CH639362A5

CH639362A5 - Arzneimittel zur verhinderung der fortpflanzung bei maennlichen saeugetieren einschliesslich menschen.

Info

Publication number: CH639362A5
Application number: CH766778A
Authority: CH
Inventors: Catherine Laure Rivier; Jean Edouard Frederic Rivier; Wylie Walker Jun Vale
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1977-07-14
Filing date: 1978-07-14
Publication date: 1983-11-15
Also published as: SE7807816L; GB2001077A; NZ187806A; US4218439A; CA1110232A; AU3792978A; AU519687B2; NL7807612A; DE2830629A1; FR2397192A1; GB2001077B

Description

Die Erfindung betrifft ein Arzneimittel für männliche Säugetiere einschliesslich Menschen zur Verhinderung der Fortpflanzung, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wirksame Menge eines Peptids der Formel p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3

enthält.

Das im Arzneimittel als Wirkstoff enthaltene Peptid be-einflusst die Ausschüttung von Gonadotropinen von der Hypophysendrüse bei männlichen Säugetieren einschliesslich Menschen. Das genannte Peptid inhibiert also die Ausschüttung von männlichen Steroidhormonen.

Die Hypophysendrüse ist mit einem Stiel an dem Bereich in der Basis des Gehirns angebracht, der als Hypothalamus bekannt ist. Die Hypophysendrüse enthält zwei Lappen, die Vorder- und Hinterlappen. Der Hinterlappen der Hypophyse speichert und leitet in den allgemeinen Kreislauf zwei Hormone ein, die in dem Hypothalamus erzeugt werden. Diese sind Vasopressin und Oxytocin. Der Vorderlappen der Hypophysendrüse scheidet eine Reihe von Hormonen ab, die komplexe Protein- oder Glycoproteinmoleküle sind und die durch den Blutstrom an verschiedene Organe wandern und die ihrerseits die Sekretion im Blutstrom anderer Hormone aus den peripheren Organen stimulieren. Insbesondere werden von der Hypophyse follikelanregendes Hormon und luteinisierendes Hormon ausgeschüttet. Diese Hormone regulieren in Kombination die Funktion der Gonaden bzw. Geschlechtsdrüsen bei der Bildung von Testosteron in den Hoden und Progesteron und Östrogen in den Ovarien und weiterhin regulieren sie die Bildung und Reifung der Gameten bzw. Geschlechtszellen. Diese Hormone werden manchmal als Gonadotropine oder gonadotropische Hormone bezeichnet.

Die Ausschüttung bzw. Freisetzung von Hormon durch den Vorderlappen der Hypophyse erfordert im allgemeinen eine vorherige Ausschüttung einer anderen Klasse von Hormonen, die von dem Hypothalamus gebildet werden. Eins der hypothalamischen Hormone wirkt als Faktor, der die Ausschüttung der gonadotropen Hormone, insbesondere des luteinisierenden Hormons, auslöst. Der Einfachheit halber wird im folgenden das luteinisierende Hormon als «LH» bezeichnet. Das hypothalamische Hormon, das als Ausschüttungsfaktor für LH wirkt, wird im folgenden als «LRF» bezeichnet, worin RF für «Releasing Faktor» bzw. «Ausschüttungsfaktor» steht und L angibt, dass das Hormon LH ausschüttet. LRF wurde isoliert und identifiziert.

Es wurde gezeigt, dass einige weibliche Säugetiere, die keinen Ovulationszyklus aufweisen und die keine Hypophysen- oder Ovarienkrankheit bzw. Mangel aufweisen, normale Mengen an Gonadotropinen, LH und FSH (follikelstimulierendes Hormon) abzuscheiden beginnen nach der Verabreichung von LRF. Die Verabreichung von LRF ist für die Behandlung von solchen Fällen von Unfruchtbarkeit geeignet, wo der funktionelle Fehler bzw. Mangel in dem Hypothalamus liegt. Die Ovulation kann in weiblichen Säugetieren durch die Verabreichung von LRF induziert werden. Jedoch muss der Dosisgehalt an LRF, der für den Ein-fluss der Ovulation erforderlich ist, manchmal sehr hoch sein. In kürzlichen Veröffentlichungen wurde angegeben, dass die Verabreichung von grossen und häufigen Mengen von LRF tatsächlich die Geschlechtsdrüsenfunktion bei weiblichen Ratten inhibiert. Aus diesem Grund wurde LRF als potentielles Contraceptivum geprüft. Der Hauptnachteil bei der Verwendung von LRF als potentielles Contraceptivum ist natürlich, dass grosse und häufige Dosen erforderlich sind.

