DE2445581C3

DE2445581C3 - Verfahren zur Herstellung von D-Gluconsäure-dlactam

Info

Publication number: DE2445581C3
Application number: DE2445581A
Authority: DE
Inventors: Shigeharu Inouye; Taro Yokohama Niida; Tomizo Yokohama Niwa; Kazuo Fujisawa Saito; Takashi Shomura; Takashi Kawasaki Tsuruoka
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1973-09-25
Filing date: 1974-09-24
Publication date: 1978-04-20
Also published as: US3956337A; FR2244762A1; DE2445581A1; FR2244762B1; JPS5058287A; JPS5317677B2; CA1027888A; GB1482127A; DE2445581B2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Gluconsäure-o-lactam. D-Gluconsäure-o-lactam wird durch Oxydation von Nojirimycin mit reinen oder rohen Enzymen, die Glucose oxydieren, oder durch Einwirkung von Mikroorganismen, die fähig sind, Glucose oxydierende Enzyme zu bilden, hergestellt.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Gluconsäure-o-lactam der Formel C_nHuNOs

H -

CH₂OH
>- ___NH
H

HO

?^H

OH

aus Nojirimycin. Nojirimycin ist eine antibiotische Verbindung, die aus einem Kulturmedium von bestimmten Species von Streptomyces (vgl. T. N i i d a et al., J. Antibiotics, Ser. A 20, 62 [1967]) erhalten wird; die chemische Struktur wurde als 5-Amino-5-deoxy-D-glucopyranose bestimmt (vgl. S. Inouye et al. Tetrahedron, 24, 2125 [1968]). D-Gluconsäure-o-lactam dient nicht nur als konkurrenzfähiger Inhibitor für /?-Glucosidase (vgl. Agricultural and Biological Chemistry, 34,966 [1970]), sondern auch als Zwischenprodukt, das für die Synthese von verschiedenen Arten biologisch und physiologisch aktiver Substanzen wertvoll ist (vgl. japanische Patentanmeldungen 78 378/1973 und 76 577/ 1973).

Die chemische Oxydation von Nojirimycin zu D-Gluconsäure-o-lactam wurde bislang nach einem Verfahren durchgeführt, bei dem als Oxydationsmittel Hypo.iodsäure (vgl. Tetrahedron, 24, 2125 [1968]) und Hypobromsäure verwendet wurden. Wird dieses Verfahren jedoch in industriellem Maßstab für die Herstellung von D-Gluconsäure-Ö-Iactam durchgeführt, so ist es erforderlich, große Mengen an Jod oder Brom zu handhaben, was für den Menschen gefährlich ist, außerdem verursacht dieses Handhaben ernste Um- to weltverschmutzungsprobleme.

Die Anmelderin hat nun überraschenderweise gefunden, daß das D-Gluconsäure-(5-lactam leicht durch enzymatische Umsetzung von Nojirimycin mit Glucose oxydierenden Enzymen oder Mikroorganismen, die <<* Glucose oxydierende Enzyme bilden, erhalten wird.

Obgleich man angenommen hat, daß Nujirimycin als Inhibitor für Glucoseoxydase wirkt, da eine enge Ähnlichkeit zwischen Nojirimycin und Glucose in dei Molekülstruktur besteht, wird Nojirimycin im Gegen satz zu den Erwartungen als Substrat von Glucoseoxy dase zu D-Gluconsäure-Ö-Iactam oxydiert

Als Glucose oxydierende Enzyme sind Glucoseoxyda se und Glucosedehydrogenase bekannt Die erstere findet sich beispielsweise in einer im Handel erhältlicher rohen Enzympräparation (hergestellt von Nagasc Sangyo Co., Japan), die aus einer Kulturbrühe aui Penicillium amagasakiensis extrahiert wird; in einei Glucoseoxydasepräparatton (hergestellt von MiIe; Laboratory\ die aus Aspergillus niger extrahiert wird; ir einem rohen Enzym, welches durch Extraktion vor Penicillium notatum erhalten wird. Nojirimycin kanr überraschenderweise durch enzymatische Reaktion vor allen diesen Glucose oxydierenden Enzymen oxydier werden, wobei D-Gluconsäure-o-lactam erhalten wird.

Überraschenderweise wurde außerdem gefunden daß Nojirimycin durch Verwendung von Mik·. iorganis menzellen oxydiert werden kann, die eine Fähigkei besitzen, Glucose oxydierende Enzyme zu bilden, wöbe D-Gluconsäure-o-lactam in hoher Ausbeute erhaltet wird. Typische Mikroorganismen, die fähig sind, eir Glucose oxydierendes Enzym zu bilden, sind solche, di< bei der Gluconsäurefermentation vervendet werden. Ir diesem Fall ist das Enzym, welches an der Oxydationsre aktion teilnimmt, Glucosedehydrogenase. Es ist gu bekannt, daß Mikroorganismen, die Gluconsäun fermentieren, in Fungi und Bakterien vielfach vorkom men, wobei die ersteren beispielsweise Pilzfungi wi( Aspergillus, Penicillium und Rhizopus und die letzterer Acetobacter, Gluconobacter und Pseudomonas seir können.

