DE2734821B2

DE2734821B2 - Blutgerinnungsfördernde Präparation und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2734821B2
Application number: DE2734821A
Authority: DE
Inventors: Johann Dr. Eibl; Fritz Dr. Elsinger; Otto Dr. Schwarz
Original assignee: Immuno AG fuer Chemisch Medizinische Produkte
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1976-08-30
Filing date: 1977-08-02
Publication date: 1980-11-06
Also published as: NO148142B; FI57421B; NO148142C; CH635747A5; NL170922B; AR213861A1; FI57421C; ES461918A1; FR2362633A1; ATA640576A; CA1079191A; NL7708872A; NL170922C; DK151932C; NO772978L; SE443511B; DK384577A; FR2362633B1; LU78024A1; DE2734821A1

Description

Die Erfindung betrifft eine blutgerinnungsfördernde Präparation hergestellt aus menschlichem Titratplasma, enthaltend einen gegen Hämophilie A mit Faktor VHI-Inhibitor wirksamen Faktor.

Diese Substanz beeinflußt in neuartiger Weise die Blutgerinnung und bewirkt eine Umgehung der Faktor Vlll-Wirkung, was bedeutet daß die Blutgerinnung ohne Faktor Vlll-Zufuhr normalisiert wird.

Die Hämophilie A ist eine seit langem bekannten Krankheit (Bluterkrankheit), bei der der Blutgerinnungsablauf durch das Fehlen der Aktivität eines Blutgerinnungsfaktors gestört ist Dieser Faktor wird als Antihämophiler Faktor (AHF) oder Faktor VIII bezeichnet Eine Heilung dieser angeborenen, durch defekte Gene bedingten Krankheit als solche ist nicht möglich. Die Behandlung kann — im Falle einer Blutung

— nur durch intravenöse Zufuhr entsprechender Mengen an Faktor VIII, welcher aus dem Blut gesunder Spender stammt, erfolgen. Während man früher auf Vollblut bzw. Vollplasma angewiesen war, von denen große Mengen appliziert werden mußten, gibt es heute Präparate, die den Faktor VIII in konzentrierter und auch stabiler, gefriergetrockneter Form enthalten. Die Behandlung mit diesen Präparaten führt in den meisten Fällen zu einer raschen Blutstillung.

Es gibt jedoch auch Patienten, bei denen nicht nur ein Fehlen der Faktor VIII-Aktivität vorliegt sondern die auch einen gegen Faktor VIII gerichteten Hemmstoff (Inhibitor) besitzen, der — je nach vorhandener Menge

— die Wirkung von zugeführtem Faktor VIII durch Neutralisation (Inhibition) zunichte macht. Bei diesen Faktor VHI-Inhibitor-Patienten gab es bisher wenig Aussicht auf eine erfolgreiche Behandlung. Die einzige Möglichkeit bestand in der Entfernung des Inhibitors vor der Behandlung mit Faktor VIH-Konzentraten, was nur durch Austausch des Patientenplasmas gegen das Plasma eines gesunden Spenders oder gegen Plasmaer satzmittel möglich ist; dies erfordert einen großen technischen und medizinischen Aufwand. Der Plasmaaustausch muß vor neuerlicher Behandlung wiederholt werden, da der Inhibitor — speziell nach Zufuhr von neuem Faktor VIII als Antigen durch »Boostereffekt« — sich wieder nachbildet Eine Behandlung der

Inhibitorpatienten mit sogenannten »Immunsuppressi-

va« zur Unterdrückung der in vivo-Synthese des

Inhibitors ist bisher meistens erfolglos verlaufen. Seit kurzem zeichnet sich eine neue Möglichkeit zur

bo Behandlung von Faktor VHI-Inhibitor-Patienten ab. Kurcynski und Penner, New Engl. J. Med„ Bd. 291, Seiten 164 bis 167, 1974, berichteten als erste über eine erfolgreiche Behandlung von Faktor VIII-Iniiibitor-Patienten mit sogenannten »aktivierten« Prothrombin-

b5 komplex-Konzentraten. Auch in Publikationen von Sultan, Brouet und Debre, New Engl. J. Med., Bd. 291, Seite 1087, 1974, und Abildgaard, Britton und Roberts, Blood, Bd. 44, Seite 933, !974, wird über klinisch

erfolgreiche Anwendungen von aktivierten Prothrombinkomplex-Präparaten bei blutenden Faktor VHi-Inhibitor-Patienten berichtet

Die sogenannte Aktivierung dieser Prothrombinkomplex-Konzentrate ist wahrscheinlich auf unbekannte Verunreinigungen zurückzuführen. Die Präparate konnten bezüglich ihres wirksamen Prinzips nicht getestet und nicht standardisiert werden. Die Ergebnisse sind daher unsicher und kaum wiederholbar.

