (Horikoshi K. et ai., (1976) Agrig. Biol. Chem., 40, s. 1363 - 1367).

Kyseessä olevan menetelmän mukaisesti voidaan vie-10 raan DNA:n liittämiseksi vektori-DNA:han käyttää mitä tahansa tavanomaisia menetelmiä. Esimerkiksi kromosomaalinen DNA pilkotaan sopivan restriktioentsyymin tai endonukleaa-sin avulla, jotta saadaan vieras DNA-fragmentti eli ekso-genootti, joka sitten sekoitetaan vektori-DNA:n kanssa, 15 jota on käsitelty samanlaisella restriktioentsyymillä, ja seos sidotaan sopivan ligaasin avulla. Täten, kuten edellä on kuvattu, kyseessä olevan keksinnön mukaisia uusia plas-mideja voidaan saada valmistamalla restriktio-entsyymin avulla DNA-fragmentti, joka koodaa penisillinaasin, solun-20 ulkoista tuottoa, uuttamalla plasmidivektori-DNA:a restriktioentsyymillä, joka ei sekaannu DNA-fragmentin sisältämään geneettiseen informaatioon, käsittelemällä DNA-fragmenttia sekä uutettua vektoriplasmidia DNA-ligaasilla yhdlstelmäplasmidin konstruoimiseksi sekä eristämällä yh-25 distelmäplasmidi tavanomaisella tavalla [katso Bolivar et V ai Gene, 2, 95 (1977)].

Uusi plasmidi pEAP2 voidaan konstruoida Bacillus sp. no 170:n kromosomaalisesta DNA-fragment!sta sekä plas-: .· midi pMB9:stä. Kuviossa 4 on esitetty restriktioentsyymi- 30 kartta plasmidi pEAP2:lle. Kuten kuviosta 4 nähdään, plasmidi pEAP2 konstruoidaan plasmidista pMB9, johon Bacillus sp. no 170:n kromosomaalinen DNA; joka koodaa solunulkoi-: sen penisillinaasin tuottoa, insertoidaan plasmidi-pMB9:n

Hind 111-restriktiokohdan väliin. Täten plasmidi pEAP2 on 35 syklinen DNA-molekyyli, jossa on noin 7700 nukleotidiemäs- 6 CS 7 21 paria (7,7 kb) ja joka käsittää pMB9-DNA:n sekä kromoso-maalisen DNA:n, jossa on noin 2000 nukleotidiemäsparia (2 kb).

(b) Mikro-organismien valmistus 5 Yhdistelmäplasmidit, jotka on konstruoitu kromo- somaalisista DNA-fragmenteista sekä vektori-DNA-plasmi-deista, viedään tavanomaista transformaatiotekniikkaa käyttäen Escherichia-voli- isäntämikro-organismiin. Viljelyä jatketaan, kunnes saadaan aikaan stabiloitu geno-10 tyyppi, jotta saadaan transformantti, joka kantaa molempia genotyyppejä valitulla kromosomaalisella DNA:11a sekä vek-tori-DNA:lla. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää tavanomaista, ns. "shot gun"-menetelmää.

Tyypillinen isäntämikro-organismi, jota voidaan 15 käyttää kyseessä olevassa keksinnössä on Escherichia coli HB101, joka on Escherichia coli K-12:n sekä Escherichia coli B:n hybridi-kanta.

Transformantilla Escherichia coli HB101 (pEAP2), joka valmistetaan viemällä plasmidi pEAP2 Escherichia coli 20 HB101:een, on samanlaiset mikrobiologiset ominaisuudet kuin isännällä Eschrichia coli HB101:llä penisilliinire-sistenssiä lukuunottamatta [Molecular Cloning, A. Laboratory Manual, s. 504 (1982), genotyyppi: F~, hsd S 20 (rB mB), rec A13, ara-14, proA2, lacYl, galK2, rpsL20 (Sm'), 25 ksyl-5, mtl-1, supE44 ^"]. E.coli HB101 (pEAP2):lle on edelleen tunnusomaista plasmidi pEAP2:n ominaisuus, eli solunulkoisen penisillinaasin tuottamiskyky.

Penieillinaasin solunulkoinen tuotto Escherichia coli HB101 (pEAP2):lla, kuten on esitetty myöhemmin kuva-30 tuissa esimerkeissä, yltää yli 80 %:iin kokonaistuotosta solunsisäinen tuotto mukaanluettuna, ja pysyy paikallaan pitkän viljelyn jälkeen. Tälle vastakohtana, enemmän kuin 80 % penisillinaasin kokonaistuotosta tunnetulla kannalla Escherichia coli HB101 (pBR322):lla on solunsisäistä ja 35 solunulkoista penisillinaasin tuottoa tunnetulla kannalla 7 t 3 721

Bacillus sp. no 170tila ei voida pitää yllä pitkää aikaa.

