DE2141387A1

DE2141387A1 - Verfahren zur auf mikrobereiche beschraenkten verdampfung, zerstoerung, anregung und/oder ionisierung von probenmaterial sowie anordnung zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE2141387A1
Application number: DE2141387A
Authority: DE
Inventors: Gerwin Dr Ing Franzen; Franz Dr Hillenkamp; Raimund Dr Kaufmann; Ernst Dr Remy
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1971-08-18
Filing date: 1971-08-18
Publication date: 1973-02-22
Also published as: DE2141387B2; DE2141387C3; US3813544A

Description

Verfahren zur auf Mikrobereiche beschränkten Verdampfung,

Zerstörung, Anregung und/oder Ionisierung von Probenmaterial soitfie Anordnung zur Durchführung des Verfahrens

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur auf Mikrobereiche beschränkten Verdampfung, Zerstörung, Anregung und/oder Ionisierung von Probenmaterial mittels kohärenter elektromagnetischer Strahlung, die durch ein optisches System auf die Probe fokussiert wirdo

Ein derartiges Verfahren kann entweder zum Erzeugen bestimmter gewünschter und zu untersuchender Veränderungen und Zerstörungen an der Probe selbst oder zum Erzeugen einer Emission von Atomen und Molekülen des Probenmate-

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rials im geladenen oder ungeladenen Zustand dienen, die dann mit weiteren Nachweismethoden, z.B. Massenspektrometrie, weiter analysiert werden. Anordnungen zur Durchführung eines solchen Verfahrens und Prinzipüberlegungen über seine Anwendbarkeit sind aus der OS 1 598 632 bekannt. Verhältnismäßig problemlos ist die Anwendung eines solchen Verfahrens dann, wenn es sich um stark absorbierendes Probenmaterial handelt und außerdem an die Kleinheit des zu analysierenden Bereichs keine besonders grossen Anforderungen gestellt werden.

Der Erfindung liegt jedoch die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der genannten Art auf biologisches Probenmaterial anzuwenden und dabei Untersuchungen im subzellulären Bereich durchzuführen. Es soll also ein "Strahlenstichverfahren" geschaffen werden, mit dem aus kleinsten, wohl definierten Bereichen von biologischen Mikrostrukturen, z.B. Zellen bzw. Zellenbestandteilen, Materie entfernt werden kann, wobei entweder die hierdurch hervorgerufenen Veränt derungen und Zerstörungen und ihr Einfluß auf den betreffenden Mikroorganismus Gegenstand der Untersuchung sind (z.B. "Genchirurgie" und ähnliche Anwendungsgebiete) oder die Zusammensetzung des emittierten Materials gemessen und dadurch Aufschluß über die Verteilung bestimmter Substanzen innerhalb der Zellen gewonnen wird. Beispiele für solche

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Untersuchungen sind z.B. die allgemeine Erforschung der Lebens- und Stoffwechselvorgänge und Transportmechanismen innerhalb der Zelle und ihre Steuerung durch Enzyme, die an Substrukturen der Zelle wie Membranen, Mitochondrien, Lysosomen und Myofilamente gebunden sind. Insbesondere interessiert dabei die subzelluläre Verteilung der für die Enzymtätigkeit wichtigen aktivierenden oder hemmenden Ionen (z.B. Na , K , Mg⁺) und ihre Ortsveränderungen. Ionenverteilungen innerhalb der Zelle spielen auch eine erhebliche Rolle bei der Erforschung von Herzmuskelerkrankungen, Nierenerkrankungen, in der Krebsforschung und dergleichen. Schließlich können auch allgemeine Erkenntnisse über die Wirksamkeit bekannter oder neuer Pharmaka durch Untersuchung der Verteilung des betreffenden Wirkstoffs innerhalb, der Zelle gewonnen werden =

Der Amrendung des eingangs genannten Verfahrens- auf diesem Aufgabengebiet stehen erhebliche Schwierigkeiten entgegen. Erfolgreiche Versuche, das Verfahren entsprechend anzupassen und diese Schwierigkeiten zu überwinden, sind bisher nicht bekannt geworden. Eine HauptSchwierigkeit besteht dann, wenn das Absorptionsvermögen biologischen Probenmaterials für die anregende Laserstrahlung sehr gering ist, insbesondere wenn es sich um mikroskopisch beobachtbare Dünnschichtpräparate mit Zellflüssigkeit enthaltendem Zellenmaterial handelt. Ein zweites

