DE2025624C2 - 5'-0-Ester von ara-Cytidin und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

worin R, einen Rest der Formeln

1-(J?-D-Arabinofuranosyl)-Cytosin, auch als ara-Cytidin, Cytarabin, Cytosinarabinosid bezeichnet, ist seit einiger Zeit als wirksames Mittel zur Bekämpfung des Wachstums bestimmter Krebsarten, insbesondere der Leukämie, bekannt Seine Verwendung wird jedoch dadurch behindert, daß es wegen der schnellen Desaminierung der Verbindung zu dem unwirksamen Uracilarabinosid schwierig ist, eine wirksame Konzentration der Verbindung in den zu behandelnden Zellen herzustellen und aufrechtzuerhalten.

Die vorliegende Erfindung betrifft 5'-O-Ester des ara-Cytidins der allgemeinen Formel I

CH₃(CH₂U- CH₃(CHj)₁₄-

CH₃(C H₂)₁₆—

25 NH₂

bedeutet, sowie deren pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze.

2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise 5'-trityl-ara-cytidin mit einem /^,jS-Trihalogcnäthoxycarbonylhalogenid der allgemeinen Formel

CX]CH₂OCX²

worin X¹ Chlor oder Brom und X² Chlor, Brom oder ]od bedeuten, umsetzt, die Tritylgruppe durch Behandlung in 80%iger Essigsäure abspaltet, die geschützte Verbindung mit einem als Acylierungsmittel geeigneten Derivat einer Carbonsäure der allgemeinen Formel RiCOOH, in der Ri die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, umsetzt, die /J,j3,j?-Trihalogenäthoxycarbonylgruppe anschließend entfernt und den erhaltenen 5'-O-Ester gegebenenfalls mit einer pharmazeutisch verträglichen, starken Mineral- oder organischen Säure umsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acylierungsmittel ein Carbonsäurechlorid verwendet.

4. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise in einem inerten Lösungsmittel die protonierte Form des ara-Cytidins mit einem Chlorid oder einem Anhydrid einer

R₁COCH₂ _

l/N

I^ hoN

OH

worin R₁ einen Rest der Formeln

CH₃(CHj)₁₀- CH₃(CHj)₁₄

CH₃(CH₂),,-

oder

bedeutet, sowie deren pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze sowie Verfahren zu deren Herstellung.

Zu den erfindungsgemäßen Verbindungen gehören auch die Salze der 5'-0-Derivate mit pharmazeutisch verträglichen Mineralsäuren oder organischen Säuren mit einem pK-Wert von etwa 2 oder darunter.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen bei der Verabreichung die für ara-Cytidin charakteristischen Eigenschaften, jedoch eine erheblich längere Wirkungsdauer als ara-Cytidin. Dieser Depoteffekt ist offenbar auf die verzögerte Freisetzung von ara-Cytidin über längere Zeiträume nach der Verabreichung zurückzuführen.

Durch dsn Depoteffekt der neuen Verbindungen werden umständliche Dosierungsvorrschriften und Vorrichtungen, wie Tropfeninfusionen überflüssig.

Der folgende Versuch zeigt die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen gegenüber L-1210-Leukämie bei Mäusen bei einmaliger Verabreichung dieser Verbindungen in Einzeldosen im Vergleich zu ara-Cytidin.

Den als Versuchstiere verwendeten Mäusen wurden am Tag 0 L-1210-Leukämie-Zellen in den angegebenen Konzentrationen in einem Volumen von 0,2 ml steriler Kochsalzlösung inokuliert

Die zu untersuchenden Verbindungen wurden in einem sterilen Vehikel gelöst oder suspendiert und intraperitoneal in einem Volumen von 0,2 ml injiziert

Ihre Wirksamkeit wird durch die bei den behandelten Tieren gegenüber den Kontrolltieren erzielte Vergrößerung der Lebensspanne, ILS, ausgedrückt, wobei der ILS-Wert (in %) aus dem Verhältnis der mittleren Oberlebenszeit der behandelten Tiere (T) zu der der Kontrolltiere (C) wie folgt berechnet wird:

% ILS = (-=-· 1001-100.

