DE2342862B2

DE2342862B2 - An beiden Kettenenden Reste von a -Aminooxycarbonsäuren aufweisende Peptide mit ACTH-Wirkung, Verfahren zu ihrer Herstellung und diese Peptide enthaltende Arzneimittel

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Publication number: DE2342862B2
Application number: DE2342862A
Authority: DE
Inventors: Gyoergy Dr. Hajos; Lajos Dipl.- Chem.-Ing. Dr. Kisfaludy; Miklos Loew; Olga Nyeki Geb. Kuprina; Agnes Patthy Geb. Lukats; Maria Szirmai Geb. Sarkoezi; Laszlo Dr. Szporny
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1972-08-25
Filing date: 1973-08-24
Publication date: 1980-05-08
Also published as: ATA706473A; CA1024509A; IL43056A0; DD108746A5; AU471173B2; IL43056A; JPS5434731B2; DE2342862A1; AT335082B; AU5929173A; ES418158A1; US3862111A; CH591430A5; CS172872B2; NL7311592A; SU651691A3; BE804016A; FR2196815A1; DE2342862C3; HU167360B

Description

Q-O-OSer-Tyr-Scr-McUilulORj-IIis-l'hc-Ai-g-

rrp-Gly-Lys(Q»-I'ro-Val-Gly-|Lys(Q)|„-X

worin η und OSer die in Anspruch I angegebenen liedeuiungen besii/en und

X den nut Carboxyl- und Scitenkettenaminoschut/· i-Tiippi- vetsL'henen Rest der \-/\inim>oxy-i--amim>-

R eine Carboxylsehut/gruppe. insbesondere eine ten.-iiiiiyl- oder Henzylgruppe. und
die Cimppen Q gleiche oder verschiedene Aminoseh nt/gruppen, insbesondere Ben/.yloxy carbonyl . ten-Butyloxycarbonyl- oder Foriuylgruppen, bedeuten, jeweils in an sich bekannter Weise die Schutzgruppen abspaltet und gewünschtenfalls die erhaltenen Peptide in ihre Säureadditionssalze oder Amide überführt.

3. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch I.

I:s ist bekannt, daß die Peptidkette des Adrenocorticotrophormons (ACTH) weilgehend modifiziert werden kann, ohne daß dadurch die adrenocorlicolrope Wirkung aufgehoben würde. So kann vom C-terminalen Ende des Moleküls mehr als ein Drittel der Aminosäurekette abgespalten werden, ohne daß die spezifische Aktivität sinkt. Die Abspaltung weilerer Aminosäuren führt jedoch zu einer sprungartigen Abnahme der Aktivität. Das Fragment 1-19 besitzt 30%, das Fragment I-Ib jedoch nur ungefähr 1% der Aktivität des gesamten Moleküls. Demgegenüber verursacht am N-terminalen Kettenende bereits die Abspaltung der ersten Aminosäure einen Aktivitätsverlust von 50% (F.. Schröder, K. l.übke: The Peptides, Academic Press, New York, 1966,24b - 249).

Die an Stelle des N-icrminalcn Serins D-Aminosäuren, in der Natur nicht vorkommende Aminosäuren oder die vom Serin durch Forliiahme seiner liinktionellen Gruppen ableitbaren Acylgruppen ((Mlydroxypropionyl-, Propionylgruppe) enthaltenden ACTH-Fragmente /eigen fallweise eine stärkere Aktivität als das natürliche ACTH, da diese modifizierten Fragmente, wie angenommen werden kann, gegenüber den Fn/vmen vom Aminonentidasetyn resistent sind und daher im Organismus langsamer abgebaut werden als das natürliche ACTH. Deswegen zeigen diese modifizierten Fragmente auch dann eine starke adrenocorticotrope Aktivität, wenn die modifizierende Gruppe die Rolle des N-terminalen Serinteils des natürlichen Hormons nicht völlig auszufüllen vermag.

Die Erscheinung, daß bei Verringerung der Gliederzahl des ACTH-Fragments vom C-lerniinalen Ende aus die Wirkung der C-terminalen Amid-Derivate später abzusinken beginnt als die der die entsprechenden freien Carboxylgruppen enthaltenden Peptide, ist auf vergleichbare Gründe zurückzuführen, denn die meisten Enzyme vom Typ der Carboxypeptidase sind nicht imstande. Peptidamide abzubauen. Daher schien es. als sei durch Amidieren des C-ierminalcn Carboxyls die gleiche Schutzwirkung /\\ erreichen wie am N-terminalen Kettenende durch entsprechende Substitution des Serinteils. Neuerdings wurde jedoch festgestellt, dall es Carboxypeptidase·Enzyme gibt, die auch zum Abspähen der C-lerminalen Aminosäure der Peptidamide befähigt sind (|. I). Glass u.a.: Proc. Nat. Acad. Sei. I). S. 63. 1426 (I9b9)). Da die substituierten Amide von diesen Fn/ymen nicht hydrolysiert werden, kann man erwarten, daß die C-lerminal substituierten, zum Amid umgesetzten ACTII-Fragmente im Organismus langsamer abgebaut werden und dadurch eine stärkere biologische Wirkung zeigen als die entsprechenden einfachen Amide. Deutschen Forschern ist es tatsächlich gelungen, einige llepladekapeptidalkylamid-Derivaie mn starker adrenoeorlicotroper Wirkung herzustellen(Dl-OS 19 >4 794).

Ils winde nun gefunden, daß es zur Erreichung der gesteigerten Wirkung sehr vorteilhaft ist. wenn an den ACTIIt ragmenien 1-17. 1-18 oder 1-19 beide lerminalen Aminosäuren durch Aminooxysäuren ersetzt vvvrden, und /war die N-lerminale (Serin) durch Da- A mi nooxy -/Mi ydroxy propionsäure und die C-terniinale durch I,- oder I) vAniinooxy-i-aminocapronsäure.

Gegenstand der Erfindung sind Peptide der allgemeinen Formel (I)

ll-D-OSer-Tyr-Ser-Mel-Glu-llis-Prie-Aig-Trp-Gly-LyS-PrO-VaI-(Uy-(IyS)₁₁-OFvS-OII

in der «eine ganze Zahl von 2 bis 4, D-OSer die I)-Form des Restes der \ Aminooxy/J-hydroxypropion- und OLys die L- oder D-Form des Restes der x-Aminooxy-f-aminocapmnsäure bedeuten, sowie deren Sätireadditionssal/e und Amide.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der Peptide tier allgemeinen Formel (I) so\· n· von deren Säureadditionssal/en und Amiden, das dadurch gekennzeichnet ist, dall man von Peptiden der allgemeinen Formel Il

Q-I) OSiτ-Tyr-Ser-Mcl-G Iu(OR)-I I is I'he-Λ rg- IYp-Gly-Lys(Q)-Pro-Val-Gly-!Lys(Q)|„-X

(II)

worin η und OSer die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und

X den mit Carboxyl- und Seitenkeltenaminosehulzgrtippe versehenen Rest tier x-Aminooxy-i-aminocapronsäure.

R eine CarboxyIsehul/gruppe, insbesondere eine lert.-BiUyI- oder lien/ylgruppc. und

die Gruppen O gleiche oder verschiedene Aminoschutzgruppen. insbesondere Benzyloxycarbonyl-, tert.-Butyloxycarbonyl- oder Formylgruppen, bedeuten, jeweils in an sich bekannter Weise
die Schutzgruppen abspaltet und gewünschtenfalls die erhaltenen Peptide in ihre Säureadditionssalze oder Amide überführt.

Gegenstand der Erfindung sind schließlich Arzneimittel.dieeine Verbindung nach Anspruch 1 enthalten.

Die als Ausgangsstoffe verwendeten geschützten Peptide werden, ausgehend von den entsprechenden vAminooxysäuren und Aminosäuren, in an sich bekannter Weise durch Fragmentkondensation oder durch Keltenverlängerung um jeweils eine Aminosäure hergestellt, wobei nach der Azid-. der Aklivester-, der I)CC- oder der Technik des gemischten Anhydrids gearbeitet weiden, aber auch die sogenannte Synthese in fester Phase angewandt werden kann, bei der das Peptid mit seiner am Kettenende befindlichen Carboxylgruppe an ein Polymer gekuppelt ist und aufgebaut wird, indem die Aminosäuren und schließlich die (X-Aminooxysäure in der entsprechenden Reihenfolge an die an das Polymer gebundene C-terminale A-Aniinooxysäure angebaut wird.

