DE3108152A1

DE3108152A1 - Verfahren zur gewinnung von restriktions-enzymen

Info

Publication number: DE3108152A1
Application number: DE19813108152
Authority: DE
Inventors: Toshiyuki Tachikawa Tokyo Kosaka; Toshizo Mitaka Tokyo Sakurai
Original assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Current assignee: Yakult Honsha Co Ltd
Priority date: 1980-04-02
Filing date: 1981-03-04
Publication date: 1982-01-07
Also published as: US4542099A; DE3108152C2; JPS56140888A; CH655947A5; GB2073202A; FR2479850B1; FR2479850A1; GB2073202B

Description

Gegenstand der Erfindung sind Restriktions-Enzyme von Bifidusbakterien und ein Verfahren zu ihrer Gewinnung.

Restriktions-Enzyme sind Endonucleasen, die bestimmte Nucleotidseguenzen an doppe1strängigen Desoxyribonucleinsäuren (DNA) erkennen und die DNA an oder nahe bei diesen Sequenzen schneiden, wobei einzelne DNA-Bruchstücke erhalten werden.

Seit der Entdeckung eines Restriktions-Enzyms in Haemophilus influenzae wurde eine Anzahl von Restriktions-Enzymen aus einer Vielzahl von Bakterien isoliert (Roberts, 1980).

Wegen ihrer einzigartigen Eigenschaft, DNA an bestimmten

Stellen zu schneiden, haben sich diese Enzyme in einer Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten bei der DNA-Forschung als wertvoll erwiesen, beispielsweise bei der Aufstellung physikalischer Genkarten, DNA-Sequenzanalysen, Genisolierung und Klonierungs-Verfahren (recombinant DNA). 25

Zwar sind zahlreiche Restriktions-Enzyme mit unterschiedlicher Spezifizität bekannt. Trotzdem besteht nach wie vor Bedarf an neuen Spezifizitäten, um DNA-Moleküle weiter zu charakterisieren und die Klonierung von DNA-Molekülen in

vitro (Aufbau neuer DNA) zu ermöglichen. Außerdem wird nach besseren Quellen für einige der bekannten Enzyme zur praktischen Verwendung gesucht.

Bei der Untersuchung zahlreicher Arten von nicht pathogenen 35

Bakterien des Verdauungstraktes auf die Anwesenheit von Restriktions-Enzymen wurde festgestellt, daß Bifidus-

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bakterien eine Anzahl dieser Enzyme mit vorteilhaften Eigenschaften für eine praktische Verwendung erzeugen.

Bifidusbakterien können leicht in großem Maßstab gezüchtet werden und die Enzyme können einfach gereinigt werden, da sie bemerkenswert stabil sind und störende Nucleaseaktivitäten in den rohen Extrakten nur in geringem Maße vorhanden sind.

Unter den Bifidusbakterien, die auf Restriktions-Enzyme geprüft wurden, zeigten acht von fünfzehn Stämmen aus neun Spezies Enzymaktivität. Diese Stämme sind nachstehend aufgeführt.

15 B. bifidum YIT4OO7 FERM-P 5871

JB. breve YIT4OO6 FERM-P 3906

B. infantis 659 ATCC25962

B. infantis S76e ATCC157O2

B. longum El 94b ATCC157O7

20 _B. thermophilum RU 326 ATCC25866

J3. breve S1 ATCC157OO

B_. breve S50 ATCC15698

Die Kultivierung eines Restriktions-Enzym erzeugenden Stammes der Erfindung kann auf jede übliche Art in jedem herkömmlichen Medium durchgeführt werden. Das Kultivierungsverfahren und das verwendete-Medium sind deshalb nicht kritisch und unterliegen keiner besonderen Begrenzung.

Zur Gewinnung von Restriktions-Enzymen aus Bifidusbakterien werden die Zellen bei 37⁰C in einem geeigneten anaeroben Medium bis zur frühen stationären Phase kultiviert. Dies bedeutet, daß die Kultur nicht besonders sorgfältig überwacht werden muß. Die Zellen werden dann durch Zentrifugieren geerntet und bei -20⁰C bis zur Verwendung aufbewahrt.

