DE2723463C3

DE2723463C3 - Verfahren zur Herstellung von 7-Aminocephem-Verbindungen

Info

Publication number: DE2723463C3
Application number: DE2723463A
Authority: DE
Inventors: Shinji Yokohama Kanagawa Miyado; Taro Yokohama Kanagawa Niida; Chuhei Yokohama Kanagawa Nojiri; Shigeo Tokyo Seki
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1976-05-24
Filing date: 1977-05-24
Publication date: 1981-09-24
Also published as: DE2723463A1; FR2352820B1; JPS52143289A; FR2352820A1; DE2723463B2; GB1566830A; CA1086668A; US4141790A

Description

COOH

in der X für eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen Thioschwefelsäurerest steht, dadurch gekennzeichnet, daß man auf Verbindungen der allgemeinen Formel II

HOOCCH(CHj)₃CONH

N
\

COOH

R,

in der

Ri ein Wasserstoffatom, eine niedrigmolekulare Alkanoylgruppe, eine Aryl-alkanoylgruppe, eine

25 Alkoxycarbonylgruppe, eine niedrigmolekulare Halogenalkoxycarbonylgruppe, eine Aroylgruppe, eine N-Arylcarbamoylgruppe oder eine Arylgiuppe,

Rj entweder ein Wasserstoffatom oder gemeinsam mit der Gruppe der Formel

R₁-N-

eine Pkthalimidogruppe un'd

X eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen Thioschwefelsäurerest

bedeuten,

oder auf deren Metallsalze oder Salze mit organischen Basen eine Kultur des Mikroorganismus Aspergillus sp. MA-13 (ATCC Nr. 20 491) und/oder des Mikroorganismus Alternaria sp. MA-133 (ATCC Nr. 20 492) oder ein aus der Kultur gewonnenes Sekundärpriiparat in Gegenwart eines wäßrigen Mediums einwirken läßt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen der allgemeinen Fonnel I

H₂N

CH₂X

in der X für eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen Thioschwefelsäurerest steht.

Nützliche Antibiotika der Cephalosporinreihe, wie beispielsweise Cefalotin, Cefaloridin oder Cefaloglycin, erhält man im allgemeinen durch Umwandlung des durch Fermentationsverfahren gebildeten Cephalosporins C in 7-Aminocephalosporansäure (die im folgenden auch als »7-ACA« bezeichnet wird), weiche Säure man chemisch in geeigneter Weise modifiziert. Daher ist die 7-Aminocephalosporansäure das wichtigste Ausgangsmaterial zur Herstellung dieser Cephalosporin-Antibiotika. Weiterhin tragen sowohl Cefoxitin, das als neues synthetisches Cephalosporin-Antibiotikum entwickelt wird und das aufgrund seiner bei Bewertungsuntersuchungen festgestellten ausgezeichneten Eigenschaften (siehe Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 5 [1974], 25) erhebliches Interesse findet, als auch Cefuroxim, das sich ebenfalls im Entwicklungszustand befindet Und ausgezeichnete Eigenschaften aufweist (siehe The journal of Antibiotics, Vol.29 [1976], 29) in der 3^Steliung Carbamoyloxymethylgruppen. Für die Synthesen dieser Verbindungen stellt die S-Desacetyl·?· ifnino-cephalösporansäure (im folgenden auch als »D-7-ACA« bezeichnet) ein besseres Ausgangsrnatefial dar- Die a-Desacetyl^amino-cephalosporansaure ist auch als Ausgangsmaterial für die Synthese von in der 3-Stellung substituierten Vinyl-cephalosporinen geeignet, die aufgrund ihrer starken antibakteriellen Wirkung auf gramnegative Bakterien (vgl. Journal of Medical Chemistry, Vol. 18 [1975], 986) allgemeines Interesse finden.
(I) Es sind bereits eine Reihe von Verfahren vorgeschla-

gen worden, mit denen die Desacylierung von Cephalosporin C in der 7-Stellung, die im folgenden der Einfachheit halber als »Desacylierung« bezeichnet wird, auf chemischem Wege erreicht wird, wobei diese Desacylierung tatsächlich mit Hilfe chemischer Verfahrensweisen in technischem Maßstab durchgeführt wird. Ein bekanntes Verfahren zur chemischen Desacylierung von Cephalosporin C ist beispielsweise das Iminohalogenid-Verfahren (siehe die veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. Sho-41-13 862). Dieses Desacylierungsverfahren umfaßt die folgenden Schritte: Schutz der Aminogr jppe des Cephalosporin C. Schutz der Carboxylgruppe. Umwandlung in das Iminochlorid, Umwandlung in den Iminoether, Desacylierung und Abspaltung der Schutzgruppe der Carboxylgruppe. Da dieses Verfahren eine Reihe von Schritten umfaßt, ist die Durchführung der aufeinanderfolgenden Verfahrensschritte sehr aufwendig und zeitraubend. Weiterhin wurde als Verbesserung des Iminohalogenid-Verfahrens das sogenannte Silylchlorid-Verfahren vorgeschlagen (vgl. die veröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. Sho-45-40 899). Dieses Verfahren ist im Vergleich zu dem Iminohalogenid-Veffahren dadurch vorteilhaft, daß es eine geringere Anzahl von Verfahfensschritten benötigt; es wirft jedoch weitere Proble* me auf, wie das Abkühlen auf Temperaturen von Unterhalb -^6O⁰C und die Anwendung kostspieliger Reaklionsvofrichlungen. Neben diesen Problemen leiden die chemischen Desaeylierurtgsverfähren an dem

