DE102008049833A1

DE102008049833A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Durchführung einer quantitativen ortsaufgelösten Lokal- und Verteilunganalyse chemischer Elemente und in-situ Charakterisierung der ablatierten Oberflächenregionen

Info

Publication number: DE102008049833A1
Application number: DE102008049833A
Authority: DE
Inventors: Sabine Dr. habil. Becker; Anne-Dorothea Dr. Müller; Myroslav Dr. Zoriy
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2008-10-01
Filing date: 2008-10-01
Publication date: 2010-04-22

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung, mit der sowohl eine quantitative ortsaufgelöste Nanolokal- und Verteilungsanalyse von Elementkonzentrationen einer Probe als auch eine mikroskopische Erfassung der Oberflächentopographie im Nanometerbereich derselben Probe durchgeführt werden kann. Die Laserablation unter Anwendung des Nahfeldeffektes des biologischen Materials der Probe erfolgt in einer mit einem ICP-MS (induktiv gekoppeltes Plasmamassenspektrometer) gekoppelten Laserablationskammer. Auf die Probenoberfläche wird ein gepulster Laserstrahl mit wenigstens 109 W/cm2 Leistungsdichte unter feldverstärkung fokussiert. Das stöchiometrisch ablatierte Probenmaterial wird in das ICP-MS transportiert und analysiert. Zur In-situ-Charakterisierung der Morphologie der Probenoberfläche vor und nach dem Materialabtrag mit Nahfeld-Laserablation wird ein modifiziertes Rastersondenmikroskop eingesetzt. Erfindungsgemäß wird bei der Vorrichtung und den genannten Verfahren eine an einen elektroakustischen Wandler im Rastersondenmikroskop montierte und in x-y-z-Richtung positionierbare Metall aufweisende Spitze eingesetzt, die sowohl für die Signalerfassung der Mikroskopie der Probenoberfläche benötigt wird, als auch für die Nahfeldverstärkung während der Laserablation eingesetzt wird.

