DE2715748B2

DE2715748B2 - Gereinigte aktive Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs und ihre Verwendung

Info

Publication number: DE2715748B2
Application number: DE19772715748
Authority: DE
Inventors: Jean Paris Choay; Jean Oissel Goulay; Jean-Claude Maromme-la-Maine Lormeau
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1976-04-07
Filing date: 1977-04-07
Publication date: 1981-03-19
Also published as: DE2715748C3; DE2715748A1; NL7703738A; JPS52151711A; GB1581472A; JPS6157289B2; FR2347048B2; BE853350R; FR2347048A2

Description

Die Erfindung betrifft eine weitere Ausgestaltung der in der Hauptanmeldung P 24 59 9153-41 beschriebenen gereinigten aktiven Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs gemäß Oberbegriff des Hauptanspruchs sowie deren Verwendung zur Bekämpfung von Firinolvseunterfunktionen.

Gegenstand der Hauptanmeldung ist eine aktive Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs, die bei neutralem pH-Wert in Wasser löslich ist, im wesentlichen frei von Plasmin ist und zu mindestens 40 Gew.-% native Plasminogenfragmente aufweist, aus denen ein Peptidfragment mit einem Molekulargewicht von 7000 bis 8000 N-terminal abgespalten ist, erhältlich durch Auslaugen eines von Plazentablut befreiten Plazentabreies im Temperaturbereich von 0 bis 20⁸C, mit einer Losung, die

a) einen pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise einen neutralen pH-Wert aufweist,

b) eine Aminosäure enthält, welche die Aktivierung des Plasminogens inhibiert, in einer Konzentration von mehr als 0,001 Mol sowie ein Verfahren zur Gewinnung dieser aktiven Verbindung.

Nach diesem Verfahren erhält man diese aktive Verbindung des Plasrninogen-Typs menschlichen Ursprungs durch

a) fraktioniertes Ausfällen der Verbindung des Plasminogen-Typs,

b) Aufnehmen der erhaltenen Ausfällung, die die Verbindung des Plasminogen-Typs enthält, mit einer wäßrigen Lösung,

c) Dialysieren der erhaltenen wäßrigen Lösung,

d) Affinitätschromatographieren des erhaltenen gereinigten Dialysats und

e) erneutes Dialysieren des Eluats der Affinitätschromatographie,

is wobei sämtliche Verfahrensschritte bei einem pH-Wert von oberhalb 5 durchgeführt werden. Dabei erhält man die aktive Verbindung des Plasminogev-Typs, ausgehend von Plazentabreien, die man ihrerseits insbesondere durch mechanisches Zerkleinern gefrorener Plazen- tas, Auftauen der erhaltenen Breie, das praktisch beendet wird, wenn die Temperatur dieser Breie 1*C übersteigt und Abtrennen des Plazentablutes, vorzugsweise bei einer Temperatur von etwa 4° C, insbesondere durch Zentrifugieren und Gewinnen des unlöslichen Breies erhält Dieser Plazentabrei enthält insbesondere die Plazentagewebe und die Fibrinklumpen oder -klümpchen, die in der Plazenta enthalten waren.

Gemäß der in der Hauptanmeldung beschriebenen Verfahrensweise bewirkt man eine Extraktion der Verbindungen des Plasminogen-Typs, die in diesem Brei enthalten sind, indem man den Plazentabrei mit einer Lösung, die einen pH-Wert aufweist, der das ln-Lösung-Halten des extrahierten Plasminogens ermöglicht, und insbesondere zwischen 5 und 110 und vorzugsweise im Neutralbereich liegt, in Gegenwart eines Inhibitors der Aktivierung des Plasminogen^ insbesondere einer ε-Aminosäure, auslaugt, wobei man nach der Abtrennung des restlichen Breies eine Lösung erhält, die die fraglichen Verbindungen vom Plasminogen-Typ enthält Der Inhibitor der Aktivierung des Plasminogens und mindestens ein großer Anteil der die Verbindungen vom Plasminogen-Typ begleitenden Proteine, die in der genannten Lösung enthalten sind, können mit Hilfe klassischer Verfahrensweisen beseitigt werden, insbe sondere jener, die in der Hauptanmeldung beschrieben sind.

Es ist hierdurch möglich, Zubereitungen oder Produkte, die wasserlösliche Verbindungen vom Plasminogen-Typ enthalten, zu gewinnen, die einen Plasmino-

gengehait von mehr als 4 UCA-Einheiten/mg (kaseino-Ivtische Einheiten/mg) und einen Plasmingehalt aufweisen, der vernachlässigt werden kann, da er unterhalb 0,04 UCA-Einheiten/mg liegt Insbesondere liegen die Plasminogengehalte der nach dem Verfahren der Hauptanmeldung erhältlichen Zubereitungen, ausgedrückt in Mikrokatal, im Bereich von 23 bis 2,6 Mikrokatal.