Die Erfindung bezweckt die Oberwindung der geschilderten Nachteile und Schwierigkeiten und stellt sich die Aufgabe, eine Präparation zu schaffen, die in wiederholbarer und gezielter Weise eine Generierung der gewünschten Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität gewährleistet Die Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität bzw. mit anderen Worten die Wirksamkeit gegen Hämophilie A mit Inhibitor soll mit Hilfe eines geeigneten Testsystems meßbar und standardisierbar sein. Die Präparation soll klinisch wirksam und verträglich sein, d. h. bei blutenden Faktor VIH-Inhibitor-Patienten zu einer Blutstillung führen und keine unerwünschten Nebenwirkungen zeigen.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch eine blutgerinnungsfördernde Präparation, hergestellt aus menschlichem Zitratplasma, enthaltend einen gegen Hämophilie A mit Faktor Vlll-Inhibitor wirksamen Faktor mit einem Molekulargewicht von etwa 100 000, erhältlich durch Behandein des Zitrationen enthaltenden Blutplasmas in Abwesenheit von freien Calciumionen mit wasserunlöslichen anorganischen gerinnungsoberflächen-aktiven Stoffen, wie Kieselgel, Kaolin oder Diatomeenerde, unter Einhaltung eines pH-Bereiches von 5,5 bis 8,5 und einer Temperatur von 0 bis 30⁰C, anschließendes Abscheiden der wasserunlöslichen Stoffe und Behandeln des Überstandes mit schwachbasischen Ionenaustauschern, worauf der zusammen mit den Faktoren II, VII, IX und X an den Ionenaustauschern adsorbierte blutgerrinnungsfordernde Faktor eluiert und zu lyophilisierten Präparaten verarbeitet wird, — gelöst.

Die neue Substanz mit Faktor VIH-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität ist ein Protein mit einem höheren Molekulargewicht als jenes der nicht aktivierten Faktoren II, VII, IX und X (Prothrombinkomplex), die ein Molekulargewicht von etwa 70 000 aufweisen, und ist daher von diesen strukturell verschieden.

Weitere Merkmale der erfindungsgemäßen blutgerinnungsfördernden Präparation sowie des Verfahrens zu ihrer Herstellung ergeben sich aus den Unteransprüchen.

Es ist zwar aus der DE-OS 24 59 291 bereits bekannt, eine Lösung des Prothrombinkomplexes, der die Faktoren II, VII, IX und X umfaßt mit kolloidaler Kieselsäure zu behandeln. Diese jekannte Behandlung erfolgt jedoch am Ende des Fraktionierungsprozesses lediglich zu Reinigungszwecken und zur Entfernung von Lipiden und unstabilen Proteinverunreinigungen aus dem Endprodukt. Eine Generierung des neuen Faktors mit Wirksamkeit gegen Hämophilie A mit Faktor Vlll-Inhibitor kann in dieser Phase wie beim Arbeiten nach der DE-OS 24 59 291, nicht mehr erfolgen. Man muß vielmehr als Ausgangsmaterial für die Herstellung der neuen Präparation menschliches Zitratplasma verwenden, welches alle Gerinnungsfaktoren in nativer Form enthält.

Bezüglich des Standes der Technik ist noch anzumerken, daß die Maßnahmen der Adsorption an Ionenaustauschern und ΕΙϋ!βΓυη^σ bei der Auferbeitun** eines Prothrombinkomplexes an sich bekannt sind, vgL z. B. DE-OS 22 62 520 und DD-PS1 21 793.

Zur Verarbeitung im erfindungsgemäßen Verfahren

können außer Vollplasma auch Plasmafraktionen

s verwendet werden, die nach Abtrennen des Faktors

VfII (AHF) anfallen, z.B. ein Plasmaüberstand von Kryopräzipitat oder von Präzipitat 1 nach Cohn.

Zweckmäßig werden bei Durchführung des erfindungsgernäßen Verfahrens die wasserunlöslichen anor- ganischen gerinnungs-physiologisch-oberfläschenakti ven Stoffe in einer Menge von 0,05 bis 5%, vorzugsweise 0,1 bis 1%, bezogen auf die Menge des

Plasmas, verwendet Zur Genierung des neuen Faktors mit Aktivität gegen

Hämophilie A mit Faktor VIH-Inhibitor können Stoffe eingesetzt werden, die zum Großteil aus feinteiligem Siliciumdioxid bestehen, z. B. Stoffe aus der Gruppe der Diatomeenerden, wie Celit, oder Stoffe, die aus Siliciumdioxid und Aluminiumoxid zusammengesetzt sind, z. B. Kaolin. Allgemein sind Stoffe geeignet die als »oberflächenaktiv im Gerrinnungssystem« bekannt sind bzw. die durch ihre Oberflächenaktivität in der Lage sind, die Kontaktphase der Blutgerinnung einzuleiten. Während die durch diese Stoffe oberflächenaktivierba ren Gerinnungsfaktoren (Faktoren XI und XII) in ihrer aktivierten Form in dieser Stufe adsorbiert werden, bleiben die Faktoren II, VII, IX, X zusammen mit dem generierten blutgerinnungsfördernden Faktor im Überstand und können nach Abtrennung der oberflächenak- tiven, wasserunlöslichen Stoffe unter Anwendung bekannter Methoden abgetrennt bzw. angereichert werden. Für letzteren Schritt können z. B. schwach basische Ionenaustauscher verwendet werden; Diäthylaminoäthyl (DEAE)-Gruppen-haltige, hochmolekulare Stoffe, z. B. DEAE gebunden an Cellulose oder quervernetzte Dextrane, haben sich besonders bewährt. Durch Adsorption an die erwähnten Ionenaustauscher, Waschen und Eluieren der adsorbierten Plasmaproteine mit erhöhter Ionenstärke kann die Proteinfraktion, welche die Faktor VM-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität nun in gereinigter und angereicherter Form enthält isoliert werden. Nach Entfernung der Salze durch Dialyse und anschließende Gefriertrocknung erhält man die lohe, die Faktor VM-Inhibitor-Über brückungs-Aktivität enthaltende Fraktion in trockener, stabilder Form. Aus dieser entsteht das fertige Präparat durch Wiederauflösung in Wasser, Zusatz von Salzen, pH Einstellung, Sterilfiltration und neuerliche Gefriertrocknung.