Description

Die Erfindung betrifft einerseits ein Verfahren zur quantitativen Lokalanalyse und Verteilungsanalyse zur Bestimmung von Elementkonzentrationen und der in-situ Charakterisierung von Probenoberflächen (Topographie) vor und nach der chemischen Analyse. Ferner betrifft die Erfindung eine zur Durchführung der vorgenannten Verfahren geeignete Vorrichtung.
Stand der Technik
Als Analysenmethode zur Messung von lateralen Elementverteilungen im μm Bereich und zur Bestimmung von Spurenelementen bis in den ng/g und sub-ng/g-Konzentrationsbereich werden derzeit in der Massenspektrometrie zur direkten Ablation des zu untersuchenden festen Probenmaterials verschiedene Verfahren z. B. unter Verwendung von fokussierten Laserstrahlen angewandt. Bekannt ist beispielsweise das Verfahren der Laserablation – induktiv gekoppelten Plasmamassenspektrometrie (LA-ICP-MS) in der Spuren- und Mikrolokalanalyse. Dieses Verfahren ist nachteilig jedoch nicht in der Lage, Elementverteilungen und -konzentrationen im nanoskaligen Maßstab, insbesondere unterhalb von 1000 nm zu bestimmen, wie sie beispielsweise bei der Analyse an einzelnen Zellen oder auch Zellorganellen gefordert wird.
In zunehmendem Maße werden in der Analytik Laser, wie beispielsweise der Nd-YAG-Laser mit einer Wellenlänge im UV-Bereich (λ-266 nm oder 213 nm) eingesetzt. Diese Laser werden häufig für den Probeneintrag in nachweisstarke ICP-Massenspektrometer (LA-ICP-MS: laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry) verwendet. Zurzeit sind Nd-YAG-Lasersysteme mit einem Laserspotdurchmesser von einigen μm bis zu einigen hundert μm zur Mikrolokalanalyse kommerziell verfügbar (z. B. LSX 213, 500 CETAC Technologies, Ohama, USA oder UP 213, 266 New WAVE Research, Fremont, USA). Nachteilig reicht die Leistungsdichte solcher Lasersysteme in der Regel nicht aus, um bei einem lateralen Auflösungsvermögen der LA-ICP-MS im unteren μm-Bereich biologische Matrizes direkt mit hoher Effizienz zu ablatieren. Der begrenzende Faktor ist dabei die Beugungsgrenze, die ein Laser regelmäßig nicht unterschreiten kann. Dies bedeutet, dass die mögliche minimale Auflösungsgrenze im Bereich einer Wellenlänge des Lasers liegt. Ortsaufgelöste Analysen unterhalb von 1 μm sind daher regelmäßig gar nicht möglich.
Für viele medizinisch-molekularbiologische Fragestellungen wird jedoch ein laterales Auflösungsvermögen des zu verwendenden Analysenverfahrens von einigen hundert nm bis in den unteren nm-Bereich gefordert. Eine solche Ortsauflösung könnte dazu führen, dass eine direkte Nanolokalanalytik an einzelnen Zellorganellen durchführbar wäre, und gleichzeitig eine ortsaufgelöste Verteilungsanalytik (1D-Linescan, 2D- oder 3D-Imaging oder Mapping) im Nanometerbereich der interessierenden Elemente, wie beispielsweise Cu, Zn, S, Fe und P ermöglicht würde.
In [1] wird ein Verfahren beschrieben, das die Nahfeld-Laserablation zur Erzeugung neutraler Moleküle aus einer Antracen-Kristalloberfläche nutzt. Diese wurden über ein Interface (suction tube: 20 μm Stahlkapillare) in eine Elektronenstoßionenquelle eines Quadrupol-Massenspektrometers extrahiert. Die Laserablation des organischen Materials wurde mit Hilfe eines, die Frequenz verdreifachenden, Nd-YAG-Lasers mit einer Wellenlänge von 355 nm und mit 250 μJ Energie pro Puls durchgeführt, dessen Laserstrahl in eine speziell präparierte optische Faser mit ausgezogener Spitze für die Nahfeldoptik eingekoppelt wurde. Diese Spitze hatte eine 170 nm Apertur. Die mit Hilfe der Laserablation erzeugten Krater auf der Antracen-Kristalloberfläche wiesen dabei etwa denselben Durchmesser auf.
Die Grundlagen und Prinzipien der Nahfeld-LA-ICP-MS sind bereits in DE 103 54 787 B4 beschrieben. Der experimentelle Aufbau zur NF-LA-ICP-MS ist aus [2] bekannt. Theoretische Überlegungen und die Grundlagen des Nahfeldeffektes bei Laserablation wurden bereits in [3] zusammengefasst und diskutiert.
Genaue Berechungen auf der Basis der Maxwell-Gleichungen in der so genannten Nahfeldzone ergeben, dass es je nach der Form und den optischen Eigenschaften des Objektes eine optimale Objektgröße und eine Strahlungswellenlänge gibt, bei der der Feldverstärkungsfaktor am größten ist. Beispielsweise weist ein sphärisches Teilchen aus Silber einen maximalen Feldverstärkungsfaktor von ca. 40 an seiner Oberfläche auf, wenn es mit Licht mit einer Wellenlänge von 400 nm bestrahlt wird. Streckt man dieses Teilchen bis auf ein Achsenverhältnis von 1:4, so erhöht sich der Feldverstärkungsfaktor auf 500, wobei sich die Resonanzwellenlänge auf 575 nm verschiebt. Dabei wird vorausgesetzt, dass der elektrische Vektor der einfallenden Lichtwelle entlang der großen Hauptachse des Teilchens liegt. Einen ähnlichen Feldverstärkungseffekt kann man nicht nur bei isolierten Teilchen beobachten, sondern auch an der nm-scharfen Spitze einer Metallnadel, die mit Licht aus rotem oder infrarotem Spektralbereich bestrahlt wird, und bei der der elektrische Vektor der einfallenden Lichtwelle entlang der Spitzachse angeordnet ist.
Beträgt die eingestrahlte Laserleistungsdichte mehr als 10⁹ W/cm², so wird das Probenmaterial nahezu stöchiometrisch ablatiert. Unter einer stöchiometrischen Ablation im Sinne dieser Erfindung wird verstanden, dass die atomare Zusammensetzung des durch die Laser-Festkörperwechselwirkung entstandenen Dampfes identisch der des laserbestrahlten Festkörpers ist. Dies ermöglicht vorteilhaft eine einfache semiquantitative Analyse des Probenmaterials, wobei die Elementkonzentrationen in beliebigen Probenmaterialien mit einem Fehlerfaktor von 2 bis 3 bestimmbar sind. Bei dieser eingestrahlten Laserleistungsdichte wird die Quantifizierung der massenspektrometrischen Analysendaten wesentlich vereinfacht, da Fraktionierungseffekte in der Regel minimiert werden.
