DE2625843A1

DE2625843A1 - Neue peptide, deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel

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Publication number: DE2625843A1
Application number: DE19762625843
Authority: DE
Inventors: Andrew Victor Prof Schally
Original assignee: COY DAVID HOWARD PROF
Current assignee: COY DAVID HOWARD PROF
Priority date: 1975-06-12
Filing date: 1976-06-09
Publication date: 1976-12-23
Also published as: HK61079A; DE2625843C2; AU500087B2; SE427031B; FR2313940B1; FR2313940A1; NZ181036A; CH615662A5; CA1067487A; SE7606692L; AU1452476A; GB1535602A; JPS6022720B2; CA1065859A; BE842857A; JPS5231073A

Description

PATENTANWÄLTE O Γ* O C O / O !

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER ΔΌΔΟΟΗΟ j

DR.-ING. WOLFRAM BUNTE !

DR. WERNER KINZEBACH ,

D-8OOO MÜNCHEN 4O. BAUERSTRASSE 22 ■ FERNRUF (Ο89) 37 OS 83 · TELEX 8215208 I8AR D I POSTANSCHRIFT: D-800O MÜNCHEN 43. POSTFACH 7βΟ

M/17 132

ANDREW VICTOR SCHALLY, -q HlNl 1976

2500 Whitney Place, Apt.319 ^Λ
Metairie, Louisiana/USA

DAVID HOWARD COY

4319 Perrier Street, New Orleans

Louisiana/USA

Neue Peptide, deren Herstellung
und diese enthaltende Arzneimittel

Die Erfindung betrifft Peptide der Formel I

(pyro)-Glu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z I j

a) X = Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NH₂; oder

b) X = Ser, Y = D-Phe und Z = GIy-NH₂; oder ;

c) X = D-Ser, Y = D-Leu und Z = NHR¹, worin
R = niedrig-Alkyl,

und Zv/ischenprodukte zu deren Synthese. . j

Die Peptide der Formel I, worin

a) X = Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NH₃; oder

b) X = Ser, Y = D-Phe und Z = GIy-NH₂; oder J

c) X= D-Ser, Y = D-Leu und Z = NHR¹ '

i werden auch bezeichnet mit jeweils ^!

a) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L- ;

tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid; oder

b) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L- ,

tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl- | glycinamid; oder

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c) L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-D-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyl-niedrigalkylamid

und können mit der Abkürzung a) [D-Trp⁶]-LH-RH;

b) [D-Phe⁶]-LH-RH; bzw.

c) [D-Ser,D-Leu ,desGly-NH- ]-LH-RH-(niedrig-alkyl)-amid bezeichnet werden.

Sowohl das luteinisierende Hormon (LH) als auch das Follikelstimulierende Hormon (FSH) sind gonadotrope Hormone, die von der Hypophyse von Mensch und Säugetieren produziert werden. LH stimuliert zusammen mit FSH die Freisetzung von Östrogenen aus den reifenden Follikeln in den Ovarien und induziert im weiblichen Organismus den Ovulationsprozeß. Im männlichen Organismus stimuliert LH die interstitiellen Zellen bzw. die Leydig¹sehen Zwischenzellen und wird daher auch interstitielle Zellen stimulierendes Hormon (ICSH) genannt. FSH induziert die Reifung der Follikel in den Ovarien und spielt zusammen mit LH eine bedeutende Rolle beim Zyklus des weiblichen Organismus. FSH fördert die Entv/icklung der Keimzellen der männlichen Hoden. Sowohl LH als auch FSH werden von der Hypophyse durch Einwirkung des LH- und FSH-freisetzenden Hormons freigesetzt, und es bestehen deutliche Hinweise darauf, da3 dieses freisetzende Hormon im Hypothalamus gebildet wird und die Hypophyse auf neurohumoralem Wege erreicht, vergl. z.B. A.V. Schally et al., Recent Progress in Hormone Research, 24_, 497 (1968).

Das natürliche LH- und FSH-freisetzende Hormon wurde aus dem Hypothalamus von Schweinen isoliert, und seine Struktur wurde von A.V. Schally et al., Biochem.Res.Commun., 43_, 393 und 1334 (1971) untersucht, der die Decapeptid-Struktur

(pyro)-GIu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHp vorschlug.

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Diese Struktur hat sich durch Synthese bestätigt, vergl. beispielsweise H. Matsuo et al., Biochem.Biophys.Res.Comm., 45, 822 (1971) und R. Geiger et al-, ibid., 45., 767 (1971).

Im folgenden wird das natürliche LH- und FSH-freisetzende Hormon LH-RH genannt.

Auf Grund der Bedeutung von LH-RH sowohl in der diagnostischen als auch in der therapeutischen Medizin besteht ein beträchtliches Interesse an der Herstellung neuer Verbindungen mit im Vergleich mit dem natürlichen Hormon verbesserten Eigenschaften. Eine Annäherung an dieses Ziel war die selektive Modifikation oder der selektive Ersatz von Aminosäureresten des LH-RH durch andere Aminosäuren. Obwohl sich in einigen wenigen Fällen Peptide mit derartigen Änderungen als aktiver erwiesen haben als LH-RH, beispielsweise [D-Ala ]-LH-RH, A. Arimura et al., Endocrinology, 95_, 1174 (1974), [D-Leu⁶]-LH-RH und [D-Leu⁶,desGly-NH₂ ¹⁰]-LH-RH-äthylamid, J.A. Vilchez-Martinez et al., Biochem.Biophys.Res.Commun., 59, 1226 (1974), haben sich in den meisten Fällen modifizierte Peptide als weniger aktiv erwiesen.

Es wurde nunmehr gefunden, daß

a) der Ersatz des Glycylrests in der 6-Stellung von LH-RH durch D-Tryptophan; oder

b) der Ersatz des Glycylrests in 6-Stellung von LH-RH durch D-Phenylalanin; oder

c) der Ersatz des L-Serylrests in 4-Stellung von LH-RH durch einen D-Serylrest, Ersatz des Glycylrests in 6-Stellung durch einen D-Leucylrest und Ersatz des Glycinamidrests in ΙΟ-Stellung durch eine niedrig-Alkylamidgruppe,

zu einem Peptid der Formel I führt, das wesentlich aktiver und länger wirksam ist als LH-RH.

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Ιί/ΐ7 132 - 4 -

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wurde gefunden, daß die Änderung der Asymmetrie des Serylrests in 4-Stellung zusammen mit der Einführung eines D-Leucylrests in der 6-Stel— lung zu einer erhöhten Wirksamkeit und verlängerten Wirksamkeitsdauer des Peptids der Formel I führt, worin X = D-Ser, Y = D-Leu und Z = NHR , was überraschend ist, insbesondere, da im allgemeinen eine Änderung der Asymmetrie der Aminosäurereste von LH-RH und/oder ein Ersatz davon zu einem Derivat führt, das wesentlich weniger v/irksam ist als LH-RH selbst; vergl. beispielsweise Y. Hirotsu, Biochem.Biophys. Res.Cotnmun., 5_9_, 277 (1975). In diesem Zusammenhang hat es sich auch gezeigt, daß [D-Ser j-LH-RH weniger als 5 % der LH-RH-Aktivität des natürlichen Hormons aufweist.

Die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide der Formel I sind von praktischer Bedeutung. Die geringere minimal wirksame Dosis verringert Nebenwirkungen sowie die Kosten zur Her-stellung der Verbindung, und die längere Wirkungsdauer verringert die Notwendigkeit mehrfacher Verabreichung.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind ausgewählt aus der Gruppe der Verbindungen der Formel I

(pyro)-Glu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z I worin

a) X = Ser, Y = D-Trp und Z= GIy-NH₂; oder

b) X = Ser, Y = D-Phe und Z = GIy-NH₉; oder

c) X = D-Ser, Y = D-Leu und Z = NHR , worin

R = niedrig-Alkyl,

oder einem nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen bzw. verwendbaren Salz davon;

einer Verbindung der Formel II

R⁸-(pyro)-Glu-His(N^-R⁷)-ΤΓρ-Χ^α-αγΓ (R⁵) -Y-Leu-Arg(N^G-R⁴ )-Pro-Z¹ worin

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a) X¹ = Ser(R⁶)[ Y = D-Trp und Z¹ = GIy-R²; oder

b) X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Phe und Z¹ = GIy-R²; oder

c) X¹ = D-Ser(R⁶), Y = D-Leu und Z¹ = OR³, worin

2 3

R = Amino oder O-(niedrig-Alkyl), R = niedrig-Alkyl, R , R , R und R = Schutzgruppen, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen abgespalten werden können, die das Molekül (pyro )-Glu-His-Trp-X.-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z, worin X, Y und Z wie vorstehend definiert sind, nicht angreifen,

und R = Wasserstoff oder eine der Schutzgruppen; und Verbindungen der Formel

R^CpyroJ-Glu-His-Trp-D-SeriR⁶) -Tyr( R⁵)-D-Leu-Leu-Arg(N^G-R⁴)-Pro-NHR¹

worin R = niedrig-Alkyl, R¹, R , R und R = Schutzgruppen, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen entfernt werden können, die das Molekül
(pyro)-Glu-His-Trp-D-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHR nicht an-

greifen, und R = Wasserstoff oder eine dieser Schutzgruppen.