Die bei den Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt

Tabelle

Wirksamkeit gegenüber L 1210-Leukämie bei Mäusen bei i. p.-Verabreichung in Einzeldosen

Verbindung	Konz. d. Tumorzellen pro Maus	Dosis	Mittlere Überlebenszeit Versuchstier Kontrolltier	(C)	Verhältnis T/C,	Vergrößerung der Lebe&s- spanne (ILS),
		mg/kg	(T)	6,5 7,0	%	%
5'-O-Benzoyl-ara- cytidin	106	200 150	18,5 19,0	7,0	285 271	185 • 171
		100	17,0	8,5 6,5	243	143
5'-O-Palmityl-ara- cytidin	105 106	200 150	18,5 23,0	7,0	218 354	118 254
	106	100	15,5	6,5	222	122
5'-O-(p-Anisoyl)-ara- cytidin	106	200 150	20,5		316	216
		100		8,5
5'-O-Lauroyl-ara- cytidin	105	200 150	>22	8,5	259	>159
	105	100	19	7,0	224	124
5'-O-Stearyl-ara- cytidin	106	200 150	20 15,5	7,0	308 222	208 122
		100	15,5	7	222	122
ara-Cytidin	106	200	7,5	107	7

Wie die Tabelle zeigt, ist ara-Cytidin bei einmaliger Verabreichung einer Einzeldosis wirkungslos; seine Wirksamkeit zeigt sich erst nach mehrmaliger Verabreichung.

Um ara-Cytidin erfindungsgemäß nur in 5'-O-Stellung zu acylieren, muß die gleichzeitige Acylierung der Aminogruppe in 4-Stellung verhindert werden. Dies erfolgt, indem man zunächst die Aminogruppe auf entsprechende Weise schützt. Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt der Schutz dadurch, daß ma;i ara-Cytidin mit einem Trihalogenäthoxycarbonylhalogenid der Formel

CXjCH₂OCX²

Il ο

in welcher X¹ Chlor oder Brom und X² ein Chlor, Brom oder )od bedeutet, umsetzt. Beispiele für derartige Reagentien sind Trichloräthoxycarbonylchlorid und Tribromäthoxycarbonylchlorid (J. Org. Chem. 33, 3589-93(1968)).

Wird ara-Cytidin mit der entsprechenden molaren Menge (etwa 2 Mol) Trihalogenäthoxycarbonylhalogenid umgesetzt, so erhält man das Zwischenprodukt N⁴-5'-0-Bis-trihalogenäthoxycarbonyl-ara-cytidin. Die Umsetzung kann in Pyridin erfolgen, wobei das Produkt durch Abdestillieren des Lösungsmittels erhalten wird. Die Reaktionsbedingungen zur Entfernung der Schutzgruppe vom Arabinoserest gemäß Beispiel 1 können dann angewandt werden. Die in Tetrahydrofuran gelöste Verbindung wird mit einem gleichen Volumen etwa 0,3 n-Natriumhydroxydlösung behandelt, bis zur Ausbildung des Gleichgewichts bei Raumtemperatur stehengelassen und dann mit Essigsäure neutralisiert. Das Produkt N⁴-Trihalogenäthoxycarbonyl-ara-cytidin kann durch Kristallisation gewonnen und durch Umkristallisieren aus Aceton gereinigt werden.

Durch Acylierung der 5'-O-Stellung des Zwischenprodukts unter Verwendung von z. B. Halogeniden oder Anhydriden von Carbonsäure der allgemeinen Formel

RiCOOH, worin Ri die oben genannte Bedeutung besitzt, als Acylierungsmittel erhält man die mit Aminoschutzgruppe versehenen Derivate der erfindungsgemäßen 5'-O-Ester von ara-Cytidin. Die Schutzgruppe kann durch Behandeln mit metallischem Zink in Methanollösung, durch Behandeln mit metallischem

NH₂

Zink, beispielsweise Zinkstaub, und Essigsäure, beispielsweise in 80-90%iger Essigsäurelösung, oder durch Behandeln mit Zinkchlorid oder Zinkacetat in Methanol entfernt werden.