weiteren Nachteil, daß es zur Erzielung hoher Ausbeuten erforderlich ist, hochreines Cephalosporin C als Ausgangsmaterial einzusetzen.

Die theoretische Möglichkeit der direkten Desacylierung von Cephalosporin C durch die Anwendung von Mikroorganismen oder Enzymen scheint aufgrund von Erfahrungen bei der Herstellung von 6-Amino-penicillansäure (6-APA) aus Penicillin gegeben zu sein. Es sind bislang jedoch noch keine Berichte über die Herstellung von 7-Amino-cephalosporansäure oder von 3-Desacetyl-7-amino-cephaIosporansäure ausgehend von Cephalosporin C in technischem Maßstab veröffentlicht worden. Es wird angenommen, daß dies eine Folge der Tatsache ist, daß in der 7-Stellung des Cephalosporins C eine spezifische Gruppe (das heißt die D-5-Amino-5-carboxy-pentanoylgruppe) vorhanden ist, was erwarten läßt, daß die enzymatisch bewirkte direkte Desacylierung schwierig oder nicht durchzuführen ist.

In der US-PS 32 39 394 ist ein Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephalosporansäure aus Cephalosporin C um?- Verwendung von Mikrobenzellen beschrieben. Dieseb Verfahren besteht darin, daß man Cephalosporin C mit den gezüchteten Zellen eines bestimmten Bakterienstammes aus der Gruppe der Genera Brevibacterium, Achromobacierium und Flavobacterium, behandelt, um eine Reaktionsmischung zu erhalten, die 7-Amino-cephalosporansäure und 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure enthält. Bei einem solchen Verfahren ist jedoch keine Verbesserung der Reaktionsausbeute aufgrund der Tatsache zu erwarten, daß die verwendeten Mikrobenstämme eine extrem geringe Desacylierungsaktivität besitzen und daß das eine Desacylierungsafctivität aufweisende Enzym auch eine /?-Lactamase-Wirkung enualtet, \ as zur Folge hat, daß die /?-Lactam ringe von sowohl Cephalosporin C als auch dem daraus gebildeten Produkt, ni ilich 7-Aminocephalosporansäure, gespalten werden.

Es wurde nun von der Anmelderin überraschenderweise gefunden, daß gewisse Mikroorganismenstämme, die zu den Genera Aspergillus oder Alternaria gehören, eine starke Desacylierungswirkung entfalten und dafür geeignet sind, aus Cephalosporin C oder seinen Derivaten 7-Amino-cephalosporansäure oder 3-Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure zu bilden. Die Erfindung beruht nun auf dieser überraschenden Erkenntnis. Das erfindungsgemäße mikrobiologische Desacylierungsverfahren besitzt gegenüber den herkömmlichen Verfahren eine Reihe von Vorteilen, beispielsweise den, daß lediglich eine einzige Verfahrensstufe erforderlich ist, daß das Verfahren einfacher und wirksamer durchgeführt werden kann, daß insbesondere keine Ausgangsmaterialien mit hoher Reinheit erforderlich sind, und daß nur geringe Vorrichtungskosten aufgewandt werden müssen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man auf Verbindungen der allgemeinen Formel II

HOOC C H(C HihCONH
N

R₂

60

COOH

in der

Ri ein Wässerstöffatöm, eine iiiedrigniölekulare Alks·, rioylgruppe, eine Aryl^alkäfioylgruppe, eine Alkoxy

65 carbonylgruppe, eine niedrigmolekulare Halogenalkoxycarbonylgruppe, eine Aroylgruppe, eine N-Arylcarbamoylgruppe oder eine Arylgruppe,
Rj entweder ein Wasserstoffatom oder gemeinsam mit der Gruppe der Formel

R₁-N-

eine Phthalimidogruppe und

X eine Hydroxygruppe, eine Acetoxygruppe oder einen Thioschwefelsäurerest

bedeuten,

oder auf deren Metallsalze oder Salze mit organischen Basen eine Kultur des Mikroorganismus Aspergillus sp. MA-13 (ATCC Nr. 20 491) und/oder des Mikroorganismus Alternaria sp. MA-133 (ATCC Nr. 20 492) oder ein aus der Kultur gewonnenes Sekundärpräparat in Gegenwart eines wäßrigen Mediums einwirken läßt

Der Einfachheit halber werden die 7-Amino-cephem-Verbindungen der allgemeinen Formel I im folgenden als »7-Amino-cephem -Verbindungen I« bezeichnet, während die Homologen des Cephalosporins C der allgemeinen Formel II als »Verbindungen II« bezeichnet werden.

