CH618466A5

CH618466A5 -

Info

Publication number: CH618466A5
Application number: CH1005775A
Authority: CH
Inventors: Oskar R Zaborsky; Allen I Laskin
Original assignee: Exxon Research Engineering Co
Priority date: 1974-08-07
Filing date: 1975-07-31
Publication date: 1980-07-31
Also published as: SE7508882L; IL47762A0; JPS5141494A; US3970521A; IL47762A; GB1513185A; CA1060366A; IT1040424B; JPS5839514B2; DE2534412A1; SE430791B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Glycoenzymen. Unter Immobilisierung versteht man im allgemeinen die Bindung eines ersten Stoffes derart an einen zweiten Stoff, dass der erste Stoff in bestimmten Lösungsmiteln, insbesondere Wasser, unlöslich wird.

Enzyme können durch viele chemische oder physikalische Arbeitsweisen immobilisiert werden. Bisher hat man zur Ausführung der chemischen Methoden stets die Aminosäurereste eines Enzyms umgewandelt, auch wenn das Enzym andere funktionelle Gruppen aufweist, die modifiziert werden könnten, beispielsweise die Kohlenhydratreste von Glycoenzymen. So hat man bereits Glycoenzyme wie Glucoseoxydase und Gly-coamylase durch chemische Eingriffe an deren Aminosäureresten immobilisiert. In letzter Zeit bekannt gewordene Arbeiten über die Funktion der Kohlenhydratreste von Glucoseoxydase haben wahrscheinlich gemacht, dass diese Zuckerreste bei der enzymatischen Katalyse nicht beteiligt sind, so dass man daraus die Folgerung ziehen kann, dass diese Reste besser dazu geeignet sein könnten, Glycoenzyme kovalent an wasserunlösliche Polymere über diese katalytisch nicht unbedingt erforderlichen Kohlenhydratreste und nicht über die Aminosäuregruppen zu binden, von denen einige für die Bindung an das Substrat und die Katalyse wichtig sind. Diese Erfindung bezieht sich nun ganz allgemein auf die Immobilisierung von Enzymen an anderen als den Aminosäuregruppen.

Erfindungsgemäss behandelt man ein Glycoenzym mit einem Oxydationsmittel bei Bedingungen, unter denen in den Kohlenhydratresten des Glycoenzyms Carbonylgruppen oder Acetalgruppen gebildet werden. Dann wird das oxydierte Produkt mit einem aminogruppenhaltigen Stoff unter Bedingungen zusammengebracht bei denen sich eine Verbindung des aminogruppenhaltigen Stoffs mit dem oxydierten Glycoenzym bildet. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens behandelt man das Glycoenzym, beispielsweise Glucoseoxydase, mit wässriger Perjodsäure oder Natriumperjodatlösung bei einem pH zwischen 2,5 und 7,5 und einer Temperatur zwischen 5 und 40 °C solange, bis ein Teil des Kohlenhydratrestes oxydiert ist, d. h. in einen Rest überführt ist, der Carbonyl- oder Acetalgruppen enthält Das oxydierte Glycoenzym wird dann mit einem wasserunlöslichen Polymer, beispielsweise Poly-p-aminostyrol, zusammengebracht, wobei sich eine wasserunlösliche Verbindung des Glycoenzyms mit dem Polymer ergibt. Die am meisten bevorzugte Enzym-Polymer-Verbindung, beispielsweise Glucoseoxydase mit Poly-p-aminostyrol, besitzt die volle Aktivität verglichen mit einer Lösung von Glucoseoxydase und zeigt eine verbesserte Wärmestabilität.

Die Modifizierung von Glycoproteinen mit Perjodaten ist bekannt. In Biochemical and Biophysical Research Communications, Bd. 31, Nr. 1,1968 ist beispielsweise die Modifizierung von Meerrettichperoxydase mittels Natriummetaperjodat unter Bildung eines Oxydationsproduktes beschrieben. Jedoch wird eine weitere Umsetzung dieses Oxydationsproduktes, beispielsweise zur Herstellung eines immobilisierten Enzyms, nicht erwähnt. Bossard (Année Biol. 52,202 El948]) gibt an, dass Perjodsäure die Glucosidase von Mandeln zerstört. Auf ähnliche Weise zeigen Maekawa u. a., Bd. 29, Nr. 7, S. 353-356 in Proc. Japan Acad. (1953) die Oxydation von a-Amylase mit Natriummetaperjodat unter Bildung eines Oxydationsproduktes, welches nur noch einen kleinen Bruchteil der ursprünglichen Amylaseaktivität aufweist Auch hier wird nichts über eine weitere Umsetzung der oxydierten a-Amylase, beispielsweise zur Immobilisierung der Amylase, erwähnt.

