<Desc/Clms Page number 1>
EMI1.1
der DNS erfolgt. Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolierung von Wachstumshormon-Genen, deren Reinigung, Transfer und Replikation in einem mikrobiellen Wirt und ihre anschliessende Charakterisierung. Durch die Erfindung werden neue Produkte bereitgestellt. Zu diesen gehören ein Plasmid, in welches eine spezifische Nucleotidsequenz, die einem höheren Organismus entstammt, inseriert ist, und ein neuer Mikroorganismus, der als Teil seiner genetischen Ausstattung eine spezifische Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus enthält.
Folgende Symbole und Abkürzungen werden in vorliegender Beschreibung verwendet :
DNS = Desoxyribonukleinsäure
RNS = Ribonukleinsäure cDNS = komplementäre DNS (enzymatisch synthetisiert aus einer mRNS-Sequenz) mRNS = messenger-RNS tRNS = transfer-RNS dATP = Deoxyadenosintriphosphat dGTP = Deoxyguanosintriphosphat dCTP = Deoxycytidintriphosphat
A = Adenin
T = Thymin
G = Guanin C = Cytosin
EMI1.2
ATP = Adenosintriphosphat
TTP = Thymidintriphosphat
Die biologische Bedeutung der Basensequenz der DNS ist die eines Speichers der genetischen Information. Es ist bekannt, dass die Basensequenz der DNS als Code verwendet wird, der die Aminosäuresequenz sämtlicher von der Zelle erzeugter Proteine bestimmt.
Ausserdem dienen Teile der Sequenz regulatorischen Zwecken, zur Steuerung von Herstellungszeitpunkt und Menge jedes Proteins. Die Arbeitsweise dieser steuernden Elemente ist erst zum Teil erkannt. Schliesslich dient die Basensequenz in jedem Strang als Matrize bei der Replikation der DNS, die die Zellteilung begleitet.
Die Art und Weise, in welcher die Information der Basensequenz der DNS auf die Aminosäuresequenz von Proteinen übertragen wird, ist ein fundamentaler Vorgang, der universell für alle lebenden Organismen ist.
Es konnte bewiesen werden, dass jede üblicherweise in Proteinen vorhandene Aminosäure durch die Sequenz eines oder mehrerer Trinucleotide oder Tripletts bestimmt wird. Jedem Protein entspricht somit ein Segment der DSN mit einer Triplett-Sequenz, die der Aminosäuresequenz des Proteins entspricht. Den genetischen Code veranschaulicht folgende Tabelle.
<Desc/Clms Page number 2>
Genetischer Code
EMI2.1
<tb>
<tb> Phenylalanin <SEP> (Phe) <SEP> TTK <SEP> Histidin <SEP> (His) <SEP> CAK
<tb> Leucin <SEP> (Leu) <SEP> XTY <SEP> Glutamin <SEP> (Gln) <SEP> CAJ
<tb> Isoleucin <SEP> (Ile) <SEP> ATM <SEP> Asparagin <SEP> (Asn) <SEP> AAK
<tb> Methionin <SEP> (Met) <SEP> ATG <SEP> Lysin <SEP> (Lys) <SEP> AAJ
<tb> Valin <SEP> (Val) <SEP> GTL <SEP> Asparaginsäure <SEP> (Asp) <SEP> GAK
<tb> Serin <SEP> (Ser) <SEP> ORS <SEP> Glutaminsäure <SEP> (Glu) <SEP> CAJ <SEP>
<tb> Prolin <SEP> (Pro) <SEP> CCL <SEP> Cystein <SEP> (Cys) <SEP> TGK
<tb> Threonin <SEP> (Thr) <SEP> ACL <SEP> Tryptophan <SEP> (Try) <SEP> TGG
<tb> Alanin <SEP> (Ala) <SEP> GCL <SEP> Arginin <SEP> (Arg) <SEP> WGZ
<tb> Tyrosin <SEP> (Tyr) <SEP> TAK <SEP> Glycin <SEP> (Gly) <SEP> GGL
<tb> Terminationssignal <SEP> TAJ
<tb> Terminationssignal <SEP> TGA
<tb>
Schlüssel :
Jedes Triplett aus drei Buchstaben stellt ein Trinucleotid der DNS dar, mit einem 5'-Ende links und einem 3'-Ende rechts. Die Buchstaben stehen für die Purin- oder Pyrimidinbasen, die die Nucleotidsequenz bilden :
A = Adenin
G = Guanin C = Cytosin
T = Thymin X = T oder C, falls Y = A oder G X = C, falls Y = C oder T Y = A, G, C oder T, falls X = C Y = A oder G, falls X = T W = C oder A, falls Z = A oder G
EMI2.2
Z = A, G, C oder T, falls W = C
Z = A oder G, falls W = A
QR = TC, falls S = A, G, C oder T
QR = AG, falls S = T oder C S = A, G, C oder T,
falls QR = TC S = T oder C, falls QR = AG J = A oder G
K = T oder C
L = A, T, C oder G M = A, C oder T
Im biologischen Vorgang der Übersetzung der Nucleotidsequenz in eine Aminosäuresequenz erfolgt als erste Stufe die sogenannte Transcription. In dieser Stufe wird ein Segment der DNS mit der für das herzustellende Protein zuständigen Sequenz auf eine RNS übertragen. Die RNS ist ein der DNS ähnliches Polynucleotid, in dem jedoch Ribose an Stelle der Desoxyribose und Uracil an Stelle von Thymin stehen. Die Basen der RNS sind zur gleichen Art von Basenpaarung befähigt wie die Basen der DNS. Die durch Transcription einer DNS-Nucleotidsequenz entstehende RNS ist daher zu dieser kopierten Sequenz komplementär.
Diese RNS wird als messengerRNS (mRNS) bezeichnet wegen ihrer Zwischenstellung zwischen dem genetischen Apparat und dem Apparat der Proteinsynthese der Zelle.
<Desc/Clms Page number 3>
In der Zelle dient die mRNS als Matrize in einem komplexen Vorgang, an dem zahlreiche
Enzyme und Organellen innerhalb der Zelle beteiligt sind und der zur Synthese spezifischer
Aminosäuresequenzen führt. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet.
Häufig gibt es weitere Stufen, die dazu dienen, aus der bei der Translation entstandenen
Aminosäuresequenz ein funktionales Protein zu erzeugen. Ein Beispiel ist die Herstellung des
Insulins.
Zahlreiche Proteine von Bedeutung für Medizin oder Forschung werden in den Zellen höherer
Organismen wie der Wirbeltiere gefunden oder hergestellt. Hiezu gehören z. B. das Hormon Insulin, andere Peptidhormone wie das Wachstumshormon, an der Regulierung des Blutdrucks beteiligte
Proteine und zahlreiche Enzyme mit Bedeutung für technische, medizinische oder Forschungszwecke.
Häufig ist es schwierig, diese Proteine in brauchbaren Mengen durch Extraktion aus dem Organis- mus zu gewinnen, insbesondere bei Proteinen menschlichen Ursprungs. Es besteht daher ein
Bedarf an Techniken, durch die derartige Proteine von Zellen ausserhalb des Organismus in vernünftigen Mengen erzeugt werden. In manchen Fällen ist es möglich, geeignete Zellstämme durch die Techniken der Gewebekultur zu erhalten.
Das Wachstum von Zellen in Gewebekulturen ist jedoch langsam, das Medium ist teuer, die Bedingungen müssen genau kontrolliert werden und die Ausbeuten sind niedrig. Häufig ist es auch schwierig, einen gezüchteten Zellstamm mit den gewünschten differenzierten Eigenschaften zu erhalten.
Im Gegensatz dazu können Mikroorganismen wie Bakterien relativ leicht in chemisch definierten
Medien gezüchtet werden. Die Fermentationstechnologie ist bereits hochentwickelt und gut steuerbar.
Das Wachstum der Organismen erfolgt rasch, und hohe Ausbeuten sind möglich. Ausserdem wurden bestimmte Mikroorganismen bereits genetisch genau charakterisiert und gehören in der Tat zu den am besten charakterisierten und erkannten Organismen.
Es wäre daher sehr erwünscht, den Transfer eines Gen-Codes für ein Protein medizinischer Bedeutung aus einem Organismus, der normalerweise das Protein produziert, in einen geeigneten Mikroorganismus zu erzielen. Auf diese Weise könnte das Protein unter gesteuerten Wachstumsbedingungen vom Mikroorganismus hergestellt und in gewünschten Mengen erhalten werden. Es ist auch möglich, dass die Gesamtkosten der Herstellung des gewünschten Proteins durch ein derartiges Verfahren erheblich vermindert werden könnten. Die Fähigkeit zur Isolierung und zum Transfer der Gensequenz, die die Produktion eines speziellen Proteins bestimmt, in einen Mikroorganismus genau bekannter genetischer Struktur eröffnet ausserdem der Forschung die wertvolle Möglichkeit, zu untersuchen, wie die Synthese eines solchen Proteins gesteuert und wie das Protein nach der Synthese verarbeitet wird.
Ferner können isolierte Gene verändert werden, so dass sie Proteinvarianten mit andern therapeutischen oder funktionellen Eigenschaften codieren.
Die Erfindung betrifft Massnahmen, um die genannten Ziele zu erreichen. Ein Verfahren wird offenbart, das mehrere Stufen, einschliesslich Enzym-katalysierter Reaktionen, umfasst.
Nachstehend werden die bisherigen Kenntnisse über die Natur dieser Enzymreaktionen skizziert.