Im folgenden sei zunächst ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der 7-Amino-cephem-Verbindungen I angegeben, die durch Behandlung von Cephalosporin C oder seinen Derivaten mit den gezüchteten Myzelen der oben beschriebenen Mikroorganismenstämme erhalten wurden; weiterhin sind einige experimentelle Ergebnisse angegeben, die mit den folgenden Methoden ermittelt wurden:

A) Methode zur quantitativen Bestimmung der
7-Amino-cephem-Verbindungen I

1. Für in organischen Lösungsmitteln lösliche Substrate

Reagentien:

Lösung A: 2%ige Lösung von Phenylacetylchlorid

in Aceton,
Lösung B: 5%ige wäßrige Natriumbicarbonatlö-

sung.

Man stellt 1 ml der Reaktionsmischung, die man durch das Behandeln der Substratlösung mit dem gezüchteten Myzel erhält, mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 2,5 und extrahiert (das heißt wäscht) zweimal mit gleichen Mengen Äthylacetat. Den Extrakt stellt man mit 1 n-Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 7, gibt bei O⁰C 0,6 ml der Lösung B zu und versetzt unmittelbar danach mit 2 ml der Lösung A. Die erhaltene Mischung wird während 60 Minuten bei O⁰C aufbewahrt. Anschließend untersucht man die antimikrobielle Wirkung der Reaktionsmischung mit Hilfe einer mikrobiologischen Untersuchungsmethode, Zu diesem Zweck führt man die Papiefscheibenmethode bei 37⁰C während 16 Stunden auf einer Analysenplatte durch, wobei man als Test-Mikroorganismus Bacillus sUbtilis ATCC 6633 verwendet. Getrennt davon bereitet man mit der authentischen 7'Amittö-cephen>Verbm' dung eine geeignete Anzahl von wäßrigen Lösungen

IO

unterschiedlicher Konzentrationen, die man in der oben beschriebenen Weise mU Phenylacetylchlorid umsetzt, worauf man das gebildete Reaktionsprodukt in der oben beschriebenen Weise auf seine antimikrobielle Wirkung untersucht So kann man die Menge der in der Probe der Reaktionsmischung vorhandenen 7-Amino-cephem-Verbindung mit Hilfe einer Eichkurve ablesen, die mit Hilfe der authentischen 7-Amino-cephem-Verbindung ermittelt wurde.

2. Für in organischen Lösungsmitteln unlösliche Substrate:

Reagentien etc.:

Papierchromatographie:

Filterpapier (Toyo Nr. 50 Filterpapier) der is Größe 2 cm χ 40 cm,
Lösungsmittelsystem:
Acetonitril/Wasser-Mischung (4/1).

hochspannungspapierelektrophorese:

Pufferlösung:

Ameisensäure/Essigsäure-Mischung (1 /4)
(der pH-Wert der Mischung beträgt 1,9),

Filterpapier: Toyo Nr. 51 Filterpapier

Spannung: 160 V/cm

Zeit: 30 Minuten 2s

Man trägt einen aliquoten Anteil der Reaktionslösung des Substrats und des Myzelins oder des Konzentrats davon auf das Filterpapier (Toyo Nr. 50) auf und entwickelt das Filterpapier bei Raumtemperatur nach jo der absteigenden Methode während 4 Stunden mit dem oben beschriebenen Lösungsmittelsystem. Anschließend wird das Filterpapier an der Luft getrocknet, worauf zwei 3 cm breite Streifen aus dem Filterpapier herausgeschnitten werden, und zwar von Stellen, die s> 7,5 cm bzw. 13,5 cm von dem Startpunkt des Filterpapiers entfernt sind, wobei diese Bereiche die Mitten der Streifen betreffen. Jeder der Ausschnitte wird gut mit 2 ml einer 0.05 rn-Phosphatpufferlösung (mit einem pH-Wert von 7) extrahiert, worauf man 1 ml des ·»<» Extrakts mit Phenylacetylchlorid umsetzt und dann die antimikrobielle Wirkung des Materials in der unter Ziffer 1 beschriebenen Weise bestimmt. In dieser Weise kann getrennt die quantitative Bestimmung von Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure (D-7-ACA). die ■»*> 7,5 cm vom Startpunkt entfernt vorliegt, und von 7-Amino-cephalosporansäure(7-,\CA), die 13,5 cm vom Startpunkt entfernt vorliegt, durchgeführt werden, woraus die Ausbeuten der entsprechenden Produkte errechnet werden können. w