Gemäß einer bevorzugten Ausfuhrungsform sind in den Verbindungen der Formel II und der Verbindung der Formel

R⁸-^>yiX))-Glu-4iLs-Itp-D-Ser(R⁶ )-Tyr( R⁵)-D-Leu-Leu-Arg (N^G-R⁴ )-Pro-NHR ¹

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R₁R und R wie vorstehend definiert, R = eine Schutzgruppe für die N -, Ν^ω- und N ^ω -Stickstoffatome des Arginins, ausgewählt aus der Gruppe von Tosyl, Nitro, Benzyloxycarbonyl und Adamantyloxycarbonyl; R = eine Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Tyrosin, ausgewählt aus der Gruppe von 2-Brombenzyloxycarbonyl, Benzyl, Acetyl, Tosyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Tetrahydropyran-2-yl, Trityl, 2,4-Dichlorbenzyl und Benzyloxycarbonyl; R = eine Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe des Serins,

5 7

ausgewählt aus der vorstehend für R definierten Gruppe; R = eine Schutzgruppe für die Imidazol-Stickstoffatome des Histidins, ausgewählt aus der Gruppe von Tosyl und Dinitrophenyl; und R = Wasserstoff oder eine α-Amino-Schutzgruppe, ausgewählt aus der Gruppe von tert.-Butyloxycarbonyl, Benzyl'oxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl und d-Isobornyloxy-

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H 132 carbonyl.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung betrifft Zwischenprodukte, die an einen festen Harzträger gebunden sind. Diese Zwischenprodukte werden durch die Formeln

R⁸- (pyro)-GIu-His (N^Irn-R⁷)-Trp-X^Tyr (R⁵ )-Y-Leu-Arg(N^G-R⁴)-Pro-Z², R⁹-Hi s(N^Im-R ⁷)-Trp-X^a-Tyr(R⁵)-Y-Leu-Arg(N^G-R⁴)-Pro-Z², R⁹-Trp-X¹-Tyr(R⁵)-Y-Leu-Arg(N^G-R⁴)-Pro-Z² und R⁹_X¹_Tyr(R⁵)-Y-Leu-Arg(N^G-R⁴)-Pro-Z² dargestellt, worin

a) X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Trp und Z² = GIy-A; oder

b) X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Phe und Z² = GIy-A; oder

c) X¹ = D-Ser(R⁶), Y = D-Leu und Z² = A¹;

worin R , R , R , R und R wie vorstehend definiert sind,

R = eine dem Fachmann für die stufenweise Synthese von Polypeptiden bekannte a-Amino-Schutzgruppe - geeignete Gruppen sind nachfolgend aufgeführt - und A und A = Verankerungsbindungen, die bei der Synthese im festen Zustand angewendet werden, gebunden an einen festen Harzträger. A wird ausgewählt aus der Klasse von:

Harz-¹ Iträger)

und 0

und

A¹ = 0

CH,

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Der hier verwendete Ausdruck "niedrig—Akyl" soll Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bezeichnen und umfaßt Methyl, Äthyl, Propyl und Isopropyl.

N = die Seitenketten-Stickstoffatome von Arginin.

Tm '

N = die Imidazöl-Stickstoffatome von Histidin. Das Symbol f& bedeutet "Phenyl".

Im allgemeinen basieren die hier verwendeten Abkürzungen zur Bezeichnung der Aminosäuren und Schutzgruppen auf den Empfehlungen der IUPAC-IUB-Kommission für die biochemische Nomenklatur, vergl. Biochemistry 1Λ, 1726 (1972). Beispielsweise t-Boc = tert.-Butyloxycarbonyl, Z = Benzyloxycarbonyl, Tos = Tosyl, 2-Br-Cbz = 2-Brombenzyloxycarbonyl, BzI = Benzyl und Dnp = 2,4-Dinitrophenyl. Die hier für die verschiedenen Aminosäuren verwendeten Abkürzungen sind Arg = Arginin, GIy = Glycin, His - Histidin, Leu = Leucin, Pro = Prolin, (pyro)-Glu = 5-Oxoprolin (Pyroglutaminsäure), Ser = Serin, Trp = Tryptophan und Tyr = Tyrosin. Alle hier beschriebenen Aminosäuren gehören der L-Reihe an, falls nicht anders angegeben, d.h. D-Ser = ein D-Serylrest, D-Leu = ein D-Leucylrest, D-Phe = ein D-Phenylalanylrest und D-Trp = ein Tryptophylrest.

Die erfindungsgemäßen Peptide der Formel I können in Form von Säureadditionssalzen erhalten werden. Beispiele für solche Salze sind die Salze mit organischen Säuren, z.B. Essigsäure, Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure oder ToluolsuIfonsäure, sowie polymere Säuren, wie Gerbsäure bzw. Tannin oder Carboxymethylcellulose, und Salze mit anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäuren, z.B. Chlorwasserstoffsäure,oder Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Gegebenenfalls kann ein spezielles Säureadditionssalz in ein anderes Säureadditionssalz, z.B. ein Salz mit einer nicht-toxischen, pharmazeutisch verträglichen Säure, durch Behandlung mit dem entsprechenden lonenaustauscher-

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harz nach der von R.A. Boissonnas et al., Helv.Chim.Acta, 43, 1349 (1960) beschriebenen Weise umgewandelt werden. Geeignete Ionenaustauscherharze sind Kationenaustauscher auf Cellulosebasis, beispielsweise Carboxymethylcellulose, oder chemisch modifizierte quervernetzte Dextran-Kationenaustauscher, beispielsweise solche vom Sephadex C-Typ, und stark basische Anionenaustauscherharze, beispielsweise die von J.P. Greenstein und M. Winitz in "Chemistry of the Amino Acids", John Wiley and Sons, Inc., New York und London, 1961, Band 2, Seite 1456 aufgeführten.

Die Peptide der Formel I und ihre Salze besitzen wertvolle lang-wirksame LH- und FSH-freisetzende Hormon-Wirksamkeit.

Die wertvollen LH- und FSH-freisetzende Hormon-Wirksamkeit und die langanhaltende Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen sind aus pharrnakologischen Standard-Unter suchungen ersichtlich. Beispielsweise können diese Wirksamkeiten durch von A. Arimura et al., Endocrinology, 9J5_, 1174 (1974) beschriebenen Untersuchungen veranschaulicht v/erden. Beispielsweise zeigen nach der dort beschriebenen Arbeitsweise LH-Freisetzungs-Ergebnisse, die an Ratten erzielt wurden, denen eine Dosis von (50 ng,subkutan)der Verbindung verabreicht wurde, daß die Peptide der Formel I Spitzenaktivitäten etwa 2 Stunden nach der Dosierung aufweisen und daß noch nach bis zu 6 Stunden eine beträchtliche Wirksamkeit vorliegt. Dagegen wird bei der gleichen Dosis von LH-RH (50 ng, subkutan) eine Spitzenaktivität nach etwa 15 Minuten erzielt, und nach 1 Stunde können keine Wirkungen der Injektion mehr beobachtet werden. Auch integrierte Mengen von LH während einer Zeitdauer von 6 Stunden zeigen, daß die Verbindungen der Formel I [D-Ser ,D-Leu ,des-Gly-NH- J-LH-RH-äthylamid, [D-Phe J-LH-RH und [D-Trp J-LH-RH 21-, 20- bzw. 12-mal aktiver bei der Freisetzung von LH sind als LH-RH. Die FSH-Freisetzungs-Daten nach Injektionen der Verbindungen der Formel I zeigen, daß [D-Ser⁴,D-Leu⁶,desGly-NH₂ ¹⁰J-LH-RH-äthylamid, [D-Phe⁶]-LH-RH und [D-Trp⁶J-LH-RH etwa 11-, 20- bzw. 20-mal aktiver sind als LH-RH bei der gleichen Dosie-

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rung (50 ng).

Darüber hinaus kann die Wirksamkeit einer Verbindung der Formel I am Menschen demonstriert v/erden:

Radioirnmun-Unt er suchung en von Serumgehalten von LH nach intranasaler Verabreichung zeigen, daß die minimal wirksame Dosis von LH-RH etwa 2,0 mg beträgt, wohingegen eine äquivalente Wirksamkeit mit einer Dosis von 0,5 ng [D-Trp J-LH-RH erzielt wird. Hierbei werden die Verbindungen an Menschen in einer normalen Salzlösung verabreicht. Im Hinblick auf die FSH-Freisetzung beim Menschen ergeben vergleichende Untersuchungen von LH-RH'und [D-Trp J-LH-RH besonders bemerkenswerte Ergebnisse. Die intranasale Verabreichung von bis zu 2,0 mg LH-RH hat eine geringe oder gar keine Auswirkung auf die durch Radioimmun-Untersuchung gemessenen FHS-Serum-Gehalte, H.Go Dahlen et al., Horm.Metab.Res., 6_, 510 (1974). Jedoch setzen unter den gleichen Bedingungen 0,5 mg [D-Trp J-LH-RH beträchtliche Mengen an FSH frei, d.h. Mengen im Bereich von 0,3 bis über 1,5 miu/ml. Es ist ersichtlich, daß eine Verbindung, die dazu geeignet ist, FSH wirksam freizusetzen, viele therapeutische Anwendungsmöglichkeiten besitzt, vergl. beispielsweise H.G. Dahlen et al., a.a.O.

Die LH- und FSH-Freisetzungs-Eigenschäften der Peptide der Formel I, die ihrerseits die Ovulation bei Tieren bewirken, machen die Peptide für die veterinärmedizinische Praxis sowie für die Viehzucht wertvoll. Es kann oft erwünscht sein, die Brunstperiode in Viehhaltungen, beispielsweise bei Rindern, Schafen oder Schweinen, synchron ablaufen zu lassen, entweder, um alle weiblichen Tiere einer Gruppe durch ein männliches Tier mit den erwünschten genetischen Qualitäten zu besamen, oder, um eine künstliche Besamung bei einer maximalen Anzahl von weitlichen Tieren durchführen zu können, und zwar beides innerhalb einer relativ kurzen Zeitspanne. Bisher hat man dies durch Verabreichung von ovulationsinhibierenden Mitteln an die Tiere, Absetzen der Verabreichung dieser Mittel

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kurz vor der zur Befruchtung oder künstlichen Besamung vorgesehenen Zeit und Vertrauen auf die natürliche Produktion von LH und FSH zur Einleitung der Ovulation und Brunstperiode, oder durch Verabreichen von Gonadotropinen, bewirkt. Jedoch war dies nicht völlig zufriedenstellend, da die Ovulation zu einer vorherbestimmten Zeit niemals bei allen Tieren gleichzeitig, sondern lediglich bei einem gewissen Anteil davon auftrat, wenn man keine gonadotropen Hormone verwendete. Andererseits machten die hohen Kosten der Gonadotropine und durch ihre Verabreichung bewirkte Nebenwirkungen diese Methode nicht praktizierbar. Es ist nunmehr möglich, eine im wesentlichen vollständige Synchronisierung der Ovulation und der Brunstperiode zu erzielen, dadurch, daß man die Tiere einer bestimmten Gruppe zunächst mit einem Ovulationsinhibitor behandelt, der anschließend abgesetzt wird, und dann ein Peptid der Formel I kurz vor der für die Befruchtung oder künstliche Besamung bestimmten Zeit verabfolgt, unt eine Ovulation und Brunst zu diesem Zeitpunkt zu erzielen. Die Zeitspanne bis zum Einsatz der Ovulation und der Brunst nach Verabreichung des Peptids variiert mit der Tierspezies, und die optimalen Zeitintervalle sind für die jeweiligen Spezies zu ermitteln. Bei Nagetieren, wie Ratten oder Hamstern, findet beispielsweise die Ovulation innerhalb von 18 Stunden nach Verabreichung eines erfindungsgemäßen Peptids statt.