Die funklionellen Gruppen, die an der Reaktion nicht teilnehmen, werden /.weckmäßig geschützt, und zwar durch Gruppen, die durch Hydrolyse, Acidolyse, I lydrazinolysc oder Reduktion leicht abgespalten werden können. Die Carboxylgruppe kann /. 15. vorzugsweise durch Verestern mil Methanol, tert,-Butanol, Benzylalkohol. p-Chlorben/ylalkohol oder pNilrobenzylalkohol oder durch Amidbildung geschützt werden, zum Schul/' der Aminooxy- und der Aminogruppen kommen in erster Linie die Tosyl-, Trilyl-, Formyl-. Trilluoraeetyl-, o-Nitrobenzolsulfenyl-, Phthalyl-, Benzyloxycarbonyl- und p-Chlorben/.yloxycarbonyl-Gruppe, besonders jedoch die lerl.-Butyloxycarbonylgruppe in Trage. Die Guanidiiiogruppe des Arginins kann vor allem durch die Nitmgruppe geschützt, aber auch in ihrer proionierien l-'orm verwendei werden. Die Imiiiogruppe des I listidins kann mit der Ben/.yl-, Trilyl- oder der Dinitrophenylgruppe geschül/.t werden. Die Hydroxylgruppen der .Seitenkelten werden fallweise durch Verälhern geschützt, wobei vorzugsweise mit leri.-Butanol oder mit Benzylalkohol verälherl wird.

Durch Anwendung einer geeigneten Kombination von Schutzgruppen kann erreicht werden, daß diese Schutzgruppen in an sich bekannter Weise, zum Beispiel durch Hydrolyse, Acidolyse, I lydrazinolyse oder Reduktion selektiv oder gleichzeitig entfernt werden können.

Nach einer bevorzugten Ausführiingsform des Verfahrens wird so vorgegangen, daß man eine geschützte x-Aininooxysäure mil dem Tripeplid-Mcthylester Tyr-Sei -Met-OCH > kondensiert, das llydrazid des erhaltenen substituierten Teirapeptidmethylesters zum Azid umsetzt und mit diesem das Dekapeptid CJIu(OBu¹)-! lis-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-

(BOC)-Pm-VaI-GIy aeyliert. Das auf diese Weise erhaltene substituierte Tetradekapeptid kondensiert man mit dem Ester des aus der entsprechend geschützten, kompletten weiteren Aminosäuresequenz bestehenden Peptides, das llydrazid des auf diese Weise erhaltenen substituierten Peptidcstcrs setzt man zum Azid um und aeyliert damit das einsprechend geschützte Derivat der C-tcrminalcn Aminooxysäure. So wird zum Beispiel bei der Herstellung eines substituierten Hcpuulckapcptidcs das substituierte Tetradekapeptid mit dem Ester des 15— 16-Dipeptides, bei der Herstellung eines substituierten Oktadekapeptides mii dem Ester des 15—17-Tripeptides, bei der Herstellung eines substituierten Nonadekapeptides mit dem Ester des 15- 18-Te;rapeptides kondensiert. Bei diesen Kondensationen wird vorzugsweise das DCC-Verfahren oder die Methode des Aktivesters angewandt. Im letzteren Falle, besonders bei der Verwendung von Pentachlorphenyl- oder Pcntafluorphenylester braucht der aktive F.ster nicht isoliert zu werden; er kann mit Hilfe von Pentachlorphenol oder Peniafluorphenol und DCC (vgl. AT-PS 2 95 051) aus dem substituierten Tetradekapeplid im Reaklionsgemisch der Kondensationsreaklion gebildet werden.

Es kann auch so vorgegangen werden, daß man das entsprechend geschützte C-terminale Aminooxysäuredenvat mit dem einsprechend geschützten 15-Ib-Dipeptid, 15-17-Tripeptid oder 15-I8-Tetrapeptid acylicri, das auf diese Weise erhaltene substituierte Peptidderivat nach der selektiven Entfernung der N-terminalen Schutzgruppe mit dem substituierten Tetradekapepiid kondensiert und so das als Ausgangssloff benötigte, an beiden linden Aminooxysäuren enthallende geschützte Peptid erhält. Am Ende der Synthese weiden die an der N-terminalen vAminooxygnippe wk\ an i'en Aminogruppen der Seitenketlen befindlichen terl.-Bulyloxycarbonylgmppen. die an den Carboxylgruppen der Seitenkelten und an der C-terminalen Carboxylgruppe — sofern diese nicht amidiert ist — befindlichen lert.-Butylestergruppen sowie die am Hydroxyl der Seitenketlen eventuell vorhandenen tert.-Butylathergriippen gleichzeitig mittels Acidolyse, zum Beispiel durch Behandeln mit Trifluoressigsäure. abgespalten.

Wenn das als Ausgangsstoff benutzte Peptid auch mit Trifluoressigsäure nicht abspaltbare Schutzgruppen, zum Beispiel Formylgruppen, enthält, so werden diese vor oder nach der Entfernung der übrigen Schutzgruppen in einem besonderen Reaktionsschritt abgespalten. Die Reinigung des von seinen Schuizgruppen befreiten Endproduktes kann durch Verteilung im Gegenstrom oder durch Säulenchromalographie, zum Beispiel durch lonenausiauschehromatographie an unterschiedlichen Carboxymethylcellulosearten, vorgenommen werden.

Die neuen Verbindungen werden in Abhängigkeit von der bei ihrer Herstellung angewendeten Methode in Form freier Basen oder des Salzes erhalten. Aus den Salzen können die freien Basen in an sich bekannter Weise freigesetzt werden. Die freien Basen können mit den für pharmazeutische /.wecke verwendbaren Säuren zu Säureadditionssalzen umgesetzt werden. Für diesen Zweck kommen anorganische Säuren, zum Beispiel .Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, aber auch organische Säuren, wie zum Beispiel Ameisensäure, Essigsäure, höhere Fettsäuren, Milchsäuren, Weinsäure, Zitronensäure in Frage.

Unter Amiden der neuen Verbindungen werden auch die am Stickstoff unterschiedlich substituierten Amide, in erster Linie die an der C-terminalen Carboxylgruppe amidierten, in der Seitenkette jedoch gegebenenfalls auch freie Carboxylgruppen enthaltenden Peptidamide verstanden.

Aus den erfindungsgemäßen Peptiden können zur pharmazeutischen Verwendung die üblichen pharmazeutischen Präparate hergestellt werden. Diese Präparate enthalten die erfiiuliiin'siJoni-iUon Verhin-

düngen zusammen mit zur enteralen oder parenteralen Verabreichung geeigneten organischen oder anorganischen Streckmitteln. Die pharmazeutischen Präparate können feste Lyophilisatc sein, wobei als Streckmittel mit Peptiden nicht reagierende Verbindungen, /um Beispiel Mannit, Milchzucker oder Stärke, in Frage kommen, sie können aber auch in Form von Suspensionen und Emulsionen hergestellt werden, welche verschiedene neutrale Konservierungsmiuel und Stabilisatoren enthalten.

Entsprechend der üblichen Dosis des Adrenocorticotrophormons enthalten die pharmazeutischen Präparate die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von /um Beispiel 0.1-5 mg/ml. Die Präparate können subcutan. intramuskulär oder parenteral 1 — 7mal pro Woche verabreicht werden.

Die praktische Ausführung des Verfahrens wird an Hand der folgenden Beispiele erläutert.

In den Beispielen werden zur Beziehung der Aminosäuren und der Peptid-Derivate die durch die IUPAC-IUB vorgeschlagenen Abkürzungen benutzt (J. Biol. C'hem. 247, 977 [1972]). Zur Bezeichnung der Λ-Aminooxysäuren werden die den Abkürzungen der Aminosäuren ähnlichen, weiter oben bereits erwähnten Symbole OScr bzw. OLys benutzt. Die obigen Abkürzungen beziehen sich — GIy ausgenommen — falls nicht anders angegeben, auf die -Antipoden. Als weitere Abkürzungen werden verwendet:

PCPOH = Pentachlorphenol.
PFPOH = Pentachlorphenol.
DCC = Dicyclohexylcarbodiiniid. DCU = Dicyclohexylcarbamid. BOC = tcrt.-Butyloxycarbonyl. Bu' = tert.-Butyl.
For = Formyl.
>

Die Bestimmung des Schmelzpunktes wurde mit dem Apparat nach Dr. Tottoli vorgenommen. Die dünnschichtchromalographischen Untersuchungen wurden an dem Adsorbens Silikagel nach Stahl mit folgenden Lösiingsmittelgemischcn durchgeführt:

1. Essigester:

(Pyridin : Essigsäure : Wasser = 20 :6 : 11) = 99 : 1

2. Essigester:

(Pyridin : Essigsäure : Wasser = 20:6:ll) = 8:2

3. Essigester:

(Pyridin : Essigsäure : Wasser = 20 :6 : ll) = 6 :4

Beispiel 1

D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-OLys-NHj

0,75 g (0,267 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OLyS(FOr)-NH. werden in einem Gemisch aus 6 ml Trifluoressigsäure, 0,75 ml Wasser und 0,75 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 150 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet. Es werden 0,70 g (86%) Trifluoracetat des substituierten Formyl-Oktadekapeptides erhalten. Dit Substanz wird in 10 ml Wasser gelöst, 0,25 ml Mercaptoäthanol werden zugesetzt und der pH-Wert der Lösung mit n-Natronlaugc auf 5 eingestellt. Danach wird die Lösung mit 11,5 ml 2-m-Hydrazinacetatlösung vermischt und zwei Stunden lang bei 95" C auf dem Wasserbad gehalten. Danach wird im Vakuum eingeengt und die Restlösung auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht. -, Man eluicrl mit einem aus 0.2 m (pH b.7) und 0.5 in (pH b,7) Ammoniumacetatpuffcr bereiteten linearen PufCergradienten. lyophilisiert die entsprechenden Fraktionen und erhält 0.275 g (38«/») substituiertes Oktadekapeplid amid.

