DE102019101773B4

DE102019101773B4 - Mikroskopiesystem und Verfahren zum Betreiben eines Mikroskopiesystems

Info

Publication number: DE102019101773B4
Application number: DE102019101773.4A
Authority: DE
Inventors: Marco Wilzbach; Christoph Nieten; Stefan Meinkuß
Original assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Current assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2021-06-17
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: US11835461B2; DE102019101773A1; DE102019101773B9; JP2020118691A; JP7431046B2; US20200240918A1

Abstract

Mikroskopiesystem (1) zur gleichzeitigen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts (13), umfassend:eine Mikroskopieoptik (14), welche dazu konfiguriert ist, eine Objektebene (18) durch einen Beobachtungsstrahlengang (22) auf eine Bildebene (19) abzubilden;ein in dem Beobachtungsstrahlengang (22) anordenbares Beobachtungsfilter (23),wobei der Transmissionsgrad (41) des Beobachtungsfilters (23) von λ1 bis λ2 kleiner als W1 ist, von λ3 bis λ4 größer als W2=1% und kleiner als 60% ist und von λ5 bis λ6 größer als W3 ist,wobei λ1, λ2, λ3, λ4, λ5, λ6 Wellenlängen sind, für die 350 nm < λ1 < λ2 ≤ λ3 < λ4 ≤ λ5 < λ6 < 750 nm mit 440 nm < λ3 < 460 nm und 480 nm < λ4 < 620 nm gilt, undwobei W1, W2, W3 Werte sind, für die 0 < W1 < W2 < W3 < 1 gilt;eine erste Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, erstes Licht mit Wellenlängen zwischen λ1 und A2 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten;eine zweite Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, zweites Licht mit Wellenlängen zwischen λ3 und λ4 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; undeine Steuerung (12), welche dazu konfiguriert ist, die erste Lichtquelle und/oder die zweite Lichtquelle individuell zu steuern, wodurch ein Verhältnis der Intensität des ersten Lichts zu der Intensität des zweiten Lichts veränderbar ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikroskopiesystem und ein Verfahren zum Betreiben eines Mikroskopiesystems. Insbesondere dienen das Mikroskopiesystem und das Verfahren zur gleichzeitigen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts, welches mit einem Fluoreszenzfarbstoff, beispielsweise Protoporphyrin IX (PpIX) oder Fluorescein, versetzt ist.
Mikroskopiesysteme zur gleichzeitigen oder sequenziellen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts werden beispielsweise im Bereich der Tumor-Chirurgie eingesetzt. Ein tumoröses Gewebe wird mit einem Fluoreszenzfarbstoff versetzt, welcher an das tumoröse Gewebe bindet. Der Fluoreszenzfarbstoff bindet jedoch nicht an nicht-tumoröse Gewebe. Nach Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs kann das tumoröse Gewebe lokalisiert werden, indem ein Bild des Gewebes mit Fluoreszenzlicht aufgenommen wird und darin die fluoreszierenden Bereiche identifiziert werden.
Damit das tumoröse Gewebe aus dem gesunden Gewebe, das das tumoröse Gewebe umgibt, entfernt werden kann, muss das tumoröse Gewebe relativ zu seiner Umgebung identifiziert und lokalisiert werden. Es ist daher erforderlich, auch die Umgebung, also nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts, zu erfassen.
Um dies zu erreichen wird in herkömmlichen Mikroskopiesystemen zur gleichzeitigen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts eine Weißlichtquelle mit spektral annähernd homogener Intensität im sichtbaren Wellenlängenbereich verwendet, beispielsweise eine Xenon-Lampe. Die Einstellung der dem Objekt zugeführten wellenlängenabhängigen Intensität von Beleuchtungslicht wird üblicherweise über einen oder mehrere Beleuchtungsfilter eingestellt. Das von dem Objekt ausgehende Licht, welches sowohl Fluoreszenzlicht als auch an nicht-fluoreszierenden Bereichen reflektiertes Licht umfasst, wird üblicherweise durch ein Beobachtungsfilter gefiltert und einem Beobachter zugeführt.
Da das Verhältnis zwischen der Intensität des Fluoreszenzlichts und der Intensität des zur Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs verwendeten Lichts sehr klein ist, werden das Fluoreszenzlicht und an nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts reflektiertes Licht als stark unterschiedlich hell wahrgenommen, was die Lokalisierung der fluoreszierenden Bereiche und damit des tumorösen Gewebes erschwert. Zudem ist die Intensität des Fluoreszenzlichts, welches von Tumoren niedrigen Grades ausgeht, im Vergleich zu der Intensität des Fluoreszenzlichts, welches von Tumoren hohen Grades ausgeht, um einen Faktor von bis zu 20 kleiner, was die Lokalisierung darüber hinaus erschwert.
Zudem ist die farbliche Wiedergabe von nicht-fluoreszierenden Bereichen häufig nicht farbecht, sondern durch eine dominante Farbe gekennzeichnet, sodass der nicht-fluoreszierende Bereich dem Chirurg in einer unnatürlichen Farbe dargeboten wird, was die Orientierung im nicht-fluoreszierenden Bereich erschwert. Diese nichtfarbechte Wiedergabe ist teilweise auch dadurch bedingt, dass bessere Verläufe der wellenlängenabhängigen Transmissionsgrade der Filter technisch nicht realisierbar sind, beispielweise nicht als Interferenzfilter realisierbar sind.
Relevante Offenbarungen hierzu sind beispielsweise: DE 10 2010 044 503 A1 , EP 0 930 843 B1 , US 2006 0 198 001 A1 , DE 11 2014 003 992 T5 , US 5 507 287 A , WO 2005 / 034 747 A1 , DE 10 2008 018 637 A1 , DE 10 2006 047 911 A1 , DE 697 38 555 T2 , WO 2007 / 085 496 A1 , DE 691 31 176 T2 , DE 10 2008 034 008 A1 , DE 10 2014 016 850 A1 , DE 10 2018 114 695 B3 , DE 10 2015 011 429 A1 , DE 10 2010 033 825 A1 , DE 103 39 784 A1 , US 2013 / 0 307 953 A1 , US 2017 /0 235 118 A1 , EP 1 598 688 B1 , US 7 580 185 B2 , DE 298 24 467 U1 , US 2017 / 0 237 958 A1 .
Vor diesem Hintergrund ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Mikroskopiesystem, ein Verfahren zum Betreiben eines Mikroskopiesystems und ein Mikroskopieverfahren vorzuschlagen, welche die oben genannten Probleme lösen.
Erster Aspekt
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung umfasst ein Mikroskopiesystem zur gleichzeitigen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts eine Mikroskopieoptik, welche dazu konfiguriert ist, eine Objektebene durch einen Beobachtungsstrahlengang auf eine Bildebene abzubilden; ein in dem Beobachtungsstrahlengang anordenbares Beobachtungsfilter; wenigstens zwei (schmalbandige) Lichtquellen; und eine Steuerung, welche dazu konfiguriert ist, eine oder mehrere der wenigstens zwei Lichtquellen individuell zu steuern, sodass das Verhältnis der Intensitäten des von den wenigstens zwei Lichtquellen erzeugten Lichts veränderbar ist.
In der Bildebene der Mikroskopieoptik kann ein Bilddetektor angeordnet werden, um so ein Bild eines in der Objektebene angeordneten Objekts aufzunehmen.
Von den wenigstens zwei Lichtquellen ist (wenigstens) eine erste Lichtquelle dazu konfiguriert, erstes Licht zu erzeugen und auf den Objektbereich zu richten, wobei das erste Licht geeignet ist, einen in dem Objekt vorhandenen Fluoreszenzfarbstoff anzuregen. Hierzu umfasst das erste Licht Licht mit Wellenlängen im Absorptionsbereich des Fluoreszenzfarbstoffs. Für PpIX kann das erste Licht Wellenlängen im Bereich von 380 nm bis 420 nm umfassen.
Von den wenigstens zwei Lichtquellen ist (wenigstens) eine zweite Lichtquelle dazu konfiguriert, zweites Licht zu erzeugen und auf den Objektbereich zu richten, wobei das zweite Licht zur Sichtbarmachung von nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts dient. Hierzu umfasst das zweite Licht Licht mit Wellenlängen außerhalb des Absorptions- und Emissionsbereichs des Fluoreszenzfarbstoffs.
Eine oder mehrere der Lichtquellen können schmalbandig sein. Schmalbandige Lichtquellen erzeugen Licht gemäß einer spektralen Intensitätsverteilung, wobei die spektrale Intensitätsverteilung eine maximale spektrale Emissionsintensität an einer Zentralwellenlänge aufweist und wobei die Differenz zwischen einer oberen Grenzwellenlänge, an der die spektrale Emissionsintensität 1% der maximalen spektralen Emissionsintensität beträgt und die größer als die Zentralwellenlänge ist, und einer unteren Grenzwellenlänge, an der die spektrale Emissionsintensität 1% der maximalen spektralen Emissionsintensität beträgt und die kleiner als die Zentralwellenlänge ist, höchstens 150 nm, insbesondere höchstens 100 nm, weiter insbesondere höchstens 50 nm oder höchstens 20 nm oder höchstens 10 nm, beträgt.
Eine oder mehrere der Lichtquellen können von der Steuerung individuell gesteuert werden. Das bedeutet, dass eine Lichtquelle unabhängig von den anderen Lichtquellen gesteuert werden kann. Somit kann die Intensität des von den individuell steuerbaren Lichtquellen erzeugten Lichts individuell eingestellt werden. Somit kann das Verhältnis der Intensitäten von Licht, das von verschiedenen Lichtquellen erzeugt wird, verändert werden. Beispielsweise ist die Steuerung dazu konfiguriert, den Betriebsstrom und/oder die Betriebsspannung der individuell steuerbaren Lichtquellen zu verändern, um hierdurch die Intensität des durch diese Lichtquellen erzeugten Lichts zu verändern. Die Lichtquellen sind beispielsweise Leuchtdioden.
Der (wellenlängenabhängige) Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters ist - wie üblich - definiert als das Verhältnis der Intensität von durch das Beobachtungsfilter transmittiertem Licht einer Wellenlänge zu der Intensität von auf das Beobachtungsfilter gerichtetem Licht derselben Wellenlänge.
Der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters ist so ausgebildet, dass er das zur Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs verwendete Licht blockiert (nicht transmittiert), dass er das zur Sichtbarmachung von nicht-fluoreszierenden Bereichen verwendete Licht zu einem vorbestimmten Grad transmittiert und dass er das Fluoreszenzlicht bestmöglich transmittiert.
Durch die individuelle Einstellbarkeit der Lichtquellen und damit der spektralen Intensitätsanteile des auf das Objekt gerichteten Lichts und der geeigneten Wahl des Transmissionsgrads in den zur Sichtbarmachung von nicht-fluoreszierenden Bereichen genutzten Wellenlängenbereichen werden die folgenden Vorteile erzielt:

Zum einen können die fluoreszierenden Bereiche und die nicht-fluoreszierenden Bereiche als nahezu gleich hell wahrgenommen werden, indem die Intensität des von den einzelnen Lichtquellen erzeugten Lichts entsprechend eingestellt wird. Mit der ersten Lichtquelle kann die Intensität des von den fluoreszierenden Bereichen ausgehenden Fluoreszenzlichts (im Wesentlichen unabhängig von der zweiten Lichtquelle) eingestellt werden. Mit der zweiten Lichtquelle kann die Intensität des vom Objekt an nicht-fluoreszierenden Bereichen reflektierten Lichts (im Wesentlichen unabhängig von der ersten Lichtquelle) eingestellt werden. Somit können die Intensitäten des von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen ausgehenden Licht aufeinander abgestimmt werden, sodass beide Bereiche annähernd gleich hell erscheinen.

Des Weiteren können alle Lichtquellen hierbei in ihren emissionsstabilen Arbeitsbereichen betrieben werden. Das Emissionsspektrum von Lichtquellen ist im Allgemeinen bei sehr kleinen Betriebsströmen bzw. -spannungen nicht stabil. Das bedeutet, dass sich das Emissionsspektrum mit sich änderndem Betriebsstrom ändert. Um dies zu vermeiden, können alle Lichtquellen in ihren emissionsstabilen Arbeitsbereichen betrieben werden, beispielweise indem alle Lichtquellen mit wenigstens 0,1% ihrer jeweiligen maximalen Leistungsaufnahme betrieben werden. Damit die Intensität des zur Sichtbarmachung von nicht-fluoreszierenden Bereichen verwendeten Lichts, welches von einer Lichtquelle mit wenigstens 0,1% ihrer maximalen Leistungsaufnahme betrieben wird, näherungsweise gleich der Intensität des Fluoreszenzlichts ist (d. h. fluoreszierende und nicht-fluoreszierende Bereiche gleich hell erscheinen), kann der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters in den zur Sichtbarmachung von nicht-fluoreszierenden Bereichen genutzten Wellenlängenbereichen entsprechend klein gewählt werden. Hierdurch können alle Lichtquellen in ihren emissionsstabilen Arbeitsbereichen betrieben werden.
Des Weiteren ist ein Beleuchtungsfilter nicht erforderlich.
Werden zur Sichtbarmachung von nicht-fluoreszierenden Bereichen wenigstens zwei Lichtquellen und wenigstens zwei separate Durchlassbereiche im Beobachtungsfilter verwendet, wird hierdurch ein weiterer Vorteil erzielt: Die farbliche Wiedergabe von nicht-fluoreszierenden Bereichen kann durch die geeignete Wahl der Intensitäten des von den zur Sichtbarmachung von nicht-fluoreszierenden Bereichen verwendeten Lichtquellen erzeugten Lichts und der Transmissionsgrade der hierzu entsprechend im Beobachtungsfilter vorgesehenen Durchlassbereiche eingestellt werden. Insbesondere kann die farbliche Wiedergabe auf eine farbechte Wiedergabe eingestellt werden.
In den nachfolgend beschriebenen Ausführungsformen ist der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters von λ1 bis A2 kleiner als W1, von λ3 bis λ4 größer als W2 und von λ5 bis λ6 größer als W3, wobei A1, A2, A3, λ4, λ5, λ6 Wellenlängen sind, für die 350 nm < λ1 < A2 ≤ λ3 < λ4 ≤ λ5 < λ6 < 750 nm gilt, und wobei W1, W2, W3 Werte sind, für die 0 < W1 < W2 < W3 < 1 gilt; und eine erste Lichtquelle ist dazu konfiguriert, erstes Licht mit Wellenlängen zwischen λ1 und A2 zu erzeugen, und eine zweite Lichtquelle ist dazu konfiguriert, zweites Licht mit Wellenlängen zwischen λ3 und λ4 zu erzeugen.
Für die gleichzeitige Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines mit PpIX versetzten Objekts können das Beobachtungsfilter und die Lichtquellen wie folgt konfiguriert sein:
350 nm < λ1 < 400 nm; und/oder 410 nm < A2 < 440 nm; und/oder
440 nm < λ3 < 460 nm; und/oder 480 nm < λ4 < 620 nm; und/oder
530 nm < λ5 < 620 nm; und/oder 650 nm < λ6 < 750 nm; und/oder
W1=0,1% oder W1=0,01%; und/oder
W2=1%; und/oder
W3=90%.
Erste Ausführungsform
Zur Beobachtung der nicht-fluoreszierenden Bereiche im blauen Wellenlängenbereich, wie es in bestimmten Anwendungen üblich und gewünscht ist, gelten des Weiteren die folgenden Einstellungen:
480 nm < λ4 < 520 nm; und/oder
wobei der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters von λ3 bis λ4 größer als 10% und kleiner als 60% ist; und/oder
wobei der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters von λ2+Δ bis λ3-Δ und von λ4+Δ bis λ5-Δ kleiner als das 0,1-fache von W1 ist, wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt; und/oder
wobei die Intensität des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder
wobei die Intensität des zweiten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt.
Um die farbliche Wiedergabe der nicht-fluoreszierenden Bereiche einstellen zu können, insbesondere auf eine farbechte Wiedergabe, umfasst das Mikroskopiesystem ferner eine dritte Lichtquelle, welche dazu konfiguriert ist, drittes Licht mit Wellenlängen zwischen λ7 und λ8 zu erzeugen und auf die Objektebene zu richten, wobei λ7, λ8 Wellenlängen sind und A2 < λ7 < λ8 < A5 gilt. Nachfolgend werden einige Konfigurationen beschrieben, mit denen eine farbechte Wiedergabe der nicht-fluoreszierenden Bereiche durch geeigneten Betrieb der Lichtquellen erreicht wird.
Zweite Ausführungsform
Der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters ist von λ3 bis λ6 größer als W3. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des zweiten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des dritten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität.
Dritte Ausführungsform
Der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters ist von λ3 bis λ4 kleiner als 5% und es gilt 600 nm < λ4 < λ5 < 620 nm. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des zweiten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität.
Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des dritten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität.