Die vorstehende Methode zur Erzielung der Ovulation und Brunst innerhalb eines genau vorherbestimmten Zeitintervalls zur Sicherstellung einer erfolgreichen Befruchtung ist besonders bedeutsam für die Züchter von Rassepferden und Ausstellungstieren, wo die Kosten für die Dienste eines besonders hervorragenden männlichen Tieres häufig sehr beträchtlich sind.

Die Peptide der Formel I können auch nützlich zur Steigerung der Anzahl der Lebendgeburten pro Trächtigkeit in Viehbeständen, beispielsweise von Rindern, Schafen oder Schweinen, verwendet werden. Für diesen Zweck wird das Peptid in

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einer Reihe von parenteralen Dosierungen, vorzugsweise durch intravenöse oder subkutane Injektionen, im Bereich von 0,1 bis 10 meg pro kg Körpergewicht pro Tag, 96 bis 12 Stunden vor der erwarteten Brunst mit anschließender Befruchtung gegeben. Eine einleitende Injektion von 1000 bis 5000 iU eines Gonadotropin-Serums von trächtigen Stuten kann ebenfalls 1 oder 2 Tage vor der vorstehenden Injektion des Peptids gegeben werden. Eine ähnliche Behandlung mit oder ohne vorhergehende Behandlung ist ebenfalls zur Einleitung der Pubertät bzw. Reifungsperiode von Haustieren geeignet.

Wird ein Peptid der Formel I zur Einleitung der Ovulation und der Brunst oder zur Einleitung der Pubertät bei Warmblütern, insbesondere bei Nagetieren, wie Ratten oder Hamstern, oder in Viehbeständen verwendet, so wird es systemisch, vorzugsweise parenteral, in Kombination mit einer pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeit oder einem festen Träger verabreicht. Der Anteil des Peptids wird durch seine Löslichkeit in dem gegebenen Träger, durch den gewählten Verabreichungsweg und nach biologischer Standardpraxis bestimmt. Zur parenteralen Verabreichung an Tiere wird das Peptid in einer sterilen wäßrigen Lösung verwendet, die auch andere gelöste Materialien, wie Puffer oder Konservierungsmittel, sowie ausreichend pharmazeutisch verträgliche Salze oder Glucose enthalten kann, um die Lösung isotonisch zu machen. Die Dosierung variiert mit der Form der Verabreichung und der speziellen Tierart, die behandelt werden soll, und liegt vorzugsweise bei 0,1 meg bis 10 meg pro kg Körpergewicht. Jedoch ist es besonders erwünscht, einen Dosisgehalt im Bereich von etv/a 1 meg bis etwa 5 meg pro kg Körpergewicht anzuwenden, um wirksame Ergebnisse zu erzielen.

Die Peptide der Formel I können auch in einer der langwirksamen, langsam freisetzenden oder Depot-Dosierungsformen, die nachstehend beschrieben sind, vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion oder durch Implantation, verabreicht werden. Derartige Dosisformen sind derart gestaltet, daß sie etwa 0,1 meg bis etwa 10 meg pro kg Körpergewicht pro Tag freisetzen.

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Die Peptide der Formel I sind auch in der Humanmedizin nützlich. Beispielsweise wurde auch das Kuman-Choriongonadotropin (HCG), das hauptsächlich LH und etwas FSH enthält, über 30 Jahre zur Behandlung gewisser endokriner Erkrankungen, wie Störungen des Zyklus, Amenorrhoe, mangelhafte Entwicklung der sekundären Geschlechtsmerkmale und Unfruchtbarkeit bei der Frau, oder gewisse Fälle von Hypogonadismus, verzögerter Pubertät, Kryptorchismus und nicht-psychogener Impotenz beim Mann, vertuender. In letzter Zeit wurde die Unfruchtbarkeit der Frau auch mit menschlichem Henopause-Gonadotropin (HMG) behandelt, das hauptsächlich FSH enthält, gefolgt von einer Behandlung mit HCG. Einer der Nachteile dieser Behandlung der Unfruchtbarkeit von Frauen mit HCG oder mit HMG, gefolgt von HCG, zeigte sich darin, daß bei einer derartigen Behandlung häufig eine Superovulation und unerwünschte Mehrfachgeburten eintreten, wahrscheinlich, da es nicht möglich ist, lediglich die exakten Mengen an FSH und LH zu verabreichen, die für die Ovulation notwendig sind.

Die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Peptids gleicht diese Nachteile aus, da die Verbindung die Freisetzung von LH und FSH über die Hypophyse lediglich in genauen Mengen, die für die normale Ovulation erforderlich sind, bewirkt. Aus diesen Gründen ist ein erfindungsgemäßes Peptid nicht nur für die vorstehenden Zwecke geeignet, sondern ebenfalls zur Anwendung an Frauen bei der Behandlung von Störungen des Zyklus, der Amenorrhoe, von Hypogonadismus und mangelhafter Entwicklung der sekundären Geschlechtsmerkmale geeignet.

Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Peptide zur Kontrazeption geeignet. Wird beispielsweise das Peptid an Frauen zu einem frühen Zeitpunkt des Menstruationszyklus verabreicht, so wird LH zu diesem Zeitpunkt freigesetzt und bewirkt eine vorzeitige Ovulation. Das ungereifte Ovum ist entweder nicht geeignet zur Befruchtung oder, falls dennoch eine Befruchtung stattfinden sollte, ist es sehr unwahrscheinlich, daß das befruchtete Ei implantiert wird, da das

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zur Präparation des Endotnetriums erforderliche Östrogen-Progestin-Gleichgewicht nicht vorliegt und das Endometrium sich nicht in dem für die Implantation notwendigen Zustand befindet. Wird andererseits das Peptid gegen das Ende des Zyklus verabreicht, so wird das Endometrium unterbrochen, und die Menstruation erfolgt.

Auch sind die erfindungsgemäßen Peptide nützlich bei der Kontrazeption durch die "Rhythmus"-Methode, die immer relativ unzuverlässig war, das es nicht möglich ist, die Ovulation der Frau mit dem erforderlichen Genauigkeitsgrad vorherzubestimmen. Die Verabreichung des Peptids in der Mitte des Zyklus, d.h. zu etwa dem normalerweise zu erwartenden Zeitpunkt der Ovulation, bewirkt kurz danach eine Ovulation und gestaltet so die "Rhythmus"-Methode sicher und wirksam.

Die Peptide der Formel I sind auch als diagnostisches Mittel zur Unterscheidung zwischen den Funktionen oder Verletzungen von Hypothalamus oder Hypophyse der Frau geeignet. Bei der Verabreichung des Peptids an einen Patienten, bei dem man derartige Mißfunktionen oder Verletzungen vermutet, und einem anschließend beobachteten Anstieg des LH-Gehaltes hat man einen guten Hinweis darauf, daß der Hypothalamus den Grund für die Mißfunktion ist und die Hypophyse intakt ist. Wird andererseits anschließend an die Verabreichung des Peptids kein Anstieg des zirkulierenden LH beobachtet, so kann mit großer Sicherheit eine Diagnose auf Mißfunktion oder Verletzung der Hypophyse gestellt werden.

Beim Manne schafft die Verabreichung eines Peptids der Formel I die Mengen an LH (oder ICSH) und an FSH, die für eine normale sexuelle Entwicklung in Fällen von Hypogonadismus oder verzögerter Pubertät notwendig sind, und ist auch bei der Behandlung von Kryptorchismus nützlich. Darüber hinaus stimuliert das durch die Verabreichung des Peptids freigesetzte FSH die Entwicklung von Keimzellen in den Hoden, und das Peptid ist geeignet zur Behandlung von psychogener und nicht-psychogener Impotenz.

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Werden die Peptide der Formel I, vorzusgweise in Form ein-23 Säureadditionssalzes, in der Humanmedizin verv/endet, so werden sie systemisch, entweder intravenös, subkutan oder durch intramuskuläre Injektion oder sublingual, nasal oder vaginal in Zusammensetzungen zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel oder Träger verabreicht.

Zur Verabreichung auf nasalem Wege in Form von Tropfen oder Sprays bevorzugt man ein Peptid der Formel I, gelöst in einem sterilen wäßrigen Vehikel, das auch andere gelöste Bestandteile, wie Puffer oder Konservierungsmittel, sowie ausreichende Mengen an pharmazeutisch verträglichen Salzen oder an Glucose zur Erzielung einer isotonischen Lösung enthalten kann. Dosierungen auf intranasalem Wege liegen im Bereich von 0,1 bis 50 mcg/'kg oder vorzugsweise 0,5 bis 10 mcg/kg.

Die Peptide der Formel I können auch als nasale oder vaginale Pulver oder Einblasungen verwendet werden. Für derartige Zwekke wird das Peptid in feinverteilter fester Form zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen festen Träger, beispielsweise einem feinverteilten Polyäthylenglykol ("Carbowax 1540"), feinverteilter Lactose oder, vorzugsweise für die vaginale Verabreichung, sehr feinverteiltem Siliciumdioxid ("Cab-O-Sil"), verabreicht. Derartige Zusammensetzungen können auch andere Excipienten in feinverteilter fester Form, wie Konservierungsmittel, Puffer oder oberflächenaktive Mittel, enthalten.

Zur sublingualen oder vaginalen Verabreichung bevorzugt man die Formulierung der Peptide der Formel I in festen Dosisformen, wie Sublingualtabletten oder vaginalen Einlagen oder Suppositoryen, mit ausreichenden Mengen an festen Excipienten, wie Stärke, Lactose, gewissen Typen von Ton, Puffern, Gleitmitteln, desintegrierenden Mitteln oder oberflächenaktiven Mitteln, oder mit halbfesten Excipienten, die bei der Formulierung von Suppositorien üblich sind. Beispiele für derartige Excipienten finden sich in der pharmazeutischen Standard-Literatur, a.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company_s Easton, Pa=_s 1970.