κι Das als Ausgangsstoff verwendete geschützte substituierte Okiadekapeptidamid wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1

L-A-tcrt.-Biityloxjcarbonyl-aminooxyi -formylamino-capronsäuretBOC-OLys/For/)

23.2 g (bOmMol) -N-f-Formvl-D-Lysin und 43.2 » (423 mMol) Natriumbromid werden in 248 ml 2.5 ii

Jd Schwefelsäure gelöst. Die Lösung wird auf 0 gekühlt, und unter Rühren werden innerhalb von 30 Minuten in Portionen 13.3 g (192 mMol) Natriumnitrit zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei 0 C und eine Stunde lang bei Zimmertemperatur nachge-

:> rührt und dann dreimal mit 200 ml Äther ausgeschüttelt. Die vereinigten ätherischen Lösungen werden getrocknet und danach eingedampft. Die als Rückstand verbleibenden 18.4 g rohe D-.vBrom-f-formylaminocapronsäurc werden in 190 ml Äthanol gelöst und tier

ιί Lösung 8.4 g (15OmMoI) Kaliumlndroxyd und 10.0 g (7b mMol) ten.-Butyloxyearboin !hydroxylamin zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird zwei Stunden lang gekocht und über Nacht bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Dann wird das Lösungsmittel abdestillicrt. der

η Rückstand in 80 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mit IO%iger Salzsäure auf 3 eingestellt. Die saure Lösung wird mit Natriumchlorid gesättigt und dreimal mit 150 ml Äther, danach mit 150 ml Essigestei ausgeschüttelt. Die Äther- und Lssigestcrphasen

mi werden vereinigt, getrocknet und eingedampft. Der kristalline Rückstand (Ib g) wird aus 25 ml Essigester umkristallisieri. Man erhall 10.4 g(27%) L-,\-teri.-Butyloxycarbonyl-aminooyv-i·-Conny laniino-capronsäure.

Schmelzpunkt: 114-1Ib C. R", =0,31. [λ]/>=-52.5 (V= I.Methanol).

Analyse Ci;H_.jN:O„(290.32):

Berechnet: C49.6%. H 7.65%; -„> gefunden: C 49,9%, H 7,6%.

Schritt 2

L-iVtert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-

f-formylamino-capronsäure-amid

(BOC-OLys/FoiV-NH:)

5.0g (17.2 mMol) BOC-OLys(For) werden in 107 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst und der Lösung 1,90 ml (17.2 mMol) N-Methylmorpholin zugesetzt. Die

no Lösung wird auf -10'C abgekühlt, und unter Rühren werden 2,25 ml (17,2 mMol) Chlorkohlensäure,sobutylester zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird noch IO Minuten lang bei -IOC gehalten und dann aiii — 20^rC gekühlt. Nun werden vorsichtig 10.7 ml

hi (142niMol) konzentrierte Ammoniumhydroxydlösung zugetropft und das Reaktionsgemisch eine Stunde lang bei OC und eine Stunde lang bei Zimmertemperatur gerührt. Danach wird das Tetrahydrofuran abdestillicrt

und der halbkristalline Rückstand mit 20 ml eines Gemisches aus Essigestcr : Pyridin : Essigsäure : Wasser im Verhältnis 900:54:16:30 auf eine Silikagelsäure von 250 ml Volumen aufgebracht. Man eluiert mit derselben Mischung, sammelt die Traktionen, die den gewünschten Stoff enthalten und dampft sie ein. Man erhält 4.3 g (86%) BOC-OLys(F-Or)-NH.. in l-orm eines schwach gelben amorphen Stoffes. Rr= 0.54. C-Hj₁NsO, (289.34).

Schritt 3

TerL-Butyloxyearbonyl-D-ivammooxy-^-benzyloxypropionsäure

48.4 g (0.364 Moi) lerl.-Butyioxycarbonyl-hydroxyiamin. 40,7 g (0.728 Mol) Kaliumhydroxyd und 94.0 g (0,364 Mol) Dl.-i\-BiOin-/i-benzyloxypropionsäiire werden in 360 ml Wasser gelöst. Das Reaklionsgemisch wird bei Zimmertemperatur 3 Stunden lang gerührt. Dann wird sein pH-Wert auf 3 eingestellt und dreimal mit 720 ml Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird mit 720 ml Wasser ausgeschüttelt, getrocknet und mit 78 ml (0,40 Mol) Dicyclohexylamin versetzt. 43,61 g Dicyclohexylaminsalz der lert.-Butyloxycarbonyl-DL^-aminooxy-/J-benzyloxypropionsäure werden erhalten (Schmelzpunkt: 144—146°C). Das Salz wird in 500 ml Äther suspendiert und die Suspension fünfmal mit 100 ml 0.2-n-Schwcfelsäure ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird nach dem Trocknen zurTrockne eingedampft, der Rückstand in 700 ml Äthanol gelöst, und es werden 6.56 g (48.5 Mol) ( + )-Amphetaminbase zu der Lösung gegeben.

Die Lösung wird über Nacht an einen kühlen Ort gestellt, anderntags werden die ausgeschiedenen Kristalle abfiltriert. Das erhaltene (-f)-Amphetaminsalz der tcrt.-Butyloxyearbonyi-D-i\-aminooxy-/i-benzyloxypropionsäure wird aus Äthanol umkristallisiert. Ausbeute: 13.27g. Schmelzpunkt: 188-191⁰C, [\] +54 (V= 0.5. Methanol). Aus dem Salz wird in bekannter Weise die tert.-Butyloxyearbonyl-D- \-ammoo\\ -,i-bcnzyloxyprapionsäure erhalten. Ausbeute: 7.9 g (14%). Schmelzpunkt: 96-98⁰C. [λ] =+38° Cc-= I.Äthanol).

Schritt 4

tert.-Butyloxycarbonyl-D-A-aminooxy/j-hydroxypropionsäurc(BOC-D-OSer)

5.5 g (17.7mMol) D-rv-tert.-Butyloxycarbonylaminooxy-/?-benzyloxypropionsäure werden in 110 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 2,75 g 10%igem Aktivkohle-Palladium-Katalysator hydriert. Nach drei Stunden wird der Katalysator abfiltriert, das Methanol abdestilliert und der ölige Rückstand unter Petroläther stehen gelassen. Die Substanz kristallisiert innerhalb einiger Stunden aus. Nach dem Filtrieren und Trocknen erhält man 3,65 g (96%) D-a-tert.-Butyloxycarbonylaminooxy-/?-hydroxypropionsäure. Schmelzpunkt

94 - 95° C. Ri = 0,27. QH ,-,NO_n (221,22).

Schritt 5
BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-N₂H₃

4,4 g (2OmMoI) BOC-D-OSer und 9,0 g (2OmMoI) Tyr-Ser-Met-OCHj werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung auf 0°C gekühlt und zuerst 2,22 ml (2OmMoI) N-Methylmorpholin, dann 3,8 g (18.4 mMol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei 0"C gerührt und bis zum nächsten Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen Danach wird das DCU abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand in 400 ml Essigester ge- ·) löst. Die Lösung wird zweimal mit je 200 ml n-Salzsäure und zweimal mit je 200 ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, dann getrocknet und schließlich eingedampft. Der Rückstand (8,10 g geschützter substituierter Tetrapeptidester) wird m 85 ml

in Methanol gelöst, der Lösung werden 2,2 ml (46 mMol] Hydrazinhydrat zugegeben und das Reaktionsgemisch bis zum nächsten Tage bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anderntags wird das Methanol abdestilliert der Rückstand mit Essigester verrieben, filtriert, mit

π Essigester und Äther gewaschen und über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Man erhält 7,21 g (63%] geschütztes substituiertes Tetrapeptidhydrazid. Det Schmelzpunkt des aus Wasser umkristallisierten Produktes liegt bei 174-175° C. R'=0,30.

²⁽¹ Analyse Cr.H4oN_hOi_(lS(6l6,69):

Berechnet: C 48,7%, H 6,55%, N 13,6%;
gefunden: C 48,3%. H 6,6%, N 13,8%.

2-, Schritt 6

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GluiOBu'J-His-Phe-Arg-Trp-GIy-LyS(BOC)-Pro-VaI-GIy · HCI

1,25 g (2,13 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-N₂H₃

in werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst und die Lösung auf — 20⁰C gekühlt. Unter Rühren werden zuerst 2,08 ml (8,32 mMol) 4 η salzsaurer Essigester, danach 0,32 ml (2,70 mMol) tert.-Butylnitrit zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird bei — 10⁰C 5 Minuten ge-

r, rührt, dann auf -20⁰C gekühlt, und es werden 2,78 g Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy und 1,4 ml (8,13 mMol) Diisopropyläthylamin in 23 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei einer Temperatur

4(i von -5 bis 0⁰C gerührt und dann bei 0°C bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Die Lösung wird eingedampft und der Rückstand mit 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung verrieben. Nach dem Filtrieren, Waschen mit Wasser und Trocknen erhält man

4-, 3,49 g (94%) geschütztes substituiertes Tetradekapeptid. Dieses wird in 24 ml Methanol suspendiert, und eine aus 4,75 ml konzentrierter Salzsäure und 4,75 ml Pyridin bereitete Pyridinhydrochloridlösung zu der Suspension gegeben. Die Lösung wird mit 240 ml

-,(i Wasser verdünnt und der ausgefallene Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und schließlich getrocknet. 2.95 g (73%) Hydrochlorid des geschützten Tetradekapeptides werden erhalten. Schmelzpunkt: 200 - 202° C, Rf= 0,25. Coi H, J₄NnO₂SCIS (1989,68).