Pazur u. a. (Archives of Biochemistry and Biophysics, 103, 515-518 [1963]) beschreiben die Oxydation von a-Amylase und Glucoamylase mit Perjodat unter Bildung eines Produktes, dessen enzymatische Aktivität nicht vermindert ist. Die Verfasser geben jedoch nicht an, dass dieses Produkt unter Bildung eines immobilisierten Enzyms weiter umgesetzt werden kann. Pazur u. a. (Arch. Biochemistry and Biophysics, 111,351-357 [1956]) erwähnen die Oxydation des Kohlenhydratrestes von Glucoseoxydase mit Natriummetaperjodat. Die Verfasser geben an, dass das Enzym nach der Oxydation an Aktivität verliert und erwähnen nicht eine weitere Umsetzung des Oxydationsproduktes, beispielsweise unter Bildung einer immobilisierten Glucoseoxydase.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass man immobilisierte Glycoenzyme bequem dadurch herstellen kann, dass man ein Glycoenzym unter Bedingungen, bei denen im Kohlenhydratrest des Glycoenzyms Carbonylgruppen oder deren Derivate gebildet werden, oxydiert und das Oxydationsprodukt dann mit einem aminogruppenhaltigen Stoff unter Bildung einer wasserunlöslichen Verbindung dieses aminogruppenhaltigen Stoffes mit dem oxydierten Glycoenzym weiter umsetzt. Vorzugsweise ist die aminogruppenhaltige Substanz ein Polymer, beispielsweise Poly-p-aminostyrol. Die bevorzugten Enzym-Polymer-Verbindungen, die man erfindungsgemäss erhält, zeigen eine Aktivität die praktisch derjenigen des Ausgangsenzyms gleich ist und zeigen verbesserte Wärmestabilität.

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Glycoenzyme sind Enzyme, die in ihrem Molekülaufbau Kohlenhydratreste aufweisen. Man kennt heute noch nicht die genaue Funktion dieser Kohlenhydratreste in derartigen Enzymen, aber es wird vermutet und es bestehen Anhaltspunkte dafür, dass diese Reste katalytisch inert sind, d. h. für die Aktivität nicht unbedingt erforderlich sind. Die Erfindung zieht Vorteile aus der katalytischen Trägheit der Kohlenhydratreste, um sie zur Bindung des Glycoenzyms an eine aminogruppenhaltige Substanz zwecks Modifizierung des Enzyms und beispielsweise die Herstellung einer wasserunlöslichen Verbindung zu benutzen.

Es sind bereits zahlreiche Glycoenzyme bekannt, siehe beispielsweise Pazur u. a, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Bd. 27,1972, Academic Press, New York, ab Seite 301. Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch zur Modifizierung von Glycoproteinen und Glycopeptiden im allgemeinen angewendet werden. Das Verfahren ist jedoch insbesondere zur Modifizierung von Glycoenzymen geeignet, bei dem man einen katalytisch unwirksamen Bestandteil des Enzyms zur Herstellung der wasserunlöslichen Verbindung benutzt. Auf diese Weise können die bei den bekannten Verfahren zur Herstellung immobilisierter Enzyme angetroffenen Schwierigkeiten, nämlich der Aktivitätsverlust, vermieden werden, weil das Enzym über katalytisch unnötige Gruppen an ein wasserunlösliches Material gebunden wird.

Die Erfindung kann insbesondere zur Immobilisierung von Glucoseoxydase, a-Amylase, Glucoamylase, Invertase, Galac-tosidase, Bromelin, Chlorperoxydase, Peroxydase und verschiedener Proteasen angewendet werden. Diese Enzyme sind in den folgenden Prozessen katalytisch wirksam: Entfernung von Sauerstoff aus Lösungen (Glucoseoxydase); Stärkehydrolyse (a-Amylase, Glucoamylase); Zuckerhydrolyse (Invertase); Lac-tosehydrolyse (Galactosidase); Hydrolyse von Peptiden, Ami-den und Estern (Bromelin); Synthese von Kohlenstoff-Halogen-Bindungen (Chlorperoxydase); Oxydation von Phenolen, Ami-nöphenolen, Diaminen und Aminosäuren in Gegenwart von H2O2 (Peroxydase); sowie Hydrolyse von Proteinen (Proteasen).