Das erfindungsgemäße Verfaliren wird durch folgende Reaktionsgleichungen wiedergegeben:

OH

Base

Hydrolyse

Zink,Essigsäure

CX₃CH₂OCCl (etwa 2 Mol) _{( CXjC}H₂O-C-O-CH_{2 Λ} Pyridin .^O

OH

- HOCH₂

OH

Acylierungstiiittel

R₁-C-OCH

OH

In dem obigen Schema können in verschiedenen Stufen Abwandlungen vorgenommen werden. Beispielsweise kann das N^Trihalogenathoxycarbonyl-ara-cytidin der allgemeinen Formel O

C — O —CH₂CX]
NH

HOCH₂

OH

auch durch Umsetzung von 5'-0-Trity!-ara-cytidin (US-PS 33 38 882, Beispiel 1) mit einem Trihalogenäthoxycarbonylhalogenid hergestellt werden. Die Reaktion wird in trockenem Pyridin bei niedrigen Temperaturen von etwa -5 bis +5°C, vorzugsweise bei etwa 3°C, durchgeführt. Beträgt das Moiverhältnis von 5'-O-Trityl-ara-cytidin zu Trihalogenäthoxycarbonylhalogenid

NH₂

etwa 1:1, so erhält man als Reaktionsprodukt

N⁴-Triha!ogenäthoxycarbonyl-5'-O-trityl-ara-cytidin.
Wird ein Überschuß an Trihalogenäthoxycarbonylhalogenid verwendet, d. h. ein Molverhältnis von weniger als

1:3 und vorzugsweise von etwa 1 :4 bis 1 : 5, so besteht das Reaktionsprodukt aus N⁴-2',3'-O tris-Trihalogenäthoxycarbonyl-S'-O-trityl-ara-cytidin. Das Lösungsmittel wird entfernt und der Rückstand wird in ein chloriertes Kohlenwasserstofflösungsmittel, beispielsweise Methylenchlorid, extrahiert, dann wird mit Wasser gewaschen. Besteht das Reaktionsprodukt aus der Tris-trihalogenäthoxycarbonylverbindung, so kann die Schutzgruppe in 2'-O- und 3'-O-Stellung gegebenenfalls an dieser Stelle entfernt werden, und zwar durch Hydrolyse mit einer Base, z.B. 0,15 n-Natriumhydroxyd in einem Tetrahydrofuran-Wasser-Gemisch (50:50), wobei man die N-geschützte 5'-O-Tritylverbindung erhält, die isoliert wird.

Im anderen Fall wird aus dem Extrakt der Chlorkohlenwasserstoff abgedampft. Falls erwünscht, kann die mit einer Trihalogenäthoxycarbonyl-Schutzgruppc versehene 5'-O-Tritylverbindung aus geeigneten Lösungsmitteln, z. B. MethylenchLorid oder Aceton kristallisiert werden. Zwecks Entfernung der 5'-Tritylgruppe wird, wie in Beispiel 2 erläutert, mit 80%iger Essigsäure behandelt, wobei man das Zwischenprodukt N^-Trihalogenäthoxycarbonyl-ara-cytidin erhält.

Das Zwischenprodukt kann somit z. B. gemäß folgender Reaktion erhalten werden:

C-O-CH₂

Il

CX₃CH₂OCCl (etwa 1,1 Mol) Pyridin

80% Essigsäure

OH

ίο

Das N⁴-2',3'-0-tris-Trihalogenäthoxycarbonyl-5'-0-trityl-ara-cytidin kann auch nach folgendem Reaktionsschema in die erfindungsgemäßen 5'-O-Ester des ara-Cytidins überführt werden:

NH₂

N-

HO

OH

NHCOCH₂CCl₃

Übersch.
O

CCI₃CH₂OCCl
Pyridin

N-

-C-O-CH₂

C-OCH₂CCl₃ OCOCH₂CCl₃

Il ο

NHCOCH₂CCl₃

ft

N'

80% Essigsäure

HOCH

C-OCH₂CCl₃ OC-OCH₃CCl₃

Il ο

Acylierungsmittel

Zn, Essigsäure
Zn, Methanol, A

R₁-C-OCH₂

Die primäre Aminogruppe des ara-Cytidins kann auch durch Protonierung vor einer gleichzeitigen Acylierung geschützt werden. Dies ergibt sich beispielsweise, wenn man ara-Cytidin mit dem Acylierungsmittel. etwa einem Acylhalogenid oder Acylanhydrid in Gegenwart einer ausreichend hohen Wasserstoffionen-Konzentration umsetzt, so daß die primäre Aminogruppe des ara-Cytidins geschützt ist. Es wurde gefunden, daß die Aminogruppe dann den konventionellen Acylierungsverfahren widersteht, d. h. es wird einfach das Proton als blockierende Gruppe verwendet. Als protonierte Form ist ein Säuresalz, beispielsweise das Hydrochlorid des ara-Cytidins geeignet.