In diesem Zusammenhang sei daran erinnert, daß eine Plasminogen-Aktivität von 1 Mikrokatal der Plasmin dosis entspricht, die man aus der entsprechenden Plasminogendosis nach der Aktivierung des Plasminogens mit Urokinase erhält, die dazu in der Lage ist, I μΜοΙ des Methylesters von N-Acetyl-glycin-L-lysin pro Sekunde bei 37°C zu hydrolysieren (wobei die

h) Aktivität der Esterhydrolyse des Plasmins mit einem pH-Staten erfolgt).

Die Analyse der nach dem Verfahren der Hauptanmeldung erhaltenen Zubereitungen zeigt, daß sie

verschiedene Verbindungen vom Plasminogen-Typ enthalten. Insbesondere unter Zuhilfenahme von Elektrofokussierungstechniken jst festzustellen, daß sie bis zu 8 Protein-Peaks aufweisen können, deren isoelektrische Punkte zwischen 6,00 und 8,25 liegen. Die Bestimmung der NHrGruppen aufweisenden, endständigen Aminosäuren der verschiedenen Verbindungen vom Plasminogen-Typ, die in den fraglichen Zubereitungen enthalten sind (insbesondere unter Anwendung der Methode von Gros und Labouesse, Europ. J. Biochem. 7 [1969], 453) hat gezeigt, daß sie erhöhte Anteile an »voraktivierten Plasminogenen« oder »durch teilweise Proteolyse gebildete Plasminogene« enthalten, die aus dem vollständigen Plasminogen, das auch als »Glutamyl-PIasminogen« bezeichnet wird, entstanden sind, das die gleiche NHrGruppen aufweisende endständige Aminosäure wie das Plasminogen des zirkulierenden Blutes aufweist, und das insbesondere dadurch gebildet ist, daß die letzteren mindestens ein Peptidfragment verloren haben, das die endständigen Aminosäuren dieser Verbindung enthält, die durch Glutaminsäure mit freier Aminogruppe gebildet sind.

Diese Verbindungen des Plasminogen-Typs scheinen von der gleichen Art zu sein wie jene, die vorübergehend im Verlauf der Proteolyse der nativen Plasminogene zu Plasmin unter dem Einfluß «ines Aktivators des Plasminogens oder des Plasmins als solchem auftreten, worauf die Ausdrücke »voraktivierte Plasminogene« oder »durch teilweise Proteolyse gebildete Plasminogene« zurückgehen, die zur Bezeichnung der besonderen Verbindungen Vc₁Ui Plasminogen-Typ verwendet werden, von denen hierin die Rode ist

Unter den voraktivierten Plasminogenen, die in den Zubereitungen der Hauptanmeldu^? enthalten sind, findet man in den fraglichen Zubereitungen oder Produkten häufig die überwiegende Anwesenheit von Peptidketten, die als endständige Aminosäuregruppen mit freier Aminogruppe Methionin enthalten und die im folgenden als »Methionyl-Plasminogene« bezeichnet werden. So können diese Zubereitungen beispielsweise 40 bis 60% Methionyl-Plasminogen enthalten.

Wie in der Hauptanmeldung angegeben ist, sind die aktiven Verbindungen des Plasminogen-Typs in Wasser löslich. Sie sind weiterhin stabil, insbesondere weil sie kein Plasmin oder Plasmin nur in vernachlässigbaren Mengen enthalten.

Es hat sich gezeigt, daß die nach dem Verfahren der Hauptanmeldung erhaltenen aktiven Verbindungen, insbesondere wenn dieses Verfahren in technischem Maßstab durchgeführt wird, auch erhebliche Mengen anderer voraktivierter Plasminogene enthalten können, insbesondere Verbindungen vom Plasminogen-Typ, die als endständige Aminosäure mit freier Aminogruppe Lysin enthalten (Lysyl*Plasminogen).

Die vorliegende Erfindung betrifft nun noch weiter an »voraktivierten Plasminogenen« angereicherte aktive Verbindungen des Plasminogen-Typs, insbesondere wasserlösliche Verbindungen, deren Bestandteile vom Plasminogsn-Typ im wesentlichen vollständig voraktiviert sind, gemäß Hauptanspruch. Sie betrifft insbesondere aktive Verbindungen, deren Bestandteile, insbesondere unter den weiter unten beschriebenen experimentellen Bedingungen, praktisch vollständig und in stabiler Weise an Fibrinklumpen oder -klUmpchen gebunden werden, was im Gegensatz steht zu dem Verhalten des »Glutamyl-Plasminogens« oder des zirkulierenden Plasminogens, die unter den gleichen Bedingungen nur in geringer Menge an Fibrin gebunden werden und daran nicht gebunden bleiben.