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Hauptproblem besteht in der Forderung nach äußerst kleinen Abmessungen des von der Laserstrahlung tatsächlich erfaßten und zur Emission bzw. Verdampfung von Material angeregten Bereiches. Für die Untersuchung subzellulärer Strukturen sollte die Abmessung dieses Bereiches in allen Richtungen maximal zwischen 1 und 2 μ, vorzugsweise aber unter 1 μ bis zu wenigen Zehnteln μ liegen. Einerseits gelangt man bei der Fokussierung Von Laserstrahlung auf derart kleine Bereiche bereits an die Grenze des durch Beugung und Wellenlänge gegebenen Auflösungsvermögens des optischen Systems, und andererseits wäre das Volumen eines derart kleinen Bereiches um mindestens zwei Grössenordnungen kleiner als die bei bisherigen Versuchen zur Laser-Verdampfung von Probenmaterial erfaßten Volumina, und entsprechend nimmt die Zahl der emittierten und nachweisbaren Ionen ab.

Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Erkenntnis, daß bei Erhöhung der Leistungsdichte im Fokus eines Laserstrahls die Absorption in schwach absorbierendem Probenmaterial wie z.B. biologischem Material, sich in einem verhältnismäßig engen Intervall sprunghaft erhöht, dessen Lage und Breite von dem betreffenden Material und der verwendeten Wellenlänge abhängen kann. Während man unterhalb der betreffenden Grenze praktisch

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fehlende Absorption und kaum Emission von Atomen oder Ionen des Probenmaterials beobachtet, tritt oberhalb der Grenze eine sehr starke Absorption mit praktisch vollständiger Materialzerstörung ein.

Erfindungsgemäß ist nun ein Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gekennzeichnet, daß man zur Beeinflussung von biologischem Probenmaterial und Erzielung einer unter Zellengröße liegenden Ausdehnung des angeregten Bereiches der Probe die Leistungsdichte der Strahlung derart einstellt, daß sie im Fokus im Beugungsmaximum nullter Ordnung oberhalb, im Beugungsmaximum erster Ordnung dagegen unterhalb der Grenze liegt, bei der die sprunghafte Steigerung der Absorption im Probenmaterial eintritt.

Man erzielt hierdurch den Vorteil, daß man einerseits im Fokus im zentralen Beugungsscheibchen sehr starke Absorption und dementsprechend eine starke Emission von ungeladenen und geladenen Teilchen des Probenmaterials erhält und daß andererseits diese starke Absorption auf das zentrale Beugungsscheibchen beschränkt ist, während bereits im Beugungsmaximum erster Ordnung und in allen weiteren Beugungsringen praktisch keine Absorption der Strahlung mehr eintritt und das Probenmaterial somit unbeeinflußt bleibt. Hierdurch ist es möglich, die Abmes-

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sungen des Areals, von dem Material aus der Probe austritt, sehr stark zu verkleinern und zwar noch unter die Grenze, die sich theoretisch nach den Gesetzen der Beugungsoptik für die Größe des Fokus ergibt. Erst hierdurch wird die Anwendung des·Verfahrens für die Untersuchung biologischen Probenmaterials im subzellulären Bereich möglich. Voraussetzung hierfür ist die Tatsache, daß die sprunghafte Erhöhung der Absorption so ausgeprägt ist, daß es möglich ist, das Austreten von Material nur im nullten, nicht aber im ersten Beugungsmaximum erfolgen zu lassen. Bei sorgfältiger Justierung und Konstanthaltung der Leistungsdichte kann es sogar möglich sein, die starke Absorption auf einen kleinen Bereich im Mittelpunkt bzw. Maximum des zentralen Beugungsscheibchens zu begrenzen, wodurch das Auflösungsvermögen noch weiter gesteigert werden kann.