so Untersuchungen über die Eigenschaften der erfindungsgemäß hergestellten Präparationen brachten den Beweis, daß für die Faktor VHI-Inhibitor-Überbrücknungs-Aktivität die Faktoren Ha (Thrombin) und Xa nichts beitragen. Thrombin in Spuren, wie es in der erfindungsgemäß hergestellten Präparation enthalten sein kann, ergibt keine Verkürzung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit von Faktor VHI-Inhibitorplasma. Auch Sojabohnen-Trypsininhibitor — ein bekannter Inhibitor von Faktor Xa-Aktivität — hemmt die Faktor VIH-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität der Präparation nicht. Aufgrund von gelchromatographischen Untersuchungen hat sich ergeben, daß die neue Substanz ein höheres Molekulargewicht aufweist als die bekannten Faktoren des Prothrombinkomplexes II, VlI.

IX und X. Da ferner die aktivierten Faktoren des Prothrombinkomplexes durch enzymatische Abspaltung eines Bruchstückes des entsprechenden nativen (nicht aktivierten) Gerinnungsfsktors entstehen, somit

kleinere Moleküle entstehen als die Moleküle der entsprechenden nicht aktivierten Faktoren, ist mit Sicherheit anzunehmen, daß die Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität in den erfindungsgemäß hergestellten Präparationen nicht durch einen aktivierten Faktor des Prothrombinkomplexes bewirkt wird, sondern eben durch die neu generierte Substanz mit höherem Molekulargewicht

Zur Kennzeichnung der neuen Substanz kann einerseits das Verhältnis der Aktivitäten der Gerinnungsfaktoren II, VIL IX und X zur Faktor VIH-Inhibitor-Uberbi ückungs-Aktivität herangezogen werden: Dieses Verhältnis, ausgedrückt in Einheiten, liegt zwischen 0,1 und 10, vorzugsweise zwischen 03 und 2, wobei eine Einheit Faktor IL VII, IX, X der Aktivität dieser Faktoren entspricht die durchschnittlich in 1 ml frischem menschlichem Zitratplasma enthalten ist, und eine Einheit der Faktor VHI-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität als jene Aktivität definiert ist welche die aktivierte partielle Thromboplastinzeit eines hochtitrigen Faktor VIH-Inhibitorplasmas auf die Hälfte des Leerwertes verkürzt Andererseits kann zur Kennzeichnung der neuen Substanz auch ihre amidolytische Aktivität herangezogen werden. Unter amidoiytischer Aktivität versteht man die Fähigkeit einer Substanz, in standardisierten Peptidverbindungen, die über eine Amidbindung mit dem Chromophor p-Nitroanilin verbunden sind, das p-Nitroanilin abzuspalten, welches photometrisch bestimmt wird. Solche standardisierten Peptidpräparate werden z. B. von der Firma KABI in Schweden hergestellt; so sind das Peptid

S^ieON-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-

L-arginin-p-nitroanilid · HCl (Kurzform:

Bz-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid · HCI) für

Thrombin spezifisch,
S-2222N-Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-

L-glycyl-L-arginyl-p-nitroanilid · HCl

(Kurzform: Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-

p-nitroanilid · HCl) für
Xa und S-2251 D-Valyl-L-leucyl-L-lysyl-

p-nitroanilid · 2 HCl (Kurzform: D-Val-Leu-Lys-

p-nitroanilid · 2 HCl) für Plasmin.
Testet man die erfindungsgemäß hergestellte Präparation gegenüber den genannten Substraten, so findet man eine vernachlässigbar geringe amidoiytische Aktivität. Andererseits würde ein Test eines Präparates mit einem Gehalt von Thrombin und/oder Faktor Xa, wenn man diese auf die gleiche Faktor vm-inhibitor-Überbrükkungs-Aktivität einstellt, die die erfindungsgemäß hergestellte Präparation zeigt, eine hohe amidolytische Aktivität zeigen.