Gemäß der Erfindung wird daher eine gereinigte wasserlösliche Verbindung des Plasminogen-Typs erhalten, die zu Plasmin aktiviert werden kann, die sich dadurch auszeichnet, daß sie im wesentlichen von Glutarayl-PIasminogen und Plasmin frei ist

Die genannten Verbindungen umfassen im wesentlichen voraktivierte Zytnogene, die insbesondere von Glutamyl-PIasminogen abgeleitet sind, indem die ίο letztere Verbindung ein Peptidfragment verloren hat, das die durch Glutaminsäure mit freier Aminogruppe gebildeten endständigen Aminosäuregruppen dieser Verbindung aufweist

Die Gesamtheit dieser Verbindungen ist im wesentli- ! 5 cnen an einen Fibrinklumpen gebunden und bleibt selbst nach dem Waschen dieses Klumpens unter Bedingungen, die weiter unten angegeben sind, gebunden. Ihr isoelektrischer Punkt liegt oberhalb 6,7 und insbesondere zwischen 7 und 9.

Die Technik, die dazu angewandt wird, den Bindungsgrad der Verbindungen des Plasminogen-Typs an Fibrin zu ermitteln, ist eine Methode, die an die Methode angepaßt ist, die von EG.Vairel (Prod. Pharm. 5,25 [1970J 347-353) für die Untersuchung der geringen Piasminaktivitäten angegeben wurde. Das Prinzip ist das folgende: Man bildet den Klumpen in dem Ende eines Giasröhrchens, indem man 0,4 ml Humanplasma erneut mit Calcium behandelt Man wäscht den Klumpen, indem man eine isotonische Chloridlösung hindurchfühlt, bis sie sich in Gegenwart eines Plasminogen-Aktivators nicht mehr löst Der Klumpen wird anschließend während einer vorbestimmten Zeit mit einer Lösung der zu untersuchenden Plasminogene in Kontakt gebracht Dann wäscht man ihn erneut mit der isotonischen Chloridlösung, um das nichtgebundene Plasminogen zu extrahieren. Die Anwesenheit von an das Fibrin gebundenem Plasminogen wird durch eine Lyse des Klumpens nach dem Inkontaktbringen mit einem Plaskiinogen-Aktivator (20 μ CTAJmI Urokinase oder 150 μ SK/ml Streptokinase pro 2 ml des Klumpens) nachgewiesen.

Insbesondere wird die erfindungsgemäße aktive Verbindung aus Plazenta gewonnen.

Die Erfindung betrifft ferner und vorzugsweise eine gereinigte aktive Verbindung, die als Hauptbestandteil Lysyl-Plasminogen enthält

Sie betrifft gemäß einer weiteren Ausführungsform aktive Verbindungen, die im wesentlichen aus Methionyl-Plasminogen oder aus Methionyl-Plasminogen, so Lysyl-Plasminogen und gegebenenfalls auch Valyl-PIasminogen bestehen.

Die genannten aktiven Verbindungen sind dadurch erhältlich, daß man eine insbesondere aus Plazenta gewonnene Ausgangslösung, die im wesentlichen von Inhibitoren der Aktivierung des Plasminogens frei ist und Verbindungen des Plasminogen-Typs, von denen ein Teil aktiviert ist, enthält, bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9, insbesondere bei neutralem pH-Wert, und bei einer Temperatur zwischen 0 und 40° C, insbesondere bei einer Temperatur von etwa +4"C, während eines Zeitraumes mit Fibrin in Kontakt bringt, der dazu ausreicht, eine wirksame Bindung des wesentlichen Anteils der in dieser Lösung enthaltenen voraktivierten Plasminogene an das Fibrin zu bewirken: im daß man das Fibrin wäscht, insbesondere mit einem Medium der Art, wie dem. in dem zuvor die genannten Verbindungen des Plasminogen-Typs in der Ausgangslösung gelöst waren, um die nichtgebundenen Proteine

zu entfernen; und daß man anschließend die an das Fibrin gebundenen voraktivierten Plasminogene eluiert, indem man sie mit einer Lösung eines Inhibitors der Aktivierung des Plasminogen in Kontakt bringt, worauf man diese vorak ti vierten Plasminogene durch Entfernen der genannten Inhibitoren in gereinigtem Zustand gewinnen kann oder gewinnt

Die bevorzugt bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Ausgangslösungen sind Lösungen von Verbindungen des Plasminogen-Typs, wie man sie bei dem Verfahren des Hauptpatentes, insbesondere ausgehend von Plazentabrei, erhält Diese Zubereitungen enthalten, wie oben bereits angegeben wurde, in der Tat bereits erhebliche Mengen voraktivierter Plasminogene und sind darüber hinaus praktisch frei von Plasmin. Es versteht sich jedoch, daß die eingesetzten Ausgangslösungen auch auf andere Plasminogen-Quellen zurückgehen können, insbesondere auf Plasmen, wobei es sich versteht, daß die in ihnen enthaltenen Verbindungen vom Plasiminogen-Typ, insbesondere die »Glutamyl-Plasminogene« zuvor teilweise durch Anwendung an sich bekannter Verfahrensweisen vorahdviert worden sind. Es sind insbesondere Methoden zur Reinigung von Plasminogenen, ausgehend von solchen Ausgangsmaterialien, beschrieben worden, die zu einer teilweisen Proteolyse der anfänglich vorhandenen Plasminogene führen.