Vierte Ausführungsform
Weiter bevorzugt umfasst das Mikroskopiesystem nach der dritten Ausführungsform ferner ein zwischen den Lichtquellen und der Objektebene anordenbares Beleuchtungsfilter, wobei der Transmissionsgrad des Beleuchtungsfilters von λ1 bis λ3' und von λ4' bis λ4 größer als W3 ist und von λ3'+Δ bis λ4'-Δ und ab λ4+Δ kleiner als W1 ist, wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt; und wobei λ3', λ4' Wellenlängen sind und λ3 < λ3' < λ4' < λ4 und 480 nm < λ3' < 520 nm und 520 nm < λ4' < 550 nm und λ4'-λ3' > 20 nm gilt. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des zweiten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ4' höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität. Vorteilhafterweise ist die Intensität des dritten Lichts zwischen λ4' und λ4 signifikant hoch und beträgt unterhalb von λ3' und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität.
Fünfte Ausführungsform
Der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters ist von λ3 bis λ4 kleiner als 5%; der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters ist von λ7 bis λ8 größer als W2 und kleiner als 5%; und der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters ist von λ4+Δ bis λ7-Δ kleiner als W1, wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt; wobei λ7, λ8 Wellenlängen sind und wobei λ4 < λ7 < λ8 < λ5 und 480 nm < λ4 < 520 nm und 520 nm < λ7 < 550 nm und λ7-λ4 > 20 nm und λ5-λ8 < 30 nm gilt. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des zweiten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ7 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des dritten Lichts unterhalb von λ4 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität.
Sechste Ausführungsform
Der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters ist von λ3 bis λ4 kleiner als 5%; der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters ist von λ4+Δ bis λ5-Δ kleiner als W1, wobei 480 nm < λ4 < 520 nm und 530 nm < λ5 < 560 nm und λ5-λ4 > 20 nm gilt. Das Mikroskopiesystem umfasst ferner ein zwischen den Lichtquellen und der Objektebene anordenbares Beleuchtungsfilter, wobei der Transmissionsgrad des Beleuchtungsfilters von λ1 bis λ4 größer als W3 ist, wobei der Transmissionsgrad des Beleuchtungsfilters von λ4+Δ bis λ5'-Δ kleiner als W1 ist, wobei der Transmissionsgrad des Beleuchtungsfilters von λ5' bis λ6' größer als W2 und kleiner als 5% ist, wobei der Transmissionsgrad des Beleuchtungsfilters von λ6' bis λ6 kleiner als W1 ist, wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt, wobei λ5', λ6' Wellenlängen sind und λ4 < λ5' < λ6' < λ6 gilt, und wobei 530 nm < λ5' < 570 nm und 600 nm < λ6' < 620 nm gilt. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des zweiten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des dritten Lichts unterhalb von λ4 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität.
Für die gleichzeitige Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines mit PpIX versetzten Objekts eignen sich für die vorangehend beschriebenen Ausführungsformen insbesondere die wie folgt konfigurierten Lichtquellen: Die erste Lichtquelle kann eine Leuchtdiode mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 420 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 10 nm bis 20 nm sein. Die zweite Lichtquelle kann eine Leuchtdiode mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 440 nm bis 470 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 20 nm bis 50 nm sein. Die dritte Lichtquelle kann eine Leuchtdiode mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 500 nm bis 560 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 40 nm bis 110 nm sein.
Siebte Ausführungsform
Für die gleichzeitige Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines mit Fluorescein versetzten Objekts umfasst das Mikroskopiesystem ferner eine dritte Lichtquelle, welche dazu konfiguriert ist, drittes Licht mit Wellenlängen zwischen λ5' und λ6' zu erzeugen und auf die Objektebene zu richten; ein zwischen den Lichtquellen und der Objektebene anordenbares Beleuchtungsfilter, wobei der Transmissionsgrad des Beleuchtungsfilters von λ1 bis λ4 größer als W3 ist, wobei der Transmissionsgrad des Beleuchtungsfilters von λ5' bis λ6' größer als W2 und kleiner als 5% ist, wobei λ5', λ6' Wellenlängen sind und λ5 < λ5' < λ6' gilt; und wobei der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters von λ3 bis λ4 kleiner als 5% ist.
Vorteilhafterweise ist der Transmissionsgrad des Beleuchtungsfilters von λ4+Δ bis λ5'-Δ kleiner als W1, wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt. Vorteilhafterweise ist der Transmissionsgrad des Beleuchtungsfilters von λ6' bis 750 nm kleiner als W1. Vorteilhafterweise ist der Transmissionsgrad des Beobachtungsfilters von λ4+Δ bis λ5-Δ kleiner als W1 ist, wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt.
Das Beobachtungsfilter und die Lichtquellen können für die gleichzeitige Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines mit Fluorescein versetzten Objekts wie folgt konfiguriert sein:
350 nm < λ1 < 460 nm; und/oder 460 nm < A2 < 480 nm; und/oder
470 nm < λ3 < 490 nm; und/oder 490 nm < λ4 < 510 nm; und/oder
520 nm < λ5 < 550 nm; und/oder 680 nm < λ6 < 750 nm; und/oder
620 nm < λ5' < 650 nm; und/oder 680 nm < λ6' < 750 nm; und/oder
W1=0,1% oder W1=0,01%; und/oder
W2=0,5%; und/oder
W3=90%.
Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des ersten Lichts oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des zweiten Lichts unterhalb von λ3 und oberhalb von λ5' höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität. Vorteilhafterweise beträgt die Intensität des dritten Lichts unterhalb von λ4 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität.
Für die gleichzeitige Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines mit Fluorescein versetzten Objekts eignen sich für die vorangehend beschriebenen Ausführungsformen insbesondere die wie folgt konfigurierten Lichtquellen: Die erste Lichtquelle kann eine Leuchtdiode mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 440 nm bis 470 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 10 nm bis 20 nm sein. Die zweite Lichtquelle kann eine Leuchtdiode mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 500 nm bis 560 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 40 nm bis 110 nm sein. Die dritte Lichtquelle kann eine Leuchtdiode mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 600 nm bis 640 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 10 nm bis 20 nm sein.
Vorteilhafterweise sind der wellenlängenabhängige Transmissionsgrad des Beleuchtungsfilters und des Beobachtungsfilters so aufeinander abgestimmt, dass zwischen 350 nm und 750 nm keine Wellenlänge existiert, für welche sowohl der Absolutwert der wellenlängenabhängigen Steigung des Transmissionsgrads des Beleuchtungsfilters als auch der Absolutwert der wellenlängenabhängigen Steigung des Transmissionsgrads des Beobachtungsfilters größer als 2%/nm sind. Hierdurch wird vermieden, dass sich der Transmissionsgrad des Beleuchtungsfilters und des Beobachtungsfilters bei einer Wellenlänge stark ändert. Herstellungsbedingte Toleranzen hinsichtlich des Transmissionsgrads des Beleuchtungsfilters und des Beobachtungsfilters wirken sich daher nicht signifikant auf die Farbechtheit und die Helligkeit verschiedener Spektralbereiche aus, die mit den Beleuchtungsfiltern und Beobachtungsfiltern erreicht werden.
Zweiter Aspekt
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betreiben eines Mikroskopiesystems, insbesondere eines der hierin beschriebenen Mikroskopiesysteme.
Das Verfahren umfasst: Erzeugen von Beleuchtungslicht und Richten des erzeugten Beleuchtungslichts auf ein Objekt; Erzeugen eines Beobachtungsstrahlengangs, welcher das Objekt in eine Bildebene abbildet, wobei in dem Beobachtungsstrahlengang ein Beobachtungsfilter angeordnet ist. Das Beleuchtungslicht wird so erzeugt, dass $| \vec{W} - \vec{f} | \leq 0,2$
gilt, worin W einen Farbort eines Weißpunkts in der CIE Normfarbtafel des CIE 1931-Normvalenzsystems repräsentiert und $\vec{f}$
einen Farbort mit Koordinaten x_f, y_f in der CIE Normfarbtafel des CIE 1931-Normvalenzsystems repräsentiert.
Der Abstand |·| eines Farbortes $\vec{A}$
mit Koordinaten x_A und y_A in der CIE Normfarbtafel des CIE 1931-Normvalenzsystems von einem Farbort $\vec{B}$
mit Koordinaten x_B und y_B in der CIE Normfarbtafel des CIE 1931-Normvalenzsystems ist definiert als: $| \vec{A} - \vec{B} | = {({(x_{A} - x_{B})}^{2} + {(y_{A} - y_{B})}^{2})}^{\frac{1}{2}}$
Die Koordinaten x_f, y_f des Farborts $\vec{f}$
sind definiert durch $x_{f} = \frac{X}{X + Y + Z} und y_{f} = \frac{Y}{X + Y + Z},$
worin X, Y, Z Tristimuluswerte des CIE 1931-Normvalenzsystems repräsentieren, welche definiert sind durch $\begin{array}{l} X = k \int I (λ) \cdot T (λ) \cdot \bar{x} (λ) \cdot d λ, \\ Y = k \int I (λ) \cdot T (λ) \cdot \bar{y} (λ) \cdot d λ, \\ Z = k \int I (λ) \cdot T (λ) \cdot \bar{z} (λ) \cdot d λ, \end{array}$
worin I (λ) die Intensität des Beleuchtungslichts repräsentiert, T (λ) den Transmissionsgrad (41, 61, 81, 101, 121, 141, 161) des Beobachtungsfilters (23) repräsentiert, x̅(λ), y̅(λ), z̅(λ) die Spektralwertfunktionen des CIE 1931-Normvalenzsystems repräsentieren und k eine Konstante ist.
Der Weißpunkt kann beispielsweise der Weißpunkt D50 mit den Koordinaten x=0,3457 und y=0,3585 in der CIE Normfarbtafel des CIE 1931-Normvalenzsystems sein. Alternativ kann der Weißpunkt beispielsweise der Weißpunkt D65 mit den Koordinaten x=0,3127 und y=0,329 in der CIE Normfarbtafel des CIE 1931-Normvalenzsystems sein. Weiter alternativ kann der Weißpunkt einer Farbvalenz entsprechen, deren Farbort von dem Farbort des Weißpunkts D50 in der CIE 1976 u'v' Farbtafel einen Abstand von höchstens 0,2, insbesondere höchstens 0,1 oder höchstens 0,05, aufweist.
Der Abstand |·| eines Farbortes $\vec{A}$
mit Koordinaten u'_A und v'_A in der CIE 1976 u'v' Farbtafel von einem Farbort $\vec{B}$
mit Koordinaten u'_B und v'_B in der CIE 1976 u'v' Farbtafel ist definiert als: $| \vec{A} - \vec{B} | = {({(u'_{A} - u'_{B})}^{2} + {(v'_{A} - v'_{B})}^{2})}^{\frac{1}{2}}$
Bevorzugt wird das Beleuchtungslicht so erzeugt, dass $| \vec{W} - \vec{f} | \leq 0,15$
oder $| \vec{W} - \vec{f} | \leq 0,1$
gilt. Die Integrale über die Wellenlänge λ werden von 380 nm bis 780 nm integriert.
Gleichung (1) beschreibt eine Bedingung für einen maximalen Farbvalenzabstand in der CIE 1931 Normfarbtafel. Hierbei repräsentiert $\vec{f}$
einen Farbort in der CIE Normfarbtafel des CIE 1931-Normvalenzsystems, der erhalten wird, wenn Beleuchtungslicht der Intensität I(λ) auf ein weißes Objekt trifft und das von dem weißen Objekt ausgehende Licht mit einem Beobachtungsfilter mit dem Transmissionsgrad T (λ) gefiltert wird. Der geforderte geringe Abstand von dem Weißpunkt in der CIE 1931 Normfarbtafel bedeutet, dass das weiße Objekt annähernd weiß beobachtet werden kann. Auf allgemeine Objekte übertragen bedeutet dies, dass das Objekt annähernd farbecht beobachtet werden kann. Dies erleichtert einem Chirurgen die Orientierung im Operationsfeld.
Das Beleuchtungslicht wird beispielsweise mittels mehrerer Lichtquellen erzeugt, welche Licht in verschiedenen Wellenlängenbereichen erzeugen. Das Erzeugen des Beleuchtungslichts kann umfassen: Einstellen, insbesondere Variieren, einer Energie, die wenigstens einer der mehreren Lichtquellen zur Erzeugung des Beleuchtungslichts zugeführt wird.
Das Verfahren kann mit den hierin beschriebenen Mikroskopiesystemen durchgeführt werden.
Dritter Aspekt
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Mikroskopieverfahren, bei welchen fluoreszierende Bereiche und nicht-fluoreszierende Bereiche als annähernd gleich hell wahrgenommen werden können.
Hierzu umfasst das Mikroskopieverfahren: Erzeugen von Beleuchtungslicht und Richten des erzeugten Beleuchtungslichts auf ein Objekt; Erzeugen eines Beobachtungsstrahlengangs, welcher das Objekt in eine Bildebene abbildet, wobei in dem Beobachtungsstrahlengang ein Beobachtungsfilter angeordnet ist; wobei ein erster Wert, welcher einen Mittelwert des Transmissionsgrads des Beobachtungsfilters über einen ersten Wellenlängenbereich repräsentiert, kleiner als ein zweiter Wert ist, welcher einen Mittelwert des Transmissionsgrads des Beobachtungsfilters über einen zweiten Wellenlängenbereich repräsentiert, wobei der zweite Wert kleiner als ein dritter Wert ist, welcher einen Mittelwert des Transmissionsgrads des Beobachtungsfilters über einen dritten Wellenlängenbereich repräsentiert; wobei ein vierter Wert, welcher einen Mittelwert der Intensität des Beleuchtungslichts über den ersten Wellenlängenbereich repräsentiert, größer als ein fünfter Wert ist, welcher einen Mittelwert der Intensität des Beleuchtungslichts über den zweiten Wellenlängenbereich repräsentiert, wobei der fünfte Wert größer als ein sechster Wert ist, welcher einen Mittelwert der Intensität des Beleuchtungslichts über den dritten Wellenlängenbereich repräsentiert; wobei der erste, zweite und dritte Wellenlängenbereich einander nicht überlappen und jeweils zwischen 350 nm und 1000 nm liegen.
Der erste Wellenlängenbereich entspricht demjenigen Wellenlängenbereich, in dem ein in dem Objekt vorhandener Fluoreszenzfarbstoff eine signifikante Absorption aufweist. Um den Fluoreszenzfarbstoff effizient anregen zu können, weist das Beleuchtungslicht im ersten Wellenlängenbereich eine hohe Intensität auf, welche durch den vierten Wert charakterisiert wird. Damit an dem Objekt reflektiertes Licht des ersten Wellenlängenbereichs das Fluoreszenzlicht, welches im Wesentlichen ausschließlich in dem dritten Wellenlängenbereich erzeugt wird, nicht überstrahlt, weist das Beobachtungsfilter im ersten Wellenlängenbereich einen geringen Transmissionsgrad auf, welcher durch den ersten Wert charakterisiert wird.
Damit das Fluoreszenzlicht effizient beobachtet werden kann, weist das Beobachtungsfilter im dritten Wellenlängenbereich einen hohen Transmissionsgrad auf, welcher durch den dritten Wert charakterisiert wird. Damit das Fluoreszenzlicht nicht von an dem Objekt reflektiertem Beleuchtungslicht des dritten Wellenlängenbereichs überstrahlt wird, weist das Beleuchtungslicht in dem dritten Wellenlängenbereich eine geringe Intensität auf, welche durch den sechsten Wert charakterisiert wird.
Der zweite Wellenlängenbereich dient zur Sichtbarmachung nicht-fluoreszierender Bereiche des Objekts. Hierzu weist das Beleuchtungslicht eine mittelgroße Intensität in dem zweiten Wellenlängenbereich auf, welche durch den fünften Wert charakterisiert wird, und das Beobachtungsfilter weist im zweiten Wellenlängenbereich einen mittleren Transmissionsgrad auf, welcher durch den zweiten Wert charakterisiert wird.
Das durch das Beobachtungsfilter transmittierte Licht des ersten und zweiten Wellenlängenbereichs bewirkt die Sichtbarmachung von nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts und trägt somit überwiegend zur Helligkeit der nicht-fluoreszierenden Bereiche in der Bildebene bei. Das durch das Beobachtungsfilter transmittierte Licht des dritten Wellenlängenbereichs bewirkt die Sichtbarmachung von fluoreszierenden Bereichen des Objekts und trägt somit überwiegend zur Helligkeit der fluoreszierenden Bereiche in der Bildebene bei. Durch die angegebene Relation der ersten bis sechsten Werte zueinander wird bewirkt, dass die nicht-fluoreszierenden Bereiche und die fluoreszierenden Bereiche des Objekts annähernd gleich hell erscheinen. Zudem sind sie so aufeinander abgestimmt, dass zudem eine annähernd farbechte Beobachtung von nicht-fluoreszierenden Bereichen ermöglicht wird.