Ein weiteres Merkmal der erfindungsgemäßen Präparation ist auch darin zu sehen, daß sie, wenn überhaupt, nur eine geringe Thrombinaktivität besitzt. Das Verhältnis der Thrombinaktivität zur Faktor VIII-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität übersteigt 0,02 nicht, wobei die Thrombin-Aktivität in NIH-Einheiten (NIH = US-National Institute of Health) und die Faktor VIII-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität in Einheiten dieser Aktivität ausgedrückt ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren und die Eigenschaften der danach hergestellten Präparationen sind in den folgenden Beispielen und Testergebnissen näher erläutert:

Beispiel 1
Frisch gefrorenes Plasma wird bei 0° bis +4° C durch Zentrifugieren abgetrennt Der Kryoüberstand wird mit 0,5 η Salzsäure auf pH 7,0 gestellt, mit 5 g Kaolin pro 1 Liter Kryoüberstand versetzt und bei +4⁰C I Stunde gerührt Hierauf wird Kaolin durch Zentrifugieren abgetrennt Die generierte Substanz mit Faktor VIII-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität wird nun — zusammen mit den Faktorsn des Prothrombinkomplexes — an DEAE-Sephadex adsorbiert
Zu diesem Zweck werden 0,5 g DEAE-Sephadex A-50 pro 11 Kaolinüberstand zugesetzt und eine halbe Stunde bei +4^CC gerührt Die DEAE-Sephadex wird abgetrennt; das überstehende Plasma kann zur Gewinnung von Gamma-Globulin und Albumin verwendet werden; DEAE-Sephadex wird einem zweifachen Waschprozeß mit einer Trinatriumcitrat-Natriumchlorid-Lösung unterworfen, wobei ein pH-Wert von 7,5 eingehalten wird.

Zur Elution wird das DEAE-Sephadex mit 3% Natriumchlorid, 0,1% TrinatriumcitraU H₂O (2% des ursprünglichen Plasmavolumens) 20 Minuten gerührt und durch Filtration das Eluat gewonnen. Dieses wird über Nacht gegen 0,05% Trinatriumcitrat2 H₂O 0,1% Natriumchlorid-Lösung bei pH 7,0 bei +4° C dialysiert, hierauf eingefroren und einem ersten Lyophilisations-Vorgang unterworfen (bulk). Im bulk-Material wird die Faktor VIII-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität sowie die Aktivität der Faktoren des Prothrombinkomplexes bestimmt

Für die Herstellung der pharmazeutisch anwendba-

JO ren Präparation mit Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrükkungs-Aktivität soll das Verhalten Einheiten Faktor II-VII-IX-X zu Einheiten dieser Aktivität zwischen 0.5 und 2 liegen; dies kann durch Mischung geeigneter bulk-Chargen erfolgen. Das bulk-Material wird mit

J5 destilliertem, pyrogenfreiem Wasser gelöst, so daß die Faktor VIII-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität zwischen 10 und 50 Einheiten pro ml beträgt (vorliegendenfalls 25 Einheiten pro ml). Nach Zusatz der nötigen Salze zur Herstellung der Isotonie und Einstellung des pH zwischen 7,0 und 7,5 wird die Lösung durch Membranfilter geklärt und zuletzt durch ein 0,2 μΐη Membranfilter sterilfiltiert. Die Lösung wird unter sterilen Bedingungen zu 20 ml in die Endbehälter verfüllt, tiefgefroren und lyophilisiert.

Beispiel 2

so Als Ausgangsmaterial dient wieder frisch gefrorenes Plasma bzw. der daraus resultierende Kryoüberstand. Dem Kryoüberstand werden ohne pH-Stellung (nativer pH = 7,8) 10 g Celit 512 pro 1 Liter Kryoüberstand zugesetzt und 3 Stunden bei +4° C gerührt. Nach Abtrennung des Celits durch Zentrifugation wird die Aufarbeitung der Präparation mit der generierten Substanz mit Faktor VIII-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität in gleicher Weise vorgenommen wie in Beispiel 1.

An den fertigen Präparationen wurden neben den

bo üblichen Sicherheitstests auf Sterilität, Unschädlichkeit, Pyrogenfreiheit, Abwesenheit von H B_rAntigen Tests auf Wirksamkeit (Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrükkungs-Aktivität), Gehalt an Prothrombinkomplex-Faktoren, Thrombingehalt sowie die amidolytische Aktivitat mit den drei Substanzen S-2160, S-2222 und S-2251 durchgeführt.

Die vorgenommenen Tests wurden in nachfolgend

und das dabei anfallende K.r^voⁿräziⁿitst beschriebener Weiss durch^führt:

1. Wirksamkeitstest (Bestimmung der Einheiten
mit Faktor VIII-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität)

a) Reagenzien:

Faktor Vlll-Inhibitorplasma: .-

Zitratplasma eines Patienten mit Haemophilie A mit einem Inhibitor gegen Faktor VIII (Inhibitortiter mindestens 10 Einheiten per ml), lyophilisiert. Während der Testperiode wird das Inhibitorplasma ins Eisbad gestellt.

Phospholipid- Kaolin-Suspension:

Das Phospholipid-Konzentrat (Tachostyptan, Hormon Chemie München) wird i : 200 im Gwrens Puffer verdünnt und mit 0,5% Kaolin G/V (0,5 g '' pro 100 ml) versetzt. Das Gemisch wird tiefgefroren gelagert. Während der Testperiode wird es bei Raumtemperatur gehalten.