Zur Oxydation der Kohlenhydratgruppen des Glycoenzyms zu Carbonylgruppen oder Acetalgruppen können verschiedene Oxydationsmittel verwendet werden. Beispiele dafür sind Bleitetraacetat, Manganacetat, Kobaltacetat, Thalliumace-tat, Cersulfat usw. Das bevorzugte Oxydationsmittel ist jedoch ein Perjodat, beispielsweise Perjodsäure, Natriummetaperjodat, Kaliummetaperjodat usw.

Die Oxydation von Kohlenhydraten und Polysacchariden mit Perjodaten ist bekannt, siehe z. B. J. M. Bobbitt, Advances in Carbohydrate Chemistry, 11,1956, Academic Press, New York, ab Seite 1. In dieser Schrift diskutiert der Verfasser die Verwendung verschiedener Perjodatverbindungen zur Oxydation von Kohlenhydratgruppen. Die dort beschriebenen Arbeitsweisen sind im allgemeinen zur Herstellung oxydierter Glycoenzyme anwendbar, die danach erfindungsgemäss zur Bildung der immobilisierten Glycoenzyme verwendet werden.

Vorzugsweise wird das oxydierte Glycoenzym dadurch erhalten, dass man das Glycoenzym mit einem Perjodat in einer wässrigen Lösung bei einem pH zwischen 2,5 und 7,5, vorzugsweise zwischen 4,5 und 6,5, zusammenbringt. Die Temperatur bei dieser Reaktion wird vorzugsweise zwischen 5° und 45 °C gehalten, insbesondere zwischen 10 und 30 °C. Das Glycoenzym kann in einer Konzentration zwischen 0,1 und 10 mg/ml vorliegen, beispielsweise mit 2 mg/ml. Die Perjodat-konzentration der wässrigen Lösung liegt im allgemeinen zwischen 0,1 und 5 mg/ml, beispielsweise bei etwa 0,5 mg/ml. Der Fachmann wird diese Bedingungen so einstellen, dass er ein Glycoenzym erhält, welches ausreichend oxydiert ist, jedoch noch eine genügende Aktivität aufweist, und es danach mit der aminogruppenhaltigen Verbindung reaktionsfähig ist. Bei der

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Oxydation des Glycoenzyms bilden sich Carbonylgruppen oder deren Vorprodukte, beispielsweise Acetale, die bei der anschliessenden Umsetzung mit einer Aminoverbindung reagieren.

Es ist bereits bekannt, dass die verschiedenen Glycoenzyme unterschiedliche Mengen an Kohlenhydratgruppen aufweisen. Im allgemeinen stellt man die Perjodatkonzentration im Hinblick auf die Menge an anwesendem Glycoenzym und die Menge an Kohlenhydratgruppen ein, welche das Glycoenzym aufweist.

Bezüglich der anwesenden Kohlenhydratgruppen wird im allgemeinen ein Überschuss an Perjodat angewendet, weil die Reaktion nicht bis zum Ende verläuft. Es wird angenommen, dass manche Kohlenhydratgruppen vor dem Angriff des Per-jodats sterisch geschützt sind; in jedem Fall sind aber so viele Kohlenhydratgruppen zugänglich, dass die Bildung der für die weitere Reaktion notwendigen Carbonylgruppen gesichert ist.