Schritt 7
Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH₃ · Oxalat

11,0 g (17,7 mMol) Z-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCH₃ bo (K. Hofmann, J. Am. Chem. Soc. 86,4991 [1964]) werden in 200 ml Methanol gelöst, mit 2,0 g (22£ mMol) wasserfreier Oxalsäure versetzt und in Gegenwart von 2,0 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator b5 abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Man erhält 9,1 g (89%) Dipeptidester-oxalat, das nach Umkristallisieren aus IsopropanoI-Diisopropyläther bei 65-67°C schmilzt R?=0,34.

[λ]«+ 3,79" (c= I, Methanol).
Analyse Cj₁H^NjO₁ ι (578.65):

Berechnet: C 51,9%. H 8,9%, N 9.7%; gefunden: C 51.5%. Il 7,9%, N 9.9%.

Schritt 8
Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH _;

8,1 g (14.OmMoI) LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCHi ■ Oxa lat werden in 60 ml Essigester suspendiert, der Suspension zuerst 3,1 ml (28,0 mMol) N-Methylmorpholin, dann 6,7 g (14,OmMo!) Z-Lys(BOC)-ONSu zugesetzt und das Reaktionsgemisch zwei Stunden lang bei ZiffirnertciTiperäiäir gerührt. Danach wird das Cinge- i > dickte Reaktionsgemisch mit 200 ml Essigester und 40 ml Wasser verdünnt. Nach Abtrennung der wäßrigen Phase wird die Essigesterphase zweimal mit 40 ml η-Salzsäure und zweimal mit 40 ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschea über Natriumsul- _>u fat getrocknet und schließlich eingedampft Der Rückstand wird mit Diisopropyiäther verrieben, das erhaltene rohe Produkt wird aus einem Isopropanol-Diisopropyläther-Gemisch umkristallisiert. Man erhält 8,0 g (67%) Methylester des geschützten Tripeptides. _>-> Schmelzpunkt: 117-118°C R) = 0,58, [x] „-17.47" (c= I.Methanol).

Analyse C₁₂H ,,,N-O,, (351.03):

Berechnet: C 59,3%. H 8.3%: m

gefunden: C 59.7%. H 8.2%.

Schritt 9

BOC- D-OSer-Tyr-Ser- M et-G lu(OBu')H is- Phe-A rg TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)- '' LyS(BOC)-OCH, ■ HCI

1,25g Z-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCH, wer den in 25 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 0,2 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator hy- -ίο driert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Methanol abdestiliiert und der als Rückstand verbliebene Tripeptidester zusammen mit 2,42 g (1,24 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val- _A; GIy-HCI in 12 ml Dimethylformamid gelöst. Der Lösung werden 0,97 g (3,64 mMol) PCPOH und 0,255 g (1,24 mMol) DCC zugesetzt und das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur 2 Tage stehen gelassen. Das ausgeschiedene DCU wird abfiltriert, das Filtrat im ™ Vakuum eingeengt und das Produkt durch Zugabe von Äther ausgefällt. Das nach Filtrieren und Trocknen erhaltene rohe Produkt (3,4 g, Schmp.: 177°C, unter Zersetzung) wird aus einem Methanol-Äther-Gemisch umgefällt 2,6 g (80%) Hydrochlorid des geschützten γ, substituierten Heptadekapeptid-methylesters werden erhalten. Schmelzpunkt: 191°C (Zersetzung), Rf=0,54. Ci25Hi9bN₂₇O:wC]S (2688,61).

Schritt 10 «i

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-

LyS(BOC)-N₂H₃

2,5 g (0,93 mMol) BOC-D-OSer-Tyl-Ser-Met-Glu- _b5 (OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Giy-Lys(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OCH₃ · HCl werden in 75 ml kochendem Methanol gelöst Die Lösung wird auf Zimmertemperatur abgekühlt, mit 0,91 ml (18,7 niMol) Hydrazinhydiat versetzt und bei Zimmertemperatur zwei Tage lang stehen gelassen. Danach wird das Methanol abdesiilliert und der Rückstand mit Äther verrieben. Das rohe Produkt (2,15 g, Schmp.: 199"C, unter Zersetzung) wird aus Dimethylformamid und Wasser umgefällt. Man erhält 2,00 g* (81%) Hydrazid des geschützten substituierten Heptadekapeptides. Schmelzpunkt: 205 C (Zersetzung). Rj^l=0,49. C,._JH_l.,,N.._uO,,.S(2b52,16).

Schritt 11

BOC-D-OSer-Tyi-Ser-Met-GluiOBu'Hlis-Phe-Arg-Trp-Gly-l,vs(BOC)-Pro-Val-Gly-Lys(BOC)-Lys(BOC>

l.ys( BOC)-O l.ys( For)-NH:

a) 0,57 g (1,97 mMol) BOC-OLys(For)-NH.. werden in 7,5 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in 4 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit Diisopropyl-äthylamin neutralisiert.

b) 1,00 g (0,377 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-G!u(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys( BOQ-Pro-Val-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-N₂Hi werden unter schwachem Erwärmen in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf — 20°C abgekühlt, und unter Rühren werden zuerst 0.54 ml (1,52 mMol) 2,8-n-salzsaurcr Essigester, dann 0.05 ml (0,42 mMol) lert.-Butylnitrit zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten lang bei -10°C gerührt, auf -20"C abgekühlt und dann die gemäß Absatz a) bereitete, neutralisierte OLysiForJ-NH.-Trifluoracetatlösung zusammen mit 0.2 ml (1,17 m.Mo!) Diisopropyl-äthylamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde lang bei —5 bis 0"C gerührt und dann bei 0^uC bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Danach wird die Hälfte des Lösungsmittels abdesiillicrt und der Rest mit 20 ml Wasser verdünnt. Die ausfallende Masse erstarrt beim Stehen. Sie wird unter frischem Wasser zerpulvert, filtriert und getrocknet. 0,80 g (75,5%) geschütztes substituiertes Oktadekapeplidamid werden erhalten. Schmelzpunkt: 140-145°C, Rr¹= 0.47, CnH^NaOihS (2809.35).

Bei spi e I 2

D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-D-Olys-NHj

0,75 g (0,267 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-D-OLyS(FOr)-NH, werden in einem Gemisch aus 6 ml Trifluoressigsäure, 0,75 ml Wasser und 0,75 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 15OmI Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd im Vakuum getrocknet Es werden 0,65 g (80%) Trifluoracetat des substituierten Formyl-Oktadekapeptides erhalten. Die Substanz wird in 10 ml Wasser gelöst, 0,25 ml Mercaptoäthanol werden zugesetzt, und der pH-Wert der Lösung wird mit η-Natronlauge auf 5 eingestellt Danach wird die Lösung mit 10,6 ml 2-m-Hydrazinacetatlösung vermischt und zwei Stunden lang bei 95° C auf dem Wasserbad gelassen. Nach Einengen im Vakuum wird die Restlösung auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule aufgebracht Man eluiert mit einem aus 0,2 m (pH 6,7)

und 0,5 in (pll 6,7) Aiiimoniumaeetatpuffer bereitelen Puffergradienten, sammelt und lyophilisicrt die entsprechenden Fraktionen und erhält 0,28 g(4l%) substituiertes Oktadekapeptidamid.

Das als Ausgangssloff verwendete geschützte substi tuierte Oktadekapeptidamid wird auf folgende Weise hergestellt:

Schrill I

D-iVtert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-

F-forinylaniino-capronsäiire

(BOC-D-Ol.ys(For))

Auf die im Schritt I von Beispiel I beschriebene

\l/.,;,„ .„;r-/H .mc Kl.i'.Piirmd.l -1 uiin-H-A-Irrl -Rlltul-

oxycarbonyl-aminooxy-s-formylamino-capronsäure hergestellt. Schmelzpunkt: 1I4-U6°C. Ri = 0,31, [nc],)= +58,6° (c= 1, Methanol).

AnalyseC,..H^N.O_n(290,32):

Berechnet: C 49,6% 11 7.65%; gefunden: C 50,0%. 117,6%.

Schritt 2

D-(X-IeIt.-BuIy loxycarbony l-aminooxy-

i-formylamino-capronsäureamid

(BOC-D-Ol.ys(For)-NH>)

Das Amid wird, ausgehend von 5.0 g (17,2niMol) BOC-D-OLys(For), auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellt. Man erhält 4,4 g (88%) BOC-D-OLys(For)-NH.. ■ Rf=0,54.Ci_.H..jN,0,(289,34).