Zitrat-/Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel für Proben:

0,7% Natriumchlorid/0,7% Natriumzitrat · 2 H₂O m/20 Calciumchlorid:

2Ϊ

Während der Testperiode wird es bei 37° C gehalten.

b) Testmethode:

Nach Auflösung der zu untersuchenden Probe mit jo Faktor VIII-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität und eines Standardpräparates mit Faktor Vlll-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität mit definierten Einheiten dieser Aktivität pro ml in der angegebenen Menge destillierten Wassers, werden unter Ver- r, Wendung von ZitraWKochsalzIosung 6 geometrische Verdünnungen hergestellt, wobei man mit 5 Einheiten mit Faktor Vlll-Inhibitor Überbrükkungs-Aktivität pro ml beginnt. Diese Verdünnungen werden während der Testperiode in einem w Eisbad gehalten. Die Reagenzien wurden auf folgende Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,05 ml Faktor VIH-Inhibitorplasma

0,05 ml Probe (Verdünnungen der Testproben und des Standards, sowie auch Zitrat-/Koch-

salzlösung als Leerwert)
0,05 ml Phospholipid Kaolin Suspension
6 Minuten bei 37° C inkubieren
0,05 ml m/20 Calciumchlorid

Die Zeit von der Calciumchloridzugabe bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen (Kippen der Teströhrchen oder Anwendung eines automatischen Koagulometers).

c) Berechnung der Einheiten mit Faktor Vlll-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität pro Flasche:

Es wird eine Eichkurve erstellt, indem man die Gerinnungszeiten (in Sekunden) der Verdünnungen e>o des Standard-Präparates mit Faktor VIH-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität gegen die enisprechenden Konzentrationen (in Einheiten pro ml) auf doppelt logarithmisches Millimeterpapier aufträgt Die Faktor VIII-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivitäten der Testprobenverdünnungen werden unter Verwendung der Eichkurve und durch Multiplikation mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor errechnet. Der Mittelwert dieser Ergebnisse entspricht der Faktor Vlll-lnhibitor-Überbrükkungs-Aktivität der Testprobe, ausgedrückt in Einheiten pro ml. Multipliziert man diesen Wert mit dem Lösungsvolumen (in ml), dann erhält man die Gesamtmenge der Einheiten pro Flasche.

2. Bestimmung der Aktivität der Gerinnungsfaktoren Ii, VII, IX und X

A) Faktor II-Bestimmung

a) Reagenzien:

Serum:

Blut eines gesunden Spenders (ohne Antikoagulans) wird 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Vom geronnenen Blut wird das Serum entfernt, zentrifugiert, in Portionen aufgeteilt und tiefgefroren aufbewahrt.

Rinderoxalatplasma mit Bariumsulfat absorbiert (als Quelle für Faktor V und als Verdünnungsmittel für Proben):

Neun Teile Rinderblut werden mit einem Teil 134°/oigen Natriumoxalat vermischt. Das sich ergebende Plasma wird mit 10% Bariumsulfat absorbiert. Nach der Zentrifugierung wird das absorbierte Plasma in Portionen abgefüllt und tiefgekühlt aufbewahrt.

»Thromborel« (kalziumhältiges, menschliches Thromboplastin) Behringwerke AG, Marburg-Lahn.

b) Testmethode:

Die Reagenzien (sie werden mit Ausnahme von Thromborel während des Testvorganges in einem Eisbad aufbewahrt), werden auf folgende Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,05 ml Serum

0,05 ml Probe (Reihenverdünnungen der zu testenden Probe bzw. eines »normalen Plasmas« oder eines Standards)

eine Minute bei 37° C inkubieren

0,2 ml Thromborel (ist während des Testvorganges auf 37° C zu halten)

Die Zeit ab der Zugabe von Thromborel bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

c) Berechnung der Faktor II-Konzentration:

Aus gepoolten Plasmaproben von mindestens 15 gesunden Spendern wird ein Standardplasma hergestellt Dieses »Poolplasma« gilt als »normales Plasma« und seine Faktor II-Aktivität wird mit 100% angenommen. Nun wird eine Eichkurve erstellt, indem man die Gerinnungszeiten der Plasmareihenverdünnungen dieses gepoolten Plasmas (unverdünnt, 1:2, 1:4, 1:8, ...) gegen die entsprechenden Konzentrationen auf doppelt logarithmisches Millimeterpapier aufträgt Die Faktor Η-Konzentrationen der Testprobenverdünnungen werden unter Verwendung der Eichkurve in Prozent des normalen Plasmas ausgedrückt und mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor multipliziert Der Durchschnittswert dieser Ergebnisse entspricht der Aktivität des Testmaterials in

Prozent des Faktors Ii. Die Menge des in einer Flasche vorhandenen Faktors II wird nach der folgenden Formel berechnet:

Einheiten Faktor II =

(% Faktor 11-Konzentration) χ (Volumen in ml) _

tine Einheit Faktor II ist äquivalent zu jener Faktor Il-Aktivität, die durchschnittlich in 1 ml frischem Zitratplasma vorhanden ist.

