DE1545760C3

DE1545760C3 - Vincaleukoblastinderivate

Info

Publication number: DE1545760C3
Application number: DE1545760A
Authority: DE
Inventors: William Walter Indianapolis Ind. Hargrove (V.St.A.)
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1964-03-09
Filing date: 1965-03-08
Publication date: 1978-10-05
Also published as: DE1795823C3; FR6668M; DE1795763C3; US3392173A; ES310240A1; FR1449628A; DE1795763A1; BE660843A; CH507970A; DE1795823B2; GB1095833A; DE1545760B2; DE1795823A1; SE330700B; NL6502977A; DE1795763B2; DE1545760A1

Description

worin R die Äthylgruppe, eine Monohalogenalkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen oder die Dichlormethylgruppe ist, und deren Salze mit Säuren.

Andere Salze anorganischer Säure, z. B. Chloride, Bromide, Phosphate und Nitrate, sowie Salze mit organischen Säuren, z. B. die Acetate, Chloracetate, Trichloracetate und Benzoate werden nach einem dem Verfahren zur Herstellung der Sulfate ähnlichen Verfahren hergestellt. Die entsprechende Säure wird dabei in geeigneter Verdünnung anstelle der lproz. wäßrigen Schwefelsäure eingesetzt.

Wenn in der obigen Formel R eine Monohalogenalkylgruppe darstellt, kommen sämtliche Halogene der 7. Hauptgruppe des Periodensystems in Frage, insbesondere Fluor, Chlor und Brom.

Die erfindungsgemäßen Vincaleukoblastinderivate verlängern die Lebenserwartung von Mäusen, die mit dem P-1534-Stamm der Mäuseleukämie infiziert worden sind. Die Tabelle gibt die Ergebnisse von Testversuchen wieder. In Spalte I ist R, in Spalte II der Dosisspiegel und in Spalte III die prozentuale Lebensverlängerung der behandelten Mäuse im Vergleich zu einer Kontrollgruppe von Mäusen angegeben, die lediglich mit dem jeweiligen, für die Injektionen des aktiven Arzneimittels verwendeten pharmazeutischen Träger injiziert worden waren.

Die Erfindung betrifft Vincaleukoblastinderivate der allgemeinen Formel

Ο—CO—R

COOCH₃

Diese Verbindungen besitzen oncolytische Wirksamkeit, z. B. bei Leukämie von Mäusen.

Diese Vincaleukoblastinderivate können dadurch hergestellt werden, daß Vincaleukoblastin (R = CH₃) durch Hydrolyse unter sauren oder basischen Bedingungen in Desacetylvincaleukoblastin umgewandelt und dann acyliert wird, vorzugsweise mit einem Anhydrid der allgemeinen Formel (R-CO)2O, wobei sich ein Gemisch aus mono- und diacyliertem Produkt bildet; dieses läßt sich durch selektive Hydrolyse unter Verwendung einer Suspension aus Kieselsäuregel in feuchtem Methanol in den angestrebten Monoester überführen.

Die erhaltenen Produkte können in ihre Salze mit Säuren überführt werden. Dazu werden sie in einem Gemisch aus Methanol und Wasser gelöst. Zum Beispiel wird lproz. Schwefelsäure bis zum pH-Wert 2 zugegeben, wodurch sich das Sulfat bildet, das abgetrennt und aus einem Gemisch aus Äthanol und Isopropanol oder einem anderen geeigneten Medium umkristallisiert werden kann.

²⁵ Tabelle	Dosis, mg/kg	Prozentuale Lebens verlängerung
Rest R 3«	0,35	127%
ClCH₂-	0,3	37%
Cl₂CH-	0,55	77% + 1 Überlebender
_j5 C₂H₅-	0,35	25-30%
CH₃- (Vincaleukoblastin)

Die beim Krebstest angewendeten Dosen stellen jeweils die höchsten Dosen dar, bei welchen noch keine Toxizität beobachtet wurde. Höhere Dosen sind im allgemeinen toxisch, so daß die Versuchstiere bereits infolge der Drogenverabreichung eingehen statt an den Folgen der Erkrankung.

Zum Vergleich ist in Tabelle I auch die Dosis und die erreichbare Lebensverlängerung für das bekannte Vincaleukoblastin (R = CH₃) angegeben. Man erkennt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen merklich besser wirken.