Kyseessä oleva keksintö, joka antaa käyttöön Escherichia coli HB101 (pEAP2):n, jolla on kyky tuottaa solun-ulkopuolisesti entsyymiproteiineja, kuten esimerkiksi pe-5 nisillinaasia, ei ole ainoastaan uusi vaan myös neuvokas keksintö. Escherichia coli HB101 (pEAP2) voi tuottaa ja erittää soluista elatusaineeseen suurien penisillinaasi-määrien lisäksi suuria määriä muita entsyymiproteiineja, jotka voidaan myös koota. Nimenomaan on havaittu, että 10 Escherichia coli HB101 (pEAP2) tuottaa ja erittää soluista elatusaineeseen suuria määriä alkalista fosfataasia, β-galaktosidaasia sekä noin kymmentä proteiinityyppiä, jotka ainoastaan on havaittu soluissa eikä koskaan solujen ulkopuolella.

15 Sellainen Escherichia colin HB101 (pEAP2):n suo rittama solunulkoinen tuotto näyttää toteen, että plas-midi pEAP2:n kantama DNA, jossa on noin 2000 nukleotidi-emäsparia, antaa käyttöön isännän, jolla on kyky tuottaa metabolisia tuotteita solun ulkopuolelle.

20 (c) Mikro-oraanismien vilielv

Vaiheessa (b) valmistettujen transformanttien viljelyyn voidaan käyttää mitä tahansa elatusainetta, joka soveltuu spesifisten aineiden, joita spesifinen geneettinen informaatio koodaa, tuottamiseen ja joka soveltuu 25 Escherichia-suvun mikro-organismien viljelyyn. Kyseessä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä on tarpeellista viljellä mikro-organismia elatusaineessa, joka sisältää epäorgaanista suolaa, joka on tarpeellinen mikro-organismin kasvulle, tai valittua hiilenlähdettä yhdessä epäor-30 gaanisen suolan kanssa ja jatkaa mikro-organismin viljelyä sen jälkeen, kun mikro-organismin solujen konsentraatio on saavuttanut maksimin ja kunnes penisillinaasin tuotto ja kerääntyminen elatusaineessa saavuttaa maksimin.

.·:*. Epäorgaanisiin suoloihin, joita voidaan käyttää • 35 kyseessä olevassa keksinnössä, kuuluu natrium- sekä ka- 0 3 721 8 liumsuoloja, kuten esimerkiksi natriumkloridi, natriumsul-faatti, kaliumkloridi yms., joiden joukossa natriumkloridi on edullinen. Elatusaine, joka sisältää epäorgaanisen suolan tai valitun hiilenlähteen yhdessä epäorgaanisen suolan 5 kanssa, voi sisältää sellaisen hiilenlähteen, kuten glukoosin, sakkaroosin, laktoosin, maltoosin, glyserolin, leseitä, ksylaania yms., sekä typen lähteenä ammoniakki-vettä, ammoniumsuoloja yms., epäorgaanisia ioneja ja valinnaisesti sellaista ravintoainetta kuten aminohappoja, 10 vitamiineja yms. Elatusaineet, joita voidaan käyttää kyseessä olevassa keksinnössä, ovat sellaisia, joissa on peruselatusaineena LB-lihaliemi (joka sisältää tryptonia, hiivauutetta sekä NaCl:a), BPB-lihalierai (Difco Laboratories; sisältää polypeptonia, hiivauutetta sekä K2HP0A), 15 ravinnelihaliemi (Difco 0001), tryptoni-NaCl-lihaliemi tai joku muu sellainen peruselatusaine.

Koska enemmän kuin 80 % kokonaistuotteista jää so-lunsisäiseen jakeeseen elatusaineessa, joka ei sisällä epäorgaanista suolaa, on tarpeellista käyttää elatusainet-20 ta, joka sisältää epäorgaanisen suolan, jotta suurin osa tuotteista erittyy solujen elatusaineeseen. Käytetyn epäorgaanisen suolan määrä on alueella 0,5 - 3,0 paino-% ela-tusaineen perusteella laskettuna.

Escherichia coli HB101 (pEAP2):n viljelyssä saa-25 daan erinomaisia tuloksia, kun käytetään LB-lihalientä, johon on lisätty glukoosia sekä edelleen glyserolia hii-lenlähteinä, mieluummin määrältään 0,1 ja 0,2 paino-% ela-tusaineen perusteella vastaavasti laskettuna.