Zur Charakterisierung der Oberflächentopographie und -morphologie im Nanometerbereich werden beispielsweise in der optischen Nahfeldmikroskopie elektroakustische Sensoren eingesetzt. Ferner sind Raster-Tunnelmikroskope (STM = Scanning Tunneling Microscope) in der Lage, zerstörungsfrei und hoch auflösend die Topographie von Proben zu erfassen. Mit der Entwicklung des Atomkraftmikroskopes (AFM = Atomic Force Microscope) ist es auch möglich geworden, diese Untersuchungen auf nicht-leitfähige Proben auszuweiten. Die AFM ist heutzutage eine oft verwendete Oberflächenanalysentechnik, die es demzufolge erlaubt, mit hoher Ortsauflösung beliebige Materialien (elektrisch leitende, halbleitende oder isolierende Proben, wie z. B. auch biologische Proben) zu analysieren. Hierbei tastet eine scharfe, idealerweise in einem einzigen Atom endende Spitze die Probenoberfläche in geringem Abstand, dem so genannten Nahfeldbereich, ab. Zwischen der meist auf einem Hebelarm (Cantilever) angeordneten Spitze und dem jeweils nächstgelegenen Atom der Probenoberfläche wirken zwischenmolekulare schwache van-der-Waals-Kräfte. Die Auslenkung des Cantile vers kann dabei direkt, z. B. mittels eines Lasers, oder auch interferometrisch oder kapazitiv bestimmt werden. Heute erfolgt die Erfassung der Auslenkung oft durch direkt am Cantilever bzw. – im Nicht-Kontaktmodus – am Schwinger angeordnete, auf Verbiegung derselben ansprechende piezoelektrische Elemente.
Im völlig zerstörungsfreien so genannten Nicht-Kontaktmodus wird die Spitze eines AFM der Probenoberfläche lediglich stark angenähert, was z. B. die Möglichkeit eröffnet, auch weiche Materialien, z. B. sehr kleine biologische Proben, Zellproteine oder auch lebende einzelne Zellen mit höchster Ortsauflösung zu untersuchen. Hierbei oszilliert die Mikroskopspitze – angeregt durch einen piezoelektrischen Wandler – nahe ihrer Resonanzfrequenz. Bei Annäherung der vibrierenden Spitze an die Probenoberfläche wirken schwache Anziehungskräfte mit sehr geringer Reichweite zwischen Spitze und Probe, sogenannte van-der-Waals-Kräfte. Deren Wirkung wird gegebenenfalls durch die Oberflächenspannung von Gas- und Flüssigkeitsadsorbaten (z. B. Kohlenwasserstoffmoleküle, Wasserdampf oder kondensiertes Wasser aus der Umgebungsluft) auf der Probenoberfläche verstärkt. Die schwachen van-der-Waals-Anziehungskräfte äußern sich in einer Verringerung der Resonanzfrequenz und mit ihr in der Vergrößerung der Amplitude der Schwingung der AFM-Spitze, die beispielsweise laserinterferometrisch werden kann. Wird die Schwingungsamplitude über eine Rückkopplungselektronik während der Untersuchung von ausgewählten Oberflächenbereichen (Imaging – durch Scanning der x- und y-Koordinaten) konstant gehalten, was einer Abstands- und Kraftkonstanz entspricht, kann analog zu den vorgenannten AFM-Mikroskop-Varianten ein Oberflächenprofil der Probe aufgenommen werden. Die Ortsauflösung im Nicht-Kontaktmodus ist jedoch vor allem beim Einsatz unter Atmosphärenbedingungen durch den die Topographie-Information verfälschenden Einfluss der Adsorbatschichten auf die Schwingungsdämpfung der Mikroskopspitze meist sehr begrenzt.
Praktische Bedeutung hat vor allem der intermittierende Betriebsmodus des AFM erlangt, bei dem die Mikroskopspitze mit einer größeren Amplitude als im Nicht-Kontaktmodus vibriert. In der Nähe der Probenoberfläche wird die Oszillation infolge der dort wirkenden Kräfte gedämpft, die Amplitude wird verkleinert und die Spitze berührt die Probenoberfläche pro Messpunkt vielmals leicht. Dieses Verfahren wird auch als so genannter Tapping Modus bezeichnet. Dies erfolgt mit einem gegenüber dem Kontaktmodus wesentlich verringerten Energieumsatz, so dass auch gegen Beschädigungen anfällige Proben, wie biologische Mate rialien oder Halbleiterwafer, untersucht werden können. Die dämpfungsbedingt erniedrigte Schwingungsamplitude wird durch eine Rückkopplungselektronik konstant gehalten, so dass die mittlere z-Koordinate der Spitze der Probentopographie folgt.
Zur Charakterisierung von Probenoberflächen ist darüber hinaus auch das Nahfeld-Scanning-Mikroskop (NSOM = „Nearfeld Scanning Optical Microscope”) geeignet. Diese Methode kann in Kombination mit Atomkraftmikroskopen oder dessen Varianten verwendet werden, indem beispielsweise eine optische Faser als AFM-Spitze dient. Bei dieser Art von NSOM wird eine Probe punktweise gerastert und von Laserlicht be- bzw. durchstrahlt. Das hierzu benutzte Licht wird meist mittels eines Lichtwellenleiters an die Probe herangeführt, der an seinem Ende eine opake Schicht trägt, die eine Apertur im Subnanometerbereich aufweist. Ein Detektor registriert ortsabhängig das mit der Probe wechselwirkende Licht – z. B. im Transmissions-, Reflexions- oder Fluoreszenz-Modus – so dass die Aufnahme eines Rasterbildes der unmittelbar vor der Apertur angeordneten Probe ohne Begrenzung der Auflösung durch Beugung möglich ist.
Aufgabe und Lösung
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zu Verfügung zu stellen, welches einerseits eine qualitative Lokal- und Verteilungsanalyse im Nanometerbereich sowie gleichzeitig die quantitative Bestimmung von Elementkonzentrationen in verschiedenen Probenmaterialien ermöglicht, als auch in der Lage ist, auf einfache Weise zeitnah die untersuchte Probenoberfläche vor und nach der Analyse darzustellen und zu charakterisieren. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine zur Durchführung des Verfahrens geeignete Vorrichtung zu schaffen.
Die Aufgaben der Erfindung werden gelöst durch ein Verfahren mit der Gesamtheit an Merkmalen gemäß Hauptanspruch sowie durch eine Vorrichtung mit der Gesamtheit an Merkmalen gemäß Nebenanspruch. Vorteilhafte Ausführungen des Verfahrens und der Vorrichtung finden sich in den jeweils darauf rückbezogenen Ansprüchen.
Gegenstand der Erfindung