Bei der Oxydation wird vorzugsweise das Tageslicht ausgeschlossen, um eine Überoxydation des Glycoenzyms zu verhindern. Eine Reaktionszeit, die mindestens zur Bildung einer kleinen Menge an Carbonylgruppen für die nachfolgende Reaktion mit einer Aminoverbindung ausreicht, muss gewählt werden. Beispielsweise kann die Dauer der Reaktion des Glycoenzyms mit dem Perjodat 15 Minuten bis 24 Stunden, vorzugsweise 30 bis 180 Minuten betragen. Das oxydierte Glycoenzym wird dann vorzugsweise von der wässrigen Lösung, welche noch Perjodat enthält, abgetrennt. Das oxydierte Glycoenzym kann jedoch auch mit der aminogruppenhaltigen Substanz ohne Abtrennung umgesetzt werden, wenn störende Verbindungen abwesend sind, beispielsweise Verbindungen, die auch mit Ami-nogruppen oder einem Überschuss an Aminogruppen reagieren. Das oxydierte Glycoenzym kann bequem durch Dialyse gegen eine gepufferte Lösung abgetrennt werden. Beispielsweise kann die Lösung mit einem Acetatpuffer mit einem pH von 5,59 über eine Membrane zusammengebracht werden, bis kein weiteres dialysierbares Material hindurchtritt. Das oxydierte Glycoenzym sollte bei einer Temperatur von weniger als 25 °C gehalten werden, wenn es vor der nachfolgenden Umsetzung aufbewahrt werden soll.

Eine wässrige Lösung des oxydierten Glycoenzyms, welche beispielsweise 0,1 bis 3% Glycoenzym enthält, wird dann mit dem aminogruppenhaltigen Stoff zusammengebracht. Vorzugsweise ist dieser wasserunlöslich, beispielsweise ein Polymer, wobei jedoch auch niedermolekulare aminogruppenhaltige Verbindungen verwendet werden können. Das pH wird bei dieser Reaktion im allgemeinen entweder auf leicht sauer oder . leicht basisch eingestellt, vorzugsweise auf 5,5 bis 6,5 oder 7,5 bis 9,5. Zur Einstellung des pH-Wertes kann man mit Vorteil entweder HCl oder NaOH verwenden. Das Gemisch wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen 5 und 35 °C so lange gerührt, bis sich die gewünschte Verbindung aus oxydiertem Glycoenzym und Aminoverbindung ausgebildet hat. Dann kann man das Reaktionsprodukt abfiltrieren und es vorzugsweise mit Wasser und einer Salzlösung waschen, beispielsweise gepuffertem Natriumchlorid, wobei nicht umgesetztes Enzym entfernt wird.

Die aminogruppenhaltige Substanz, welche beim erfin-dungsgemässen Verfahren verwendet wird, enthält mindestens eine Aminogruppe pro Molekül. Vorzugsweise weist diese Substanz mindestens eine primäre Aminogruppe auf. Für die Reaktion mit dem oxydierten Glycoenzym sind sekundäre Aminogruppen weniger bevorzugt, während tertiäre Aminogruppen am wenigsten bevorzugt werden.

Das Amin wird so ausgewählt, dass die gebildete Enzym-Amino-Verbindung nach der Reaktion wasserunlöslich ist. Vorzugsweise ist diese Verbindung ein wasserunlöslicher Feststoff, der in enzymkatalysierten Reaktionen als heterogener Katalysator verwendet werden kann. Amine, die mehr als eine Amino-

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grappe aufweisen, insbesondere primäre Aminogruppen, werden bevorzugt.

Die beim erfindungsgemässen Verfahren verwendete Aminoverbindung kann unter Verbindungen der allgemeinen Formel

R - X - N - R-l ausgewählt werden, worin R, Ri und R2 für Wasserstoff oder einen gegebenenfalls substituierten Kohlenwasserstoffrest stehen und X ein Stickstoff- oder Kohlenstoffatom ist. Die in den Kohlenwasserstoffresten gegebenenfalls vorhandenen Substi-tuenten können Halogen, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor, Silizium oder Stickstoff enthalten.

Vorzugsweise ist R eine praktisch lineare polymere Kette, beispielsweise mit einem Molekulargewicht zwischen 500 und 1 000 000 und Ri und R2 sind Wasserstoff. Wenn X für Stickstoff steht, ist daran kovalent eine weitere Gruppe gebunden, die in der obenstehenden Formel nicht dargestellt ist. Wenn X für Kohlenstoff steht, weist dieses Atom selbstverständlich zwei weitere, nicht dargestellte kovalent-gebundene Gruppen aus. Diese Gruppen sind im allgemeinen Wasserstoff oder Kohlenwasserstoffreste, beispielsweise mit bis zu 20 C-Atomen. Vorzugsweise sind diese Gruppen Wasserstoff oder Ci- bis C3-Alkylgruppen, insbesondere jedoch Wasserstoffatome.

