DE102004025726A1

DE102004025726A1 - Verwendung eines spezifischen K252a-Derivats für die Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, die durch eine pathologische Hyperphosphorylierung und eine Aggregation von Tau Proteinen in neurofibrillären Knäueln charakterisiert sind

Info

Publication number: DE102004025726A1
Application number: DE102004025726A
Authority: DE
Inventors: Hanno Roder
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-05-26
Filing date: 2004-05-26
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2024-05-27
Also published as: US20070232584A1; WO2005117550A3; AU2005249460A1; JP5068164B2; CA2568213C; US20120149685A1; CA2568213A1; AU2005249460B2; US8003631B2; EP1824462A4; EP1824462A2; DE102004025726B4; JP2008502602A; WO2005117550A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer spezifischen Indolocarbazol-Verbindung der allgemeinen Formel 1 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung einer neurodegenerativen und/oder demenziellen Erkrankung, die durch die molekulare Pathologie des Mikrotubuli-assoziierten Taus bestimmt wird, wie der Alzheimerschen Krankheit, der Frontallappendemenz, der Pickschen Krankheit, dem Parkinsonismus mit Demenz, der corticobasalen Degeneration, der Argyrophilic Grains Disease oder der supranuklearen Palsy. Ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung solcher Krankheiten wird ebenfalls beschrieben. Darüber hinaus werden ein Verfahren zur Identifizierung wirksamer Inhibitoren der neurofibrillären Degeneration und zwei Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten Dosierung eines Inhibitors der PHF-artigen Tau-Hyperphosphorylierung zur Behandlung einer Erkrankung, die durch neurofibrilläre Degeneration charakterisiert ist, beschrieben.

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer spezifischen Indolocarbazol-Verbindung der allgemeinen Formel 1 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung einer jeden neurodegenerativen und/oder demenziellen Erkrankung, die durch die molekulare Pathologie des Mikrotubuli-assoziierten Taus (im folgenden als „Tauopathie" bezeichnet) bestimmt wird. Weiterhin werden ein Verfahren zur Identifizierung wirksamer Inhibitoren der neurofibrillären Degeneration sowie zwei Verfahren zur Bestimmung einer angemessenen Dosierung eines Inhibitors der Paired Helical Filament-artigen Tau-Hyperphosphorylierung in vitro zur Behandlung einer durch neurofibrilläre Pathologie charakterisierten Krankheit beschrieben.
Es ist jetzt weithin dokumentiert, daß abnormale Proteinphosphorylierung mit der pathologischen Aggregation des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau in einem gemeinhin als neurofibrilläre Degeneration bezeichneten neurodegenerativen Prozess eng verknüpft ist, höchst wahrscheinlich sogar auf kausale Weise. Die entsprechenden Krankheiten, die gegenwärtig etwa 22 häufige als auch sehr seltene Indikationen umfassen, wie die Alzheimersche Krankheit (AK), Frontallappendemenz (auch als Frontotemporale Degeneration, FTD), corticobasale Degeneration (CBD), Picksche Krankheit (PK), Parkinson Krankheit mit Demenz (PDD), supranucleare Palsy, Argyrophilic Grains Disease (AGD), als auch eine Reihe noch nicht mit einem häufig verwendeten Namen benannte seltenerer Krankheiten, haben die intrazelluläre Bildung neurofibrillärer Tangles (NFT) in verschiedenen neuronalen Populationen des menschlichen Gehirns gemein, die mit der Symptomatology funktionell korreliert sind. Unabhängig von der klinischen Ausprägung bestehen neurofibrilläre Tangles ultrastrukturell ausnahmslos entweder aus Paired Helical Filaments (PHF) oder, weniger häufig, aus Straight Filaments (SF). Molekular bestehen Paired Helical Filaments ausschließlich aus Mikrotubuli-assoziierten Tau-Proteinen in einem abnormal hyperphosphorylierten Zustand, der in der normalen Zellbiologie niemals vorkommt. In diesem pathologischen Phosphorylierungszustand sind Tau-Proteine auch nicht in der Lage sich an Mikrotubuli (MT) zu binden und ihre normale physiologische Funktion der Mikrotubuli-Stabilisierung und Neuron-spezifischen Organisation des Zellskeletts und des Mikrotubuliabhängigen Transports zu erfüllen.
Die dominante Bedeutung der neurofibrillären Degeneration in durch neurofibrilläre Tangles charakterisierten klinischen Indikationen, insbesondere beim gleichzeitigen Auftreten pathologischer Merkmale, wie in der klassischen Form der Alzheimerschen Krankheit, war lange vermutet worden, blieb aber schwierig nachzuweisen, da Tauopathien ausschließlich im menschlichen Gehirn auftreten. Klarheit wurde endgültig geschaffen durch die Entdeckung, daß bestimmte Tauopathien durch Mutationen im Tau-Protein verursacht werden, und daß dieselben Mutationen in der Lage waren, letale neurodegenerative Phänotypen in Tautransgenen Mäusen auszulösen. Unabhängig davon, ob Paired Helical Filaments beim Menschen mit oder ohne Mutationen, oder bei Mäusen mit Mutationen auftreten ist, ist in jedem Falle die gleiche Form der pathologischen Hyperphosphorylierung von Tau (PHF-tau) sehr früh im Prozess mit ihrer Bildung assoziiert. Dadurch sind starke Hinweise gegeben, daß die PHF-tau Hyperphosphorylierung ein gemeinsamer Vorläuferprozess für die neurofibrilläre Degeneration unabhängig von der Etiologie ist. Daher ist es sehr wahrscheinlich, daß therapeutische Substanzen, die in diesen biochemischen Vorgang der pathologischen Phosphorylierung eingreifen, z.B. durch Inhibition der entsprechenden Kinasen, zur Behandlung von Tauopathien wirksam sind.

