DE2428955A1

DE2428955A1 - Verfahren zur extraktion von bestandteilen mit in vivo antikoagulierender wirkung aus schlangengiften und daraus erhaltene produkte

Info

Publication number: DE2428955A1
Application number: DE2428955A
Authority: DE
Inventors: Eraldo Prof Antonini
Original assignee: Laboratori Biochimici Fargal Pharmasiast SpA
Current assignee: Laboratori Biochimici Fargal Pharmasiast SpA
Priority date: 1973-09-03
Filing date: 1974-06-15
Publication date: 1975-03-13
Also published as: FR2242110A1; ATA583374A; BE817699A; ES447851A1; DE2428955B2; US4027012A; AT335614B; GB1472574A; JPS5637792B2; CH626263A5; SE420321B; NL7407948A; JPS5049487A; SE7407341L; FR2242110B1; DE2428955C3; CA1028948A

Description

Patentanwalt HERMANN L. JUNG 757 baden baden

_hem mdwIg-Wlhelm-Straße

Telefon (07221)23933 Telegramme: JUPAT Baden-Baden

LB-1218M _Tag 12.6.197*.

_Tag

Verfahren zur Extrakt*ion von Bestandteilen mit "in vivo" antikoagulierender Wirkung aus Schlangengiften und daraus erhaltene Produkte.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion und Isolierung aus Schlangengift dieenzymatischen Komponente mit "invitro" koagulierender und "in vivo" antikoagulierender . Wirkung von den anderen Komjjienten mit "in vivo" koagulierender Wirkung und von den Proteinanteilen. Im besonderen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung einer außerordentlich reinen enzymatischen "in vivo" antikoagulierenden Komponenten des Schlangengiftes durch chromatografische Trennverfahren für die Gift-Komponenten.

Es ist allgemein bekannt, daß das Gift mehrerer Schlangenarten Enzyme enthält, welche die Eigenschaft besitzen, "in vitro" die Gelierung des Fibrinogen von Säugetier-Plasma zu katalysieren und deshelb die Koagulation bzw. Gerinnung des Blutes, des Plasmas und von Fibrinogen-Lösungen zu verursachen. Einige dieser Enzyme haben jedoch, wenn sie "in vivo" verwendet werden, die Eigenschaft, einen bemerkenswerten • Abfall des Fibrinogens zu bewirken und dadurch die

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Ungerinnbarkeit des Blutes zu verursachen. Zürn Beispiel ist der Fall des Giftes der Ancistrodon rhodostoma charakteristisch, weil dieses Gift koagulierende Eigenschaften "in vitro" besitzt, jedoch antikoagulierende Eigenschaften" "in vivo". Diese Tatsache findet eine Erklärung darin, daß in Schlangengiften neben anderen Protein-Komponenten zwei Typen von Enzymen anwesend sind, welche beide mit "in.vitro" koagulierender Wirkung ausgestattet sind, von denen jedoch eines, wenn es in Tierblut injiziert wird, eine vollständig entgegengesetzte Wirkung zeigt, nämlich die Ungerinnbarkeit des Blutes.

Daraus geht hervor, daß solche Verfahren außerordentlich wichtig sind, welche, wie bei der vorliegenden Erfindung, entwickelt worden sind, um die Komponenten des Schlangengiftes zu trennen und die Komponenten mit "in vivo" antikoagulierende Wirkung mit einem hohen Grad von Reinheit zu isolieren, welche dann mit außerordentlich guten Resultaten für die Herstellung von Präparaten mit pharmakologischer Wirkung verwendet werden können.

Bis heute wurde die Trennung von enzymatischen Verbindungen des Schlangengiftes durch Chromatografie mit Ionenaustauscherharzen und/oder mit Fraktionierverfahren durch Ausfällung mit Salzen oder durch geeignete Lösungsmittel durchgeführt.

Diese Methoden stellen jedoch weder einen zufriedenstellenden Reinheitsgrad sicher noch können sie mit einem in vernünftigen Grenzen liegenden geringen Aufwand von Arbeit durchgeführt werden.