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Die Dosierung der Peptide der Formel I hängt mit der Verabreichungsform und vom speziellen zu behandelnden Patienten ab. Im allgemeinen beginnt man die Behandlung mit geringen Dosierungen, die wesentlich unter der optimalen Dosis der Verbindung liegen. Anschließend werden die Dosierungen in kleinen Schritten erhöht, bis den Umständen entsprechende optimale Wirkungen erzielt werden. Im allgemeinen ist es erwünscht, die Peptide der Formel· I in einer Konzentration zu verabreichen, die im allgemeinen wirksam LH und FSH freisetzt, ohne schädliche oder nachteilige Nebenwirkungen zu ergeben, und vorzugsweise wird in einer Dosierung im Bereich von etwa 0,01 meg bis etwa 100 mcg pro kg Körpergewicht verabreicht, obwohl die vorstehenden Variationen durchgeführt werden können. Jedoch wird eine Dosierung des Peptide der Formel I, worin

a) X = Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NH₂ oder

b) X = Ser, Y = D-Phe und Z = GIy-NH₀

die im Bereich von etwa 0,5 meg bis etwa 5,0 mcg pro kg Körpergewicht liegt, und des Peptids der Formel I, worin

c) X = D-Ser, Y = D-Leu und Z = NHR¹,

die im Bereich von etiva 0,1 meg bis etwa 10 mcg pro kg Körpergewicht liegt, besonders bevorzugt verwendet, um wirksame Ergebnisse zu erzielen.

Häufig ist es erwünscht, die Peptide der Formel I kontinuierlich über länger^ Zeiträume in lang wirksamen, langsam freisetzenden Formen oder in Depot-Dosierungsformen zu verabreichen. Solche Dosierungsformen können entweder ein pharmazeutisch verträgliches Salz der Verbindung mit einem niedrigen Loslichkeitsgrad in Körperflüssigkeiten, beispielsweise Salze mit Pamoasäure oder Gerbsäure bzw. Tannin oder Carboxymethylcellulose, enthalten, oder sie können die Peptide in Form eines wasserlöslichen Salzes, zusammen mit einem schützenden Träger enthalten, der eine rasche Freisetzung verhindert. Im

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letzteren Falle können die Peptide beispielsweise mit einer nicht-antigenen, partiell hydrolysierten Gelatine in Form einer viskosen Flüssigkeit verabreicht i^erden; oder sie können auf einem pharmazeutisch verträglichen festen Träger, v/ie beispielsweise Zinkhydroxid mit oder ohne Protamin, adsorbiert und suspendiert in einem pharmazeutisch verträglichen flüssigen Vehikel verabreicht werden; oder die Peptide können in Gelen oder Suspensionen mit einem nicht-antigenen Schutz-Hydrokolloid, beispielsweise Natriumcarboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Natriumalginat, Gelatine, PoIygalakturonsäuren, beispielsweise Pektin, oder gewisse Mucopolysaccharide, zusammen mit wäßrigen oder nicht—wäßrigen, pharmazeutisch verträglichen flüssigen Vehikeln, Konservierungsmitteln oder oberflächenaktiven Mitteln, formuliert sein. Beispiele für solche Formulierungen finden sich in pharmazeutischer Standard-Literatur, z.B. in Remington's Pharmaceutical Sciences, a.a.O. Langwirksame, langsam freisetzende Präparate der Peptide können auch durch Einschluß in Mikrokapseln aus einem pharmazeutisch verträglichen Überzugsmaterial, beispielsweise Gelatine, Polyvinylalkohol und Athylcellulose, erhalten werden. V/eitere Beispiele für Überzugsmaterialien und die Verfahren zur Mikroeinkapselung sind von J.A. Herbig in "Encyclopedia of Chemical Technology", Band 13, 2. Auflage, Wiley, New York, 196 7, Seiten 436 bis 456 beschrieben. Solche Formulierungen sowie Suspensionen von Salzen der Peptide, die in Körperflüssigkeiten lediglich mäßig löslich sind, werden so eingestellt, daß sie etwa 0,1 meg bis etwa 50 meg des Hormons pro kg Körpergewicht pro Tag freisetzen, und sie werden bevorzugt durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Alternativ können einige der festen Dosierungsformen, die vorstehend aufgeführt sind, beispielsweise gewisse schlecht wasserlösliche Salze oder Dispersionen in oder Adsorbate auf festen Trägern von Salzen der Peptide, beispielsweise Dispersionen in einem neutralen Hydrogel eines Polymeren von Athylenglykolmethacrylat oder ähnlichen Monomeren, die quervernetzt sind, wie in der US-PS 3 551 556 vom 29. Dezember 1970 beschrieben, in der Form von Pellets vorliegen,

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die etwa die gleichen Mengen, wie vorstehend gezeigt, freisetzen und subkutan oder intramuskulär implantiert werden können.

Alternativ kann eine langsam freisetzende Wirkung während langer Zeiträume auch durch Verabreichung der erfindungsgemäßen Peptide in Form eines Säureadditionssalzes in einer intravaginalen "Vorrichtung oder in einem temporären Implantat, beispielsweise einem Container, der aus nicht-reizenden Siliconpolymeren, wie Polysiloxan, z.B. "Silastic", oder einem neutralen Hydrogel eines Polymeren, wie vorstehend beschrieben, hergestellt ist, der eine Permeabilität aufweist, die zur Freisetzung von etwa 0,1 meg bis etwa 50 meg pro kg Körpergewicht pro Tag erforderlich ist. Derartige intravaginale oder implantierbare Dosisformen zur verlängerten Verabreichung v/eisen den Vorteil auf, daß sie entfernt werden können, wenn es erwünscht ist, die Behandlung zu unterbrechen oder zu beenden.

Die bei der Synthese der erfindungsgemäßen Peptide der Formel I verwendeten speziellen Seitenketten-Schutzgruppen sollten gemäß folgenden Regeln ausgewählt werden:

a) Die Schutzgruppe sollte in jeder Stufe der Synthese stabil sein gegenüber dem Reagens und den Reaktionsbedingungen, die zur Entfernung der a-Amino-Schutzgruppe gewählt werden,

b) die Schutzgruppe sollte ihre Schutzwirkung beibehalten, d.h. nicht unter Kupplungs- bzw. Reaktionsbedinqungen abgespalten werden, und

c) die Schutzgruppe der Seitenketten sollte bei beendeter Synthese,die die gewünschte Aminosäure-Sequenz enthält, unter Reaktionsbedingungen, die die Peptidkette nicht verändern, abspaltbar sein.

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Unter Bezugnahme auf R umfassen geeignete a-Amino-Schutzgruppen

1) aliphatische Urethan-Schutzgruppen, beispielsweise tert.-Butyloxycarbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl, Biphenylisopropyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl;

2) Schutzgruppen vom Cycloalkylurethan-Typ, z.B. Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, d-Isobornyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Nitrophenylsulfenyl, Tritylsulfenyl, α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl und Trityl.

9 Bevorzugt v/ählt man die a-Amino-Schutzgruppe für R aus tert.-Butyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Arayloxycarbonyl, d-Isobornyloxycarbonyl, o-Nitrophenylsulfenyl, Biphenylisopropyloxycarbonyl und α,α-Dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl.

Die erfindungsgemäßen Peptide der Formel I werden unter Anwendung einer Festphasen-Synthese hergestellt, die durch folgenden Ausführungsformen veranschaulicht werden soll, in denen spezielle Peptide der Formel I hergestellt werden.

a) und b) Peptide der Formel I, worin

a) X = Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NH₂ oder

b) X = Ser, Y = D-Phe und Z =

Die Synthese in fester Phase der Peptide der Formel I, die unter a) und b) beschrieben sind, beginnt man mit dem C-terminalen Ende des Peptids unter Anwendung eines a-Amino-geschützten Harzes. Ein derartiges Ausgangsmaterial wird durch Bindung eines a-Amino-geschützten Glycins an ein Benzhydrylaminharz, ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz, wobei das erstgenannte bevorzugt Ist, hergestellt. Die Herstellung eines Benzhydrylamlnharzes wird beispielsweise von P. Rivaille et al., Helv^Chim.Acta, S4, 2772 (1971), und

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die Herstellung des Hydroxymethylharzes wird von M. Bodans und J.T. Sheehan, Chem.Ind. (London), 38.» 1597 (1966) beschrieben. Ein chlormethyliertes Harz ist im Handel von den Bio Rad Laboratories, Richmond, California, erhältlich. Bei der Anwendung des Benzhydrylaminharzes wird eine amidvorankernde Bindung mit dem α-Amino-geschützten Glycin wie folgt gebildet:

H OH ^—.

I I I / \

9 ' ™ il Har7-\

Dadurch wird es möglich, die C-terminale Amidfunktion direkt nach beendeter Synthese der Aminosäure-Sequenz zu erhalten durch Absaplten des Harzträgers von dem gebundenen Peptid unter Bildung des Glycinamids am C-endständigen Teil des gewünschten Decapeptids. In diesem Falle werden bei Verwendung von Fluorwasserstoff zur Abspaltung des Harzträgers auch die Schutzgruppen der Seitenkette abgespalten, wobei man das entsprechende Decapeptid der Formel I erhält, worin

a) X = Ser, X = D-Trp und Z = GIy-NH₂ oder

b) X = Ser, Y = D-Phe und Z =

Werden die anderen Harze verwendet, so ist die verankernde Bindung die Benzylestergruppe, wie vorstehend aufgezeigt. In diesem Falle besteht eine zweckmäßige Verfahrensweise zur Umwandlung des gebundenen geschützten Peptids in das C-endständige Amid darin, das geschützte Peptid von dem Harz durch AmmonoIyse zu entfernen und anschließend die Schutzgruppen des resultierenden Amids durch Behandeln mit Natrium und flüssigem Ammoniak oder durch Spaltung mit Fluorwasserstoff zu entfernen. Ein alternatives Verfahren besteht in der Spaltung durch Umesterung mit einem niedrig-Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, in Anwesenheit von Triäthylamin und anschließende Umwandlung des resultierenden Esters in ein Amid

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und schließlich Entfernung der Schutsgruppen, wie vorstehend beschrieben. Es sei hier auch auf J.M. Steward und J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969, Seiten 40 bis 49 hingewiesen.