Vaikka viljelyolosuhteita, kuten esimerkiksi pH:ta, 30 lämpötilaa, hapen johtamista yms. voidaan muuttaa Esche-richia-coli -mikro-organismin maksimikasvun saamiseksi, on kyseessä olevassa keksinnössä välttämätöntä jatkaa mikro-organismin viljelyä sen jälkeen, kun mikro-organismin solujen konsentraatio on saavuttanut maksimin, toisin sanoen 35 myöhemmän logaritmisen vaiheen jälkeen sekä kunnes peni- £5 721 9 sillinaasin sekä kerääntyminen elatusaineessa saavuttavat maksimin.

Elatusaineeseen suoritetun Escherichia-coli -mikro-organismin siirrostuksen jälkeen solujen konsentraatio 5 saavuttaa maksimin 5-20 tunnin kuluttua ja penisillinaasin tuotto ja kerääntyminen saavuttavat maksimin 12-48 tunnin kuluessa. Vaikka elatusaineen pH ei ole kriittinen, se on edullinen pH-alueella 5-8, erityisesti pH 7:ssä. Täten lisäämättä enempää mikro-organismin kasvulle tarpeel-10 lista epäorgaanista suolaa, hiilenlähteitä yms. viljelyn aikana mikro-organismi tuottaa suuria määriä solunulkoista penisillanaasia, jota voidaan koota mukavasti.

Esimerkkeihin mikro-organismeista, joita tässä keksinnössä voidaan käyttää, sisältyvät (i) Bacillus sp. no 15 170 ja (ii) Escherichia coli HB101 (pEAP2), jotka talle tettiin kokoelmaan Fermentation Research Institute,

Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japani, International Depository Authority:iin (tässä yhteydessä myöhemmin nimi-20 tetty "FERM":ksi) vastaavasti talletustulonumeroin, FERM BP-467 ja FERM BP-468 ja ne ovat FERM:in kokoelmassa, josta ne ovat rajoituksitta saatavissa. Edellä mainittujen mikro-organismien säilytysja vastaanottonumerot ovat seu-raavat: 25

Mikro-organismi_Säilytyspaikka Tulonumero (i) Bacillus sp. no 170 FERM FERM BP-467 (ii) Escherichia coli FERM FERM BP-468 HB101 (pEAP2)

30 Patentinhakija tulee ylläpitämään talletukset FERM

BP-467 ja FERM BP-468 rajoittamattomina aina patenttiajan loppuun saakka, jos tälle hakemukselle myönnetään patentti, ja täten mainitut mikro-organismikannat ovat kolmannen osapuolen saatavissa milloin tahansa, patenttiajan keston 35 loppuun saakka.

« * 1:721 ίο

Seuraavassa selvitetään esimerkkien avulla kyseessä olevan keksinnön mukaisten plasmidien rakentamismenetelmät, transformantin Escherichia coli HB101 (pEAP2) valmistusmenetelmät sekä penisillinaasin solunulkoinen tuotto 5 transformanttien avulla.

Esimerkki 1 (1) Penisillinaasin tuottamiskyvyn geneettisen informaation sisältävän kromosomaalisen DNA;n valmistus

Alkalofiilista Bacillus sp. no. 170 (FERM BP-467), 10 jolla on kyky tuottaa solunulkoista penisillinaasia, viljeltiin 30 °Csssa ravistellen 19 tunnin ajan lihaliemessä (joka sisälsi 2,0 g glyserolia, 5,0 g hiivauutetta, 5,0 g polypeptonia, 1,0 g K2HP0* 0,2 g MgS04.7H20, 10 g NaHC03 litrassa deionisoitua vettä; pH 9,0). Koottiin myöhemmässä 15 logaritmisessa vaiheessa olevat solut, joista kromosomaa- linen DNA uutettiin fenoliuuttomenetelmän avulla, sekä puhdistettiin, jotta saatiin 5 mg kromosomaalista DNA.

12) Kromosomaalisen DNA-fragmentin kytkeminen vektori -DNA: hän 20 Vaiheessa (1) saatua kromosomaalista DNA:ta (10 ug) uutettiin restriktioentsyymillä Hind III 37 °C:ssa 5, 10, 20, 30 sekä 60 minuutin ajan, jotta saatiin DNA-fragment-te ja.

Plasmidi pMB9 [Bethesda Research Laboratories, Yh-25 dysvallat, tetrasykliiniresistentti (Tetr)], jota käytet tiin vektorina, pilkottiin Hind 111:11a, kuumennettiin 65 °C:ssa 5 minuutin ajan ja sekoitettiin sitten DNA-frag-menttien kanssa. Seosta käsiteltiin T4-faagi-DNA-ligaasil-la 5 minuutin ajan.