Einige der oben angegebenen Substituenten, die in den bevorzugten Gruppen R vorhanden sein können, d. h. im poly-meren Rest, können seitlich an der Polymerkette gebunden sein oder als Heteroatome darin vorliegen. Beispielsweise können Sauerstoffsubstituenten in Form eines Heteroäthers vorliegen, z. B. R ist beispielsweise ein Polyäthylenoxydrest; oder aber als Sauerstoffatome von Carbonylgruppen, wobei beispielsweise R ein Polyvinylacetatrest sein kann.

Vorzugsweise ist der aminogruppenhaltige Stoff ein wasserunlösliches aminogruppenhaltiges Polymer, beispielsweise Poly-p-aminostyrol, Aminoäthylcellulose, Carboxymethylcellu-losehydrazid, Biogel-P-2-Hydrazid(Polyacrylamidderivat der Bio-Rad Corp, Richmond, Kalifornien) oder Aminosepharose, herstellbar nach Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245,3059-3065 (1970); weiterhin ein aminoalkyliertes Glas der Pierce Chemical, Rockford, Illinois usw.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die erfindungsgemäss hergestellte Glycoenzym-poly-p-Aminostyrol-Verbin-dung eine Aktivität aufweist, die praktisch derjenigen des Glycoenzyms im nativen Zustand, d. h. in wässriger Lösung, gleich ist Es war noch überraschender, dass viele der so hergestellten Glycoenzym-Aminopolymer-Verbindungen eine verbesserte thermische Stabilität verglichen mit den nativen Enzymen aufweisen.

Die erfindungsgemäss erhaltenen wasserunlöslichen Enzymverbindungen können in allen Verfahren verwendet werden, bei denen man heute native Glycoenzyme verwendet. In Folge der erhöhten Wärmestabilität der neuen Verbindungen können diese Verfahren bei höheren Temperaturen ausgeführt werden, ohne dass eine Denaturierung des Enzyms eintritt.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.

Beispiel 1

An Glucoseoxydase aus Aspergillus niger (Worthington Biochemical Corp, Freehold, N. J.) wurde spektrophoto-

metrisch eine Aktivität bei 460 nm an einer Verbindung Pero-xydase-o-dianisidin unter Verwendung von D-Glucose in 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,0 bei 25 °C, gemessen; siehe H.H. Weetall und L.S. Hersh, Biochim. Biophys. Acta 206,54-60, 1970. Die Aktivität der immobilisierten Enzymderivate wurde nach O. Zaborsky und J. Ogletree, Biochim. Biophys. Acta 289, 68-76,1972, bestimmt.

Die Konzentration von Glucoesoxydase wurde spektro-photometrisch bei 450 nm (50 mM Acetatpuffer, pH 5,6) und einem Extinktionskoeffizient von 1,41x10* M-1 cm-1 gemessen. Die Konzentration an katalytisch aktivem Enzym wurde spek-trophotometrisch mittels des differentiellen molaren Extinktionskoeffizienten bei 450 nm von 1,31 x WM-1 cm-1 bestimmt, siehe M.K. Weibel und H.J. Bright, J. Biol. Chem. 246, 2734-2744,1971. Die Konzentration an katalytisch aktivem Enzym wurde weiterhin spektrophotometrisch mit einem differentiellen molaren Extinktionskoeffizienten von 1,31 x 104 M-1 cm-1 bei 450 nm durch anaerobe Titration des Enzyms mit Glucose gemessen, siehe obige Autoren in Biochem. J. 124, 801-807 (1971). Der Proteingehalt der Enzym-Polymer-Verbindung wurde durch Aminosäureanalyse nach der beschriebenen Arbeitsweise analysiert, siehe O.R. Zaborsky und J. Ogletree, Biochim. Biophys. Acta 289,68-76 (1972). Die Menge an Protein wurde aus den gefundenen Mengen an Alanin (Ala), Valin (Val) und Glutaminsäure (Glu) und der Annahme berechnet, dass das Molekulargewicht des Enzyms 150 000 beträgt und 108 Ala-, 79 Val- und 99 Glu-Reste pro Molekül aufweist, siehe J.H. Pazur, K. Kleppe und A. Cepure, Arch. Biochem. Biophys. 111,351-357(1965).