Wenn das Substr?t ein Buntesalz des Cephalosporins C ist. das heißt eine Verbindung der allgemeinen Formel I. in der X für eine Gruppe der Formel -S-SOiM steht, in der M den Rest einer anorganischen oder organischen Base darstellt (siehe E. H. Flynn, ν Cephalosporins and Penicillins, Academic Press, New York and London [1972], 20), wird ein aliquoter Anteil der bei der Umsetzung der Verbindung mit den Zellen oder ihrem Konzentrat erhaltenen Lösung mit Phenylessigsäure in der oben beschriebener. Weise umgesetzt. m> Man trägt einen aliquoten Anteil der gebildeten Reaktionslösung auf das Filterpapier (Toyo Nr, 51) auf und führt eine Hochspannüngs^Papiefeleklröphörese durch. Anschließend trocknet man das Filterpapier und jchneidet einen 3 cm breiten Filterpapierstreifen in e>5 einer Entfernung von 6 cm von dem SfartpUnkt an der Anodenseite dei Filterpapiers heraus, wobei dieser Bereich die Mitte des Streifens darstellt. Dann wird der Ausschnitt extrahiert und es wird die untimikrobielle Wirkung des Extraktes in der oben beschriebenen Weise ermittelt. In dieser Weise kann m-απ quantitativ das Buntesalz der 7-Amino-cephaIosporansäure quantitativ über die antimikrobielle Wirkung des phenylacetylierten Derivates ermitteln.

B) Einige experimentelle Ergebnisse

Wie aus der folgenden Tabelle I hervorgeht, bilden sich durch die Desacylierung von Cephalosporin C mit dem Myzel-Enzym 7-Aminocephalosporansäure (7-ACA) und Desacetyl-7-amino-cephaIosporansäure (D-7-ACA). Weiterhin zeigt sich, daß die letztere Verbindung, das heißt die Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure, das überwiegende P-odukt darstellt. Dies beruht auf der Tatsache, daß in dem eine Desacylierungswirkung aufweisenden kultivierten Myzel neben dem desacylierenden Enzym ein ^cn/ym enthalten ist. das die Esterbindung der 3-Aceio-ygninpe de«. Cephalosporins hydrolysiert, das heißt eine Acetylesterase. Die Stärke der enzymatischen Wirkung dieser Acetylesterase variiert mn dem eingesetzten Miki^organismenstamm. Aspergillus sp. MA-13 zeigt eine starke enzymatische Wirkung dieses En/\ms. mit dem Ergebnis, daß vorzugsweise Desacetyl-7-amino-cephalosporansäure gebildet wird. Demgegenüber wem Alternaria sp. MA-133 nur ei.ie relativ schwache Aktivität dieses Enzyms auf. so daß 7-Aminocephalosporansäure bevorzugt gegenüber der Desacetyl-7-amino-cephalosporansaure gebildet w .rd

Weitet hin hat sich gezeigt, wie aus der folgenden Tabelle II hervorgeht, daß die gezüchteten Mvzele der oben beschriebenen Mikioorganismenstämme nicht nur eine desacylierende Wirkung auf die verschiedenen N-Derivate von Cephalosporin unter Bildung der entsprechenden 7-Amino-cephem-Verbindungen. sondern auch auf die Buntesalze des Cephalosporins C (das heißt die Derivate des Cephalosporins C. die einen Thioschwefelsäurerest in der 3-Stellung aufweisen) ausüben, wodurch die entsprechenden Buntesalze der 7-Amino-cephalosporansäure gebildet werden.

1. Man beschickt ein Reagenzglas mit 0.5 g (Naßgewicht) der Mikroorganismenkultur, die man durch Züchten der unten angegebenen Schimmelpilzstämme in der in Beispiel I beschriebenen Weise unter Verwendung des Mediums 1 oder des Mediums 2. wie sie in Beispiel 1 beschrieben sind, erhält und .-nit einer aliquoten Menge von 10 ml einer 0.5%igen wäßrigen Lösung des Natriu^salzes von Cephalosporin C (die einen pH-Wert von 7 aufweist) und versetzt die Lösung mit einer solchen Menge Natriumazid. daß sich eine Konzentration von 100 mg/ml ergibt. Man setzt di:n Inhalt des Reagenzglases um, indem man das Reagenzglas während 16 Stunden bei 28" C in einer Schüttelvorrichtung schüttelt. Anschließend filtriert man die Reaktionsmischung und unterzieht das Filtrat der quantitativen Bestimmung bezüglich 7'Amino=ce= phälospörarisäure und Desacefyl*7»atr)irii>-cephalosporansäure unter Anwendung der oben beschriebenen Methode 2. Die Ausbeulen der entsprechenden Produkte sind in der folgenden Tabelle I als Prozentsatz, bezogen auf die Menge des eingesetzten Substrates, angegeben.