Insbesondere wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein a-Amino-geschütztes Glycin, vorzugsweise tert.-Butyloxycarbonylglycin, mit Benzhydrylamxnharz mit Hilfe der Carboxylgruppen aktiverenden Verbindung, vorzugsweise Dicyclohexylcarbodiimid, gekoppelt. Anschließend an die Koppelung des a-Amino-geschütsten Glycins an den Harz träger wird die a-Amino-Schutzgruppe beispielsweise durch Trifluoressxgsäure in Mcthylenchlorid, Trifluoressxgsäure allein oder Chlorwasserstoff säure in Dioxan entfernt. Die Entfernung der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur zwischen 0°C und Raumtemperatur durchgeführt. Andere Standard-Spaltungsmittel und Bedingungen zur Entfernung von speziellen a-Amino-Schutzgruppen können verwendet werden, wie beispielsweise von E.Schröder und K. Lübke, "The Peptides", Band I, Academic Press, New York, 1965, Seiten 72 bis 75 beschrieben.

Nach Entfernung der a-Amino-Schutzgruppe werden die verbleibenden a-aminogeschützten Aminosäuren stufenweise in der gewünschten Reihenfolge unter Bildung des Peptids gekoppelt. Jede geschützte Aminosäure wird in den Festphasen-Reaktor in etwa dreifachem Überschuß eingeführt, und die Koppelung wird in einem Medium von Methylenchlorid oder Mischungen von Dimethylformamid und Methylenchlorid durchgeführt. In Fällen, wo eine unvollständige Kupplung auftritt, wird der Kupplungsarbeitsgang wiederholt, bevor die a-Amino-Schutzgruppe abgespalten wird und bevor die Kupplung der nächsten Aminosäure an die an das Polymere gebundene Aminosäure öder das Peptid erfolgt. Der Erfolg der Kupplungsreaktion zu jeder Stufe der Synthese wird durch die Ninhydrinreaktion, wie von E. Kaiser et al., Analyt.Biochem., 214_, 595 (1970) beschrieben, durchgeführt.

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Nach der Synthese der gev/ünschten Amino säuren- Sequenz wird das Peptid von dem Harzträger durch Behandeln mit einem Reagens, wie Fluorwasserstoff, abgespalten, das nicht nur das Peptid von dem Harz abspaltet, sondern alle restlichen Schutzgruppen von Seitenketten und die a-Amino-Schutzgruppe (falls vorhanden) an dem Pyroglutaminsäurerest in dem Falle, wo das Benzhydrylaminharz zur direkten Erzielung des Peptids der Formel I, vorstehend als a) oder b) beschrieben, verwendet wurde,abspaltet.

Wird ein chlormethyliertes Harz verivendet, so kann das Peptid von dem Harz durch Umesterung mit einem niedrig-Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, abgetrennt werden, worauf das gewonnene Produkt an Siliciumdioxidgel chromatographiert und die gewonnene Fraktion einer Behandlung mit Ammoniak unterzogen wird, um den niedrig-Alkylester, vorzugsweise den Methyl- oder Äthylester, in das C-endständige Amid umzuwandeln. Die Seitenketten-Schutzgruppen werden anschließend durch Arbeitsweisen, wie vorstehend beschrieben, beispielsweise durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder mit Fluorwasserstoff, abgaspalten.

7 Zusätzlich zu den vorstehend beschriebenen Schutzgruppen (R )

7 für die Imidazol-Stickstoffatome von Histidin, kann R 2,2,2-Trifluor-1-benzoyloxycarbonylaminoäthyl und 2,2,2-Trifluor-ltert.-butyloxycarbonylaminoäthyl umfassen.

c) Peptide der Formel I, worin

c) X = D-Ser, Y = D-Leu und Z = NHR¹

Die Synthese in fester Phase des Peptids der Formel I,worin X = D-Ser, Y = D-Leu und Z = NHR , wird von dem C-endständigen Ende des Peptids unter Anwendung eines a-aminogeschütsten Prolinharzes begonnen. Ein derartiges Ausgangsmaterial wird durch Binden eines a-aminogeschützten Prolins an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz, wobei das erstgenannte bevorzugt 1st, hergestellt. Die Herstellung eines

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Hycroxymethylharzes wird von M. Bodansky und J. T. Sheehan, Chem.Ind. (London) ,3j3, 1597 (1966) beschrieben. Ein chlormethyliertes Harz ist im Handel von den Bio Rad Laboratories, Richmond, California, erhältlich. Bei Verwendung des chlormethylierten Harzes wird eine Ester-Ankergruppe mit dem ct-aminogeschützten Prolin wie folgt gebildet:

R — Pro — 0 — CH₂ \träger

Harz-\ .rager/

Ein zweckmäßiges Verfahren zur Umwandlung des gebundenen geschützten Peptids in das C-endständige (niedrig-Alkyl)-amid besteht in der Abspaltung des geschützten Peptids von dem Kars durch Behandeln mit einem niedrig-Alkylamin, vergl. D.H. Ccy et al., Biochem., I Biophys.Res.Commun., 5J7_, 335 (1974), wobei man das entsprechende geschützte Peptid-(niedrig-alkyl)-arnid erhält. Anschließend werden die Schutzgruppen des resultierenden Peptid-(niedrig-alkyl)-amids durch Behandeln mit Natrium und flüssigem Ammoniak oder vorzugsweise durch Fluorwasserstoffspaltung unter Bildung des entsprechenden erfindungsgemäßen Peptids der Formel I, wie vorstehend unter c) beschrieben, entfernt. Ein alternatives Verfahren besteht in der Sapltung durch Umesterung mit einem niedrigen Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, in Anwesenheit von Triethylamin und anschließender Umwandlung des resultierenden Esters in das entsprechende (niedrig-Alkyl)-amid und anschließende Entfernung der Schutzgruppen, wie vorstehend beschrieben. Vergl. hierzu J.M. Steward und J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969, Seiten 40 bis 49.

Insbesondere wird gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung a-aminogeschütztes Prolin, vorzugsweise tert.— Butyloxycarbonylprolin, mit einem chlormethylierten Harz mit Hilfe eines Katalysators, vorzugsweise Cäsiumbicarbonat oder Triethylamin, gekoppelt. Nach der Koppelung des cc-aminogeschützten Prolins an den Harzträger wird die oc-Amino-Schutzgruppe, beispielsweise unter Anwendung von Trifluoressigsäu-

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re in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder Chlorwasserstoff säure in Dioxan, entfernt. Die Abspaltung der Schutzgruppe wird bei einer Temperatur zwischen etwa 0 C und Raumtemperatur durchgeführt. Andere Standard-Spaltungsmittel und Bedingungen zur Entfernung spezifischer a-Amino-Schutzgruppen können angewendet werden, wie von E. Schröder und K. Lübke, "The Peptides", Band I, Academic Press, New York, 1965, Seiten 72 bis 75 beschrieben. Nach Entfernung der oc-Arnino-Schutsgruppe werden die verbleibenden a-arainogeschützten α-Aminosäuren stufenweise in der beschriebenen Reihenfolge gekoppelt, um die Verbindung der Formel I zu ergeben, die vorstehend unter c) beschrieben wurde. Jede geschützte Aminosäure wird in den Festphasen-Reaktor in etwa dreifachem Überschuß eingeführt, und die Koppelung wird in einem Medium von Methylenchlorid oder Mischungen von Dimethylformamid und Methylenchlorid durchgeführt. In Fällen, bei denen eine unvollständige Koppelung aufgetreten ist, wird der Koppelungsvorgang vor Entfernung der a-Amino-Schutzgruppe, vor Koppelung der nächsten Aminosäure an den Festphasen-Reaktor, wiederholt. Der Erfolg der Koppelungsreaktion bei jeder Synthesestufe wird durch die Ninhydrin-Reaktion, wie von E. Kaiser et al., Analyt.Biochem. ,· 3_4_, 595 (1970) beschrieben, überwacht.

Nach der Synthese der gewünschten Aminosäuren-Sequenz wird das geschützte Peptid von dem Harzträger durch Behandlung mit einem (niedrig-Alkyl)-amin entfernt, wobei man das entsprechende geschützte Peptid-(niedrig-alkyl)-amin erhält, und auch bei der Verwendung von Dinitrophenyl oder Tosyl als Schutzgruppe für den Histidylrest wird die Dinitrophenyl- oder Tosyl-Schutzgruppe während der Behandlung mit dem (niedrig- Alkyl)-amin entfernt. Das Peptid kann auch von dem Harz durch Umesterung mit einem niedrig-Alkanol, vorzugsweise Methanol oder Äthanol, abgetrennt werden, worauf das gewonnene Produkt durch Chromatographie an Siliciumdioxidgel gereinigt und die gewonnene Fraktion einer Behandlung mit einem (niedrig-Alkyl)-amin zur Umwandlung des niedrig-Alkylesters, vorzugsweise des Methyl- oder Äthylesters, 'in das C-endständige (niedrig-Alkyl)-amid unterzogen wird. (Es sei bemerkt, daß,

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falls eine Dinitrophenyl- oder Tosylgruppe am Histidylrest vorhanden ist, diese ebenfalls abgespalten wird.) Die verbleibenden Seiteriketten-Schutzgruppen des geschützten Äthylamids v/erden anschließend durch vorstehend beschriebene Verfahrensweisen, beispielsweise durch Behandlung mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder mit Fluorwasserstoff unter Bildung des Nonapeptids der Formel I, wie vorstehend als c) beschrieben, abgespalten.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

L-Pyroqlutamyl-L-histidyl(tosyl)-L-tryptophyl-L-seryl(benzyl·)-L-tyrosyl (2-brombenzyloxycarbonyl )-D-tryptor>hyl-L-leucyl-L-

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arqinyKtosyl)-L-prolylqlycylbenzhydrylamin-Harz [R -(pyro)— GIu-His-(N^Im-R )-Trp-Ser(R⁶)-Tyr(R )-D-Trp-Leu-Arq(N^G-R')-Pro-Gly-A; R⁴ = Tos, R^D = 2-Br-Cbz, R⁶ = BzI, R⁷ = Tos, R = H und A = Benzhydrylaminharz]

1,25 g (1,0 mMol) Benzhydrylaminharz werden in das Reaktionsgefäß einer autontatisehen Peptid-Synthese-Vorrichtung (Beckmann-Modell 990) gefügt, das dazu programmiert ist, folgende '»vaschzyklen durchzuführen:

a) Methylenchlorid; b) 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 χ während jeweils 2,5 und 25 Minuten); c) Methylenchlorid; d) Äthanol; e) Chloroform; f) 10% Triäthylarain in Chloroform (2 χ je 25 Minuten); g) Chloroform; h) Methylenchlorid.