Inhibitoren von Kinasen, die zur Gruppe der glykosylierten Indolocarbazole gehören, sind in Hinblick auf die Hemmung verschiedener Kinase im letzten Jahrzehnt besondere Aufmerksamkeit geschenkt worden. Die hervorstechendsten Vertreter dieser Klasse sind die natürlichen Alkaloidprodukte Staurosporin und K252a. Diese und mehrere andere Derivate wurden hauptsächlich für therapeutische Verwendungen bei verschiedenen Krebsindikationen untersucht. In einigen wenigen Fällen wurden auch Indikationen im Zentralnervensystem (ZNS) erwogen, wie z.B. das spezifische K252a-Derivat CEP-1347 für die Parkinsonsche Krankheit (PD) aufgrund seiner hemmenden Aktivität beim JNK Pfad über die MLK-Targets (multi-lineage kinase) [Maroney et al., J. Biol. Chem., 276, 25302-8 (2001)]. Unabhängig von ihrer Kinase-inhibitorischen Wirkung wurden bestimmte K252a-Derivate wegen ihres offenbaren Neurotrophin Agonismus auch bei neurodegenerativen Krankheiten als nützlich angesehen [z.B. WO 95/07911].

Bis jetzt liegt nur eine Offenlegung für spezifische niedermolekulare Kinaseinhibitoren vor, die in einem zellulären Modell die Tau-Hyperphosphorylierung inhibieren können. Bestimmte Derivate synthetischer Analoga von K252a, die im Unterschied zu den meisten anderen im Stand der Technik beschriebenen Verbindungen dieser Strukturklasse nicht über den Naturstoff zugänglich sind, zeigten eine nützliche Potenz und Wirksamkeit und bei der Verhinderung der PHF-tau-Hyperphosphorylierung [WO 00/01699]. Jedoch wiesen diese Verbindungen kein hohes Maß an Kinase-Spezifität auf; vielmehr wurde anscheinend mehr als eine Kinase inhibiert. Zudem waren durch die Synthese nur Verbindungen in racemischer Form zugänglich.