Der erste Wellenlängenbereich kann Wellenlängen enthalten, für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Absorptionsrate des in dem Objekt vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs wenigstens 5%, insbesondere wenigstens 10%, weiter insbesondere wenigstens 50% beträgt. Dementsprechend enthält der erste Wellenlängenbereich diejenigen Wellenlängen, an denen der Fluoreszenzfarbstoff effizient angeregt werden kann.
Der dritte Wellenlängenbereich kann Wellenlängen enthalten, für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Emissionsrate des in dem Objekt vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs wenigstens 5%, insbesondere wenigstens 10%, weiter insbesondere wenigstens 50% beträgt. Dementsprechend enthält der dritte Wellenlängenbereich diejenigen Wellenlängen, an denen der Fluoreszenzfarbstoff effizient Fluoreszenzlicht erzeugt.
Der zweite Wellenlängenbereich kann ausschließlich Wellenlängen enthalten, für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Absorptionsrate des in dem Objekt vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs höchstens 20%, insbesondere höchstens 10%, weiter insbesondere höchstens 5% beträgt und für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Emissionsrate des in dem Objekt vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs höchstens 20%, insbesondere höchstens 10%, weiter insbesondere höchstens 5% beträgt. Dementsprechend enthält der zweite Wellenlängenbereich im Wesentlichen nur diejenigen Wellenlängen, die außerhalb der Wellenlängenbereiche liegen, in denen der Fluoreszenzfarbstoff effizient angeregt werden kann und Fluoreszenzlicht erzeugt.
Bei Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Protoporphyrin IX umfasst der erste Wellenlängenbereich bevorzugt die Wellenlänge 405 nm und/oder Wellenlängen von 390 nm bis 420 nm, der zweite Wellenlängenbereich Wellenlängen von 450 nm bis 600 nm und dritte Wellenlängenbereich Wellenlängen von 620 nm bis 720 nm.
Bei Verwendung des Fluoreszenzfarbstoffs Fluorescein umfasst der erste Wellenlängenbereich bevorzugt Wellenlängen von 480 nm bis 500 nm, der zweite Wellenlängenbereich Wellenlängen von 620 nm bis 750 nm und der dritte Wellenlängenbereich Wellenlängen von 550 nm bis 600 nm.
Bevorzugt beträgt ein Verhältnis des ersten Werts zu dem zweiten Wert höchstens 1/100, insbesondere höchstens 1/1000. Bevorzugt beträgt ein Verhältnis des zweiten Werts zu dem dritten Wert höchstens 0,9, insbesondere höchstens 0,8, weiter insbesondere höchstens 0,5. Bevorzugt beträgt ein Verhältnis des vierten Werts zu dem fünften Wert mindestens 2, insbesondere mindestens 5. Bevorzugt beträgt ein Verhältnis des vierten Werts zu dem sechsten Wert mindestens 1000, insbesondere mindestens 10000. Hierdurch wird sowohl eine annähernd gleich Helligkeit als auch eine annähernd farbechte Wiedergabe erzielt.
Das Beleuchtungslicht kann unter Verwendung mehrerer (schmalbandiger) Lichtquellen erzeugt werden, beispielsweise unter Verwendung der in Bezug auf andere Aspekte beschriebenen Lichtquellen. Mindestens eine der Lichtquellen erzeugt Licht mit Wellenlängen im ersten Wellenlängenbereich; mindestens eine der Lichtquellen erzeugt Licht mit Wellenlängen im zweiten Wellenlängenbereich. Mindestens eine der Lichtquellen kann individuell steuerbar sein, um hierdurch das Verhältnis zwischen der Intensität des Lichts mit Wellenlängen im ersten Wellenlängenbereich und der Intensität des Lichts mit Wellenlängen im zweiten Wellenlängenbereich verändern zu können.
Bevorzugt erzeugen die Lichtquellen im Wesentlichen kein Licht mit Wellenlängen im dritten Wellenlängenbereich. Hierdurch wird vermieden, dass das von den Lichtquellen erzeugte Licht das Fluoreszenzlicht im dritten Wellenlängenbereich verfälscht.
Ein alternatives Mikroskopieverfahren umfasst: Erzeugen von Beleuchtungslicht und Richten des erzeugten Beleuchtungslichts auf ein Objekt; Erzeugen eines Beobachtungsstrahlengangs, welcher das Objekt in eine Bildebene abbildet; wobei das Beleuchtungslicht so erzeugt wird, dass ein Verhältnis eines ersten Kennwerts zu einem zweiten Kennwert einen Wert im Bereich von 20/1 bis 1/20 aufweist, wobei der erste Kennwert ein Wert einer Kenngröße für die Intensität von Licht des Beobachtungsstrahlengangs an ersten Orten in der Bildebene ist, an welchen Farbvalenzen des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs innerhalb eines ersten Farbvalenzbereichs eines Farbraums liegen; wobei der zweite Kennwert ein Wert der Kenngröße für die Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs an zweiten Orten in der Bildebene ist, an welchen Farbvalenzen des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs innerhalb eines zweiten Farbvalenzbereichs des Farbraums liegen.
Bevorzug wir das Beleuchtungslicht so erzeugt, dass das Verhältnis des ersten Kennwerts zu dem zweiten Kennwert einen Wert im Bereich von 10/1 bis 1/10 oder 5/1 bis 1/5 oder 3/1 bis 1/3 aufweist.
In der Bildebene wird durch den Beobachtungsstrahlengang ein Abbild des Objekts erzeugt. Wenn ein in dem Objekt vorhandener Fluoreszenzfarbstoff durch das Beleuchtungslicht angeregt wird, enthält das Abbild im Allgemeinen fluoreszierende Bereiche (erste Orte) und nicht-fluoreszierende Bereiche (zweite Orte). Stark fluoreszierende Bereiche (erste Orte) weisen im Abbild die für den Fluoreszenzfarbstoff typischen Farbvalenzen auf, die innerhalb des ersten Farbvalenzbereichs liegen. Schwach- und nicht-fluoreszierende Bereiche (zweite Orte) weisen im Abbild andere Farbvalenzen auf, die innerhalb des zweiten Farbvalenzbereichs liegen. Dementsprechend sind der erste und zweite Farbvalenzbereich nicht-überlappende Bereiche desselben Farbraums.
Fluoreszierende Bereiche des Objekts (erste Orte) können in der Bildebene anhand der für den Fluoreszenzfarbstoff typischen Farbvalenzen von nicht-fluoreszierenden Bereichen (zweiten Orten) unterschieden werden. Damit sowohl fluoreszierende als auch nicht-fluoreszierende Bereiche durch einen Beobachter oder eine Steuerung unterschieden werden können, ist es vorteilhaft, wenn die fluoreszierenden und die nicht-fluoreszierenden Bereiche annähernd gleich hell erscheinen, also in der Bildebene eine annähernd gleich große Intensität oder einen annähernd gleich großen Lichtstrom aufweisen. Lichtstrom bezeichnet den für das menschliche Auge sichtbaren Anteil einer Strahlungsleistung, gewichtet mit der Hellempfindlichkeitskurve des menschlichen Auges.
Dies wird in dem Mikroskopieverfahren dadurch erreicht, dass das Beleuchtungslicht so erzeugt wird, dass das Verhältnis des ersten Kennwerts zu dem zweiten Kennwert einen Wert im Bereich von 20/1 bis 1/20 aufweist. Der erste Kennwert repräsentiert beispielsweise den Mittelwert der Intensität des Lichts im Beobachtungsstrahlengang in der Bildebene an den ersten Orten, also denjenigen Orten in der Bildebene, an denen das Licht im Beobachtungsstrahlengang die für den Fluoreszenzfarbstoff typischen Farbvalenzen aufweist. In diesem Beispiel repräsentiert der zweite Kennwert den Mittelwert der Intensität des Lichts im Beobachtungsstrahlengang in der Bildebene an den zweiten Orten, also denjenigen Orten in der Bildebene, an denen das Licht im Beobachtungsstrahlengang nicht die für den Fluoreszenzfarbstoff typischen Farbvalenzen aufweist.
Der erste Kennwert und der zweite Kennwert repräsentieren jeweils einen Wert einer Kenngröße desselben Typs. Beispielsweise repräsentiert der erste Kennwert einen Maximalwert, dann repräsentiert der zweite Kennwert ebenfalls einen Maximalwert. Alternativ repräsentiert der erste Kennwert beispielsweise einen Mittelwert, dann repräsentiert der zweite Kennwert ebenfalls einen Mittelwert.
Der erste Kennwert kann einen Maximalwert oder einen Mittelwert der Intensität (oder des Lichtstroms) des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs an den ersten Orten repräsentieren. Der zweite Kennwert kann einen Maximalwert oder einen Mittelwert der Intensität (oder des Lichtstroms) des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs an den zweiten Orten repräsentieren.
Das Mikroskopieverfahren kann ferner umfassen: Bestimmen der ersten Orte in der Bildebene, an welchen die Farbvalenzen des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs innerhalb des ersten Farbvalenzbereichs des Farbraums liegen; Bestimmen der zweiten Orte in der Bildebene, an welchen die Farbvalenzen des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs innerhalb des zweiten Farbvalenzbereichs des Farbraums liegen; wobei das Beleuchtungslicht in Abhängigkeit der Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs an den bestimmten ersten Orten und in Abhängigkeit der Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs an den bestimmten zweiten Orten erzeugt wird. Hierdurch werden die ersten und zweiten Orte in der Bildebene identifiziert und das Beleuchtungslicht in Abhängigkeit der Intensität an diesen Orten erzeugt.
Das Mikroskopieverfahren kann ferner umfassen: Bestimmen der Intensität des Lichts im Beobachtungsstrahlengang an den ersten und zweiten Orten bzw. Bestimmen des Lichtstroms des Lichts im Beobachtungsstrahlengang an den ersten und zweiten Orten. Beispielsweise ist in der Bildebene ein Bilddetektor angeordnet, welcher dazu konfiguriert ist, ein Farbbild des Abbilds aufzunehmen, anhand dessen einerseits die ersten und zweiten Orte identifiziert und andererseits die Intensität des Lichts im Beobachtungsstrahlengang an den ersten und zweiten Orten bestimmt werden kann.
Das Mikroskopieverfahren kann ferner umfassen: Aufnehmen eines Bildes des Objekts in der Bildebene, wobei das Bild eine Vielzahl von Bildpunkten umfasst; Vergleichen von Farbvalenzen an den Bildpunkten des Bildes mit dem ersten Farbvalenzbereich und/oder mit dem zweiten Farbvalenzbereich; Bestimmen von ersten Bildpunkten aus der Vielzahl von Bildpunkten basierend auf einem Ergebnis des Vergleichs, wobei die ersten Bildpunkte den ersten Orten in der Bildebene entsprechen und wobei Farbvalenzen an den ersten Bildpunkten innerhalb des ersten Farbvalenzbereichs des Farbraums liegen; und Bestimmen von zweiten Bildpunkten aus der Vielzahl von Bildpunkten basierend auf dem Ergebnis des Vergleichs, wobei die zweiten Bildpunkte den zweiten Orten in der Bildebene entsprechen und wobei Farbvalenzen an den zweiten Bildpunkten innerhalb des zweiten Farbvalenzbereichs des Farbraums liegen.
Das Mikroskopieverfahren kann ferner umfassen: Bestimmen des ersten Kennwerts basierend auf der bestimmten Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs an den bestimmten ersten Orten; und Bestimmen des zweiten Kennwerts basierend auf der bestimmten Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs an den bestimmten zweiten Orten; wobei das Beleuchtungslicht in Abhängigkeit des bestimmten ersten Kennwerts und in Abhängigkeit des bestimmten zweiten Kennwerts erzeugt wird. Dementsprechend werden der erste und zweite Kennwert bestimmt, beispielsweise berechnet, und zwar basierend auf den bestimmten bzw. gemessenen Intensitätswerten an den ersten und zweiten Orten, die zuvor auf Grundlage eines aufgenommenen Bildes und anhand ihrer Farbvalenzen, insbesondere durch Vergleich mit dem ersten und zweiten Farbvalenzbereich, identifiziert wurden. Der so erhaltene erste und zweite Kennwert werden dann zur Erzeugung des Beleuchtungslichts verwendet.
Das Beleuchtungslicht wird beispielsweise mittels mehrerer Lichtquellen erzeugt, welche Licht in verschiedenen Wellenlängenbereichen erzeugen. Das Erzeugen des Beleuchtungslichts kann umfassen: Einstellen, insbesondere Variieren, einer Energie, die wenigstens einer der mehreren Lichtquellen zur Erzeugung des Beleuchtungslichts zugeführt wird, in Abhängigkeit des ersten und zweiten Kennwerts.
Insbesondere kann vorgesehen sein, dass das Beleuchtungslicht unabhängig von der Intensität von Licht des Beobachtungsstrahlengangs an dritten Orten in der Bildebene erzeugt wird, wobei Farbvalenzen des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs an den dritten Orten außerhalb des ersten und zweiten Farbvalenzbereichs liegen. Das bedeutet, dass zur Erzeugung des Beleuchtungslichts ausschließlich die Intensität des Lichts im Beobachtungsstrahlengang an den ersten und zweiten Orten verwendet wird. Die Intensität des Lichts im Beobachtungsstrahlengang an anderer Orte in der Bildebene wird nicht zur Erzeugung des Beleuchtungslichts verwendet.
Der erste Farbvalenzbereich und der zweite Farbvalenzbereich können so gewählt sein, dass ein kleinster Farbabstand zwischen dem ersten Farbvalenzbereich und zweiten Farbvalenzbereich in der CIE 1976 u'v' Farbtafel wenigstens 0,01, insbesondere wenigstens 0,1 beträgt.
Ferner kann der erste Farbvalenzbereich so gewählt sein, dass er auf Farbvalenzen beschränkt ist, welche von Referenzfarbvalenzen in der CIE 1976 u'v' Farbtafel einen Farbabstand von höchstens 0,1, insbesondere höchstens 0,03 oder höchstens 0,01, haben, wobei die Referenzfarbvalenzen Licht in einem Referenzwellenlängenbereich entsprechen, welcher ausschließlich Wellenlängen enthält, für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Emissionsrate eines in dem Objekt vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs wenigstens 5%, insbesondere wenigstens 10%, weiter insbesondere wenigstens 50% beträgt. Die Referenzfarbvalenz ist beispielsweise eine Farbvalenz, die dem Emissionsspektrum eines Fluoreszenzfarbstoffs in dem Objekt entspricht. Zu dem ersten Farbvalenzbereich gehören demnach nur solche Farbvalenzen, die von dieser Referenzfarbvalenz nicht weiter als der angegebene Maximalabstand entfernt sind.
Wenn der Fluoreszenzfarbstoff PpIX ist, ist bevorzugt, dass der erste Farbvalenzbereich eine Farbvalenz umfasst, welche Licht mit einer Wellenlänge von 635 nm entspricht. Ferner ist bevorzugt, dass der erste Farbvalenzbereich auf Farbvalenzen beschränkt ist, welche von einer Referenzfarbvalenz, welche Licht mit einer Wellenlänge von 635 nm entspricht, in der CIE 1976 u'v' Farbtafel einen Farbabstand von höchstens 0,1, insbesondere höchstens 0,03 oder höchstens 0,01 haben.
Wenn der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein ist, ist bevorzugt, dass der erste Farbvalenzbereich eine Farbvalenz umfasst, welche Licht mit einer Wellenlänge von 530 nm entspricht. Ferner ist bevorzugt, dass der erste Farbvalenzbereich auf Farbvalenzen beschränkt ist, welche von einer Referenzfarbvalenz, welche Licht mit einer Wellenlänge von 530 nm entspricht, in der CIE 1976 u'v' Farbtafel einen Farbabstand von höchstens 0,1, insbesondere höchstens 0,03 oder höchstens 0,01 haben.
Merkmale des ersten, zweiten und dritten Aspekts können miteinander kombiniert werden.
Die hierin beschriebenen Beobachtungsfilters und Beleuchtungsfilter können beispielsweise als Interferenzfilter ausgebildet sein. Interferenzfilter umfassen mehrere Schichten von Materialien unterschiedlicher optischer Eigenschaften, beispielsweise unterschiedliche Brechungsindizes. Jede Schicht kann unterschiedlich dick sein. Die Anzahl der Schichten kann je nach Anforderungen an den Filter zwischen einigen wenigen und mehreren hundert liegen. Durch die spezielle Wahl der Dicke und der optischen Eigenschaft einer jeden Schicht können die hierin beschriebenen Transmissionsgrade realisiert werden.
Hilfsmittel zur Bestimmung der Dicken und optischen Eigenschaften der Schichten eines Filters in Abhängigkeit eines vordefinierten wellenlängenabhängigen Transmissionsgrades sind bekannt. Der Entwurf solcher Schichtfolgen kann mit Simulationsprogrammen erfolgen, die als Eingabedaten die optischen Eigenschaften (Brechungsindex und Absorption in Abhängigkeit von der Wellenlänge, Dispersion) der zu verwendenden Materialien sowie das gewünschte Transmissions- bzw. Reflexionsspektrum verwenden. Das Simulationsprogramm gibt das simulierte Transmissions- bzw. Reflexionsspektrum sowie die Schichtenfolge bzw. die Dicke der Schichten und die verwendeten optischen Eigenschaften bzw. Materialien aus. Die Berechnung kann in einem Iterationsverfahren erfolgen. Auf diese Weise können selbst Filter mit komplizierten Anforderungen, z. B. Mehrband-Filter, entworfen und hergestellt werden.