Es wurde allerdings gefunden, daß beim Arbeiten in dem genannten Bereich der Leistungsdichte die Gefahr auftritt, daß sich die auf das zentrale Beugungsscheibchen konzentrierte Anregung und Aufheizung des Probenmaterials durch Sekundärprozesse, insbesondere vermutlich Stoßwellen, selbsttätig im Probenmaterial ausbreitet und zu einer explosionsartigen Vergrößerung des von der Abtragung und Verdampfung erfaßten Bereiches führt. Dieser Gefahr kann durch geeignete Wahl der Wellenlänge und/oder

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der Impulsdauer der verwendeten Laserstrahlung entgegengewirkt werden.

Vorzugsweise sollte die Leistungsdichte im Fokus im Beugungsmaximum nullter Ordnung oberhalb, im Beugungsmaximum erster Ordnung unterhalb einer Grenze liegen, die für übliches biologisches Probenmaterial und für normale

7 9/2 Laserwellenlängen bei etwa 10 bis 10 W/cm liegt und sich für das jeweils vorliegende Probenmaterial und die benutzte "Wellenlänge durch einfache Versuche ermitteln läßt.

Um einerseits die Absorption der verwendeten Strahlung im Probenmaterial zu erhöhen und dadurch mit geringeren Leistungsdichten"arbeiten zu können und um andererseits einen Fokus mit nach den Beugungsgesetzen kleineren Abmessungen zu erzielen, arbeitet man vorzugsweise mit einem im UV-Bereich emittierenden Laser oder einem Laser, dessen Strahlung durch Frequenzverdoppelung bzw. durch 'nichtlineare Effekte in den UV-Wellenlängenbereich transponiert wird.

Das Arbeiten in dem genannten Bereich der Leistungsdichte ist zwar besonders vorteilhaft im Hinblick auf die f" rohr kleiner Anregungsbereiche. Dabei kann je-

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doch der Nachteil auftreten, daß das Energiespektrum der vermutlich durch verschiedene Prozesse wie Verdampfung, Stoßionisation, Feldemission, den angeregten Bereich verlassenden geladenen Teilchen äußerst breit gezogen ist. Es reicht von 0 bis über 1000, bei mehrfach geladenen Ionen auch bis über 2000 eV. Es ist kaum ein Massenspektrometer bekannt, welches Ionen mit einem derartig breiten Energiespektfum aufnehmen und verarbeiten kann. Es wäre deshalb eine Vorselektion nach Energie notwendig, was einen starken Verlust an Nachweiswahrscheinlichkeit mit sich bringen würde. Um diese Schwierigkeit wenigstens teilweise auszuschalten, ist gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung vorgesehen, daß man auf das Probenmaterial ein elektrisches und/oder magnetisches Feld zur Bremsung und Energiekonzentrierung der austretenden Ionen einwirken läßt. Hierzu kann man beispielsweise ein elektromagnetisches Hochfrequenzfeld verwenden. Besonders vorteilhaft ist es, wenn man die Probe direkt im Magnetfeld eines nachgeschalteten Massenspektrometers anordnet. Dieses Magnetfeld kann insbesondere dazu dienen, die zu Beginn des Verdampfungsprozesses aus dem Probenmaterial austretenden Elektronen in ihrer Bewegung so zu beeinflussen, daß dadurchderen nachbeschleunigende Wirkung auf die nachfolgenden Ionen ausgeschaltet wird. Weiterhin können diese Felder zur Ionisation von noch vorhandenen Neutralgasanteilen beitragen oder zur Führung der geladenen Teilchen in das

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Massenspektrometer. Ferner ist es möglich, die Energieverteilung der emittierten Ionen durch optimale Wahl von Impulsdauer und Wellenlänge günstig zu. beeinflussen.

Die Erfindung betrifft auch eine Anordnung zum Durchführen des genannten Verfahrens mit einem Laser, einer die Laserstrahlung fokussierenden Optik, einer im Fokus angeordneten Probe und einem das emittierte Probenmaterial auffangenden Massenspektrometer. Eine solche Anordnung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß die Probe im Magnetfeld des Massenspektrometers oder einem diesem vorgeschalteten Magnet- und/oder Hochfrequenzfeld angeordnet ist.