Reverse Transcriptase katalysiert die Synthese der einer RNS-Matrize komplementären DNS in Gegenwart der RNS-Matrize, eines Oligo-deoxynucleotid-Primers und der vier Deoxynucleosid-triphosphate dATP, dGTP, dCTP und TTP. Die Reaktion wird eingeleitet durch die nichtcovalente Bindung des Oligo-deoxynucleotid-Primers an das 3'-Ende der mRNS, darauf folgt die stufenweise Addition der geeigneten Deoxynucleotide, entsprechend der Basenpaarungsregel, an das 3'-Ende der wachsenden Kette. Das als Produkt erhaltene Molekül kann als haarnadelförmig beschrieben werden, es enthält die Ausgangs-RNS und einen komplementären DNS-Einzelstrang.
Die reverse Transcriptase kann ferner eine ähnliche Reaktion katalysieren, bei der ein DNS-Einzelstrang als Matrize dient, in welchem Fall man als Produkt einen haarnadelförmigen DNS-Doppelstrang erhält mit einer Schleife DNS-Einzelstrang, durch die ein Paar Enden verbunden werden ; vgl.
Aviv, H., und Leder, P., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 1408 (1972), und Efstratiadis, A., Kafatos, F. C., Maxam, A. F., und Maniatis, T., Cell. 7, 279 (1976).
Restriktions-Endonucleasen sind Enzyme, die zur Hydrolyse von Phosphodiesterbindungen in doppelsträngiger DNS befähigt sind, wobei die Sequenz des DNS-Stranges gespalten wird.
Liegt die DNS in Form einer geschlossenen Schleife vor, so wird diese in lineare Form überführt.
Das Hauptmerkmal eines Enzyms dieser Art besteht darin, dass die hydrolytische Wirkung
<Desc/Clms Page number 4>
EMI4.1
<Desc/Clms Page number 5>
Zur Illustrierung der Ausführung der Erfindung werden die Isolierung und der Transfer von Wachstumshormon-Gen im einzelnen beschrieben. Das Wachstumshormon wurde in diesem Fall gewählt wegen seiner zentralen Bedeutung aus der Sicht der klinischen Medizin und aus der
Sicht der Grundlagenforschung. Das offenbarte Verfahren kann vom Durchschnittsfachmann ohne weiteres auf die Isolierung von Wachstumshormon-Gen aus andern Organismen, einschliesslich
Menschen, übertragen werden.
Die Möglichkeit, menschliches Wachstumshormon in den Bedarf deckenden Mengen zu erzeugen, wäre daher äusserst erwünscht. Die Herstellung von menschlichem Wachstumshormon in Bakterien stellt eine Technik dar, mit der dieses angestrebte Ziel erreicht werden könnte. Ein Fortschritt in dieser Richtung wurde jedoch bisher dadurch vereitelt, dass keine Technik zur Einführung des Wachstumshormon-Gens in Bakterien vorlag. Die Erfindung stellt eine derartige Technik bereit.
Die Möglichkeit zur Herstellung einer DNS mit einer spezifischen Sequenz, die den genetischen
Code für ein spezifisches Protein abgibt, erlaubt die Modifizierung der Nucleotidsequenz durch chemische oder biologische Mittel derart, dass auch das schliesslich erzeugte Protein modifiziert wird. Auf diese Weise könnte man z. B. ein modifiziertes Wachstumshormon herstellen, das auf spezielle medizinische Bedürfnisse ausgerichtet ist. Die genetische Fähigkeit zur Herstellung einer wachstumshormonähnlichen Aminosäuresequenz mit den wesentlichen funktionellen Eigenschaften des Wachstumshormons kann daher auf einen Mikroorganismus übertragen werden.
Die Befähigung zum Transfer des genetischen Codes für ein bestimmtes Protein, das im normalen Stoffwechsel eines höheren Organismus benötigt wird, in einen Mikroorganismus, wie z. B. ein Bakterium, eröffnet neue Möglichkeiten zur Herstellung derartiger Proteine. Damit entsteht auch die Möglichkeit zur Vermehrung oder zum Ersatz solcher Proteine durch Proteine, welche von erfindungsgemäss veränderten Mikroorganismen erzeugt wurden dort, wo die Fähigkeit des höheren Organismus zur normalen Produktion dieser Proteine geschädigt wurde, und es ergibt sich z.
B. die Möglichkeit zum Aufbau von Symbiosen zwischen erfindungsgemässen Mikroorganismen und Menschen mit chronischen oder akuten Mangelkrankheiten, wobei die auf erfindungsgemässe Weise genetisch veränderten Mikroorganismen implantiert oder anderweitig einverleibt werden, um den pathologischen Stoffwechselfehler auszugleichen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung einer spezifischen, genetische Information enthaltenden Nucleotidsequenz, die Synthese von DNS mit dieser spezifischen Nucleotidsequenz und den Transfer der DNS in einen Wirtsorganismus.
Die Erfindung wird dargestellt am Beispiel spezifischer DNS-Sequenzen, die in ein Bakterium transferiert werden, nämlich des Gens für Ratten-Wachstumshormon und des Gens für menschliches Wachstumshormon. Danach kann davon ausgegangen werden, dass die Methode auf den Transfer jeder beliebigen DNS-Sequenz eines höheren Organismus, wie z. B. eines Wirbeltieres, auf jeden beliebigen Mikroorganismus gut anwendbar ist. Ein höherer Organismus wird hier definiert als jeder beliebige eucaryontische Organismus mit differenzierten Geweben, einschliesslich z. B. der Insekten, Mollusken, Pflanzen, Wirbeltiere, einschliesslich Säugetiere, wobei zu letzteren Rinder, Schweine, Primaten und Menschen gehören.
Unter einem Mikroorganismus versteht man jeden mikroskopisch lebenden Organismus, der unter die Bezeichnung Protist fällt, wobei er procaryontisch oder eucaryontisch sein und z. B. aus einem Bakterium, Protozon, Algen und Pilzen, einschliesslich Hefen, bestehen kann. Im vorliegenden Verfahren wird eine ausgewählte Zellpopulation zunächst nach einer neuen Methode isoliert. Aus den Zellen wird intakte mRNS nach einem Verfahren extrahiert, bei dem praktisch sämtliche RNase-Aktivität unterdrückt wird. Die intakte messenger-RNS aus dem Extrakt wird durch Säulenchromatographie gereinigt und dann der Einwirkung von reverser Transcriptase unterworfen, wobei diese Einwirkung in Gegenwart der zur Synthese eines komplementären (cDNS)-Stranges erforderlichen vier Deoxynucleosid-triphosphate erfolgt.
Das Produkt dieser ersten Reaktion mit reverser Transcriptase wird in einem Verfahren weiterbehandelt, das die Ribonucleotidsequenz selektiv entfernt. Die zurückbleibende Deoxynucleotidsequenz, die zur Ausgangs-mRNS komplementär ist, wird in einer zweiten Reaktion mit reverser Transcriptase oder DNS-Polymerase in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate inkubiert. Das resultierende Produkt ist eine doppelte cDNS-Struktur, deren komplementäre Stränge an
<Desc/Clms Page number 6>
einem Ende durch eine einsträngige Schleife miteinander verbunden sind. Dieses Produkt wird dann mit für den Einzelstrang spezifischer Nuclease behandelt, die die einsträngige Schleife abspaltet.
Die resultierende doppeltsträngige cDNS wird sodann verlängert, indem man an beiden Enden eine spezifische DNS addiert, die die Sequenz einer Erkennungs- bzw. Spaltstelle eines Restriktionsenzyms aufweist. Die Addition wird durch eine DNS-Ligase katalysiert. Die verlängerte cDNS wird dann mit einer Restriktions-Endonuclease behandelt, wobei an den 5'-Enden jedes Stranges der Doppelhelix selbst-komplementäre einsträngige Enden entstehen.
Eine Plasmid-DNS mit einer Erkennungsstelle für die gleiche Restriktions-Endonuclease wird mit diesem Enzym behandelt, um den Polynucleotidstrang zu spalten und selbst-komplemen- täre einsträngige Nucleotidsequenzen an den 5'-Enden zu erzeugen. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen an den einsträngigen Enden werden entfernt, um zu verhindern, dass das Plasmid eine zur Transformierung einer Wirtszelle fähige Ringstruktur bildet. Die wie vorstehend beschrieben vorbereitete cDNS und die Plasmid-DNS werden dann in Gegenwart von DNS-Ligase zusammen inkubiert. Unter den beschriebenen Reaktionsbedingungen kann die Bildung eines lebensfähigen, geschlossenen Ringes aus Plasmid-DNS nur erfolgen, falls ein Segment der cDNS eingefügt wird.
Das die cDNS-Sequenz enthaltende Plasmid wird dann in eine geeignete Wirtszelle verbracht. Zellen, die ein lebensfähiges Plasmid aufgenommen haben, erkennt man am Auftreten von Kolonien
EMI6.1
dann gezüchtet, und das neukombinierte Plasmid wird anschliessend reisoliert. Auf diese Weise können grosse Menge an rekombinierter Plasmid-DNS hergestellt werden, woraus man die spezifische cDNS-Sequenz durch endonucleolytische Spaltung mit dem entsprechenden Restriktionsenzym wieder isolieren kann.
Das erfindungsgemässe Grundverfahren ist auf die Isolierung jeder beliebigen Nucleotidsequenz aus einem höheren Organismus, einschliesslich des Menschen, und deren Transfer in einen Mikroorganismus als Wirt anwendbar. Das Verfahren erweist sich als nützlich zum Transfer eines genetischen Codes für ein spezifisches Protein von medizinischem oder technischem Wert und zur mikrobiologischen Synthese solcher Proteine. Zur Veranschaulichung der Erfindung wurde die Wachstumshormon codierende Nucleotidsequenz aus Ratten isoliert, in Bakterien transferiert und dort repliziert.
Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur Isolierung eines DNS-Moleküls mit spezifischer Nucleotidsequenz und deren Transfer in einen Mikroorganismus, wobei man die ursprüngliche Nucleotidsequenz der DNS nach der Vermehrung im Mikroorganismus wiederfindet.
Die das erfindungsgemässe Verfahren ausmachenden Stufen können in vier allgemeine Kategorien unterteilt werden :
1. Die Isolierung einer gewünschten Zellpopulation aus einem höheren Organismus
Es gibt zwei Quellen für eine genetische Sequenz, die ein spezielles Protein codiert : die DNS des zugrunde liegenden Organismus selbst und eine RNS-Übersetzung der DNS. Nach den heutigen Sicherheitsbestimmungen der National Institutes of Health wird für die U. S. A. vorgeschrieben, dass menschliche Gene jeder Art nur dann in neukombinierte DNS und anschliessend in Bakterien eingebracht werden können, nachdem sie sehr sorgfältig gereinigt wurden, oder wenn man in besonders ausgestatteten (P4) Einrichtungen arbeitet, vgl.
US-Federal Register, Bd. 41,
EMI6.2
mit der Isolierung der spezifischen mRNS, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die das gewünschte Protein codiert. Auf diese Weise geniesst man den weiteren Vorteil, dass die mRNS leichter als aus Zellen extrahierte DNS gereinigt werden kann. Insbesondere kann man auch Vorteil ziehen aus der Tatsache, dass in hochdifferenzierten Organismen, wie den Wirbeltieren, die Identifizierung einer spezifischen Zellpopulation von spezieller Lokalisierung im Organismus möglich ist, deren Funktion hauptsächlich in der Produktion des betreffenden Proteins besteht. Eine solche Population kann auch während einer vorübergehenden Entwicklungsstufe des Organismus vorliegen.
In derartigen Zellpopulationen besitzt ein grosser Anteil der aus den Zellen isolierten mRNS die gewünschte Nucleotidsequenz. Die Wahl der zu isolierenden Zellpopulation und das bei der
<Desc/Clms Page number 7>
Isolierung angewendete Verfahren können im Hinblick auf die Ausgangsreinheit der mRNS von wesentlicher Bedeutung sein.
In den meisten Geweben, Drüsen und Organen werden die Zellen von einem im allgemeinen faserigen Netzwerk aus Bindegewebe zusammengehalten, das hauptsächlich aus Kollagen besteht, das jedoch je nachdem auch andere Strukturproteine, Polysaccharide und mineralische Ablagerungen enthalten kann. Die Isolierung von Zellen eines bestimmten Gewebes erfordert zwangsläufig Verfah- ren zur Freisetzung der Zellen aus der Bindegewebs-Matrix. Die Isolierung und Reinigung eines speziellen differenzierten Zelltyps umfasst daher zwei Hauptstufen : die Absonderung der Zellen vom Bindegewebe und die Abtrennung der gewünschten Zellen von allen andern im Gewebe vorliegenden Zellarten. Die erfindungsgemäss vorgesehenen Arbeitsweisen sind auf die Isolierung zahlreicher Zelltypen aus verschiedenen Geweben anwendbar.
Häufig kann der Anteil an gewünschter mRNS erhöht werden, wenn man die Zellreaktionen auf Stimuli aus der Umgebung richtig einsetzt. So kann z. B. die Behandlung mit einem Hormon zu gesteigerter Produktion der gewünschten mRNS führen. Weitere Verfahren sind das Züchten bei einer bestimmten Temperatur oder in Gegenwart eines spezifischen Nährmediums oder einer sonstigen chemischen Substanz. Bei der Isolierung von Wachstumshormon-mRNS von Ratten wird durch Behandlung gezüchteter Hypophysenzellen mit Thyroidhormon und Glucocorticoiden der Anteil an Wachstumshormon-mRNS auf synergistische Weise beträchtlich erhöht.
2. Extraktion der mRNS
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist die praktisch vollständige Entfernung der RNase-Aktivität im Zellextrakt. Die zu extrahierende mRNS ist ein einsträngiges Polynucleotid, ungepaart mit einem komplementären Strang. Die hydrolytische Aufspaltung einer einzigen Phosphodiesterbindung in der Sequenz würde daher das gesamte Molekül für den Zweck der Transferierung einer intakten genetischen Sequenz in einen Mikroorganismus unbrauchbar machen. Wie bereits erwähnt, ist das Enzym RNase weit verbreitet, aktiv und aussergewöhnlich stabil. Es findet sich auf der Haut, übersteht die üblichen Spülverfahren für Glasapparaturen und verunreinigt gelegentlich Lagerbestände organischer Chemikalien.
Die Schwierigkeiten sind besonders akut beim Arbeiten mit Extrakten von Pankreaszellen, da die Schilddrüse eine Quelle für Verdauungsenzyme darstellt und daher an RNase reich ist. Das Problem der Verunreinigung durch RNase stellt sich jedoch bei sämtlichen Geweben, und das vorliegend offenbarte Verfahren zur Entfernung der RNase-Aktivität ist auf sämtliche Gewebe anwendbar. Die überraschende Wirksamkeit der Methode wird am Beispiel der erfolgreichen Isolierung intakter mRNS aus isolierten Inselzellen der Bauchspeicheldrüse beschrieben.
Beim Aufreissen der Zellen und bei sämtlichen Vorgängen, die zur Isolierung der von Protein praktisch freien RNS angewendet werden, setzt man erfindungsgemäss eine Kombination aus einem chaotropen Anion, einem chatropen Kation und einem Disulfidbindungen spaltenden Mittel ein.
Die Wahl der geeigneten chaotropen Ionen basiert auf deren Löslichkeit in wässerigen
EMI7.1
Salzen, die durch Kombination derartiger Kationen und Anionen gebildet sind, hängt zum Teil von deren Löslichkeit ab. So ist z. B. Lithium-dijodsalicylat ein stärkeres Denaturierungsmittel als Guanidiniumthiocyanat, jedoch besitzt es eine Löslichkeit von nur etwa 0, 1 M, ausserdem ist es relativ teuer. Die bevorzugte Kombination aus Kation und Anion liegt im Guanidiniumthiocyanat vor, da dieses Salz leicht zugänglich und in wässerigen Medien gut löslich ist, bis zu etwa 5molaren Lösungen.
Thiolverbindngen, wie das S-Mercaptoäthanol, spalten bekanntlich intramolekulare Disulfid-
EMI7.2
captan u. dgl. Eine wesentliche Eigenschaft ist die Löslichkeit in Wasser, da die Thiolverbindung in grossem Überschuss über die intramolekularen Disulfide vorliegen muss, um die Austauschreaktion zu Ende zu führen. ss-Mercaptoäthanol wird wegen seiner Verfügbarkeit und seines günstigen Preises bevorzugt.
<Desc/Clms Page number 8>
EMI8.1
<Desc/Clms Page number 9>
an Säulen mit Cellulose, an die Oligo-thymidylat gebunden ist, s. Aviv, H., und Leder, P., loc. cit. Die vorstehenden Verfahren liefern im wesentlichen reine, intakte mRNS aus Ausgangsmaterialien, die an RNase reich sind.
Die Reinigung der mRNS und die folgenden in vitro durchgeführten Stufen können mit jeder mRNS, unabhängig von ihrem Herkunftsorganismus, in praktisch gleicher Weise ausgeführt werden.
Unter bestimmten Bedingungen, z. B. bei der Verwendung von Zellen aus Gewebekulturen als Quelle der mRNS, kann die Verunreinigung mit RNase so niedrig sein, dass obige Stufe der RNase-Inhibierung nicht erforderlich ist. In diesen Fällen können die Methoden des Standes der Technik zur Verminderung der RNase-Aktivität ausreichen.
3. Bildung der cDNS
Die Zeichnung ist eine schematische Wiedergabe der restlichen Stufen des Verfahrens. Die erste Stufe besteht in der Bildung einer DNS-Sequenz, die zur gereinigten mRNS komplementär ist. Als Enzym wählt man für diese Reaktion reverse Transcriptase, obgleich im Prinzip jedes Enzym verwendet werden könnte, das zur Bildung eines komplementären DNS-Stranges auf Grund der als Matrize verwendeten mRNS fähig ist. Die Reaktion kann unter den bekannten Bedingungen ausgeführt werden, wobei man die mRNS als Matrize und ein Gemisch der vier Deoxynucleosidtriphosphate als Vorläufer des DNS-Stranges einsetzt. Zweckmässig wird eines der Deoxynucleosid-
EMI9.1
tung und Abtrennung, z. B. durch Chromatographieren und Elektrophorese, kontrollieren und quantitative Ausbeuteangaben machen zu können ; vgl.
Efstratiadis, A., et. al., loc. cit. Wie aus der
Zeichnung ersichtlich, erhält man als Produkt der Reaktion mit der reversen Transcriptase eine doppelsträngige Haarnadelform mit nichtcovalenter Bindung zwischen dem RNS-Strang und dem DNS-Strang.
Das Produkt der Reaktion mit der reversen Transcriptase wird nach Standardverfahren aus dem Reaktionsgemisch gewonnen. Zweckmässig verwendet man eine Kombination aus Phenolextraktion, Chromatographieren an einem dreidimensional vernetzten Polysaccharid und Ausfällung mit Äthanol.
Sobald die cDNS enzymatisch synthetisiert ist, kann die RNS-Matrize entfernt werden.