Ausführungsformen der Erfindung werden nachfolgend anhand von Figuren näher erläutert. Hierbei zeigt:

1 ein erfindungsgemäßes Mikroskopiesystem;
2 Absorptions- und Emissionsspektren von PpIX und Fluorescein;
3 Beleuchtungslichtspektren zweier Lichtquellen der ersten Ausführungsform;
4 den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad eines Beobachtungsfilters der ersten Ausführungsform;
5 Beleuchtungslichtspektren dreier Lichtquellen der zweiten bis sechsten Ausführungsform;
6 den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad eines Beobachtungsfilters der zweiten Ausführungsform;
7 eine CIE 1931 Normfarbtafel zur Erläuterung der Farbvalenz, die für ein weißes Objekt mittels der zweiten Ausführungsform erreicht werden kann;
8 den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad eines Beobachtungsfilters der dritten Ausführungsform;
9 eine CIE 1931 Normfarbtafel zur Erläuterung der Farbvalenz, die für ein weißes Objekt mittels der dritten Ausführungsform erreicht werden kann;
10 den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad eines Beobachtungsfilters der vierten Ausführungsform;
11 eine CIE 1931 Normfarbtafel zur Erläuterung der Farbvalenz, die für ein weißes Objekt mittels der vierten Ausführungsform erreicht werden kann;
12 den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad eines Beleuchtungsfilters und eines Beobachtungsfilters der fünften Ausführungsform;
13 eine CIE 1931 Normfarbtafel zur Erläuterung der Farbvalenz, die für ein weißes Objekt mittels der fünften Ausführungsform erreicht werden kann;
14 den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad eines Beleuchtungsfilters und eines Beobachtungsfilters der sechsten Ausführungsform;
15 Beleuchtungslichtspektren dreier Lichtquellen einer siebten Ausführungsform;
16 den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad eines Beleuchtungsfilters und eines Beobachtungsfilters der siebten Ausführungsform;
17 eine CIE 1931 Normfarbtafel zur Erläuterung der Farbvalenz, die für ein weißes Objekt mittels der siebten Ausführungsform erreicht werden kann;
18 eine beispielhafte Konfiguration eines Mikroskopiesystems zur Angleichung der Helligkeit von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Objektbereichen für Protoporphyrin IX;
19 eine beispielhafte Konfiguration eines Mikroskopiesystems zur Angleichung der Helligkeit von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Objektbereichen für Fluorescein;
20 eine schematische Darstellung eines Abbilds eines Objekts in einer Bildebene;
21 eine schematische Darstellung eines aus einer Vielzahl von Bildpunkten bestehenden Bildes des in 20 gezeigten Abbilds;
22 eine CIE 1931 Normfarbtafel zur Erläuterung von Farbvalenzbereichen; und
23 ein beispielhaftes Mikroskopieverfahren zur Angleichung der Helligkeit von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Objektbereichen.

1 zeigt ein beispielhaftes Mikroskopiesystem 1 zur gleichzeitigen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts.
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst eine Beleuchtungsvorrichtung 3. Die Beleuchtungsvorrichtung 3 umfasst mehrere Lichtquellen 5, eine Beleuchtungsoptik 7 und ein Beleuchtungsfilter 9, welches wahlweise in einem von der Beleuchtungsoptik 7 gebildeten Beleuchtungsstrahlengang 10 angeordnet werden kann. Dies wird durch einen Doppelpfeil in 1 dargestellt. Mittels der mehreren Lichtquellen 5 und dem Beleuchtungsfilter 9 kann die Beleuchtungsvorrichtung 3 verschiedene Beleuchtungslichtspektren erzeugen und auf einen Objektbereich 11 richten.
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst eine Steuerung 12, welche dazu konfiguriert ist, die mehreren Lichtquellen 5 individuell, d. h. voneinander unabhängig, zu steuern. Beispielsweise sind die Lichtquellen zwei oder mehr Leuchtdioden. Jede der Leuchtdioden kann von der Steuerung 12 einzeln gesteuert werden. Beispielsweise steuert die Steuerung 12 den Betriebsstrom und/oder die Betriebsspannung, die einer Leuchtdiode zum Erzeugen von Licht zugeführt bzw. an diese angelegt wird. Hierdurch kann die Intensität des durch die Lichtquellen 5 erzeugten Lichts individuell eingestellt werden.
Mit dem Beleuchtungsstrahlengang 10 richtet die Beleuchtungsvorrichtung 3 Beleuchtungslicht auf den Objektbereich 11, in welchem ein Objekt 13 angeordnet werden kann, welches mit einem Fluoreszenzfarbstoff versetzt sein kann. Der dem Objekt 13 zugeführte Fluoreszenzfarbstoff reichert sich in einigen Bereichen des Objekt 13 stark an (fluoreszierende Bereiche). Diese Bereiche enthalten beispielsweise Tumorzellen, an die sich der Fluoreszenzfarbstoff bindet. In anderen Bereichen des Objekts 13 reichert sich der Fluoreszenzfarbstoff nicht oder nur geringfügig an (nicht-fluoreszierende Bereiche). Diese Bereiche enthalten beispielweise keine Tumorzellen.
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst ferner eine Mikroskopieoptik 14, welche im vorliegenden Beispiel ein Objektiv 15 und weitere Linsen 16 und 17 umfasst. Die Mikroskopieoptik 14 ist dazu konfiguriert, den Objektbereich 11, insbesondere eine Objektebene 18 auf eine Bildebene 19 abzubilden. Im vorliegenden Beispiel ist in der Bildebene 19 eine Detektionsfläche eines Lichtdetektors 20 des Mikroskopiesystems 1 angeordnet. Der Lichtdetektor 20 kann beispielsweise ein Bildsensor sein. Der Lichtdetektor 20 gibt ein Signal 21 aus, welches die Intensität des auf die Detektionsfläche des Lichtdetektors 20 treffenden Lichts repräsentiert. Der Lichtdetektor 20 ist mit der Steuerung 12 verbunden und die Steuerung 12 empfängt von dem Lichtdetektor 20 das von diesem ausgegebene Signal 21. Die Steuerung kann das von dem Lichtdetektor 20 erzeugte Bild verarbeiten und darstellen. Anstelle des Lichtdetektors 20 oder zusätzlich zu diesem kann ein Okular vorgesehen sein, welches in Zusammenwirkung mit der Mikroskopieoptik 14 geeignet ist, die Objektebene 18 auf die Retina eines Auges abzubilden.
In dem von der Mikroskopieoptik 14 bereitgestellten Beobachtungsstrahlengang 22, welcher die Objektebene 18 auf die Bildebene 19 abbildet, kann ein Beobachtungsfilter 23 angeordnet sein. Ferner kann ein Aktor (nicht gezeigt) vorgesehen sein, welcher das Beobachtungsfilter 23 in den Beobachtungsstrahlengang 22 einführen kann und das Beobachtungsfilter 23 aus dem Beobachtungsstrahlengang 22 heraus führen kann. Dies wird durch einen Doppelpfeil in 1 dargestellt.
Je nach Konfiguration der mehreren Lichtquellen 5, des Beleuchtungsfilters 9 und des Beobachtungsfilters 23 können gleichzeitig fluoreszierende und nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 beobachtet werden. Nachfolgend werden verschiedene Ausführungsformen für die Fluoreszenzfarbstoffe Protoporphyrin IX (PpIX) und Fluorescein beschrieben.
2 zeigt das wellenlängenabhängige Absorptionsspektrum von PpIX als Graph A_PpIX , das wellenlängenabhängige Emissionsspektrum von PpIX als Graph E_PpIX , das wellenlängenabhängige Absorptionsspektrum von Fluorescein als Graph A_FL und das wellenlängenabhängige Emissionsspektrum von Fluorescein als Graph E_FL.
Der Fluoreszenzfarbstoff PpIX weist ein Absorptionsspektrum A_PpIX auf, welches zwischen 350 nm und 430 nm eine normierte Absorptionsintensität von mehr als 0,2 aufweist. Die normierte Absorptionsintensität ist auf die maximale Absorptionsintensität normiert, d. h. das normierte Absorptionsspektrum weist lediglich Werte zwischen 0 und 1 auf. In dem Bereich von 350 nm bis 430 nm lässt sich der Fluoreszenzfarbstoff PpIX daher effizient anregen. Das Maximum der Absorption weist der Fluoreszenzfarbstoff PpIX bei etwa 405 nm auf. Der Fluoreszenzfarbstoff PpIX emittiert Fluoreszenzlicht in einem Spektralbereich von etwa 600 nm bis 750 nm, wobei ein Hauptmaximum der Emissionsintensität bei 635 nm und ein Nebenmaximum bei etwa 705 nm liegen.
Der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein weist zwischen etwa 450 nm und 530 nm eine normierte Absorptionsintensität von mehr als 0,2 auf. In diesem Bereich lässt sich der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein daher effizient anregen. Das Absorptionsspektrum von Fluorescein weist bei etwa 495 nm ein Maximum auf. Der Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein emittiert Emissionslicht im Bereich von etwa 490 nm bis 650 nm. Das Maximum des Emissionsspektrums liegt bei etwa 520 nm.
Beispiel zur ersten Ausführungsform
3 zeigt Beleuchtungslichtspektren (spektrale Intensitätsverteilungen) 31, 32 einer ersten und zweiten Lichtquelle gemäß der ersten Ausführungsform. Die erste Lichtquelle dient im Wesentlichen ausschließlich der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs PpIX, d. h. der Sichtbarmachung von fluoreszierenden Bereichen des Objekts. Die zweite Lichtquelle dient im Wesentlichen ausschließlich der Sichtbarmachung von nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts.
Die erste Lichtquelle erzeugt ein Beleuchtungslichtspektrum 31 mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 410 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 10 nm bis 20 nm. Unterhalb von etwa 370 nm und oberhalb von etwa 450 nm beträgt die Intensität des von der ersten Lichtquelle erzeugten ersten Lichts höchstens 1% ihrer maximalen spektralen Intensität. Die erste Lichtquelle ist beispielsweise eine Leuchtdiode.
Die zweite Lichtquelle erzeugt ein Beleuchtungslichtspektrum 32 mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 440 nm bis 470 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 20 nm bis 50 nm. Unterhalb von etwa 440 nm und oberhalb von etwa 500 nm beträgt die Intensität des von der zweiten Lichtquelle erzeugten zweiten Lichts höchstens 1% ihrer maximalen spektralen Intensität. Die zweite Lichtquelle ist beispielsweise eine Leuchtdiode.
Die erste und zweite Lichtquelle werden so betrieben, dass die maximale spektrale Intensität der ersten Lichtquelle höchstens 20-mal und mindestens 3-mal so groß wie die maximale spektrale Intensität der zweiten Lichtquelle ist.
4 zeigt den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 41 eines Beobachtungsfilters 23 gemäß der ersten Ausführungsform. Von λ1=360 nm bis A2=430 nm beträgt der Transmissionsgrad 41 etwa 0,01%. Von λ3=435 nm bis X4=500 nm beträgt der Transmissionsgrad 41 etwa 55%. Von λ5=600 nm bis X6=750 nm beträgt der Transmissionsgrad 41 etwa 95%. In den übrigen Wellenlängenbereichen zwischen λ1 und λ6 beträgt der Transmissionsgrad 41 höchstens 0,001%. Ferner gilt: W1=0,1%; W2=1%; und W3=80%.
Dementsprechend unterdrückt das Beobachtungsfilter 23 das am Objekt 13 reflektierte erste Licht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ1 und A2 eine hohe Intensität aufweist. Ferner wird das am Objekt 13 reflektierte zweite Licht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ3 und λ4 eine hohe Intensität aufweist, durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert, sodass nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 bläulich beobachtet werden können. Ferner wird das vom Objekt 13 ausgehende Fluoreszenzlicht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ5 und λ6 eine hohe Intensität aufweist, durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert, sodass fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 mit rötlichen Farbvalenzen beobachtet werden können.
Durch die individuelle Einstellbarkeit der Intensitäten des ersten und zweiten Lichts (vgl. 3) und die konkrete Wahl des Transmissionsgrads 41 des Beobachtungsfilters 23 werden zwei wesentliche Vorteile erzielt. Zum einen können die fluoreszierenden Bereiche und die nicht-fluoreszierenden Bereiche als nahezu gleich hell wahrgenommen werden, indem die Intensität der Lichtquellen entsprechend eingestellt wird. Zum anderen können, aufgrund der konkreten Wahl des Transmissionsgrads 41 zwischen λ3 und λ4 sowie zwischen λ5 und λ6, die Lichtquellen hierbei in ihrem stabilen Emissionsbereich betrieben werden. Zudem ist ein Beleuchtungsfilter nicht erforderlich.
Beispiele zur zweiten bis sechsten Ausführungsform
5 zeigt Beleuchtungslichtspektren (spektrale Intensitätsverteilungen) 51, 52, 53 einer ersten, zweiten und dritten Lichtquelle gemäß einer zweiten bis sechsten Ausführungsform. Die erste Lichtquelle dient im Wesentlichen ausschließlich der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs PpIX, d. h. der Sichtbarmachung von fluoreszierenden Bereichen des Objekts. Die zweite und dritte Lichtquelle dienen im Wesentlichen ausschließlich der Sichtbarmachung von nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts.
Die erste und zweite Lichtquelle entsprechen denen des Beispiels zur ersten Ausführungsform. Das bedeutet, dass das in 3 dargestellte Beleuchtungslichtspektrum 31 der ersten Lichtquelle der ersten Ausführungsform und das in 5 dargestellte Beleuchtungslichtspektrum 51 der ersten Lichtquelle der zweiten bis sechsten Ausführungsform identisch sind und dass das in 3 dargestellte Beleuchtungslichtspektrum 32 der zweiten Lichtquelle der ersten Ausführungsform und das in 5 dargestellte Beleuchtungslichtspektrum 52 der zweiten Lichtquelle der zweiten bis sechsten Ausführungsform identisch sind.
Die dritte Lichtquelle erzeugt ein Beleuchtungslichtspektrum 53 mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 500 nm bis 560 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 40 nm bis 110 nm. Unterhalb von etwa 470 nm und oberhalb von etwa 630 nm beträgt die Intensität des von der dritten Lichtquelle erzeugten dritten Lichts höchstens 1% ihrer maximalen spektralen Intensität. Die dritte Lichtquelle ist beispielsweise eine Leuchtdiode.
Die erste und dritte Lichtquelle werden so betrieben, dass die maximale spektrale Intensität der ersten Lichtquelle höchstens 20-mal und mindestens 3-mal so groß wie die maximale spektrale Intensität der dritten Lichtquelle ist.
Beispiel zur zweiten Ausführungsform
6 zeigt den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 61 eines Beobachtungsfilters 23 gemäß der zweiten Ausführungsform. Von λ1=350 nm bis λ2=435 nm beträgt der Transmissionsgrad 61 etwa 0,005%. Von λ3=440 nm bis λ4=λ5=600 nm und von λ5 bis λ6=750 nm beträgt der Transmissionsgrad 61 etwa 95%. Ferner gilt: W1=0,01%; W2=1%; und W3=80%.
Dementsprechend unterdrückt das Beobachtungsfilter 23 das am Objekt 13 reflektierte erste Licht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ1 und A2 eine hohe Intensität aufweist. Ferner wird das am Objekt 13 reflektierte zweite und dritte Licht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ3 und λ4 eine hohe Intensität aufweist, durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert, sodass nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 annähernd farbecht beobachtet werden können. Ferner wird das vom Objekt 13 ausgehende Fluoreszenzlicht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ5 und λ6 eine hohe Intensität aufweist, durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert, sodass fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 mit rötlichen Farbvalenzen beobachtet werden können.
Durch die individuelle Einstellbarkeit der Intensitäten des ersten, zweiten und dritten Lichts (vgl. 5) und die konkrete Wahl des Transmissionsgrads 61 des Beobachtungsfilters 23 werden drei wesentliche Vorteile erzielt. Zum einen können die fluoreszierenden Bereiche und die nicht-fluoreszierenden Bereiche als nahezu gleich hell wahrgenommen werden, indem die Intensität der Lichtquellen entsprechend eingestellt wird. Des Weiteren können, aufgrund der konkreten Wahl des Transmissionsgrads 61 zwischen λ3 und λ4 sowie zwischen λ5 und λ6, die Lichtquellen hierbei in ihrem stabilen Emissionsbereich betrieben werden. Schließlich kann die farbliche Wiedergabe der nicht-fluoreszierenden Bereiche durch die individuelle Einstellbarkeit der Intensitäten des zweiten und dritten Lichts so eingestellt werden, dass die nicht-fluoreszierenden Bereiche annähernd farbecht beobachtet werden können. Zudem ist ein Beleuchtungsfilter nicht erforderlich.