Tabelle I

Mikfoüfgünismenslamm

Medium Ausbeute der 7-Amino-ccphem-Verbindungen

7-ACA D-7-ACA insgesamt

CM (%) CA)

Aspergillus sp. MA-13 2

(FERM-P3490 oder ATCC Nr. 20491)

Alternaria sp. MA-133 I

(FERM-P3492 oder ATCC Nr. 20492)

2. Man züchtet Aspergillus sp. MA-13 (FERM-P 3490) (ÄTCC Nr. 20 491) in der in Beispiel I beschriebenen Weise unter Anwendung des Mediums 2, das ebenfalls in Beispiel I erläutert ist. Die erhaltene Kultur des Schimmelpilzstamms setzt man mit verschiedenen Substraten während 16 Stunden bei 3Ö°C in der unter Ziffer I beschriebenen Weise um. Man filtriert die Reaktionsmischung und führt eine quantitative Bestimmung des Filtrats hinsichtlich der gebildeten 7-Amino-cephem-Verbindung unter Anwendung der oben beschriebenen Methoden I und 2 durch. Die Ausbeuten der als Produkt erhaltenen DesacetyI-7-amino-cephalosporansäure (D-7-ACA) sind in der folgenden Tabelle Il als Prozentsatz, bezogen auf die Menge des eingesetzten Substrats, angegeben.

Tabelle H

Substrat	Ausbeute an
	D-7-ACA
N-Formyl-cephalosporin C	12
N-(2-Chlora'thoxycarbonyi !-cephalo	11,5
sporin C
N-(p-Chlorbenzoyl)-cephalo-	8
N-Phenylcarbamoyl-cephalo-	8
sponn C
N-Phthaloyl-cephalosporin C	11
Desacetyl-cephalosporin-C-	18.5
Nalriumsalz
f ephalosporin-C-Buntesalz	5*)

15

jo

35

40

*) Als Produkt ?.rhalt man das entsprechende Buntesal/

55

Es ist festzuhalten, daß der wesentlichste Vorteil des erfindungsgemäßen Desacylierungsverfahrens unter Anwendung von Kulturen von Schimmelpilzen der oben beschriebenen Art oder den daraus bereiteten Sekundärpräparaten darin zu sehen ist. daß sich in dem Reaktionssystem nur wenig /?-Lactamase findet, die zu einer Spaltung des Lactamrings der als Substrat verwendeten Verbindungen II oder der daraus gebildeten 7-Amino-cephem-Verbindungen 1 führen würde, was zur Folge hat daß erfindungsgemäß in wirksamer Weise und mit hohen Ausbeuten die als Produkt erwünschten 7-Amino-cephem-Verbindungen I gebildet werden. In dieser Hinsicht ist das erfindungsgemäße Verfahren den herkömmlichen Verfahren, beispielswei

4,5

18.5
3

18,5
7,5

se den unter Anwendung von Bakterien durchgeführten Verfahren überlegen, bei denen der Nachteil der /3-Lactamaseaktivität besteht.

Aspergillus sp. MA-13

1 WarhsHim auf Afrar

Der Stamm bildet, wenn er auf Karloffel-Glucose-Agarplatten bei 26°C während 7 Tagen gezüchtet wird, eine Kolonie mit einem Durchmesser von 56 mm, dessen weißes Myzel sich radial ausbreitet. Die Kolonie zeigt ein samtiges Aussehen, wobei sich um das Zentrum des Myzels herum vereinzelt schwarze Sporen finden.

Züchtet man den Stamm in der oben beschriebenen Weise auf einer Agarplatte nach Czapeck, so bildet der Stamm eifv? Kolonie mit einem Durchmesser von 42 mm, die ein samtiges Aussehen zeigt. Um die Zentren des Myzels herum finden sich braungefärbte Sporen.

Die mikroskopische Untersuchung zeigt die folgenden morphologischen Eigenschaften: zusammen mit den ausgereiften Konidienköpfen tritt eine Vielzahl von dicht gepackten, braungetärbten Konidien mit einem Durchmesser von 30 bis 50 μηι auf. Die Konidiophoren besitzen eine Länge von 200 bis 300 μπι, die fast senkrecht stehen und an ihren Spitzen sphärische Vesikel mit einem Durchmesser von 3 bis 4 μΐη aufweisen. Die Sterigmen umfassen zwei Bereiche und die Konidien sind kugelförmig ohne Fortsätze und weisen einen Durchmesser von 3 bis 4 μΐη auf.

I. Knysioiogische Eigenschaften

Optimale Wachstumstemperatur:

Der Stamm wächst bei Temperaturen im Bereich von 15 bis 42° C. wobei die optimale Temperatur bei

etwa 35° C liegt.
Optimaler pH-Wert für das Wachstum:

Der Stamm kann bei pH-Werten im Bereich von 2 bis 8 wachsen, wobei der optimale pH-Wert im

Bereich von 3 bis 6 liegt
Nitrat-Anabolismustest:

Negativ

Aufgrund der oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften wurde der Stamm als zu dem Genus Aspergillus sp. gehörig identifiziert

Alternaria sp. MA-133
1. Wachstum auf Agar

Züchtet man den Stamm bei 26° C während 7 Tagen auf einer Kartoffel-Glucose-Agarplatte, so bildet er eine Kolonie mit einem Durchmesser von 40 mm, die an der Peripherie eine grünlich-schwarze Färbung aufweist Die Kolonie besitzt ein flauschiges baumwonartiges Aussehen und zeigt nur geringe Sporenbildung.