Das gewaschene Harz wird anschließend mit 525 mg (3,0 mMol) tert.-Butyloxycarbonylglycin in Methylenchlorid gerührt, und es werden 3,0 mMol Dicyclohexylcarbodiiraxd zugefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur (22 bis 25 C) während 2 Stunden gerührt, und das Aminosäureharz wird anschließend nacheinander mit Methylenchlorid (3 x), Äthanol (3 x) und Methylenchlorid (3 χ ) gewaschen. Die gebundene Aminosäure wird mit 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 χ

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während 2,5 und 25 Minuten) von der Schutzgruppe abgespalten, und anschließend werden die vorstehend beschriebenen Waschzyklen c) bis h) durchgeführt.

Die folgenden Aminosäuren (3,0 mMol) v/erden anschließend
nacheinander durch den gleichen Reaktionszyklus gekoppelt:
t-Boc-L-prolin; t-Boc-L-arginin(Tos); t-Boc-L-leucin;
t-Boc-D-tryptophan; t-Boc-L-tyr-osin (2-Br-Cbz); t-Boc-L-serin(Bzl); t-Boc-L-tryptophan; t-Boc-L-histidin(Tos);
L-(Pyro)-glutaminsäure.

Das fertige Decapeptidharz wird 3 χ rait Kethylenchlorid und anschließend 3 χ mit Methanol gev/aschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 98 % der theoretischen Gewichtszunahme erhält.

Das in diesem Beispiel verwendete Benzhydrylaminharz ist ein handelsübliches Harz (1 % quervernetzt, Bachern Inc., Marina del Rey, California).

Beispiel 2

L-Pyroqlutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arqinyl-L-prolylqlycinamid; I, X -Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NH2 [(pyro)-GIu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂]

Die Entfernung der Schutsgruppen und Abspaltung des Decapeptids von dem Decapeptid-Harz, beschrieben in Beispiel 1, wird durch Behandeln von 1,0 g Material mit 24 ml Fluorwasserstoff und 6 ml Anisol während 30 Minuten bei 0 C bewirkt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck entferne und das Anisol durch Waschen mit Äthylacetat entfernt.

Das rohe Peptid wird durch Gelfiltration an einer Säule
(2,5 χ 100 cm) von Sephadex G-25 (einem feingradigen bzw.
feinen, chemisch modifizierten quervernetaten Dextran) durch Eluieren mit 2m-Essigsäure gereinigt, und es wurden die Frak-

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tioneri gesammelt und im Vakuum zur Trockne verdampft, die einen Haupt-UV-Absorptions-Peak bei 280 nm zeigten.

Das zurückbleibende Öl wurde auf eine Säule (2,5 χ 100 cm) von Sephadex G-25 (fein) aufgebracht, die vorher mit der unteren Phase, gefolgt von der oberen Phase eines n-Butanol:Essigsäure:Wasser-(4:l:5)-Lösungsmittelsystems äquilibriert worden war. Das Eluieren mit der oberen Phase ergab eine Haupt-Peak-Fraktion, und das Material aus dieser Zone wurde auf einer Säule (1,4 χ 94 cm) von Carboxymethylcellulose gemäß den von D.H. Coy et al., J.Med.Chem., 16_, 1140 (1973) beschriebenen Bedingungen eluiert. Entsprechende Fraktionen (1050 bis 1190 ml) ergaben nach Lyophilisieren auf konstantes Gewicht D-Trp -LK-RH als weißes, flaumiges Pulver (80 mg); [α]™"" -58,8° (c = 0,^3, In-HOAc).

Das Produkt erwies sich im Dunnschichtchromatogramm in vier verschiedenen Lösungsmittelsystemen als homogen, wenn Mengen von 20 bis 30 meg aufgetragen und die Flecken durch Joddampf und anschließend Ehrlich-Reagens sichtbar gemacht wurden. Man erhielt folgende R^-Werte:

1-Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:5, obere Phase) 0,25; Äthylacetat:Pyridin:Essigsäure:Wasser (5:5:1:3) 0,63; 2-Propanol:lm-Essigsäure (2:1) 0,38;
1-Butanol:Essigsäure:Wasser:Äthylacetat (1:1:1:1) 0,51.

Ergebnis der Aminosäuren-Analyse:

GIu 1,08; His 0,95; Trp 2,00; Ser 0,94;' Tyr 0,97; Leu 0,93; Arg 0,98; Pro 1,00; GIy 1,02; NH₃ 1,03.

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Beispiel 3

L-Pyroqlutamyl-L-histidyl(tosyl)-L-tryptophyl-L-seryl(benzyl)-L-tyrosyKP-brombenzyloxycarbonyD-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyKtosyl)-L-prolylglycylbenzhydryl-Harz [r -(pyro)-Glu-His-(N^Im-R^/)-Trp-Ser(R⁶)-Tyr(R⁵)-D-Phe-Leu-Arg(N^G-R⁴)-Pro-GIy-A; R⁴ = Tos, R⁵ = 2-Br-Cbz, R⁶ = BzI, R⁷ = Tps, R = H und A = Benzhydrylaminharz]

1,25 g (1,0 mMol) Benzhydrylaminharz wurden in das Reaktionsgefäß einer automatischen Peptid-Synthese-Vorrichtung (Beckmann-Modell 990), programmiert zur Durchführung folgender Waschzyklen, eingefüllt:

a) Methylenchlorid, b) 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 χ während jeweils 2,5 und 25 Minuten), c) Methylenchlorid, d) Äthanol, e) Chloroform, f) 10% Triäthylamin in Chloroform (2 χ während je 25 Minuten), g) Chloroform, h) Methylenchlorid.

Das gewaschene Harz wird anschließend mit 525 mg (3,0 mMol) tert.-Butyloxycarbonylglycin in Methylenchlorid gerührt und mit 3,0 mMol Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur (22 bis 25°C) 2 Stunden gerührt, und das Aminosäureharz wird anschließend nacheinander 3 χ mit Methylenchlorid, 3 χ mit Äthanol und 3 χ mit Methylenchlorid gewaschen. Die gebundene Aminosäure wird mit 33% Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 χ während jeweils 2,5 und 25 Minuten) von der Schutzgruppe befreit, und anschließend werden die vorstehend beschriebenen Waschzyklen c) bis h) durchgeführt.

3,0 mMol der folgenden Aminosäuren werden anschließend nacheinander im gleichen Reaktionszyklus gekoppelt: t-Boc-L-prolin; t-Boc-L-arginin(Tos); t-Boc-L—leucin; t-Boc-D-phenylalanin; t-Boc-L-tyrosin(2-Br-Cbz); t-Boc-L-serin(Bzl); t-Boc-L-tryptophan; t-Boc-L-histidin(Tos); L-(Pyro)-glutaminsäure.

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Das fertiggestellte Decapeptidharz wird 3 χ mit Methylenchlorid und anschließend 3 χ mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 100 % der theoretischen Gewichtszunahme erhält.

Das in diesem Beispiel verwendete Benzhydrylamxnharz ist ein handelsübliches Produkt (1 % quervernetzt, Bachern Inc., Marina del Rey, California).

Beispiel 4

L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid; 1,X= Ser, Y = Phe und Z = Gly-NH- [(pyro)-GIu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-

Arg-Pro-Gly-NH₂]

Die Entfernung der Schutzgruppen und Abspaltung des Decapeptids von dem Harz, beschrieben in Beispiel 3, wird durch Behandlung von 1,5 g Material mit 24 ml Fluorwasserstoff und 6 ml Anisol während 30 Minuten bei 0 C durchgeführt. Der Fluorwasserstoff wird unter Vermindertem Druck entfernt, und das Anisol wird durch Waschen mit Äthylacetat entfernt.

Das rohe Peptid wird durch Gelfiltration an einer Säule (2,5 χ 100 cm) Sephadex G-25 (feingradiges bwz. feines, chemisch modifiziertes quervernetztes Dextran), durch Eluieren mit 2m-Essigsäure gereinigt, und es werden Fraktionen, die einen Haupt-UV-Absorptions-Peak bei 280 nm zeigen, gesammelt und zur Trockne verdampft.

Das zurückbleibende Öl wird auf eine Säule (2,5 χ 100 cm) von Sephadex G-25 (feii|i) aufgebracht, die vorher mit der unteren Phase, gefolgt von der oberen Phase eines n-Butanol:Essigsäure: Wasser(4:l:5)-Lösungsmittelsystems, äquilibriert wurde. Durch Eluieren der oberen Phase erhielt man eine Haupt-Peak-Fraktion, und Fraktionen dieses Peaks wurden gesammelt und zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wurde von O,2n-Essigsäure lyophi-

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lisiert, wobei man 158 mg [D-Phe J-LH-RH als flaumiges weißes Pulver erhielt; [ap^⁵ -57,5° (c = 0,55, 0,In-HOAc).

Das Produkt erwies sich im Dünnschichtchromatogramm in vier verschiedenen Lösungsmittelsystemen als homogen bei Auftrag von 20 bis 30 meg und durch Joddampf und anschließend Ehrlich-Reagens sichtbar gemachten Flecken. Man erhielt folgende R_f-Werte:

1-Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:5, obere Phase) 0,14; Äthylacetat:Pyridin:Essigsäure:Wasser (5:5:1:3) 0,68; 2-Propanol:lm-Essigsäure (2:1) 0,41; l-Butanol:Essigsäure;Wasser:Äthylacetat (1:1:1:1) 0,47.

Die Aminosäuren-Analyse ergab:

GIu 1,01; His 0,97; Trp 0,90; Ser 0,92; Tyr 1,00; Phe 0,96; Leu 1,00; Arg 1,02; Pro 0,95; GIy 1,00; NH₃ 1,00.

Beispiel 5

L-Pyroglutamyl-L-histidyl(dinitrophenyl)-L-tryptophyl-D-seryl-

(benzyl)-L-tyrosyl(2-brombenzyloxycarbonyl)-D-leucyl-L-leucyl-

L-arginyl(tosyl)-L-prolyl-0-CH₂-Hars, R⁸-(pyro )-Glu-His(N^Irn-R⁷)-Trp-D-Ser(R⁶)-Tyr(R⁵)-D-Leu-Leu-Arg(N^G-R⁴)-Pro-A¹; R⁴= Tos,

Hars-⁵ = 2-Br-Cbz, R⁶ = BzI, R⁷ = Dnp, R⁸ = H und A¹ = ⁰-^CH2"~\er~ /

1,40 g (0,5 mMol Prolin) Boc-Prolinharz der Formel

Boc-Pro-0-CHp

werden in das Reaktionsgefäß einer automatischen Peptid-Synthese-Vorrichtung (Beckmann-Modell 990) gefüllt, die zur Durchführung der folgenden Waschzyklen programmiert ist:

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a) Methylenchlorid, b) 33 % Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 χ jeweils 2,5 bzw. 25 Minuten), c) Methylenchlorid, d) Äthanol, e) Chloroform, f) 10 % Triäthylamin in Chloroform (2 χ je 5 Minuten), g) Chloroform und h) MethylenChlorid.