Ziel der erfindungsgemäßen neuen experimentellen Anordnung und des Verfahrens zur ortsaufgelösten Lokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente und der in-situ Charakterisierung von Oberflächen ist es, die Vorteile der Nahfeld-LA-ICP-MS zur Nanolokal- und Verteilungsanalyse chemischer Element mit einer mikroskopischen Anordnung, basierend auf dem Prinizip der Rasterkraftmikroskopie (AFM – atomic force microscopy), zu verbinden, um beispielsweise die zu untersuchende Probenoberfläche auf einfache Weise vor und nach der Ablation mit NF-LA-ICP-MS mikroskopisch darzustellen und zu charakterisieren.
Die Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren, bei dem ein laserinduziertes Nanoplasma zur stöchiometrischen Laserablation des untersuchten Materials eingesetzt wird. Dabei können neben beliebigen Festkörperproben auch vorteilhaft biologische Materialien untersucht werden. Unter biologischen Materialien sind dabei insbesondere Materialien in Zellorganellen (z. B. Mitochondrien), biologische Gewebeschnitte oder biologische Nanostrukturen zu verstehen. Die Laserablation des biologischen Materials erfolgt in der Regel in einer Laserablationskammer mit einem gekühlten Targethalter. Die Laserablationskammer ist vorteilhaft mit einem ICP-MS oder auch weniger empfindlichen ICP-OES (OES – optical emission spectrometry) gekoppelt. Der Beschuss der Probenoberfläche erfolgt mit Photonen eines Lasers, wobei eine Ortsauflösung (Laserspotdurchmesser) auf der Oberfläche der Probe von weniger als 1 μm, insbesondere unterhalb von 0,5 μm, und vorteilhaft sogar unterhalb von 0,1 μm, realisierbar ist. Besonders vorteilhaft wird eine Ortsauflösung sogar bis in den Bereich von 20 bis 30 nm erreicht.
Zusätzlich können aber mit diesem laserinduzierten Analysenverfahren ebenso Bulkanalysen, das bedeutet Multielementanalysen am Probenmaterial mit einem Laserspotdurchmesser im unteren μm bis zu 300 μm Bereich und Verteilungsanalysen (Imaging) der Isotope und Elemente, durchgeführt werden.
Während der analytischen Messung wird auf die Probenoberfläche ein gepulster Laserstrahl der Leistungsdichte von wenigstens 10⁹ W/cm², vorteilhaft sogar bis 10¹⁰ W/cm², mit einem Spotdurchmesser in einem weiten Bereich von einerseits 20–30 μm, bis andererseits unterhalb von 100 nm, fokussiert. Die Ortsauflösung bis in den Nanometerbereich wird erfindungsgemäß durch die Anwendung des Nahfeldeffektes bei der Laserablation ermöglicht.
Dabei wird der defokussierte Laserstrahl in der Nähe der vom Laser bestrahlten Oberfläche an einer Metall aufweisenden Spitze im Nahfeld verstärkt, die in der Nähe des auf die Oberfläche der Probe strahlenden Lasers angeordnet werden kann. Dazu ist beispielsweise eine ultrafeine ganzmetallische Spitze geeignet, die aus Gold oder Silber besteht. Durch eine solche metallische Spitze können regelmäßig Zerstörungen aufgrund der sehr hohen Laserleistung verhindert werden.
Bei einer Leistungsdichte des Lasers von wenigstens 10⁹ W/cm², vorteilhaft sogar bis 10¹⁰ W/cm², auf der Oberfläche der Probe, erfolgt die Ablation des Probenmaterials in der Laserablationskammer in der Regel stöchiometrisch. Das so ablatierte Probenmaterial wird anschließend mit einem Trägergas, beispielsweise einem Argon-Strom, in das induktiv gekoppelte Plasma (inductively coupled plasma = ICP) eines hochselektiven ICP-Massenspektrometers transportiert und ionisiert. Anschließend werden die Ionen nach ihrem Masse-zu-Ladungsverhältnis im Trennsystem des Massenspektrometers separiert und empfindlich detektiert. Eine Bestimmung der elementaren Zusammensetzung bis in den Ultraspurenbereich und eine Verteilungsanalyse des untersuchten Probenmaterials sind dabei mit diesem erfindungsgemäßen Verfahren möglich. Als alternatives Analysengerät kommt beispielsweise auch die ICP-OES in Betracht.
Weitere Details dieser Messung für die ortsaufgelöste Lokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente sind aus DE 103 54 787 A1 bekannt, deren Inhalt explizit in dieser Anmeldung als mit offenbart angesehen wird.
Zusätzlich zu dieser Messung für die ortsaufgelöste Lokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente weist das erfindungsgemäße Verfahren nur die Schritte auf, dass die untersuchte Probenoberfläche vor und/oder auch nach der erfolgten Ablation dargestellt und charakterisiert werden kann. Dazu erfolgt vor und/oder auch nach einer Ablation von Probenmaterial eine Messung der Probenoberfläche im Nanometerbereich mit einer mikroskopischen Anordnung basierend auf dem Prinzip der Rasterkraftmikroskopie (AFM – atomic force microscopy). Erfindungsgemäß muss dazu die Probe aber weder verändert oder transportiert werden, sondern kann vorteilhaft in ihrer Position auf dem Probentisch verbleiben.
Für die mikroskopische Untersuchung wird ein modifiziertes AFM mit einem elektroakustischen Wandler (atomic force sensor) im Nicht-Kontaktmodus eingesetzt, welches erfindungsgemäß dieselbe Metall aufweisende Spitze verwendet, wie sie für die Nahfeldverstärkung des Laserstrahls bei der analytischen Messung mit NF-LA-ICP-MS eingesetzt wird. Während der AFM-Messung wird zunächst die Metall aufweisende Spitze in direkte Nähe der Probenoberfläche, z. B. auf eine biologische Probe oder eine einzelne Tumorzelle, gebracht, so dass nur die van-der-Waals-Kräfte zwischen den Atomen der metallischen Spitze und den Atomen oder Molekülen wirken, die sich in Nähe der metallischen Spitze befinden. Eine geeignete Spitze könnte beispielsweise aus Silber oder Gold bestehen oder mit Silber oder Gold beschichtet sein. Bei Annäherung der vibrierenden, bzw. nahe ihrer Resonanzfrequenz oszillierenden Spitze an die Probenoberfläche wirken schwache Anziehungskräfte mit sehr geringer Reichweite zwischen Spitze und Probe, sogenannte van-der-Waals-Kräfte. Die schwachen van-der-Waals-Anziehungskräfte äußern sich in einer Verringerung der Resonanzfrequenz und mit ihr in der Vergrößerung der Amplitude der Schwingung der AFM-Spitze, die durch Messung der Änderung der Frequenz im Schwingquarz bestimmt werden kann. Alternativ kann man die Spitze auch soweit angenähert betreiben, dass eine Abnahme der Amplitude zu verzeichnen ist.