Deshalb liegt der vorliegenden Erfindung.die Aufgabe zugrunde, ein Trennprozess für diese Enzyme zu finden,

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welcher sowohl die Reinheit des "in vivo" antikoagulierenden Enzyms als auch die Schnelligkeit des Durchführungsverfahrens garantiert.

Das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung einer chromatografischen Säule, welche mit einem festen ni.cht in wässrigen Lösungsmitteln löslichen Träger für die selektive Absorption des "in vivo" antikoagulierenden Enzyms gefüllt ist, wobei der Träger mit einem Substrat oder Hemmkörper für das besagte Enzym fest verbunden ist. Wenn man das Schlangengift, welches vorher für diese chromatografische Behandlung präpariert worden ist, durch die Säule unter geeigneten Bedingungen des pH und der Ionenstärke passieren läßt, so findet nur die Absorption des "in vivo" antikoagulierenden Enzyms statt, während die anderen Komponenten des Giftes nicht absorbiert werden. Folglich kann Eluierung des Träger-Enzym-Systems mit Lösungen bei einem pH, welcher verschieden vom Anfangswert ist oder mit Lösungen, welche ein freies Enzym-Substrat oder Hemmkörper enthalten, das gewünschte Enzym aus der Säule· mit .einem hohen Reinheitsgrad herausgelöst werden.

Deshalb betrifft die vorliegende Erfindung im besonderen ein Verfahren zur Extraktzion und zur Isolierung aus Schlangengift die enzymatische "in vivo" antikoagulierende Komponente aus den anderen Komponenten, welche "in vitro" koagulierende Wirkung haben, und von den Protein-Anteilen. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß das Schlangengift,' gelöst in einem für die chromatografische Abtrennungsbehandlung geeigneten Medium, eine Säule passiert, welche mit einem festen nicht in wässrigen Lösungsmitteln löslichen Träger für die selektive Absorption des "in vivo" antikoagulierenden Enzyms gefüllt ist,

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wobei der Träger mit einem Substrat oder Hemmkörper für das besagte Enzym verbunden ist, und daß ein erstes Eluierungsmittel bei pH 6-7 und mit einer Molarität von weniger oder gleich 0,05 M durch die Füllung gegeben wird, in die das Gift eingeführt wurde, wobei das Eluat in aufeinander folgenden Portionen gesammelt wird, bis die Eluierung von mehr als 95 % der Proteinanteile des Giftes und der "invitro" koagulierend wirkenden Fraktion erhalten ist und daß ein zweites Eluierungsmittel bei einem pH größer als 9 und mit einer Molarität von größer oder gleich 0,3 M durch die Säule gegeben wird, wobei das Eluat in aufeinander folgenden Portionen gesammelt wird, bis die Eluierung des "in vivo" antikoagulierenden Enzym, welches in der Säule absorbiert war, zusammen mit weniger als 5 % der Proteinanteile erhalten ist.

Für die Herstellung eines für die pharmakologische Verwendung geeigneten Präparates wird das so gewonnene zweite Eluat lyophilisiert, nachdem es mit Wasser bis auf 25 Trombinic Einheiten (NIH) pro ml verdünnt, durch Filtration durch ein Mikrofilfer sterilisiert, ein Hilfsmittel für die Lyophilisierung dem Filtrat zugegeben und das so erhaltene Material in 1 oder 2 ml-Dosen (23 - 50 NIH-Einheiten) in Ampullen abgefüllt wurde.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird im -Falle des Giftes der Ancistrodon rhodostoma als Hemmkörper (Inhibitor) für das "in vivo" antikoagulierende Enzym als Aminosäure Arginin durch covalente Bindung mit dem festen Träger verbunden, mit dem die Säule gefüllt ist. Das Trägermaterial selbst wird nach einer der allgemeinen Verfahren hergestellt, und ist

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bereits bekannt, daß damit Aminogruppen enthaltende Substanzen an eine unlösliche Matrix verschiedenen Typs gebunden werden kann. Als besonders geeignet für diesen Zweck haben sich in wässrigen Lösungsmitteln unlösliche Polymersubstanzen herausgestellt, welche Hydroxylgruppen enthalten, wie z.B. Dextran-Gel oder mit Cyanbromid vorbehandelte Zellulose.

