DE102006056929B4

DE102006056929B4 - Massenspektrometrie mit Laser-Ablation

Info

Publication number: DE102006056929B4
Application number: DE102006056929A
Authority: DE
Inventors: Evgenij Nikolaev; Jochen Franzen
Original assignee: Bruker Daltonik GmbH
Current assignee: Bruker Daltonics GmbH and Co KG
Priority date: 2006-12-04
Filing date: 2006-12-04
Publication date: 2010-09-02
Anticipated expiration: 2026-12-05
Also published as: GB2444621B; US7910881B2; GB2444621A; GB0723592D0; US20080128614A1; DE102006056929A1

Abstract

Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Oberflächenmaterial, dadurch gekennzeichnet, dass das Oberflächenmaterial an einer Abtragungsstelle durch Laserlichtpulse verdampft wird und das dampfförmige Material an einer Expositionsstelle von einer Flüssigkeit aufgenommen und mit der Flüssigkeit zu einer Ionenquelle transportiert wird.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die massenspektrometrische Untersuchung von Oberflächenmaterial durch Laser-Ablation.
Die Erfindung besteht darin, das durch Laserlichtpulse verdampfte Material durch eine offene Flüssigkeit aufzufangen und mit der Flüssigkeit einer Ionisierung, vorzugsweise durch Elektrosprühen, zuzuführen. Das Verfahren kann insbesondere für eine bildgebende Massenspektrometrie verwendet werden.
Stand der Technik
Die massenspektrometrische Untersuchung von Material auf oder in Oberflächen fester Körper hat viele Anwendungen, die von bildgebender Massenspektrometrie von Substanzverteilungen in Gewebedünnschnitten oder dünnschicht-chromatographischen Platten bis zur Analyse willkürlich aufgebrachten Analysenproben auf Probenträgern handeln kann. Für die Abtragung des Oberflächenmaterials gibt es viele verschiedene Verfahren, die teilweise auch sofort ionisieren, wie beispielsweise Vakuum-Hochfrequenzfunken (SSMS = „spark source mass spectrometry”), Ionenzerstäubung (SIMS = Sekundärionen-Massenspektrometrie) oder matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI = „matrix assisted laser desorption and ionization”). Andere Abtragungsverfahren, wie die Laser-Ablation, tragen nur Neutralmoleküle des Untersuchungsmaterials ab. Die Neutralmoleküle müssen dann einer Ionisierung unterworfen werden, beispielsweise in einem induktiv gekoppelten Plasma (ICP), in dem die Moleküle bis zu ionisierten Atomen zersetzt werden, und so die elementare Zusammensetzung des Materials der Oberfläche zu bestimmen gestatten. Das Verfahren wird beispielsweise für eine Analyse von Metallatomen in organischem Material eingesetzt. Aus der veröffentlichten Patentanmeldung US 2005/0247871 A1 ist bekannt, dass Neutralmoleküle, die in einem ersten Ionisierungsverfahren, wie z. B. MALDI, zusammen mit Ionen erzeugt werden, mittels einer Elektronenquelle durch Stoßionisation ionisiert werden. Den veröffentlichten Patentanmeldungen DE 196 08 963 A1 und US 2005/0199823 A1 kann des Weiteren entnommen werden, dass durch Laser-Ablation an Atmosphärendruck desorbierte Neutralmoleküle durch chemische Ionisierung (APCI = ”atmospheric pressure chemical ionization”) bzw. durch Kontakt mit dem Sprühnebel einer Elektrosprüheinrichtung (ESI = ”electro-spray ionization”) ionisiert werden.
In den letzten Jahren ist die bildgebende Massenspektrometrie in den Vordergrund gerückt, wobei insbesondere die matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI) als Abtragungs- und Ionisierungsmethode angewandt wird. Dazu ist es aber erforderlich, Matrixsubstanz auf die Probenoberfläche aufzutragen. Die besonders an Gewebedünnschnitten erfolgreiche Methode verlangt eine relativ dicke, sehr gleichmäßig in einzelnen Lagen als Lösung durch Sprühen aufgetragene Schicht an Matrixmaterial, um vergiftende Substanzen zurückzuhalten und Proteine zur Oberfläche zu transportieren. Ein dazu günstiges Verfahren wurde in der Patentanmeldung DE 10 2006 019 530 A1 beschrieben.