Durch definiertes Scannen der Nadel über die Probenoberfläche als Funktion der xyz-Koordinaten und durch Messung der Änderung der Frequenz im Schwingquarz kann die Oberflächentopographie der Probe vorteilhaft an gerade der Stelle abgebildet werden, an der die Ablation erfolgen soll, bzw. schon erfolgt ist.
Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung, die zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens geeignet ist. Die Vorrichtung umfasst dabei einen Laser mit einer Leistungsdichte von wenigstens 10⁹ W/cm² auf der Oberfläche einer zu analysierenden Probe, eine Laserablationskammer sowie ein nachgeschaltetes Massenspektrometer. Zur Anwendung der Nahfeldtechnik weist die Laserablationskammer eine Metall aufweisende Spitze auf, die in die Nähe des auf die Oberfläche der Probe strahlenden Lasers angeordnet werden kann. Dazu ist beispielsweise eine ultrafeine ganzmetallische Spitze geeignet. Diese besteht vorteilhaft aus Gold oder Silber. Die Spitze bewirkt vorteilhaft eine Verstärkung des elektrischen Feldes des Laserlichtes.
Die metallische Spitze ist erfindungsgemäß gleichzeitig Teil eines modifizierten Rasterkraftmikroskops, welches mit einem elektroakustischen Wandler für die Nahfeldmikroskopie ausgestattet ist. Es sind verschiedene Ausführungen von akustischen Wandlern bekannt, die jeweils Einfluss nehmen auf die Steifigkeit des Sensors, seine Resonanzfrequenz sowie auf die Ausrichtung seiner Schwingungsmoden, z. B. lateral oder vertikal.
So wird die sogenannte Tuning forke, eine miniaturisierte Stimmgabel, die lateral oder vertikal montiert werden kann, vorteilhaft in der Nahfeldmikroskopie eingesetzt. Die auf einer senkrecht montierten Stimmgabel basierende Methode zur Abstandsdetektion einer rastersondenmikroskopischen Anordnung wird auch als Scherkraftdetektion bezeichnet. Bekannt als elektroakustischer Wandler sind auch Nadelsensoren aus Quarzglas, die geometrisch anders aufgebaut sind, und auf Grund ihrer hohen Güte vorteilhaft im Ultrahochvakuum eingesetzt werden. Als einen weiteren Vertreter der elektroakustischen Wandler ist der Q-plus Sensor für Lateralkräfte, ein Cantilever aus Quarz für höchstauflösende Rasterkraftmikroskopie, zu nennen, der eine besonders hohe Steifigkeit aufweist und deswegen zur Detektion von subatomaren Strukturen eingesetzt werden kann. Ein Fachmann kann vorteilhaft je nach Fragestellung, Anwendungsgebiet und Auswerteverfahren einen dafür geeigneten elektroakustischen Wandler auswählen.
Die metallische Spitze des Rasterkraftmikroskops (AFM) mit gleichzeitiger Funktion der Nahfeldverstärkung für die Laserablation ist auf einer Vorrichtung zur Positionierung der Spitze in der Nähe der Probe angeordnet. Diese Positionierungsvorrichtung lässt sich vorteilhaft in allen drei Raumrichtungen verschieben. Die Schrittweitenauflösung sollte insbesondere bei wenigstens 2 μm liegen.
Auch der gesamte Probentisch mit der Laserablationskammer und der Positioniervorrichtung für die Spitze ist vorteilhaft auf einer 3-dimensionalen Verschiebeeinheit angeordnet, die ebenfalls eine Verschiebeauflösung von wenigstens 2 μm aufweisen sollte.
Erfindungsgemäß wird die Anordnung zur Nahfeld-Laserablation um ein spezielles hochauflösendes Mikroskop (Rasterkraftmikroskop – atomic force microscope – AFM) mit elektroakustischem Wandler (atomic force sensor) erweitert und mit diesem vorteilhaft gekoppelt, so dass vor und nach einem Probenabtrag durch die Laserablation unter Anwendung des Nah feldeffektes auch eine mikroskopische Untersuchung im Nanometerbereich an der Probenoberfläche vorgenommen werden kann. Somit können die mittels NF-LA-ICP-MS zu analysierenden Bereiche im nm-Bereich (z. B. Membranproteine in Einzelzellen) gezielt ausgewählt und auf Phosphor- oder Metallbindungen (Phosphoproteine bzw. Metalloproteine) definiert untersucht werden.
Während mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM) allein lediglich die Topographie einer Probenoberfläche räumlich aufgelöst dargestellt werden kann, können mit der Nahfeld-Laserablations-ICP-Massenspektrometrie (NF-LA-ICP-MS) essentielle und toxische Metalle (z. B. Cu, Zn, Fe, Mn, Ni, Ca, K, Mg, Ti, Co, Pb, U. Cd, Hg u. a.) oder auch Nichtmetalle (C, S, P, Cl u. a.) detektiert und quantifiziert werden. Vorteil der erfindungsgemäßen Kombination der NF-LA-ICP-MS mit AFM ist die Möglichkeit der zerstörungsfreien Analyse der Probenoberflache in-situ vor und nach der zerstörenden Laserablation. Damit lassen sich insbesondere auch neue Erkenntnisse zum Laserablationsprozess im Nahfeldbereich erzielen.
Das erfindungsgemäße Laserablationssystem unter Anwendung der nanoskaligen Nahfeldoptik in Kombination mit einem modifizierten Rasterkraftmikroskop, das mit einem hochempfindlichen ICP-Massenspektrometer (z. B. doppelfokussierendem Sektorfeld-ICP-MS oder Quadrupol-ICP-Massenspektrometer) gekoppelt ist, ist insbesondere dazu geeignet, molekularbiologische Untersuchungen mit einem Auflösungsvermögen von einigen hundert nm und darunter durchzuführen, um beispielsweise Akkumulationen oder Defizite von Metallen (Cu, Fe, Zn, Mn, Ca u. a.) in-situ in einzelnen Zellen und Zellorganellen zu erfassen, die Ursachen schwerer Erkrankungen des Menschen sein können.
Mittels der erfindungsgemäßen Nahfeld-Laserablations-ICP-Massenspektrometrie in Kombination mit der Rasterkraftmikroskopie-AFM (NF-LA-ICP-MS/AFM) kann beispielsweise über ein schnelles Scanningverfahren zur quasi-simultanen und direkten Elementanalyse eine einfache Diagnose von mitochondrialen Speichererkrankungen beim Menschen ermöglicht werden.
Spezieller Beschreibungsteil
Nachfolgend wird der Gegenstand der Erfindung anhand von zwei Figuren näher erläutert, ohne dass der Gegenstand der Erfindung dadurch eingeschränkt werden soll. Dabei zeigt die 1: Detaillierte Anordnung der Laserablationskammer mit Nahfeldverstärkung durch eine verstellbare metallische Spitze, die über einen elektroakustischen Wandler aus Quarzglas an ein AFM gekoppelt ist: in Aufsicht (a) und Vorderansicht (b).
Dabei bedeuten in der 1:

1: Laserablationskammer
2: dünne metallische Spitze aus Silber oder Gold zur Erzielung der Nahfeldverstärkung
3: Elektroakustischer Wandler (Quarzglas)
4: Positioniervorrichtung der Spitze und Vorrichtung zur Signalaufbereitung
5: x-y-z-Scanner der mit dem Probentisch verbunden ist
6: vibrationsgedämpfter Tisch
7: Probentisch zur Aufnahme der zu analysierenden Probe
8: defokussierter Laserstrahl für Nahfeld-Laserablation
9: Deckglas der Laserablationskammer
10: Trägergasstrom
11: Trägergasstrom mit gegebenenfalls ablatiertem Probenmaterial zur Einleitung ins ICP-MS

Die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einer Ablationskammer ist für die direkte Analyse von Gewebeschnitten oder einzelnen Zellen mittels NF-LA-ICP-MS in Kombination mit einer speziellen Rastersondenkraftmikroskopie (AFM) im Nahfeldbereich (Nahfeldmikroskopie) geeignet. Dabei wird die dünne Spitze, insbesondere eine Ag-Draht-Spitze, mit einem elektroakustischen Wandler (atomic force sensor) gekoppelt (siehe 1). Man ist damit in der Wahl der Steifigkeit des Sensors, seiner Resonanzfrequenz sowie der Ausrichtung seiner Schwingungsmoden (lateral und vertikal) frei und kann sich den Anforderungen der NF-LA-ICP-MS anpassen. Die Positionierung der Spitze in x-y Richtung für die Laserablation im Nahfeld und die AFM Messungen und die Signalaufbereitung der AFM Daten erfolgt über eine speziell entwickelte Steuerelektronik.
Um biologische Proben, wie Gewebeschnitte, einzelne Zellen oder Zellorganellen, direkt zu analysieren, kann der Probenhalter optional in der Laserablationskammer, beispielsweise mit einem Peltierelement gekühlt werden.
Das erfindungsgemäße Analysensystem ist insbesondere gekennzeichnet durch ein Laserablationssystem zur quantitativen ortsaufgelösten Lokal- und Verteilungsanalyse chemischer Elemente und in-situ Charakterisierung von Oberflächenstrukturen mit folgenden Eigenschaften:

– Ag-Nadel (metallische Spitze) und Mikromanipulator
– Blitzlampengepumpter Nd-YAG Festkörperlaser mit Pulsbreite < 5 ns, Wellenlänge (z. B. für Ag-Spitzen von 532 nm), Wiederholraten von bis zu 20 Hz und gausförmigem transversalen Strahlenprofil. Die minimal benötigte Laserleistungsdichte des defokussierten Laserstrahls beträgt 10⁵–10⁶ W/cm². Durch Anwendung des Nahfeldeffektes erhöht sich die Laserleistungsdichte auf 10⁹–10¹⁰ W/cm².
– Echtzeit Probenbeobachtung mit Hilfe eines Zoommikroskops, einer CCD Kamera und einer Bildbearbeitungssoftware während des Ablationsprozesses (erforderliche Auflösung < 2 μm)
– 3-dimensionale Probenpositionierung mit einer Auflösung von < 2 μm.
– Einsatz eines zusätzlichen, stark vergrößernden optischen Mikroskops (< 500 ×) außerhalb der Strahlachse zur Feinpositionierung der Nanospitze.
– Ablationskammer mit Eintrittsfenster für Laserstrahlung, Beobachtung und Mikromanipulatorversteller. Die dünne Silbernadel ist an einen elektroakustischen Wandler (Quarzglas) montiert, der mit einer Steuerelektronik zur Positionierung der Spitze in x-y-Richtung für die Laserablation und Mikroskopie der Probenoberfläche im Nahfeld und zur Signalaufbereitung verbunden ist.

Alle Eintrittsfenster der Laserablationskammer sind abgedichtet.
Die Quantifizierung der Analysenresultate der erfindungsgemäßen NF-LA-ICP-MS kann über bekannte Quantifizierungsstrategien, beispielsweise unter Verwendung von zertifizierten Standardreferenzmaterialien oder Matrix-angepasster Laborstandards oder mit Hilfe der Isotopenverdünnungsanalyse erfolgen.
Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung ist die quantitative intra- und extrazelluläre Elementverteilung in gesunden und pathologischen Zellen und Geweben mit gleichzeitiger rastersondenmikroskopischen Untersuchung im Nahfeldbereich der Probenoberfläche vor und nach der Laserablation. Zudem sind aber auch Nanolokalanalyse an beliebigen Festkörperproben mit hoher Ortsauflösung, wie beispielsweise in der Mikroelektronik, der Werkstoffforschung, der Geologie oder auch der Umweltanalytik, möglich.
Die erfindungsgemäße Analysenmethode eignet sich vorteilhaft insbesondere für folgende Anwendungsbeispiele:

• Nanolokal- und ortsaufgelöste Verteilungsanalyse an Gewebeschnitten (z. B. von Hirnproben zum Studium neurodegenerativer Erkrankungen) und Zellorganellen (z. B. Mitochondrien) mittels NF-LA-ICP-MS.
• Nanolokal- oder Verteilungsanalyse an Festkörperoberflächen (z. B. S-Layer, Nanocluster, Nanodrähte, Mikro- und Nanoarrays) an Interfaces oder an dünnen Schichten (Mikro- und Nanoelektronik, Materialforschung).
• Nanolokal- oder Verteilungsanalyse an biologischen Proben (z. B. an sehr kleinen Ausschnitten pflanzlichen und tierischen Gewebes), medizinischen Proben (Zähnen, Knochen, Haare u. ä.) oder auch an geologischen Proben (Einschlüsse, Inhomogenitäten).