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^Γ " -⁴- " 31Q8152¹

Ein typisches Verfahren zur Reinigung von Restriktions-Enzymen aus Bifidusbakterien wird nachstehend beschrieben. Die gefrorenen Zellproben werden aufgetaut und 4 Volumen 10 mMol K₀HPO--KH₀PO₁₄, pH-Wert 7,0, 7 mMol 2-Mercaptoätha-

und ζ *i zi
nol 1 mMol EDTA (Äthylendiamxntetraacetat (Puffer A) mit einem Gehalt von 25 ng Phenylmethy!sulfonylfluorid (PMSF), 1 mMol NaN₃ und 0,4 mol/1 NaCl suspendiert.

Hierauf wird die Zeilsuspension auf Eis mit 100 μg/ml Lysozym behandelt, um die Zellen gegen Ultraschall empfindlich zu machen. Die Behandlung mit Ultraschall wird dann durchgeführt, bis mehr als 90 % der Zellen aufgebrochen sind. Dabei wird darauf geachtet, daß die Temperatur unter 10°C bleibt. Alle weiteren Verfahrensschritte werden unter 5⁰C durchgeführt.

Die mit Ultraschall behandelte Zellsuspension wird 1 Stunde bei 100 000 χ g zentrifugiert und der überstand abdekantiert. Anschließend wird eine 10 % (Gewicht/Volumen) Lösung von Streptomycinsulfat langsam bis auf eine Endkonzentration von 1,2 % zugesetzt. Nach mindestens 30 Minuten Rühren werden die ausgeschiedenen Nucleinsäuren durch Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit entfernt.

Der DNA-freie überstand wird mit Ammoniumsulfat fraktioniert und die Restriktions-Enzym-Aktivität enthaltenden Fraktionen werden durch Kombinationen von Gelfiltration, Ionenaustausch- und Affinitätschromatographie weiter gereinigt, üblicherweise sind zwei oder drei Säulenchromatographieschritte ausreichend, um ein teilweise gereinigtes Enzym zu erhalten, das im wesentlichen frei von Nucleasen als Verunreinigung ist.

Die durch Reinigung aus Bifidusbakterien gewonnenen Restriktions-Enzyme haben einige gemeinsame Eigenschaften. Eine ihrer vorteilhaften Eigenschaften ist die bemerkens-

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.5 J

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werte Stabilität. Deshalb können diese Enzyme ohne nennenswerten Verlust an Aktivität in Abwesenheit von Glycerin oder Serumalbumin gereinigt werden.

Wie erwähnt, zeigen acht von fünfzehn Stämmen aus neun Arten, die untersucht wurden, Restriktions-Enzym-Aktivität. Diese Enzyme wurden nach der Nomenklatur von Smith and Nathans (1973) benannt. Die Enzyme sind in nachstehender Tabelle I aufgeführt. Bisher wurden noch nicht alle diese Enzyme vollständig gereinigt und charakterisiert. Einige allgemeine Eigenschaften wurden jedoch bereits an den teilweise gereinigten Enzymen festgestellt.

(1) Substratspezifizität 15

Restriktions-Enzyme von acht Stämmen von Bifidusbakterien wurden auf ihre Substratspezifizität bei Standard DNA's geprüft. Folgende DNA's wurden verwendet: E_. coli PhageADNA, E. coil Phage 0X174 RFI DNA_f Animal Virus Adenovirus type 2 DNA und Animal Virus SV4O DNA. Die durch die Enzyme erzeugten Bruchstücke dieser DNA's werden durch Elektrophorese auf Agarosegel analysiert. Die Bruchstück-Muster werden unter UV-Licht photographiert. Aus nachstehender Tabelle II ist zu sehen, daß die meisten dieser Enzyme in ihrer Substratspezifität verschieden zu sein scheinen.