Schritt 3

BOC-D-OSci-Tyr-Scr-Mct-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-

Trp-G Iy- Lys( BOC)- Pro-VaI-G Iy- Lys( BOC)- Ly s( BOC)-

Lys(BOC)-D-OLys(For)-NH...

Ausgehend von 0,57 g (1,97 niMol) BOC-D-OLys-(For)-NH.., erhält man auf die im Schritt 11 von Beispiel 1 beschriebene Weise 0,90 g (85%) geschütztes substi-' tuiertes Oktadekapeptidamid. Schmelzpunkt: 140- 145°C, Ri^;=0.47.C, „H ..,»,N n.O _!hS (2809.35).

Beispiel 3

H-D-OSer-Tyr-Scr-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-OLys-NH,

1,2g (0.437 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GIu-(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-GIy-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLys(BOC)-NH2 werden in einem Gemisch aus 9,6 ml Trifluoressigsäure, 1,2 ml Wasser und 1,2 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird eine Stunde lang stehen gelassen und dann mit 240 ml Äther verdünnt Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd getrocknet. Es werden 1,10 g (84%) durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Oktadekapeptidamid-trifluoracetat erhalten. Das rohe Trifluoracetat wird in 20 ml Wasser gelöst und die Trifluoracetationen werden mittels acetatcyclischer Ionenaustauscher gegen Acetationen ausgetauscht

Danach wird die so erhaltene Lösung auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule (4,5 χ 65 cm) aufgebracht Man eluiert mit einem aus 21 0,2 m (pH = 6,7) und 21 0,5 m (pH =6,7) Ammoniumacetatpuffer bereiteten linearen Puffer-

gradienten mit einer Geschwindigkeit von 80 ml/h, sammelt die das Produkt enthaltenden 98-115 Fraktionen und lyophilisiert sie. Man erhält 0,40 g (41%) durch Aniinooxycarbonsäure substituiertes Oktadekapeptidamid. Peptidgehalt: 78% (im UV-Spektrum) Met-Sulfoxidgchalt: 2,3%. Tyr/Trp- Verhältnis: 1:10.

Aminosiiureanalyse:

Lys 3,5 (4), His 0,9 (1). Arg 1,0 (1), Scr 0,85 (1), GIu 1,0 (1). Pro 1.0 (1). GIy 1,9 (2), VaI 0,9 (I), Met 0.7 (l),TyrO.9(l),Phe 1.0(1). Rf =0,18.

Das als Ausgangsstoff verwendete, geschützte, durch Aiiiinooxycarbonsäure substituierte Oktadekapeptidamid wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt I

Dicyclohexylaminos ilzder L-fx-tert.-Butyloxycarbo-

nyl-aniinooxy-f-benzyloxy-carbonyl-amino-capron-

säure(DOC-OLys/Z/-OH OCHA)

Aul die im Schritt 1 von Beispiel 1 beschriebene Weise wird aus Ν-κ-Beti/.yloxycarbonyl-D-Lysin hergestellt. Die erhaltene ölige L-ix-tert.-Bulyloxycarbonyl-

aminooxy-fi-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäure
wird in Äther gelöst und mit Dicyclohexylamin zum Dicyclohexylaminsalz umgesetzt. Schmelzpunkt: 158- 161°C (aus Äthanol-Wasser-Gemisch umkristallisiert): R₁ ¹=0.15[i\]i>= -34,6° Cc·= I.Äthanol).

Schritt 2

l.-i\-tert.-Butyloxyearbonyl-aminooxy-E-benzyloxy-

carbonyi-amino-eapronsäure-amid

(BOC-O/LVS/Z/-NH2)

Das Dicyclohexylaminsalz von L-a-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-e-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäure wird mit Äther und n-Schwefelsäure ausgeschüttelt und die ätherische Lösung eingedampft. Die erhaltene Säure wird auf die im Schritt 2 von Beispiel I beschriebene Weise in das Amid umgewandelt. Nach Eindampfen des Reaktionsgemisches wird das Rohprodukt, anstatt säulenchromatographisch gereinigt, in Äthylacetat gelöst und mit Wasser, n-Schwefelsäure und schließlich mit 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Danach wird die Äthylacetatphase eingedampft. Man erhält das L-a-tert.-Butyloxy-carbonyl-aminooxy-e-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäure-amid in Form eines dicken Öles. Schmelzpunkt: 93-95°C (aus Methanol-Wasser-Gemisch umkristallisiert) Rf =0,42 [λ]»= -27.5° (c= I.Methanol).

Schritt 3

L-a-tert-Butyloxycarbonyl-aminooxy-E-aminocapronsäure-amid-oxalat(BOC-OLys-NH2 · Oxalat)

12,0 g (30,4 mMol) BOC-OL>s(Z)-NH₂ werden in 240 ml Methanol gelöst, mit 3,0 g (33,3 mMol) wasserfreier Oxalsäure versetzt und in Gegenwart von 2,0 g 10%igen Palladium-Aktivkohle-Katalysator hydriert Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Man erhält nach Umkristallisieren des Rohoxalates (9,3 g) aus einem Genrisch von 45 ml. Methanol und 95 ml Äther 8,7 g (81,5%) L-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-E-amino-capronsäure-amid-

Oxalat. Schmelzpunkt: 153-155°C. R,'= 0,30 [«]» 38,Γ (c=\. Methanol).

Schritt 4

L-ft-Aminooxy-F-terl.-Butyloxycarbonyl-aminocapronsäurc-amid(N-ÖLys/BOC/-NH:)

8.0 g(22,8 mMol) BOC-OLys-NH. ■ Oxalat werden in 40 ml Trifluoressigsäurc gelöst und die Lösung nach einer halben Stunde unter vermindertem Druck eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit gewechselten Äther gewaschen, danach 24 ml Dioxan und so viel 2-n-Natriumhydroxyd zugegeben, daß eine schwache Lauge (pH =8 — 9) entsteht. Nach Zugabe von 6.6 g (45,6 mMcl) · tert.-Butyloxycarbonyl-azid und 2,3 g (57,5 mMol) Magnesiumoxyd wird das Reaktionsgemisch 16 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt, danach der feste Teil abfiltrieri und das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Wasser gelöst und dreimal mit 70 ml Äthylacetat ausgeschüttelt. Nach Eindampfen der Äthylacetat-Phasen wird der Rest mit Äther verrieben, abfiltriert und danach das Rohprodukt (6,35 g) aus Äthylacetat umkristallisiert. Man erhält 3.6 g (60,5%) L-ft-Aminooxy-F-tert.-butyloxycarbonyl-aminocapronsäure-amid. Schmelzpunkt: 118-120 C Ri =0,30[«]/>= -39.5° (C= I.Methanol).

Schritt 5
Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-N:Hi

25,15 g (29,5 mMol) Z-Lys(BOC)-Lys(BOC)-LyS(BOC)-OCH₁ werden in 500 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 5.0 g 10%igem Aktivkohle-Palladium-Katalysator hydriert. Nach Ablauf der Reaktion wird der Katalysator abfiltriert, das Filtrat eingedampft und der Rest in 180 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird mit 5.72 ml (41,OmMoI) Triäthylamin und 10,26 g (36,8 mMol) Tritylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, danach das Lösungsmittel abdestillier! und der Rest in 300 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 50 ml Wasser, dreimal mit 50 ml 5%iger Citronensäurelösung und dreimal mit 50 ml 8°/oiger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt, dann getrocknet und schließlich eingedampft. Der Rest wird unter Petroläther zerpulvert. Nach dem Filtrieren und Trocknen erhält man 28.0 g rohes Tri-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCHj. Die rohe Substanz wird ohne weitere Reinigung in 170 ml Methanol gelöst, mit 7,25 ml (150 mMol) Hydrazinhydrat versetzt und das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach drei Tagen wird das Methanol abfiltriert und der Rest mit Äther verrieben. Das Rohprodukt (17,65 g) wird aus einem Gemisch von 35 ml Methanol und 350 ml Äther umkristallisiert. Man erhält 13,85 g (49%) geschützte Tetrapeptidhydrazide. Schmelzpunkt: 197-199°C Rf =0,13 [«]_o=-7,1 ^c= 1, Methanol).

Schritt 6
Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLys(BOC)-NH2

4,1 g (4,27 mMol) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-N₂H₃ werden in 14 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf —20° C gekühlt, und unter Rühren werden zuerst 6,5 ml (17,0 mMol) 2,6-n-Salzsäurelösung in Äthylacetat, dann 0,65 ml (5,45 mMol) terL-Butylnitrit zugetropft Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten lang

bei -10'C gerührt, dann auf -20" C gekühlt und die Lösung von 1,42 g (5,45 mMol) H-OLys(BOC)-NI I; und 2,2 ml (12.8 mMol) Diisopiopyläthylamin in 7 ml Dimethylformamid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird

ι eine Stunde lang zwischen — 5" C und OC gerührt, dann bis zum nächsten Tag bei OC stehen gelassen. Danach wird die Lösung eingedampft, der Rest in 140 ml Älhylacelat gelöst und die Lösung mit 40 ml Wasser, dreimal mit 40 ml 5%igcr Citronensäurelösung, dann

in zweimal mil 40 ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen wird das Älhylacetat abdcsiilliert und der feste Rückstand mit Äther verrieben. Nach dem Abfiltrieren und Trocknen erhält man 2,75 g (54%) geschütztes, durch Aminooxy-

·,-, carbonsäure substituiertes Tetrapcptidamid. Schmelzpunkt: 137-140'C R₁'=0.26. [λ];>=-24.4° ^= 1. Methanol).