Um Nojirimycin durch die Verwendung solchei Mikroorganismen zu oxydieren, ist es erforderlich, di< Mikroorganismen in üblicherweise verwendetem KuI turmedium zu kultivieren, welches Zucker, Proteine Aminosäuren und organische Salze enthält. Bevorzugt! Kulturmedien sind solche, die Glucose-Bouillon, Natri umglutamat und anorganische Salze enthalten. Dit Kulturtemperatur sollte im Bereich von 20 bis 37°C liegen und die Kulturzeit sollte, obgleich sie abhängij von dem Kulturverfahren einschließlich der Belüftung des Schütteins und der Oberflächenkulturen variiert bevorzugt im Bereich von 20 bis 70 Stunden liegen.

Die geernteten Mikroorganismen werden von dei Kulturbrühe abgetrennt und anschließend bevorzug mit einer anorganischen oder organischen Pufferlösunj gewaschen. Nojirimycin wird bevorzugt bei dei praktischen Anwendung in einer geeigneten Pufferlö sung, die neutral oder schwach alkalisch ist, in einei Konzentralion von 2 bis 20% gelöst. Die Zellenmenge die zu der Nojirimycinlösung zugegeben wird, is üblicherweise eine Menge, ausgedrückt durch da: feuchte Gewicht von '/2 bis I, bezogen auf das Gewich des Nojirimycins, damit die Oxydationsreaktion mi relativ hoher Geschwindigkeit abläuft. Die Oxydations reaktion wird bevorzugt bei einer Temperatur von 2( bis 40⁰C unter Schütteln oder Rühren durchgeführt. Die Umsetzung kann in einer Zeit von 1 bis 24 Stunder beendigt sein. Die geernteten Zellen können entwedei in feuchter Form oder in gewaschener Form öder if trockener oder gefrorener und getrockneter Forn verwendet werden. Die Zellen können auch wiedei verwendet werden, indem man sie aus dem Reaktionssy stern nach Beendigung der Umsetzung abtrennt.

Das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem di< Bakterien oder Funguellen für die Umwandlung vor

Nojirimycin in D-Gluconsäure-O-Iaetam verwendet werden, kann genau so allgemein durchgeführt werden, wie das Verfahren, bei dem Glucose oxydierende Enzyme oder rohe Enzympräparationen, die Glucose oxydierende Enzyme enthalten, für die Oxydation von Nojirimycin zu D-Gluconsäure-Ö-Iactam verwendet werden. Das heißt, eine wäßrige Lösung aus Nojirimycin wird zu einem Glucose oxydierenden Enzym oder einer rohen Präparation davon gegeben, während man bei einem pH-Wert von 5 bis 8 unter Luft-Strömungsbedingungen rührt Die Reaktionstemperatur liegt allgemein im Bereich von Zimmertemperatur bis ungefähr 60⁰C, bevorzugt bei 30 bis 40⁰C. Obgleich die Reaktionszeit mit den verwendeten Reaktionstemperaturen variieren kann, ist die Umsetzung im allgemeinen in einer Zeit von 10 bis 80 Stunden beendigt.

In jedem Fall wird die Reaktionslösung dann der Zentrifugentrennung unterworfen, um Zellen und Mycelia daraus abzutrennen, und das Filtrat wird dann durch eine Säule geleitet, die mit einem stark saurer. Ionenaustauschharz gefüllt ist, um nichtumgesetztes Nojirimycin zu entfernen. Anschließend wird die durchgelaufene Lösung mit einem basischen Ionenaustauschharz neutralisiert.

Wenn die Oxydationsreaktion mit hoher Leistung bzw. Ausbeute abläuft, wird die neutralisierte Lösung, so wie sie ist, einer Konzentrationsbehandlung unterworfen, um D-Gluconsäure-o-iactam in Form von Kristallen zu erhalten. Wenn die neutralisierte Lösung jedoch einige Verunreinigungen enthält, wird sie chromatographisch oder durch andere Maßnahmen gereinigt und anschließend konzentriert, wobei man das Lactam in Form von Kristallen erhält. Gewünschtenfalls können die Kristalle durch Umkristalli^ation uwter Verwendung eines Wasser-Alkohol-SyEtems *.ei>.er gereinigt werden. Die Ausbeute beim erfindungsgemäßen Verfahren liegt 10 bis 20% höher als bei dem bekannten chemischen Oxydationsverfahren.