Oxydation von Glucoseoxydase mit Perjodsäure

Zu einer gerührten Lösung von 40,2 mg, 2,68 x 10-7 Mol Glucoseoxydase in 20 ml 50 mM-Acetatpuffer, pH 5,60, in einem vor Licht geschützten, auf 25 °C durch Thermostat gehaltenen Gefäss wurden 0,4 ml einer Perjodsäurelösung mit 9,12 mg oder 4,00 x 10~5 Mol Perjodsäure gegeben. Die gelbe Lösung wurde 4 Stunden gerührt, worauf man 0,025 ml (4,48 x IO-4 Mol) Äthylenglycol zur Zerstörung des überschüssigen Perjodats zugab und weitere 30 Minuten weiter rührte. Die Lösung wurde in eine Ultrafiltrationszelle (Amicon Modell 202) gegeben, welche mit einem Filter XM-50 ausgerüstet war und unter 3,5 Atmosphären Stickstoffdruck arbeitete, und gegen 50 mM Acetatpuffer mit pH 5,59 dialysiert, bis kein weiteres dialysierbares Material überging. Die Umwandlung der Perjodsäure nach den ersten 4 Stunden Reaktion mit der Glucoseoxydase betrug 61,6%, bezogen auf die Absorptionsänderung bei 223 nm (siehe J. J. Dixcon und D. Lipkin, Anal. Chem. 26,1092-1093 [1954]) zu. Das oxydierte Enzym wurde bei 5 °C aufbewahrt

Verbindung der oxydierten Glucoseoxydase mit Poly-p-aminostyrol

Zu 5 ml einer Lösung von 10 mg oxydierter Glucoseoxydase wurden 250 mg feingepulvertes Poly-p-aminostyrol gegeben, welches von der Firma Polysciences Inc., Warrington, Pa. erhältlich ist. Die Suspension wurde mit 0,1 N NaOH auf pH 9 eingestellt, bei ca. 25 °C 1 Stunde lang gerührt und dann durch ein 0,45 ji-Millipore-Filter filtriert. Der Rückstand wurde mit 11 H2O und 111 M NaCl in 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,4) gewaschen. Nachdem einige ml Waschwasser hindurchgelaufen waren, konnte keine Aktivität im Waschwasser mehr festgestellt werden. Das ursprüngliche Filtrat zeigte eine hohe Aktivität; die NaCl-Waschflüssigkeit hatte keine Aktivität.

Die Reaktion oxydierter Glucoseoxydase mit p-Aminosty-rol ergab eine aktive Enzym-Polymer-Verbindung. Es wird angenommen, dass das Enzym an die Polymere über eine Imi-nobindung gebunden ist. Wenn jedoch die aminogruppenhaltige Substanz ein Hydrazid ist, stellt die Bindung wahrschein-

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lieh eine Hydrazonbindung dar. Die Beladung des Proteins (mg Enzym pro g Enzym-Polymer-Verbindung) mit dem p-Amino-styrol beträgt 5 bis 8 mg. Die Aktivität des immobilisierten Enzyms entspricht derjenigen des nativen und oxydierten Enzyms, siehe Tabelle I unten. Es ist wahrscheinlich, dass dies auf die Immobilisierung des Enzyms über die katalytisch nicht erforderlichen Kohlenhydratreste zurückzuführen ist, da im Enzym keine oxydierten Aminosäurereste festgestellt werden konnten.

Die Endverbindung wurde 6 Wochen in einem 100-mM-Phosphatpuffer von pH 6,31 aufbewahrt. Die Verbindung behielt dabei ihre Aktivität und der Puffer blieb inaktiv, was beweist, dass keine Desorption eingetreten ist.

Tabelle II zeigt die thermische Stabilität der Glucoseoxydase. Es geht aus ihr hervor, dass die nativen und oxydierten Enzyme ähnliche Stabilitäten haben, wobei das oxydierte Enzym etwas stabiler ist, während die wasserunlösliche Endverbindung bedeutend erhöhte Stabilität zeigt. Andere aminogruppenhaltige Polymere wie Aminoäthylcellulose, Carboxy-methylcellulosehydrazid, Biogel P-2-Hydrazid und Aminose-pharose, wurden ebenfalls zur Immobilisierung oxydierter Glucoseoxydase verwendet; siehe Tabelle III bezüglich der Resultate.