Bei diesem Verfahren ist es jedoch nachteilig, dass durch die aufgetragene Schicht an Matrixsubstanz die laterale Ortsauflösung auf bestenfalls etwa 200 Mikrometer begrenzt wird, selbst wenn es gelingt, den desorbierenden Laserstrahl feiner zu fokussieren. Damit ist es nicht möglich, in einzelne biologische Zellen hinein zu sehen und beispielsweise die Zusammensetzung einzelner Organellen zu bestimmen.
Aus anderen Anwendungen der Massenspektrometrie (wie z. B. auch der ortsaufgelösten ICP-MS in der Offenlegungsschrift DE 103 54 787 A1 ) ist es bekannt, dass sich durch elektrische Nahfelder, die beispielsweise vor den Abtastnadeln eines Atomkraft-Mikroskops (AFM = „atomic force microscope”) erzeugt werden können, eine Nahfeld-Fokussierung von Laserstrahlen erzeugen lässt, die Verdampfungskrater bis herunter zu nur etwa 30 Nanometer Durchmesser zu erzeugen erlaubt. Mit dieser lateralen Ortsauflösung von etwa 30 Nanometer lässt sich ein Volumen mit etwa 10 000 Molekülen verdampfen, wenn man ein mittleres Molekulargewicht von etwa 1000 atomaren Masseneinheiten annimmt. Mit 100 Nanometer Verdampfungskrater lassen sich etwa 300 000 Moleküle verdampfen. Diese Molekülzahlen sind für massenspektrometrische Analysen sehr gering; sie verlangen hoch wirksame Methoden für die Ionisierung und den Ionentransfer zum Massenanalysator.
Aufgabe der Erfindung
Es ist die Aufgabe der Erfindung, die mit Pulsen von Laserlicht verdampften Substanzen einer hoch wirksamen Ionisierung zuzuführen, um dann die Ionen einer massenspektrometrischen Analyse unterwerfen zu können.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung besteht darin, die Wolke der vorzugsweise unter Schutzgas in einem Laserlichtpuls von einer Abtragungsstelle auf einer Oberfläche verdampften Substanzen an einer Expositionsstelle durch eine Flüssigkeit aufzunehmen, in ihr zu lösen und mit der Flüssigkeit einer Ionenquelle zuzuführen. Die Ionenquelle arbeitet vorzugsweise durch Elektrosprühen. Für die Verdampfung kann ein linsenfokussierter Laserstrahl, aber auch ein Laserstrahl mit Nahfeld-Fokussierung verwendet werden. In der Expositionsstelle kann die Flüssigkeit offen zutage treten, oder durch eine permeable Membran oder durch einen porösen Deckel abgedeckt sein, so dass eine Lösung der verdampften Moleküle aus der Wolke stattfinden kann. Als Expositionsstelle kann beispielsweise ein Kapillarmeniskus am Ende von konzentrischen Kapillaren dienen, aber auch eine offene Stelle in Flüssigkeits-Chips. Insbesondere können Zufluss oder Abfluss der Flüssigkeit zur Expositionsstelle oder beides geregelt sein. Das Schutzgas kann die Wolke mit verdampften Material auf die Expositionsstelle zu bewegen. Besonders geeignet zur Ionisierung ist Nano-Elektrosprühen mit hoch effizientem Transfer der Ionen in das Vakuumsystem des Massenspektrometers.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die 1 bis 3 zeigen verschiedene Ausführungsformen für eine exponierte Flüssigkeitsoberfläche am Ende von konzentrischen Kapillaren für die Aufnahme der verdampften Materialien.
In 1 ist ein offener Kapillarmeniskus (6) gezeigt, der aber einer Regelung des Zu- und Abflusses bedarf, um eine konstante Form zu wahren. Der Kapillarmeniskus (6) befindet sich am Ende zweier konzentrischer Kapillaren, wobei der Zufluss (3) durch die Außenkapillare (1) und der Abfluss (5) durch die Innenkapillare (2) verläuft. Der Fluss (4) im Inneren kehrt vor dem Meniskus um und fließt in der Innenkapillare zurück.