Vorzugsweise dient das Objektiv eines zur visuellen Beobachtung der Probe angeordneten Mikroskops gleichzeitig als fokussierende Optik für die seitlich in das Mikroskop eingeleitete Laserstrahlung.

Gemäß der Erfindung werden vorzugsweise biologische Proben mit die Zellflüssigkeit noch enthaltenden Zellen untersucht. Mikroskopische Dünnschichtproben derartigen Materials können nur im tiefgeforenen Zustand hergestellt werden, und deshalb ist vorzugsweise die Anordnung mit einer Einrichtung zur Probentiefkühlung ausgerüstet. Dabei kommt es bei den erfindungsgemäß zu untersuchenden

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biologischen Proben darauf an, sie nach extrem schneller Tiefkühlung, die außerhalb der Apparatur erfolgt, und nach Überführung in die Apparatur weiterhin wirksam und vor allem in allen Bereichen gleichmäßig zu kühlen. Hierzu genügt in der Regel eine Kühlung lediglich der Probenhalterungnicht, und es muß eine sehr wirksame und direkte Kühlung der Probe vorgenommen werden. Erfindungsgemäß wird hierzu vorgeschlagen, den Raum zwischen der Probe bzw. einem die Probe berührenden Fenster und dem die Laserstrahlung fokussierenden Objektiv mit einer insbesondere zirkulierenden Kühlflüssigkeit auszufüllen, die aufgrund ihrer optischen Eigenschaften gleichzeitig als Immersionsmedium wirkt. Geeignete Kühlflüssigkeiten, die einen ausreichend niedrigen Dampfdruck haben, noch bei sehr tiefen Temperaturen flüssig bleiben und für UV-Licht durchlässig sind, sind fluorierte Kohlenwasserstoffe, insbesondere Frigen 23· Durch diese Verwendung eines Kühlmittels als Immersionsflüssigkeit werden die Probe und auch das Objektiv so wirksam gekühlt, sq daß der Entstehung von Temperaturgradienten zwischen Probe, Probenhalterung und Objektiv entgegengewirkt wird.

Bei einer anderen Anordnung kann das durch eine Kühlflüssigkeit gekühlte Objektiv zusammen mit der Probe im

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Vakuumraum angeordnet sein.'Auch in diesem Fall wird die Wärmeleitung vom Objektiv her ausgeschaltet.

Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Anordnung mit Zusatzeinrichtungen für zusätzliche Messungen ausgerüstet, z.B. zum Messen von UV-Tieftemperatur-Lumineszenz sowie mit spektrophotometrischen Einrichtungen zur Messung von Absorption, Fluoreszenz, Streuung und/oder Phasendrehung von sichtbarem oder unsichtbarem Licht..

Um den extrem kleinen wirksamen Brennfleck der Laserstrahlung exakt auf eine gewünschte Stelle der Probe, z.B. eine bestimmte Zellensubstruktur, richten zu können, ist es vorteilhaft, eine Einrichtung vorzusehen, die es ermöglicht, vor Auslösung eines Laserimpulses den betreffenden Bereich der Probe exakt in den Brennfleck des Laserlichtes einzustellen, wobei wegen der außerordentlich geringen Schärfentiefe die Einstellung außer in den X-und Y-Koordinaten der Probenebene auch in der dazu senkrechten Z-Richtung erfolgen muß. In vorteilhafter weiterer Ausgestaltung der Erfindung ist deshalb eine kontinuierlich brennende Lichtquelle für sichtbares Licht vor der die Laserstrahlung fokussierenden Optik derart angeordnet, daß diese einen als Zielmarkierungen dienenden sichtbaren Brennfleck erzeugt, der mit dem Brennfleck des Laserlichtes nach Lage und Schärfenebene zusammenfällt. Insbe-

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sondere kann die Lichtquelle ein kontinuierlich betriebener Laser mit.geringer Leistungsdichte sein, dessen Strahlengang derart mit dem des Haupt- oder Leistungslasers zusammenfallen kann, daß er auch'zur VorJustierung des Hauptlasers dienen kann.