B) Faktor VII-Bestimmung

a) Reagenzien:

Faktor VII-Mangelplasma: Zitratplasma eines Patienten mit schwerem Faktor VII-Mangel (Faktor VII unter 1%), in tiefgefrorenem Zustand gelagert oder nach Zugabe von 1 % Gewicht/Volumen HEPES lyophilisiert, mit einem pH-Wert von 7,0.

Zitrierte Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel der Proben:

0,7% Trinatriumzitrat ■ 2 H₂O, 0,7% Natriumchlorid. »Thromborel« (Kalziumhältigcs humanes Thromboplastin) der Behring-Werke AG, Marburg/Lahn.

b) Testmethode:

Das Mangelplasma und die Verdünnungen der Probe werden im Eisbad aufbewahrt »Thromborel« wird während der Untersuchung bei 37° C gelagert.

Die Reagenzien werden auf folgende Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,05 ml Faktor VII-Mangelplasma

0,05 ml Probe (Reihenverdünnungen der zu testenden Probe, bzw. eines »normalen Plasmas« oder eines Standards)

Eine Minute inkubieren bei 37° C

0,2 ml »Thromborel«

Die Zeit von der »Thromborek-Zugabe bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

c) Berechnung der Faktor VI I-Konzentration:

Die Berechnung der Faktor VII-Konzentration erfolgt in gleicher Weise wie für Faktor II beschrieben.

C) Faktor IX-Bestimmung

a) Reagenzien:

55

Faktor IX-Mangelplasma: Zitratplasma eines Patienten mit schwerer Hämo-

philie B (Faktor IX unter 1%), in tiefgefrorenem

Zustand gelagert Phospholipid/Kaolin-Suspension: Phospholipid-Konzentrat (Tachostyptan, Hormon Chemie München) wird 1:200 in Owren's Puffer

verdünnt, mit Kaolin versetzt (0,5 g per 100 ml) und tiefgekühlt gelagert

Rinderoxalatplasma, mit Bariumsulfat absorbiert,

als Verdünnungsmittel für Proben:

9 Teile Rinderblut werden mit einem Teil l,34%igem Natriumoxalat vermischt Das sich ergebende Plasma wird mit 10% Bariumsulfat

65 absorbiert. Nach dem Zentrifugieren wird das absorbierte Plasma in Portionen abgefüllt und tiefgefroren aufbewahrt. m/20 Kalziumchlorid

b) Testmethode:

Inkubation von Faktor !X-Mange!p!asma mit Phospholipid/Kaolin-Suspension: Die erforderliche Menge von Mangelplasma wird

mit einem gleichen Volumen von Phospholipid/

Kaolin-Suspension vermischt, 5 Minuten bei 37° C

inkubiert und dann 30 Minuten in einem Eisbad gelagert

Die Reagenzien (sie werden mit Ausnahme von Kalziumchlorid während des Testvorganges in

einem Eisbad aufbewahrt), werden auf folgende

Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,20 ml inkubierte Mangelplasma-Phospholipid/ Kaolin-Suspension

0,10 ml Probe (Reihenverdünnungen der zu testenden Probe bzw. eines »normalen Plasmas« oder eines Standards)

eine Minute bei 37° C inkubieren

0,10 ml m/20 Kalziumchlorid (ist während des Testvorganges bei 37⁰C zu halten)

Die Zeit ab der Zugabe von Kalziumchlorid bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

c) Berechnung der Faktor IX-Konzentration:

Die Berechnung der Faktor IX-Konzentration erfolgt in gleicher Weise wie für Faktor H beschrieben.

D) Faktor X-Bestimmung:

a) Reagenzien:

Faktor X-Mangelplasma: Zitratplasma von einem Patienten mit schwerem Faktor X-Mangel (Faktor X unter 1%) wird

tiefgekühlt gelagert oder nach Hinzufügung von 1% HEPES und Einstellen des pH-Wertes auf 7,0 lyophilisiert

Zitrat-Kochsalzlösung als Verdünnungsmittel für

Proben:

0,7% Natriumchlorid/0,7% Natriumzitrat · 2 H₂O

»Thromborel« (kalziumhältiges, menschliches

Thromboplastin), Behringwerke AG, Marburg/

Lahn.

b) Testverfahren:

Die Reagenzien (sie werden mit Ausnahme von Thromborel während des Testvorganges in einem Eisbad aufbewahrtX werden auf folgende Weise in Glasröhrchen pipettiert:

0,05 ml Faktor X-Mangelplasma

0,05 ml Probe (Reihenverdünnungen der zu testenden Probe bzw. des »normalen Plasmas« oder eines Standards)

it

eine Minute bei 37° C inkubieren 0,20 ml Thromborel (ist während des Testvorganges auf 37° C zu halten).

Die Zeit ab der Zugabe von Thromborel bis zur Gerinnselbildung wird mit einer Stoppuhr gemessen.

c) Berechnung einer Faktor X-Konzentration:

Die Berechnung der Faktor X-Konzentration erfolgt in gleicher Weise wie für Faktor II beschrieben.