Es besteht daher Bedarf an einem Peptid, das die Sekretion von Steroiden in wesentlich geringeren Gehalten inhibiert als LRF, und bei dem eine weniger häufige Verabreichung erforderlich ist. Es besteht weiterhin ein Bedarf an einem Peptid, das entweder männlichen oder weiblichen Säugetieren zur Verhinderung der Vermehrung verabreicht werden kann. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu erkennen, dass die pharmazeutische Industrie zahlreiche Bemühungen unternommen hat, ein Verfahren zur Behandlung von männlichen Säugetieren zu entwickeln, um die Vermehrung zu verhindern, dass aber bis jetzt noch kein solches geeignetes Verfahren gefunden wurde. Es ist überraschend, wegen der vollständig unterschiedlichen Hormonsysteme von männlichen und weiblichen Säugetieren, dass das gleiche Peptid entweder zur Behandlung von männlichen oder weiblichen Säugetieren verwendet werden kann, um eine Vermehrung bzw. Fortpflanzung zu verhindern.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Peptidbehandlung zur Verfügung zu stellen, gemäss der die Ausschüttung von Steroiden durch die Gonaden von männlichen Säugetieren, insbesondere Menschen, inhibiert wird. Es kann eine Peptidbehandlung zur Verfügung gestellt werden, die eine verbesserte Inhibitorwirkung bei den Vermehrungsverfahren von Säugetieren einschliesslich Menschen ermöglicht. Das im erfindungsgemässen Mittel als Wirkstoff enthaltene Peptid inhibiert die Ausschüttung von Gonadotropinen bei wesentlich niedrigeren Dosisgehalten, verglichen mit bekannten Peptiden, die die Freigabe von Gonadotropinen inhibieren. Das Peptid kann als Contraceptivum für männliche Säugetiere verwendet werden. Das das Peptid enthaltende, erfindungsgemässe Arzneimittel kann nach irgendeinem geeigneten und zweckdienlichen Verfahren, wie oral, durch Injektion oder subkutan, verabreicht werden. Das Peptid wird gewöhnlich mit geeigneten, pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln, wie Pflanzenölen, Zuckern, Polysacchariden und Gummis, kombiniert.

LRF wurde als Decapeptid der folgenden Struktur p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 charakterisiert.

s io

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Peptide sind Verbindungen, die zwei oder mehrere Aminosäuren enthalten, worin die Carboxylgruppe der einen Säure an die Aminogruppe der anderen Säure gebunden ist. Die Formel für LRF, wie oben dargestellt, entspricht der üblichen Darstellung von Peptiden, worin die Aminogruppe links und die Carboxylgruppe rechts erscheint. Die Stellung der Aminogruppen wird durch Bezeichnung der Amino-gruppen von links nach rechts identifiziert. Im Fall von LRF wurde der Hydroxylteil der Carboxylgruppe mit einer Aminogruppe (NH2) ersetzt. Die Abkürzungen für die einzelnen Aminosäuregruppen oben sind üblich und beruhen auf dem Trivialnamen der Aminosäure, worin p-Glu Pyrolglutamin-säure, His Histidin, Trp Tryptophan, Ser Serin, Tyr Tyrosin, Gly Glycin, Leu Leucin, Arg Arginin und Pro Prolin bedeuten. Ausgenommen von Glycin besitzen die Aminosäuren, sofern nicht anders angegeben, die L-Konfiguration.

Es ist bekannt, dass die Substitution von D-Ala oder D-Lys für Gly in der 6-Stellung von LRF-Decapeptid ein Pep-tidmaterial ergibt, das eine 3- bis lOfache grössere Potenz besitzt als LRF bei der Ausschüttung von luteinisierenden Hormonen und anderen Gonadotropinen von der Hypophyse von Säugetieren. Die Ausschüttungswirkung wird gewöhnlich erhalten, wenn das substituierte Peptid in den Blutstrom von Säugetieren eingeführt wird.