Wie weiten, oben dargestellt wird dann zu diesen mit Cyanbromid aktivierten Substanzen eine Arginin-Lösung hinzugegeben, wobei sich eine Verbindung zwischen der.festen Matrix (Kunstharz) und dem Arginin-Rückstand bildet.

Als besonders geeignet als Trägermaterial hat sich ein Dextran-Gel herausgestellt, welche:, von den pharmazeutischen .Firmen unter dem Handelsnamen "Sepharose" vertrieben Tvird.

Nachfolgend werden einige illustrative aber nicht als Einschränkung aufzufassende Beispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben, welche sich auf das Gift der Ancistrodon rhodostoma (Beispiel I) und die Isolierung eines solchen "in vivo" antikoagulierenden Enzyms beziehen und auch auf die Herstellung eines pharmakologischen Präparates mit antikoagulierender Wirkung (Beispiel II).

Beispiel I

Reinigung des koagulierenden Wirkstoffes des Giftes der Ancistrodon rhodostoma·

Eine chromatografische Säule mit einem Durchmesser von 0,7 cm mit 10 ml eines gepackten Gels bestehend aus "Sepharose" verbunden mit Arginin, wird vorbereitet.

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Die Säule wird dann mit einem Tris-(hydroxymethylaminomethan)-phosphat 0,05 Puffer bei pH ? (hiernach für Abkürzung mit Tris-Phosphat bezeichnet) ins Gleichgewicht gebracht.

50 mg des lyophilisierten Giftes der Ancistrodon rhodostoma, gelöst in 1 ml desselben Puffers, wird zum Ausgleich der Säule benutzt. Die in die Säule eingeführte Giftlösung wird danach mit dem Tris-Phosphat 0,05 M Puffer bei pH 7 eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen von ungefähr 2 ml gesammelt. Die ersten JO ml des Eluats enthalten mehr als 90 % des gesammten Proteins, welches in dem in die Säule eingefüllten Gifts vorhanden war, und ungefähr -180 Einheiten der "in vitro" koagulierenden Wirkstoffe. (1 willkürliche Einheit des koagulierenden Wirkstoffes ist für die Zwecke der folgenden Experimente so definiert, daß diejenige henge des Enzyms, welche die beginnende sichtbare Bildung von Fibrinfiebern unter Umrühren in 15 Sekunden bei Raumtemperatur in einer 0,5 %-igen Lösung von menschlichem Fibrinogen erzeugen. Diese Einheit unterschiedet sich von den eingangs genannten NIH-Einheiten, welche als Trombinic-Einhelt nach dem N.I.H.-Standard; definiert sind). Wach dem Durchlauf der ersten 30 ml des Eluats wird die Lösung gewechselt und mit einem 0,2 M Tris-HCl-Puffer bei pH 9,3 eluiert. Dann wird das Eluat des neuen Puffers ebenfalls in Portionen von 2 ml gesammelt. Weniger als 10 % des in den 50 mg des in die Säule eingefüllten Giftes anwesenden Proteins und ungefähr ^20 koagulierende Einheiten sind in den ersten 20 ml dieses neuen Eluats enthalten.

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I-ian sollte beachten, daß:

a) das zweite Eluat deshalb den größeren Anteil der koagulierenden Wirkstoffe enthält und nur eine kleine Fraktion des Proteins des Ancistrodon rhodostoma-■ Giftes.

b) Die koagulierenden Wirkstoffe, welche im ersten Eluat anwesend sind, unterscheiden von den im zweiten Eluat vorhandenen koagulierenden Wirkstoffen und sind nicht in diese konvertierbar, was aus dem Nachfolgenden Versuch hervorgeht.

