DE2450357C2

DE2450357C2 - Pentapeptid und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE2450357C2
Application number: DE2450357A
Authority: DE
Inventors: Kengo Niiza Saitama Araki; Takafumi Tokyo Nakamura; Shinro Narashino Chiba Tachibana; Mikio Urawa Saitama Uchiyama
Original assignee: EISAI Co Ltd TOKYO JP
Current assignee: EISAI Co Ltd TOKYO JP
Priority date: 1973-10-23
Filing date: 1974-10-23
Publication date: 1983-07-21
Also published as: GB1491017A; FR2248052A1; DE2450357A1; US3928306A; DE2463205C2; FR2248052B1

Description

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Das erfindungsgemäße Pentapeptid der Formel:
H-Arg-Pro-Trp-IIe-Leu-OH (I)

weist verschiedene pharmakologische Wirkungen auf, insbesondere eine Aktivität bezüglich der Muskelkontraktion des Magenbodens und der Blutdruckdepression.

Die pharmakologische Aktivität entspricht '/200 der des Xenopsins.

Xenopsin ist nur schwierig erhältlich, weil es bisher aus afrikanischen Fröschen gewonnen wurde und zu seiner Isolierung komplizierte Extraktionsverfahren erforderlich sind. Bei der synthetischen Herstellung des Xenopsins, das ein Oktapeptid ist, müssen acht verschiedene Aminosäuren in bestimmter Frequenz miteinander verbunden werden.

Das Pentapeptid der Formel (1) gemäß der Erfindung wird durch Abspalten der Schutzgruppe oder Schutzgruppen des geschützten Pentapeptids der Formel

Ri-(N"»-R*)Arg-Pro-Trp-lle-Leu-OR³ (II)

in der R¹, R² und R³ Wasserstoffatome oder übliche Schutzgruppen sind, wobei R¹, R² und R³ nicht gleichzeitig Wasserstoff bedeuten, in an sich bekannter Weise hergestellt.
Als Aminoschutzgruppen R¹ und R² in Formel (II) kommen beispielsweise Acylreste, wie Formyl-, Benzoyl-, Phthalyl-, Trifluoracetyl- und Tosylreste; Alkylreste, wie Trityl und Benzyl; Alkylidenreste und urethanartige Reste, wie Benzyloxycarbonyl-, p-Brom-, p-Chlor- und p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, Tolyloxycyclohexyloxy- und t-Butoxycarbonylreste in Frage. Als Schutzgruppen R³ in Formel (II) können erwähnt werden: niederes Alkyl, wie Methyl, Äthyl, Propyl; Benzyl, p-Brom-, p-Chlor- und p-MethoxybenzyL

Die Abspaltung der Schutzgruppe oder Schutzgruppen von dem Pentapeptid der Formel (II) kann mit Hilfe üblicher Methoden, wie der Behandlung mit Trifluoressigsäure, Fluorwasserstoffsäure, sowie durch katalytische Reduktion in Gegenwart von Palladium-auf-Kohle erfolgen.

Die Verbindung der Formel (I) kann gewünschtenfalls in deren pharmakologisch annehmbares Säureadditionssalz gemäß üblichen Salzbildungsmethoden überführt werden. Als pharmakologisch annehmbare anorganische Säuren können Salzsäure, Schwefelsäure, Brornwasserstoffsäure und Salpetersäure erwähnt werden. Als pharmakologisch annehmbare organische Säuren können Ameisensäure, Oxalsäure, Essigsäure, Citronensäure, Weinsäure, Fumarsäure, Maleinsäure und Methansulfonsäure erwähnt werden.

Das geschützte Pentapeptid der Formel (II), das als Ausgangsmaterial zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dient, ist eine neue Verbindung. Es können verschiedene Verfahren zur Synthese des Peptids der Formel (II) verwendet werden. Beispielsweise kann das Peptid durch Kondensation der folgenden beiden Fragmente A und B erhalten werden:

H-Trp-Ile-Leu-OR³
R'-(N«-R²)Arg-Pro-OH

(Fragment A)
(Fragment B)

wobei R¹, R² und R³ die vorstehend angegebenen Bedeutungen haben.

Diese Fragmente A und B können unter Bildung der Verbindung der Formel (II) gemäß üblichen Peptidverbindungsmethoden kondensiert werden.

Das Fragment A ist gleichfalls eine neue Verbindung, die durch aneinanderfolgendes Binden der entsprechenden Aminosäureeinheiten hergestellt werden kann. Beispielsweise kann das Fragment der Formel

H-Trp-Ile-Leu-OBZL (B')

gemäß der in F i g. 1 angegebenen Arbeitsweise hergestellt werden.