(2) pH-Optimum

Das pH-Optimum dieser Enzyme liegt zwischen pH 6,8 und 8,0.

(3) Optimale Temperatur

Die optimale Temperatur für diese Enzyme liegt um 37⁰C. 35

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— D ~

(4) Hemmung/ Aktivierung und Stabilisierung

2+

Die Anwesenheit vom Mg*⁴¹"¹" ist wesentlich, dagegen wird aber weder Adenosintriphosphat noch S-Adenoxylmethionin benötigt. Einwertige Kationen sind nicht erforderlich und hemmen die Enzymaktivität bei höherer Konzentration.

Tabelle I

Stamm	Hinterlegung	Enzym ^;.
B-bifidum	YIT 4007	Bbi I Bbi II
B.breve Sl	ATCC 15700	Bbe SI
B.breve S50	ATCC 15698	Bbe AI
B. breve	YIT 4006	Bbe I Bbe II
.B.infantis 6 59	ATCC 2 5962	Bin I
B. infantis S76e	ATCC 15702	Bin SI
B. longum E194b	ATCC 15707	Bio I
B. thermophilum	ATCC 25866	Bth I

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ω αϊ

ω ο

to

cn

Tabelle II

Restriktions-Enzyme in Bifidusbakterien

	Hinterr?	Bbi I	Sequenz	Zahl der Schnittstellen	SV 4 0	0X174
Stamm	legung	Bbi II	CTGCAG	Lambda Ad2	2	1
B.bifidum	YIT 4007	Bbe SI	GRCGYC	18 25	0	7
		Bbe AI	-	>14 >14
B.breve Sl	ATCC 15700	Bbe I		+ +
B.breve S50	ATCC 15698	Bin I	GGCGCC	+ +	0	2
B.breve	YIT 4006	Bin SI	CCYRGG	1 >18	δ	0
B.infantis 659	ATCC 25962	Bio I		+	+	0
B.infantis S76e	ATCC 15702	Bth I
B.longum E194b	ATCC 15707		CTCGAG	+ +	0	1
B.thermophilum	ATCC 25866	1 6

CD

OO cn

1 Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Ein Stamm Bifidobacterium thermophilum (ATCC 25866) wird auf einem modifizierten VL-G Medium (Azuma und Suto, 1970) gezüchtet, das nach der modifizierten Hungate-Methode hergestellt wurde (Azuma und Suto, 1970; Hungate, 1969). Das modifizierte VL-G Medium enthält in 1 Liter: 75 ml 0,1 % K₃HPO₄ (Salzlösung I), 75 ml Salzlösung II, bestehend aus 0,6 % KH₃PO₄, 1,2 % (NH₄J₃SO₄, 1,2 % NaCl, 0,12 % MgSO₄.7H₂O und 0,12 % CaCl₃^H₃O, 0,1 ml 0,1 % Resazulin, 1 g Trypticase, 0,5 g Hefeextrakt, 0,2 g Fleischextrakt, 0,5 g Glucose, 5 ml 8 % Na₃CO₃, 1 ml 3 % Cystein-HCl und 790 ml destilliertes Wasser.

Für die Herstellung in kleinem Maßstab wird modifiziertes VL-G Medium (6x1 Liter) mit 1/250 Volumen der über Nacht gezüchteten Kultur von_B_. thermophilum über impft. Die Zellen werden dann etwa 15 Stunden bei 37⁰C bis zur frühen stationären Phase gezüchtet, durch Zentrifugieren geerntet und bei -20⁰C gelagert. Die Ausbeute beträgt etwa 25 g.

Der DNA-freie Zellextrakt wird in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten. Der DNA-freie Extrakt wird sodann innerhalb von 30 Minuten mit festem Ammoniumsulfat versetzt, bis 55prozentige Sättigung erreicht ist. Das Gemisch wird hierauf 1 Stunde bei 0⁰C gerührt. Anschließend wird das Gemisch 25 Minuten bei 12 000 U.p.M. zentrifugiert, der Niederschlag gesammelt, in einem möglichst kleinen Volumen Puffer A suspendiert und gegen den Puffer, .der 3x gewechselt wird, dialysiert.