Zahlreiche Verfahren zum selektiven Abbau von RNS in Gegenwart von DNS sind bekannt. Das bevorzugte Verfahren ist eine alkalische Hydrolyse, die hochselektiv ist und durch PH-Einstellung leicht gesteuert werden kann.
Nach der alkalischen Hydrolyse und anschliessender Neutralisierung kann die mit P markier- te cDNS durch Aufällung mit Äthanol konzentriert werden, falls dies erwünscht ist.
Die Synthese einer doppelsträngigen haarnadelförmigen cDNS erfolgt unter Verwendung des entsprechenden Enzyms, z. B. mit DNS-Polymerase oder reverser Transcriptase.
Die Reaktionsbedingungen sind ähnlich wie vorstehend beschrieben, einschliesslich der Verwendung eines in a -Stellung mit 32p markierten Nucleosid-triphosphats. Die reverse Transcriptase ist aus verschiedenen Quellen erhältlich, z. B. aus Vogel-Myeloblastosisvirus (das Virus ist erhältlich von der Life Sciences Incorporated, St. Petersburg, Florida, die es gemäss einem Vertrag mit den National Institutes of Health produziert).
Nach der Bildung der cDNS-Haarnadel kann es empfehlenswert sein, die DNS aus dem Reaktionsgemisch rein zu gewinnen. Auch hier kann man zweckmässig Phenolextraktion, Chromatographieren an einem dreidimensional vernetzten Polysaccharid und Ausfällung mit Äthanol zur Reinigung des DNS-Produktes und Befreiung von verunreinigendem Protein verwenden.
Die Haarnadelstruktur kann in eine übliche doppelsträngige DNS überführt werden, indem man die einsträngige Schleife, die die Enden komplementärer Stränge verbindet, entfernt. Zu diesem Zweck stehen verschiedene Enzyme zur Verfügung, die eine spezifische hydrolytische Spaltung einsträngiger DNS-Bereiche bewirken. Ein für diesen Zweck geeignetes Enzym ist die Sl-Nuclease aus Aspergillus oryzae (das Enzym kann von der Miles Research Products, Elkhart, Indiana, bezogen werden). Die Behandlung der haarnadelförmigen DNS mit Sl-Nuclease führt in hohen Ausbeuten zu cDNS-Molekülen mit basengepaarten Enden. Extraktion, Chromatographieren und Ausfällung mit Äthanol erfolgen wie vorstehend beschrieben.
Die Verwendung von reverser Transcriptase und Sl-Nuclease bei Synthesen doppelsträngiger cDNS-Übertragungen von mRNS wurde von Efstratiadis et. al., loc. cit., beschrieben.
<Desc/Clms Page number 10>
Gegebenenfalls kann man den Anteil an cDNS-Molekülen mit stumpfen Enden erhöhen durch eine Behandlung mit E. coli-DNS-Polymerase I in Gegenwart der vier Deoxynucleosid-triphosphate. Die Kombination von Exonuc1ease- und Polymerase-Aktivität des Enzyms führt zur Entfernung sämtlicher hervorstehender 3'-Enden und zum Auffüllen sämtlicher hervorstehender 5'-Enden. Auf diese Weise wird die Teilnahme der Hauptmenge der cDNS-Moleküle an den folgenden Verknüp- fungsreaktionen sichergestellt.
Die nächste Verfahrensstufe besteht in der Behandlung der Enden des cDNS-Produkts derart, dass geeignete Sequenzen an jedem Ende stehen, die eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease aufweisen. Die Wahl des an die Enden zu addierenden DNS-Fragments bestimmt sich durch Zweckmässigkeitsgründe in der Handhabung. Die an die Enden zu addierende Sequenz
EMI10.1
Plasmid sollte mindestens eine Stelle besitzen, die auf die Spaltung durch Restriktions-Endo- nuclease anspricht. Das Plasmid pMB9 besitzt z. B. eine Erkennungsstelle für das Enzym Hind
III. Hind III wird aus Hemophilus influenza isoliert und nach dem Verfahren von Smith, H. O., und Wilcox, K. W., J. Mol. Biol. 51,379 (1970), gereinigt.
Das Enzym Hae III aus Haemophilus aegyptious wird nach dem Verfahren von Middleton, J. H., Edgell, M. H., und Hutchinson III, C. A., J. Virol. 10,42 (1972), gereinigt. Ein Enzym aus Hemophilus suis, das als Hsu I bezeichnet wird, katalysiert die Hydrolyse an den gleichen Erkennungsstellen wie Hind III. Diese beiden
Enzyme werden daher als funktional austauschbar betrachtet.
Zweckmässig verwendet man ein chemisch synthetisiertes doppelsträngiges Decanucleotid mit der Erkennungssequenz für Hind III zur Bindung an die Enden des cDNS-Doppelstranges.
Das doppelsträngige Decanucleotid besitzt die in der Zeichnung dargestellte Sequenz, vgl. Heyneker, H. L., et al., und Scheller, R. H., et al., loc. cit. Verschiedene solcher synthetischer Sequenzen mit Erkennungsstellen stehen heute zur Verfügung, so dass man die Enden der doppelten DNS so präparieren kann, dass sie auf die Einwirkung einer der zahlreichen Restriktions-Endonucleasen ansprechen.
Die Bindung der Erkennungsstellensequenz an die Enden der cDNS kann auf bekanntem
Weg erfolgen. Das Verfahren der Wahl ist eine Reaktion, die als "Verknüpfung stumpfer Enden" bezeichnet und von einer DNS-Ligase katalysiert wird, die nach der Methode von Panet, A., et al., Biochemistry 12, 5045 (1973), gereinigt worden war. Die Reaktion der Verknüpfung stumpfer
Enden wurde von Sgaramella, V., et al., loc. cit., beschrieben. Das Produkt der Verknüpfung einer cDNS mit stumpfen Enden mit einem grossen molaren Überschuss eines doppelsträngigen Decanucleotids mit einer Hind III-Endonuclease-Erkennungsstelle ist eine cDNS mit dieser Hind III-Erkennungssequenz an jedem Ende.
Die Behandlung des Reaktionsprodukts mit Hind III-Endonuc1ease führt zur Spaltung an der Erkennungsstelle und Bildung einsträngiger selbst-komplementärer 5'-Enden, s. Zeichnung.
4. Bildung eines rekombinierten DNS-Transfer-Vektors
Im Prinzip kann eine Vielzahl Viren- und Plasmid-DNS zur Neukombination mit der auf vorstehend beschriebene Weise hergestellten cDNS verwendet werden. Die Grundvoraussetzungen bestehen darin, dass der DNS-Transfer-Vektor zum Eintritt in eine Wirtszelle befähigt sein muss, seine Replikation in der Wirtszelle erfolgt und dass er ausserdem eine genetische Bestimmungsgrösse besitzt, die es ermöglicht, diejenigen Wirtszellen, die den Vektor aufgenommen haben, auszusondern. Aus Gründen der öffentlichen Sicherheit sollte der Auswahlbereich eingeschränkt werden auf solche Transfer-Vektorarten, die für die jeweiligen Versuche geeignet erscheinen, entsprechend den vorstehend erwähnten Richtlinien der National Institutes of Health.
Die Liste genehmigter DNS-Transfer-Vektoren wird ständig erweitert, da neue Vektoren entwickelt und vom entsprechenden Kommittee der National Institutes of Health anerkannt wurden. Erfindungsgemäss ist selbstverständlich die Verwendung jeglicher Viren- und Plasmid-DNS vorgesehen, die die beschriebenen Fähigkeiten besitzen, einschliesslich solcher, deren Genehmigung noch bevorsteht. Geeignete Transfer-Vekto-
EMI10.2
<Desc/Clms Page number 11>
Science 196,161 (1977)] und Derivate des Plasmids col EI [vgl. z. B. Rodriguez, R. L., Bolivar, S., Goodman, H. M., Boyer, H. W., und Betlach, M. N., ICN-UCLA Symposium on Molecular Mechanisms
In The Control of Gene Expression, D. P. Nierlich, W. J, Rutter, C. F., Fox.
Eds. (Academic Press, N. Y., 1976), S. 471-477]. Plasmide aus col EI sind relativ klein, sie besitzen Molekulargewichte in der Grössenordnung weniger Millionen und haben die Eigenschaft, dass die Anzahl der Kopien von Plasmid-DNS pro Wirtszelle von 20 bis 40 unter Normalbedingungen auf 1000 oder mehr erhöht werden kann, wenn man die Wirtszelle mit Chloramphenicol behandelt. Die Fähigkeit zur Erhöhung der Genmenge in der Wirtszelle erlaubt es unter bestimmten Umständen, unter der Kontrolle des Experimentators die Wirtszelle zu veranlassen, dass sie hauptsächlich Proteine erzeugt, die von den Genen auf dem Plasmid codiert werden. Derartige Derivate von col EI sind daher bevorzugte Transfer-Vektoren gemäss der Erfindung.
Zu den geeigneten Derivaten von col EI gehören die Plasmide pMB-9, die das Gen für Tetracyclin-Resistenz tragen, und pBR-313, pBR-315, pBR-316, pBR-317 und pBR-322, die ausser dem Tetracyclin-Resistenz-Gen ein Gen für Ampieillinresistenz besitzen. Die Anwesenheit von Arzneimittelresistenz-Genen stellt eine zweckmässige Möglichkeit zur Auswahl der Zellen dar, die mit Erfolg vom Plasmid befallen wurden, da Kolonien dieser Zellen in Gegenwart der Wirkstoffe wachsen, während Zellen ohne das Plasmid nicht wachsen bzw. keine Kolonien bilden. In den Beispielen dieser Beschreibung wurde stets ein Plasmid aus col EI verwendet, das zusätzlich zum Arzneimittel-Resistenz-Gen eine Hind III-Erken- nungsstelle besass.