Es ist bekannt, dass die Substitution verschiedener Aminosäuren für His (oder das Weglassen von His) in der 2-Stel-lung des LRF-Decapeptids Peptidmaterialien mit einer Inhibitorwirkung auf die Ausschüttung von luteinisierendem Hormon und anderen Gonadotropinen von der Hypophyse von Säugetieren bewirkt. Insbesondere werden unterschiedliche Grade an Inhibierung bei der Ausschüttung von luteinisierendem Hormon erhalten, wenn His weggelassen wird, oder durch Asp, Cys, D-AIa, D-Phe und Gly ersetzt wird. Es wurde weiterhin gefunden, dass die Inhibitorwirkung dieser Peptide, die in der 2-Stellung modifiziert sind, stark verbessert werden kann, wenn D-Ala oder D-Lys für Gly in der 6-Stellung der Decapeptide substituiert wird. Beispielsweise ist das Peptid p-Glu-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

um das 3fache wirkungsvoller als Inhibitor für die Ausschüttung von Gonadotropin, als das gleiche Peptid, wenn Gly in der 6-Stellung anstelle von D-Ala vorhanden ist.

Es konnte ein Peptid synthetisiert werden, das um das etwa 150fache wirksamer ist als LRF. Es wurde gefunden, dass dieses Peptid bei der Verhinderung der Fortpflanzung wirksam ist, wenn es periodisch männlichen Säugetieren bei sehr niedrigen Dosismengen verabreicht wird. Es wurde ebenfalls gefunden, dass dieses Peptid wirksam ist, um die Implantation von befruchteten weiblichen Säugetiereiern bei sehr niedrigen Dosisgehalten zu verhindern, verglichen mit LRF. Das Peptid ist ebenfalls sehr wirksam und verursacht eine Resorption der befruchteten Eier, wenn es kurz nach der Konzeption verabreicht wird.

Das im erfindungsgemässen Arzneimittel als Wirkstoff enthaltene Peptid wird durch die folgende Formel dargestellt:

p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3.

Das wirksame Peptid kann nach einem Verfahren mit fester Phase synthetisiert werden. Die Synthese wird vorzugsweise stufenweise an chlormethyliertem Harz durchgeführt. Das Harz enthält gewöhnlich feine Perlen, vorzugsweise mit einem Durchmesser von 20 bis 70 um, eines synthetischen Harzes, das gewöhnlich durch Copolymerisation von Styrol mit 1 bis 2% Divinylbenzol hergestellt wird. Der Benzolring in dem Harz kann in einer Friedel-Craft-Reaktion mit Chlormethyläther und Zinn (IV) chlorid chlormethyliert werden. Das so eingeführte Chlor zeigt eine reaktive Bindung von Benzylchloridtyp. Die Friedel-Craft-Reaktion wird im allgemeinen weitergeführt, bis das Harz 0,5 bis 2 mMol Chlor pro Gramm Harz enthält.

Wie im folgenden beschrieben, werden die verwendeten Reagentien zuerst mit ihrem chemischen Namen und dann mit ihrer üblichen Abkürzung aufgeführt. Nachfolgend werden dann die Reagentien in der Regel mit ihren üblichen Abkürzungen bezeichnet.

Vorzugsweise geht man folgendermassen vor:

Das Triäthylammoniumsalz von Na-Boc-geschütztem Pro wird an dem chlormethylierten Harz durch Erhitzen am Rückfluss in Äthanol während etwa 48 Std. verestert. Es ist weiterhin möglich, das Harz oder Kaliumsalz in Dimethyl-formamid (DMF) oder Dimethylsulfoxid (DMS) bei Temperaturen im Bereich von 40 bis 80 °C zu verwenden. Nach der Schutzgruppenabspaltung und Neutralisation wird das Na-Boc-Derivat der nächsten Aminosäure Arg zusammen mit dem Kupplungsmittel angefügt, das Dicyclohexylcarbo-diimid (DCC) ist. Die Seitenkette von Arg wird mit Tosyl (Tos) geschützt. Die Schutzgruppenabspaltung, die Neutralisation und die Addition von den folgenden Aminosäuren wird entsprechend dem folgenden Schema durchgeführt:

Schema für die Kupplung von Aminosäuren bei der Synthese in fester Phase von p-Glu-His-Trp-Ser-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3 an 10 g Harz:

Stufe Reagenzien und Verfahren Misch zeit Min.