Das Dialysat wird auf eine Whatman P-11 Phosphocellulose-Säule (1,5 χ 25 cm) aufgebracht, die vorher mit Puffer A äquilibriert wurde. Nach dem Waschen mit 90 ml Puffer wird die Säule mit einem 300 ml linearen Gradienten von 0 bis

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0,5 mol/1 NaCl in Puffer A entwickelt. Enzymaktivität wird bei 0,05 bis 0,15 mol/1 NaCl eluiert.

Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen 3x gewechselte Puffer}⁰van⁹ 10 mmol/lTris-HCl, pH 7,4, 7inmol/l 2-Mercaptoäthanol und 1 inmol/lEDTA (Puffer B) dialysiert. Hierauf wird das Produkt auf eine Whatman DEAE-Cellulose DE52 Säule (1,0 χ 20 cm) aufgebracht, die vorher mit Puffer B äquilibriert wurde. Nach dem Waschen mit 30 ml Puffer wird die Säule mit 150 ml linearem Gradienten von 0 bis 0,5 mol/1 NaCl eluiert. Die Enzymaktivität enthaltenden Fraktionen, die bei 0,25 bis 0,35 mol/1 NaCl eluiert werden, werden vereinigt, gegen Puffer B mit einem Gehalt von 0,25 mol/1 NaCl dialysiert und danach auf eine Heparin-Sepharose CL-6B Säu-Ie (1,0 χ 7 cm) aufgebracht, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde. Nach dem Waschen wird die Säule mit 60 ml linearem Gradienten von NaCl in Puffer B entwickelt. Die Enzymaktivität wird bei 0,4 bis 0,5 mol/1 NaCl eluiert. Die aktiven Fraktionen werden wieder vereinigt, durch Dialyse gegen Puffer B, der 50 % Glycerin enthält, konzentriert und bei -20°C aufbewahrt.

Nach der Inkubation mit überschüssigem Enzym über längere Zeit ergibt der Bthl-Verdau von Λ DNA scharfe Banden ohne Geschmier auf Agarosegel. Wie in Tabelle II zu sehen ist, wird SV40 DNA durch Bthl nicht gespalten. Wenn superhelicale SV40 DNA mit überschüssigem Enzym über längere Zeit inkubiert wird, erfolgt keine nennenswerte Umwandlung dieser DNA in die entspannte Ringform. Diese Ergebnisse zei- «_η gerenigten

^ου gen an, daß keine feststellbare Verunreinigung des partiell /

Bthl mit nicht spezifischen Nucleasen vorliegt.

Der Vergleich der mit verschiedenen DNA-Molekülen erhaltenen Spaltprodukte zeigt, daß Bthl ein Isoschizomeres von Xhol ist, das bekannterweise die Nucleotidsequenz 5* -CTCGAG- 3¹ erkennt.

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1 Beispiel2

ä· breve YIT4OO6 wird in der in Beispiel 1 für _B_. thermophilum beschriebenen Weise gezüchtet. Die Ausbeute beträgt etwa 35 g aus 6 Liter Kulturbrühe.

Der DNA-freie Extrakt wird wie für Bthl beschrieben hergestellt und mit Ammoniumsulfat fraktioniert. Die meiste Enzymaktivität wird im Abschnitt 40 bis 60 % gefunden und in Puffer A mit einem Gehalt von 0,1 mol/1 NaCl suspendiert. Nach der Dialyse gegen den gleichen Puffer wird das Dialysat auf eine Whatman Phosphocellulose P-11 Säule (1,5 χ 35 cm) aufgebracht, die vorher mit Puffer A mit einem Gehalt von 0,1 mol/1 NaCl äquilibriert wurde. Die Säule wird gespült und mit 450 ml linearem Gradienten von 0,1 bis 0,6 mol/1 NaCl in Puffer A entwickelt. Die bei 0,25 bis 0,35 mol/1 NaCl eluierte Enzymaktivität wird gesammelt und gegen Puffer B dialysiert.