7 zeigt die CIE 1931 xy Normfarbtafel mit der Spektralfarblinie S und der Purpurlinie P. Ein hohler Kreis repräsentiert den D50 Weißpunkt bei x=0,3457, y=0,3585. Ein Kreuz bei ca. x=0,26, y=0,45 repräsentiert eine Farbvalenz, mit der ein weißes Objekt vom Normalbeobachter mit dem Mikroskopiesystem gemäß der zweiten Ausführungsform wahrgenommen wird, wenn das Beobachtungsfilter wie in 6 gezeigt konfiguriert ist, die maximale spektrale Intensität des von der ersten Lichtquelle erzeugten Lichts jeweils etwa 20-mal so groß wie die maximale spektrale Intensität des von der zweiten bzw. dritten Lichtquelle erzeugten Lichts ist. Nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts können daher annähernd farbecht wahrgenommen werden. Außerdem ergibt sich bei dieser Konfiguration eine annähernd gleiche Helligkeit von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts.
Beispiel zur dritten Ausführungsform
8 zeigt den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 81 eines Beobachtungsfilters 23 gemäß der dritten Ausführungsform. Von λ1=350 nm bis λ2=435 nm beträgt der Transmissionsgrad 81 etwa 0,005%. Von λ3=440 nm bis λ4=610 nm beträgt der Transmissionsgrad 81 etwa 2%. Von λ5=620 nm bis λ6=750 nm beträgt der Transmissionsgrad 81 etwa 95%. Ferner gilt: W1=0,01%; W2=1%; und W3=80%.
Dementsprechend unterdrückt das Beobachtungsfilter 23 das am Objekt 13 reflektierte erste Licht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ1 und A2 eine hohe Intensität aufweist. Ferner wird das am Objekt 13 reflektierte zweite und dritte Licht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ3 und λ4 eine hohe Intensität aufweist, durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert, sodass nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 annähernd farbecht beobachtet werden können. Ferner wird das vom Objekt 13 ausgehende Fluoreszenzlicht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ5 und λ6 eine hohe Intensität aufweist, durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert, sodass fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 mit rötlichen Farbvalenzen beobachtet werden können.
Durch die individuelle Einstellbarkeit der Intensitäten des ersten, zweiten und dritten Lichts (vgl. 5) können die Vorteile des Beispiels der zweiten Ausführungsform erzielt werden, wobei aufgrund des im Vergleich zur zweiten Ausführungsform geringeren Transmissionsgrads 81 zwischen λ3 und λ4 eine bessere Farbechtheit der Beobachtung der nicht-fluoreszierenden Bereiche erzielt wird. Außerdem können die zweite und dritte Lichtquelle mit einer im Vergleich zur zweiten Ausführungsform höheren Leistung betrieben werden, was wiederum die Stabilität der erzeugten Beleuchtungslichtspektren 52, 53 verbessert. Zudem ist ein Beleuchtungsfilter nicht erforderlich.
9 zeigt die CIE 1931 xy Normfarbtafel mit der Spektralfarblinie S und der Purpurlinie P. Ein hohler Kreis repräsentiert den D50 Weißpunkt bei x=0,3457, y=0,3585. Ein Kreuz bei ca. x=0,33, y=0,38 repräsentiert eine Farbvalenz, mit der ein weißes Objekt vom Normalbeobachter mit dem Mikroskopiesystem gemäß der dritten Ausführungsform wahrgenommen wird, wenn das Beobachtungsfilter wie in 8 gezeigt konfiguriert ist, die maximale spektrale Intensität des von der ersten Lichtquelle erzeugten Lichts etwa 7-mal so groß wie die maximale spektrale Intensität des von der zweiten Lichtquelle erzeugten Lichts ist und die maximale spektrale Intensität des von der ersten Lichtquelle erzeugten Lichts etwa 5-mal so groß wie die maximale spektrale Intensität des von der dritten Lichtquelle erzeugten Lichts ist. Nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts können daher annähernd farbecht wahrgenommen werden. Außerdem ergibt sich bei dieser Konfiguration eine annähernd gleiche Helligkeit von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts.
Beispiel zur vierten Ausführungsform
10 zeigt den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 101 eines Beobachtungsfilters 23 (durchgezogene Linie) und den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 102 eines Beleuchtungsfilters 9 (gestrichelte Linie) gemäß der vierten Ausführungsform. Das Beobachtungsfilter des Beispiels zur vierten Ausführungsform entspricht dem Beobachtungsfilter des Beispiels zur dritten Ausführungsform (λ1=350 nm; λ2=435 nm; λ3=440 nm; A4=610 nm; λ5=620 nm; λ6=750 nm).
Von 360 nm bis λ3'=500 nm beträgt der Transmissionsgrad 102 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 95%. Von etwa λ3' bis etwa λ4'=560 nm beträgt der Transmissionsgrad 102 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 0,005%. Von λ4' bis etwa λ4 beträgt der Transmissionsgrad 102 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 95%. Von etwa λ4 bis λ6 beträgt der Transmissionsgrad 102 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 0,005%. Ferner gilt: W1=0,01%; W2=1%; und W3=80%.
Das Beleuchtungsfilter und das Beobachtungsfilter haben zusammen im Wesentlichen die gleiche Wirkung wie das Beobachtungsfilter des Beispiels zur fünften Ausführungsform. Das Beobachtungsfilter unterdrückt das am Objekt 13 reflektierte erste Licht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ1 und A2 eine hohe Intensität aufweist und das Beleuchtungsfilter im Wesentlichen ungedämpft passiert. Ferner wird das am Objekt 13 reflektierte zweite Licht durch das Beleuchtungs- und das Beobachtungsfilter auf Wellenlängen beschränkt, welche im Wesentlichen nur zwischen λ3 und λ3' liegen. Ferner wird das am Objekt 13 reflektierte dritte Licht durch das Beleuchtungs- und das Beobachtungsfilter auf Wellenlängen beschränkt, welche im Wesentlichen nur zwischen λ4' und λ4 liegen. Licht des Wellenlängenbereichs von λ3' bis λ4' wird durch das Beleuchtungs- und das Beobachtungsfilter effektiv unterdrückt. Nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 können daher annähernd farbecht beobachtet werden. Ferner wird das vom Objekt 13 ausgehende Fluoreszenzlicht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ5 und λ6 eine hohe Intensität aufweist, durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert, sodass fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 mit rötlichen Farbvalenzen beobachtet werden können.
11 zeigt die CIE 1931 xy Normfarbtafel mit der Spektralfarblinie S und der Purpurlinie P. Ein hohler Kreis repräsentiert den D50 Weißpunkt bei x=0,3457, y=0,3585. Ein Kreuz bei ca. x=0,35, y=0,36 repräsentiert eine Farbvalenz, mit der ein weißes Objekt vom Normalbeobachter mit dem Mikroskopiesystem gemäß der vierten Ausführungsform wahrgenommen wird, wenn das Beobachtungsfilter und das Beleuchtungsfilter wie in 10 gezeigt konfiguriert sind, die maximale spektrale Intensität des von der ersten Lichtquelle erzeugten Lichts etwa 10-mal so groß wie die maximale spektrale Intensität des von der zweiten Lichtquelle erzeugten Lichts ist und die maximale spektrale Intensität des von der ersten Lichtquelle erzeugten Lichts etwa 5-mal so groß wie die maximale spektrale Intensität des von der dritten Lichtquelle erzeugten Lichts ist. Nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts können daher annähernd farbecht wahrgenommen werden. Außerdem ergibt sich bei dieser Konfiguration eine annähernd gleiche Helligkeit von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts.
Durch die individuelle Einstellbarkeit der Intensität 52 des zweiten Lichts und der Intensität 53 des dritten Lichts (vgl. 15) und die konkrete Wahl des Transmissionsgrads 101 des Beobachtungsfilters 23 und des Transmissionsgrads 102 des Beleuchtungsfilters 9 werden drei wesentliche Vorteile erzielt. Zum einen können die fluoreszierenden Bereiche und die nicht-fluoreszierenden Bereiche als nahezu gleich hell wahrgenommen werden, indem die Intensität der Lichtquellen entsprechend eingestellt wird. Des Weiteren können die Lichtquellen hierbei in ihrem stabilen Emissionsbereich betrieben werden, da das von der zweiten und dritten Lichtquelle erzeugte Licht ausreichend stark durch den Beobachtungsfilter 23 und den Beleuchtungsfilter 9 gedämpft wird. Schließlich kann die farbliche Wiedergabe der nicht-fluoreszierenden Bereiche durch die individuelle Einstellbarkeit der Intensitäten des zweiten und dritten Lichts so eingestellt werden, dass die nicht-fluoreszierenden Bereiche annähernd farbecht beobachtet werden können.
Die in 11 eingezeichnete gestrichelte Linie repräsentiert die Farben der nicht-fluoreszierenden Bereiche des Objektes, die durch Variation des Verhältnisses zwischen (einem Maximum) der Intensität 52 des zweiten Lichtes und (einem Maximum) der Intensität 53 des dritten Lichtes erhalten werden können. Auf diese Weise lässt sich vorteilhaft auch ein anderer Weißpunkt als D50 einstellen.
Beispiel zur fünften Ausführungsform
12 zeigt den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 121 eines Beobachtungsfilters 23 gemäß der fünften Ausführungsform. Von λ1=350 nm bis λ2=435 nm beträgt der Transmissionsgrad 121 etwa 0,005%. Von λ3=440 nm bis λ4=500 nm beträgt der Transmissionsgrad 121 etwa 2%. Von etwa λ4 bis etwa λ7 beträgt der Transmissionsgrad 121 etwa 0,005%. Von A7=535 nm bis λ8=610 nm beträgt der Transmissionsgrad 121 etwa 2%. Von λ5=620 nm bis λ6=750 nm beträgt der Transmissionsgrad 121 etwa 95%. Ferner gilt: W1=0,01%; W2=1%; und W3=80%.
Dementsprechend unterdrückt das Beobachtungsfilter 23 das am Objekt 13 reflektierte erste Licht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ1 und A2 eine hohe Intensität aufweist. Ferner wird das am Objekt 13 reflektierte zweite Licht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ3 und λ4 eine hohe Intensität aufweist, durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert. Ferner wird das am Objekt 13 reflektierte dritte Licht im Wesentlichen nur zwischen λ7 und λ8 effizient durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert. Nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 können daher annähernd farbecht beobachtet werden. Ferner wird das vom Objekt 13 ausgehende Fluoreszenzlicht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ5 und λ6 eine hohe Intensität aufweist, durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert, sodass fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 mit rötlichen Farbvalenzen beobachtet werden können.
Durch die individuelle Einstellbarkeit der Intensitäten des ersten, zweiten und dritten Lichts (vgl. 5) können die Vorteile des Beispiels zur dritten Ausführungsform erzielt werden, wobei aufgrund der im Vergleich zur dritten Ausführungsform ausgeprägteren spektralen Trennung von an dem Objekt 13 reflektiertem zweiten und dritten Licht eine noch bessere Einstellbarkeit der farbechten Wiedergabe der nicht-fluoreszierenden Bereiche erzielt wird. Außerdem können die zweite und dritte Lichtquelle mit einer im Vergleich dem Beispiel zur zweiten Ausführungsform höheren Leistung betrieben werden, was wiederum die Stabilität der erzeugten Lichtspektren verbessert. Zudem ist ein Beleuchtungsfilter nicht erforderlich.
13 zeigt die CIE 1931 xy Normfarbtafel mit der Spektralfarblinie S und der Purpurlinie P. Ein hohler Kreis repräsentiert den D50 Weißpunkt bei x=0,3457, y=0,3585. Ein Kreuz bei ca. x=0,34, y=0,35 repräsentiert eine Farbvalenz, mit der ein weißes Objekt vom Normalbeobachter mit dem Mikroskopiesystem gemäß der fünften Ausführungsform wahrgenommen wird, wenn das Beobachtungsfilter wie in 12 gezeigt konfiguriert ist, die maximale spektrale Intensität des von der ersten Lichtquelle erzeugten Lichts etwa 10-mal so groß wie die maximale spektrale Intensität des von der zweiten Lichtquelle erzeugten Lichts ist und die maximale spektrale Intensität des von der ersten Lichtquelle erzeugten Lichts etwa 6-mal so groß wie die maximale spektrale Intensität des von der dritten Lichtquelle erzeugten Lichts ist. Nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts können daher annähernd farbecht wahrgenommen werden. Außerdem ergibt sich bei dieser Konfiguration eine annähernd gleiche Helligkeit von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts.
Die in 13 eingezeichnete gestrichelte Linie repräsentiert die Farben der nicht-fluoreszierenden Bereiche des Objektes, die durch Variation des Verhältnisses zwischen (einem Maximum) der Intensität 52 des zweiten Lichtes und (einem Maximum) der Intensität 53 des dritten Lichtes erhalten werden können. Auf diese Weise lässt sich vorteilhaft auch ein anderer Weißpunkt als D50 einstellen.
Beispiel zur sechsten Ausführungsform
14 zeigt den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 141 eines Beobachtungsfilters 23 (durchgezogene Linie) und den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 142 eines Beleuchtungsfilters 9 (gestrichelte Linie) gemäß der sechsten Ausführungsform.
Von λ1=350 nm bis λ2=430 nm beträgt der Transmissionsgrad 141 des Beobachtungsfilters 23 etwa 0,005%. Von λ3=435 nm bis X4=500 nm beträgt der Transmissionsgrad 141 des Beobachtungsfilters 23 etwa 2%. Von etwa λ4 bis λ5=560 nm beträgt der Transmissionsgrad 141 des Beobachtungsfilters 23 etwa 0,005%. Von λ5 bis X6=750 nm beträgt der Transmissionsgrad 141 des Beobachtungsfilters 23 etwa 95%. Ferner gilt: W1=0,01%; W2=1%; und W3=80%.
Von 360 nm bis etwa λ4 beträgt der Transmissionsgrad 142 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 95%. Von etwa λ4 bis etwa λ5'=565 nm beträgt der Transmissionsgrad 142 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 0,005%. Von λ5' bis etwa X6'=620 nm beträgt der Transmissionsgrad 142 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 2%. Von etwa λ6' bis λ6 beträgt der Transmissionsgrad 142 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 0,005%.
Das Beleuchtungsfilter und das Beobachtungsfilter des Beispiels zur sechsten Ausführungsform haben zusammen im Wesentlichen die gleiche Wirkung wie das Beleuchtungsfilter und das Beobachtungsfilter des Beispiels zur fünften Ausführungsform. Das Beobachtungsfilter 23 unterdrückt das am Objekt 13 reflektierte erste Licht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ1 und A2 eine hohe Intensität aufweist und das Beleuchtungsfilter 9 im Wesentlichen ungedämpft passiert. Ferner wird das am Objekt 13 reflektierte zweite Licht durch das Beleuchtungs- und das Beobachtungsfilter auf Wellenlängen beschränkt, welche im Wesentlichen nur zwischen λ3 und λ4 liegen. Ferner wird das am Objekt 13 reflektierte dritte Licht durch das Beleuchtungs- und das Beobachtungsfilter auf Wellenlängen beschränkt, welche im Wesentlichen nur zwischen λ5' und λ6' liegen. Licht des Wellenlängenbereichs von etwa λ4 bis λ5 wird durch das Beleuchtungs- und das Beobachtungsfilter effektiv unterdrückt. Nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 können daher annähernd farbecht beobachtet werden. Ferner wird das vom Objekt 13 ausgehende Fluoreszenzlicht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ6' und λ6 eine hohe Intensität aufweist, durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert, sodass fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 mit rötlichen Farbvalenzen beobachtet werden können.
Beispiel zur siebten Ausführungsform
15 zeigt Beleuchtungslichtspektren einer ersten, zweiten und dritten Lichtquelle gemäß einer siebten Ausführungsform.
Die erste Lichtquelle dient im Wesentlichen ausschließlich der Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs Fluorescein, d. h. der Sichtbarmachung von fluoreszierenden Bereichen des Objekts. Die zweite und dritte Lichtquelle dienen im Wesentlichen ausschließlich der Sichtbarmachung von nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts.
Die erste Lichtquelle erzeugt ein Beleuchtungslichtspektrum 151 mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 440 nm bis 470 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 20 nm bis 50 nm. Unterhalb von etwa 430 nm und oberhalb von etwa 500 nm beträgt die Intensität des von der ersten Lichtquelle erzeugten ersten Lichts höchstens 1% ihrer maximalen spektralen Intensität. Die erste Lichtquelle ist beispielsweise eine Leuchtdiode.
Die zweite Lichtquelle erzeugt ein Beleuchtungslichtspektrum 152 mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 500 nm bis 560 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 40 nm bis 110 nm. Unterhalb von etwa 430 nm und oberhalb von etwa 650 nm beträgt die Intensität des von der zweiten Lichtquelle erzeugten zweiten Lichts höchstens 1% ihrer maximalen spektralen Intensität. Die zweite Lichtquelle ist beispielsweise eine Leuchtdiode.