Die am stärksten wirkende Fraktion in Bezug auf die koagulierende Wirkung des ersten Eluats in Tris-Fhosphat 0,05 M Puffer bei pH 7 wird noch einmal in die in diesem Beispiel bereits beschriebene Säule zurückgegeben und wieder mit 0,05 M Puffer bei pH 7,0 ausgeglichen. Die Eluierung wird dann mit dem gleichen Puffer durchgeführt. Die gesammten koagulierenden Wirkstoffe, welche in die Säule eingegeben worden sind, werden nunmehr mit den ersten 20 ml eluiert. Das darauf folgende Eluat mit Tris-HCl 0,2 M Puffer bei pH 9,3 zeigt diesmal keinerlei Signifikante koagulierende Wirkung.

Ähnliche Resultate, wie die hier vorbeschriebenen, wurden in einer großen Anzahl von Versuchen erhalten, welche nach derselben Methode durchgeführt worden sind, wie sie vorbeschrieben ist, in denen Jedoch die Zusammensetzung des Puffers,' welcher für die erste und zweite Eluierung verwendet wurde, variiert worden ist. Für die erste Eluierung, worin der größere Anteil der "in vitro" koagulierenden Wirkstoffe in der Säule zurückgehalten wird, sind Tris-Phosphat-Puffer mit einer Molarität weniger oder gleich 0,05 M und einem pH zwischen 6 und 7 verwendet worden. Für die zweite Eluierung, welche den größeren Anteil der "in vitro" koagulierenden Wirkstoffe aus der Säule entfernt, sind Puffer mit einer Möiarität größer oder gleich 0,3 M "

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und einem pH zwischen 6 und 7 oder größer als 9 verwendet worden. Ein spezifisches Beispiel der unterschiedlichen Methoden für die Absorption und Eluierung in Bezug auf die vorstehend beschriebenen Versuche sei hiernach wiedergegeben.

Beispiel II

Reinigung eines "in vitro" koagulierenden Y/irkstoffes des Giftes der Ancistrodon rhodostoma und Vervollständigung eines Präparates iflit "in vivo" antikoagulierender Eigenschaft und geeignet für therapeutische Verwendung.

Eine chromatοgrafische Säule mit einem Durchmesser von 0,7 cm, welche 10 ml eines aus "Sepharose" mit Arginin bestehenden Gels enthält, wird wie im vorhergehenden Beispiel beschrieben, vorbereitet. Die Säule wird dann mit einem 0,01 MTris-Phosphat-Puffer bei pH 6,0 ins Gleichgewicht gebracht. 500 mg eines lyophilisierten Giftes der Ancistrodon rhodostoma wird in 5 ml desselben Puffers (0,01 MTris-Phosphat bei pH 6) gelöst und die Lösung wird anschließend durch die Säule gegeben.

Dann wird die Säule gewaschen, indem man 30 ml eines 0,01 MTris-Phosphat-Puffers bei pH 6,0 durch die Säule laufen läßt. Das Eluat wird in Fraktionen von 2 ml gesammelt. Dann wird die Lösung für die Eluierung gewechselt und ein 0,3 MTris-Phosphat-Puffer bei pH 6,0 verwendet. 75 ml dieser letztgenannten Lösung wird dann durch die Säule hindurchgegeben und das Eluat in zwei Fraktionen gesammelt.

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Das erste Eluat (0,01 M Tris-Phosphat bei pH 6) enthält mehr als 95 % des Proteins, welches am Anfang in den 500 mg des Giftes enthalten waren und ungefähr 2200 Einheiten der koagulierenden-Wirkstoffe. Das zweite Eluat (0,3 H Tris-Phosphat bei pH 6,0) enthält weniger als 5 % des Proteins, welches am Anfang in dem Gift enthalten'war und enthält außerdem 6000 Einheiten (willkürliche Einheiten) der "in vitro" koagulierenden Wirkstoffe. Man stellt nach Ultra-Filtration fest, daß das darin enthaltene Proteinmaterial im wesentlichen homogen ist, wenn es mit der Ultrazentrifuge oder durch Elektrophorese auf einem Gel analysiert wird.