Als Acylierungsmittel eignen sich die Halogenide, insbesondere die Chloride und die Anhydride der Säure R₁COOH.

Ferner kann selbstverständlich die Säure RiCOOH in ein aktives Acylierungsmittel umgewandelt werden, indem man sie zunächst mit p-Toluolsulfonylchlorid umsetzt und dieses Reaktionsprodukt anstelle von Anhydrid oder Chlorid verwendet (vgl. J. Am. Chem. Soc 77,6214 (1955)).

Analog kann die Säure R₁COOH durch Umsetzung mit (CF₃CO)₂O, das nach der Methode von Chem. Rev. 55, 787 (1955) als Acylierungsmittel dient, in ein Acylierungsmittel überführt werden.

Ein weiteres geeignetes Veresterungsverfahren besteht in der direkten Verwendung der Säure RiCOOH, wobei die Reaktion nach den Angaben von Compt Rend. 252,896 (1961), Ibid. 255,945 (1962), J. Org. Chem. 27, 4075 (1962) und Tetrahedron 21. 3531 (1965) in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid durchgeführt wird.

Die Wasserlöslichkeit der erfindungsgemäßen 5'-O-Derivate kann durch Herstellung der Salze mit pharmazeutisch verträglichen Säuren, die einen pK-Wert von etwa 2 oder weniger aufweisen, verbessert und die pharmazeutische Brauchbarkeit

damit gesteigert werden.

Diese Säuren gehören zu den starken Mineralsäuren oder organischen Säuren: sie eignen sich besonders, da ara-Cytidin und dessen 5'-O-Derivate schwache Basen darstellen. Beispiele für geeignete starke Säuren sind

so Salzsäure, Schwefelsäure. Phosphorsäure. Glutarsäure. Glutaminsäure, Weinsäure. Trihydroxybenzoesäurc. Ameisensaure und dergleichen. Die Salze werden dadurch gebildet, daß man das gewünschte 5'-O-Derivat in einem Medium, wie beispielsweise Methanol,

suspendiert und ein Äquivalent der entsprechenden Säure zusetzt Dabei erhält man eine Lösung des Salzes, aus der dieses durch Zusatz eines geeigneten Mediums, beispielsweise Diäthyläther, abgetrennt werden kann. Die Salze können durch Umkristallisieren aus Lösu:igs-

mittelgemischen, z. B. Methanoläther, umkristallisiert werden. Die Hydrohalogenide können ferner dadurch erhalten werden, daß man einfach das bei der Reaktion mit RiCOCl resultierende Reaktionsgemisch vor der Isolierung des Acylierungsproduktes nicht neutralisiert.

Beispiel 1

4,18 g (lOMillimol) N⁴-Trichloräthoxycarbonyl-aracytidin wurden in 50 ml frisch destilliertem wasserfrei-

em Pyridin gelöst. Der Lösung wurden bei 25° C 1,92 g (11 Millimol) Benzoylchlorid in 10 ml Pyridin zugetropft. Die Dünnschichtchromatographie (Silicagel; Cyclohexan-Äthylacetat-Äthanol 5:3:1) zeigte an, daß die Reaktion nach 48 Stunden nicht wesentlich fortgeschritten war. Daher wurden weitere 1,92 g Benzoylchlorid in 10 ml Pyriditi zugesetzt und nochmals 24 Stunden lang stehengelassen. Dann zeigte das Dünnschichtchromatogramm, daß allenfalls wenig Ausgangsmaterial zurückgeblieben war. Das Reaktionsgemisch wurde in 60 ml Wasser gegossen und das Gemisch wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft. Die letzten Pyridinspuren wurden durch mehrmalige Co-Destillation mit Toluol im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Chloroform gelöst, mit Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Dann wurde das Chloroform im Vakuum abdestilliert und der Rückstand wurde aus Aceton kristallisiert, wobei man 5'-0-Benzoyl-N"-trichloräthoxycarbonylara-cytidin erhielt.