Bei dem verwendeten Fibrin handelt es sich insbesondere um ein Fibrin, das zuvor von sämtlichen Plasmaverunreinigungen, insbesondere restlichen Plasminogenen, befreit worden ist wobei ein solches Fibrin gegen die Einwirkung von Plasminogen-Aktivatoren unempfindlich ist

Zweckmäßigerweise bewirkt man eine Chromatographie unter Verwendung einer mit Fibrin beschickten Säule, die mit einer gepufferten Lösung äquilibriert worden ist, die insbesondere von der gleichen Art und der gleichen Zusammensetzung ist, wie das Medium der Ausgangslösung, die die zu reinigenden Plasminogene enthält, wobei das Verfahren darin besteht, daß man die Ausgangslcsung der zu reinigenden Plasminogene über die Fibrinsäule führt, man die Fibrinsäule anschließend mit dem genannten Medium und in Abwesenheit von Plasminogen wäscht, bis die Abströme keine Proteine mehr enthalten, worauf man die an das Fibrin der Säule gebundenen Plasminogene ek-iert, indem man eine Lösung durch die Säule führt, die einen Inhibitor der Aktivierung des Plasminogen enthält

Das verwendete Fibrin kann man in irgendeiner an sich bekannten Weise gewinnen, insbesondere durch Zugabe von Thrombin zu Fibrinogen, das insbesondere menschlichen Ursprungs ist, oder durch Auflösen dieses Fibrinogens in einem Plasma und erneute Zugabe von oder Behandlung mit Calcium (bzw. Calciumionen) unter Rühren.

Das erhaltene Fibrin wird vermählen, so daß man ein feinteiliges Pulver erhält

Dieses Vermählen kann man durch Homogenisieren einer Suspension des Fibrins in einer isotonischen Natriumchloridlösung (isotonische Chloridlösung) bewirken.

Zweckmäßigerweise wird das erhaltene feinvermahlene Fibrin von Plasmaverunreinigungen oder anderen Verunreinigungen, insbesondere dem gegebenenfalls noch darin vorhandenen Plasminogen, befreit, was man durch mehifdches Waschen erreicht, wobei man mindestens einmal mit einer Lösung wäscht, die einen Inhibitor der Aktivierung des Plasniinogens enthält.

Beispielsweise wäscht man das Fibrin jedesmal mit der 4- bis lOfachen Menge ihres Volumens einer wäßrigen Lösung, wobei man mindestens einen Waschvorgang mit einer 0,5 m ε-Aminocapronsäurelösung bewirkt, so daß man ein Fibrin erhält das gegenüber der Einwirkung von Aktivatoren unempfindlich ist, selbst nach dem Inkubieren während 24 Stunden in einer Urokinase-Lösung (bei der man insbesondere 500 mg Fibrin pro ml einer Lösung einsetzt, die 20 μ CTA

ίο Urokinase enthält).

Dieses Fibrin wird anschließend zur Beschickung einer Säule verwendet, die mit einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert zwischen 6 und 9, insbesondere mit einem pH-Wert von etwa 7, deren Ionenstärke

is mindestens gleich 2 ist, äquilibriert bzw. ins Gleichgewicht gebracht wird. Zweckmäßigerweise verwendet man eine 03%ige Natriumchloridlösung.

Man erzielt gute Ausbeuten der Extraktion der in einer Lösung der oben definierten Art enthaltenen voraktivierteir Plasminogene, -venn man für die Reinigung einer Lösung, die Iirg der Verbindungen vom Plasminogen-Typ enthält ein Säulenvolumen der Fibrinsäule von 2 bis 6 ml, insbesondere etwa 4 ml, anwendet und den stündlichen Durchsatz der Lösung des zu reinigenden Plasminogen durch die Säule auf etwa 1 bis etwa 100 Volumen-Prozent zweckmäßig etwa 25 bis 50 Volumen-Prozent und insbesondere etwa 25 Volumen-Prozent, bezogen auf das Volumen der Säule, einstellt

jo Die auf die Kolonne aufgetragene Plasminogenlösung enthält zweckmäßigerweise 1 bis 10 Mikrokatal Plasminogen pro mL Nach dem Oberführen dieser Lösung durch die Säule wäscht man die Säule mit einem Volumen der Pufferlösung, das mindestens gleich ist dem Volumen der Säule, wobei man das Ende des Auftretens von nichtgebundenen Proteinen im Eluat mit Hilfe an sich bekannter Verfahrensweisen ermitteln kann, beispielsweise durch Bestimmen der optischen Dichte bei einer Wellenlänge von 280 nm.