Das gewaschene Harz wird anschließend mit 645 mg (1,5 mMol) tert.-Butyloxycarbonyl-tosyl—arginin in Methylenchlorid gerührt, und 1,5 mMol Dicyclohexylcarbodiimid v/erden zugesetzt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur (22 bis 25°C) 2 Stunden gerührt, und das Aminosäureharz wird anschließend nacheinander 3 χ mit Methylenchlorid gewaschen. Die gebundene Aminosäure wird mit 33 % Trifluoressigsäure in Methylenchlorid (2 χ 2,5 bzw. 25 Minuten) von der Schutzgruppe befreit, und anschließend werden die vorstehend beschriebenen Waschzyklen c) bis h) durchgeführt.

1,5 mMol der folgenden Aminosäuren werden anschließend nacheinander durch die gleiche Reaktionsfolge gekoppelt: t-Boc-L-1eucin; t-Boc-D-leucin; t-Boc-L-tyrosin(2-Br-Cbz); t-Boc-D-serin(BzI); t-Boc-L-tryptophan; t-Boc-L-histidin(Dnp); L-(Pyro)-glutaminsäure.

Das fertiggestellte Nonapeptidharz wird 3 χ mit Methylenchlorid und anschließend 3 χ mit Methanol gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 96 % der theoretischen Gewichtszunahme erhält.

Das in diesem Beispiel verwendete Prolinharz ist ein handelsübliches chlormethyliertes Harz (1 % quervernetzt, Bio Rad Labs., Richmond, California).

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Beispiel 6

L-Pyroqlutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-D-seryl(benzyl)-L-tyrosyl^-brombenzyloxycarbonyD-D-leucyl-L-leucyl-L-arqinyl-(tosyl)-L-prolyläthylamid, R -(pyro)-GIu-His-Trp-D-Ser(R )-■ Tyr(R )-D-Leu-Leu-Arg(N^R⁴J-PrO-NHR¹; R⁴ = Tos, R⁵ = 2-Br-Cbz, R⁶ = BzI, R⁸ = H und R¹ = C₃H₅

2,16 g des geschützten Nonapeptidharzes von Beispiel 5 werden in 20 ml Äthylarain bei O C suspendiert und 6 Stunden gerührt. Überschüssiges Äthylamin wird anschließend bei Raumtemperatur verdunsten gelassen, und das gespaltene Peptid wird mit Dimethylformamid von dem Harz gewaschen. Das geschützte Peptid wird anschließend durch Zusatz von Äthylacetat ausgefällt und unter Bildung von 672 mg eines cremefarbenen Pulvers filtriert. R_f an Siliciumdioxidgel in 1-Butanol: Essigsäure:Wasser (4:1:5, obere Phase) = 0,45. Dieses Material wird in Beispiel 7 ohne weitere Reinigung verwendet.

Beispiel 7

L-Pyroqlutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-D-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arqinyl-L-prolyl-äthylamid, 1,X= Ser_y Y = D-Leu und Z = NHEt [(pyro)-GIy-His-Trp~D-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHE t]

Die Entfernung der Schutzgruppen von dem geschützten Nonapeptid, hergestellt wie in Beispiel 6 beschrieben, wird durch Behandeln von 670 mg des Materials mit 50 ml Fluorwasserstoff und 15 ml Anisol während 30 Minuten bei 0°C durchgeführt. Der Fluorwasserstoff wird unter vermindertem Druck entfernt und das Anisol durch Waschen mit Äther entfernt.

Das rohe Peptid wird durch Gelfiltration an einer Säule (2,5 χ 100 cm) von Sephadex G-25 (feingradig bzw. fein, chemisch modifiziertes quervernetztes Dextran) durch Eluieren mit O,2m-Essigsäure gereinigt, und Fraktionen, die einen Haupt-UV-Absorptions-Peak bei 280 nm zeigen, werden gesammelt und zur Trockne verdampft.

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Das zurückbleibende Öl wird auf eine Säule (2,5 χ 100 cm) von Sephadex G-25 (fein) aufgetragen, die vorher rcit der unteren Phase, gefolgt von der oberen Phase von n-Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:5) als Lösungsmittelsystem äquilibriert wurde. Durch Eluieren der oberen Phase erhält man eine Hauptfraktion mit einer hohen UV-Absorption bei 280 nm, und dieses Material wird der Chromatographie an einer Säule (1,5 χ 94 cm) von Siliciumdioxidgel unterzogen und mit einem Gemisch von 1-Butanol: Essigsäure:Wasser (4:1:1) eluiert. Entsprechende Fraktionen (300 bis 390 ml) ergaben nach Verdampfen und Lyophilisieren von Wasser auf konstantes Gewicht [D-Ser ,D-Leu ,desGly-NH- ]-

LH-RH-äthy1amid als weißes, flaumartiges Pulver von 103 mg; [a]^³ = -29,6° (c = 0,54, 0,In-HOAc).

Das Produkt erweist sich in dem Dunnschichtchromatogramm in vier verschiedenen Lösungsmittelsystemen an Siliciumdioxidgel-Platten beim Auftrag von 20 bis 30 meg und Sichtbarmachen dor Flecken mit Joddampf, gefolgt von Ehrlich-Reagens, als homogen. Man erhielt folgende R_f-Werte:

1-Butanol:Essigsäure:Wasser (4:1:5, obere Phase) 0,20; Äthylacetat:Pyridin:Essigsäure:Wasser (5:5:1:3) 0,72; 2-Propanol:Im-Essigsäure (2:1) 0,43;
1-Butanol:Essigsäure:Wasser:Äthylacetat (1:1:1:1) 0,50.

Die Aminosäuren-Analyse ergab:

GIu 1,03; His 0,93; Trp 1,01; Ser 0,82; Tyr 0,97; Leu 1,98; Arg 1,00; Pro 0,90; Äthylamin 0,98.

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Claims

Patentansprüche

11. /Peptide der Formel I

(pyro)-GIu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z (I)

worin

a) X = Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NH,; oder

b) X = Ser, Y = D-Phe und Z = GIy-NPI₂; oder

c) X = D-Ser, Y = D-Leu und Z = NHR¹, worin

1
R = niedrig-Alkyl,

oder ein nicht-toxisches, pharmazeutisch verträgliches bzw. verwendbares Salz davon.

2. L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid oder ein nicht-toxisches, pharmazeutisch verträgliches Additions salz davon gemäß Anspruch 1.

3. L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-phenylalanyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolylglycinamid oder ein nicht-toxisches, pharmazeutisch verwendbares Additionssalz davon gemäß Anspruch 1

4. L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-D-seryl-L-tyrosyl-D-leucyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolyläthylamid oder ein nicht-toxisches, pharmazeutisch verwendbares Additionssalz davon gemäß Anspruch 1.

5. Verbindung der Formel II

R⁸-(pyro)-GIu-Hi s (N^Im-R⁷)-Trp-X¹-Tyr (R⁵ )-Y-Leu- Arg (N^R⁴¹

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worin

a) X¹ = Ser(R⁶),Y = D-Trp und Z¹ = GIy-R²; oder

b) X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Phe und Z¹ = GIy-R²; oder

c) X¹ = D-Ser(R⁶), Y = D-Leu und Z¹ = OR³, worin

2 3

R = Amino oder O-(niedrig-Alkyl), R = niedrig-Alkyl,

R , R , R und R = Schutzgruppen, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen, die das Molekül

(pyro)-Glu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z (I) nicht angreifen, abgespalten werden können, worin

a) X = Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NH₂; oder

b) X = Ser, Y = D-Phe und Z = GIy-NH₂; oder

c) X = D-Ser, Y = D-Leu und Z = NHR¹, worin

1 8

R = niedrig-Alkyl und R = Wasserstoff oder eine dieser

Schutzgruppen.

6. Verbindung der Formel II gernäß Anspruch 5, worin X =

r Ί P ?

Ser(R ), Y = D-Trp und Z = GIy-R , worin R = Amino.

7. Verbindung der Formel II gemäß Anspruch 5, worin X = Ser-(R⁶), Y = D-Phe und Z¹ = GIy-R², worin R² = Amino.

X =

C. Verbindung der Formel II gemäß Anspruch 5, worin Ser(R⁶), Y = D-Trp und Z¹ = GIy-R², worin R² = Amino,

4 5 6

R = Tosyl, R = 2-Brornbenzyloxycarbonyl, R = Benzyl,

V 8

R = Tosyl und R = Wasserstoff·

9. Verbindung der Formel II gemäß Anspruch 5, worin X Ser(R⁶), Y = D-Phe und Z¹ = GIy-R², worin R² = Amino,

4 5 6

R = Tosyl, R = 2-Brombenzyloxycarbonyl, R = Benzyl,

7 8

R = Tosyl und R = Viasserstoff.

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10. Verbindung der Formel
R⁸-(pyro)-Glu-HLS-Trp-D-Ser(R⁶)-Tyr(R⁵)-I>-Leu-Leu-Arg (N^G-R⁴ 3-

"1 Λ ζ C^ R

worin R = niedrig-Alkyl, R , R , R und R = Schutzgruppen, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen abgespalten werden können, die das Molekül (pyro )-Glu-His-Trp-D-Ser-Tyr- D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHR nicht angreifen und R = Wasserstoff oder eine dieser Schutzgruppen.