2.2 g (3.0 Millimol) 5'-0-Benzol-N⁴-trichloräthoxycarbonyl-ara-cytidin wurden mit 25 ml 90%iger (Volumen/ Volumen) Essigsäure und 2,0 g (31 Millimol) Zinkstaub behandelt; das Gemisch wurde ca. 18 Stunden lang bei 25°C gerührt. Dann wurde filtriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde an 200 g Silicagel Chromatographien, wobei mit Cyclohexan-Äthylacetat-Äthanol (5:3:1) eluiert wurde. Die ersten 40 100 ml-Fraktionen enthielten kein gewünschtes Produkt, so daß auf das Lösungsmittelsystem Methyläthylketon-Aceton-Wasser (72 : 20 :8) übergegangen wurde. Die Fraktionen 1 — 18 wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Beim Kristallisieren des Rückstands aus Methanol erhielt man 5'-O-Benzoyl-ara-cytidin als Produkt, Schmelzpunkt 199,5-201°C als Hydrat.

Das als Ausgangsmaterial eingesetzte Trichloräthoxycarbonyl-ara-cytidin wurde in folgender Weise hergestellt:

193.69 g(0.4 Mol) 5'-O-Trityl-ara-cytidin wurden in 4 1 frisch destilliertem wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wurde auf 3° C abgekühlt und mit 84,4 g (0,4 Mol) Trichloräthoxycarbonylchlorid behandelt. Dann wurde 4 Stunden lang bei 3° C gerührt, danach ließ man das Gemisch sich im Verlauf von ca. 18 Stunden auf 25° C erwärmen. Das Pyridin wurde im Vakuum bei 40°C abdestilliert und der gummiartige Rückstand wurde mit 1 1 Methylenchlorid behandelt. Feststoff in einer Menge von 23,7 g wurde abfiltriert. Durch Dünnschichtchromatographie wurde festgestellt, daß es sich bei dem Feststoff um Ausgangmaterial handelte. Die Methyienchioridlösung wurde 3 χ mit ö,i n-Saizsäure und 1 χ mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wurde das Methylenchlorid langsam abgedampft, wobei sich Kristalle ausschieden. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit kaltem Methylenchlorid gewaschen und getrocknet, wobei man 64,5 g des gewünschten Produktes erhielt. Dünnschichtchromatographische Untersuchungen der Methylenchlorid-Mutterlaugen ergaben Flecken, die rascher wanderten als die dem gewünschten Produkt entsprechenden Flecken, und die vermutlich den in 2'- und 3'-Stellung acylierten Verbindungen entsprachen. Diese Verbindungen wurden hydroiisiert, indem man den Rückstand der Mutterlaugen mit 11 Tetrahydrofuran und 11 03 n-Natriumhydroxydlösung behandelte. Nach 1,5 Stunden waren alle rascher wandernden Flecken des Dünnschichtchromatogramms verschwunden. Das Reaktionsgemisch wurde mit konzentrierter Salzsäure auf pH 6,5 angesäuert. Das Tetrahydrofuran wurde im Vakuum abgedampft und der wäßrige Rückstand wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Das Methylenchlorid wurde gewaschen und getrocknet und abgedampft. Wiederum bildeten sich Kristalle, die gesammelt und gewaschen wurden, wobei man 42,5 g Produkt erhielt. Die Mutterlaugen wurden weiter eingeengt und ergaben nochmals 45,5 g eines Materials,

ίο das, wie aus dem Dünnschichtchromatogramm zu ersehen, aus einem Gemisch aus Produkt und Ausgangsmaterial im Verhältnis ca. 50 :50 bestand. Die 45,5 g wurden mit 500 ml Aceton erwärmt und Ungelöstes wurde abfiltriert. Dieses Produkt erwies sich als Trityl-ara-cytidin. Die Aceton-Mutterlaugen wurden zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde unter langsamem Einengen aus Methylenchlorid kristallisiert; dabei wurden 19 g N⁴-Trichloräthoxycarbonyl-5'-0-trityl-ara-cytidin erhalten. Die Ausbeute betrug somit insgesamt 126 g (48% der Theorie). Durch zweimaliges Umkristallisieren aus Methylenchlorid wurde eine analysenreine Probe hergestellt.