Die Enzym-Polymer-Verbindungen wurden bei 60 °C auf Wärmestabilität in Form einer wässrigen Suspension bzw. Lösung (natives Enzym) in einem Natriumacetatpuffer bei pH 5,6 untersucht. Die Konzentration an nativem und oxydiertem Enzym wurde auf 0,4 mg/ml eingestellt. Die Konzentration der Endverbindung betrug ca. 0,75 mg/ml.

Tabelle I

Spezifische Aktivitäten von Glucoseoxydasen

Glucoseoxydase Spezifische Aktivitäten

(Einheiten/mg Protein)

Native 91,9 (a)

Oxydierte 92,5 (a)

An Poly-p-aminostyrol gebundene 93,1 (b)

(a) Bezogen auf das Protein, welches durch anaerobe Spektraltitration mit Glucose bestimmt wurde.

(b) Bezogen auf Protein, welches durch Aminosäureanalyse bestimmt wurde. Die Proteinbeladung betrug 5,87 mg Enzym/g an Enzym-Polymer-Verbindung

Tabelle II Thermische Stabilität Relative Aktivität von Glucoseoxydasen (Prozent)

Zeit (Stunden)

Native

Oxydierte

Poly-p-

Aminostyrolverbindung

0

100

0,25

63,4

76,0

76,8

0,50

47,1

59,1

60,0

0,75

36,8

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24,6

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2,7

24,3

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12,7

Tabelle III

Thermische Stabilität von Glucoseoxydase, gebunden an Bio-Gel P-2 Hydrazid

Zeit (Stunden)

Relative Aktivität

(Prozent)

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96,7

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78,9

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74,0

27,2

53,0

12,1

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5,4

92,0

4,4

Thermische Stabilität von Glucoseoxydase, gebunden an

Amino-Sepharose

Zeit (Stunden)

Relative Aktivität

(Prozent)

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100

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85,2

1,0

93,8

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76,7

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85,0

2,5

86,1

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Beispiel 2

Bindung von oxydierter Glucoseoxydase an Aminoäthyl (AE)-Cellulose und Chromatographie

Auf eine Säule aus AE-Cellulose (Bio-Rad Cellex-AE, Austauschkapazität 0,25 mg/g) mit einem Durchmesser von 0,9 cm und einer Länge von 12,5 cm, die zuvor mit 100 ml 5 M NaCl-50 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,93, und danach mit 100 ml 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,94 gewaschen worden war, und zwar mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 40 ml/h mittels einer Präzisionsdosierpumpe, wurden 1,0 ml nativer oder oxydierter Glucoseoxydase aufgebracht. Es wurden Fraktionen von einem ml abgenommen und deren Absorption bei 280 nm verfolgt. Nach Durchgang von 30 ml wurde der Puffer gewechselt und anstelle des 50 mM Natriumacetats mit pH 4,93 nacheinander 1 M NaCl-50 mM Acetat, pH 4,94,2,5 M Na Cl-50 mM Acetat, pH 4,94 bis 5 M NaCl-50 mM Acetat, pH 4,94 verwendet. Nach Eluierung mit dem 5 M NaCl-Puffer wurde die Säule mit 50 mM Acetatpuffer vom pH 4,93 gewaschen. Getrennte, jedoch gleiche Säulen wurden für die native und oxydierte Glucoseoxydase verwendet. Am Ende der Eluierung wurde die Aktivität in beiden AE-Cellulosesäulen gemessen und festgestellt, dass eine Aktivität sowohl oben als auch unten an der Kolonne zu finden war. Die Resultate sind in Tabelle IV angegeben. Das oxydierte Enzym lässt sich bei der Eluierung nur in geringeren Mengen wiedergewinnen, was zeigt, dass sich eine wasserunlösliche Enzym-Aminopolymer-Verbindung gebildet hat.

Die Verbindung aus oxydiertem Enzym und Aminopolymer wurde auf Aktivität untersucht, und es zeigte sich, dass sie gegenüber dem nativen Enzym eine erhöhte Aktivität hatte.