WO 97/05140 beschreibt ein breites Spektrum modifizierter K252a-Derivate, wobei wenige Verbindungen aufgrund ihrer PKC inhibitorischen Wirkung für therapeutische Verwendungen für Immunsuppression und bei zellproliferativen Erkrankungen (Krebs) beispielhaft angegeben werden.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß Verbindungen der allgemeinen Formel 1 für die potente und wirksame Hemmung der authentischen PHF-tau-Hyperphosphorylierung und Inhibition der neurofibrillären Degeneration geeignet sind, eine spezifische Verwendung, die bislang für diese Verbindungen nicht bekannt war.

Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung einer Indolocarbazol-Verbindung der allgemeinen Formel 1 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon

wobei
R₁ entweder COOR (R = H, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl) oder CONHR₄ (R₄ = H, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl) ist, vorzugsweise CONHR₄, wobei R₄ stärker bevorzugt H oder Methyl ist;
R₂ und R₃ unabhängig voneinander H, F, Methyl, OH, NH₂ oder NR₅R₆ (mit R₅ und R₆ unabhängig voneinander H oder Methyl), vorzugsweise H sind; und
Z entweder (H,H) oder O ist, vorzugsweise (H,H);
für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung einer neurodegenerativen und/oder demenziellen Erkrankung, welche durch die molekulare Pathologie des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Taus bestimmt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen der allgemeinen Formel 1 in Form ihrer pharmazeutisch verträglichen Salze verwendet. Jedes pharmazeutisch verträgliche Salz kann verwendet werden. Bevorzugte Salze sind Hydrochlorid-, Sulfat-, Mesylat-, und p-Toluolsulfonsäure-Salze.

Eine weitere Ausführungsform ist ein Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer neurodegenerativen und/oder demenziellen Erkrankung, die von der molekularen Pathologie des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau bestimmt ist, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel 1 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon, an ein Subjekt, daß einer solchen Behandlung bedar, umfasst

wobei:
R₁ entweder COOR (R = H, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl) oder CONHR₄ (R₄ = H, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl) ist;
R₂ und R₃ unabhängig voneinander H, F, Methyl, OH, NH₂ oder NR₅R₆ (mit R₅ und R₆ unabhängig voneinander H oder Methyl) sind; und
Z entweder (H,H) oder O ist.

Als eine weitere Ausführungsform wird ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der neurofibrillären Degeneration und ihrer Wirksamkeit beschrieben, umfassend:

i. Inkubation von metabolisch aktivem Hirnschnittgewebe aus dem Gehirn eines Säugers mit Kandidatenverbindungen in verschiedenen Konzentrationen;
ii. Provokation der Tau-Hyperphosphorylierung mit einem PP2A-Inhibitor;
iii. Quantifizierung von Tau-Phosphoepitopen im Gewebe oder in Gewebsextrakten mittels einer immunchemischen Methode; und
iv. Vergleich der Phosphoepitopprovokation in dem Hirnschnittgewebe, das unterschiedlichen Konzentrationen der Inhibitorverbindung ausgesetzt war, mit der von unbehandeltem Kontrollgewebe.

In der vorliegenden Erfindung werden Okadeinsäure und Calyculin, insbesondere Okadeinsäure, als Beispiele für PP2A-Inhibitoren angeführt.

Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten Dosierung eines Inhibitors der Paired Helical Filaments-artigen Tau-Hyperphosphorylierung zur Behandlung einer Erkrankung, die durch die neurofibrilläre Pathologie charakterisiert ist, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

i. Titration des Inhibitors in durch einen PP2A-Inhibitor stimulierten Hirnschnitten zur Bestimmung der wirksamen Gewebskonzentrationen; und
ii. pharmakokinetische Bewertung des Verabreichungsschemas zur Erzielung der effektiven Konzentrationen im Zentralnervensystem des Subjekts.