Wie beim Plasmid kann auch die Wahl des geeigneten Wirtes aus einem sehr breiten Spektrum erfolgen, wobei der Bereich aus Gründen der öffentlichen Sicherheit jedoch eng begrenzt wurde.
Ein E. coli-Stamm mit der Bezeichnung X-1776 wurde entwickelt und von den National Institutes of Health für Verfahren der beschriebenen Art genehmigt, wobei P2-Einrichtungen vorgeschrieben sind ; vgl. Curtiss, III, R., Ann. Rev. Microbiol., 30,507 (1976). E. coli RR-1 kann verwendet werden, wenn P3-Einrichtungen vorhanden sind. Wie im Fall der Plasmide sieht die Erfindung selbstverständlich die Verwendung von Stämmen jeglicher Wirtszellen vor, die zur Beherbergung
EMI11.1
Plasmid-DNS mit cDNS vermischt, wobei beide analog behandelte Endgruppen enthalten. Um die Möglichkeit, dass cDNS-Segmente Kombinationen miteinander eingehen, minimal zu halten, wird die Plasmid-DNS in molarem Überschuss über die cDNS eingesetzt. Diese Arbeitsweise hat bisher dazu geführt, dass die Hauptmenge der Plasmide ohne ein inseriertes cDNS-Fragment zirkuliert.
Die anschliessend transformierten Zeilen enthalten dann hauptsächlich Plasmid und keine mit cDNS neukombinierten Plasmide. Das Ergebnis ist ein sehr langwieriger und zeitraubender Selektionsvorgang. Gemäss dem Stand der Technik wurde dieses Problem gelöst, indem man versuchte, DNS-Vektoren herzustellen mit einer Erkennungsstelle für die Restriktions-Endonuclease in der Mitte eines geeigneten Markierungsgens derart, dass die Insertion der cDNS das Gen teilt, wodurch Verlust der vom Gen codierten Funktion eintritt.
Vorzugsweise wird eine Methode zur Herabsetzung der Kolonienzahl, die auf neukombinierte Plasmide zu untersuchen sind, angewendet. Hiebei behandelt man Plasmid-DNS, die mit der Restriktions-endonuclease abgeschnitten wurde, mit alkalischer Phosphatase (handelsübliches Enzym). Durch die Behandlung mit alkalischer Phosphatase werden die 5'-terminalen Phosphatgruppen von den mit der Endonuclease erzeugten Enden des Plasmids entfernt, und die Selbstverknüpfung der Plasmid-DNS wird verhindert. Die Ringbildung und Transformation hängen somit von der Insertion eines DNS-Fragments ab, das 5'-phosphorylierte Enden aufweist. Dieses Verfahren setzt die relative Häufigkeit von Transformationen ohne Neukombination auf weniger als 1 bis zu herab.
Das erfindungsgemässe Verfahren basiert auf der Tatsache, dass die durch DNS-Ligase katalysierte Reaktion stattfindet zwischen einer S'-Phosphat-DNS-Endgruppe und einer 3'-Hydroxyl-DNS- Endgruppe. Wird die terminale 5 r -Phosphatgruppe entfernt, so tritt keine Bindungsreaktion ein.
Ist doppelsträngige DNS zu verbinden, so sind zwei Situationen möglich, wie in Tabelle 1 gezeigt :
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
EMI12.2
<tb>
<tb> Fall <SEP> Reaktionsteilnehmer <SEP> Ligase-Produkt
<tb> 1 <SEP> 3'5'3'5'
<tb> OH <SEP> H203P0-0-P-0- <SEP>
<tb> + <SEP> +2H20
<tb> OPO3H2 <SEP> HO <SEP> 0-P-O--- <SEP>
<tb> 5' <SEP> 3' <SEP> 5' <SEP> 3'
<tb> II <SEP> 3' <SEP> 5' <SEP> 3' <SEP> 5'
<tb> --(H <SEP> H2O3PO-- <SEP> --O-P-O--
<tb> --OH <SEP> + <SEP> OH-- <SEP> --OH <SEP> HO--+H2O
<tb> 5'3'5'3'
<tb> III <SEP> 3'5'
<tb> OH <SEP> HO
<tb> + <SEP> keine <SEP> Reaktion
<tb> OH <SEP> HO-
<tb> 5'3'
<tb>
In Tabelle 1 wird die doppelsträngige DNS schematisch durch zwei parallele Linien wieder- gegeben, wobei die 5'-und 3'-Endgruppen je nachdem Hydroxyl- oder Phosphatgruppen aufweisen.
Im Fall I liegen 5'-Phosphatgruppen an beiden reaktionsfähigen Endgruppen vor, mit dem Ergebnis, dass beide Stränge covalent gebunden werden. Im Fall II besitzt nur einer der zu verbindenden Stränge eine terminale 5'-Phosphatgruppe mit dem Ergebnis, dass eine einsträngige covalente Bindung erfolgt, während im andern Strang eine Diskontinuität vorliegt. Der nichtcovalent verbundene Strang bleibt mit dem Molekül auf Grund von Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basenpaaren an den gegenüberliegenden Strängen in bekannter Weise verbunden.
Im Fall III besitzt keines der Enden der Reaktionsteilnehmer eine 5'-Phosphatgruppe, so dass keine Bindungsreaktion eintreten kann.
Unerwünschte Bindungsreaktionen können daher verhindert werden, indem man entsprechende Enden der Reaktionsteilnehmer, deren Verbindung zu verhüten ist, behandelt unter Entfernung der 5'-Phosphatgruppen. Man kann jede Methode zur Entfernung von 5'-Phosphatgruppen anwenden, die die DNS nicht anderweitig beschädigt. Bevorzugt wird die durch das Enzym alkalische Phosphatase katalysierte Hydrolyse.
Das vorstehend beschriebene Verfahren ist auch dann brauchbar, wenn ein lineares DNS-Molekül in zwei Unterfragmente, typischerweise mit einer Restriktions-Endonuclease, zu spalten und dann in der originalen Sequenz zu rekonstituieren ist. Die Unterfragmente können gesondert gereinigt und die gewünschte Sequenz kann durch erneute Verbindung der Unterfragmente rekonstituiert werden. Das Enzym DNS-Ligase, das die Ende-an-Ende-Verknüpfung von DNS-Fragmenten katalysiert, kann zu diesem Zweck verwendet werden, vgl. Sgaramella, V., Van de Sande, J. H., und Khorana, H. G., Proc. Natl. Sci., USA 67,1468 (1970). Sind die zu verbindenden Sequenzen nicht stumpf, so kann man die aus E. coli erhaltene Ligase verwenden, vgl. Modrich, P., und Lehman, I. R., J. Biol.
Chem. 245,3626 (1970).
EMI12.3
cDNS entfernt vor der Spaltung der homogenen cDNS mit einer Restriktions-Endonuclease. Man verwendet wieder bevorzugt alkalische Phosphatase. Die 5'-terminalen Phosphatgruppen sind
<Desc/Clms Page number 13>
eine strukturelle Vorbedingung für die spätere verbindende Wirkung der DNS-Ligase, die zur
Rekonstituierung der gespaltenen Unterfragmente verwendet wird. Enden ohne 5'-terminale Phosphat- gruppe können daher nicht covalent gebunden werden. Die DNS-Unterfragmente können nur an solchen Enden gebunden werden, die eine 51 -Phosphatgruppe besitzen.
Dieses Verfahren verhindert die wichtigste unerwünschte Bindungsrektion, nämlich die
Verbindung von zwei Fragmenten mit umgekehrter Sequenz, d. h. hinten-an-vorn statt vorn-an-hin- ten. Andere mögliche Nebenreaktionen, wie Dimerisierung und Cyclisierung, werden nicht verhin- dert, da diese in einer Reaktion vom Typ II gemäss Tabelle 1 erfolgen. Diese Nebenreaktionen sind weniger nachteilig, da sie zu physikalisch abtrennbaren und identifizierbaren Produkten führen, was bei der Neukombination in falscher Richtung nicht der Fall ist.
Zur Illustrierung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde Wachstumshormon codierende cDNS isoliert und mit einem Plasmid rekombiniert. Die DNS-Moleküle wurden zur Transformation von E. coli X-1776 verwendet. Die Selektion der zu transformierenden Zellen erfolgte durch Wachstum auf einem tetracyclinhaltigen Medium. Eine aus transformierten Zeilen gewonnene neukombinierte
Plasmid-DNS enthielt ein inseriertes DNS-Fragment von etwa 410 Nucleotiden Länge. Weitere Neukom- binationen, die auf gleiche Weise isoliert worden waren, wurden ebenfalls analysiert. Die inserierten Fragmente wurden mit Hind III- oder Hsu I-Endonuclease aus dem Plasmid freigesetzt und die DNS-Sequenz wurde nach der Methode von Maxam, A. M., und Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci.,
USA 74, 560 (1977), ermittelt.
Die Nucleotidsequenzen der inserierten DNS-Fragmente waren überlappt und enthielten die gesamte Codierungsreaktion für Ratten-Wachstumshormon.
Nach ausgiebiger Replikation in E. coli wurde eine Nucleotidsequenz von etwa 800 Nucleotiden
Länge isoliert, die die gesamte codierende Sequenz für Ratten-Wachstumshormon und Teile des Vorläuferpeptids und einen Teil der 5'-untranslatierten Region enthielten.