1 CH2C12 waschen 80 ml (2-mal) 3

2 Methanol (MeOH) waschen 30 ml (2-mal) 3

3 CH2C12 waschen 80 ml (3-mal) 3

4 50% Trifluoressigsäure (TFA) + 5% 1,2 Äthandithiol in CH2C12 70 ml (2-mal) 10

5 CH2C12 waschen 80 ml (2-mal) 3

6 Triäthylamin (Et3N) 12,5% in Dimethyl-formamid (DMF) 70 ml (2-mal) 5

7 MeOH waschen 40 ml (2-mal) 2

8 CH2C12 waschen 80 ml (3-mal) 3

9 Boc-Aminosäure (10 mMol) in 30 ml DMF (1-mal) + Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (10 mMol) in DMF 30

10 MeOH waschen 40 ml (2-mal) 3

11 Et3N 12,5% in DMF 70 ml (1-mal) 3

12 MeOH waschen 30 ml (2-mal) 3

13 CH2CI2 waschen 80 ml (2-mal) 3

Nach Stufe 13 wird ein aliquoter Teil für den Ninhydrin-test entnommen. Wenn der Test negativ ist, wird zur Stufe 1 für die Kupplung der nächsten Aminosäure zurückgegangen. Wenn der Test positiv oder etwas positiv ist, werden die Stufen 9 bis 13 wiederholt.

Das obige Schema kann zum Kuppeln von jeder der Aminosäuren des im erfindungsgemässen Arzneimittel enthaltenen Peptids verwendet werden. Der Na-Boc-Schutz wird z. B. für jede der restlichen Aminosäuren innerhalb der Synthese verwendet. OBzl wird als Seitenkettenschutzgruppe für Ser und Tyr verwendet. 2,6-Dichlorbenzyl kann als Seitenkettenschutzgruppe für Tyr verwendet werden. Tos, Dinitrophenyl (Dnp) oder Boc kann als Seitenkettenschutzgruppe für His verwendet werden. p-GIu wird als Benzyloxy-carbonal (Z)-geschützte Aminosäure eingeführt.

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Die Spaltung des Peptids von dem Harz erfolgt vorzugsweise durch Rühren des Harzes über Nacht in destilliertem Äthylamin bei 0 °C in einem Druckbehälter. Nach der Entfernung von überschüssigem Äthylamin durch Destillation unter Stickstoff oder im Vakuum kann das in Methanol suspendierte Harz von der Aufschlämmung durch Filtration entfernt werden. Das Harz wird in der Regel weiter nacheinander mit DMF, Methanol, DMF und Methanol gewaschen. Die wiedergewonnene Lösung aus gespaltenem, geschützten Peptid wird bevorzugt zur Trockne an einem Rotationsvakuumverdampfer bei Zimmertemperatur eingedampft. Das Peptid wird gewöhnlich einer minimalen Menge an Methanol zum Auflösen des Peptids aufgenommen. Die Lösung kann tropfenweise in einem 50fachen Überschuss an trockenem Äther unter Rühren gegeben werden. Ein ausge-flockter Niederschlag tritt auf, der durch Filtration oder Zentrifugieren abgetrennt werden kann. Der wiedergewonnene Niederschlag wird im allgemeinen getrocknet und die Schutzgruppen können abgespalten werden.

Die Schutzgruppenabspaltung des Peptids findet vorzugsweise bei 0 °C mit Chlorwasserstoffsäure (HF) statt. Anisol kann zu dem Peptid vor der Behandlung mit HF zugegeben werden. Nach der Entfernung von HF im Vakuum wird das Peptid vorzugsweise mit Äther behandelt, abdekantiert, in verdünnter Essigsäure aufgenommen und lyophilisiert.

Die Reinigung des Peptids erfolgt vorzugsweise durch Io-nenaustauschchromatographie an einer CMC-Säule, gefolgt von einer Verteilungschromatographie unter Verwendung des Elutionssystems: n-Butanol; Essigsäure; Wasser (4:1:5; Vol. Verhältnis). Die für die Trennungschromatographiesäule ist insbesondere Sephadex G 25.