Schritt 7

^:" H- Ly s( BOC)- Lys( BOC)- Ly s( BOC)-O Lys( BOC)-

NH:HCI

5,0 g (4,22 mMol) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-OLyS(BOC)-NHj werden in 50 ml Methanol

>-, gelöst und mit einer Pyridin-Hydrochloridlösung aus 1.7 ml Pyridin und 1.7 ml fconz. Salzsäure versetzt. Das Reaktionsgcmiscli wird 20 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann das Methanol abdestilliert und die zurückbleibende dicke Masse mit

κι 150 ml Wasser durchgeknetet, nach Abgießen des Wassers im Vakuum getrocknet und unter Äther zerpulvert. Mach dem Abfiltrieren und Trocknen erhält man 3.7 g (82%) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLyS(BOC)-NH; · HCI. Schmelzpunkt: 120-123 C

π Ri =0.72[λ]/,= + 17 (C= I.Methanol).

Schritt 8

BOC-D-OSer-Tyr-Scr-Met-GluiOBu'J-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOCy Pro-VaI-GIy-LyS(BOC)- ^w Lys( BOC)-Lys(BOC)-OLys(BOC)-N H:

0.9995 g (0.5 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val· GIy-OH HCI. 0.491g (0.5 mMol) H-Lys(BOC)-Lys-

₄-, (BOC)-LyS(BOC)-OLyS(BOC)-NH-HCI und 0,800g (3.0 mMol) PCPOH werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst und zuerst 0,055 ml (0.5 mMol) N-Methylmorpholin, dann 0.210 g (1,0 mMol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird einen Tag lang bei Zimmertempera-

_w tür stehen gelassen, dann das DCC abfiltriert und das Filtrat mit 100 ml Äther verdünnt. Das ausgeschiedene Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 1.30 g (90%) geschütztes, durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Oktadekapeptidamid. Rf =0.50.

Beispiel 4

D-Oser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-D-OLys-NH.

1,2 g (0,417 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-D-OLyS(BOC)-NH2 werden in einem Gemisch von 9,6 ml Trifluor_b5 essigsaure, 1,2 ml Wasser und 1,2 ml Anisol gelöst. Die Lösung wird eine Stunde lang stehen gelassen und danach mit 240 ml Äther verdünnt. Der ausgeschiedene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und

über Phosphorpentoxvd und Kaliumhydroxyd im Vakuum getrocknet. Man erhält 1,05g (80%) substituiertes Oktadckapeptiuamid-trifluoracetat. Das rohe Trifiuoracetat wird in 20 ml Wasser gelöst, und die Trifluoracetaiionen werden mittels acetatcyclischcm Ionenaustauscher gegen Aeeialioncn ausgetauscht. Danach wird die so erhaltene Lösung auf eine mit Ionenaustauscher aus Carboxymethylcellulose gefüllte Säule (4.5 χ 55 cm) aufgebracht. Man eluiert mit einem aus 21 0.2-n-(pH=6.7) und 2 1 0.5-n-(pH = 6.7) Ammoniumacctatpuffcr bereiteten linearen Piiffergradienten mit einer Geschwindigkeit von 80 ml/h, sammelt die das Produkt enthallenden Fraktionen 103-112 und lyophilisiert sie. Man erhält 0,42 g (37%) durch Aminooxycarbonsäurc substituiertes Oktadekapeptidamid. Peptidgehalt: 82% (im UV-Spektrum): Met-Sulfoxidgchalt. 1.8%:Tyr/TrpVerhältnis: 1.07.

Aminosäureanalyse:

Lys 3.4 (4). His 1,0 (1). Arg 0.9 (1). Scr 0.8 (1), GIu 0.9 (1). Pro 1.0 (1), GIy 2,05 (2), VaI 0.9 (1), Met 0.75(1). Tyr 0,9(1), Phel,0(l),R_r- =0,18.

Das als Ausgangsstoff verwendete geschützte, durch Aminooxycarbonsäure substituierte Oktadekapeptidamid wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt 1

Dicyclohexylaminsal/von D-A-tert.-Butyloxycarbonylammooxy-f-bcn/yloxycarbonyl-amino-capronsäure

"(BOC-D-OLvs/Z/-OH · DCHA)

Auf die im Schritt 1 von Beispiel 1 beschriebene Weise wird die Säure aus N-f-Benzyloxycarbonyll.-Lysin hergestellt.

Die erhaltene ölige D-viert.-Butyloxycarbonylaminooxy-f-ben/yloxycarbonyl-amino-capronsäure wird in Äther gelöst und mit Dicyclohexylamin zum Dicyelohcxylaminsalz umgesetzt. Schmelzpunkt: 159-162 C (aus Ällianol-Wasser-Geniisch umkristallisiert): R] = 0.15[λ]/)= +35.4' Cc= !.Äthanol).

Schritt 2

D-rx-tcrt.-Bulyloxyearbonyl-aniinooxy-f-benzyl-

oxycarbonyl-amino-capronsäureamid

(BOC-D-OLys/Z/NH;)

Auf die im Schritt 2 von Beispiel 3 beschriebene Weise wird aus dem Dicyclohexylaminsalz von D-a.-

tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-f-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäure das Amid hergestellt. R/=0.42. Schmelzpunkt: 95-97°C. [<%]/>= +28.9° (c=\. Methanol).

Schrill 3

D-a-tert.-Eutyloxycarbonyl-aminooxy-e-aminocapronsäurearnid-oxalat(BOC-D-OLys-NH: ■ Oxalat)

Auf die im Schritt 3 von Beispiel 3 beschriebene Weise wird ,aus D-rt-tert.-Butyloxycarbonyl-aminooxy-f-benzyloxycarbonyl-amino-capronsäureamid das Oxalat hergestellt. Schmelzpunkt: 155-157°C

' <= +39.0° (c= !.Methanol).

Schritt 4

D-.-v-Aminooxy-t-tert.-Butyloxycarbonyl-aminocapronsäureamid(N-D-OLys/BOC-NHj)

Auf die im Schritt 4 von Beispiel 3 beschrieben Weise wird diese Verbindung aus D-{\-tert.-Butyloxy carbonyl-aminooxy-f-amino-capronsäureamid-oxalat
hergestellt. Schmelzpunkt: 118-120°C
[ix]n= +40.4° (c= 1. Methanol).

R/ = 0.2

Schritt 5
ι, Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-D-OLys(BOC)-NH:

Auf die im Schritt 6 von Beispiel 3 beschriebene Weise wird diese Verbindung aus 8,7 g (1,OmMoI) Tn-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-N^Hi und 3,0 g (HJmMoI) H-D-OLyS(BOC)-NH₂ hergestellt. Nach Eindampfen der Äthylacetatphase wird das zurückbleibende Rohprodukt mit 20 ml eines Gemisches aus Äthylacetat: (Pyridin : Essigsäure : Wasser = 20 :60 :11) = 99 :1 auf eine Silikagelsäule aufgebracht

2-, und Chromatographien. Das Eluat wird in 15-ml-Fraktionen entnommen und ihre Zusammensetzung mittels Dünnschichtchromatographie untersucht. Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen 85—192 werden gesammelt und das Lösungsmittel abdestilliert. Man erhält

in 3,70 g (34,5%) geschütztes, durch Aminooxycarbonsäurc substituiertes Tetrapeptidamid. Schmelzpunkt: 132-136°CRi=0,23.

Schritt 6

H - Ly s( BOC)- Ly s( BOC)- Ly s( BOC)- D-O Lys( BOC)-NH₂HCl

4„ 2,0 g (2,1OmMoI) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-D-OLyS(BOC)-NH₂ werden in 20 ml 80%iger Essigsäure gelöst. Die Lösung wird 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann eingedampft und der Rest mit Äther verrieben. Das so erhaltene,

j-, durch Aminooxycarbonsäure substituierte Tetrapeptidamidacelat (1,68g: Schmelzpunkt: 94-95°C) wird in 17 ml Methanol gelöst, dann Pyridinhydrochloridlösung, erhalten durch Versetzen von 1,35 ml Pyridin mit 1,35 ml konz. Salzsäure, zugegeben und das Methanol

-,D abdestilliert. Der Rückstand wird mit 50 ml Wasser verrieben. Nach dem Filtrieren, Waschen mit Wasser und Trocknen werden 1,2 g (72%) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-D-OLys(BOC)-NH₂ · HCl erhalten. Schmelzpunkt: 122-125°C; R/ = 0.70.