11. Verbindung gemäß Anspruch 10, worin R = Äthyl.

12. Verbindung der Formel II

R⁸-(pyro)-Glu^Üs(N^Irn-R ⁷)-Trp-X ^a~Tyr(R ⁵J-Y- Leu- Arg (N^G-R⁴ J-Pro-Z¹

worin

a) X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Trp und Z¹ = GIy-R²; oder

b) X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Phe und Z¹ = GIy-R²; oder

c) X¹ = D-Ser(R⁶), Y = D-Leu und Z¹ = OR³, worin

R = Amino oder O-(niedrig-Alkyl); R³ = niedrig-Alkyl;

R⁴ = eine Schutzgruppe für die N**"-, N^w-und N ^w '-Stickstoffatome des Arginins aus der Gruppe von Tosyl, Nitro, Benzyloxycarbonyl und Adamantyloxycarbonyl;

R = eine Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Tyrosin aus der Gruppe von 2-Brombenzyloxycarbonyl, Benzyl, Acetyl, Tosyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Tetrahydropyran-2-yl, Trityl, 2,4-Dichlorbenzyl und Benzyloxycarbonyl ;

R = eine Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Serin aus der vorstehend für R definierten Gruppe;

7
R = eine Schutzgruppe für die Imidazol-Stickstoffatome des Histidins aus der Gruppe von Tosyl und Dinitrophenyl;

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Vi/11 132 - 36 -

R = Wasserstoff oder eine a-Amino-Schutzgruppe aus der Gruppe von tert.-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl und d-Isobornyloxycarbonyl.

13. Verbindung der Formel

R⁸-(pyro)-Glu-HLs-Trp-D-Ser (R⁶ )-Tyr (R ⁵)-D-Leu-Leu-Arg (N^G-R⁴)-Pro-N HR¹

worin

1
R = niedrig-Alkyl;

R* = eine Schutzgruppe für die N -, N^ω - und N ^c0 — Stickstoffatome von Arginin aus der Gruppe von Tosyl, Nitro, Benzyloxycarbonyl und Adamantyloxy— carbonyl;

R = eine Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Tyrosin aus der Gruppe von 2-Brombenzyloxycarbonyl, Benzyl, Acetyl, Tosyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Tetrahydropyran-2-yl, Trityl, 2,4-Dichlorbenzyl und Benzyloxycarbonyl;

R = eine Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe von Serin aus der vorstehend für R definierten Gruppe; und ·

R = Wasserstoff oder eine α-Amino-Schutzgruppe aus der Gruppe von tert.-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl und d-Isobornyloxycarbonyl.

1 4

14. Verbindung gemäß Anspruch 13, worin R = Äthyl, R = Tosyl,

R = 2-Brorabenzyloxycarbonyl, R = Benzyl und R = Wasserstoff.

15. Verbindung ausgewählt aus der Gruppe von

-rVttp-X ^a-Tyr(R ⁵J-Y-LeU- Arg (N^G-R⁴ )-Pro-Z²

R⁹-His (N^Im-R⁷)-Trp-X^Tyr (R⁵ )-Y-Leu-Arg (N^G-R⁴)-Pro-Z², R⁹-Trp-X¹-Tyr(R⁵)-Y-Leu-Arg(N^G-R⁴)-Pro-Z² und R⁹-X^a-Tyr(R⁵)-Y-Leu-Arg(N^G-R⁴)-Pro-Z²

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M/17 132

worin

a) X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Trp und Z² = GIy-A; oder

b) X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Phe und Z² = GIy-A; oder

c) X¹ = D-Ser(R⁶), Y = D-Leu und Z² = A¹, worin

worin R , R , R und R = Schutzgruppen, die durch eine

oder mehrere chemische Behandlungen abgespalten werden können, die die entsprechende Verbindung der Formel I

(pyro)-GIu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z

(I)

nicht angreifen, worin

a) X = Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NH₂; oder

b) X = Ser, Y = D-Phe und Z = GIy-NH₂J oder

c) X = D-Ser, Y = D-Leu und Z = NHR¹,

Ί 8

worin R = niedrig-Alkyl, R = Wasserstoff oder eine

9
a-Amino-Schutzgruppe, R = eine a-Amino-Schutzgruppe,

A = ausgewählt aus der Gruppe von

H I

I I

N — C ρ

und 0

, und

A¹ = 0 CH

1 6

16. Verbindung gemäß Anspruch 15, worin X = Ser(R ),

Y = D-Trp und Z = GIy-A, worin A = ein Benzhydrylaminharz.

17. Verbindung gemäß Anspruch 15, worin X = Ser(R ), Y =

2
D-Phe und Z = GIy-A, worinA=ein Benzhydrylhydrylaminharz.

18. Verbindung gemäß Anspruch 15 mit der Formel

R^-(pyro)-GIu-HiS(N^Irn~R⁷)-Trp-X¹-Tyr (R⁵)-Y-Leu- Arg (N^G-R⁴ )-Pro-Z²

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M/17 132 - 38 -

worin X = Ser(R^ü), Y = D-Trp und Z = GIy-A, worin R⁴ =

5 fs 7

Tosyl, R = 2-Brombenzyioxycarbonyl, R = Benzyl, R =

Tosyl, R = Wasserstoff und A = ein Benzhydrylaminharz. 19. Verbindung gemäß Anspruch 15 mit der Formel R⁸-(pyro )-Glu-His (N^-R^-Trp-X^Tyr (R⁵ )-Y-Leu-Arg (N^G-R⁴ )-Pro-Z²

worin X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Phe und Z² = GIy-A, worin R⁴ = Tosyl, R = 2-Brombenzyloxycarbonyl, R = Benzyl, R = Tosyl, R = Wasserstoff und A = ein Benzhydrylaminharz.

20. Verbindung gemäß Anspruch 15 mit der Formel R⁸-(pyro)-Glu-His(N^Im-R⁷} -Trp-X¹-Tyr(R⁵ )-Y-Leu-Arg(N^G-R⁴)-Pro-Z²

worin X¹ = D-Ser(R⁶), Y = D-Leu und Z² = A¹, worin R⁴ = Tosyl, R = 2-Brombenzyloxycarbonyl, R = Benzyl, R =

8 1

2,4-Dinitrophenyl, R = Wasserstoff und A^- = 0-CHp

21. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

i) eine Verbindung der Formel
R⁸-(pyro)-Glu-His(N^:i:tn-R⁷)-Trp-X¹-Tyr (R⁵ )-Y-Leu-Arg(N^G-R⁴)-Pro-Z²

worin X = Ser(R ), Y = D-Trp und Z = GIy-A, worin A =

H H S—N^

I I /Harz-\ 4 5 6 7

N-C-p- Iträgeri und R *, R , R und R = Schutzgrut>-

pen, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen abgespalten werden können, die nicht die entsprechende

Verbindung der Formel I angreifen, und R = Wasserstoff oder eine dieser Schutzgruppen, mit einem Reagens umsetzt,

das dazu geeignet ist_s die Sc^-r.-grupr.-an E'% R^, R , R

8 "*

und R ohne /-«riariff ds:* ' ^;^ί,: r..uvr dar Formel I unter Bildung der entspreaierideii Verbindung der Formel I

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(pyro)-GIu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z

worin X = Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NH₂, abzuspalten; oder ii) eine Verbindung der Formel II

R⁸-(pyro )-Glu-His (N^-R^-Trp-X^Tyr (R⁵ )-Y-Leu-Arg (N^G-R⁴ J-Pro-Z¹

worin X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Trp und Z¹ = GIy-R², worin R² = Amino und R , R , R und R Schutzgruppen sind, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen abgespalten werden können, die die entsprechende Verbindung der Formel I nicht

angreifen, und R = Wasserstoff oder eine dieser Schutzgruppen, mit einem Reagens umsetzt, das die Schutzgruppen R , R , R , R und R ohne Angriff der Verbindung der Formel I abspalten kann, um eine Verbindung der Formel I

(pyro)-GIu-Hi s-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z

worin X = Ser, Y = D-Trp und Z = GIy-NH₂, zu ergeben; oder iii) eine Verbindung der Formel
R⁸- (pyro J-GIu-HiS(N¹^-R⁷ )-Trp-X^a-Tyr (R⁵ )-Y-Leu-Arg (N^G-R⁴ )-Pro-Z²

worin X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Phe und Z² = GIy-A, worin A =

und R , R , R und R Schutzgruppen

sind, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen abgespalten werden können, die die entsprechende Verbin-

dung der Formel I nicht angreifen, und R Wasserstoff oder eine dieser Schutzgruppen ist, mit einem Reagens umsetzt, das die Schutzgruppen R , R , R , R und R abspalten kann, ohne die Verbindung der Formel I anzugreifen, wobei man die entsprechende Verbindung der Formel I

(pyro J-GIu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z (I)

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2S2S843

erhält, worin X = Ser, Y = D-Phe und Z = GIy-NH₂; oder iv) eine Verbindung der Formel II

R⁸-(pyro )-Glu-His (IT^-R⁷)-Trp-X^Tyr (R⁵)-Y-Leu-Arg(N^G-R⁴) -Pro-Z¹

worin X¹ = Ser(R⁶), Y = D-Phe und Z¹ = GIy-R², worin R² = Amino und R , R , R und R Schutzgruppen sind, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen abgespalten werden können, die die entsprechende Verbindung der Formel I

nicht angreifen, und R = Wasserstoff oder eine dieser Schutzgruppen, mit einem Reagens umsetzt, das die Schutzgruppen R , R , R , R und R entfernen kann, ohne die Verbindung der Formel I anzugreifen, wobei man die entsprechende Verbindung der Formel I

(pyro)-Glu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z worin X = Ser, Y = D-Phe und Z = GIy-NH₂, erhält; oder v) eine Verbindung der Formel
R⁸-( pyro)-G]u-His-Tr.p-D-£er(R⁶)-Tyr (R⁵)-D-Leu-Leu-Arg(N^G-R⁴ J-Pro-NHR¹

worin R = niedrig-Alkyl und R , R , R und R Schutzgruppen sind, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen abgespalten werden können, die die entsprechende Ver-

bindung der Formel I nicht angreifen, und R Wasserstoff oder eine dieser Schutzgruppen ist, mit einem Reagens umsetzt, das die Schutzgruppen R , R , R und R abspalten kann, ohne die Verbindung der Formel I anzugreifen, wobei man die entsprechende Verbindung der Formel I

(pyro)-GIu-His-Trp-X-Tyr-Y-Leu-Arg-Pro-Z

erhält, worin X = D-Ser, Y = D-Leu und Z = NHR , worin R = niedrig-Alky.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mittel zur Abspaltung der Schutzgruppe Fluorwasserstoff verwendet.

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23. Arzneimittel mit üblichen Formulierungsmitteln und Trägern, dadurch gekennzeichnet, daß es eine oder mehrere Verbindungen der Ansprüche 1 bis 20 enthält.

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