30 Seokseen lisättiin kaksi kertaa tilavuus etanolia.

Seostettiin plasmidit, jotka kantoivat kromosomaalisen DNA:n fragmentteja, ja ne koottiin.

13) Mikro-oraanismien transformaatio plasmideilla.

*: loilla on penisillinaasin solunulkoista tuottoa koskeva 35 geeni

Escherichia coli HB101, joka on Escherichia coli L 5 721 11 K-12:n sekä Escherichia coli B:n hybridi-kanta, siirros-tettiin 10 ml:aar LB-lihaiientä [joka eisa'si 10 g trypto-nia (Difco Laboratories, Detroit, Mich.), 5 g hiivauutet-ta, 1 g glukoosia sekä 10 g NaCl yhdessä litrassa deioni-5 soitua vettä; pH oli säädetty 7,0:ksi] sekä viljeltiin 37 °C:ssa ravistellen, kunnes saavutettiin kasvun myöhempi logaritminen vaihe. Solut koottiin ja lietettiin 0,03 mo-laariseen (lopullinen konsentraatio), jääkylmään CaCl2-liuokseen, jotta saatiin kelvollisia soluja. Solususpensio 10 sekä vaiheessa (2) saatu plasmidi-liuos yhdistettiin, ja sitä pidettiin jäissä 60 minuutin ajan. Seosta kuumennettiin 42 °C:een 1-2 minuutin ajan plasmidi-DNAsn viemiseksi soluihin. Tämä solususpensio siirrostettiin tuoreeseen LB-lihaliemeen ja sitä viljeltiin 37 °C:ssa 3-5 tunnin 15 ajan samalla ravistellen. Solut koottiin ja pestiin, jotta saatiin Escherichia coli HB101 (pEAP2), jolla on penisil-linaasin tuottamiskyky.

Esimerkki 2

Plasmidi pEAP2:n valmistaminen 1a puhdistus 20 1. Bakteerisoluviljelraä, jossa käytetään Esche richia colia HB101 (pEAP2) (FERM BP-468)

Esiviljy LB:ssä Yli yön 37 °C:ssa

Viljely M-9:ssä Lisätään kloramfenikolia 130 25 I Klettin yksikön jälkeen 16 tuntia 37 °C:ssa

Sentrifugointi 5000 kierrosta minuutissa, ^ 20 min 4 °C:ssa.

Solusaostuma Säilytetty -80 °C:ssa.

30 2. Plasmidi-DNA:n puhdistus

Solusaostuma 10 ml, 20 % sakkaroosia, 50 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8. Lietetty, pidetään jäissä.

50 ml:n polypropyleenisentrifugiputki 35 2 ml, 0,25 M EDTA. 1 ml, lysotsyymiä (5 mg/ml v, 0,025 H Tris, pH 8) 0,1 ml, RNaasia (10 mg/ml) 12 oS/21

Solujen hajolttaminen. Varovainen sekoitus. Seisotetaan 15-30 min jäiden päällä.

5 ml, 3 x Triton. Varovainen sekoitus. Seisotetaan v 15 - 45 min jäiden päällä.

5 Sentrifugointi. 17000 kierrosta minuutissa, I 40 min 4 °Csssa.

Supematanttiliuos muovisy 1 interiin i 250 ml sn vetoinen lasipullo 10 2/3 tilavuutta DD H20 2/3 tilavuutta kylmää kyllästettyä fenolia. Sekoi-v tetaan varovasti.

Sentrifugointi ^ 6500 kierrosta minuutissa, 15 min 4 °C:ssa.

15 Ylempi jae

Yhtä suuri tilavuus fenolia; kloroformia.

Sentrifugointi 6500 kierrosta minuutissa. 15 min. 4 °C:ssa.

Ylempi jae 250 ml:n pullossa 20 1/25 tilav. 5 M NaClta 2 tilavuutta EtOH:a -20 °Csssa Yli yön -20 °C:sea Sentrifugointi 6500 kierrosta minuutissa, 60 min -20 °C:ssa V 25 DNA-saostuma. Nesteylimäärän kuivaus 5 ml A-50 puskuria, uudelleenlietetty 1 ml steriiliä 80 %:sta glyserolia, varovainen se- „ koitus \r A-50-pylväs (2x35 cm, 1 jae = 4 ml) 30 l DNA-jae (A260 huippu) |,2 tilav. ETOH -20 °C:eea. Yli yön -20 °C:ssa / Sentrifugointi j, 6500 kierrosta minuutissa, 60 min -20 °C:ssa *:*·: 35 US721 13 DNA-saostuma 2.1 ml TEN-puskuria 5 ml:n vetoisessa selluloosani traattiputkessa 2.2 g CsCl:a; sekoitus. (Pimeässä) 5 150 μΐ Pdl (2 mg/ml). Hyvä sekoitus. 2 ml mineraa- ' liöljyä putken yläpäähän