3. Thrombintest

a) Reagenzien:

l°/oige Fibrinogenlösung menschlichen Ursprungs standardisiertes Thrombin (Topostasin, Roche, 3000 NIH-Thrombin-Einheiten pro Flasche) 0,7% Natriumchlorid/0,7% Natriumzitrat ■ 2 H₂O als Verdünnungsmittel (Zitrat'/Kochsalzlosung).

b) Testmethode:

Nach Auflösung des lyophilisierten Produktes in der angegebenen Menge destillierten Wassers werden sechs geometrische Verdünnungen unter Verwendung von ZitraWKochsalzlosung und acht geometrische Verdünnungen vom standardisierten Thrombin hergestellt, wobei man mit 1 NIH-Einheit per ml beginnt

Testverfahren:

0,20 ml 1 %ige Fibrinogenlösung und

0,20 ml Probe (Präparation mit Faktor VIH-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität und Thrombinverdünnungen, sowie auch ein Leerv/ert mit Zitrat-/Kochsalzlösung)

werden bei 37° C inkubiert Die Zeit bis zur Gerinnselbildung wird durch Kippen der Teströhrchen in immer größer werdenden Zeitabständen, u.zw. von 10 Minuten bis zu einer Stunde, gemessen. Dieser Vorgang erstreckt sich auf mindestens 6 Stunden. Ein letztes Kippen der Röhrchen erfolgt nach der Inkubation über Nacht Der Leerwert (Verdünnungsmittel als Probe) muß über Nacht stabil bleiben (keine Gerinnselbildung).

c) Berechnung der Thrombin-Konzentration:

Es wird eine Eichkurve ersiüllt, indem man die Gerinnungszeiten der geometrischen Verdünnungen des Standardthrombins gegen die entsprechende Konzentration (Thrombineinheiten pro ml) auf doppelt logarithmisches Millimeterpapier aufträgt Die Thrombin-Konzentrationen der Testprobenverdünnungen werden unter Verwendung der Eichkurve und durch Multplikation mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor errechnet Der Mittelwert dieser Ergebnisse entspricht der Thrombin-Aktivität der Testprobe, ausgedrückt in Thrombineinheiten pro mL Multipliziert man diesen Wert mit dem Lösungsvolumen in ml, so erhält man die Gesamtmenge der Thrombin-Einheiten pro Flasche.

4. Bestimmung der amidolytischen Aktivität, a) Reagenzien:

Chromogene Substrate:

S-2160: N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-p-nitroanilid · HCl (Kurzform: Bz-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid · HCl) 0,5 mg/ml H₂O=0,73 m molar

S-2222: N-Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-

L-glycyl-L-arginyl-p-nitroanilid ■ HCl (Kurzform: Bz-lle-Glu-Gly-Argp-nitroanilid · HCl) 1,4 mg/ml H₂O= 1,91 m molar

S 2251: D-Valyl-1-leucyl-L-lysyl-p-nitro-

anilid · 2 HCl (Kurzform: D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid ■ 2 HCl) 1,65 mg/ml H₂O=2,99 m molar

Puffer: 6,06 g »Tris« (Tris(hydroxymethyl)-amino-

methan)=0,05 molar 10,60 g Natriumchlorid=0,18 molar

Mit 1 Liter dest. Wasser lösen. Der pH-Wert wird mit konzentrierter Salzsäure auf 7,4 eingestellt

b) Testverfahren:

1,0 ml Puffer

0,1 ml Testprobe (Präparation mit Faktor VIII-In-

hibitor-Überbrückungs-Aktivität) 0,2 ml Substrat (S-2160 bzw. S-2222 bzw. S-2251)

Dieses Gemisch wird in eine auf 37° C temperierbare Küvette (Schichtdicke 1 cm) gefüllt und in einem Photometer bei 405 nm Zunahme der optischen Dichte in Zeitintervallen von 1 Minute gemessen.

c) Auswertung:

Aus mindestens 5 Einzelmessungen wird die durchschnittliche Zunahme der optischen Dichte pro Minute berechnet und mit 1000 multipliziert; dieser Wert wird mit A OD · W/min bezeichnet und dient zur Charakterisierung der amidolytischen Aktivität (Enzymaktivität) der untersuchten Probe zu Bezug auf das jeweils eingesetzte Substrat Dividiert man nun die gemessenen Δ OD ■ 10³/ min-Werte durch die Aktivität der Testprobe in Einheiten mit Faktor VHI-Inhibitor-Überbrükkungs-Aktivität pro 0,1 ml (eingesetzte Probennienge) bzw. in Faktor IL VH, IX, X-Einheiten pro 0,1 ml so ergibt sich eine für die jeweilige Testprobe — unter den erwähnten Testbedingungen — charakteristische »spezifische amidolytische Aktivität«, d.h. der auf 1 Einheit mit Faktor VIII-Inhibitor-Oberbrückungs-Aktivität bzw. 1 Einheit Faktor II, VII, IX, X bezogen Δ OD · 10V min-Wert

Die nach den Beispielen 1 und 2 hergestellten Präparationen zeigten bei den in der beschriebenen Weise durchgeführten Tests die in der Tabelle angegebenen Eigenschaften.