Es ist bemerkenswert, daß die Bindung der voraktivierten Plasminogene und insbesondere der Methionyl- und Lysyl-Plasminogene an Fibrin unter den angegebenen Bedingungen ausreichend selektiv und stabil ist, so daß die Bindung das Waschen mit der Pufferlösung übersteht

Die Elution der an Fibrin gebundenen Verbindungen vom Plasminogen-Typ kann dann mit einer Lösung irgendeines bekannten Inhibitors der Aktivierung von Plasminogen erreicht werden. Man bewirkt diese Elution insbesondere mit einer Lösung, die mehr als 0,005 Mol pro Uter, beispielsweise 0,05 Mol pro Liter E-Aminocapronsäure in einer isotonischen Chloridlösung enthält Man kann jedoch auch auf andere Inhibitoren der Aktivierung des Plasminogens zurückgreifen. Beispielsweise kann man trans-4-Amino-methyl-eycIohexancarbonsäure oder p-Aminomethylbenzoesäure verwenden. Die Verbindungen des Plasminogen-Typs können dann in an sich bekannter Weise aus dem Eiuat gewonnen werden, beispielsweise mit Hilfe der Methoden, die als beispielhafte Methoden in der Hauptanmeldung angegeben sind. Beispielsweise kann man die ε-Aminocapronsäure durch Dialyse gegen destilliertes Wasser, durch Überführen der Lösung über

h■> ein geeignetes Molekularsieb oder durch Ausfällen der Proteine, beispielsweise mit einem Alkohol oder mit einem Salz, wie Ammoniumsulfat, abtrennen. Gemäß der bevorzugten Verfahrensweise fällt man die eluierten

Proteine mit Alkohol selektiv aus einer Wasser-Alkohol-Mischung (35° GL) aus.

Das schließlich erhaltene Produkt kann gefriergetrocknet werden.

Ausgehend von einer aus Plazenta gewonnenen Lösung von Plasminogenen, wie man sie nach der Hauptanmeldung erhält, gewinnt man in dieser Weise aktive Verbindungen, die vollständig frei sind von »Glutamy 1-Plasminogenen« und die als endständige Aminosäuren mit NH₂-Gruppe Methionin oder Lysin enthalten. Die isoelektrischen Punkte dieser Plasminogen-Bestandteile liegen oberhalb 6,7. Sie liegen insbesondere zwischen 7 und 9. Die Plasminogenc werden in selektiver und stabiler Weise an einen Fibrinklumpen gebunden und bleiben dort gebunden, wenn man den Klumpen mit einer gepufferten Lösung mit neutralem pH-Wert eluiert, die frei ist von Inhibitoren der Aktivierung des Plasminogens.

Gemäß anderen zweckmäßigen Ausführungsformen der Erfindung kann man die Verbindungen vom Plasminogen-Typ an Fibrin binden, dann kann man dieses waschen, worauf man die zurückgehaltenen Plasminogene eluiert, indem man andere Methoden als chromatographische Verfahrensweisen anwendet. Insbesondere kann man diskontinuierlich arbeiten, beispielsweise in der Weise, daß man eine Suspension von Fibrin in der die zu reinigenden Plasminogene enthaltenden Lösung bereitet, nach Beendigung der Bindung das das Plasminogen aufweisende Fibrin abtrennt, gewinnt, wäscht und anschließend in einer Lösung suspendiert, die den Inhibitor der Aktivierung des Plasminogens enthält, und schließlich nach der Abtrennung des Fibrins die Lösung gewinnt, in der die gewünschten voraktivierten Plasminogene enthalten sind, wobei es sich versteht, daß die Bedingungen hinsichtlich der Behandlungszeit, des pH-Wertes und der Temperatur ebenfalls in jenen Bereichen liegen können, die bereits weiter oben angegeben sind.

Es ist darauf hinzuweisen, daß Methionyl-Plasminogen und Lysyl-Plasminogen sich nur durch eine verminderte Anzahl von Aminosäuren, die 5 nicht übersteigen, unterscheiden. Es scheint so zu sein, daß Lysyl-Plasminogen von Methionyl-Plasminogen dadurch abgeleitet ist, daß diese letztere Verbindung ein kleines Peptidfragment, das aus den genannten Aminosäuren besteht, verloren hat, insbesondere während längerer Lagerung von rohen Extrakten, die man bei einer Zwischenstufe des Verfahrens zur Extraktion und zur Reinigung von aus Plazenta gewonnenen Verbindungen vom Plasminogen-Typ erhält, insbesondere zwischen der eigentlichen Maßnahme der Extraktion aus den Plazentas, die in der Hauptanmeldung beschrieben ist, und der letzten Stufe der Reinigung durchlaufen wird. Das gleiche Ergebnis kann man auch bei einer technischen Herstellung beobachten, bei der die verschiedenen Behandlungen der rohen Extrakte mit den verwendeten Reagentien im aligemeinen während längerer Zeitdauern als bei jenen Verfahrensweisen erfolgen, die mit geringeren Mengen im Laboratorium durchgeführt werden.

Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der gereinigten, aktiven Verbindung zur Bekämpfung von Fibrinolyseunterfunktionen, insbesondere in Form von pharmazeutischen Zubereitungen, die im wesentlichen von Plasmin frei sind und die genannten Verbindungen des Plasminogen-Typs zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Bindemittel, Trägermaterial und/oder Hilfsstoff enthalten, und insbesondere jenen pharmazeutischen Zubereitungen dieser Art, die injizierbar sind.

Weitere Ausführungsformen, Gegenstände und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus dem folgenden Beispiel.

Beispiel

1. Extraktion von Verbindungen vom Plasminogen-Typ aus Plazentas

und ihre Reinigung

Die eigentliche Plazenta, die Membranen und die Plazentaschnur werden nach der Lieferung gefroren

r> und bei -20° C gelagert. Die Plazentas werden in gefrorenem Zustand mechanisch in Stücke mit einer Seitenlänge von 1 bis 5 mm zerkleinert und dann unter Rühren in 2 Volumen einer isotonischen Chloridlösung aufgetaut. Nachdem die Temperatur der Suspension

>n +6⁰C erreicht hat, wird die Suspension zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit (Plazentablut), die Hämoglobin und Plasmaproteine enthält, jedoch praktisch frei ist von Plasminogenen, wird verworfen. Das Sediment oder der Plazentabrei, der aus Plazentagewebe und zum

.'i geringeren Anteil aus Fibrinklumpen besteht, wird während 2 Stunden bei +4°C mit 2 Volumina einer isotonischen Chloridlösung, die 0,05 Mol pro Liter e-Aminocap^ronsäure enthält, ausgelaugt und dann erneut zentrifugiert. Die extrahierten Verbindungen

jo vom Plasminogen-Typ finden sich in der überstehenden Flüssigkeit. Sie werden bei einem pH-Wert von 7,0 durch Zugabe von Ammoniumsulfat in einer Menge, die dazu ausreicht, eine Endsättigungskonzentration von 40% zu erreichen, ausgefällt. Das in dem Niederschlag enthaltene Proenzym wird anschließend durch Affinitätschromatographie gereinigt (nach der Methode von D. Deutsch und E. T. Merz, Science, 170 [1970]. 1095-1096). Bei jeder Stufe der Reinigung gibt man Aprotinin (den aus dem Pankreas extrahierten Kunitz-Inhibitor, der im Handel unter der Bezeichnung Iniprol erhältlich ist) zu, um einen Abbau der Verbindungen vom Plasminogen-Typ durch Proteolyse des als Verunreinigung vorhandenen Plasmins zu verhindern. Unabhängig von der Menge der als Ausgangsmaterial

■»■> behandelten Plazenta (5, 50, 200 oder 1000 kg) erhält man in allen Fällen Präparate von Verbindungen vom Plasminogen-Typ, die, in trockenem Zustand, eine spezifische Aktivität von 2,4 bis 2,6 Mikrokatal pro mg aufweisen.

Die Analyse der endständigen Aminosäuren mit NH2-Gruppe nach der bereits erwähnten Technik von Gros und Labouesse weist auf die Anwesenheit erhöhter Mengen von Lysyl-Plasminogen und Methionyl-Plasminogen hin, während als restliche Verbindun- gen vom Plasminogen-Typ Glutamyl-Plasminogen vorhanden ist

Sie besitzen insbesondere die in der folgenden Tabelle I angegebene Zusammensetzung:

TabeUe I

EndstSndige Aminosäuren mit NH^Gruppe Menge in %

Methionin Glutaminsäure Lysin Valin

55 25 20 Spuren

2. Herstellung einer Fibrinsäule

Man löst 9 g menschliches Fibrinogen unter Rühren während j Stunden in 200 ml Humanplasma. Das Plasma wird dann durch Zugabe von 30 ml einer 2%igen Calciumchloridlösung mit Calcium behandelt. Nach der Koagulation läßt man den gebildeten Klumpen während _i6 Stunden bei Raumtemperatur stehen, damit die Wirkung des durch das Plasma zugeführten Faktors XIII vollständig ist und eine gute »Festigkeit« des Fibrins sicherstellt. Der Klumpen wird dann in Stücke zerschnitten und anschließend in 800 ml isotonischer Chloridlösung homogenisiert (wozu man einen Homogenisator des Typs Ultraturax verwendet, der während 5 Minuten mit maximaler Geschwindigkeit betrieben wird). Die Fibrinteilchen werden anschließend auf einem Büchner-Filter mit 3 I isotonischer Chloridlösung, I I isotonischer Chloridlösung, die 04 Mol pro I

i UllSaul t* Wllltiai

sung, 112m NaCl-Lösung mit einem pH-Wert von 7,2, und schließlich mit 21 isotonischer Chloridlösung gewaschen. Das in dieser Weise erhaltene Fibrin ist von sämtlichen Plasmaverunreinigungen befreit und in 5 m Harnstofflösungen unlöslich. Insbesondere unterliegt es keiner Lyse, wenn man es mit einem Aktivator des 2> Plasminogen in Kontakt bringt (indem man 2 ml des Fibrins während 24 Stunden mit 20 μ CTA/ml Urokinase oder 150 μ SK/ml Streptokinase behandelt).