Bei tiefgekühlten Proben sind die Zellen und ihre Substrukturen. ortsfest, so daß für das Einstellen mit dein Hilfsbrennfleck und das anschließende manuelle Auslösen des Laserimpulses ausreichend Zeit zur Verfügung steht. In manchen Fällen, insbesondere zur Anwendung des Strahlenstichs bei lebenden Zellorganismen, muß mit ungekühlten Proben gearbeitet werden, bei denen die zu erfassenden Zellen oder Mikroorganismen in der sie umgebenden Flüssigkeit frei beweglich sind und teils aufgrund der Braunschen Molekularbewegung und teils durch ihre eigenen Fortbewegungsorgane außerordentlich schnelle Ortsveränderungen durchführen. Die Zeit, in der eine solche biologische MikroStruktur durch den Zielbrennfleck läuft, ist dann meistens kürzer als die bis zur Auslösung des Laserimpulses erforderliche menschliche Reaktionszeit. Um eine automatische Auslösung des Laserimpulses zu bewirken, wird erfindungsgemäß die unterschiedliche Lichtstreuung an den zu beobachtenden Mikrostrukturen und dei* sie umgebenden Flüssigkeit ausgenutzt. Hierzu sind ein oder mehrere, vor und/oder hinter der Probe angeordnete

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Photoempfänge für an der Probe gestreutes Licht der Hilfslichtquelle und eine von den Photoempfängen gesteuerte Auslösevorrichtung für die Laserimpulse vorgesehen.

Die Erfindung vri.rd im folgenden anhand der Zeichnungen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt eine Prinzipskizze der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Fig. 2 zeigt schematisch die Wirkungsweise des Verfahrens an einer mikrobiologischen Probe.

In Fig. 1 ist mit 1 eine Lasereinrichtung üblicher und im Handel erhältlicher Art bezeichnet, bestehend aus Leistungslaser, Laseroptik, Frequenzverdoppler bzw. nichtlineares optisches Element, Blenden usw. Durch den Frequenzverdoppler kann die Wellenlänge der Laserstrahlung in den UV-Bereich verlegt werden. Der Laser arbeitet im Impulsbetrieb, wobei die Impulsdauer je nach Art des Probenmaterials und des gewünschten Anregungs- oder Zerstörungseffektes im Bereich von με oder ns liegen kann. Sehr kurze Impul^cse im Bereich von 20 ns und darunter kann man durch sogenannte Poekels-Zellen steuern.

Die Laserstrahlung wird z.B. seitlich in ein Mikros-

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kop 2 eingeleitet und durch einen Spiegel 3 zum Objektiv 2b des Mikroskops gelenkt. Das Objektiv 2b befindet sich in einer Kühlflüssigkeit 4, die durch eine (nicht dargestellte) Kühleinrichtung zirkuliert und dort z.B. mit flüssigem Stickstoff ständig auf eine tiefe Temperatur von z.B. 77° K gekühlt wird. Diese das Objektiv 2b kühlende Flüssigkeit 4 wirkt gleichzeitig aufgrund ihrer optischen Eigenschaften als Immersionsflüssigkeit zur Vergrößerung der numerischen Apertur des Mikroskops. Als Kühl- und Immersionsflüssigkeit kann insbesondere Frigen 23 verwendet werden.

Die vom Objektiv 2b fokussierte Laserstrahlung gelangt durch ein Fenster 6 in eine Vakuumkammer 5» in der durch (nicht dargestellte) Einrichtungen ständig ein hohes Vakuum aufrechterhalten wird. In der Vakuumkammer befindet sich die zu untersuchende Probe 7 auf einer tiefgekühlten Probenhalterung 7a. Eine Verbindungsstange zu einem (nicht dargestellten) Probenmanipulator zum Verschieben der Probenhalterung 7a ist durch eine Vakuumdurchführung 9 aus der Vakuumkammer 5 herausgeführt und weist ferner eine Verbindung 11 zu einem Kühlmittel 12 auf. Während bei der dargestellten Ausführungsform die Probe 7 ausschließlich durch die Probenhalterung 7a gekühlt wird, kann die Anordnung auch so getroffen werden, daß die Probe 7 in direktem Kontakt am Vakuumfenster 6

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anliegt, so daß die Kühlung auch direkt durch die Kühl- und Imrnersionsflüssigkeit 4 stattfindet.