In 2 sind die beiden Kapillaren (1) und (2) durch eine hauchdünne Membran (7) abgeschlossen. Die permeable Membran (7), beispielsweise eine Silikonmembran, kann die Substanzen der Substanzwolke lösen und an die Flüssigkeit abgeben.
In 3 sind die Kapillaren durch eine poröse oder filzartige Materialscheibe (8) verschlossen, durch die die Flüssigkeit hindurch strömt.
Die 4 zeigt schematisch, wie Material von der Oberfläche eines Festkörpers (10) durch einen Laserlichtpuls (12), der in einem Pulslaser (14) erzeugt und von einer Linse (13) auf die Stelle (11) fokussiert wird, zu einer Wolke (15) verdampft wird. Die Wolke (15) wird von einer leichten Strömung (16) eines Schutzgases auf den Meniskus (6) einer konzentrischen Kapillaranordnung nach 1 zugeblasen und dort gelöst.
5 zeigt ein Schema des Nanosprühens: aus einer Kapillarenspitze (31) wird durch ein elektrisches Ziehfeld eine Flüssigkeit (32) zunächst zu einem Taylor-Konus (33) geformt und dann als dünner Strahl (34) herausgezogen, der in verdampfende Tröpfchen (35, 36) aufgelöst zusammen mit Schutzgas (39) durch eine Düse (37) in eine Kapillare (38) eintritt und ins Vakuum eines Massenspektrometers befördert wird.
In 6 wird der Laserstrahl (12) im Nahfeld der Nadel (17) an einer Federzunge (18) eines Atomkraft-Mikroskops fokussiert, so dass der Verdampfungskrater (11) extrem klein wird.
In den 7 und 8 werden zwei Prinzipien einer Meniskus-Regelung gezeigt:
7 zeigt eine Regelung durch einer gespiegelten, äußeren Lichtstrahl, der durch einen Lichtgeber (20) erzeugt und von einem Detektor (21) detektiert wird.
In 8 wird eine innen liegende Glasfaser (22) verwendet, um Licht aus einem kombinierten Geber-Empfänger (23) zum Meniskus und gespiegelt wieder zurück zu bringen.
Beste Ausführungsformen
Eine einfache, aber sehr effektive Ausführungsform ist als Prinzipschema in 4 gezeigt. Hier wird ein Laserstrahlpuls (12) aus einem Pulslaser (14) durch eine Linse kurzer Brennweite auf die Stelle (11) fokussiert und verpufft Material von dieser Stelle. Es können dafür sowohl Infrarotlaser, Laser im sichtbaren Bereich wie auch vorzugsweise UV-Laser verwendet werden. Die zeitliche Länge des Laserlichtpulses liegt vorzugsweise bei einigen Nanosekunden, doch können auch erheblich längere Pulse verwendet werden. Die Verdampfung findet vorzugsweise bei Atmosphärendruck unter einem inerten Schutzgas statt, beispielsweise unter reinem Stickstoff. Die Verdampfungswolke (15) wird von einer leichten Strömung (16) des Schutzgases zu einem freiliegenden Meniskus (6) einer geeigneten Flüssigkeit geweht, wo sich die Substanzen der Wolke auflösen. Der Lösungsvorgang löst eine Saugwirkung aus, so dass die gesamte Wolke aufgelöst wird, soweit die Moleküle der Wolke überhaupt in der verwendeten Flüssigkeit löslich sind. Die gelösten Substanzen werden im Flüssigkeitsstrom (5) einer Nanosprüh-Einrichtung zugeführt. Die Flüssigkeit muss polarisierbar und niederviskos sein; günstig ist beispielsweise Wasser mit einem Zusatz an Methylalkohol.