Es wird auch ein Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten Dosierung eines Inhibitors der Paired Helical Filaments-artigen Tau-Hyperphosphorylierung zur Behandlung einer Erkrankung, die durch die neurofibrilläre Pathologie charakterisiert ist, offenbart, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:

i. Bestimmung des normalen Spiegels eines Paired Helical Filaments-artigen Tau-Phosphoepitops in der zerebrospinalen Flüssigkeit von gesunden Kontrollsubjekten der gleichen Altersgruppe;
ii. Steigern der Dosierung eines Inhibitors bei einem einzelnen unter einer Form von neurofibrillärer Degeneration leidenden Subjekt in Intervallen von mehreren Wochen oder Verabreichen steigender Dosen eines Inhibitors an getrennte Subjekte;
iii. immunchemische Bewertung der Verringerung des Paired Helical Filaments-artigen Tau-Phosphoepitops in der zerebrospinalen Flüssigkeit des gleichen Subjekts unmittelbar vor Beginn der Behandlung und nochmal nach mehreren Wochen kontinuierlicher Dosierung des Inhibitors; und
iv. Vergleich des Spiegels von Paired Helical Filaments-artiger Tau-Phosphoepitope in zerebrospinaler Flüssigkeit vor und nach Beginn der Behandlung eines unter einer Form von neurofibrillärer Degeneration leidenden individuellen Subjekts, und Bestimmung der Dosis als effektive Dosis, bei der der Spiegel des Paired Helical Filaments-artigen Tau-Phosphoepitops in den Bereich reduziert wurde, der bei gesunden Kontrollen der gleichen Altersgruppe vorkommt.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel 1 lösen ernsthafter Probleme, die mit ungünstigen physikochemischen Eigenschaften, die mit den in WO 00/01699 offenbarten Inhibitoren der Tau-Hyperphosphorylierung assoziiert sind, welche deren Verwendung für pharmazeutische Zwecke limitieren. Die Strukturklasse der Indolocarbazole im allgemeinen ist sehr bekannt für Probleme im Hinblick auf Löslichkeit, Formulierung und Bioverfügbarkeit. Demgegenüber zeigen Verbindungen der allgemeinen Formel 1 bessere Löslichkeit, orale Bioverfügbarkeit und Blut-Hirnschranken-Penetration als vorher für entsprechende Derivate von K252a berichtet, wobei die letztgenannte Eigenschaft von besonderer Wichtigkeit für die Behandlung von Tauopathien im Zentralnervensystem ist.

Ebenso wichtig sind die pharmakoökonomischen Verbesserungen und die zusätzliche Sicherheit, die durch die offenbarten Verbindungen bereitgestellt wird, im Vergleich zu jenen, die in [WO 00/01699] beschrieben sind, wodurch ein bequemer synthetischer Zugang zu den relevanten reinen Enantiomeren möglich ist.

Unter den Verbindungen der allgemeinen Formel 1 sind die Verbindungen der Formeln 2 und 3 in der dem natürlichen (–)-K252a entsprechenden absoluten Konfiguration bevorzugt aufgrund ihrer Kombination von Eigenschaften, die bei der Behandlung von Krankheiten, die durch neurofibrilläre Degeneration charakterisiert sind, nützlich sind, als auch aufgrund der bequemen Zugänglichkeit.