Die Laserstrahlung wird durch das Objektiv 2b auf die Probe 7 fokussiert. Durch die Laserstrahlung werden aus der Probe 7 geladene und ungeladene Atome und" Moleküle verdampft bzw. durch direkte Emission herausgeschlagen. Die geladenen Teilchen -werden mittels eines unterhalb der Probe angeordneten Massenspektrometers 15 mit Nachweisdetektor 16, z.B. Sekundärelektronenvervielfacher, empfangen und hinsichtlich ihrer Masse analysiert.

Um die emittierten geladenen Teilchen energiemäßig zu homogenisieren und um gegebenenfalls ungeladene Teilchen nachträglich zu ionisieren, kann eine Vorrichtung zur Erzeugung eines magnetischen, elektrischen und/oder Hochfrequenzfeldes vorgesehen sein, die durch eine Spule 8 im Innern der Vakuumkammer 5 angedeutet ist. Eine weitere felderzeugende Einrichtung 18 außerhalb der Vakuumkammer 5 kann die Wirkung unterstützen. Statt dieser Anordnung mit einer besonderen Einrichtung zur Erzeugung eines Feldes kenn die Vorrichtung auch so ausgestaltet nein, daß die Probe 7 direkt im Magnetfeld des Massenr;oektrometer-a 15 angeordnet ist.

\"ie'< C(Ji-C untorhal.b der Probe 7 nngeordne be Hilfs-

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und Nachweiseinrichtungen sind ein Monitor 13, bestehend aus einem Kollektor oder Sekundärelektronenvervielfacher, zur Überwachung einer gleichmäßigen Emissionsrate von der Probe, eine Beleuchtungseinrichtung 14 für die mikroskopische Beobachtung der Probe im Hellfeld, Dunkelfeld, mit Phasenkontrast usw., sowie eine Vorrichtung 17 (die hinter der Beleuchtungseinrichtung 14 nach hinten ausgestellt zu denken ist) zur Beobachtung der Lumineszenz. Ferner kann ein (nicht dargestellter) Monitor zur Überwachung der Konstanz der Laserstrahlung vor und/oder hinter der Probe angeordnet sein.

Die Einrichtungen 13, 14, 15 und 17 können beispielsweise an einer schwenkbaren Revolverhalterung austauschbar angeordnet sein und wahlweise in ihre Betriebsstellung eingeschwenkt werden.

Bei Betrieb der Vorrichtung wird folgendermaßen vorgegangen: Durch zirkulierende Kühlflüssigkeit 4 wird das Objektiv 2b gekühlt. Die Probe wird in einer getrennten Vorrichtung in Form eines tiefgekühlten, wasserhaltigen Schnitts hergestellt, und zwar mit Hilfe der Kryotomietechnik und unter Anwendung einer so raschen Abkühlung, daß keine die Zellstrukturen zerstörende Kristallbildung eintritt. Die Probe wird durch Kühlung der Probenhalterung 7a sowie gegebenenfalls durch Kontakt am gekühlten

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Vakuumfenster 6 auf der erforderlichen Tieftemperatur gehalten. Durch Beobachtung durch das Okular 2a des Mikroskops 2 wird nun der zu untersuchende Bereich der Probe unter das Objektiv 2b eingestellt. Sodann wird die von der Einrichtung 1 erzeugte Laserstrahlung, ζ,B. in Impulsen von 20 ns oder kürzer, auf die gewünschte Stelle der Probe gerichtet. Beispielsweise zeigt Fig. 2 einen Ausschnitt aus einer Probe mit roten Blutkörperchen 20, die einen Durchmesser von etwa 8 μ haben. Die Leistungsdichte im Fokus des Laserstrahls verteilt sich zu etwa 96% auf das zentrale Beugungsmaximum 21, zu ca. 3% auf das Beugungsmaximum erster Ordnung 22 und zu weniger als Λ% auf die restlichen, zu vernachlässigenden Beugungsringe.