Das beschriebene Verfahren ist allgemein anwendbar auf die Isolierung und Reinigung eines Gens aus einem höheren Organismus, einschliesslich menschlicher Gene, dessen Transfer in einen Mikroorganismus und Replikation im Mikroorganismus. Auch neue rekombinierte Plasmide, die das gesamte oder einen Teil des isolierten Gens enthalten, werden beschrieben. Ferner werden bisher unbekannte neue Mikroorganismen beschrieben, die als Teil ihrer genetischen Ausstattung ein Gen eines höheren Organismus enthalten.
Die folgenden Beispiele beschreiben im einzelnen das Verfahren in der Anwendung auf die Isolierung, Reinigung und den Transfer von Wachstumshormongen in E. coli.
Die Erfindung wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Beispiel 1 :
In diesem Beispiel wird das Isolieren und Reinigen einer die gesamte Strukturgensequenz von Rattenwachstumshormon besitzenden DNS zusammen mit der Synthese eines das gesamte Strukturgen für Rattenwachstumshormon besitzenden Transfer-Vektors und das Herstellen eines das Gen für Rattenwachstumshormon als Teil seines genetischen Aufbaus enthaltenden Mikroorganismusstammes beschrieben.
Im Zusammenhang mit Genen nichtmenschlichen Ursprungs wird durch die in den U. S. A. geltenden Sicherheitsbestimmungen nicht gefordert, dass die cDNS in ebensoich hohem Ausmass gereinigt wird, wie dies für cDNSen menschlichen Ursprungs gefordert wird. Aus diesem Grunde war es möglich, die das gesamte Strukturgen von Rattenwachstumshormon enthaltende cDNS durch Isolieren elektrophoretisch abgetrennter DNS der zu erwartenden Länge von etwa 800 Basenpaaren (bestimmt aus der bekannten Länge des aus Aminosäuren aufgebauten Rattenwachstumshomons) zu isolieren. Als Quelle für die mRNS des Rattenwachstumshormons wurden kultivierte Zellen von Rattenhypophysen, u. zw. ein Sub-Clon der Zellspezies GH-1, verwendet, wie sie bei ATCC bezogen werden können [vgl. Tashjian, A.
H., et al., Endochrinology 82,342 (1968) ]. In solchen unter formalen Bedingungen gezüchteten Zellen ist die mRNS des Wachstumshormons nur in einer geringen Menge von 1 bis 3% der gesamten Poly-A enthaltenden RNS enthalten, jedoch konnte der Gehalt an mRNS für Wachstumshormon durch synergistische Wirkung von Thyroidhormonen und Glücocorticoiden über jenen von mRNS-Spezies aus Zellgewebe angehoben werden. RNS wurde aus 5. 108 Zellen erhalten, die in Suspensionskultur gezüchtet wurden und vier Tage vor dem Sammeln der Zellen mit 1 mmolarem Dexamethason und 10 nanomolarem L-Trijodthyronin
<Desc/Clms Page number 14>
zur Erzeugung von Wachstumshormon angeregt worden waren. Aus der aus den kultivierten Zellen stammenden Fraktion der Cytoplasmamembranen wurde polyadenylierte RNS in bekannter Weise
EMI14.1
USA 74,1816 (1977) und Bancroft, F.
C., Wu, G., und Zubay, G., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 70, 3646 (1973) ] isoliert.
Die mRNS wurde unter Verwendung von reverser Transcriptase aus Vogel-Myeloblastosis-Virus, welche von D. J. Beard, Life Science, Inc., St. Petersburg, Florida, bezogen wurde, in doppelstran-
EMI14.2
markiertem Deoxynucleosid-triphosphat, spezifische Aktivität 500-200 Curie je Mol, 200 ug/ml Oligo-dT (12-18) von Collaborative Research, Waltham, Massachusetts, 100) ig/ml polyadenylierter RNS und 200 Einheiten/ml reverser Transcriptase vorgenommen. Das Gemisch wird bei 45 C 15 min inkubiert.
Nachdem die Lösung an EDTA-Na 2 25 mmolar gemacht worden war, wurde sie mit dem gleichen Volumen an mit Wasser gesättigtem Phenol extrahiert, worauf die wässerige Phases in einer mit Sephadex G-100 gefüllten Kolonne von 0, 3 cm Durchmesser und 10 cm Höhe unter Verwendung eines Eluiermittels chromatographiert wurde, das in Tris-HCl 10 mmolar (PH 9, 0), an NaCl 100 mmolar und an EDTA 2 mmolar war. Die aus dem Hohlvolumen eluierte Nukleinsäure
EMI14.3
dann in Wasser gelöst. Nach dem Fraktionieren durch Gelelektrophorese konnte ein schwaches, jedoch deutlich sichtbares Band festgestellt werden, welches einer eine Länge von etwa 800 Basenpaaren besitzenden DNS entsprach.
Durch Behandeln der gesamten cDNS, welche aus der mRNS der kultivierten Hypophysenzellen transkribiert worden war, mit HhaI-Endonuclease wurden zwei DNS-Hauptfragmente erhalten.
Diese Hauptfragmente enthielten, nach dem elektrophoretischen Trennen voneinander, etwa 328 Nucleotide (Fragment A) bzw. 240 Nucleotide (Fragment B).
Die Nucleotidsequenz dieser Fragmente A und B wurde dadurch bestimmt, dass die Fragmente entsprechend der Methode von Maxam und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,560 (1977), spezifisch gespalten und der Sequenzanalyse unterworfen wurden. Die Sequenzanalyse zeigte, dass die Fragmente A und B in der Tat Teile des Rattenwachstumshormon codierenden Bereiches darstellten, wie sie durch Vergleich mit der veröffentlichten Aminosäuresequenz vom Rattenwachstumshormon und durch Vergleich mit der Aminosäuresequenz anderer bekannter Wachstumshormone ergab [vgl. Wallis, M., und Davies, R. V. N., Growth hormone and related Peptides (Eds., Copecile,
EMI14.4
Washington, D. C., 1976) ].
Wenn die in der oben beschriebenen Weise elektrophoretisch isolierte und 800 Basenpaare aufweisende doppelstrangige cDNS mit einer Endonuclease behandelt wurde, wurden unter den hauptsächlichen Spaltprodukten zwei Fragmente festgestellt, deren Länge der Länge der Fragmente A und B entsprach.
Da die etwa 800 Basenpaare aufweisende cDNS aus Rattenwachstumshormon nicht durch Behandlung mit einer Restriktions-Endonuclease behandelt worden war, war es erforderlich, die DNS weiter zu reinigen, um einstrangige, unpaarige Enden zu entfernen. In der Praxis
EMI14.5
von DNS-Polymerase I aus E. coli inkubiert, um alle abstehenden 3'-Enden exonucleolytisch abzuspalten und alle abstehenden 5'-Enden aufzufüllen. DNS-Polymerase I ist bei Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, erhältlich.
<Desc/Clms Page number 15>
Die etwa 800 Basenpaare enthaltende cDNS wurde durch Zusetzen synthetisch hergestellten Hind III-Verknüpfungsmittels behandelt. Die cDNS aus Rattenwachstumshormon wurde während 30 min bei 22 C in 0, 03 m Natriumacetat, PH 4, 6, 0, 3 m Natriumchlorid und 4, 5 mmolarem ZnC12 mit 30 Einheiten einer eine Aktivität von 1200 Einheiten/ml besitzenden Sl-Nuclease (erhältlich bei Miles Laboratories, Elkhart, Indiana) und anschliessend noch weitere 15 min bei 100C inkubiert. Die Umsetzung wurde durch Zusetzen von Tris in Form der Base zum Erzielen einer Endkonzentration von 0, 1 m, von EDTA bis zu einer Endkonzentration von 25 mmolar und tRNS aus E. coli [hergestellt nach der Methode von Ehrenstein, G., Methods in Enzymology, S. P.
Colowick und N. O. Kaplan, Eds., Band 12a, S. 588 (1967) ] zu 40 I1g/ml abgebrochen. Nach dem Extrahieren des Reaktionsgemisches mit Methanol und dem Chromatographieren an einem dreidimensional vernetz-
EMI15.1
Diese Behandlung führte zu einer hohen Ausbeute an cDNS-Molekülen, welche die für die Stumpfendenligation an synthetische Decanucleotide erforderlichen basenpaarigen Enden aufwiesen.
Die Hind III-Decameren wurden nach der von Scheller, R. H., Dickerson, R. E., Boyer, H. W., Riggs, A. D., und Itakura, K., in Science 196,177 (1977), angegebenen Methode hergestellt.
Das Verknüpfen von Hind III-Decameren mit cDNS wurde durch Inkubieren bei 14 C während 1 h in 66 mmolarem Tris-HCl, PH 7, 6, 6, 6 mmolarem MgCl, l mmolarem ATP, 10 mmolarem Dithiothreitol, 3 mmolaren Hind III-Decameren mit 10 cpm/pmol und T4-DNS-Ligase (etwa 500 Einheiten/
EMI15.2
Hsu 1- oder Hind III-Endonuclease während 2 h bei 37 C wurde KCI bis zu einer Endkonzentration von 50 mmolar und EDTA bis zu einer Endkonzentration von 0, 1 mmolar zugesetzt. Hind IIIund Hae II-Endonuclease können im Handel von New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, bezogen werden.
Das Reaktionsprodukt wurde durch Gelelektrophorese analysiert, wobei zusätzlich zu den Fragmenten abgespaltener Hind II-Decamerer ein Scheitel beobachtet wurde, welcher etwa 800 Nucleotiden entsprach.