Fig. 1

Trp

He

BOC-BOC-
H

-OH
DCC¹²¹

BOC-BOC H-Leu

H-

HOBT- DCC''¹

-OBZL
-OBZL
-OBZL
-OBZL
-OBZL

In der vorstehenden Formel (B') und F i g. t haben die Abkürzungen folgte Bedeutungen:

(') Methode nach W, König und R. Geiger

(²) Carbodümidmethode

BOC t-Butoxycarbonylrest

BZL Benzylrest

DCC Dicyclohexylcarbodiimid

HOBT N-Hydroxybenzotriazol

TFA Trifluoressigsäure ι ο

Beispiel

Synthese von H-Arg-Pro-Trp-IIe-Leu-OH

1,1 g BOC-(N»-NO₂)Arg-Pro-Trp-Ile-Leu-OBZL is wurden in 50 ml 98%iger Ameisensäure gelöst Die erhaltene Lösung wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend unter verringertem Druck konzentriert.

Zum Konzentrat wurden 50 ml Äthyläther zugegeben und der Niederschfag durch Filtration abgetrennt.

Der Niederschlag wurde in 80 ml 10%iger Essigsäure in Methanol gelöst Anschließend wurde in Gegenwart von 10% Palladium-auf-Kohle 2 Tage katalytisch reduziert Nach Vervollständigung der Reduktion wurde der verbrauchte Katalysator durch Filtrieren entfernt Das Filtrat wurde unter verringertem Druck konzentriert Zu dem Konzentrat wurde Äthyläther zugegeben, und der Niederschlag durch Filtrieren abgetrennt und mit Äthyläther gewaschen. Es wurden 0,8 g Rohprodukt erhalten. Das Rohprodukt wurde chromatographisch mit einer mit SP-Sephadex® gefüllten Kolonne gereinigt, wobei eine O.i/5molare Ammoniumformiatpufferlösung e>nes pH-Werts von 6,5 als Eluierflüssigkeit verwendet wurde. C^r Hauptteil der gewonnenen Fraktion wurde gefriergetrocknet, um das erhaltene Produkt in Form eines Formiats mit folgenden Eigenschaften zu erhalten.

[α] ξ- 65,6° (c= 032 in Wasser)
Analytische Daten der Aminosäureeinheiten:
Arg = 0,96, Pro= 101, He= 1,00, Leu = 0,97

Elementaranalyse auf
C34H53N9O6 · 2 HCOOH · 2 H₂O:

ber.(%) C 53,24 H 7,58 N 15,52

gef.(°/o) C 53,14 H 7,23 N 15,83

Dünnschichtkieselgelchromatographie:

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BOC-(N<--Nq₂)Arg-Pro-Trp-Ile-Leu-OBZL. das als Ausgar.gsmaterial verwendet wurde, wurde folgendermaßen hergestellt:

575 mg H-Trp-lle-Leu-OBZL · Hydrochlorid wurden in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst Zur erhaltenen Lösung wurden 1,1 ml einer 10%igen N-Methylmorpholintetrahydrofuraniösung zugegeben. Anschließend wurden unter Rühren und Kühlen auf 0⁰C 416 mg BOC-(N°>NO₂)Arg-Pro-OH, 250 mg N-Hydroxybenzotriazol und 250 mg Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Es wurde 5 Stunden bei der vorerwärmten Temperatur gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur absetzen gelassen. Der ausgefallene Niederschlag wurde durch Filtration entfernt und das Filtrat unter verringertem Druck konzentriert Das erhaltene Konzentrat wurde in 100 ml Äthylacetat gelöst und die Lösung nacheinander mit einer wäßrigen normalen Lösung von Natriumbicarbonat. Wasser, 1/4 molarer Citronensäure, Wasser, wiederum mit einer wäßrigen normalen Natriumbiearbonat-Lösung u-fld Wasser gewaschen, und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet

Das trockene Konzentrat wurde unter verringertem Druck konzentriert 0,9 g des Rückstandes wurden durch Ausfällen aus einer Mischung aus Äthylacetat und Petroläther gereinigt, um das beabsichtigte Produkt in pulverförmiger Form mit einem Schmelzpunkt von 95 bis 115° C (Zersetzung unter Schäumen) zu erhalten.