CsCl-gradienttisentrifugointi. 36000 kierrosta minuutissa, 40 h 20 °C:ssa. UV-valossa näkyvä. Ylempi vyöhyke; kromosomaalinen & leikattu DNA. Alempi vyöhyke; 10 V kovalentisti suljettu p-DNA

Alemman DNA-vyöhykkeen kokoaminen tipoittain

Dowex 50W-X8-pylväs. UV-tarkistus [ (Valossa) 15 Dialyysi 2-4 litraa vastaan 10 mM Tris, 1 mM EDTA-pusku-[ ria. pH 8. Yli yön 4 °C:ssa 30 ml:n vetoisessa keratiinisentrifugiputkessa, tilav. 1/25 tilav. 5 M NaCl:a. 2 tilav. EtOH -20 °C:ssa. Yli yön -20 °C:ssa 20 Sentrifugointi J. 6500 kierrosta minuutissa, 60 min -20 °C:ssa. DNA-saostumat ^ 1 - 2 ml TEN-puskuria

Puhdistettu plasmidi-DNA (1 mg/1 lihalientä). Varastointi - 25 -20 - 70 °C:ssa.

Esimerkki 3 :Λ: Escherichia coli HB101 (pEAP2) (FERM BP-468), joka saatiin esimerkin 1 vaiheessa (3), ympättiin 500 ml:n ve--:· toisiin pulloihin, jotka sisälsivät 100 ml LB-lihalientä 30 (jossa oli 10 g tryptonia, 5 g hiivauutetta, 1 g glukoosia, 2 g glyserolia sekä 10 g NaCl:a yhdessä litrassa vet- .·. : tä) ja viljeltiin 37 °C:ssa samalla ravistellen. Solukasvu (solujen määrä) mitattiin optisena tiheytenä 660 nm:ssä.

Solunulkoiset ja solunsisäiset penisillinaasiak-35 tiivisuudet määritettiin muunnetun Sargentin menetelmän • » • « 13 721 14 avulla (Sawai et ai; Antimicrob. agents Chemother. 13, 910 (1978))/ jolloin entsyymimäärä, joka hydrolysoi 30 °Csssa yhden mikromoolin bentsyylipenisilliiniä yhdessä minuutissa, on yksi penisillinaasiyksikkö.

5 Kuten kuviossa 1 on esitetty, transformantin solu- kasvu saavutti maksimin 16 tunnin pituisen viljelyn jälkeen ja solunulkoinen penisillinaasiaktiivisuus alkoi nousta 20 tunnin jälkeen ja saavutti maksimin (noin 20 yksikköä/ml) 28 tunnin viljelyn jälkeen.

10 Tuotettu penisillinaasiaktiivisuus oli hyvin sta biili, kuten on esitetty kuviossa la, tuotto säilyi korkeana vieläpä 48 tunnin viljelyn jälkeen sekä saavutti enemmän kuin 80 % kokonaisentsyymituotosta. Tälle vastakohtana solunsisäinen penisillinaasituotto havaittiin ai-15 kaisessa vaiheessa (8-20 tunnin viljelyn jälkeen). Mutta maksimi oli vain 8 yksikköä/ml tai noin 10 % kokonaisent-syymituotosta ja sitä paitsi solunsisäinen tuotto väheni nopeasti. Mitään solunsisäistä penisillinaasiaktiivisuutta ei havaittu 48 tunnin viljelyn jälkeen. Kuvio Ib esittää 20 solunulkoisen ja solunsisäisen pensillinaasiaktiivisuuden prosentuaalisen määrän kokonaisentsyymiaktiivisuudesta. Vertailuna viljeltiin Bacillus sp. no 170 (FERM BP-467), joka on DNA:n luovuttaja sekä Escherichia colia HB101 (pBR322) (jossa on plasmidi pBR322, jolla on penisilli-25 naasin tuottoa koskeva geneettinen informaatio) [Boyer et ai; Gene, osa 2, s. 95-113 (1977)] sekä määritettiin peni-sillinaasiaktiivisuudet.