D-Gluconsäure-Ö-Iactam ist ein Zwischenprodukt für die Synthese von 19-Glucuronicase-Inhibitor, D-Glucaro-o-lactam.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

100 ml eines sterilen, 2%igen Kyokuto-Bouillonkulturmediums in einem 500-ml-Sakaguchi-Kolben wurden mit Pseudomonas ovalis IFO 12051 inokuliert. Man kultivierte bei 28° C 42 Stunden, während der Kolben mit einer Reziprok-Schüttelvorrichtung geschüttelt wurde. Die geernteten Zellen wurden dann aus dem Kulturmedium durch Zentrifugieren isoliert und in 50 ml m/20 Phosphatpufferlösung (pH-Wert 7,5) dispergiert und anschließend wurde zentrifugiert, wobei man gewaschene Zellen erhielt.

0,9 g (Feuchtgewicht) der gewaschenen Zellen wurden zu 50 ml einer 2%igen Nojirimycin-Phosphatpufferlösung (m/20) bei einem pH-Wert von 7,5 gegeben und dann wurde bei 28⁰C 3,5 Stunden umgesetzt, während die Reaktionsmischung mit einer Reziprok-Schüttelvorrichtung geschüttelt wurde. Anschließend erfolgte eine Zentrifugentrennung. Die entstehende überstehende Lösung wurde durch eine 15-ml-Säule, die mit einem slark sauren Ionenaustauschharz gefüllt war, geleitet und anschließend wurde unter Verwendung eines basischen lonenaustauschharzes neutralisiert. Die so neutralisierte Flüssigkeit wurde auf ungefähr 5 ml bei vermindertem Druck eingeengt. Die eingeengte Lösung wurde in eine 85-ml-Aktivkohlesäule gegeben und mit Wasser entwickelt. Jeweils 5 ml der eluierten Fraktionen wurden der Papierchromatographie unterworfen (wobei die Entwicklung durch ein aufsteigendes

Verfahren unter Verwendung von Toyo-Filterpapier Nr. 50 — Toyo Roshi Co_n Japan, erfolgte und man eine Mischung aas n-Butanol, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 3:1:1 verwendete). Der Rf-Wert von D-Gluconsäure-O-Iactam wurde zu 0,3 bestimmt

ίο und das Material wurde als D-Gluconsäure-o-lac-am identifiziert, Fp. 203 bis 205⁰C, [ä]d= +63°. Die so identifizierten Fraktionen wurden bei vermindertem Druck eingeengt, wobei man 430 mg Kristalle erhielt.

Beispiel 2

Ein steriles Kulturmedium mit einem pH-Wert von 6,8, welches 0,2% Natriumglutamat, 0,2% K₂HPO₄, 0,01% MgCl₂, 0,001% FeSO₄, 2% Saccharose, 0,5% Pepton und 0,2% Hefeextrakt enthielt, wurde mit einer

2Q Platinschleife mit Gluconobacter suboxidans IAM 1829 inokuliert Man kultivierte bei 28°C während 42 Stunden in einer Rohrschüttelvorrichtung. Zehn Kulturmedien (100 ml) der gleichen Zusammensetzung, wie oben erwähnt, wurden mit den so erhaltenen kultivierten Zellen in einer Menge von 1 ml inokuliert. Das Kulturmedium war sterilisiert, man arbeitete in 500-ml-Sakaguchi-Kolben. Die so inokulierten Zellen wurden bei 28°C 43 Stunden unter Verwendung einer Reziprok-Schüttelvorrichtung kultiviert, anschließend wurde mittels Zentrifugieren getrennt und dann mit einer Phosphatpufferlösung gewaschen, wobei man 5.5 g (Feuchtgewicht) gewaschene Zellen erhielt.

5 ml einer 2%igen Nojirimycinlösung (mit einem pH-Wert von 7,5 und einer Konzentration von m/20, hergestellt unter Verwendung einer Phosphatpufferlösung) wurden in je fünf Sakaguchi-Kolben gegeben. Dazu gab man jeweils 0,9 g (Feuchtgewicht) der gewaschenen Zellen für die Umsetzung mit dem Nojirimycin. Man schüttelte bei 28°C 3 Stunden mit einer Reziprok-Schüttelvorrichtung. Die entstehende Reaktionslösung wurde zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit durch eine Säule aus einem stark sauren Ionenaustauschharz gewaschen. Anschließend wurde mit einem basischen Ionenaustauschharz neutralisiert. Die so neutralisierte Lösung wurde bei vermindertem Druck konzentriert und im Vakuum getrocknet, wobei man 3,76 g kristallines D-Gluconsäure-o-lactam erhielt.