Herstellung der Verbindungen

Die Verbindungen der allgemeinen Formel 1 können aus kommerziell erhältlichem Staurosporin erhalten werden, z.B. unter Verwendung der in WO97/05140 beschriebenen Verfahren und von allgemein anerkannten chemischen Umsetzungen funktioneller Gruppen, die im Kontext der Derivatisierung von Indolocarbazolen im Stand der Technik [z.B. WO94/02488] offenbart sind. Diese Dokumente sind durch Bezugnahme hier aufgenommen. Multigramm Mengen der bevorzugten Verbindung der Formel 3 werden durch Reaktion des entsprechenden Carboxymethylderivats der Verbindung der allgemeinen Formel 1 (R₁ = COOCH₃, dargestellt wie in WO97/05140) mit Methylamin in Tetrahydrofuran hergestellt. Alternativ kann das Carboxymethylderivat zuerst unter alkalischen Bedingungen gemäß WO97/05140 hydrolysiert werden und dann in der Gegenwart eines Kondensationsreagens, z.B. 1,1'-Dicarbonyldiimidazol, mit Methylamin in Tetrahydrofuran umgesetzt werden. Um die Löslichkeit in Vehikeln zur oralen Applikation in jeglichem in vivo Experiment zu verbessern, kann die Verbindung der Formel 3 in der Salzform überführt werden, z.B. als Hydrochloridsalz, durch Zugabe der erforderlichen Mengen der entsprechenden Säure zu einer Lösung der Verbindung der Formel 3 in Tetrahydrofuran, gefolgt vom Abdampfen des Lösungsmittels.

Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der neurofibrillären Degeneration und ihrer Potenz/Wirksamkeit:

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der neurofibrillären Degeneration und deren Wirksamkeit bereit. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

Im Schritt (i) können metabolisch aktive Hirnschnitte durch Entnahme von Hirngewebe, vorzugsweise Hippocampi, aus frisch geopferten adulten Ratten und Präparation der Schnitte mit einem Gewebechopper erhalten werden. Nach der Erholung, z.B. in einem physiologischem Puffer mit niedriger Calciumkonzentration, können die Schnitte dann im gleichen Puffer aber in Gegenwart von physiologischen Calciumkonzentrationen mit der Kandidatverbindung, vorzugsweise einer Verbindung der allgemeinen Formel 1, in verschiedenen Konzentrationen, z.B. im Bereich von 30 nM bis 10 μM bei 34 bis 37°C für beispielsweise 15 min vorinkubiert werden. Danach wird Schritt (ii) durch Zugabe eines PP2A-Inhibitors, z.B. für mindestens 1 Stunde, durchgeführt. Vorzugsweise wird Okadeinsäure bei einer Konzentration von 1 μM verwendet. Im Schritt (iii) können die Schnitte mit einem nicht-denaturierenden Puffer, der Reagentien zum Abstoppen von Kinasen, Phosphatasen und Proteasen enthält, (z.B. durch Ultraschall) extrahiert werden. Vor der immunchemischen Analyse können die Extrakte einer kurzen Hitzebehandlung durch Kochen unterworfen werden, um Tau-Proteine, die unter diesen Bedingungen löslich bleiben, im Extrakt anzureichern. Unter Verwendung konventioneller Immunoblot-Methoden (z.B. Western-blotting) oder alternativ ELISA-Methoden unter Verwendung eines phosphorylierungsabhängigen Tau-Antikörpers ist es möglich, die Menge eines PHF-artigen Tau-Phosphoepitops in einer Extraktprobe mit festem Proteingehalt zu bestimmen durch Entwicklung z.B. mit kommerziellen Färbemethoden oder Chemoluminiszenz-Kits mit nachfolgender Densitometrie (Immunoblots) oder direkter Messung von Lichtabsorption oder -emission (ELISA). Zur Verbesserung der Genauigkeit können die auf diese Weise erhaltenen Signale auf den Gehalt von Gesamt-Tau-Protein normalisiert werden, der durch die gleichen Methoden, jedoch unter Verwendung eines phosphorylierungsunabhängigen Tau-Antikörpers bestimmt wird. Die normalisierte Menge des Tau-Phosphoepitops von Interesse ist dann durch das Verhältnis des Tau-Phosphoepitops zu Gesamt-Tau-Protein in jeweils beliebigen Intensitätseinheiten gegeben. Schließlich umfasst Schritt (iv) den Vergleich der gegebenenfalls normalisierten Menge des pathologischen Tau-Phosphoepitops in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen eines Inhibitors der Tau-Hyperphosphorylierung mit der maximalen Menge, die durch den PP2A-Inhibitor alleine induziert wird. Die Konzentration des Inhibitors der Tau-Hyperphosphorylierung, welcher die Provokation eines PHF-Tau-Phosphoepitops um 50% reduziert, wird als teilweise wirksam angesehen. Dagegen ist die minimale Konzentration an Inhibitor der Tau-Hyperphosphorylierung, die die Menge der PHF-Tau-Phosphoepitope auf die normale Maße reduziert, welche in Hirnschnitten ohne Provokation durch einen PP2A-Inhibitor gefunden werden, die niedrigste vollständig wirksame Konzentration.

Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten Dosierung eines Inhibitors der Paired Helical Filaments-artigen Tau-Hyperphosphorylierung für die Behandlung einer durch neurofibrilläre Pathologie charakterisierten Erkrankung

Weiterhin werden zwei Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten Dosierung eines Inhibitors der Paired Helical Filaments-artigen Tau-Hyperphosphorylierung zur Behandlung einer durch neurofibrilläre Pathologie bestimmten Erkrankung beschrieben. In beiden Fällen kann das Subjekt jede Art von Säuger sein. In einer Ausführungsform ist der Säuger ein Mensch. In einer alternativen Ausführungsform ist der Säuger eine experimentelle Tierspezies, die gegebenenfalls nach Durchführung des Verfahrens geopfert wird.

Im ersten Verfahren werden die folgenden Schritte durchgeführt:

(i) Titration eines Inhibitors in Hirnschnitten, die gemäß dem vorstehenden Verfahren durch einen PP2A-Inhibitor stimuliert wurden, um die wirksamen Gewebskonzentrationen zu bestimmen; und
(ii) pharmakokinetische Bewertung der zum Erreichen wirksamer Konzentrationen im Zentralnervensystem des Subjektes erforderlichen Dosierungsschemata. Eine bevorzugte Ausführungsform dieses Schrittes wird im folgenden diskutiert: Dabei wird der Inhibitor der Tau-Hyperphosphorylierung, vorzugsweise eine Verbindung der allgemeinen Formel 1, einem Subjekt auf irgendeinem geeigneten Applikationsweg, vorzugsweise oral, in verschiedenen Dosen verabreicht. Die Konzentration der Verbindung in Abhängigkeit von der Zeit kann durch Messung der Menge der Verbindung in bestimmten Volumen an Plasma, die wiederholt über einen Zeitraum nach dem Dosieren entnommen werden, bewertet werden. Dazu kann die Verbindung mit einem nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel weitgehend extrahiert und in beliebigen Einheiten, z.B. durch HPLC, vorzugsweise unter Verwendung von photometrischen oder fluorometrischen Detektionsverfahren, quantifiziert werden. Die absolute Menge der Verbindung wird dann durch Vergleich dieser Werte mit einer Standardkurve, die durch Extraktion von Plasmaproben aufgestellt wird, denen vorher ex vivo eine bekannte Menge der Verbindung zugesetzt worden sind. Der Zeitpunkt mit der maximalen Plasmakonzentration wird dann gewählt, um in einer separaten Testreihe die Menge der Verbindung im Gehirn zu messen. Bei Tieren als Subjekten werden die Gehirne nach der geeigneten Zeit nach der Applikation entfernt und dann weitgehend mit einem nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel extrahiert, z.B. durch Ultraschall. Danach wird die Menge der Verbindung durch HPLC in einer identischen Weise wie beim Plasmaverfahren bestimmt. Bei menschlichen Subjekten kann die Menge der Verbindung nichtinvasiv durch quantitative Magnetische Resonanz Bildgebung (MRI) gemessen werden. Um eine ausreichende Sensitivität dieses Verfahrens zu gewährleisten, kann die Verbindung in einer für diesen Zweck geeigneten Isotopen-markierten Form, z.B. durch ¹³C Isotopeinbau an synthetisch gut zugänglichen Stellen des Inhibitormoleküls verabreicht werden.