Bacillus sp. no 170 siirrostettiin 500 mlsn vetoisiin pulloihin, jotka sisälsivät 100 ml lihalientä (joka 30 sisälsi 2,0 g glukoosia tai glyserolia, 5,0 g hiivauutet-ta, 5,0 g polypeptonia, 1,0 g Κ2ΗΡ0* 0,2 g MgS0A.7H2O sekä 10 g NaHC03 yhdessä litrassa vettä ja jonka pH oli säädetty 9,0:ksi) sekä viljeltiin 37 °C:ssa samalla ravistellen. Solunulkoinen penisillinaasiaktiivisuus havainnoitiin joka ' . 35 neljäs tunti. Se saavutti maksimin (19 yksikköä/ml) 15 85721 12 tunnin mittaisen viljelyn jälkeen, ja sitten se laski nopeasti. Mitään solunulkoista penisillinaasiaktiivisuutta ei havaittu 40 tunnin kasvatuksen jälkeen (kuvio 2).

Toisaalta Escherichia coli HB101 (pBR322) siirros-5 tettiin 500 mlsn vetoisiin pulloihin, jotka sisälsivät 100 ml LB-lihalientä, jota käytettiin myös Escherichia colin HB101 (pEAP2) viljelyssä, sekä viljeltiin 37 °C:ssa ravistellen. Kuten on esitetty kuviossa 3a, solunsisäinen penisillinaasiaktiivisuus saavutti maksimin (35 yksik-10 köä/ml) 20 tunnin mittaisen viljelyn jälkeen, ja se oli enemmän kuin 80 % kokonaisentsyymiaktiivisuudesta, mutta se laski nopeasti. Solunulkoinen penisillinaasiaktiivisuus oli alhaisempi kuin 10 % kokonaisentsyymiaktiivisuudesta. Kuvio 3b esittää solunulkoisen ja solunsisäisen penisilli-15 naasiaktiivisuuden prosentuaaliset määrät kokonaisentsyy-miaktiivisuudesta.

Penisillinaasin identifiointi

Trans formant in vil jelyneste, joka saatiin esimerkin 1 vaiheessa (3), sentrifugoitiin nopeudella 10,000 x g 20 10 minuutin ajan. Supematanttineste saatettiin 80-%:ieeen

kyllästykseen ammoniumsulfaatin avulla. Saostuma liuotettiin veteen, ja liuosta dialysoitiin yli yön 0,05 M fosfaattipuskuria vastaan, joka sisälsi 0,1 M NaCl (pH

o 7,0). Dialysaatti pantiin Sephadex G-75-pylvääseen, joka 25 oli tasapainotettu fosfaattipuskurilla, puhdistetun penisillinaasin saamiseksi.

Samalla tavalla käsiteltiin Bacillus sp. no 170 :n viljelynestettä puhdistetun penisillinaasin saamiseksi.

Escherichia colin HB101 (pEAP2) penisillinaasin 30 identifioimiseksi Bacillus sp. no 170:n penisillinaasin kanssa tutkittiin pHtn vaikutus aktiivisuuteen, lämpösta-biilisuus ja molekyylipaino kummaltakin penisillinaasil-- ta. Tämän tuloksena entsyymit olivat identtiset toistensa kanssa kuten alempana on esitetty.

*v‘: 35 (a) Entsyymin stabiilisuus tutkittiin puskuriliuok- : sissa, joilla oli erilaiset pH-arvot. Seosta inkuboitiin 85721 16 30 °C:ssa 45 minuutin ajan. Molemmat entsyymit olivat stabiilileja pH*ssa 7-9, ja entsyymitoiminnan optimi pH-arvot olivat 6,0 - 7,0.

(b) Lämpöstabiilisuus tutkittiin seuraavasti. Ent-5 syymit liuotettiin 0,05 M fosfaattipuskuriin, pH 7,0, ja liuoksia kuumennettiin valitussa lämpötilassa 10 minuutin ajan. Jäännösaktiivisuudet mitattiin pH 7,0:ssa. Molemmat entsyymit olivat stabiileja aina 50 °Cseen saakka.

(c) Entsyymin molekyylipainojen määritys suoritet-10 tiin käyttämällä SephadexR-geelisuodatusmenetelmää. Molempien entsyymien määritetyt molekyylipainot olivat 27,000 -22,000.

Esimerkki 4

Viljelyolosuhteet penisillinaasin tuottamiseksi 15 Escherichia colin HB101 (pEAP2) (FERM BP-468) avulla tutkittiin erilaisissa elatusaineissa. Muut viljelyolosuhteet olivat samat kuin esimerkissä 3.

Taulukko 1 20 Elatusaine Aika (h) Penisillinaasin aktiivisuus fU/ml)

Solun- Solun- Kokonainen _ulkoinen sisäinen_ LB-liemi 20 14,7 1,9 16,6 (88,5%) (11,5%) 25 30 15,6 2,8 18,4 (84,8%) (15,2%) BPB-liemi 20 1,6 14,6 16,2 (10%) (90%) 30 30 9,1 14,2 23,3 (39%) (61%) LB-lihaliemen komponenttien vaikutus penisillinaasin tuottoon on esitetty taulukossa 2. Tryptonin, ’ 35 tryptoosin, polypeptonin sekä NaCl:n konsentraatio oli 1 paino-%.