In der Anmeldung zitierte Literatur:

[1] R. Stöckle et al., "Nanoscale Atmospheric Pressure Laser Ablation Mass Spectrometry", Anal. Chem. 73, 2001, 1399–1402.
[2] M. V. Zoriy, M. Kayser, J. S. Becker, „Possibility of nano-local element analysis by near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS): New experimental arrangement and first application", International Journal of Mass Spectrometry 273 (2008) 151–155.
[3] J. S. Becker, A. Gorbunoff, M. Zoriy, A. Izmer, M. Kayser, "Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometer scale for elemental and isotopic analysis an gels and biological samples", J. Anal. At. Spectrom., 2006, 21, 19–25.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

- DE 10354787 B4 [0006]
- DE 10354787 A1 [0021]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- R. Stöckle et al., ”Nanoscale Atmospheric Pressure Laser Ablation Mass Spectrometry”, Anal. Chem. 73, 2001, 1399–1402 [0043]
- M. V. Zoriy, M. Kayser, J. S. Becker, „Possibility of nano-local element analysis by near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (LA-ICP-MS): New experimental arrangement and first application”, International Journal of Mass Spectrometry 273 (2008) 151–155 [0043]
- J. S. Becker, A. Gorbunoff, M. Zoriy, A. Izmer, M. Kayser, ”Evidence of near-field laser ablation inductively coupled plasma mass spectrometry (NF-LA-ICP-MS) at nanometer scale for elemental and isotopic analysis an gels and biological samples”, J. Anal. At. Spectrom., 2006, 21, 19–25 [0043]

Claims

Verfahren zur Analyse von Elementkonzentrationen und zur topographischen Charakterisierung einer Probe mit Hilfe der Laserablation – induktiv gekoppelten Plasmamassenspektrometrie (LA-ICP-MS) und der Rasterkraftmikroskopie (AFM), dadurch gekennzeichnet, – dass die eingestrahlte Laserleistungsdichte des Lasers auf der Probenoberfläche wenigstens 10⁹ W/cm² beträgt, – dass der Laserstrahl in der Nähe der vom Laser bestrahlen Oberfläche der Probe an einer Metall aufweisenden Spitze im Nahfeld verstärkt wird, wozu die Metall aufweisende Spitze in der Nähe des Spots des auf die Oberfläche der Probe fokussierten Laserstrahls positioniert wird, und – dass vor und/oder nach der Laserablation mit Hilfe derselben Metall aufweisenden Spitze als Teil des AFM die Topographie der Probenoberfläche erfasst wird.
Verfahren nach vorhergehendem Anspruch 1, bei dem der Laserstrahl auf einen Spotdurchmesser von weniger als 10 μm, insbesondere von weniger als 1 μm, und vorteilhaft von weniger als 100 nm, fokussiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, bei dem eine Metall aufweisende Spitze aus Silber oder Gold eingesetzt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die Topographie der Probenoberfläche im zerstörungsfreien Nicht-Kontaktmodus erfasst wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Metall aufweisende Spitze an einen elektroakustischen Wandler montiert ist, und über eine Positionierungsvorrichtung oberhalb einer Probe mit einer Verschiebeauflösung von weniger als 2 μm in allen drei Raumrichtungen positioniert werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die Signalaufbereitung des AFM über die Metall aufweisende Spitze erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem mit einer Steuerelektronik sowohl die Positionierung der Spitze in x-y Richtung für die Laserablation im Nahfeld als auch für die mikroskopische Untersuchung der Probenoberfläche im Nahfeld erfolgt.
Vorrichtung zur Analyse von Elementkonzentrationen und zur topographischen Charakterisierung einer Probe umfassend – einen gepulsten Nd-YAG-Laser, – eine Laserablationskammer mit einem Probentisch, – eine ICP-MS Analyseneinrichtung, – ein Rastersondenmikroskop mit einer Metall aufweisenden Spitze, – eine Positionierungsvorrichtung zur Positionierung dieser Spitze, wobei diese Spitze in der Laserablationskammer angeordnet ist und derart mit der Positioniervorrichtung verbunden ist, dass sie während des analytischen Betriebs der Vorrichtung zur Nahfeldverstärkung des Laserstrahls in der Nähe des Spots des auf die Oberfläche der Probe fokussierten Laserstrahls positioniert werden kann und während des mikroskopischen Betriebs in x-y-z Richtung über die Oberfläche der Probe bewegt werden kann.
Vorrichtung nach Anspruch 8, mit einer Gold- oder Silberspitze als Metall aufweisende Spitze.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 9, bei dem das AFM einen elektroakustischen Wandler aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, bei der die Metall aufweisende Spitze auf einer Positionierungsvorrichtung angeordnet ist, die in allen drei Raumrichtungen eine Verschiebeauflösung von weniger als 2 μm aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, bei der die Positionierungseinrichtung für die Spitze mit der Signalaufbereitung des AFM verbunden ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, bei der die Laserablationskammer mit dem Probentisch sowie die Positionierungsvorrichtung für die Spitze auf einer 3-dimensionealen Verschiebeeinheit angeordnet sind, die eine Verschiebeauflösung von wenigstens 2 μm aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, bei der der Laser im Nahfeld der Spitze eine Leistungsdichte von wenigstens 10⁹ W/cm² aufweist.