Das Peptid wird gewöhnlich in einer Menge bzw. einem Gehalt verwendet, der wirksam ist, die Befruchtung durch männliches Sperma zu verhindern. Es wurde festgestellt,

dass das im erfindungsgemässen Arzneimittel enthaltene s Peptid bei Mengen wirksam ist, die so niedrig sind wie 0,5 Mikrogramm/kg Körpergewicht/Tag bei der Verzögerung der Pubertät, der Verhinderung der Implantation von befruchteten weiblichen Säugetiereiern während der Dauer der Behandlung, zur Verringerung der Gewichte von Hoden und io Spermabläschen nach einer 7tägigen Verabreichung bei männlichen Ratten. Die Testosterongehalte bei männlichen Ratten sind vergleichbar mit denen der Vergleichstiere innerhalb von einer Woche nach der Beendigung der Behandlung während 7 Tagen. Die Prostatagewichte der männlichen 15 Ratten stellen sich in 2 Wochen wieder ein und die Spermabläschengewichte in 4 Wochen. Es ist bevorzugt, Dosisgehalte im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 50 Mikrogramm/kg Körpergewicht/Tag zu verwenden. Höhere Gehalte können verwendet werden, aber man erhält bei der Verwendung höhe-20 rer Gehalte keinen wesentlichen Vorteil.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Es wurde festgestellt, dass bei der Behandlung männli-25 eher Ratten mit 10 Mikrogramm des aktiven Peptids einmal am Tag während 7 Tagen eine Verminderung im Hoden und Samenbläschengewicht einer Spermatogenese und Plasmaandrogengehalt auftreten. Die immunoreaktiven Gonado-tropingehalte in den behandelten männlichen Tieren werden, 30 bezogen auf Vergleichstiere, bestimmt und sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I Männliche Ratten

Gew. g Ng/ml Plasma

Hoden Samenbläschen LH FSH

Test.

DHT

Behandlung Vergleich 10 [ig Peptid während 15 Tagen

2,09 0,41

1,33 0,18

58

561

718

1582

4724 756

229 151

Die histologische Prüfung der Hoden nach der 7tägigen Behandlung zeigt tubuläre Schäden, eine gehemmte Spermatogenese und degenerierte Sertoli-Zellen während einer Zeit bis zu mehreren Wochen nach Beendigung der täglichen Injektion. Die Ratten können einen Coitus nach Beendigung der Injektionen eingehen, sie sind jedoch unfähig, eine Befruchtung zu verursachen.

Es ist somit erkennbar, dass das aktive Peptid bei der Behandlung zur Verhinderung der Fortpflanzung von männlichen Säugetieren nützlich ist.

Beispiel 2

Es wurde weiterhin bestimmt, dass die Behandlung von männlichen Ratten mit 10 Hg des Peptids lmal täglich während 15 Tagen eine Abnahme im Hoden und in dem Samen-50 bläschengewicht, Spermatogenese und Plasmaantrogenge-halte bewirkt. Die immunoreaktiven Gonadotropingehalte in den behandelten männlichen Tieren sind erhöht, bezogen auf die Vergleichstiere. Das im erfindungsgemässen Arzneimittel enthaltene Peptid scheint somit ein nützliches Con-55 traeeptivum für männliche Säugetiere einschliesslich Menschen zu sein.

Tabelle II Männliche Säugetiere

Gew. g Hg/ml Plasma

Hoden Samenbläschen LH FSH

Test

DHT

Behandlung Vergleich 10 ng Peptid während 15 Tagen

N

2,09 0,41

1,33 0,18

58

561

718 4724 756

1582

229 151

Vorzugsweise wird das Peptid in einer Menge von etwa 0,5 bis etwa 50 |xg/kg Körpergewicht/Tag verabreicht. Das Peptid kann in einer pharmazeutischen Dosiseinheitsform zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln für das Peptid verabreicht werden. 5

Das erfindungsgemässe Arzneimittel inhibiert die Freigabe bzw. Ausschüttung von Steroiden durch die Gonaden

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von Säugetieren, da durch die Verabreichung des Mittels am Säugetier eine wirksame Menge eines Peptids der Formel p-GIu-His-Trp-Ser-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3 verabreicht wird. Das erfindungsgemässe Arzneimittel kann in Form einer pharmazeutischen Dosiseinheit zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel für das Peptid verabreicht werden.

Claims

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1. Arzneimittel für männliche Säugetiere einschliesslich Menschen zur Verhinderung der Fortpflanzung, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wirksame Menge eines Peptids der Formel p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-NH-CH2-CH3 enthält.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es einen pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel enthält.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Arzneimittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger oder das Verdünnungsmittel ein pflanzliches Öl, ein Zucker, ein Polysaccharid oder eine gummiartige Substanz ist.

4. Arzneimittel nach den Ansprüchen 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass es in pharmazeutischer Dosiseinheitsform vorliegt.

5. Arzneimittel nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass es in Form eines oral zu verabreichenden Präparates oder als Injektionslösung vorliegt.