[«]g>-69,0^o (c= 1 in Methanol)

1/2 H₂O:

Rr = 0,36 (Entwicklungsmittel n-Butanol : Essigsäure : Wasser 4:1:5)

Rf = 0,66 (Entwicklungsmittel n- Butanol : Essigsäure : Pyridin : Wasser 30 :20 :6 :24)

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65 Elementaranalyse auf C^H»!
ber.(%) C 59,52 H 73 N 15,09

gef. (%) C 59,67 H 7,26 N 14,78
Dünnschichtkieselgelchromatographie:

Rf = 036 (Entwicklungsmitte! Ä-thylacetat)
Rf = 032 (Entwicklungsmittel n-Butanol: Essigsäure : Wasser4 :1 :5)

H-Trp-Ile-Leu-OBZL, das als Ausgangsmaterial in Beispiel 1 verwendet wurde, ist gleichfalls eine neue Verbindung, die auf folgende Weise erhalten werden kann:

(a) Synthese von BOC-Trp-lle-Leu-OBZL

3,9 g BOC-Ile-Leu-OBZL wurde in einer 50%igen Trifluoressigsäure/Dichlormethanlösung gelöst Die erhaltene Lösung wurde 1 1/2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen, unter verringertem Druck konzentriert und der Rückstand zu 200 ml Chlorwasserstoff enthaltenden Äthyläther zugegeben. Der weiße ausfallende Niederschlag wurde durch Filtrieren abgetrennt und getrocknet. 3 g des trockenen Niederschlags mit einem Schmelzpunkt von 154 bi«155°C wurden in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst. Anschließend wurden 0,88 ml n-Methylmorpholin zugegeben. Unter Kühlen auf 0⁰C wurden nacheinander 2,4 g BOC-Trp-OH, 13 g N-Hydroxybenzotriazol und 1,8 g CyciohexylcarDodiimid zugegeben. Nach einstündigem Rühren bei dieser Temperatur wurde weitere 4 Stunden gerührt und über Nacht stehen gelassen. Der auskristallisierende Niederschlag wurde durch Filtrieren abgetrennt und das Filtrat nach Waschen mit Äthylacetat unter verringertem Druck konzentriert. Die durch Lösen des Rückstandes in Äthyläther erhaltene Lösung wurde nacheinander mit Wasser, wäßriger normaler Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 1/4 molarer wäßriger Citronensäurelösung und nochmals Wasser gewaschen, und anschließend mit Glaubersalz getrocknet. Der durch Konzentrieren unter verringertem Druck erhaltene Niederschlag wurde aus einer Mischung aus Äthyläther und η-Hexan umkristallisiert. Auf diese Weise wurden 4,5 g des beabsichtigten Produkts als weiße pulvrige Substanz mit einem Schmelzpunkt von 154 bis 156°C erhalten.

[a]^= -42° (c= 1 in Methanol)
Massenspektrum: n/e620(M⁺)

Elementaranalyse auf C₃₅H₄₈N₄O₆:
ber.(%) C 67,70 H 7,81 N 9,03
gef. (%) C 67,73 H 8,06 N 9,34

Dünnschichtkieselgelchromatographie:
Rf = 0,86 (in Äthyläther als Fließmittel)

(b) Synthese von H-Trp-Ile-Leu-OBZL

2,5 g BOC-Trp-lIe-Leu-OBZL wurden in 20 ml einer 5O°/oigen Trifluoressigsäure/Dichlormethanlösung mit einem Gehalt von 0,4 ml Mecaptoäthanol und 0,5 ml Anisol gelöst. Die erhaltene Lösung wurde 30 min bei Raumtemperatur gerührt und unter verringertem Druck auf 5 ml konzentriert Zum Konzentrat wurden nacheinander 100 ml Äthyläther und 4 ml einer 10%igen Chlorwasserstoff/Äthylacetat-Lösung zugegeben.

Durch Filtration wurde ein gelatineartiger Niederschlag gewonnen, um das beabsichtigte Produkt in Form eines Hydrochlorid-Additionssalzes zu erhalten, das aus einer Mischung aus Ätbsnol/lsopropyläther umkristalli-

siert wurde,

Ausbeute; I β g, Schmelzpunkt 219 bis 220° C. [α]*,⁷-25,33 Cc=0,75 in 50% Methanol)

Elementaranalyse 8UfC_3nH₄ON₄O₄ · HCl · H₂O: ber.(%) C 62,63 H 7,55 N 9,74 gef.(%) C 62,62 H 7,26 N 9,84

Dünnschichtkieselgelchromatographie:

Rf = 0,83 (n-Butanol: Essigsäure : Wasser

4:1 :5 als Fließmittel) Rf = 0,87 (n-Butanol: Essigsäure : Pyridin : Wasser

30 :6 :20 :24 als Fließmittel)

Claims

Patentansprüche:

1. Pentapeptid der Formel
H-Arg-Pro-Trp-Ile-Leu-OH.

2. Verfahren zur Herstellung des Pentapeptids der Formel

H-Arg-Pro-Trp-Ile-Leu-OH

gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Schutzgruppen aus einem Pentapeptid der allgemeinen Formel:

R'-(N"-R²)Arg-Pro-Trp-lle-Leu-OR³

in der R¹, R² und R³ Wasserstoff oder übliche Schutzgruppen darstellen, wobei R¹, R² und R³ nicht gleichzeitig Wasserstoff bedeuten, in an sich bekannter Weise abspaltet.

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