Die Bedingungen des Versuchstests waren folgende:
10 Mäusen wurde intraperitoneal eine Suspension bösartiger Zellen implantiert; nach 25 Stunden erhielten fünf derselben intraperitoneale Injektionen der Droge, und zwar 10 Tage täglich. Die maximal zu tolerierende Dosis ist gegeben aufgrund einer Vorausbestimmung an Schweizer weißen Mäusen. Der Test war so angelegt, daß die Kontrolltiere etwa 15 Tage lebten, so daß die prozentuale Lebensverlängerung, hervorgerufen durch

bo die verabreichte Droge, sicher ermittelt werden konnte. Wenn das Versuchstier etwa 45 Tage und länger lebte, wurde es als Überlebender eingestuft.

Die erfindungsgemäßen Vincaleukoblastinderivate haben auch Bedeutung als Zwischenprodukte zur Herstellung weiterer oncolytisch wirksamer Vincaleukoblastinderivate.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1
A) Desacetylvincaleukoblastin

a) 8 g der freien Base Vincaleukoblastin wurden in mit gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigtem Methanol bei 0⁰C gelöst. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur etwa 72 Stunden stehengelassen. Die flüchtigen Bestandteile werden durch Eindampfen im Vakuum entfernt, und der erhaltene Rückstand wurde in Wasser gelöst. Die saure wäßrige Lösung wurde durch Zugabe eines Überschusses an 14 n-Ammoniumhydroxid basisch gemacht. Die alkalische Phase wurde mit Methylendichlorid extrahiert, die Methylendichloridphase abgetrennt und das Methylendichlorid durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Der erhaltene Rückstand, der Desacetylvincaleukoblastin enthielt, wurde in Methanol gelöst. Die kristalline freie Base Desacetylvincaleukoblastin wurde durch Zugabe von Wasser zu der warmen methanolischen Lösung bis zum Trübungspunkt und anschließendes Abkühlen der Lösung erhalten.

Ausbeute 5,26 g, das sind 66%. Das NMR-Spektrum des Moduls ist in der Zeichnung I angegeben.

b) 50 g Vincaleukoblastinsulfat wurden mit einem Überschuß an wäßrigen Ammoniak behandelt, wodurch die freie Base Vincaleukoblastin erhalten wurde. Die freie Base wurde in Methylendichloridphase abgetrennt und das Methylendichlorid durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch Zugabe von Benzol und Abdestillieren des azeotropen Wasser-Benzol-Gemisches aus dem erhaltenen Gemisch getrocknet. Der erhaltene Rückstand wurde zu 3 Litern mit gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigtem Methanol bei 0⁰C gegeben. Dieses Gemisch wurde bis zur Auflösung gerührt und sodann über Nacht bei Raumtemperatur belassen. Die Dünnschichtchromatographie eines aliquoten Teils des Reaktionsgemisches zeigte eine nahezu vollständige Umwandlung des Vincaleukoblastins in das gewünschte Desacetylvincaleukoblastin. Die Lösungsmittel wurden aus dem Reaktionsgemisch durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und die erhaltene saure wäßrige Lösung mit 14 n-Ammoniumhydroxyd basisch gemacht. Die organische Base wurde durch Extraktion mit Methylendichlorid abgetrennt. Der Methylendichloridextrakt wurde einmal mit einem gleichen Volumen gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und sodann abgetrennt. Das Methylendichlorid wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt und der Rückstand durch Zugabe von Benzol und Äthanol und Abdestillieren des azeotropen Benzol-Wasser-Äthanol-Gemisches von dem erhaltenen Gemisch getrocknet. Der getrocknete Rückstand wurde dann in einer minimalen Menge heißem Äthanol gelöst und die Kristallisation durch Animpfen eingeleitet. Auf diese Weise wurden 20 g kristallines Desacetylvincaleukoblastin erhalten. Das NMR-Spektrum des Moduls ist in der Zeichnung I angegeben.