Eine Whatman DEAE-Cellulose DE52 Säule (1,0 χ 15 cm) wird vorbereitet und mit Puffer B äquilibriert. Die Phosphocellulosefraktionen werden auf die Säule aufgebracht. Nach dem Waschen wird die Säule mit 120 ml Gradienten von 0 bis 0,5 mol/1 NaCl in Puffer B eluiert.

Die aktiven Fraktionen, die bei 0,20 bis 0,25 mol/1 NaCl eluiert werden, werden vereinigt, gegen Puffer B mit einem Gehalt von 0,25 mol/1 NaCl dialysiert und auf eine Heparin-Sepharose CL-6B Säule (1,0 χ 5 cm) aufgebracht, die vorher mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde. Nach dem Waschen wird die Säule mit 40 ml Gradienten von 0,25 bis 0,75 mol/1 NaCl entwickelt. Enzymaktivität wird in den Fraktionen mit 0,4 bis 0,5 mol/1 NaCl erhalten. Diese Fraktionen werden vereinigt, durch Dialyse gegen Puffer B, der 50 % Glycerin enthält, konzentriert und bei 20°C aufbewahrt.

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Es wird festgestellt, daß das teilweise gereinigte Enzym Bbel praktisch keine nicht-spezifischen Nucleasen als Verunreinigung enthält. Nach längerer Inkubation mit überschüssigem Enzym ergibt nämlich der Bbel-Verdau von fr DNA ein Bruchstückmuster, das keine BandaufWeitung auf Agarosegel zeigt, und nur eine Spurenmenge von Nicht-Substrat SV4O DNA wird aus der superhelicalen in die entspannte Form umgewandelt.

Bbel schneidet verschiedene Standard DNA¹S in der in Tabelle II angegebenen Weise. Aufgrund dieser Schnittmuster ist die Erkennungssequenz für Bbel vermutlich das palindrome Hexanucleotid GGCGCC. Da dieses Enzym demnach eine neue Sequenzspezifizität zeigt, ist es besonders wertvoll für

15 die DNA-Forschung.

Beispiel 3

.§· bifidum YIT4OO7 wird in modifiziertem VL-G Medium in der in Beispiel 1 für B. thermophilum beschriebenen Weise gezüchtet. Die Ausbeute beträgt etwa 25 g aus 6 Liter Kultur.

Der DNA-freie Extrakt wird wie vorstehend beschrieben hergestellt und mit festem Ammoniumsulfat bis zu 65prozentiger Sättigung versetzt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren gesammelt, in 10 mMol K₂HPO₄-KH₂PO₄, pH 7,4, 7 mMol 2-Mercaptoäthanol und 1 mMol EDTA (Puffer C) gelöst und gegen den Puffer dlalysiert.

Es wird eine Whatman Phosphocellulose P-11 Säule (1,5 χ 35 cm) vorbereitet und mit Puffer C äquilibriert. Das Dialysat wird auf die Säule aufgebracht. Nach dem Waschen wird die Säule mit 450 ml Gradienten O bis 0,7 mol/1 NaCl in Puffer C entwickelt. Es werden mindestens zwei verschiedene Enzymaktivitäten aufgelöst, die als Bbil und Bbill bezeichnet werden. Bbil fließt durch die Säule, während Bbill bei 0,1 bis 0,2 mol/1 NaCl eluiert wird.

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_t Der Durchfluß und die Waschflüssigkeit, die Bbil-Aktivität enthalten, werden vereinigt, durch Zusatz von Ammoniumsulfat auf 60 % Sättigung gefällt und in einem möglichst kleinen Volumen Puffer B mit einem Gehalt von 0,1 mol/1 NaCl suspendiert. Die erhaltene Suspension wird auf eine Sephadex G-200 Säule (2,5 χ 55 cm) aufgebracht, die vorher mit dem genannten Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit Puffer B mit einem Gehalt von 0,1 mol/1 NaCl entwickelt. Die bei 0,6 bis 0,8 Bettvolumen eluierte Bbil-Aktivität wird vereinigt und erschöpfend gegen Puffer B dialysiert.