Die dritte Lichtquelle erzeugt ein Beleuchtungslichtspektrum 153 mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 610 nm bis 640 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 10 nm bis 20 nm. Die dritte Lichtquelle ist beispielsweise eine Leuchtdiode.
16 zeigt den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 161 eines Beobachtungsfilters 23 (durchgezogene Linie) und den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 162 eines Beleuchtungsfilters 9 (gestrichelte Linie) gemäß der siebten Ausführungsform.
Von λ1=420 nm bis λ2=480 nm beträgt der Transmissionsgrad 161 des Beobachtungsfilters 23 etwa 0,005%. Von λ3=490 nm bis X4=500 nm beträgt der Transmissionsgrad 161 des Beobachtungsfilters 23 etwa 2%. Von etwa λ4 bis etwa λ5=540 nm beträgt der Transmissionsgrad 161 des Beobachtungsfilters 23 etwa 0,005%. Von λ5 bis X6=700 nm beträgt der Transmissionsgrad 161 des Beobachtungsfilters 23 etwa 95%. Von etwa λ6 bis 750 nm beträgt der Transmissionsgrad 161 des Beobachtungsfilters 23 etwa 0,005%. Ferner gilt: W1=0,01%; W2=0,5%; und W3=80%.
Von 350 nm bis etwa λ1 beträgt der Transmissionsgrad 162 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 0,005%. Von λ1 bis etwa λ4 beträgt der Transmissionsgrad 162 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 95%. Von etwa λ4 bis etwa λ5'=630 nm beträgt der Transmissionsgrad 162 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 0,005%. Von etwa λ5' bis λ6'=690 nm beträgt der Transmissionsgrad 162 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 0,08%. Von etwa A6' bis 750 nm beträgt der Transmissionsgrad 162 des Beleuchtungsfilters 9 etwa 0,005%.
Dementsprechend unterdrückt das Beobachtungsfilter 23 das am Objekt 13 reflektierte erste Licht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ1 und A2 eine hohe Intensität aufweist. Ferner wird das zweite Licht vom Beleuchtungsfilter 9 oberhalb von λ4 unterdrückt. Der Anteil des zweiten Lichts zwischen λ3 und λ4 wird am Objekt 13 reflektiert und durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert und trägt damit zur Sichtbarmachung der nicht-fluoreszierenden Bereiche bei. Ferner wird das dritte Licht vom Beleuchtungsfilter 9 unterhalb von λ5' unterdrückt. Der Anteil des dritten Lichts zwischen λ5' und λ6' wird am Objekt 13 reflektiert und durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert und trägt damit zur Sichtbarmachung der nicht-fluoreszierenden Bereiche bei. Ferner wird das vom Objekt 13 ausgehende Fluoreszenzlicht, welches im Wesentlichen nur zwischen λ5 und λ5' eine hohe Intensität aufweist, durch das Beobachtungsfilter 23 transmittiert, sodass fluoreszierende Bereiche des Objekts 13 mit gelblichen Farbvalenzen beobachtet werden können.
Durch die individuelle Einstellbarkeit der Intensitäten des ersten, zweiten und dritten Lichts (vgl. 15) und die konkrete Wahl des Transmissionsgrads 161 des Beobachtungsfilters 23 und des Transmissionsgrads 162 des Beleuchtungsfilters 9 werden drei wesentliche Vorteile erzielt. Zum einen können die fluoreszierenden Bereiche und die nicht-fluoreszierenden Bereiche als nahezu gleich hell wahrgenommen werden, indem die Intensität der Lichtquellen entsprechend eingestellt wird. Des Weiteren können die Lichtquellen hierbei in ihrem stabilen Emissionsbereich betrieben werden, da das von der zweiten und dritten Lichtquelle erzeugte Licht ausreichend stark durch den Beobachtungsfilter 23 und den Beleuchtungsfilter 9 gedämpft wird. Schließlich kann die farbliche Wiedergabe der nicht-fluoreszierenden Bereiche durch die individuelle Einstellbarkeit der Intensitäten des zweiten und dritten Lichts so eingestellt werden, dass die nicht-fluoreszierenden Bereiche annähernd farbecht beobachtet werden können.
17 zeigt die CIE 1931 xy Normfarbtafel mit der Spektralfarblinie S und der Purpurlinie P. Ein hohler Kreis repräsentiert den D50 Weißpunkt bei x=0,3457, y=0,3585. Ein Kreuz bei ca. x=0,35, y=0,33 repräsentiert eine Farbvalenz, mit der ein weißes Objekt vom Normalbeobachter mit dem Mikroskopiesystem gemäß der siebten Ausführungsform wahrgenommen wird, wenn das Beobachtungsfilter und das Beleuchtungsfilter wie in 16 gezeigt konfiguriert sind, die maximale spektrale Intensität des von der ersten Lichtquelle erzeugten Lichts etwa 3-mal so groß wie die maximale spektrale Intensität des von der zweiten Lichtquelle erzeugten Lichts ist und die maximale spektrale Intensität des von der ersten Lichtquelle erzeugten Lichts etwa 5-mal so groß wie die maximale spektrale Intensität des von der dritten Lichtquelle erzeugten Lichts ist. Nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts können daher annähernd farbecht wahrgenommen werden. Außerdem ergibt sich bei dieser Konfiguration eine annähernd gleiche Helligkeit von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts.
Dritter Aspekt
Mit Bezug zu den 18 und 19 wird ein Beispiel eines Mikroskopieverfahrens gemäß dem dritten Aspekt beschrieben. Das Verfahren kann mit dem Mikroskopiesystem gemäß 1 durchgeführt werden und umfasst das Erzeugen von Beleuchtungslicht, das Richten des erzeugten Beleuchtungslichts auf ein Objekt 13 und das Erzeugen eines Beobachtungsstrahlengangs 22, welcher das Objekt 13 in eine Bildebene 19 abbildet, wobei in dem Beobachtungsstrahlengang 22 ein Beobachtungsfilter 23 angeordnet ist.
18 zeigt eine beispielhafte Konfiguration eines Mikroskopiesystems zur Durchführung des Mikroskopieverfahrens für Protoporphyrin IX. Ein Diagramm 181 in 18 zeigt das wellenlängenabhängige Absorptionsspektrum 184 von PpIX und das wellenlängenabhängige Emissionsspektrum 185 von PpIX, jeweils normiert auf ihre jeweiligen Maximalwerte, siehe auch Beschreibung zu 2. Ein Diagramm 182 in 18 zeigt den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 186 des Beobachtungsfilters 23 für den selben Wellenlängenabschnitt wie in Diagramm 181. Ein Diagramm 183 zeigt die wellenlängenabhängige Intensität 187 des auf das Objekt 13 gerichteten Beleuchtungslichts für den selben Wellenlängenabschnitt wie in Diagramm 181.
Ein erster Wert W1 repräsentiert einen Mittelwert des Transmissionsgrads 186 des Beobachtungsfilters 23 über einen ersten Wellenlängenbereich WLB1. Ein zweiter Wert W2 repräsentiert einen Mittelwert des Transmissionsgrads 186 des Beobachtungsfilters 23 über einen zweiten Wellenlängenbereich WLB2. Ein dritter Wert W3 repräsentiert einen Mittelwert des Transmissionsgrads 186 des Beobachtungsfilters 23 über einen dritten Wellenlängenbereich WLB3. Der erste Wert W1 ist kleiner als der zweite Wert W2. Der zweite Wert W2 ist kleiner als der dritte Wert W3.
Ein vierter Wert W4 repräsentiert einen Mittelwert der Intensität 187 des Beleuchtungslichts über den ersten Wellenlängenbereich WLB1. Ein fünfter Wert W5 repräsentiert einen Mittelwert der Intensität 187 des Beleuchtungslichts über den zweiten Wellenlängenbereich WLB2. Ein sechster Wert W6 repräsentiert einen Mittelwert der Intensität 187 des Beleuchtungslichts über den dritten Wellenlängenbereich WLB3. Der vierte Wert W4 ist größer als der fünfte Wert W5. Der fünfte Wert W5 ist größer als der sechste Wert W6.
Der erste, zweite und dritte Wellenlängenbereich überlappen einander nicht und liegen jeweils zwischen 350 nm und 1000 nm. In dem gezeigten Beispiel erstreckt sich der erste Wellenlängenbereich WLB1 von etwa 370 nm bis 430 nm, der zweite Wellenlängenbereich WLB2 erstreckt sich von etwa 470 nm bis 580 nm und der der dritte Wellenlängenbereich WLB3 erstreckt sich von etwa 600 nm bis 750 nm.
Mit den in Bezug auf den dritten Aspekt angegebenen Werten für die Verhältnisse zwischen den ersten bis sechsten Werten wird erreicht, dass nicht-fluoreszierende Bereiche des Objekts mittels Licht des ersten Wellenlängenbereichs WLB1 und des zweiten Wellenlängenbereichs WLB2 beobachtet werden kann, während Fluoreszenzlicht mittels Licht des dritten Wellenlängenbereichs WLB3 beobachtet werden kann. Zudem wird aufgrund der angegebenen Verhältnisse zwischen den ersten bis sechsten Werten erreicht, dass nicht-fluoreszierende Bereiche und fluoreszierende Bereiche annähernd gleich hell wahrgenommen werden können. Ferner wird erreicht, dass die nicht-fluoreszierende Bereiche annähernd farbecht wahrgenommen werden können.
19 zeigt eine beispielhafte Konfiguration eines Mikroskopiesystems zur Durchführung des Mikroskopieverfahrens für Fluorescein. Ein Diagramm 191 in 19 zeigt das wellenlängenabhängige Absorptionsspektrum 194 von Fluorescein und das wellenlängenabhängige Emissionsspektrum 195 von Fluorescein, jeweils normiert auf ihre jeweiligen Maximalwerte, siehe auch Beschreibung zu 2. Ein Diagramm 192 in 19 zeigt den wellenlängenabhängigen Transmissionsgrad 196 des Beobachtungsfilters 23 für den selben Wellenlängenabschnitt wie in Diagramm 191. Ein Diagramm 193 zeigt die wellenlängenabhängige Intensität 197 des auf das Objekt 13 gerichteten Beleuchtungslichts für den selben Wellenlängenabschnitt wie in Diagramm 191.
In dem gezeigten Beispiel erstreckt sich der erste Wellenlängenbereich WLB1 von etwa 440 nm bis 500 nm, der zweite Wellenlängenbereich WLB2 erstreckt sich von etwa 640 nm bis 750 nm und der der dritte Wellenlängenbereich WLB3 erstreckt sich von etwa 520 nm bis 620 nm.
Mit Bezug zu den 20 bis 23 wird ein Beispiel eines alternativen Mikroskopieverfahrens gemäß dem dritten Aspekt beschrieben. Das Verfahren kann mit dem Mikroskopiesystem gemäß 1 durchgeführt werden und umfasst das Erzeugen von Beleuchtungslicht, das Richten des erzeugten Beleuchtungslichts auf ein Objekt 13 und das Erzeugen eines Beobachtungsstrahlengangs 22, welcher das Objekt 13 in eine Bildebene 19 abbildet, wobei in dem Beobachtungsstrahlengang 22 ein Beobachtungsfilter 23 angeordnet ist.
20 zeigt eine schematische Darstellung eines Abbilds des Objekts 13 in die Bildebene 19. Das Abbild des Objekts 13 umfasst erste Orte 201, zweite Orte 202 und dritte Orte 203. Das Licht im Beobachtungsstrahlengang 22, welches in der Bildebene 19 das Abbild erzeugt, weist an den ersten Orten 201 Farbvalenzen auf, welche in einem ersten Farbvalenzbereich 211 liegen. Das Licht im Beobachtungsstrahlengang 22, welches in der Bildebene 19 das Abbild erzeugt, weist an den zweiten Orten 202 Farbvalenzen auf, welche in einem zweiten Farbvalenzbereich 212 liegen. Das Licht im Beobachtungsstrahlengang 22, welches in der Bildebene 19 das Abbild erzeugt, weist an den dritten Orten 203 Farbvalenzen auf, welche außerhalb des ersten Farbvalenzbereichs 211 und außerhalb des zweiten Farbvalenzbereichs 212 liegen.
22 zeigt eine CIE 1931 Normfarbtafel zur Erläuterung des ersten Farbvalenzbereichs 211, des zweiten Farbvalenzbereichs 212 und des dritten Farbvalenzbereichs 213. Der erste Farbvalenzbereich 211 liegt bei roten Farbvalenzen, also den Farbvalenzen von starker Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs PpIX. Der zweite Farbvalenzbereich 212 liegt bei blauen Farbvalenzen, also den Farbvalenzen, an denen der Fluoreszenzfarbstoff PpIX effizient angeregt werden kann. Der dritte Farbvalenzbereich 213 umfasst die restlichen Farbvalenzen der sichtbaren Farbvalenzen, die nicht in dem ersten und zweiten Farbvalenzbereich enthalten sind. Ein Pfeil 214 zeigt den kleinsten Farbabstand zwischen dem ersten Farbvalenzbereich 211 und dem zweiten Farbvalenzbereich 212.
Gemäß dem alternativen Mikroskopieverfahren wird das Beleuchtungslicht so erzeugt, dass ein Verhältnis eines ersten Kennwerts zu einem zweiten Kennwert einen Wert innerhalb eines vorbestimmten begrenzten Wertebereichs aufweist. Der erste Kennwert repräsentiert einen Wert einer Kenngröße für die Intensität (oder die Helligkeit oder den Lichtstrom oder dergleichen) des Lichts im Beobachtungsstrahlengang 22 an den ersten Orten 201. Der zweite Kennwert repräsentiert dieselbe Kenngröße in Bezug auf das das Licht im Beobachtungsstrahlengang 22 an den zweiten Orten 202.
Beispielsweise repräsentiert der erste Kennwert einen Mittelwert der Intensität des Lichts im Beobachtungsstrahlengang 22 an den ersten Orten 201 und der zweite Kennwert repräsentiert den Mittelwert der Intensität des Lichts im Beobachtungsstrahlengang 22 an den zweiten Orten 202. Wenn das Beleuchtungslicht so erzeugt wird, dass das Verhältnis des ersten Kennwerts zu dem zweiten Kennwert im Wertebereich von 20/1 bis 1/20 oder einem engeren Wertebereich liegt, können die ersten Orte 201, also die fluoreszierenden Bereiche des Objekts 13, und die zweiten Orte 202, also die nicht-fluoreszierenden Bereiche des Objekts 13, annähernd gleich hell wahrgenommen werden.
Ein Beispiel des Mikroskopieverfahrens wird nachfolgend mit Bezug zu 23 erläutert. Das Beispiel betrifft ein Verfahren zur Steuerung des Mikroskopiesystems der 1, wobei die Helligkeit von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen des Objekts 13 angeglichen wird.
In Schritt S1 wird ein Bild des Objekts 13 in der Bildebene 19 mit dem Farbbilddetektor 20 aufgenommen. Das Bild ist ein Bild des durch den Beobachtungsstrahlengang 22 in der Bildebene 19 erzeugten Abbilds des Objekts 13.
21 zeigt eine schematische Darstellung eines in Schritt S1 aufgenommen Bildes 205, welches ein Bild des in 20 gezeigten Abbilds des Objekts 13 in der Bildebene 19 ist. Das Bild 205 besteht aus einer Vielzahl von Bildpunkten 206.
In Schritt S2, welcher auf Schritt S1 folgt, werden erste Bildpunkte 207 aus den Bildpunkten 206 bestimmt. Die ersten Bildpunkte 207 entsprechen den ersten Orten 201. Das Bild 205 weist an den ersten Bildpunkten 207 Farbvalenzen auf, die innerhalb des ersten Farbvalenzbereichs 211 liegen. Die ersten Bildpunkte 207 werden beispielsweise durch Vergleichen der Farbvalenzen an den Bildpunkten 206 des Bildes 205 mit dem vorbestimmten ersten Farbvalenzbereich 211 bestimmt.
In Schritt S3, welcher auf Schritt S1 folgt, werden zweite Bildpunkte 208 aus den Bildpunkten 206 bestimmt. Die zweiten Bildpunkte 208 entsprechen den zweiten Orten 202. Das Bild 205 weist an den zweiten Bildpunkten 208 Farbvalenzen auf, die innerhalb des zweiten Farbvalenzbereichs 212 liegen. Die zweiten Bildpunkte 208 werden beispielsweise durch Vergleichen der Farbvalenzen an den Bildpunkten 206 des Bildes 205 mit dem vorbestimmten zweiten Farbvalenzbereich 212 bestimmt.
In Schritt S4, welcher auf Schritt S2 folgt, wird der erste Kennwert basierend auf der Intensität des Bildes 205 an den ersten Bildpunkten 207 bestimmt. Beispielsweise wird der Mittelwert oder der Maximalwert der Intensität an den ersten Bildpunkten 207 bestimmt.