Analyse

Ber. für C₃₁ H₂₈Cl₃N₃O₇:

C: 56,30, H: 4,27, Cl: 16,11, N: 6,36; gefunden:

C: 56,46, H: 4,30, Cl: 15,25, N: 7,26.

Ultraviolett-Spektrum[A*'°^H ιτιμ(ε · ΙΟ"³)]: 232 (11,8), 296 (5.38).

Infrarot-Spektrum (γ):

3380,3200,3120 (Sch), 1765,1650,1620,1570, 1505,1330,1245,1200,1100(m),1085,1065, 810,785,770,750,740,715 und 7.05.

116,2 g (0,175MoI) N⁴-Trichloräthoxycarbonyl-5'-0-trityl-ara-cytidin wurden 48 Stunden lang bei 25° C mit 1 1 80%iger Essigsäure behandelt. Während dieser Zeit schied sich aus dem Gemisch kristallines, tritylhaltiges Material ab, das abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft und letzte Säurespuren wurden durch Vakuumdestillation unter Zusatz mehrerer Äthanolportionen entfernt. Der glasartige Rückstand wurde aus Äthanol kristallisiert, wobei man 62,5 g Produkt erhielt. Dieses Material enthielt gemäß NMR-Analyse 10-15% Triphenylmethylcarbinol und/ oder dessen Äthyläther. Das N⁴-Trichloräthoxycarbonyl-ara-cytidin wurde chromatographisch an Silicagel gereinigt, wobei mit Cyclohexan-Äthylacetat-Äthanol (5:3:1) eluiert und anschließend durch Kristallisation aus Methylenchlorid gereinigt wurde.

Analyse

Ber. für C₁₂H₁₄Cl₃N₃O₇:

C:34,43, H:3,37, Cl:25,41, N: 10,04; gefunden:

C: 34,59, H: 3,61, Cl: 24,82, N: 9,99.

Infrarot-Spektrum (A cm-¹):

3400,1765,1640,1575,1510,1330,1275,1235, 1195,1120,1105,1070,1055,1035,810,745. Ultraviolett-Spektrum[AJ°^H (ε ■ 10"³)]: 212 (21,8), 239 (14,5), 269 (8,3).

Beispiel 2

65 g 5'-O-Benzoyl-ara-cytidin wurden mit Hilfe von 19 ml konzentrierter Salzsäure in 250 ml Methanol gelöst Dann wurden 500 ml Äther bis zur Trübung zugegeben. Das Hydrochlorid kristallisierte rasch aus.

Es wurdegesamnielt mit Methanol-Äther (1 :2) und dann mit Äther gewaschen und getrocknet wobei man 60,5 g 5'-0-Beri2oyl-ara-cyti-^Jiin-Hydrochlorid vom Schmelzpunkt 204-205° C (Zersetzung) erhielt Den Mutterlaugen wurde nochmals Äther bis zur beginnenden Trübung zugesetzt Man erhielt eine zweite Portion an Produkt die nach Waschen mit Äther und Trocknen 6,5 g wog (Gesamtausbeute 67 g, 98,5%), Schmelzpunkt 200-201⁰C (Zersetzung).