Das zweite Eluat wird mit Wasser verdünnt,bis es 25 NIH-Einheiten (N.I.H. Trombinic Einheiten) pro ml enthält. Dann wird es sterilisiert durch Filtration über filtergeeigneter Porengröße, mit einem als Hilfsmittel für die Lyophilisierung geeigneten Material versetzt und anschließend lyophilisiert. Es ist üblich, das Material nach Abfüllung in Ampullen in Mengen von 1 oder 2 ml entsprechend 25 oder 50 N.I.H.-Einheiten zu lyophilisieren.

Man stellt fest, daß das so lyophilisierte Material, wenn ea durch Zugabe von Wasser wieder aufgelöst wird, eine unveränderte "in vitro" koagulierende . Wirkung besitzt, sogar dann wenn es mehrere Monate bei Bäumtemperatur aufbewahrt worden ist. Wird dieses Präparat in Mengen von 1 N.I.H.-Einheit pro kg Körpergewicht intravenös bei Kaninchen injiziert, so ergibt sich ein sehr starker Abfall oder sogar ein völliges Verschwinden des Blut-Fibrinogena

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innerhalb weniger Stunden, wobei signifikante Nebenerscheinungen und sekundäre Wirkungen völlig fehlen.

Dies wird durch die nachfolgenden Versuche dargestellt:

8 Kaninchen wurden in einen Stall gebracht, gewogen und in vier Gruppen zu zwei Tieren abgeteilt. Jedem Tier wurde nun durch intravenöse Injektion Dosen des gereinigten Materials gegeben, welche 1 N.I.H.«Einheit pro kg Körpergewicht gemäß der vorher festgestellten "in vitro" Wirksamkeit entsprachen. Das den Tieren nach zwei Stunden nach der Injektion entnommene Blut ist nicht mehr gerinnungsfähig. Weiten? Blutentnahmen wurden nach 24 h, nach 48 h, nach 72. h und nach 96 h nach dem folgenden Schema durchgeführt.

Kaninchen Nr.	Zeit Kaninchen Nr.	Zeit
1	24h 72h 5	24h 72h
2	48h 96h 6 ·	48h 96h
3	24h 72h 7	*2Jh** 72h
4	48h 96h 8	48h 96h

Bei den entnommenen Blutproben wurde die Fibrinogen-Armut bzw. das Fehlen des Fibrinogens durch die gravimetrischt Methode bestimmt. Die erhaltenen Werte sind nachfolgend zusammengestellt und zwar ausgedrückt als mg Fibrinogen pro ml Plasma

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	Nr.	_ 1	1 - 2428955	erhalten	wurden:
Kaninchen		Zeit	mg Fibrinogen/ml Plasma	Nr.	mg Fibrinogen/ml Plasma
1		24h	fehlt		10
3		24h	fehlt		16
5 2		24h 24h 48h	Beginn der Fibrinogen-Bildung nicht ffiessbar Beginn der Fibrinogen-Bildung hicht messbar • 6.2		8.4
4		48h	/
6		48h	4.1
8	Nr.	48h	• 4.3
Kaninchen		Zeit	mg Fibrinogen/ml Plasma
1		' 72h	8.1
3		72h	/
5		72h	7.7
7		72h	/
2		96h	10.5
		96h	15.6
6		96h	8.8
8	96h	/
Blutproben	wurden zur Bestimmung der Fibrinogenarmut
	auch den unbehandelten Kaninchen entnommen, wobei folgende
Resultate
Kaninchen
1
2
3