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Tabelle IV

Chromatographie und Bindung von nativer und oxydierter Glucoseoxydase an AE-Cellulose

Native Oxydierte

Glucoseoxydase Glucoseoxydase mg an verwendetem Protein mg an wiedergewonnenem Protein (löslich) % Wiedergewinnung An AE-Cellulose nicht wiedergewonnenes Protein, mg

2,94 2,54

2,67 0,84

86,4% 31,5%

0,40 (Differenz) 1,83 (durch Differenz

Beispiel 3

Bindung oxydierter Glucoseoxydase an Carboxymethyl-cellulose (CMC)-Hydrazid 20

Oxydierte Glucoseoxydase wurde an das Hydrazid von Carboxymethylcellulose (Enzite, CMC-Hydrazid) der Miles Laboratories, Elkhardt, Indiana, auf ähnliche Weise wie bei Polyaminostyrol gebunden. Die Bindungsbedingungen waren die folgenden: 250 mg Enzite und 10,2 mg oxydierte Gluco- 25 seoxydase wurden in 10 ml eines wässrigen Acetatpuffers bei einem pH von 5,06 18 Stunden bei 5 °C zusammengebracht.

Beim Waschen der Enzym-Polymer-Verbindung traten Schwierigkeiten aufgrund von Klumpenbildung auf, welche beim Blindversuch (Glucoseoxydase und CMC-Hydrazid) nicht beobachtet wurden. Die Verbindung wurde mit 130 ml 50 mM Natriumacetat bei einem pH von 4,94 und mit 600 ml 1 M NaCl in 50 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,8, gewaschen, bis das Filtrat keine Aktivität mehr zeigte, etwa 150 ml. Der Rückstand war aktiv und wurde im Puffer bei 5 °C aufbewahrt.

Der Vergleichsfeststoff, der sich ähnlich wie Polyaminostyrol verhielt, besass ebenfalls nur eine geringe Aktivität.

Beispiel 4

Bindung von Glucoseoxydase an das Hydrazid des Bio-gel P-2

Die Bindung von oxydierter Glucoseoxydase an das Hydrazid des Bio-Gel P-2 (Teilchengrösse 0,075 bis 0,15 mm) wurde in 50 mM Natriumacetat, pH 5,51,19 Stunden bei 5 °C ausgeführt. Ein entsprechender Blindversuch mit nativer Glucoseoxydase wurde ebenfalls ausgeführt. Man wusch die Endprodukte mit 50 mM Natriumacetatpuffer vom pH 5,61 M NaCl-50 mM Natriumacetat vom pH 5,8 und 2,0 M NaCl-50 mM Acetat vom pH 5,1. In Gegensatz zur oxydierten Glucoseoxydase konnte die gesamte Aktivität von dem Gemisch aus Hydrazid und nativer Glucoseoxydase durch die 2 M NaCl-Lösung herausgewaschen werden, was auf ein nur adsorbiertes Enzym hindeutet.

G

Claims

618466 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Immobilisierung eines Glycoenzyms, dadurch gekennzeichnet, dass man den Kohlenhydratbestand-teil des Glycoenzyms bei Bedingungen oxydiert, unter denen mindestens eine Carbonylgruppe oder Acetalgruppe gebildet wird, und dass man dieses oxydierte Glycoenzym mit einem aminogruppenhaltigen Stoff unter Bildung einer wasserunlöslichen Verbindung aus Glycoenzym und aminogruppenhaltigem Stoff umsetzt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Glycoenzym mit einem perjodathaltigen Reagenz bei Bedingungen umsetzt, bei denen der Kohlenhydrat-Bestandteil des Enzyms unter Bildung mindestens einer Carbonylgruppe oder Acetalgruppe oxydiert wird, dass man das oxydierte Glycoenzym vom perjodathaltigen Reagenz abtrennt und das oxydierte Glycoenzym mit einem wasserunlöslichen aminogruppenhaltigen Polymer bei Bedingungen umsetzt, unter denen sich eine wasserunlösliche Verbindung aus Enzym und Polymer bildet

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Glycoenzym Glucoseoxydase ist

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserunlösliche Polymer Poly-p-aminostyrol ist

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man das Perjodat mit dem Glycoenzym in wässriger Lösung bei einem pH zwischen 2,5 und 7,5 umsetzt

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Perjodat Perjodsäure oder Natriumperjodat verwendet

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzungstemperatur zwischen 5 und 45 °C liegt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Glycoenzym mit einem wasserunlöslichen Polymer über eine Hydrazonbindung gebunden wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Glucoseoxydase ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet dass man als aminogruppenhaltiges Polymer ein Polyacryl-amidderivat verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer ein Derivat von Carboxymethylcellulose ist.