17

Taulukko 2 8 5721

Komponentti Aika (h) Penisillinaasin aktiivisuus (U/ml)

Solun- Solun- Kokonainen 5 _ulkoinen_sisäinen_

Tryptoni 20 14,7 1,9 16,6

NaCl (88,5%) (11,5%) 30 15,6 2,8 18,4 (84,8) (15,2%) 10 _

Tryptoni 20 2,2 8,8 11,0 (20%) (80%) 30 3,1 7,7 10,8 (28,7%) (71,3%) 15 _

Tryptoosi 20 13,7 1,1 14,8

NaCl (92,5%) (7,5%) 30 15,4 1,6 17,0 (90,5%) (9,5%) 20 _

Tryptoosi 20 1,4 7,5 8,9 (15,7%) (84,3%) 30 2,3 8,7 11,0 (20,9%) (79,1%) 25 _

Polypeptoni 20 16,4 1,5 17,9

NaCl (91,6%) (8,4%) 30 i7,i 0,7 17,8 (95,5%) (4,5%) 30 ___

Polypeptoni 20 1,8 5,7 7,5 (24%) (76%) 30 3,4 5,8 9,2 (36,9%) (63,1%) 35 85721 18 LB-lihaliemen hiilenlähteen vaikutukset penisilli-naasin tuottoon on esitetty taulukossa 3. Glukoosin, tärkkelyksen sekä maltoosin konsentraatio oli 0,1 %, glyserolin konsentraatio oli 0,2 % ja NaCl:n konsentraatio 5 oli 1 %.

Taulukko 3

Hiilen- Aika (h) Penlsillinaasin aktiivisuus (U/ml) 10 lähde Solun- Solun- Kokonainen _ulkoinen sisäinen_

Glukoosi 20 17,3 1,1 18,4

NaCl (94,0%) (6%) 30 15,1 0,5 15,6 15 (96,7%) (3,3%)

Glyseroli 20 5,4 0,6 6,0

NaCl (90,0%) (10,0%) 30 5,2 1,8 7,0 20 (74,3%) (25,7%) Tärkkelys 20 6,6 2,3 8,9

NaCl (74,2%) (25,8%) 30 4,9 3,9 8,8 1 25 (55,7%) (44,3%)

Sakkaroosi 20 7,1 2,0 9,1

NaCl (78,0%) (22,0%) 30 6,5 4,3 10,8 ;;; 30 (60,2%) (39,8%) *. : Maltoosi 20 12,8 1,5 14,3

NaCl (89,3%) (10,7%) 30 11,8 2,6 14,4 -··: 35 (81,9%) (18,1%)

Taulukko 3 jatkuu 85721 19

Hiilen- Aika (h) Penisillinaasln aktiivisuus (U/ml) lähde Solun- Solun- Kokonainen 5 _ulkoinen sisäinen_

Glukoosi 30 20,0 1,2 21,2

Glyseroli (94,3%) (5,7%)

NaCl

NaCl:n vaikutus penisillinaasln tuottoon tutkit- 10 tiin käyttämällä elatusainetta, joka sisälsi 1 % trypto-nia, 0,1 % glukoosia, 0,2 % glyserolia, 1 % hiivauutetta sekä ilmoitetun määrän NaCl:a. Tulokset esitetään taulukossa 4.

15 Taulukko 4

NaCl (%)_Solunulkoinen aktiivisuus (U/ml) 0 0,2 0,5 15,0 20 1,0 20,0 2,0 18,0 5,0 8,0 10,0 0,1 ! .· 25 Esimerkki 5

Escherichia colia HB101, Escherichia colia HB101 (pMB9) sekä Escherichia colia HB101 (pEAP2) (FERM BP-468) viljeltiin samassa LB-lihaliemessä, jota käytettiin esimerkissä 3, 37 °C:ssa 20 tunnin ajan samalla ravistellen.

30 Alkalisen fosfataasin sekä 6-galaktosidaasin entsyymiaktiivisuudet mitattiin optisen tiheyden avulla 420 nm:ssä. Tulokset on annettu taulukossa 5.