Die Absorption der Laserstrahlung in dem organischen Probenmaterial ist bei geringer Leistungsdichte äußerst gering, d.h. nahezu null, und steigt bei zunehmender Leistungsdichte zunächst innerhalb eines verhältnismäßig engen Intervalls, dessen Mitte - je nach Probenmaterial

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und Wellenlänge - im Bereich von ca. 10 - 10 W/cm liegen kann, sprunghaft an„ Dieser Bereich der sprunghaften Zunahme ist so eng, daß es möglich ist, die Leistungsdichte im zentralen Beugungsmaximum 21 höher und im Beugungsmaximum erster Ordnung 22 niedriger zu wählen-,, Bs findet dann nur im zentralen Beugungsmaximum 21 Absorption und eine Zerstörung und Verdampfung des Probenmate-

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rials statt. Auf diese Weise können Bereiche 23, 24, 25 des Probenmaterials untersucht v/erden, die außerordentlich eng begrenzt sind. Je knapper die Leistungsdichte im zentralen Beugungsmaximum 21 oberhalb der Sprunggrenze liegt, desto kleiner wird der Durchmesser der entstehenden Krater, und er kann in günstigen Fällen bis zu 0,1 μ m und darunter erreichen.

Vor dem Auslösen eines Laserimpulses muß durch Verschieben des Probenträgers die gewünschte, zu untersuchende oder zu beeinflussende Stelle der Probe in den Brennfleck der Optik eingestellt werden. Dies gilt nicht nur für die Einstellung in den X- und !»Koordinaten in der Probenebene, sondern auch die Einstellung in der dazu senkrechten Z-Richtung muß wegen der durch die große numerische Apertur sehr geringen Schärfentiefe (ca. 0,1 μη) sehr genau erfolgen. Als Hilfsmittel hierfür dient eine Hilfslichtquelle 26, die aus einer einfachen Lampe, vorteilhafterweise aber aus einem kontinuierlich betriebenen und mit sichtbarem Licht arbeitenden Laser (z.B. He-Ne-Laser) besteht. Von der Hilfslichtquelle ausgehendes paralleles bzw. parallelgerichtetes Licht wird durch einen Spiegel 27 in den Strahlengang des impulsweise arbeitenden Lasers 1 gelenkt und fällt dann mit diesem zusammen, so daß sein vom Mikroskopobjektiv erzeugter Brennfleck an derselben Stelle und in derselben Schärfenebene liegt wie

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der des Lasers 1. Dieser Brennfleck ist im Blickfeld des Mikroskops vom Okular 2a her durch den hallodurchlässigeri Spiegel 3 sichtbar und dient nach Art eines Fadenkreuzes als Marke für die Einstellung auf eine gewünschte Stelle der Probe. Kriterium für die richtige Einstellung einer Zellsubstruktur in der Z-Richtung ist dabei im wesentlichen die deutlich ansteigende Intensität des reflektierten bzw. gestreuten Lichts, die dann eintritt, wenn sich im Brennfleck eine Zelle oder Zellensubstruktur anstelle von durchsichtiger Probenflüssigkeit befindet.

Dieser Effekt läßt sich auch für eine automatische Auslösung der Laserimpulse ausnutzen. Hierzu sind oberhalb und/oder unterhalb der Probe, z.B. an den mit 28 und 29 bezeichneten Stellen, d.h. außerhalb des direkten Strahlengangs, ein oder mehrere Photoempfänger angeordnet, die für die Strahlung der Hilfslichtquelle 26 vorzugsweise selektiv empfindlich sind. An die Photoempfänger ist ein Steuergerät 30 angeschlossen. Gelangt eine der in der Probenflüssigkeit schwimmenden Mikrostrukturen in den Brennfleck der Hilfslaserstrahlung, und steigt dadurch die von den Photoempfängern 28 bzw. 29 empfangene Streustrahlung über einen nach Erfahrung einzustellenden Schwellenwert an, so löst das Steuergerät 30 einen Impuls des Lasers 1 aus.

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Der Hilfslaser 26 kann außer zum Zielen im Betrieb auch zum Vor justieren der Vorrichtung verwendet werden."