_so Beispiel 3

Aspergillus niger IAM 2094, Rhizopus delemer IAM 6015 und Gluconobacter suboxidans ATCC Nr. 621 wurden nacheinander mit Nojirimycin entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 umgesetzt, wobei man das Kulturmedium von Beispiel 1 und 1 g Nojirimycin verwendete. Die Ausbeuten an D-Gluconsäure-o-lactam sind in Tabelle I angegeben.
Tabelle I

Oxydation von Nojirimycin durch Zellen von bete stimmten Fungi- und Bakterienspecies.

Menge Kon/-, a. Ausbeute an
der Nojirimy- D-Glueonsaiire-Zcllcn ein (5-lactam

Aspcrgilkis nigcr
IAM 2094

g
1.1

2,0

12.4

Fortsetzung

Menge Kon/, a.
der Nojirimy-/.ellcn ein

u %

Ausheule un

D-Cilueonsiiure-

(5-lactiim

Rhizopus delemer 1,0 2,0 33.3

IAM 6015

Gluconobacter 0,9 4,0 57,2

suboxidans

ATCCNr. 621

dto., wieder- 0,8 2,0 22,0

verwendet

Gefrorene und 0,2 2,0 49,1

getrocknete Zellen

von Gluconobacter

suboxidans

ATCC Nr. 621

Beispiel 4

300 g Nojirimycin werden in 1,5 1 destilliertem Wasser gelöst; dazu gibt man 80 g eines rohen Enzympräparates (aus Glucoseoxydase mit 10 000 E/mg (E = Einheiten), hergestellt durch Penicillium amagasakiensis). Der pH-Wert der Reaktionsmischung wird auf 6,0 eingestellt, und dann wird die Umsetzung bei 30°C in einem 30-l-Flaschenfermentor unter Rühren (bei 300 U/min) unter Luft-Strömungsbedingungen durchgeführt. 65 Stunden nach der Umsetzung wurde die Reaktionslösung durch eine Säule, die mit 1,5 I eines stark sauren lonenaustauschharzes gefüllt war, geleitet. Die Säule wurde mit 7 I Wasser gewaschen. Die so durchgeleitete Lösung und die Waschlösungen wurden zusammen vereinigt (22 I) und dann wurde mit einem basischen Ionenaustauschharz neutralisiert. Anschließend erfolgte eine Entfärbungsbehandlung unter Verwendung von 50 g Kohlepulver. Die so entfärbte Lösung wurde, so wie sie war, konzentriert. Zu der so konzentrierte.) Lösung (500 ml) fügte man 100 ml Methanol, dann wurde gekühlt, wobei man Kristalle erhielt. Die Kristalle ίο wurden abfiltriert. Man erhielt 220 g D-Gluconsäure-älactam in Form von nadelartigen, farblosen Kristallen (Ausbeute 77%).

Beispiel 5

is 301 eines flüssigen Kulturmediums (pH-Wert eingestellt auf 7,0), welches 2,0% Stärke, 2,5% Sojabohnenpulver, 1,0% Weizenkeime, 0,5% Pepton und 0,25% Natriumchlorid enthielt, wurde unter Verwendung eines Flaschenfermentors mit Penicillium notatum IFO 4640 inokuliert. Man kultivierte bei 28° C während 72 Stunden, während man unter Lu.c■Strömungsbedingungen rührte. Nach dem Kultivieren .vurde die Lösung filtriert, wobei man 151 Filtrat erhielt. Zu dem Filtrat fügte man 2 Volumina gekühltes Aceton -ind dann wurde die Reaktionsmischung bei 5°C stehengelassen. Der Niederschlag wurde abfiltriert. Der so abgetrennte Niederschlag wurde in 500 ml Wasser gelöst, dann wurde zentrifugiert, um unlösliches Material zu entfernen. Zu der überstehenden Lösung fügte man 10 g Nojirimycin und setzte bei 35°C während 5 Stunden unter Rühren um. Die Reaktionslösung wurde wie in Beispiel 4 beschrieben, behandelt, wobei man 3,2 g nadelartige, farblose Kristalle aus D-Gluconsäure-n-lactam erhielt (Ausbeute 32%).

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von D-Gluconsaure-olactam durch Oxydation von Nojirimycin, dadurch gekennzeichnet, daß man Nojirimycin (5-Amino-5-deoxy-D-gIucose) der Einwirkung eines Glucose oxydierenden Enzyms oder eines Mikroorganismus, der fähig ist, ein Glucose oxydierendes Enzym zu bilden, bei pH-Werten von 5 bis 8 und einer Temperatur zwischen Zimmertemperatur und ungefähr 6O⁰C aussetzt.