Das Plasmid pBR-322, welches ein Ampicillinresistenzgen und innerhalb des Tetracyclinresistenzgens eine einzige Hind III-Stelle besass, wurde mit Hind II I -Endonuc1ease und alkalischer Phosphatase behandelt. Das Plasmid pBR-322 wurde an der Hind III-Restriktionsstelle mit Hsu IEndonuclease gespalten und dann mit alkalischer Phosphatase behandelt. Das Enzym war im Reaktionsgemisch in einer Menge von 0, 1 Einheit/gg enthalten, und das Reaktionsgemisch wurde bei 65 C 30 min in 25 mmolarem Tris-HCl, PH = 8, inkubiert, worauf die Phosphatase mit Phenol extrahiert wurde.
Nach einem mit Äthanol vorgenommenen Fällen wurde die mit Phosphatase behandelte Plasmid-DNS einer 800 Basenpaare enthaltenden cDNS aus Rattenwachstumshormon zugesetzt, welches kohäsive Enden von Hind III in einem Molverhältnis von 3 Mol Plasmid je Mol cDNS enthielt. Das Gemisch wurde sodann 1 h bei 14 C und in Anwesenheit von 50 Einheiten/ml T4-DNSLigase in 66 mmolarem Tris, PH 7, 6, 6, 6 mmolarem MgCl,, 10 mmolarem Dithiothreitol und 1 mmolarer ATP inkubiert.
Dieses Ligase-Reaktionsgemisch wurde zum Transformieren einer Suspension von Zellen
EMI15.3
zu einer Zelldichte von etwa 2. 10 Zellen/ml kultiviert. Die Zellen wurden bei 5 C durch Zentrifugieren bei 5000 g während 5 min abgetrennt, dann in 20 ml einer an NaCl 10 mmolaren Kochsalzlösung erneut suspendiert, anschliessend in der angegebenen Weise zentrifugiert und dann erneut in 20 ml eines Transformationspuffers suspendiert, welcher an CaCl, 75 mmolar, an NaCl 140 mmolar und an Tris (PH 7, 5) 10 mmolar war. Die Suspension wurde dann 5 min in Eis stehengelassen. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und erneut in 0, 5 ml Transformationspuffer
EMI15.4
<Desc/Clms Page number 16>
tet und im Hinblick darauf ausgewählt, dass sie auf einem 20 ig/ml Tetracyclin enthaltenden Nährmedium nicht wuchsen.
Es wurden insgesamt 10 solcher Kolonien erhalten, von welchen jede ein Plasmid enthielt, in das etwa 800 Basenpaare eingeschachtelt waren und das durch Hind III-Spaltung abgespalten wurde.
Die 800 Basenpaare aufweisende DNS aus Rattenwachstumshormon wurde in präparativer Menge aus recombinantem pRGH (RWH)-l-Klon isoliert, worauf deren Nucleotidsequenz nach der oben angegebenen Methode von Maxam und Gilbert bestimmt wurde. In diesem Falle enthielt die Nucleotidsequenz untranslatierte 5'-Bereiche des Rattenwachstumshormons (rgh) und zusätzlich eine 26 Aminosäuren enthaltende Sequenz, wie sie in dem Wachstumshormonvorstufenprotein vor der Sekretion anzutreffen ist. Der von der Gensequenz abgeleitete Messenger (Bote) der mDNS-Sequenz ist in Tabelle II gezeigt.
Die vorausgesagte Aminosäuresequenz stimmt mit Ausnahme der Stellungen 1 und 8 gut mit jener partiellen Aminosäuresequenz von Rattenwachstumshormon überein, welche von Wallis und Davies, supra, beschrieben wurde und die Reste 1-43,65-69, 108-113, 133-143 und 150-190 enthält.
<Desc/Clms Page number 17>
Tabelle II
EMI17.1
<tb>
<tb> Met <SEP> Ala <SEP> Ala <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Pro <SEP> Trp <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Cys <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> 5'---GTGGACAGATCACTGAGTGGCG <SEP> ATG <SEP> CCT <SEP> GCA <SEP> GAC <SEP> TCT <SEP> CAG <SEP> ACT <SEP> CCC <SEP> TCC <SEP> CTC <SEP> CTG <SEP> ACC <SEP> TTC <SEP> ACC <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> TCC <SEP> CTG <SEP> CTG
<tb> 1 <SEP> 20
<tb> Trp <SEP> Pro <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Gly <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Met <SEP> Pro <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Asn <SEP> Ala <SEP> Val <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> His <SEP> Leu <SEP> His <SEP> Gln <SEP> Leu
<tb> TGG <SEP> CCT <SEP> CAA <SEP> GAG <SEP> GCT <SEP> GGT <SEP> GCT <SEP> TTA <SEP> CCT <SEP> GCC <SEP> ATG <SEP> CCC <SEP> TTG <SEP>
TCC <SEP> AGT <SEP> CUG <SEP> TTT <SEP> CCC <SEP> AAT <SEP> CCT <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> CCA <SEP> CCC <SEP> CAG <SEP> CAC <SEP> CTG <SEP> CAC <SEP> CAG <SEP> CTG
<tb> 40
<tb> Ala <SEP> Ala <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Glu <SEP> Arg <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Arg <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Asn <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> Ala <SEP> Ala <SEP> Phe <SEP> Cys <SEP> Phe
<tb> CCT <SEP> GCT <SEP> GAC <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> AAA <SEP> GAG <SEP> TTC <SEP> GAG <SEP> CGT <SEP> GCC <SEP> TAC <SEP> ATT <SEP> CCC <SEP> GAG <SEP> GGA <SEP> CAG <SEP> CGC <SEP> TAT <SEP> TCC <SEP> ATT <SEP> CAG <SEP> AAT <SEP> GCC <SEP> CAG <SEP> GCT <SEP> GCT <SEP> TTC <SEP> TGC <SEP> TTC
<tb> 60 <SEP> 80
<tb> Ser <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Ala <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Gly <SEP> Lys <SEP>
Glu <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Gln <SEP> Gln <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Asp <SEP> Met <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Ile <SEP> Gln
<tb> TCA <SEP> GAG <SEP> ACC <SEP> ATC <SEP> CCA <SEP> GCC <SEP> CCC <SEP> ACC <SEP> GGC <SEP> AAG <SEP> GAG <SEP> GAG <SEP> GCG <SEP> CAG <SEP> CAG <SEP> AGA <SEP> ACT <SEP> GAC <SEP> ATG <SEP> GAA <SEP> TTG <SEP> CTT <SEP> CGC <SEP> TTC <SEP> TCG <SEP> CTG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> ATC <SEP> CAG
<tb> 100
<tb> Ser <SEP> Trp <SEP> Leu <SEP> Gly <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Phe <SEP> Thr <SEP> Asn <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Phe <SEP> Gly <SEP> Thr <SEP> Ser <SEP> Asp <SEP> Arg <SEP> Val <SEP> Tyr <SEP> Glu <SEP> Lys <SEP> Leu <SEP> Lys
<tb> TCA <SEP> TGG <SEP> CTG <SEP> GGG <SEP> CCC <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> TTT <SEP> CTC
<SEP> AGC <SEP> AGG <SEP> ATC <SEP> TTT <SEP> ACC <SEP> AAC <SEP> ACC <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> TTT <SEP> GGT <SEP> ACC <SEP> TCG <SEP> GAC <SEP> CGC <SEP> CTC <SEP> TAT <SEP> GAG <SEP> AAA <SEP> CTG <SEP> AAG
<tb> 120 <SEP> 140
<tb> Asp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Asp <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Asp <SEP> Lys
<tb> GAC <SEP> CTG <SEP> GAA <SEP> GAG <SEP> GCC <SEP> ATC <SEP> CAG <SEP> GCT <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> CAG <SEP> GAG <SEP> CTG <SEP> GAA <SEP> GAC <SEP> CGC <SEP> ACC <SEP> CCC <SEP> CGT <SEP> ATT <SEP> GGG <SEP> CAG <SEP> ATC <SEP> CTC <SEP> AAG <SEP> CAA <SEP> ACC <SEP> TAT <SEP> GAC <SEP> AAG
<tb> 160
<tb> Phe <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Asn <SEP> Met <SEP> Arg
<SEP> Ser <SEP> Asp <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Asn <SEP> Tyr <SEP> Gly <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Ser <SEP> Cys <SEP> Phe <SEP> Lys <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> His <SEP> Lys <SEP> Ala <SEP> Glu <SEP> Thr
<tb> TTT <SEP> GAC <SEP> GCC <SEP> AAC <SEP> ATG <SEP> CGG <SEP> AGC <SEP> GAT <SEP> GAG <SEP> GGT <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> AAA <SEP> AAG <SEP> TAT <SEP> GGG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> TCC <SEP> TGC <SEP> TTG <SEP> AAG <SEP> AAG <SEP> GAC <SEP> CTG <SEP> CAC <SEP> AAG <SEP> GCA <SEP> GAG <SEP> ACC
<tb> 180
<tb> Tyr <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Val <SEP> Met <SEP> Lys <SEP> Cys <SEP> Arg <SEP> Arg <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Ser <SEP> Cyc <SEP> Ala <SEP> Phe
<tb> TAC <SEP> CTG <SEP> CGG <SEP> GTC <SEP> ATG <SEP> AAG <SEP> TGT <SEP> CGC <SEP> CGC <SEP> TTT <SEP> GCG <SEP> GAA <SEP> AGC <SEP> ACC <SEP> TGT <SEP> GCT <SEP> TTC <SEP>
TAG <SEP> GCACACACTGGTGTCTCTCGCGGCACTCCCCCGTTACCCCCCTGTACT
<tb> CTGGCAACTGCCACCCCTACACTTTGTCCTAATAAAATTAATGATGCATCATATC <SEP> poly <SEP> (A) <SEP> --- <SEP> 3'
<tb>
<Desc/Clms Page number 18>
Beispiel 2 :
Im vorliegenden Beispiel wird das Isolieren und Reinigen der gesamten, menschliches Wachstumshormon codierenden Gensequenz zusammen mit der Synthese eines das gesamte Strukturgen für menschliches Wachstumshormon enthaltenden recombinanten Plasmids und die Herstellung eines Mikroorganismus beschrieben, welcher das gesamte Strukturgen für menschliches Wachstumshormon als Teil seines genetischen Aufbaus aufweist.