27 34 821	13	Beispiel I	14	Beispiel 2
	20 ml	20 ml
Abfijll- bzw.Auflösungsvolumen	470	280
Einheiten mit Faktor Vlll-Inhibitor-Überbriickungs-		240 (0,86) I
Aktivität pro Flasche	610(1,30)	260 (0,93)
Faktor ll-Einheiten pro Flasche	520(1,11)	300(1,07)
Faktor VII-Einheiten pro Flasche	700(1,49)	210(0,75)
Faktor IX-Einheiten pro Flasche	540(1,15)	1,0 (0,004)
Faktor X-Einheiten pro Flasche	1,4 (0,003)
Thrombin NIH-Einheiten pro Flasche		1 (0,71)
Amidolytische Aktivitäten (AOD. 107min)	1 (0,43)	2,5(1,79)
S-2160	3(1,28)	2(1,43)
S-2222	4(1,70)
S-2251

Die Zahlen in Klammern geben das jeweilige Verhältnis zu den Einheiten mit Faktor VHI-lnhibitor-Überbrückungs-Aktivitätan. Bei den amidolytischen Aktivitäten ist die Zahl in Klammer die »spezifische amidolytische Aktivität«, d.h. der jeweilige ^OD. 107min-Wert pro eine im beschriebenen Testsystem eingesetzte Einheit mit Faktor VI 11-Inhibitor-Überbrückungs-Aktivität.

Claims

Patentansprüche:

1. Bhitgerinnungsfö! iernde Präparation, hergestellt aus menschlichem Zitrat-Plasma, enthaltend einen gegen Hämophilie-A mit Faktor VHI-Inhibitor wirksamen Faktor mit einem Molekulargewicht von etwa 100 000, erhältlich durch Behandeln des Zitrat-Ionen enthaltenden Blutplasmas in Abwesenheit von freien Calciumionen mit wasserunlöslichen, anorganischen, gerinnungs-oberflächenaktiven Stoffen, wie Kieselgel, Kaolin oder Diatomeenerde, unter Einhaltung eines pH-Bereiches von 5,5 bis 83 und einer Temperatur von 0 bis 30° C, anschließendes Abscheiden der wasserunlöslichen Stoffe und Behandeln des Oberstandes mit schwachbasischen Ionenaustauschern, worauf der zusammen mit den Faktoren H, VII, IX und X an den Ionenaustauschern adsorbierte blutgerinnungsfördernde Faktor eluiert und zu lyophilisierten Präparaten verarbeitet wird.

2. Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß sie aus Blutplasma nach Abtrennung von Faktor VIII erhältlich ist

3. Präparation nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß das Verhältnis der Aktivitäten der Gerinnungsfaktoren II, VII, IX und X zur Aktivität des blutgerinnungsfördernden, gegen Hämophilie A mit Faktor Vlll-Inhibitor wirksamen Faktors, ausgedrückt in Einheiten, zwischen 0,1 und 10 liegt wobei eine Einheit Faktor II, VII, IX und X der Aktivität dieser Faktoren entspricht die durchschnittlich in 1 ml frischem menschlichem Zitratplasma enthalten ist und eine Einheit des blutgerinnungsfördernden Faktors als jene Aktivität des Faktors, welche die aktivierte partielle Thromboplastinzeit eines hochtitrigen Faktor VHI-Inhibitorplasmas auf die Hälfte des Leerwertes verkürzt definiert ist.

4. Präparation nach einem der Anspruch? 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet daß die spezifische amidolytische Aktivität bezüglich der Substrate

N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginin-

p-nitroanilid · HCl, ' N-Benzoyl-L-isoleucyl-L-glutamyl-L-glycyl-

L-arginyl-p-nitroanilid · HCI, D-Valyl-L-leucyl-L-lysyl-p-nitroani-

Hd · 2 HCl,

d.h. die Δ OD- 1 OVmin-Werte pro Einheit des blutgerinnungsfördernden, gegen Hämophilie A mit Faktor VHI-Inhibitor wirksamen Faktors nicht größer als 4 sind und die Δ OD ■ lOVmin-Werte pro 1 Einheit Faktor II, VII, IX und X nicht größer als 3 sind.

5. Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Thrombinaktivität zu der Aktivität des blutgerinnungsfördemden, gegen Hämophilie A mit Faktor VIH-Inliibitor wirksamen Faktors 0,02 nicht übersteigt, wobei die Thrombinaktivität in NIH-Einheiten und die Aktivität des blutgerinnungsfördernden Faktors in Einheiten dieses Faktors ausgedrückt ist.

6. Verfahren zur Herstellung der blutgerinnungsfördernden Präparation nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliches, Zitrat-Ionen enthaltendes Plasma in Abwesenheit von freien Calciumionen, gegebenenfalls nach Abtrennung von Faktor VIII, mit wasserunlöslichen anorganischer! gerinnungsphysiologisch-oberflä chenaktiven Stoffen behandelt, anschließend die wasserunlöslichen Stoffe abscheidet und schließlich den Oberstand mit basischen Ionenaustauschern behandelt, wobei der zusammen mit den Faktoren II, VII, IX und X an den Ionenaustauschern adsorbierte blutgerinnungsfördernde Faktor mit der den Faktor VHI-Inhibitor überbrückenden Aktivität eluiert und konzentriert wird.