Beispiel 3

4,18 g (lOMillimol) N⁴-Trichloräthoxycarbonyl-aracytidin wurden in 50 ml wasserfreiem frisch destilliertem Pyridin gelöst Dann wurden der Lösung bei Raumtemperatur 3,0 g (11 Millimol) Palmitylchlorid, gelöst in 10 ml Methylenchlorid, zugetropft Nach 18stündigem Stehen bei 25°C wurde das Reaktionsgemisch in 60 ml Wasser gegossen und das Lösungsmittel wurde im Vakuum abdestilliert bis etwa 10 ml zurückblieben. Ein halbfestes Produkt schied sich aus, das durch Dekantieren und anschließendes Waschen mit Wasser aufgearbeitet wurde. Dieses Produkt kristallisierte au«. Methanol, wobei man 5,5 g eines Stoffes erhielt, von dem auf Grund seiner Folgereaktion angenommen wurde, daß es sich um 5'-O-Palmityl-N⁴-trichloräthoxycarbonyl-ara-cytidin handelte. Das Material wurde in 100 ml 90%iger Essigsäure gelöst und mit 10 g Zinkstaub behandelt. Dann wurde 6 Stunden lang bei 25° C gerührt. Restliches Zink wurde abfiltriert und dann wurde das Filtrat im Vakuum zur Trockene eingedampft. Die letzten Essigsäurespuren wurden durch wiederholte Co-Destillation mit Äthanol im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde an 100 g Silicagel Chromatographien, wobei Packung und Eluierung mit Cyclohexan-Äthylacetat-Äthanol (5:3:1) erfolgten. Nach Abnahme von 10 Fraktionen von jeweils 100 ml wurde das Lösungsmittel auf Methyläthylketon-Aceton-Wasser (72 : 20 :8) umgestellt und wurden nochmals 10 Portionen von jeweils 100 ml aufgefangen. Die Fraktionen 14 — 20 wurden vereinigt und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde aus Methanol kristallisiert, wobei man 870 mg 5'-O-Palmityl-ara-cytidin vom Schmelzpunkt 139 —141⁰C erhielt. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Methanol erhielt man das analysenreine Material vom Schmelzpunkt 143-146⁰C.

Analyse

BeHfUrC₂SH₄₃N₃O₆:

C: 62,34, H: 9,00, N: 8,72;
gefunden:

C: 62,86, H: 9,19, N: 8,47, 8,72.

Ultraviolett-Spektrum:[A*'°n πιμ(ε · 10-3)]:

273(8,30).
Infrarot-Spektrum (γ cm-'):

3430,3330,3280 (Sch), 1740,1665 (Sch), 1635,

1600,1535,1495,1485,1290,1255,1195,

1175,1110,1095,860,790,785,780.

Das NMR-Spektrum bestätigte die zugeordnete Struktur.

kristalline S'-O-Paimityl-ara-cytidin-Hydrochlorid wurde gesammelt mit Äther gewaschen und getrocknet Es wurde in einer Ausbeute von 53,8 g (91%) erhalten. Schmelzpunkt 180— 182°C Ersetzte man in obigem Verfahren die Salzsäure durch Schwefelsäure, Phosphorsäure, Glutaminsäure, Dihydroxyweinsäure, Trihydroxybenzoesäure oder Ameisensäure, so erhielt man die entsprechenden Salze.

Beispiei 5

Wiederholte man die Verfahren der Beispiele 2 und 3

unter Verwendung von Stearylchlorid oder Laurylchlorid als Acylierungsmittel, so e;nielt man 5'-O-Stearylara-cytidin, Schmelzpunkt 143-145°C, bzw. 5'-O-Lauryl-ara-cytidin, Schmelzpunkt 144-148° C.

10

20

30

35

Beispiel 6

8,36 g (20 Millimol) N⁴-Trichloräthoxycarbonyl-aracytidin wurden in 50 ml frisch destilliertem, wasserfreiem Pyridin gelöst Der Lösung wurden unter Rühren bei Raumtemperatur 3,75 g (22 Millimol) Anisoylchlorid in 10 ml Methylenchlorir' zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und am nächsten Morgen wurde ein Dünnschichtchromatogramm angefertigt, das noch restliches Ausgangsmaterial anzeigte. Das Gemisch wurde daher in einem Wasserbad 3 Stunden lang auf 50° C erwärmt. Danach blieb das Dünnschichtchromatogramm unverändert. Das Reaktionsgemisch wurde in 30 ml Wasser gegossen und bei 50° C an einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Methylenchlorid gelöst und Imal mit 100 ml gesättigter Bicarbonatlösung, dann Imal mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Methylenchloridlösung wurde danach an 200 g Silicagel absorbiert und mit 20 Fraktionen von jeweils 50 ml aus Cyciohexan, Äthylacetat und 95%igem Äthanol

w (5:3:1) eluiert. Auf Grund der Ergebnisse der dünnschichtchromatographischen Untersuchungen wurden die Fraktionen 10-18 vereinigt und 15 Minuten lang auf dem Dampfbad unter Rückfluß mit 4 g Zinkstaub in 100 ml Methanol gekocht. Das Dünnschichtchromatogramm zeigt an, daß kein Ausgangsmaterial zurückgeblieben war; die Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde an einem Rotationsverdampfer zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde an 200 g Silicagel absorbiert, das mit Methyläthylketon,