Züchtet man den Stamm in der oben beschriebenen Weise auf einer Agarplalte nach Czapeck, so bildet er eine Kolonie mit einem Durchmesser von 22 mm, die an der Peripherie grau-schwarz gefärbt ist und im Uhrzeigersinn gekräuselt ist. Um die Mitte der Kolonie herum findet sich eine dichte Ansammlung von hellbraun gefärbtem Myzel, das eine Sporenbildung zeigt.

Zyrihtct man den Stamm auf einem Medium, das aus Blättern von breitblättrigen Bäumen besteht, die auf Agar fixiert sind, so zeigt das Wachstum eine sehr aktive Sporenbildung. Die mikroskopische Untersuchung zeigt, daß vielzellige Konidien ziegelartigen Aufbaus tinzeln oder in Ketten vorliegen.

Die Sporen besitzen Abmessungen von 8 bis IO χ 15 bis 20 um und sind oval oder rotationselliptisch bzw. eiförmig geformt. In ausgereiftem Zustand zeigen sie deutliche geringfügige Vorsprünge an ihren Oberflächen und sehen so aus. als ob sie von eins bis drei Wänden kreuzwsiss gs'.eü! wären. Einig? Snnren besitzen vertikale Scheidewände. Neben diesen Sporen reigl sich auch die Bildung von ovalen Chlamydosporen, die rötlich-braun gefärbt sind.

2. Physiologische Eigenschaften

Optimale Wachstumstemperatur:

Der Stamm kann bei Temperaturen im Bereich von 5 bis WC wachsen, wobei die optimale Temperatur bei etwa 25" C liegt.

Für das Wachstum optimaler pH-Wert:

Der Stamm kann bei pH-Werten im Bereich von 3.5 bis 10 wachsen, wobei der optimale pH-Wert bei etwa 6 liegt.

Aufgrund der oben beschriebenen mikrobiologischen Eigenschaften wird der Stamm als dem Genus Alternaria sp. zugehörig identifiziert.

Die zwei Schimmelpilzstamme, deren mikrobiologische Eigenschaften oben angegeben sind, das heißt Aspergillus sp. MA-13 und Alternaria sp. MA-133 sind die ersten Mikroorganismen, von denen gefunden wurde, daß sie Cephalosporin C-Acylase bilden. Sie wurden bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, fapan. hinterlegt und haben die Hinterlegungsnummern FERM-P 3490 und 3492 erhalten. Die Stämme wurden auch bei der American Type Culture Collection, USA, unter den Hinterlegungsnummem ATCC 20 941 bzw. 20 942 hinterlegt.

Wie ganz allgemein bei anderen Mikroorganismen auch, unterliegen die oben beschriebenen Schimmelpilzstamme Veränderungen hinsichtlich ihrer Eigenschaften. Beispielsweise können künstliche Mutanten oder Varianten aus den Stämmen gebildet werden, beispielsweise durch Bestrahlen mit ultraviolettem Licht, mit lochfrequenten Wellen, mit radioaktiver Strahlung •der unter Verwendung von chemischen Mutagenen. Diese Mutanten und Varianten können bei dem trfindungsgemäßen Verfahren ebenso verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie zu der angestrebten Desacylierung fähig sind.

Bei der Herstellung der erwünschten 7-Ammo-ce- |>hem-Verbindungen I unter Anwendung der oben •rwähnten Schimmelpilzstämme läßt man vorzugsweise die durch Züchten dieser Mikroorganismen erhaltenen Kulturen oder die daraus bereiteten Sekundärpräparate unter Anwendung geeigneter Bedingungen auf die Verbindungen Π einwirken.

Zur Gewinnung der Kulturen kann man übliche Züehtungsmethaden anwenden, bei denen Kulturme dien verwendet werden, die Nährstoffe enthalten, die normalerweise Von Mikroorganismen angenommen werden. Als Nährstoffquellen kann man irgendwelche Materialien einsetzen, die ganz allgemein zur Züchtung von Mikroorganismen verwendet werden. Beispielsweise kann man als Kohlenstoffquelle Glucose, Saccharose, Stärke, Glycerin, Maissirup, Melassen und Sojaöl

ro verwenden. Beispiele für geeignete Slickstoffquellen sind: Sojabohnenmehl, Weizenkeime, Fleischextrakte, Pepton, Maiswasser, Trockenhefe, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat. Zusätzlich zu diesen Nährstoffen kann man in geeigneter Kombination jene Additive Verwenden, die das Wachstum der Mikroorganismen fördern und die für die Steigerung der Desacylicrungswirkung, das heißt für die Beschleunigung der Ausbildung der Cephalosporin C-Acylase-Aktivität erforderlich sind. Beispiele für solche Additive sind

?n Natriumchlorid. Kaliumchlorid. Calciumcarbonat, Phosphate und ähnliche anorganische Salze. Als Züchtungsverfahren kann man irgendein übliches Verfahren anwenden, dan für das Züchten von Mikroorganismen auf festen oder flüssigen Medien geeignet ist. Für die Herstellung in industriellem Maßstab ist die Anwendung von submersen Kulturen besonders geeignet.