Das Isolieren von mDNS aus menschlichem Wachstumshormon wird im wesentlichen nach der im Beispiel 1 beschriebenen Methode vorgenommen, wobei jedoch als biologischer Ausgangsstoff Gewebe aus menschlichem Hypophysentumor verwendet wurde. 5 bösartige, menschliche Hypophysentumoren wurden nach dem Entfernen durch einen chirurgischen Eingriff in flüssigem Stickstoff rasch eingefroren. Diese Tumoren besassen ein Gewicht von 0, 4 bis 1, 5 g und wurden zunächst aufgetaut und dann in 4 molarem Guanidiniumthiocyanat, welches an Mercaptoäthanol 1 molar war und einen pH-Wert von 5, 0 besass, bei 4 C homogenisiert. Das Homogenisat wurde mit 1, 2 ml einer 5, 7 molaren Lösung von CsCl überschichtet, welche an EDTA 100 mmolar war,
EMI18.1
Die RNS wanderte zum Boden des Zentrifugenrohres.
Die RND wurde unter Verwendung einer Oligo-dT-Kolonne und durch Saecharosegradientensedi- mentation weiter gereinigt.
Etwa 10% der so isolierten RNS codierten Wachstumshormone, wie beim Einbauen einer radioaktiven Aminosäurevorstufe in ein ausfällbares Material mit Antiwachstumshormonwirkung in einem aus Weizenkeimen gewonnenen zellfreien Translationssystem [vgl. Roberts, B. E., und Patterson, B. M., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70,2330 (1973)] gezeigt werden konnte.
Die menschliches Wachstumshormon codierende cDNS wird im wesentlichen nach den Angaben in Beispiel 1 hergestellt. Die menschliches Wachstumshormon codierende cDNS wird durch Gelelektrophorese fraktioniert, wobei jenes Material für das Klonen ausgewählt wird, welches an eine Stelle wandert, die einer Kettenlänge von etwa 800 Nucleotiden entspricht. Die ausgewählte Fraktion wird mit DNS-Polymerase I behandelt und dann durch End-Addition von Hind III-Verknüpfern behandelt. Die erhaltene cDNS wird sodann unter Verwendung von DNS-Ligase mit mit alkalischer Phosphatase behandeltem Plasmid pBR-322 rekombiniert. E. coli X-1776 wird mit der recombinanten DNS transformiert, wobei ein DNS für menschliches Wachstumshormon enthaltender Stamm ausgewählt wird.
Dieser DNS für menschliches Wachstumshormon enthaltende Stamm wird in präparativen Mengen gezüchtet, worauf die menschliches Wachstumshormon codierende DNS aus dem Mikroorganismus isoliert und ihre Nucleotidsequenz bestimmt wird. Es wurde gefunden, dass die geklonte DNS für menschliches Wachstumshormon Nucleotide enthält, welche die gesamte Aminosäuresequenz menschlichen Wachstumshormons codiert. Die ersten 23 Aminosäuren des menschlichen Wachstumshormons sind HN-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-Arg-Leu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-Leu- -His-Gln-Leu. Der Rest der Sequenz ist in der folgenden Tabelle III gezeigt.
<Desc/Clms Page number 19>
Tabelle III
EMI19.1
<tb>
<tb> 24 <SEP> 34 <SEP> 40 <SEP> 43
<tb> Ala <SEP> Phe <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Gln <SEP> Glu <SEP> Phe <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Ala <SEP> Tyr <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Lys <SEP> Glu <SEP> Gln <SEP> Lys <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Gln <SEP> Asn <SEP> Pro <SEP> Gln
<tb> 5'-----G <SEP> GCC <SEP> TTT <SEP> GAC <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> CAG <SEP> CAG <SEP> TTT <SEP> GAA <SEP> GAA <SEP> GCC <SEP> TAT <SEP> ATC <SEP> CCA <SEP> AAG <SEP> GAA <SEP> CAG <SEP> AAG <SEP> TAT <SEP> TCA <SEP> TTC <SEP> CTG <SEP> CAG <SEP> AAC <SEP> CCC <SEP> CAG
<tb> 60
<tb> Thr <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Cys <SEP> Phe <SEP> Ser <SEP> Glu <SEP> Ser <SEP> Ile <SEP> Pro <SEP> Thr <SEP> Pro <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Asg <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Gln <SEP> Gln <SEP> Lys <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> ACC <SEP> TCC
<SEP> CTC <SEP> TGT <SEP> TTC <SEP> TCA <SEP> GAG <SEP> TCT <SEP> ATT <SEP> CCG <SEP> ACA <SEP> CCC <SEP> TCC <SEP> AAC <SEP> AGG <SEP> GAG <SEP> GAA <SEP> ACA <SEP> CAA <SEP> CAG <SEP> AAA <SEP> TCC <SEP> AAC <SEP> CTA <SEP> GAG <SEP> CTG <SEP> CTC
<tb> 80 <SEP> 100
<tb> Arg <SEP> Ile <SEP> Ser <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Ser <SEP> Trp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Pro <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ser <SEP> Val <SEP> Phe <SEP> Ala <SEP> Asn <SEP> Asn <SEP> Leu <SEP> Val <SEP> Tyr
<tb> CGC <SEP> ATC <SEP> TCC <SEP> CTG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> ATC <SEP> CAG <SEP> TCG <SEP> TGG <SEP> GTG <SEP> GAG <SEP> CCC <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> TTC <SEP> CTC <SEP> AGG <SEP> AGT <SEP> GTG <SEP> TTG <SEP> GCG <SEP> AAC <SEP> AAC <SEP> CTG <SEP> GTG <SEP> TAC
<tb> 120
<tb> Gly <SEP> Ala <SEP> Ser <SEP> Asp <SEP> Ser <SEP> Asn <SEP> Val <SEP> Tyr
<SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ile <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Leu <SEP> Met <SEP> Gly <SEP> Arg <SEP> Leu <SEP> Glu <SEP> Asp
<tb> GGC <SEP> GCC <SEP> TCT <SEP> GAC <SEP> AGC <SEP> AAC <SEP> GTC <SEP> TAT <SEP> GAC <SEP> CTC <SEP> CTA <SEP> AAG <SEP> GAC <SEP> CTA <SEP> GAG <SEP> GAA <SEP> GGG <SEP> ATC <SEP> CAA <SEP> ACG <SEP> CTG <SEP> ATG <SEP> GGG <SEP> AGG <SEP> CTG <SEP> GAA <SEP> GAC
<tb> 140
<tb> Gly <SEP> Ser <SEP> Pro <SEP> Arg <SEP> Thr <SEP> Gly <SEP> Gln <SEP> Ile <SEP> Phe <SEP> Lys <SEP> Gln <SEP> Thr <SEP> Tyr <SEP> Ser <SEP> Lys <SEP> Phe <SEP> Asp <SEP> Thr <SEP> Asn <SEP> Ser <SEP> His <SEP> Asn <SEP> His <SEP> Asp <SEP> Ala <SEP> Leu <SEP> Leu
<tb> GGC <SEP> AGC <SEP> CCC <SEP> CGG <SEP> ACT <SEP> GGG <SEP> CAG <SEP> ATC <SEP> TTC <SEP> AAG <SEP> CAG <SEP> ACC <SEP> TAC <SEP> AGC <SEP> AAG <SEP>
TTC <SEP> GAC <SEP> ACA <SEP> AAC <SEP> TCA <SEP> CAC <SEP> AAC <SEP> CAT <SEP> CAC <SEP> GCA <SEP> CTA <SEP> CTC
<tb> 160 <SEP> 180
<tb> Lys <SEP> Asn <SEP> Tyr <SEP> Gly <SEP> Leu <SEP> Leu <SEP> Tyr <SEP> Cys <SEP> Phe <SEP> Arg <SEP> Lys <SEP> Asp <SEP> Met <SEP> Asp <SEP> Lys <SEP> Val <SEP> Glu <SEP> Thr <SEP> Phe <SEP> Leu <SEP> Arg <SEP> Ile <SEP> Val <SEP> Gln <SEP> Cys <SEP> Arg <SEP> Ser
<tb> AAG <SEP> AAC <SEP> TAC <SEP> GGG <SEP> CTG <SEP> CTC <SEP> TAC <SEP> TGG <SEP> TTC <SEP> AGG <SEP> AAG <SEP> GAC <SEP> ATG <SEP> GAC <SEP> AAG <SEP> CTC <SEP> GAG <SEP> ACA <SEP> TTC <SEP> CTG <SEP> CGC <SEP> ATG <SEP> GTG <SEP> CAG <SEP> TGC <SEP> CGC <SEP> TCT
<tb> 191
<tb> Val <SEP> Glu <SEP> Gly <SEP> Ser <SEP> Cys <SEP> Gly <SEP> Phe
<tb> CTG <SEP> GAG <SEP> GGC <SEP> AGC <SEP> TGT <SEP> GGC <SEP> TTC <SEP> TAG <SEP> CTGCCCGGGTGGCATCCCTGTGACCCCTCCCCAGTGCCTCTCCTGGCC <SEP> -----
<SEP> 3' <SEP>
<tb>