Eine Whatman DEAE-Cellulose DE-52 Säule (1,0 χ 10 cm) wird vorbereitet und mit Puffer B äquilibriert. Sodann wird die Bbil Sephadex-Fraktion auf die Säule aufgebracht. Nach dem Waschen wird die Säule mit 80 ml Gradienten 0 bis 0,5 mol/1 NaCl in Puffer B entwickelt. Die bei 0,25 bis 0,30 mol/1 NaCl eluierte Enzymaktivität wird vereinigt und gegen Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol/1 NaCl dialysiert.

Das Dialysat wird auf eine Hydroxylapatitsäule (1,0 χ 10 cm) aufgebracht, die vorher mit Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol/1 NaCl äquilibriert wurde. Die Säule wird gewaschen und mit 80 ml Gradienten von 0,01 bis 0,5 mol/1 Kaliumphosphat in Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol/1 NaCl eluiert. Das Bbil wird bei 0,1 bis 0,25 mol/1 Kaliumphosphat eluiert.

Die Spezlfizität von Bbil wird mit einigen Standard-DNA¹s geprüft und mit dem Schnittmuster von bekannten Enzymen verglichen. Dabei wird eine Ähnlichkeit der Schnittmuster von Bbil und Pstl festgestellt. Die Muster der Bruchstücke, die von λ-DNA oder Adenovirus Typ 2 DNA, verdaut mit Pstl allein erhalten werden, sind identisch mit denen, die aus den gleichen DNA's erhalten werden, wenn sie mit Bbil und danach mit Pstl verdaut werden. Dies weist darauf hin, daß Bbil isoschizomer mit Pstl ist und das symmetrische Hexa-

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1 nucleotid CTGCAG erkennt.

Bbil ist viel stabiler als Psti und deshalb für den praktischen Gebrauch in vorteilhafter Weise geeignet,

Die Bbill-aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol/1 NaCl dialysiert. Das Dialysat wird sodann auf eine Hydroxylapatit-Säule (1,0 χ 10 cm) aufgebracht, die vorher mit dem vorstehend genannten Puffer äquilibriert wurde. Nach dem Waschen wird die Säule mit 80 ml Gradienten von 0,01 bis 0,5 mol/1 Kaliumphosphat in Puffer A mit einem Gehalt von 0,2 mol/1 NaCl entwickelt. Die Enzymaktivität wird bei 0,05 bis 0,1 mol/1 Kaliumphosphat eluiert.

In vorläufigen Versuchen wurde festgestellt, daß Bbill isoschizomer mit Acyl ist, das Hexanucleotide GRCGYC erkennt, wobei R eine Purinbase und Y eine Pyrimidinbase ist. AcYI wird aus Anabaena cyllndrica isoliert, einem Stamm von blaugrünen Algen. Die Kultur dieses Mikroorganismus ist mühsam und zeitraubend. Deshalb ist B. bifidum YIT4OO7 eine wesentlich bessere Quelle für dieses Enzym als A. cylindrica.

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Claims

VOSSIUS · VOSSIUS · TAUCHN^-ER;- HEUNEMANN · RAUH

PATENTANWÄLTE

SIEBERTSTRASSE 4- · 8OOO MÜNCHEN 0Θ · PHONE: (O89) 47 4O75 CABLE: BENZOLPATENT MÜNCHEN · TELEX 8-29463VOPAT O

u.Z.: R 038 (Ra/kä) ' 4. März 1981

Case: FA-5049 YT/ss

KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA 10 Tokio, Japan

" Verfahren zur Gewinnung von Restriktions-Enzymen " 15

Patentansp r u c h

Verfahren zur Gewinnung von Restriktions-Enzymen, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Restriktions-Enzyme erzeugenden Bifidusbakterien-Stamm züchtet und das Restriktions-Enzym aus der Bakterienkultur gewinnt.

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