In Schritt S5, welcher auf Schritt S3 folgt, wird der zweite Kennwert basierend auf der Intensität des Bildes 205 an den zweiten Bildpunkten 208 bestimmt. Beispielsweise wird der Mittelwert oder der Maximalwert der Intensität an den zweiten Bildpunkten 208 bestimmt.
In Schritt S6, welcher folgt, wenn die Schritte S4 und S5 abgeschlossen sind, wird das Beleuchtungslicht in Abhängigkeit des ersten und zweiten Kennwerts oder in Abhängigkeit der Intensität des Lichts im Beobachtungsstrahlengang 22 in der Bildebene 19 an den ersten und zweiten Orten 201, 202 oder in Abhängigkeit der Intensität an den ersten und zweiten Bildpunkten 207, 208 eingestellt. Das bedeutet, dass die wellenlängenabhängige Intensitätsverteilung des Beleuchtungslichts geändert wird. Das Beleuchtungslicht wird dabei so erzeugt, dass das oben beschriebene Verhältnis zwischen dem ersten und zweiten Kennwert einen Wert innerhalb des vorbestimmten Wertebereichs aufweist.
Das Verfahren kann wiederholt durchgeführt werden, was durch einen Pfeil von Schritt S6 zur Schritt S1 in 23 dargestellt ist.

Claims

Mikroskopiesystem (1) zur gleichzeitigen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts (13), umfassend: eine Mikroskopieoptik (14), welche dazu konfiguriert ist, eine Objektebene (18) durch einen Beobachtungsstrahlengang (22) auf eine Bildebene (19) abzubilden; ein in dem Beobachtungsstrahlengang (22) anordenbares Beobachtungsfilter (23), wobei der Transmissionsgrad (41) des Beobachtungsfilters (23) von λ1 bis λ2 kleiner als W1 ist, von λ3 bis λ4 größer als W2=1% und kleiner als 60% ist und von λ5 bis λ6 größer als W3 ist, wobei λ1, λ2, λ3, λ4, λ5, λ6 Wellenlängen sind, für die 350 nm < λ1 < λ2 ≤ λ3 < λ4 ≤ λ5 < λ6 < 750 nm mit 440 nm < λ3 < 460 nm und 480 nm < λ4 < 620 nm gilt, und wobei W1, W2, W3 Werte sind, für die 0 < W1 < W2 < W3 < 1 gilt; eine erste Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, erstes Licht mit Wellenlängen zwischen λ1 und A2 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; eine zweite Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, zweites Licht mit Wellenlängen zwischen λ3 und λ4 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; und eine Steuerung (12), welche dazu konfiguriert ist, die erste Lichtquelle und/oder die zweite Lichtquelle individuell zu steuern, wodurch ein Verhältnis der Intensität des ersten Lichts zu der Intensität des zweiten Lichts veränderbar ist.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 1, wobei gilt: 350 nm < λ1 < 400 nm; und/oder 410 nm < A2 < 440 nm; und/oder 530 nm < λ5 < 620 nm; und/oder 650 nm < λ6 < 750 nm; und/oder W1=0,1% oder W1=0,01%; und/oder W3=90%.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei gilt: 480 nm < λ4 < 520 nm; und/oder wobei der Transmissionsgrad (41) des Beobachtungsfilters (23) von λ3 bis λ4 größer als 10% ist; und/oder wobei der Transmissionsgrad (41) des Beobachtungsfilters (23) von λ2+Δ bis λ3-Δ und von λ4+Δ bis λ5-Δ kleiner als das 0,1-fache von W1 ist, wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt; und/oder wobei die Intensität (31) des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die Intensität (32) des zweiten Lichts unterhalb von λ2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die erste Lichtquelle (5) dazu konfiguriert ist, eine spektrale Intensitätsverteilung mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 420 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 10 nm bis 20 nm zu erzeugen; und/oder wobei die zweite Lichtquelle (5) dazu konfiguriert ist, eine spektrale Intensitätsverteilung mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 440 nm bis 470 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 20 nm bis 50 nm zu erzeugen.
Mikroskopiesystem (1) zur gleichzeitigen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts (13), umfassend: eine Mikroskopieoptik (14), welche dazu konfiguriert ist, eine Objektebene (18) durch einen Beobachtungsstrahlengang (22) auf eine Bildebene (19) abzubilden; ein in dem Beobachtungsstrahlengang (22) anordenbares Beobachtungsfilter (23), wobei der Transmissionsgrad (41, 61, 81, 101, 121, 141, 161) des Beobachtungsfilters (23) von λ1 bis A2 kleiner als W1 ist, von λ3 bis λ4 größer als W2 ist und von λ5 bis λ6 größer als W3 ist, wobei λ1, λ2, λ3, λ4, λ5, λ6 Wellenlängen sind, für die 350 nm < λ1 < λ2 ≤ λ3 < λ4 ≤ λ5 < λ6 < 750 nm gilt, und wobei W1, W2, W3 Werte sind, für die 0 < W1 < W2 < W3 < 1 gilt; eine erste Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, erstes Licht mit Wellenlängen zwischen λ1 und λ2 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten, wobei die Intensität (51) des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; eine zweite Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, zweites Licht mit Wellenlängen zwischen λ3 und λ4 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten, wobei die Intensität (52) des zweiten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; eine dritte Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, drittes Licht mit Wellenlängen zwischen λ7 und λ8 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten, wobei λ7, λ8 Wellenlängen sind und λ2 < λ7 < λ8 < λ5 gilt, wobei die Intensität (53) des dritten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und eine Steuerung (12), welche dazu konfiguriert ist, die erste Lichtquelle und/oder die zweite Lichtquelle individuell zu steuern, wodurch ein Verhältnis der Intensität des ersten Lichts zu der Intensität des zweiten Lichts veränderbar ist.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 4, wobei der Transmissionsgrad (61) des Beobachtungsfilters (23) von λ3 bis λ6 größer als W3 ist.
Mikroskopiesystem (1) zur gleichzeitigen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts (13), umfassend: eine Mikroskopieoptik (14), welche dazu konfiguriert ist, eine Objektebene (18) durch einen Beobachtungsstrahlengang (22) auf eine Bildebene (19) abzubilden; ein in dem Beobachtungsstrahlengang (22) anordenbares Beobachtungsfilter (23), wobei der Transmissionsgrad (81, 101) des Beobachtungsfilters (23) von λ1 bis λ2 kleiner als W1 ist, von λ3 bis λ4 größer als W2=1% und kleiner als 5% ist und von λ5 bis λ6 größer als W3 ist, wobei λ1, λ2, λ3, λ4, λ5, λ6 Wellenlängen sind, für die 350 nm < λ1 < λ2 ≤ λ3 < λ4 ≤ λ5 < λ6 < 750 nm gilt und wobei 600 nm < λ4 < λ5 < 620 nm gilt, und wobei W1, W2, W3 Werte sind, für die 0 < W1 < W2 < W3 < 1 gilt; eine erste Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, erstes Licht mit Wellenlängen zwischen λ1 und λ2 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; eine zweite Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, zweites Licht mit Wellenlängen zwischen λ3 und λ4 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; eine dritte Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, drittes Licht mit Wellenlängen zwischen λ7 und λ8 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten, wobei λ7, λ8 Wellenlängen sind und λ2 < λ7 < λ8 < λ5 gilt; und eine Steuerung (12), welche dazu konfiguriert ist, die erste Lichtquelle und/oder die zweite Lichtquelle individuell zu steuern, wodurch ein Verhältnis der Intensität des ersten Lichts zu der Intensität des zweiten Lichts veränderbar ist.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 6, wobei gilt: 350 nm < λ1 < 400 nm; und/oder 410 nm < λ2 < 440 nm; und/oder 440 nm < λ3 < 460 nm; und/oder 480 nm < λ4 < 620 nm; und/oder 530 nm < λ5 < 620 nm; und/oder 650 nm < λ6 < 750 nm; und/oder W1=0,1% oder W1=0,01%; und/oder W3=90%.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Intensität (51) des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die Intensität (52) des zweiten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die Intensität (53) des dritten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 8, ferner umfassend ein zwischen den Lichtquellen (5) und der Objektebene (18) anordenbares Beleuchtungsfilter (9), wobei der Transmissionsgrad (102) des Beleuchtungsfilters (9) von λ1 bis λ3' und von λ4' bis λ4 größer als W3 ist und von λ3'+Δ bis λ4'-Δ und von λ4+Δ bis λ6 kleiner als W1 ist, wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt; wobei λ3', λ4' Wellenlängen sind und λ3 < λ3' < λ4' < λ4 und 480 nm < λ3' < 520 nm und 520 nm < λ4' < 550 nm und λ4'-λ3' > 20 nm gilt; und/oder wobei die Intensität (51) des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die Intensität (52) des zweiten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ4' höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die Intensität (53) des dritten Lichts zwischen λ4' und λ4 signifikant ist und unterhalb von λ3' und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt.
Mikroskopiesystem (1) zur gleichzeitigen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts (13), umfassend: eine Mikroskopieoptik (14), welche dazu konfiguriert ist, eine Objektebene (18) durch einen Beobachtungsstrahlengang (22) auf eine Bildebene (19) abzubilden; ein in dem Beobachtungsstrahlengang (22) anordenbares Beobachtungsfilter (23), wobei der Transmissionsgrad (121) des Beobachtungsfilters (23) von λ1 bis λ2 kleiner als W1 ist, von λ3 bis λ4 größer als W2 und kleiner als 5% ist, von λ4+Δ bis λ7-Δ kleiner als W1 ist, von λ7 bis λ8 größer als W2 und kleiner als 5% ist, und von λ5 bis λ6 größer als W3 ist, wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt; wobei λ1, λ2, λ3, λ4, λ5, λ6, λ7, λ8 Wellenlängen sind, für die 350 nm < λ1 < λ2 ≤ λ3 < λ4 ≤ λ5 < λ6 < 750 nm und λ4 < λ7 < λ8 < λ5 gilt, und wobei W1, W2, W3 Werte sind, für die 0 < W1 < W2 < W3 < 1 gilt; eine erste Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, erstes Licht mit Wellenlängen zwischen λ1 und λ2 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; eine zweite Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, zweites Licht mit Wellenlängen zwischen λ3 und λ4 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; eine dritte Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, drittes Licht mit Wellenlängen zwischen λ7 und λ8 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten, wobei λ7, λ8 Wellenlängen sind und λ2 < λ7 < λ8 < λ5 gilt; und eine Steuerung (12), welche dazu konfiguriert ist, die erste Lichtquelle und/oder die zweite Lichtquelle individuell zu steuern, wodurch ein Verhältnis der Intensität des ersten Lichts zu der Intensität des zweiten Lichts veränderbar ist.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 10, wobei 480 nm < λ4 < 520 nm und 520 nm < λ7 < 550 nm und λ7-λ4 > 20 nm und λ5-λ8 < 30 nm gilt; und/oder wobei die Intensität (51) des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die Intensität (52) des zweiten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ7 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die Intensität (53) des dritten Lichts unterhalb von λ4 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt.
Mikroskopiesystem (1) zur gleichzeitigen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts (13), umfassend: eine Mikroskopieoptik (14), welche dazu konfiguriert ist, eine Objektebene (18) durch einen Beobachtungsstrahlengang (22) auf eine Bildebene (19) abzubilden; ein in dem Beobachtungsstrahlengang (22) anordenbares Beobachtungsfilter (23), wobei der Transmissionsgrad (141) des Beobachtungsfilters (23) von λ1 bis A2 kleiner als W1 ist, von λ3 bis λ4 größer als W2=1% und kleiner als 5% ist, von λ4+Δ bis λ5-Δ kleiner als W1 ist, und von λ5 bis λ6 größer als W3 ist, wobei λ1, λ2, λ3, λ4, λ5, λ6 Wellenlängen sind, für die 350 nm < λ1 < λ2 ≤ λ3 < λ4 ≤ λ5 < λ6 < 750 nm gilt, wobei 440 nm < λ3 < 460 nm und 480 nm < λ4 < 520 nm und 530 nm < λ5 < 560 nm gilt; wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt; und wobei W1, W2, W3 Werte sind, für die 0 < W1 < W2 < W3 < 1 gilt; eine erste Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, erstes Licht mit Wellenlängen zwischen λ1 und λ2 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; eine zweite Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, zweites Licht mit Wellenlängen zwischen λ3 und λ4 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; eine dritte Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, drittes Licht mit Wellenlängen zwischen λ7 und λ8 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten, wobei λ7, λ8 Wellenlängen sind und λ2 < λ7 < λ8 < λ5 gilt; und eine Steuerung (12), welche dazu konfiguriert ist, die erste Lichtquelle und/oder die zweite Lichtquelle individuell zu steuern, wodurch ein Verhältnis der Intensität des ersten Lichts zu der Intensität des zweiten Lichts veränderbar ist.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 12, wobei gilt: 350 nm < λ1 < 400 nm; und/oder 410 nm < λ2 < 440 nm; und/oder 440 nm < λ3 < 460 nm; und/oder 480 nm < λ4 < 620 nm; und/oder 530 nm < λ5 < 620 nm; und/oder 650 nm < λ6 < 750 nm; und/oder W1=0,1% oder W1=0,01%; und/oder W3=90%.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 12 oder 13, wobei λ5-λ4 > 20 nm gilt; und/oder wobei das Mikroskopiesystem (1) ferner umfasst: ein zwischen den Lichtquellen (5) und der Objektebene (18) anordenbares Beleuchtungsfilter (9), wobei der Transmissionsgrad (142) des Beleuchtungsfilters (9) von λ1 bis λ4 größer als W3 ist, wobei der Transmissionsgrad (142) des Beleuchtungsfilters (9) von λ4+Δ bis λ5'-Δ kleiner als W1 ist, wobei der Transmissionsgrad (142) des Beleuchtungsfilters (9) von λ5' bis λ6' größer als W2 und kleiner als 5% ist, wobei der Transmissionsgrad (142) des Beleuchtungsfilters (9) von λ6' bis λ6 kleiner als W1 ist, wobei λ5', λ6' Wellenlängen sind und λ4 < λ5' < λ6' < λ6 gilt, wobei 530 nm < λ5' < 570 nm und 600 nm < λ6' < 620 nm gilt; und/oder wobei die Intensität (51) des ersten Lichts oberhalb von λ3 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die Intensität (52) des zweiten Lichts unterhalb von A2 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die Intensität (53) des dritten Lichts unterhalb von λ4 und oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 4 bis 14, wobei die erste Lichtquelle (5) dazu konfiguriert ist, eine spektrale Intensitätsverteilung mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 400 nm bis 420 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 10 nm bis 20 nm zu erzeugen; und/oder wobei die zweite Lichtquelle (5) dazu konfiguriert ist, eine spektrale Intensitätsverteilung mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 440 nm bis 470 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 20 nm bis 50 nm zu erzeugen; wobei die dritte Lichtquelle (5) dazu konfiguriert ist, eine spektrale Intensitätsverteilung mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 500 nm bis 560 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 40 nm bis 110 nm zu erzeugen.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8 oder 10 oder 11, wobei das Mikroskopiesystem (1) kein Beleuchtungsfilter zwischen der Objektebene (18) und den Lichtquellen (5) aufweist.
Mikroskopiesystem (1) zur gleichzeitigen Beobachtung von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Bereichen eines Objekts (13), umfassend: eine Mikroskopieoptik (14), welche dazu konfiguriert ist, eine Objektebene (18) durch einen Beobachtungsstrahlengang (22) auf eine Bildebene (19) abzubilden; ein in dem Beobachtungsstrahlengang (22) anordenbares Beobachtungsfilter (23), wobei der Transmissionsgrad (41, 61, 81, 101, 121, 141, 161) des Beobachtungsfilters (23) von λ1 bis λ2 kleiner als W1 ist, von λ3 bis λ4 größer als W2=0,5% und kleiner als 5% ist und von λ5 bis λ6 größer als W3 ist, wobei λ1, λ2, λ3, λ4, λ5, λ6 Wellenlängen sind, für die 350 nm < λ1 < λ2 ≤ λ3 < λ4 ≤ λ5 < λ6 < 750 nm gilt, und wobei W1, W2, W3 Werte sind, für die 0 < W1 < W2 < W3 < 1 gilt; eine erste Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, erstes Licht mit Wellenlängen zwischen λ1 und λ2 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; eine zweite Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, zweites Licht mit Wellenlängen zwischen λ3 und λ4 zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; eine dritte Lichtquelle (5), welche dazu konfiguriert ist, drittes Licht mit Wellenlängen zwischen λ5' und λ6' zu erzeugen und auf die Objektebene (18) zu richten; eine Steuerung (12), welche dazu konfiguriert ist, die erste Lichtquelle und/oder die zweite Lichtquelle individuell zu steuern, wodurch ein Verhältnis der Intensität des ersten Lichts zu der Intensität des zweiten Lichts veränderbar ist; und ein zwischen den Lichtquellen (5) und der Objektebene (18) anordenbares Beleuchtungsfilter (9), wobei der Transmissionsgrad (162) des Beleuchtungsfilters (9) von λ1 bis λ4 größer als W3 ist, wobei der Transmissionsgrad (162) des Beleuchtungsfilters (9) von λ5' bis λ6' größer als W2 und kleiner als 5% ist, wobei λ5', λ6' Wellenlängen sind und λ5 < λ5' < λ6' gilt.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 17, wobei der Transmissionsgrad (162) des Beleuchtungsfilters (9) von λ4+Δ bis λ5'-Δ kleiner als W1 ist, wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt; und/oder wobei der Transmissionsgrad (162) des Beleuchtungsfilters (9) von λ6' bis 750 nm kleiner als W1 ist; und/oder wobei der Transmissionsgrad (161) des Beobachtungsfilters (23) von λ4+Δ bis λ5-Δ kleiner als W1 ist, wobei 3 nm ≤ Δ ≤ 10 nm gilt.