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Claims

Patent ansprüche

1· Verfahren zur Extrakt-ion und Isolierung aus Schlangengift die enzymatischen Komponenten mit "in vitro" koagulierender und "in vivo" antikoagulierender Wirkung von den anderen Komponenten mit "in vivo" koagulierender Wirkung und von den Proteinanteilen, dadurch gekennzeichnet, daß das Schlangengift gelöst in einem für die chromatografische Abtrennungsbehandlung geeigneten Medium. , eine Säule passiert, welche mit einem festen nicht in wässrigen Lösungsmitteln löslichen Träger für die selektive Absorption des "in vivo" antikoagulier enden Enzyms gefüllt ist, wobei der Träger mit einem Substrat oder Hemmkörper für das besagte Enzjm verbunden ist, und daß ein erstes Eluierungsmittel bei pH 6 - 7 und mit einer Molarität von weniger oder gleich 0,05 M durch die Füllung der Säule gegeben wird, in die das Gift eingeführt wurde, wobei das Eluat in aufeinander folgenden Portionen gesammelt wird, bis die Eluierung von mehr als 95 % der Proteinanteile des Giftes und der "in vitro" koagulierend wirkenden Fraktion, welche verschieden ist von der im zweiten Eluat anwesenden Fraktion, erhalten ist, und daß ein zweites Eluierungsmittel bei einem pH größer als 9 und mit einer Molarität von größer oder gleich 0,3 M durch die Säule gegeben wird, wobei das Eluat in aufeinander folgenden Portionen gesammelt wird, bis die Eluierung des "in vivo" antikoagulierenden Enzyms, welches in der Säule absorbiert war, zusammen mit weniger

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als 5 % der Proteinanteile erhalten ist.
2. Verfahren nach -Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger zur Füllung der Säule eine Polymersubstanz ist, welche eine Verbindung mit Aminogruppen eingeht.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymersubstanz Hydroxyl-Gruppen enthält und mit Cyanbromid aktiviert wird.
Zf. Verfahren nach - Anspruch 2 und 3» dadurch gekennzeichnet, daß als Polymersubstanz ein Dextran oder ein Zellulose-Gel verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis Jf, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat oder der Hemmkörper (Inhibitor) für das "in vivo" antikoagulierende Enzym eine Aminosäure bzw. ein Derivat davon ist.
6. Verfahren zur Extraktion und Isolierung aus dem Geift ' der Ancistrodon rhodostoma die Enzym-Komponente mit "in vivo" antikoagulierender Wirkung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Aminosäure Arginin verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gift der Ancistrodon rhodostoma lyophilisiert und gelöst ist in dem gleichen flüssigen Medium wie es für die Eluierung der Säule verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das für die erste Eluierung verwendete flüssige Medium ein Tris-(hydroxymethyl«ainomethan)-phosphat-Puffer bei pH 7 und eine Molarität von 0,05 M, oder

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pH 6 und einer Molarität von 0,01 M ist.
9. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das zweite Eluierungs-Medium ein Tris-HCl-Puffer bei pH 9,3 und einer Molarität von 0,3 M oder ein Tris-Phosphat-Puffer bei pH 6 und einer Molarität von 0,3 M ist. ■
10. Einen großen Reinheitsgrad besitzendes "in vivo" antikoagulierendes Enzym, extrahiert aus Schlangengift gemäß den Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
11. Verfahren zur Herstellung eines pharmakologischen Präparates, welches "in vivo" antikoagulierende W'irliunr besitzt, wobei ein Enzym nach Anspruch 7 verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym mit V/asser verdünnt wird auf einen Gehalt von 25 NIH-Einheiten pro 'ml, anschließend diese Flüssigkeit durch Filtration durch Mikrofilter sterilisiert wird, anschließend Hilfsmittel für die Lyophilisierung zugegeben werden und dieses Material nach der Abfüllung in Ampullen in Mengen von 1 oder 2 ml pro Ampulle (25 oder 50 NIH-Einheiten) lyophilisiert wird.
\2.» Antikoagulierendes pharmakologisch.es Präparat erhalten nach einem Verfahren nach Anspruch 11.
13. Verfahren für die Extrakt-.ion von Komponenten mit "in vivo" antikoagulierender V/irkung aus Schlangengift und Produkte, welche gemäß den Ansprüchen 1 bis 12 erhalten werden, so wie es beschrieben ist.

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