Das in dieser Weise erhaltene Fibrin wird dann in eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer jn Höhe von 45 cm eingefüllt und unter einem Durchsatz von 48 ml pro Stunde während 48 Stunden mit einer isotonischen Chloridlösung mit einem pH-Wert von 7,2 äquilibriert

3. Extraktion der voraktivierten Plasminogen-Bestandteile, ausgehend von Präparaten

von Verbindungen des Plasminogen-Typs, die nach der Behandlungsweise gemäß Ziffer 1.

erhalten wurden

Man löst 60 mg des Präparates der Verbindungen vom Plasminogen-Typ in 30 ml isotonischer Chloridlösung und trägt die Lösung oben auf die Säule auf. Man wäscht die Säule dann, um die nichtgebundenen Proteine zu entfernen, mit der gleichen isotonischen Chloridlösung, bis der Abstrom keine Proteine mehr

Tabelle II

Untersuchung der Bindung der Plasminogene an Fibrin enthält, was man durch Bestimmung der optischen Dichte der aufeinanderfolgenden Waschfraktionen bei 280 nm feststellt.

Das gebundene Plasminogen wird mit einer isotonischen Chloridlösung eluiert, die zusätzlich «-Aminocapronsäure in einer Konzentration von 0,05 Mol pro Liter enthält.

Die eluierte Fraktion, die etwa 75% der im Ausgangspräparat enthaltenen Proteine umfaßt, besteht aus einer Plasminogen-Mischung, die als endständige Aminosäuren mit freier NH2-Oruppe Methionin und Lysin enthält, und die keine Glutamyl-Plasminogene aufweist.

Durch Elektrofokussierung läßt sich ermitteln, daß die Fraktionen Proteine mit isoelektrischen Punkten von 7,07,7,65,8,00,8,12 bzw. 8,75 enthalten.

Die eluierten Proteine werden anschließend selektiv ausgefällt, indem man Alkohol in einer Menge zu der afVtrt Itanan iuHRpifrert f nettrtrr iticotil ΛαίΧ man AtnP

Wasser-Alkohol-Mischung mit einer Alkoholkonzentration entsprechend 35° GL (Gay Lussac-Einheiten) erhält. Das erhaltene Produkt wird dann gefriergetrocknet.

Sämtliche obigen Maßnahmen werden, wenn nichts anderes angegeben ist, bei einer Temperatur von etwa 4° C durchgeführt.

Die erhaltenen Produkte können an Fibrinklumpen gebunden werden, insbesondere an Klumpen, die zuvor von sämtlichen Plasminogenen befreit worden sind.

Es sei darauf hingewiesen, daß die vollständig von Plasminogen befreiten Fibrinklumpen in Gegenwart eines Plasminogen-Aktivators unter den oben beschriebenen Bedingungen keiner Lyse unterliegen. Es hat sich jedoch gezeigt, daß die gleichen Klumpen, wenn man sie mit den genannten Produkten in Berührung gebracht hat, diese Lyse unter Einwirkung eines Plasminogen-Aktivators unterliegen. Im Gegensatz dazu lassen sich die gleichen, anfänglich von Plasminogen befreiten Klumpen unter den oben angegebenen Bedingungen nicht lysieren, wenn man sie zuvor mit einem natives Plasminogen enthaltenden Plasma in Kontakt gebracht hat, zumindest unter den gleichen Bedingungen, wie die erfindungsgemäßen Verbindungen.

Die Versuchsergebnisse sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt, in der auch die Versuchsbedingungen in der Spalte »Art des Versuches« abgeführt sind.

Nr. des Versuchs

Art des Versuchs

Aktivator

Ergebnis nach 24 Stunden

1 Klumpen gewaschen und mit 2 ml Plasma in Kontakt gebracht

2 Klumpen gewaschen, mit 2 ml eines Puffers, der 0,5 mg/ml des erfindungsgemäßen Plasminogens und 10 ug/ml Aprotinin enthält, behandelt und gewaschen

Kontaktdauer: 45 Minuten

3 Der Versuch erfolgt identisch mit dem Versuch Nr. 2, wobei jedoch in Gegenwart von 0,1 mg/ml des erfmdungsgemäßen Plasminogens gearbeitet wird

4 . Versuch identisch mit dem Versuch Nr. 2,

wobei jedoch in Gegenwart von 0,25 mg/mi des erfindungsgemäßen Plasminogens gearbeitet wird

Urokinase
Streptokinase

Urokinase Streptokinase

Urokinase
Streptokinase

keine Lyse keine Lyse

100% ige Lyse 100%ige Lyse

20%ige Lyse 20%ige Lyse

50%ige Lyse 50%ige Lysc

Man gibt das Aprotinin zu, wenn man das Plasminogen in dem Puffer löst, um eine Zersetzung oder einen Abbau des Plasminogens durch das verunreinigende Plasmin sowie das Auflösen des Fibrins durch dieses gleiche Plasmin zu verhindern.