Das Züchten erfolgt unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 37"C. Vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 28°C. Die Züchtungszeit hängt von anderen Züchtungsbedingungen ab. insbesondere der Züchtungsvorrichtung und der Zusammensetzung und der Temperatur des Mediums, wobei man die Bedingungen vorzugsweise derart auswählt, daß der Züchtungsvorgang zu dem Zeitpunkt unterbrochen wird, bei dem die Desacylierungswirkung der Kultur ihr Maximum erreicht. Beispielsweise beginnt im Falle von Aspergillus sp. MA-13 die Acylase-Aktivität am 3. Tag aufzutreten und erreicht ihr Maximum am 4. bis 5. Züchtungslag, wonach sie v/ieder

tty abnimmt, bis sie völlig verschwunden ist, obwohl dies in gewissem Maß von der Art und der Konzentration des Mediums abhängt. Im allgemeinen arbeitet man b-.i einer Züchtungszeit im Bereich von vorzugsweise 3 bis 7 lagen.

-i5 Wie bereits erwähnt, verwendet man die Kultur oder das daraus bereitete Sekundärpräparat zur Desacylierung der Verbindungen II. Der Ausdruck »aus der Kultur gewonnenes Sekundärpräparat« oder die dafür verwendeten iiuqivalenten Ausdrücke stehen für irgendwo ein Produkt, das man dadurch erhält daß man die Kultur in der Weise behandelt, daß man ein Produkt erhält, dessen Wirkungsgrad bezüglich der Bildung der gewünschten 7-Amino-cephem-Verbindungen I erhöht ist, mit anderen Worten, ein Produkt, das für die Bildung

is der gewünschten Verbindungen vorteilhaft ist. Somit kann man, da für die Desacylierung nach dem erfindunpsgemäßen Verfahren das Enzym von wesentlicher Bedeutung ist, das als »Cephalosporin C-Acyiase« bezeichnet wird, eine Vielzahl von Sekundärpräparaten

ω verwenden, die eine Cephalosporin C-Acylase-Aktivität aufweisen. Beispiele für solche Sekundärpräparate sind: das aus der Kulturbrühe gewonnene und gewaschene Myzel; zellfreie Extrakte, die man durch physikalische öder chemische Behandlung des Myzels erhält (beispielsweise die Zerkleinerungsprodukte, die man durch Vermählen oder durch Ultraschallbehandlung des Myzels erhält, und MyzeHysate, die man durch Behandeln mit oberflächenaktiven Mitteln oder Enzy-

men bildet); teilweise öder vollständig gereinigte Präparate des gewünschten Enzyms, die man durch Reinigen der zellfreien Extrakte mit Hilfe üblicher Enzymreinigungsmethoden erhält, beispielsweise durch * Aussalzen, durch fraktionierte Ausfällung, durch Dialy-

se, durch Gelfiltration Und durch Ionenaustausch- oder

Adsorptions-Chromatographie; Produkte mit desacylie-

render Wirkung, die man dadurch erhält, daß man das

- Enzym entweder physikalisch oder chemisch an

Wasserlösliche, hoehvnolekulare Substanzen bindet; und Produkte mit einer Fähigkeit zur Bildung der 7-Aniinocephenv Verbindungen I, die man dadurch erhält, daß man das gewaschene Myzel an Kieselgur oder wasserunlöslichen hochmolekularen Substanzen adsorbiert.

Die Herstellung der Verbindungen I aus den Verbindungen Ii durch Desacylierung unter Anwendung der beschriebenen Kulturen oder ihrer Sekundär-Präparate erfolgt im allgemeinen in einem wäßrigen Medium. Bevor genauer auf die Reaktionsbedingungen eingegangen wird, seien im folgenden einige der Eigenschaften des intrazellularen Enzyms angegeben, das man in der Kultur findet, das heißt des Enzyms »Cephalosporin C-Acylase«. Das Enzym übt seine besacylierungswirkung bei pH-Werten im Bereich von 6 bis 8 aus, wobei nur eine verminderte oder keine Wirkung bei pH-Werten von weniger als 5 oder höher ils 9 zu beobachten ist. Das Enzym arbeitet bei Temperaturen im Bereich von 28 bis 40⁰C und verliert ieine Aktivität bei Temperaturen von mehr als 50⁰C. Daher wird die enzymatische Reaktion vorzugsweise bei pH-Werten im Bereich von 6,5 bis 7,5 und bei Temperaturen im Bereich von 28 bis 40⁰C durchgeführt. Weiterhin kann die Aktivität des Enzyms durch Enzyminhibitoren, wie Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) inaktiviert werden.