Schritt 7

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe

Arg-Trp-Gly- Lys( BOC)-Pm-VaI-GIy- Lys(BOC)-

Lys(BOC)-Lys(BOC)-D-OLys(BOC)-NH₂

0,995 g (0,5 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GIu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-Val-„, GIy-OH ■ HCI, 0,491g (0,5 mMol) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-D-OLys(BOC)NH₂ · HCI und 0,800 g (3,0 mMol) PCPOH werden in 5,0 ml Dimethylformamid gelöst und zuerst 0,055 ml {0,5 mMo!)

030 119/122

N-Methylmorpholin. dann 0210 g (1,OmMoI) DCC zugegeben. Das Reaklionsgemisch wird einen Tag lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann das DCU abfiltriert und das Filirat mit 100 ml Äther verdünnt. Das ausgeschiedene Produkt wird abfilmen, mil Äther gewaschen und getrocknet. 1.40 g (97%) geschütztes, durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Oktadekapeptidamid werden erhalten. Schmelzpunkt: 170-178°C:R'_r'= 0.52.

Beispiel 5

H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-OLys-NHj

0,400 g (0.12SmMoI) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-

VaI-GIy-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OLys(BOC)-NH_. - HCI werden in einem Gemisch von 3,2 ml Trifluoressigsäure, 0,4 ml Anisol und 0,4 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird eine Stunde lang stehen gelassen, dann mit 80 ml Äther verdünnt und der ausgeschiedene Niederschlag abfiliricrt. Das rohe Nonadckapeptidamid-Trifluoracetai wird in 5 ml Wasser gelöst und auf einer mit Carboxymethylccllulose-Ionenaustauscher gefüllten Säule (3.5 χ 5b cm) mit einem aus 1,5 1 0,2 m (pH = 6.7) und 1.3 I O.b m (pH =6,7) bereiteten linearen Puffergradienten Chromatographien. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen 82—93 werden gesammelt und iyophilisicrl. 0.131 g (36%) durch Aminooxycarbonsäure substituier!es Nonadekapeptidamid werden erhalten.
Rr =0.20:

Peptidgehali:83%:
Methionin-Siilfoxydgehalt: 1,2'Mi: Tyr/Trp:!,03.

Aminosäureanalyse:

Lys4,6(5), His 0.95(1), Arg 1,0(1). Scr 0,80(I). GIu 1.0(1), Pro LO(I)₁GIy 2.0(2), ValO.OO(l). Met 0.80(1 ),Tyr 0.95 (l),Phc 1.0(1).

Das als Ausgangsstoff verwendete geschützte, durch Aminoox) carbonsäure substituierte Nonadekapeptidamid-Hydrochlorid wird auf folgende Weise hergestellt:

Schritt I
Z- Ly s( BOC)- Ly s( BOC)- Lys( BOC)- Lys( BOC)-OCl 1,

51g (6OmMoI) Z-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC) OCHi werden in 100 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von IO g 10%igem Aktivkohle-Palladium-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfillriert und die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rest wird in 240 ml Äthylacetat gelöst, mit 28,5 g (6OmMoI) Z-Lys(BOC)-OSu versetzt und bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach zwei Stunden werden dem Reaktionsgemisch 1000 ml Äthylacetat und 200 ml Wasser zugesetzt. Nach Durchschütteln wird die wäßrige Phase abgetrennt und die Äthylacetatphase zweimal mit 200 ml η-Salzsäure und zweimal mit 200 ml 8'Miiger Nairiumhydrogencarbonatlösiing gewaschen und nach dem Trocknen eingedampft. Der Rest wird mit Äther verrieben, abfiltriuri und mit Äther gewaschen. Das Rohprodukt wird aus Allylacetat umkristallisierl. 52.06 tr (81%) Z-1.vsiBOO-i.vsiHOO-1.vsiBOO-Lvs-

(BOC)-OCHi werden erhalten. Schmelzpunkt-122-123¹C.

Schritt 2
H-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCH,

35 g (32,4 niMo!) Z-Lys(BOC)-Lys(3OC)-Lys(BOC)-LyS(BOC)-OCH₁ werden in 700 ml Methanol gelöst und in Gegenwart von 7 g 10%igem Aktivkohle-Palladium-Katalysator hydriert. Nach Beendigung der Reaktion wird der Katalysator abfiltrieri, die Lösung eingedampft und der Resl mit Äther-Diisopropyläther-Gemisch stabilisiert. Nach dem Filtrieren und Trocknen wird das Rohprodukt aus Äther-Diisopropyläther-Gemisch umkristallisierl. 24,8 g (81%) H-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OCH₁ werden erhallen. Schmelzpunkt: 101 - 103¹C.

Schritt 3
Tri- Lys(BOC)-L> s( BOC)-1.ys(BOC)-1.ys(BOC)-()CH ,

24 g (25,4 iiiMol) H-Lys(ßOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-LyS(BOC)-OCHi und 4.7 ml (33,6 niMol) Triethylamin werden in 180 ml Diehlormcthan gelöst, mit 8,5 g (30,5 niMol) Triiylchlorid versetzt und bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Nach 24 Stunden wird das Dichlormeihan abdestilliert und dem Rest 500 ml Äthylacelal und 100 ml Wasser zugesetzt. Nach Durchschütteln wird die wäßrige Phase abgetrennt und die Äthylacelatphase dreimal mil 100 ml 5%iger Citronensäure und dreimal mit KM) ml 8%iger Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt, getrocknet und danach eingedampft. Der Rest wird mit Äther verrieben, abfiltrieri, mil Diisopropyläihcr und Petroläther gewaschen. 23,6g (78.5%) Tri-Lys(BOC)-l.ys(BOC)-Lys(BOC) -LyS(HOC)-OCI I, werden erhalten. Schmelzpunkt: 166- 168"C.

Schritt 4
Tn-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-N .11,

23.3 g (l9,6mMol) Tri-l.ys( BOC)-Ly s( BOC)-LyS(BOC)-LyS(HOC)-OCHi werden in 230 ml Methanol gelöst, mil 5,7 ml (117 niMol) llydrazinhydral versetzt und bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach vier Tagen wird das Methanol abdeslillicrt und der Rest mit Äiher verrieben, ahfiltrieri und im Vakuum getrocknet. 23,0 g (98%) I n-Lys(BOC)-l.ys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-N .Hi weiden erhalten. Schmelzpunkt: 217-219'C.

Schrill 5

Tri-l.ys(B(K ) I ys( BOC)-Lys( BOC)-Ly s( BOC)-OLyS(BOC)-NH.

2,37 g (2,OmMoI) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-

Lys(BOC)-Lys(HOC)-N..H, werden in 12 ml Dimethylformamid gelost. Die Lösung wird auf —20"C abgekühlt, und es werden unter Rühren zuerst 2 ml (8,0 mMol)4n-Salzsäurelösung in Äthylacetat und dann 0.28 ml (2,3b 111M0I) tcN.-Butylnilrit zugetropft. Das Reaklionsgemisch wird 5 Minuten lang bei — IO C gehalten und dann auf —20"C gekühlt und mit 0,627 g (2,4mMol) H-OLyS(HOC)-NII. und 1,03ml (6,OmMoI) Diisopropyläthylamin in 8,0 ml Dimethylformamid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei -5 bis OC und dann bei OC bis zum nächsten Taue

stehen gelassen. Danach wird die Lösung eingedampft, der Rest mit Wasser verrieben, abfiltriert und mit Wasser gewaschen. 2,43 g (86%) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys( BOC)-OLys(BOC)- N H_. werden erhalten. Rf =0.85.

Schrit; 6

H-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OLyS(BOC)-NH. ■ HCI

1,93 g (1.4 mMol) Tri-Lys( BOC)-Lys( BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-OLyS(BOC)-NHj werden in 35 ml 80%iger wäßriger Essigsäure gelöst. Die Lösung wird nach einer Stunde eingedampft und der Rest mit Äther verrieben. Nach dem Filtrieren. Waschen mit Äther und Trocknen wird das Rohprodukt mit einem Gemisch aus Äthylacetat-(Pyridin : Essigsäure : Wasser = 20 :6 : 11) im Verhältnis 4 : I auf eine Silikagelsäule (3,2 χ 52 cm) aufgebracht und Chromatographien. Das Eluat wird in 15-mI-Fraktionen gesammelt und ihre Zusammensetzung mittels Dünnschichtchromatographie bestimmt. Die das reine Rohprodukt enthaltenden Fraktionen 95- 107 werden gesammelt, das Lösungsmittel wird abdestillicrt und der Rest mit Äther verrieben, abfiltriert und nach dem Trocknen in 20 ml Methanol gelöst. Der Lösung wird eine Pyridin-Hydrochloridlösung, erhalten durch versetzen von 0.22 ml Pyridin mit 0,22 ml konz. Salzsäure, zugegeben. Danach wird das Methanol abdestillieri und der Rest mil Äther verrieben, abfiltriert und im Vakuum getrocknet.

1,05 g (62"/(i) H-LyS(IH)C)-l.ys(BOC)-LvS(BOC)-I.ys-(BOC)-OLyS(BOC)NII. ■ HCI werden erhallen. Rf =0,25.