Der Versuch N". t zeigt, daß das native Plasminogen des Plasmas nicht an das bei der Ausfällung gebildete Fibrin adsorbier ι wird. Im Gegensatz dazu bleibt das aus der Plazenta extrahierte Plasminogen an dem Fibrin adsorbiert (Versuch Nr. 2), wobei die adsorbierte Menge von der Menge abhängt, die mit dem Klumpen in Kontakt gebracht wird (Versuche Nr. 2,3 und 4).

Die erhaltenen Präparate, die nur die voraktivierten Plasminogene enthalten, stellen besonders wertvolle Arzneimittelwirkstoffe dar, da sie sich vollständig an Fibrinklumpen binden können, was im Gegensatz zu dem Verhalten der Glutamyl-Plasminogene steht, die eher im Plasma gelöst bleiben und in allen Fällen nicht in

Aam Ifliimnen uepkleiken ΓΪΪα caIaImii/a Rtnrllincr Hat

a) Akute Atembeschwerden bei Neugeborenen und Frühgeborenen, die einen vollständigen oder teilweisen Plasminogenmangel aufweisen, ein Syndrom, das im allgemeinen mit einer Fibrin-Abscheidung im Bereich der Lungenbläschen verbunden ist:

b) Venen-Embolien und -Thrombosen;

c) Mikroembolien von im wesentlichen cerebraler Art, und

d) akute, subakute und chronische Zwischengefäßkoagulationen lokaler und verbreiteter Art mit extensiver Tendenz.

Die Verabreichung des Planzenta-Plasminogens kann durch kontinuierliche venöse Perfusionen in Mengen von 1000 bis 1200 UCA-Einheiten, die über eine Dauer von 24 Stunden bis 36 Stunden verteilt werden, oder durch langsame intravenöse Injektion erfolgen (wobei sich die angegebenen Werte auf einen Menschen mit plnpm mittlprpn Opwirht vrm fiO Wa hp7iphpr^

Plasminogen-Präparate an Fibrinklumpen begünstigt die Lösung dieser Klumpen nach der vollständigen Aktivierung der Plasminogene und ermöglicht bessere thrombolytische Behandlungen.

Ganz allgemein können die Zubereitungen auf der Grundlage der erfindungsgemäßen gereinigten, aktivierten Verbindungen des Plasminogen-Typs zur Behandlung von Thrombosen und pathologischen Fibrinabscheidungen behandelt werden, insbesondere im Fall der folgenden klinischen Indikationen:

Bei Säuglingen wendet man Dosierungen von 200 UCA alle 6 Stunden an, die durch langsame Perfusion in einer 0,9%igen isotonischen Chloridlösung, die auf einen pH- Wert von 7,4 gepuffert ist, im Verlaufe von 24 Stunden verabreicht werden.

.'ι Bei Bildung der pharmazeutischen Präparate verwendet man Lösungen der erfindungsgemäßen Verbindung in einem pharmazeutisch verträglichen Trägermaterial, insbesondere einem physiologischen Serum, vor allem einem Glucoseserum.

Claims

Patentansprüche;

1. Gereinigte aktive Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs, die bei neutralem pH-Wert in Wasser löslich ist, im wesentlichen frei von Plasmin ist und zu mindestens 40 Gew.-% native Plasminogenfragmente aufweist, aus denen ein Peptidfragment mit einem Molekulargewicht von 7000 bis 8000 N-terminal abgespalten ist, erhältlich durch Auslaugen eines von Plazentablut befreiten Plazentabreies im Temperaturbereich von 0 bis 20° C, mit einer Lösung, die

a) einen pH-Wert von 5 bis 10, vorzugsweise einen neutralen pH-Wert aufweist, und

b) eine Aminosäure enthält, weiche die Aktivierung des Plasminogens inhibiert, in einer Konzentration von mehr als 0,001 Mol, nach Patentanmeldung P 24 59 9153-41

dadurch gekennzeichnet, daß man das erhaltene Produkt

c) ausreichend lange mit gereinigtem Fibrin bei einem pH-Wert zwischen 6 und 9 und bei einer Temperatur zwischen 0 und 40° C in Kontakt bringt, worauf man

d) das Plasminogen aufweisende Fibrin wäscht, bis die nichtgebundenen Proteine entfernt sind, und man

e) anschließend die an das Fibrin gebundenen voraktivierten Plasminogene eluiert, worauf man sie

f) durch Entfernen der Inhibitoren in gereinigtem Zustand gewinnt.

2. Gereinigte aktive Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs nach Anspruch 1, die als Hauptbestandteil Lysyl-Plasminogen enthält

3. Verwendung der gereinigten aktiven Verbindung des Plasminogen-Typs menschlichen Ursprungs nach den Ansprüchen 1 bis 2 zur Bekämpfung von Fibrinolyseunterfunktionen.