Das Grundprinzip einer solchen Nanosprüh-Einrichtung ist in 5 gezeigt. Aus einer feinen Kapillarenspitze (31), die einen Öffnungsdurchmesser von nur etwa 2 bis 10 Mikrometern hat (vorzugsweise zwischen 3 und 5 Mikrometer), wird durch ein elektrisches Ziehfeld mit einer vorzugsweise negativen Spannung von rund 1000 Volt die polarisierbare Flüssigkeit (32), die die gelösten Substanzen der Verdampfungswolke enthält, zunächst zu einem Taylor-Konus (33) geformt. Aus diesem Taylor-Konus (33) wird durch das elektrische Ziehfeld ein dünner Flüssigkeitsstrahl (34) herausgezogen. Dieser Flüssigkeitsstrahl löst sich in leicht verdampfbare Tröpfchen (35, 36) von nur jeweils einigen hundert Nanometern Durchmesser auf, die zusammen mit dem vorzugsweise geheizt zugeführtem Schutzgas (39) in die Eintittskapillare (38) des Massenspektrometers eintreten. Am Eingang der Eintrittskapillare kann sich eine Düse (37) befinden. Die Tröpfchen werden in der Eintrittskapillare ins Vakuumsystem des verwendeten Massenspektrometers befördert. Die Tröpfchen können dabei im heißen Schutzgas bereits innerhalb der Eintrittskapillare verdampfen, sie können aber auch als Tröpfchen unter Bedingungen einer Bernoulli-Fokussierung im laminaren, stets die Tröpfchen beschleunigenden Schutzgasstrom bis ins Vakuumsystem fliegen und erst dort vollständig verdampfen. Diese Art der Einführung der Substanzmoleküle hat wegen der ständigen Fokussierung der Tröpfchen in die Achse hinein eine hohe Transfer-Effizienz.
Die Tröpfchen sind durch das Abziehen der Flüssigkeit an der polarisierten Oberfläche hoch geladen; sie enthalten (bei negativer Ziehspannung) sehr viele überschüssige Protonen. Beim Eintrocknen im heißen Schutzgas, das teilweise auch mit Spaltung der Tröpfchen einhergeht, wird ein Teil der Protonen auf den Substanzmolekülen abgeladen, die dadurch zu größtenteils mehrfach geladenen Ionen werden. Die Anzahl der Protonen pro Substanzmolekül hängt von der Aufnahmefähigkeit der Substanzmoleküle und damit wesentlich von deren Größe ab.
Die Substanzionen werden im Vakuumsystem in bekannter Weise dem Massenanalysator zugeführt. Es können die verschiedenen Arten von Massenanalysatoren auf der Basis von Hochfrequenz-Ionenfallen, Ionenzyklotron-Resonanz, Flugzeitmessgeräten, Quadrupol-Filtern, magnetischen Sektorfeldern oder anderen verwendet werden. Dabei können ausgewählte Substanzionen auf dem Weg zum Massenanalysator auch isoliert und fragmentiert werden, um beispielsweise eine höhere Identifizierungssicherheit zu erhalten.
Der offene Meniskus (6) am Ende der konzentrischen Kapillaren (oder in einer Expositionsstelle auf einem Flüssigkeits-Chip) muss dauernd geregelt werden. Der Abfluss kann dabei in Grenzen durch eine variable Spannung des elektrischen Ziehfeldes eingestellt werden. Der Zufluss wird in der Regel über eine Spritzenpumpe oder eine einfache Drucksteuerung gesteuert, beispielsweise durch die Höhe des Flüssigkeitsspiegels in einem Vorratsgefäß. Um den Meniskus in konstanter Form zu halten, ist aber eine Messung der Meniskusposition erforderlich, die beispielsweise durch eine optische Abtastung erhalten werden kann, wie in 7 gezeigt. Sie kann aber auch durch eine reflektierende Messung erhalten werden, die mindestens eine Glasfiber im Inneren der konzentrischen Kapillaren verwendet, wie in 8 schematisch dargestellt.