Schritt 7

BOC-D-OSer-Tyr-Sei-Met-GliKOnu) Ilis-Phe-

Arg-Trp-C;iy-Lys( BOC)-IVo-VaI-CJIy-I.ys( BOC)-

Ly s( BOC)-1 .ys( BOC)-I .ys( BOC)-O I .y s( BOC)-

Nll> · HCl

0,398 g (0,2OmMoI) IiOC-D-OSer Tyr-Sei-Mct-CJluiOBuO-His-Phe-Arg-Trp-CJIy-l.ys( BOC)-Pro-VaI-GIy-ON · HCI, 0,242 g (0.2OmMoI) Hl.ys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-OLys(BOC)-NHj · HCI und 0,165 g (0,9OmMoI) Pentachlorphenol weiden in 4 ml Dimethylformamid gelöst und zuerst 0,22 ml (0,20 mMol) N-Methylniorpholin, dann 0,063 g (0,30 mMol) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden lang bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann das DCU abfiltricrl und das Filtrat mit Äther verdünnt. Das ausgeschiedene Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. 0,572 g (92%) geschütztes Nonadekapeptidamid-hydrochlorid werden erhalten: RV =0,70.

Beispiel 6

H-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phc-Arg-Trp-GI-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-D-OLys-NH.

0,400 g (0,128 mMol) BOC-D-OSer-Tyr-Scr-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOC)-Pro-VaI-

G Iy-1 .ys( BOC)-1 .y s( BOC)-1 .ys( BOC)-1 .y s( BOC)- D-OLys(BOC)-N Hj ■ IICI werden in einem Gemisch von 3,2 ml Trifluoressigsäure, 0,4 ml Anisol und 0,4 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird nach einer Stunde mit 80 ml Äther versetzt und der ausgeschiedene Niederschlag abfiltriert. Das rohe Nonadekapeptidamid-trifluor-Carboxymethylcellulose-Ionenaustauscher gefüllten Säule (3,5 χ 56 cm) mit einem aus !,5I 0,2 m (pH = 6,7) und 1,51 0,6 m (pH =6,7) bereiteten linearen Puffergradienten Chromatographien. Die das Produkt enthal-.-, tenden Fraktionen 78 — 90 werden gesammelt und lyophilisiert. 0,149 g (39%) durch Aminooxycarbonsäure substituiertes Nonadekapeptidamid werden erhalten. Rf = 0,20 Peptidgehalt: 76%. MethioninsulCoxydgehalt: 1.6% Tyr/Trp-Verhältnis: 0,95.

'" Aminosäureanalyse:

Lys 4,5 (5), His 1.0 (1), Arg 1.0 (I), Scr 0,85 (1), GIu 1,0 (1), Pro 0,9 (1). GIy 1,95 (2), VaI 0,95 (1), Met0.80(l),Tyr0.90(l).Phcl,0(l).

ι-, Das als Ausgangsstoff verwendete geschützte, durch Aminocarbonsäure substituierte Nonadekapeptidamidhydrochlorid wird a'if folgende Weise hergestellt:

Schritt I

Tri -1 .y s( BOC)- Ly s( BOC)- Ly s( BOC)- Ly s( BOC)-D-OLyS(BOC)-NHj

ird in 5 nil Wasser ^ae!öst und die I.ösiüv* au! R-=025

2.37 g (2.OmMoI) Tri-l.ys(BOC)-Lys(BOC)-

Lys(BOC)-Lys(BOC)-NjH, werden in 12 ml Dimeihyl-

>■, formamid gelöst. Zu der aiii -20C gekühlten Lösung werden unter Rühren zuerst 2 ml (8,0 mMol) 4-n-Salzsäurelöstmg in Äthylacetat, dann 0,28 ml (2,36 mMol) tert.-Butylniirii zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird 5 Minuten lang auf -IO"C gehalten, dann auf

„, -20"C gekühlt und ein Gemisch aus 0,627 g (2,4 mMol) H-D-OIyS(BOC)-NH.. und 1,03 ml (6,OmMoI) Diisopropyläthylamiii in 8,0 ml Dimethylformamid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei einer Temperatur von —5 bis 0⁰C gerührt und dann bei

ι, 0°C bis zum nächsten Tage stehen gelassen. Dann wird die Lösung eingedampft, der Rest mit Wasser verrieben, abfiltiiert und mit Wasser gewaschen.

2,58 g (91%) Tn-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS(BOC)-LyS-(BOC)-D-OLyS(BOC)NHj werden erhalten. Ri = 0,85.

Schritt 2

11 - Ly s( BOC)-1 .ys( BOC)- Ly_a( BOC)- Ly s( BOC)- D-O Lys-(BOC)-NHj ■ HCI

1,98g (1,4 mMol) Tri-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-LyS(BOC)-D-OIyS(BOC) werden in 35 ml 80%iger wäßriger Essigsäure aufgelöst. Die Lösung wird nach einer Stunde eingedampft und der Rest mit

-,υ Äther verrieben. Nach dem Filtrieren, Waschen mit Äther und Trocknen wird das Rohprodukt mit einem Gemisch aus Äthylacetat-(Pyridin : Essigsäure : Wasser = 20:6:ll) im Verhältnis 4:1 auf eine Silikagelsäure (3,2 χ 52 cm) aufgebracht und Chromatographien.

,-, Das Eluat wird in 15-ml-Fraktionen gesammelt und ihre Zusammensetzung mittels Dünnschichtchromatographie bestimmt. Die das reine Produkt enthaltenden Fraktionen 103— 112 werden gesammelt, das Lösungsmittel wird iibdestillicrt und cer Rest mit Äther

M) verrieben, nach dem Filtrieren und Trocknen in 20 ml Methanol gelöst und mit einer Pyridin-Hydrochloridlösung versetzt. Diese Lösung wird vorher aus 0,22 ml Pyridin und 0,22 ml konz. Salzsäure erhalten. Danach wird das Methanol abdestilliert und der Rest mit Äther

tvi verrieben, abfiltriert und im Vakuum getrocknet.

0,4^r)g (65%) H-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys(BOC)-Lys-(BOC)-D-OLyS(BOC)-NH. · HCI werden erhalten.

Schritt 3

BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-GlufOBu'J-His-Phe-Arg-TrP-GIy-LyS(BOC)-PrO-VaI-GIy-LyS(BOC)-

Lys( BOC)- Lys( BOC)- Lys( BOC)-

D-ÖLys(BOC; NH.. · HCI

0.398 g (0.2OmMoI) BOC-D-OSer-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu')-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(BOr)-Pro-Val-GIy-OH ■ HCI. 0.242 g (0.2OmMoI) H-Lys(BOC)-

LyS(BOC)-LyS(BOCJ-LyS(BOC)-D-OLyS(BOC)- i" NH- HCI und 0.165g (0.9OmMoI) Pentafluorphenol werden in 4 ml Dimethylformamid gelöst und zuerst 0,022 ml (0.20 mMol) N-Methylmorpholin. dann 0.063 g (0.3OmMoI) DCC zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei Zimmertemperatur stehen gelassen, dann das r DCU abfiltriert und das Filtrat mit Äther verdünnt. Das ausgeschiedene Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. 0.591 g (95%)

geschütztes Nonadekapepl idainidludrorhlorid w erden erhalten. Rl' = 0.70.

Versuchsberiehi

Die genial! den Beispielen 5 und b erhaltenen Produkte wurden mit Tetracosactrin hinsichtlich der Wirkungsdauer verglichen. Datei ergab sich, daß bei Teiracosactrin nach Verabreichung \on 0.01 mg/kg i. ν der Corticosieronspicgel im Blut von Rauen \om nach einer Stunde erreichten Maximalwert innerhalb \on 2 bzw. 4 weiteren Stunden auf 58 b/w. 12% des Maximalwertes sank. Demgegenüber sind bei Verabreichung gleicher Dosen von [D-OS¹. Lys'^{: !}\ D-OI.ys"]-ACTH(I -19)-NH (Beispiel 6)" und [D-O'Ser . Lys^ir "\ Olys'-'J-ACTHfl- I9)-NH.. (Beispiel 5) vom nach einer Stunde erreichten Maximalwert nach 2 b/w. 4 weiteren Stunden noch 78 b/w. 32% resp. 76 b/u. 34% des Maximalwertes vorhanden.

Claims

Palentansprüche:

1. Peptide der allgemeinen Formel(l)

JJ-D-OSer-Tyr-Ser-Mel-Jlu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-(Lys)„-OLys-OH

in der π eine ganze Zahl \ on 2 bis 4 ist und
D-OSer die D-Form des Restes der a-Aminooxy-,i-Jndroxypropion- und OLys die L- oder D-Form de* Restes der A-Aminooxy-E-aminocapronsäure bedeuten, sowie deren Säureadditionssalze und Amide.

2. Verfahren zur Herstellung der Peptide der allgemeinen Formel (1) nach Anspruch 1 sowie von deren Säureadditionssalzen und Amiden, dadurch gekennzeichnet, daß man von Peptiden der allgemeinen Formel(II)