c) 20 ecm 85%iges Hydrazinhydrat, 5 g Vincaleukoblastinsulfat, 50 ecm Äthylenglykol und etwa 200 ecm 95%iges Äthanol wurden zusammengegeben. Das Reaktionsgemisch wurde zur Auflösung des Vincaleukoblastinsulfats erwärmt und sodann etwa 16 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Das Äthanol wurde aus dem Reaktionsgemisch durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 6mal mit je etwa 250 ecm Methylendichlorid extrahiert. Die Methylendichloridextrakte wurden kombiniert, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Die Dünnschichtchromatographie eines aliquoten Teils des erhaltenen Rückstandes zeigte, daß er zur Hauptsache aus Desacetylvincaleukoblastin bestand und nur eine geringe Menge Vincaleukoblastin zugegeben war. Die Umkristallisation des Rückstandes aus einem Äthanol-Wasser-Gemisch lieferte 3 g Desacetylvincaleukoblastin.

Das obige Verfahren wurde mit der Abänderung

ίο wiederholt, daß das Äthylenglycol aus dem Reaktionsgemisch fortgelassen wurde. Es wurde eine 80%ige Ausbeute an Desacetylvincaleukoblastin erhalten. Das NMR-Spektrum des Moduls ist in der Zeichnung I angegeben.

d) 1 g Vincaleukoblastin wurde in 300 ecm Methanol gelöst. Nach Zugabe von 150 mg Kaliumcarbonat wurde das Gemisch über Nacht auf Rückflußtemperatur erhitzt. Die organischen Basen wurden nach dem folgenden Verfahren isoliert und gereinigt. Die freie Base Vincaleukoblastin, die in der alkalischen Lösung unlöslich war, sonderte sich ab und wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridphase wurde abgetrennt, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Der Rückstand, der die freie Base Vincaleukoblastin enthielt, wurde in etwa 100 cm³ Methanol gelöst, und die erhaltene Lösung wurde mit gasförmigem Chlorwasserstoff gesättigt. Die saure Lösung wurde etwa 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann etwa 3 Stunden auf Rückflußtemperatur erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde abgekühlt. Es wurde ein Überschuß an 14 n-Ammoniumhydroxid zugegeben, und die erhaltene freie Base wurde mit Methylenchlorid extrahiert. Der Methylenchloridextrakt wurde abgetrennt, und das Lösungsmittel wurde durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Die Dünnschichtchromatographie des Produktes zeigte, daß es zur Hauptsache aus Desacetylvincaleukoblastin bestand. Das Desacetylvincaleukoblastin wurde aus dem Rückstand unter Verwendung eines aus Äthanol und Wasser bestehenden Lösungsmittelgemisches in kristalliner Form erhalten. Das NMR-Spektrum des Moduls ist in der Zeichnung I angegeben.

B)Desacetylvincaleukoblastin-dichloracetat

400 mg Desacetylvincaleukoblastin wurden mit einem Überschuß Dichloracetanhydrid, gelöst in Methylenchlorid, 72 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Nichtumgesetztes Anhydrid wurde durch einen Überschuß Methanol zerstört und das Reaktionsgemisch weitere 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdampfen der flüchtigen Bestandteile wurde der Rückstand mit einem Überschuß 14 n-Ammoniumhydroxid versetzt, die freien Basen mit Methylenchlorid extrahiert, die organische Phase abgetrennt und das Lösungsmittel i. V. entfernt. Der Rückstand wurde mit lOprozentiger Salzsäure gelöst und mit einem Überschuß von 14 n-Ammoniumhydroxid basisch gemacht, die freien Basen wieder mit Methylenchlorid extrahiert, das organische Lösungsmittel dann aus der organischen Phase durch Abdampfen i. V. entfernt. Dünnschichtchromatographie zeigte, daß ein Gemisch aus mono- und diacyliertem Material vorlag. Der Rückstand wurde ' daher in 100 ml 20prozentigem wäßrigem Alkohol gelöst, wozu 2 g Chromatographie-Kieselsäuregel zugesetzt worden waren. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und filtriert, das Filtrat eingedampft. Der Rückstand bestand nach Aussage des Dünnschichtchromatogramms aus reinem Desacetyl-

t J / OU

vincaleukoblastin-dichloracetat. Das in der Zeichnung angegebene NMR-Spektrum II bestätigte die Struktur der Verbindung. Die Zahlen werte des NMR-Spektrums zeigen δ 2,70(s); <5 3,60(s); <5 3,79(s); ö 6,0(s); δ 6,64(s); <5 7,24(s). Durch Zugabe von lprozentiger Schwefelsäure bis zu einem pH-Wert von 2 zu einer Methanol/Wasser-Lösung wurde dieses Derivat in sein Sulfat umgewandelt.