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Claims

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Patentansprüche

1J Verfahren zur auf Mikrobereiche beschränkten Verdampfung, Zerstörung, Anregung und/oder Ionisierung von Probenmaterial mittels kohärenter elektromagnetischer Strahlung, die durch ein optisches System auf die Probe fokussiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Mikroanalyse von biologischem Probenmaterial und Erzielung einer unter Zellengröße liegenden Ausdehnung des angeregten Bereichs der Probe die Leistungsdichte der Strahlung derart einstellt, daß sie im Fokus im Beugungsmaximum nullter Ordnung oberhalb, im Beugungsmaximum erster Ordnung dagegen unterhalb der Grenze liegt, bei der die sprunghafte Steigerung der Absorption im Probenmaterial eintritt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, . dadurch gekennzeichnet, daß die Leistungsdichte im Beugungsmaximum nullter Ordnung oberhalb, im Maximum erster Ordnung

7 9/2 unterhalb einer zwischen 10 und 10 W/cm liegenden

Grenze liegt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man mit von einem Rubin-

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laser mittels Frequenzverdoppelung bzw. nichtlinearer
optischer Effekte erzeugter kohärenter Strahlung im UV-Wellenlängenbereich oder einem im UV emittierenden Laser arbeitet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 mit
massenspektrometrischer Analyse des emittierten Probenmaterials, dadurch gekennzeichnet, daß
man auf das Probenmaterial ein elektrisches und/oder magnetisches Feld einwirken läßt, das zur Bremsung, Energiekonzentrierung, Nachionisation und Führung in das Massenspektrometer der austretenden Ionen dient.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein elektromagnetisches HF-Feld verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe im Magnetfeld des Massenspektrometers anordnet.
7. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 6, mit einem Laser, «iner die Laserstrahlung fokussierenden Optik, einer in der Schärfenebene der Optik angeordneten Probe und einem das emittierte Probenmaterial auffangenden Massenspektrometer, dadurch g e -

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kennzeichnet, daß der Laser (1) mit einem die Strahlung in den UV-Bereich transponierenden Frequenzverdoppler oder nichtlinearen Element ausgerüstet oder ein im UV emittierender Laser ist, und daß die Probe (7) im Magnetfeld des Massenspektrometers (15) oder einem diesem vorgeschalteten magnetischen, elektrischen oder HF-Feld angeordnet ist.
8. Anordnung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Objektiv eines zur visuellen Beobachtung der Probe geeigneten Mikroskops gleichzeitig als " fokussierende Optik für die in das Mikroskop eingeleitete Laserstrahlung dient.
9. Anordnung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Einrichtungen zur Tiefkühlung der Probe ausgerüstet ist.
10. Anordnung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie mit Zusatz- g einrichtungen für zusätzliche Messungen, insbesondere Messungen über Absorption, Streuung, Fluoreszenz und/oder Phasendrehung von sichtbarem oder unsichtbarem Licht an der Probe, ausgerüstet ist.
11. Anordnung nach einem der Ansprüche 7 bis 10,

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gekennzeichnet durch Anordnung einer als Immersionsflüssigkeit dienenden, insbesondere zirkulierenden Kühlflüssigkeit (4) zwischen dem Objektiv (2b) und der Probe (7) bzw. einem diese abdeckenden Fenster (6).
12. Anordnung nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das gekühlte Objektiv (2b) zusammen mit der Probe (7) in einem Vakuumraum (5) angeordnet ist.
13. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch Anordnung einer kontinuierlich betriebenen Lichtquelle (26) für sichtbares Licht vor der die Laserstrahlung fokussierenden Optik (2b) derart, daß diese einen als Zielmarkierung dienenden sichtbaren Brennfleck erzeugt, der mit dem Brennfleck für die Laserstrahlung nach Lage und Schärfenebene zusammenfällt.
14. Anordnung nach Anspruch 13, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die Lichtquelle (26) ein kontinuierlich betriebener Laser geringer Leistungsdichte ist.
15. Anordnung nach Anspruch 13 oder 14, gekennzeichnet durch einen oder mehrere, vor und/oder hinter der Probe angeordnete Photoempfänger (28, 29) für an der Probe gestreutes Licht der Lichtquelle (26), sowie

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durch eine von den Photoempfänger (28, 29) gesteuerte Auslösevorrichtung (30) für die Impulse des Leistungslasers (1).

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