5<J Aceton und Wasser getränkt war. Die Eluierung erfolgte mit 20 Fraktionen von jeweils 50 ml des gleichen Lösungsmittelsystems. Auf Grund der Ergebnisse der dünnschichtchromatographischen Untersuchungen wurden die Fraktionen 10—16 vereinigt und aus Methanol umkristallisiert, Ausbeute an 5'-O-(p-Anisoyl)-ara-cytidin 795 mg (Schmelzpunkt 225-227⁰C) (Zersetzung). Nach dem Umkristallisieren aus Methanol schmilzt eine analysenreine Probe bei 225-227° C (Zersetzung).

Analyse

Beispiel 4

55 g (0,114MoI) 5'-O-Palmityl-ara-cytidin wurden in einem Gemisch aus 350 ml Methanol und 10,5 ml konzentrierter Salzsäure gelöst. Die Lösung wurde mit Äther bis zur beginnenden Kristallisation verdünnt, dann weiter mit Äther bis auf 41 verdünnt. Das C: 54,11,
gefunden:
C: 53,95,

H: 5,08, N: 11,14;
H: 4,81, N: 11,09.

Ultraviolett-Spektrum[A£,'°^H,(E
258(14,50); 271 (Sch)(19,20);
278 (Sch) (13,00); 283 (Sch) (4,90).

Die Verschiebung der Haupt-Absorptionsbande geht auf die

CH₃O

C—CHrGruppe

10

15

zurück, wie auch die schwachen Schultern bei 278 und 283. Das UV-Spektrum bestätigt die zugeordnete Struktur.

Infrarot-Spektrum [γ cm-']:
3420.3310, !720.1665.1630,1600,1530.1490,
1275,1250,1170,1100,1035,850,825.790 und 770.

NMR- und Infrarot-Spektrum entsprechen der vorgeschlagenen Struktur.

Beispiel 7

2,80 g (0,01 Mol)ara-Cytidin-Hydrochiorid wurden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und dann mit 3,05 g (0,011 Mol) Palmitylchlorid versetzt. Die Lösung wurde bei Raumtemperatur 7 Stunden lang stehengelassen. Dann wurde das Lösungsmittel im Vakuum (ölpumpe) abgedampft und das resultierende öl wurde mit 70 ml 03 n-Natriumbicarbonatlösung verrührt Der dabei resultierende Feststoff wurde abfiltriert mehrmals mit Wasser gewaschen, trockengepreßt und dann 3mal mit 25 ml Äthylacetat gewaschen und an der Luft getrocknet Dabei erhielt man 242 g 5'-O-PalmityI-aracytidin (52%) vom Schmelzpunkt 135-145° C. Die Dünnschichtchromatographie zeigte in verschiedenen Lösungsmittelsystemen einen einzigen UV-absorbierenden Fleck. Eine Probe wurde für die Analyse einmal aus Methanol umkristallisiert (82% Rückgewinnung). Der Schmelzpunkt dieses Materials betrug 145-148° C.

Analyse

Ber. für C₂₅H₄₃N₃O₆:

C: 62,34, H: 9,00, N: 8.72;
gefunden:

C: 62,65, H: 9,29, N: 8,75.

Die IR- und UV-Absorptionskurven waren mit den Kurven einer authentischen Probe identisch. Das Material war ferner in verschiedenen Lösungsmittelsystemen chromatographisch mit der authentischen Probe identisch.

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1. S'-O-Ester des are-Cytidins der allgemeinen Formel I

   NH,

   (D

   Carbonsäure der allgemeinen Formel RiCOOH, in der Ri die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, a/s Acyüerungsmittel umsetzt

   5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als protonierte Form des ara-Cytidins ara-Cytidin-hydrochlorid verwendet