35

Taulukko 5 20 35721

Mikro- Tuotteet _Aktiivisuus (U/ml)_ organismi Solun- Solun- Koko- 5 _ulkoinen_sisäinen_nainen

Proteiinit* 0,04 (4%) 1,04 (96%) 1,08 (100%)

Alkalinen 0,02 (2%) 1,31 (98%) 1,33 E. coli fosfataasi (100%) 10 HB101 fl-galaktosi- 0,03 (2%) 1,20 (98%) 1,23 daasi (100%)

Proteiinit* 0,01 (1%) 0,78 (99%) 0,79 15 (100%)

Alkalinen 0,01 (2%) 0,47 (98%) 0,48 E. coli fosfataasi (100%) HB101 (pMB9) β-galaktosi- 0,00 (0%) 0,80 (100%) 0,80% 20 _daasi_(100%^

Proteiinit* 0,18 (21%) 0,67 (79%) 0,85% (100%)

Alkalinen 0,29 (58%) 0,21 (90%) 0,50 E. coli fosfataasi (100%) 25 HB101 β-galaktosi- 0,09 (10%) 0,81 (90%) 0,90 (pEAP2) daasi (100%)

Penisillinaasi 10,70 (83%) 2,20 (17%) 12,90 (100%) *) Proteiinit sisältävät noin 10 proteiinilaatua ja ne 30 esitetään mg:na/ml • · • · · • «· *♦«·· • · ·

Claims (11)

35721

1. Rekombinanttiplasmidi/ joka pystyy indusoimaan penisillinaasin solun ulkopuolisen erityksen Escherichia 5 colissa, joka on transformoitu mainitulla plasmidilla, tunnettu siitä, että se käsittää a) Bacillus sp. n:o 170 (FERM BP-467) -kannan kro-mosomaalisen DNA:n restriktiofragmentin, joka on valmistettu ensimmäisellä restriktioentsyymillä, edullisesti

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rekombinanttiplasmidi, tunnettu siitä, että vektoriplasmidi on plasmidi pMB9.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rekombinantti plasmidi, tunnettu siitä, että se on plasmidi pEAP2 (FERM BP-468).

4. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisen rekom-binanttiplasmidin rakentamiseksi, tunnettu siitä, 2. että se käsittää seuraavat vaiheet: a) valmistetaan ensimmäisellä restriktioentsyymil-lä Bacillus sp. n:o 170 (FERM BP-467) -kannan kromosomaa-linen DNA-fragmentti, joka koodaa penisillinaasin solun ulkopuolisen erityksen; 30 b) pilkotaan vektoriplasmidi-DNA toisella restrik- tioentsyymillä, joka ei sekaannu kromosomaalisen DNA-fragmentin sisältämään geneettiseen informaatioon; c) käsitellään mainittu kromosomaalinen DNA-fragmentti ja mainittu pilkottu vektoriplasmidi-DNA DNA-li- 35 gaasilla rekombinanttiplasmidi-DNA:n muodostamiseksi; ja 85721 d) eristetään rekombinanttiplasmidi-DNA transformoidusta isäntäsolusta, joka ilmentää penisillinaasia tuottavan fenotyypin.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen re-striktioentsyymi on restriktioentsyymi Hind III.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektoriplasmidi on pMB9.

7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että rekombinanttiplasmidi on plasmidi pEAP2 (FERM ΒΡ-46Θ).

8. Menetelmä solun ulkopuolisen penisillinaasin tuottamiseksi, jossa viljellään jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukaisella rekombinanttiplasmidilla transfor- 15 moitua Escherichia coli-mikro-organismia, tunnet- t u siitä, että a) siirrostetaan alusta, joka sisältää epäorgaanisen suolan, joka on natriumeuola tai kaliumsuola, trans-formantilla; ja 20 b) jatketaan transformantin viljelyä sen jälkeen, kun solukonsentraatio on saavuttanut huippunsa ja kunnes penisillinaasin tuotto ja akkumulaatio alustassa on saavuttanut huippunsa.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että epäorgaaninen suola on nat-riumkloridi tai kaliumkloridi.

10. Patenttivaatimuksen 8 tai 9 mukainen menetelmä,tunnettu siitä, että epäorgaanista suolaa käytetään määrässä 0,5 - 3,0 paino-% alustasta.

10 Hind ΙΙΙ-fragmentin, jonka pituus on noin 4 kb ja joka restriktiofragmentti koodaa penisillinaasin solun ulkopuolisen erityksen; ja b) vektoriplasmidi-DNA-fragmentin, edullisesti pMB9:n DNA-fragmentin, joka on valmistettu toisella re- 15 striktioentsyymillä, joka ei sekaannu kohdan a) restriktiofragmentin sisältämään geneettiseen informaatioon.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 8-10 mukainen me netelmä, tunnettu siitä, että traneformanttia viljellään 12 - 48 tuntia. • · · * · · · 35721