Statt der Verdampfung im linsenfokussierten Laserstrahl kann auch eine Verdampfung durch Nahfeldfokussierung verwendet werden, wie in 6 schematisch gezeigt. Ein solches Nahfeld kann durch eine Abtastnadel (17) an einer Federzunge oder Kantilever (18) eines Atomkraftmikroskops erzeugt werden. Wird die Umgebung der Spitze dieser sehr spitzen Abtastnadel (17), die auf weniger als ein Mikrometer an die Oberfläche herangeführt wird, mit einem Laserstrahl bestrahlt, so findet diese Nahfeldfokussierung statt. Bei pulsartiger Bestrahlung kann damit Material aus einem sehr kleinen Krater verdampft werden. Es lassen damit Kraterdurchmesser bis herunter zu etwa 30 Nanometer Durchmesser erzeugen. Auch hier kann das zu einer kleinen Wolke verdampfte Material durch leichte Strömung des Schutzgases der Expositionsoberfläche zugeführt werden. Da die Wolke des verdampften Materials rund das 1000-fache Volumen der festen Substanz einnimmt, erzeugt ein Krater von 100 Nanometer eine Wolke von etwa einem Mikrometer im Durchmesser, inhomogen vermischt mit etwa Schutzgas. Es muss daher eine gute Führung der Strömung des Schutzgases gewährleistet sein, um die winzige Wolke zur Expositionsoberfläche zu transportieren.
Die Expositionsfläche muss aber nicht unbedingt eine freie Flüssigkeitsoberfläche sein. Es kann die Flüssigkeit beispielsweise auch durch eine dünne Membran abgedeckt sein, wie in 2 gezeigt. Die Membran muss dann so geartet sein, dass sich mindestens ein Teil der verdampften Substanzen in ihr lösen und durch sie hindurch in die Flüssigkeit hinein permeiren kann. Die geforderte Löslichkeit und Permeation ist beispielsweise in Silikonmembranen geeigneten Polymerisierungsgrades für viele organische Substanzen gegeben und wird bereits in verschiedenen Zweigen der Massenspektrometrie als Substanzeinlass verwendet. Die Permeation von organischen Substanzen im Molekülmassenbereich von einigen Hundert Dalton ist um viele Zehnerpotenzen höher als die Permeation von Stickstoff; dieser Effekt wird zu einem vakuumtechnisch günstigen Einlass dieser Substanzen in das Vakuumsystem genutzt.
Es kann auch eine Abdeckung der Expositionsfläche durch einen porösen oder filzartigen Deckel vorgenommen werden, wobei die Flüssigkeit durch vielfache Kapillarkräfte in dem Deckel gehalten werden. 3 zeigt eine solche Anordnung. Es kann beispielsweise ein Stück Filter- oder Löschpapier verwendet werden. Die Kapillarkräfte im filzartigen Deckel können dazu genutzt werden, den Zufluss (3) der Flüssigkeit aus einem Vorratsbehälter, der gegebenenfalls unter leichtem Druck steht, automatisch so zu regeln, dass immer eine leicht feuchte Oberfläche des porösen Deckels vorhanden ist.
In Kenntnis dieser Erfindung kann der Fachmann für die jeweilige analytische Aufgabenstellung geeignete Verfahren zur Oberflächenanalyse entwickeln, insbesondere zur ortsaufgelösten Oberflächenanalyse.

Claims

Verfahren zur massenspektrometrischen Analyse von Oberflächenmaterial, dadurch gekennzeichnet, dass das Oberflächenmaterial an einer Abtragungsstelle durch Laserlichtpulse verdampft wird und das dampfförmige Material an einer Expositionsstelle von einer Flüssigkeit aufgenommen und mit der Flüssigkeit zu einer Ionenquelle transportiert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit an der Expositionsstelle eine freie Oberfläche anbietet.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit an der Expositionsstelle durch eine permeable Membran abgedeckt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flüssigkeit an der Expositionsstelle durch ein poröses Material abgedeckt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserlichtpulse durch eine Linse auf die Abtragungsstelle fokussiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Laserlichtpulse durch ein elektrisches Nahfeld auf die Abtragungsstelle fokussiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenquelle eine Elektrosprüh-Ionenquelle ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Ionenquelle eine Nanoelektrosprüh-Ionenquelle mit einem Durchmesser der Kapillarenöffnung von 2 bis 10 Mikrometern ist.