Mikroskopiesystem nach Anspruch 17 oder 18, wobei gilt: 350 nm < λ1 < 460 nm; und/oder 460 nm < λ2 < 480 nm; und/oder 470 nm < λ3 < 490 nm; und/oder 490 nm < λ4 < 510 nm; und/oder 520 nm < λ5 < 550 nm; und/oder 680 nm < λ6 < 750 nm; und/oder 620 nm < λ5' < 650 nm; und/oder 680 nm < λ6' < 750 nm; und/oder W1=0,1% oder W1=0,01%; und/oder W3=90%; und/oder wobei die Intensität (151) des ersten Lichts oberhalb von λ5 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die Intensität (152) des zweiten Lichts unterhalb von λ3 und oberhalb von λ5' höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt; und/oder wobei die Intensität (153) des dritten Lichts unterhalb von λ4 höchstens 1% seiner maximalen spektralen Intensität beträgt.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die erste Lichtquelle (5) dazu konfiguriert ist, eine spektrale Intensitätsverteilung mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 440 nm bis 460 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 10 nm bis 20 nm zu erzeugen; und/oder wobei die zweite Lichtquelle (5) dazu konfiguriert ist, eine spektrale Intensitätsverteilung mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 500 nm bis 550 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 40 nm bis 110 nm zu erzeugen; und/oder wobei die dritte Lichtquelle (5) dazu konfiguriert ist, eine spektrale Intensitätsverteilung mit einem spektralen Emissionsmaximum im Bereich von 600 nm bis 640 nm und einer Halbwertsbreite im Bereich von 10 nm bis 20 nm zu erzeugen.
Mikroskopiesystem nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei die Steuerung (12) dazu konfiguriert ist, den Betriebsstrom und/oder die Betriebsspannung mindestens einer der Lichtquellen (5) individuell einzustellen, um hierdurch die Intensität (31, 32, 51, 52, 53, 151, 152, 153) des durch die Lichtquellen (5) erzeugten Lichts individuell einzustellen.
Verfahren zum Betreiben eines Mikroskopiesystems, insbesondere des Mikroskopiesystems (1) nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das Verfahren umfasst: Erzeugen von Beleuchtungslicht und Richten des erzeugten Beleuchtungslichts auf ein Objekt (13); Erzeugen eines Beobachtungsstrahlengangs (22), welcher das Objekt (13) in eine Bildebene (19) abbildet, wobei in dem Beobachtungsstrahlengang (22) ein Beobachtungsfilter (23) angeordnet ist; wobei das Beleuchtungslicht so erzeugt wird, dass $| \vec{W} - \vec{f} | \leq 0,2$
gilt, worin $\vec{W}$
einen Farbort eines Weißpunkts in der CIE Normfarbtafel des CIE 1931-Normvalenzsystems repräsentiert, $\vec{f}$
einen Farbort mit Koordinaten x_f , y_f in der CIE Normfarbtafel des CIE 1931-Normvalenzsystems repräsentiert, welche definiert sind durch $x_{f} = \frac{X}{X + Y + Z} {und y}_{f} = \frac{Y}{X + Y + Z},$
worin X, Y, Z Tristimuluswerte des CIE 1931-Normvalenzsystems repräsentieren, welche definiert sind durch $X = k \int I (λ) \cdot T (λ) \cdot \bar{x} (λ) \cdot d λ,$
$Y = k \int I (λ) \cdot T (λ) \cdot \bar{y} (λ) \cdot d λ,$
$X = k \int I (λ) \cdot T (λ) \cdot \bar{z} (λ) \cdot d λ,$
worin I (λ) die Intensität des Beleuchtungslichts repräsentiert, T (λ) den Transmissionsgrad (41, 61, 81, 101, 121, 141, 161) des Beobachtungsfilters (23) repräsentiert, x(λ), y(λ), z(λ) die Spektralwertfunktionen des CIE 1931-Normvalenzsystems repräsentieren und k eine Konstante ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei gilt: $| \vec{W} - \vec{f} | \leq 0,15, insbesondere | \vec{W} - \vec{f} | \leq 0,1.$
Mikroskopieverfahren, umfassend: Erzeugen von Beleuchtungslicht und Richten des erzeugten Beleuchtungslichts auf ein Objekt (13); Erzeugen eines Beobachtungsstrahlengangs (22), welcher das Objekt (13) in eine Bildebene (19) abbildet, wobei in dem Beobachtungsstrahlengang (22) ein Beobachtungsfilter (23) angeordnet ist; wobei ein erster Wert (W1), welcher einen Mittelwert des Transmissionsgrads (186, 196) des Beobachtungsfilters (23) über einen ersten Wellenlängenbereich (WLB1) repräsentiert, kleiner als ein zweiter Wert (W2) ist, welcher einen Mittelwert des Transmissionsgrads (186, 196) des Beobachtungsfilters (23) über einen zweiten Wellenlängenbereich (WLB2) repräsentiert, wobei der zweite Wert (W2) kleiner als ein dritter Wert (W3) ist, welcher einen Mittelwert des Transmissionsgrads (186, 196) des Beobachtungsfilters (23) über einen dritten Wellenlängenbereich (WLB3) repräsentiert; wobei ein vierter Wert (W4), welcher einen Mittelwert der Intensität (187, 197) des Beleuchtungslichts über den ersten Wellenlängenbereich (WLB1) repräsentiert, größer als ein fünfter Wert (W5) ist, welcher einen Mittelwert der Intensität (187, 197) des Beleuchtungslichts über den zweiten Wellenlängenbereich (WLB2) repräsentiert, wobei der fünfte Wert (W5) größer als ein sechster Wert (W6) ist, welcher einen Mittelwert der Intensität (187, 197) des Beleuchtungslichts über den dritten Wellenlängenbereich (WLB3) repräsentiert; wobei der erste, zweite und dritte Wellenlängenbereich einander nicht überlappen und jeweils zwischen 350 nm und 1000 nm liegen; und wobei der zweite Wellenlängenbereich (WLB2) ausschließlich Wellenlängen enthält, für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Absorptionsrate (184, 194) eines in dem Objekt (13) vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs höchstens 20%, insbesondere höchstens 10%, weiter insbesondere höchstens 5% beträgt und für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Emissionsrate (185, 195) des in dem Objekt (13) vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs höchstens 20%, insbesondere höchstens 10%, weiter insbesondere höchstens 5% beträgt.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 24, wobei der erste Wellenlängenbereich (WLB1) Wellenlängen enthält, für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Absorptionsrate (184, 194) eines in dem Objekt (13) vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs wenigstens 5%, insbesondere wenigstens 10%, weiter insbesondere wenigstens 50% beträgt; wobei der dritte Wellenlängenbereich (WLB3) Wellenlängen enthält, für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Emissionsrate (185, 195) eines in dem Objekt (13) vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs wenigstens 5%, insbesondere wenigstens 10%, weiter insbesondere wenigstens 50% beträgt.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei der zweite Wellenlängenbereich (WLB2) ausschließlich Wellenlängen enthält, für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Absorptionsrate (184, 194) eines in dem Objekt (13) vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs höchstens 20%, insbesondere höchstens 10%, weiter insbesondere höchstens 5% beträgt und für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Emissionsrate (185, 195) des in dem Objekt (13) vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs höchstens 20%, insbesondere höchstens 10%, weiter insbesondere höchstens 5% beträgt.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei der erste Wellenlängenbereich (WLB1) die Wellenlänge 405 nm umfasst, insbesondere Wellenlängen von 390 nm bis 420 nm umfasst; wobei der zweite Wellenlängenbereich (WLB2) Wellenlängen von 450 nm bis 600 nm umfasst; wobei der dritte Wellenlängenbereich (WLB3) Wellenlängen von 620 nm bis 720 nm umfasst.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei der erste Wellenlängenbereich (WLB1) Wellenlängen von 480 nm bis 500 nm umfasst; wobei der zweite Wellenlängenbereich (WLB2) Wellenlängen von 620 nm bis 750 nm umfasst; wobei der dritte Wellenlängenbereich (WLB3) Wellenlängen von 550 nm bis 600 nm umfasst.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei ein Verhältnis des ersten Werts (W1) zu dem zweiten Wert (W2) höchstens 1/100, insbesondere höchstens 1/1000 beträgt; und/oder wobei ein Verhältnis des zweiten Werts (W2) zu dem dritten Wert (W3) höchstens 0,9, insbesondere höchstens 0,8, weiter insbesondere höchstens 0,5, beträgt; und/oder wobei ein Verhältnis des vierten Werts (W4) zu dem fünften Wert (W5) mindestens 2, insbesondere mindestens 5, beträgt; und/oder wobei ein Verhältnis des vierten Werts (W4) zu dem sechsten Wert (W6) mindestens 1000, insbesondere mindestens 10000, beträgt.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei das Beleuchtungslicht unter Verwendung mehrerer schmalbandiger Lichtquellen (5) erzeugt wird, wobei mindestens eine der Lichtquellen (5) Licht mit Wellenlängen im ersten Wellenlängenbereich (WLB1) erzeugt und wobei mindestens eine der Lichtquellen (5) Licht mit Wellenlängen im zweiten Wellenlängenbereich (WLB2) erzeugt.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 30, wobei die Lichtquellen (5) im Wesentlichen kein Licht mit Wellenlängen im dritten Wellenlängenbereich (WLB3) erzeugen.
Mikroskopieverfahren, umfassend: Erzeugen von Beleuchtungslicht und Richten des erzeugten Beleuchtungslichts auf ein Objekt (13); Erzeugen eines Beobachtungsstrahlengangs (22), welcher das Objekt (13) in eine Bildebene (19) abbildet; wobei das Beleuchtungslicht in Abhängigkeit der Intensität des Lichts im Beobachtungsstrahlengang (22) in der Bildebene (19) an den ersten und zweiten Orten (201, 202) so eingestellt wird, dass ein Verhältnis eines ersten Kennwerts zu einem zweiten Kennwert einen Wert im Bereich von 20/1 bis 1/20 aufweist, wobei der erste Kennwert ein Wert einer Kenngröße für die Intensität von Licht des Beobachtungsstrahlengangs (22) an ersten Orten (201) in der Bildebene (19) ist, an welchen Farbvalenzen des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) innerhalb eines ersten Farbvalenzbereichs (211) eines Farbraums liegen; wobei der zweite Kennwert ein Wert der Kenngröße für die Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) an zweiten Orten (202) in der Bildebene (19) ist, an welchen Farbvalenzen des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) innerhalb eines zweiten Farbvalenzbereichs (212) des Farbraums liegen.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 32, wobei der erste Kennwert einen Maximalwert oder einen Mittelwert der Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) an den ersten Orten (201) repräsentiert, wobei der zweite Kennwert einen Maximalwert oder einen Mittelwert der Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) an den zweiten Orten (202) repräsentiert.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 32 oder 33, ferner umfassend: Bestimmen der ersten Orte (201) in der Bildebene (19), an welchen die Farbvalenzen des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) innerhalb des ersten Farbvalenzbereichs (211) des Farbraums liegen; Bestimmen der zweiten Orte (202) in der Bildebene (19), an welchen die Farbvalenzen des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) innerhalb des zweiten Farbvalenzbereichs (212) des Farbraums liegen; wobei das Beleuchtungslicht in Abhängigkeit der Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) an den bestimmten ersten Orten (201) und in Abhängigkeit der Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) an den bestimmten zweiten Orten (202) erzeugt wird.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 34, ferner umfassend: Aufnehmen eines Bildes (205) des Objekts (13) in der Bildebene (19), wobei das Bild (205) eine Vielzahl von Bildpunkten (206) umfasst; Vergleichen von Farbvalenzen an den Bildpunkten (206) des Bildes (205) mit dem ersten Farbvalenzbereich (211) und/oder mit dem zweiten Farbvalenzbereich (212); Bestimmen von ersten Bildpunkten (207) aus der Vielzahl von Bildpunkten (206) basierend auf einem Ergebnis des Vergleichs, wobei die ersten Bildpunkte (207) den ersten Orten (201) in der Bildebene (19) entsprechen und wobei Farbvalenzen an den ersten Bildpunkten (207) innerhalb des ersten Farbvalenzbereichs (211) des Farbraums liegen; und Bestimmen von zweiten Bildpunkten (208) aus der Vielzahl von Bildpunkten (206) basierend auf dem Ergebnis des Vergleichs, wobei die zweiten Bildpunkte (208) den zweiten Orten (202) in der Bildebene (19) entsprechen und wobei Farbvalenzen an den zweiten Bildpunkten (208) innerhalb des zweiten Farbvalenzbereichs (212) des Farbraums liegen.
Mikroskopieverfahren nach Anspruch 34 oder 35, ferner umfassend: Bestimmen des ersten Kennwerts basierend auf der Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) an den bestimmten ersten Orten (201); und Bestimmen des zweiten Kennwerts basierend auf der Intensität des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) an den bestimmten zweiten Orten (202); wobei das Beleuchtungslicht in Abhängigkeit des bestimmten ersten Kennwerts und in Abhängigkeit des bestimmten zweiten Kennwerts erzeugt wird.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 36, wobei das Beleuchtungslicht mittels mehrerer Lichtquellen (5) erzeugt wird, welche Licht in verschiedenen Wellenlängenbereichen erzeugen, und wobei das Erzeugen des Beleuchtungslichts umfasst: Einstellen, insbesondere Variieren, einer Energie, die wenigstens einer der mehreren Lichtquellen (5) zur Erzeugung des Beleuchtungslichts zugeführt wird, in Abhängigkeit des ersten und zweiten Kennwerts.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 37, wobei sich der erste Farbvalenzbereich (211) und zweite Farbvalenzbereich (212) nicht überlappen; und/oder wobei ein kleinster Farbabstand (214) zwischen dem ersten Farbvalenzbereich (211) und zweiten Farbvalenzbereich (212) in der CIE 1976 u'v' Farbtafel wenigstens 0,01 beträgt.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 38, wobei der erste Farbvalenzbereich (211) auf Farbvalenzen beschränkt ist, welche von Referenzfarbvalenzen in der CIE 1976 u'v' Farbtafel einen Farbabstand von höchstens 0,1 haben, wobei die Referenzfarbvalenzen Licht in einem Referenzwellenlängenbereich entsprechen, welcher ausschließlich Wellenlängen enthält, für welche eine auf ihren Maximalwert normierte Emissionsrate (185, 195) eines in dem Objekt (13) vorhandenen Fluoreszenzfarbstoffs wenigstens 5%, insbesondere wenigstens 10%, weiter insbesondere wenigstens 50% beträgt.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 39, wobei der erste Farbvalenzbereich (211) eine Farbvalenz umfasst, welche Licht mit einer Wellenlänge von 635 nm entspricht; und/oder wobei der erste Farbvalenzbereich (211) auf Farbvalenzen beschränkt ist, welche von einer Referenzfarbvalenz, welche Licht mit einer Wellenlänge von 630 nm entspricht, in der CIE 1976 u'v' Farbtafel einen Farbabstand von höchstens 0,1 haben.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 39, wobei der erste Farbvalenzbereich (211) eine Farbvalenz umfasst, welche Licht mit einer Wellenlänge von 530 nm entspricht; und/oder wobei der erste Farbvalenzbereich (211) auf Farbvalenzen beschränkt ist, welche von einer Referenzfarbvalenz, welche Licht mit einer Wellenlänge von 530 nm entspricht, in der CIE 1976 u'v' Farbtafel einen Farbabstand von höchstens 0,1 haben.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 41, wobei der erste Farbvalenzbereich (211) in der CIE 1976 u'v' Farbtafel eine Farbvalenz mit den Koordinaten u'=0,113 und v'=0,575 oder mit den Koordinaten u'=0,570 und v'=0,514 umfasst; und/oder wobei der zweite Farbvalenzbereich (212) den Weißpunkt D50 oder D65 umfasst.
Mikroskopieverfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 42, wobei das Beleuchtungslicht unabhängig von der Intensität von Licht des Beobachtungsstrahlengangs (22) an dritten Orten (203) in der Bildebene (19) erzeugt wird, wobei Farbvalenzen des Lichts des Beobachtungsstrahlengangs (22) an den dritten Orten (203) außerhalb des ersten und zweiten Farbvalenzbereichs liegen.