Beispiel 2 Desacetylvincaleukoblastinpropionat

300 mg Desacetylvincaleukoblastin wurden in etwa 5 ecm Propionsäureanhydrid gelöst. Die Lösung wurde ι ο 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Zur Umsetzung mit dem überschüssigen Anhydrid wurden 10 mg Methanol zugegeben und die flüchtigen Bestandteile aus dem Gemisch durch Abdampfen im Vakuum entfernt. Der erhaltene Rückstand wurde in Wasser gelöst. 14 n-Ammoniumhydroxyd wurde zugegeben, um die wäßrige Phase alkalisch zu machen, und die nunmehr unlöslichen organischen Basen wurden mit Hilfe von Methylendichlorid extrahiert. Der Methylendichloridextrakt wurde durch eine AIuminiumoxyd(Stufe IH)-SMuIe gegeben. Die Dünnschichtchromatographie des aus der Säule herausfließenden Materials auf Kieselsäure zeigte, daß sich ein neues Acylderivat des Desacetylvincaleukoblastins gebildet hatte. Die Infrarotspektren und die kernmagnetischen Resonanzspektren zeigten, daß es sich bei dem neuen Acylierungsprodukt um Desacetylvincaleukoblastinpropionat handelte. Das NMR-Spektrum III des Moduls ist in der Zeichnung angegeben. Die entsprechenden NMR-Zahlenwerte sind: ö 2,66(s); δ 3,52(s); δ 3,69(s); δ 6,00(s); δ 7,02(s).

Beispiel 3 Desacetylvincaleukoblastin-chloracetat

300 mg Desacetylvincaleukoblastinsulfat wurden in Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit Ammoniumhydroxid alkalisch gemacht und der Extraktion mit Methylenchlorid unterworfen. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum wurden mehrere 10-mI-Portionen Benzol zugegeben und dann verdampft, um irgendwelches bei der Extraktion eingeschlepptes Wasser azeotrop zu entfernen. Der amorphe Rückstand wurde in 10 ml Methylenchlorid gelöst, und 300 mg Chloressigsäureanhydrid wurden zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht stehengelassen. Dann wurden 10 ml Methanol zugegeben, um restliches überschüssiges Anhydrid zu entfernen. Nach zwei Stunden wurden die flüchtigen Materialien im Vakuum entfernt, und dann wurde der Rückstand in 20 ml Methylenchlorid gelöst. Kaltes verdünntes wäßriges Ammoniumhydroxid wurde zugegeben, und die Schichten wurden schnell geschüttelt und getrennt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand in 20 ml Methanol, das 5 ml Wasser enthielt, gelöst, und 1 g Kieselsäuregel vom chromatographischen Reinheitsgrad wurde zugegeben. Dann wurde für 6 Stunden mit einem Magnetrührer gerührt, um die 3-Acetatgruppe durch Hydrolyse zu entfernen.

Das Kieselsäuregel wurde durch Filtrieren abgetrennt und wiederholt mit warmem Methanol gewaschen. Die Lösungsmittel wurden bis auf etwa 5 ml konzentriert und mit kaltem verdünntem Ammoniumhydroxid verdünnt und schnell der Extraktion mit Methylenchlorid unterworfen. Der Extrakt wurde bis zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wurde in 25 ml Äther aufgenommen und verrieben, wobei eine Ausbeute von 285 mg kristallinem Desacetylvincaleukoblastin-chloracetat erhalten wurde, das durch das in der Zeichnung angegebene NMR-Spektrum (II) identifiziert wurde. Die entsprechenden NMR-Zahlenwerte sind: δ 2,67(s); δ 3,55(s); δ 3,74(s); δ 5,55(s); Ö 6,15(s); δ 6,66(s); δ 7,24(s).

Hierzu 4 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:
Vincaleukoblastinderivate der aligemeinen Formel

OH

IO

COOCH,