Wenn die Kultur oder das daraus bereitete Sekundärpräparat in Wasser unlöslich ist, wird die Reaktion in einem System, das die Form einer Suspension hat. durchgeführt, wobei es von Vorteil ist, die Suspension in geeigneter Weise zu schütteln oder zu rühren. Alternativ kann man die Kultur oder das Sekundärpräparat in eine Säule einführen, so daß man die

durchführen kann, währenddem man eine wäßrige Lösung der Verbindung II durch die Säule führt. Die Reaktionszeit hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise der Substratkonzentration, der Aktivität des desacylierenden Enzyms und der Reaktionstemperatur, liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von 6 bis 60 Stunden. Es ist ratsam, mit Hilfe einer Voruntersuchung die Zeit zu bestimmen, die für die maximale Bildung der 7-Amino-cephera-Verbindung I erforderlich ist, und die Reaktionszeit auf der Grundlage des Ergebnisses dieser Voruntersuchung zu bestimmen. Die Substrätkonzenträtiön hängt überwiegend von der Stärke der Desacylierungswirkung ab, liegt jedoch im allgemeinen im Bereich von 0,1 bis 10%. Weiterhin ist es auch möglich, um eine Verunreinigung des Reaktionssystems während der Reaktion mit fremden Mikroorganismen zu verhindern, irgendein geeignetes Antikontaminationsmittel zu verwenden.

Die 7-Amino-cephem-Verbindungen I, die man durch Einwirkung der Kulturen der oben erwähnten Mikroorganismenstämme oder der daraus bereiteten Sekundärpräparate auf die Verbindungen II in Gegenwart eines Wäßrigen Mediums erhält, kann man mit Hilfe irgendwelcher bekannter Verfahren reinigen. Somit kann man das Endprodukt beispielsweise durch Ionenaustauschchromalographie, durch Säulenchromatographie oder durch isoelektrische Ausfällung reinigen.

ίο Man kann das Produkt auch in der Weise reinigen, daß man die letztendlich erhaltene Reakiionsmischung. gegebenenfalls im Verlaufe einer weiteren Reinigungsstufe, mit einer geeigneten organischen Säure umsetzt, so daß man ein Derivat des Endproduktes erhält, das

i>> man dann in ein wasserunlösliches Salz überführt, welches man mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert, oder das darin besteht, daß man das Endprodukt in eine für die anschließende Isolierung aus der Reaktionsmischung geeignete Form umwandelt.

Diese Reinigungsmethoden können natürlich in irgendeiner geeigneten KuiViutiiuiiCm angewandt werden.

Wenn nicht anders angegeben, sind die in den

folgenden Beispielen angegebenen Teile und Prozentteile auf das Gewicht bezogen, während das Verhältnis von Gewichtsteilen zu Volumenteilen sich so verhält.

wie Gramm zu Kubikzentimeter.

Beispiel 1

Man beschickt eine Säule mit einem Durchmesser von

ώ 4,2 cm und einer Höhe von 28 cm mit 8,7 g (Naßgewicht) der Myzelmasse, die man durch Züchten von Aspergillus sp. MA-13 (FERM-P 3490. ATCC Nr. 20 491) erhält. Man verbindet die untere und die obere öffnung der Säule miteinander unter Bildung eines geschlossenen

SS Reaktionssystems. Dann führt man von oben 200 ml einer 0,5%igen wäßrigen Lösung (mit einem pH-Wert von 7) des Natriumsalzes von Cephalosporin C mit einer Reinheit von 85% von oben nach unten durch die Säule Und zirkuliert das Material mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml pro Minute mit Hilfe einer Pumpe durch das geschlossene Reaktionssystem, wobei man sicherstellt, daß ein guter Kontakt der Substratlösung mit der Myzelmasse erfolgt. Man be>''ßt das RAaUtinnQcyctpm während 17 Stunden in einem Wasserbehälter, der bei einer konstanten Temperatur von 30⁰C gehalten wird. Anschließend trennt man die Myzelmasse von der Reaktionsmischung ab und wäscht sie mit Wasser. Man vereinigt die Reaktionslösung mit den Waschwässern, wobei sich ein Gesamtvolumen von 220 ml ergibt Die gebildete Lösung führt man durch eine mit 60 ml vernetzten! Dextran (DEAE-Sephadex®A-25 in der Chloridform) beschickte Säule. Die Saufe wird zunächst mit Wasser gewaschen und dann unter Anwendung eines ansteigenden Natriumchloridgradienten eluiert, dessen Konzentration von 0 bis 0.1 Mol pro Liter ansteigt, wobei man die D-7-AGA-Fraktionen auffängt Die vereinigten D-7-ACA-Fraktionen engt man ein und reinigt das Material durch isoelektrische Ausfällung, wobei man 90 mg 3-DesacetyI-7-amino-cephaIosporansäure mit einer Reinheit von 90% erhält Die Ausbeute an dieser Verbindung beträgt 18,1%, bezogen auf das eingesetzte Substrat

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von 7-Amino-cephem-Verbindungen der allgemeinen Formel I

H₃N

-CH₂X

(D

IO