Das zweite Verfahren eignet sich besonders für menschliche Subjekte und umfasst die folgenden Schritte:

i. Bestimmung des normalen Spiegels eines Paired Helical Filaments-artigen Tau-Phosphoepitops in der zerebrospinalen Flüssigkeit von gesunden Kontrollsubjekten der gleichen Altersgruppe;
ii. Steigern der Dosierung eines Inhibitors bei einem einzelnen unter einer Form von neurofibrillärer Degeneration leidenden Subjekt in Intervallen von mehreren Wochen oder Verabreichen steigender Dosen eines Inhibitors an getrennte Subjekte;
iii. immunchemische Bewertung der Verringerung des Paired Helical Filaments-artigen Tau-Phosphoepitops in der zerebrospinalen Flüssigkeit des gleichen Subjekts genau vor Beginn der Behandlung und nochmal nach mehreren Wochen kontinuierlicher Dosierung des Inhibitors; und
iv. Vergleich des Spiegels von Paired Helical Filaments-artiger Tau-Phosphoepitope in zerebrospinaler Flüssigkeit vor und nach Beginn der Behandlung eines unter einer Form von neurofibrillärer Degeneration leidenden individuellen Subjekts, und Bestimmung der Dosis als effektive Dosis, bei der der Spiegel des Paired Helical Filaments-artigen Tau-Phosphoepitops in den Bereich reduziert wurde, der bei gesunden Kontrollen der gleichen Altersgruppe vorkommt.

Es wird jetzt eine bevorzugte Ausführungsform dieses Verfahrens diskutiert.

In Schritt (i) wird in gesunden Subjekten ein Referenzbereich von Kontrollwerten für ein PHF-Tau-Phosphoepitop, vorzugsweise diejenigen die sich auf die Phosphorylierungen von Thr231 oder Ser422 beziehen, bestimmt. Die Subjekte sind geeigneterweise in einem Alter, in dem die entsprechende neurodegenerative Erkrankung in der Regel einsetzt. Zum Beispiel werden 2 bis 15 ml zerebrospinaler Flüssigkeit durch Lumbarpunktion entnommen. Gleiche Aliquote solcher Proben werden dann, z.B. mit allgemein verfügbaren ELISA Kits, analysiert. Für eine größere Genauigkeit können die der Analyse unterworfenen Proben auf vergleichbare Gesamtproteingehalte normalisiert werden. Für eine größere Empfindlichkeit des Tests, können die Proben vor der Verwendung durch Vakuumverdampfen konzentriert werden. Der höchste Spiegel von Tau-Phosphoepitop in einem eindeutig gesunden Subjekt kann dann als „annehmbarer Spiegel" definiert werden, vorausgesetzt, daß das Subjekt nicht innerhalb eines Jahres nach Probennahme Anzeichen einer neurodegenerativen Erkrankung aufweist.

Schritt (ii) besteht in der Verabreichung eines Inhibitors der Tau-Hyperphosphorylierung, vorzugsweise einer Verbindung der allgemeinen Formel 1, an Subjekte, die klinisch anhand etablierter funktioneller Kriterien mit einer durch neurofibrilläre Pathologie charakterisierten Erkrankung diagnostiziert worden sind. Die Diagnose kann durch Biomarker-Kriterien unterstützt werden, am besten durch Tau-Phosphoepitope in zerebrospinaler Flüssigkeit, bestimmt im Zusammenhang mit einem Test vor Beginn der Verabreichung gemäß Schritt (iii). Die Dosis der Verbindung kann entweder bei dem jeweiligen bestimmten Subjekt in Abständen von mehreren Wochen schrittweise gesteigert werden oder verschiedene Dosen können jedem Subjekt in einer Kohorte der Studie verabreicht werden. Zusätzlich können verschiedene Dosierungsintervalle verwendet werden.

In Schritt (iii) wird jedem Patienten, der einer Behandlung mit einem Inhibitor der Tau-Hyperphosphorylierung, vorzugsweise einer Verbindung der allgemeinen Formel 1, unterworfen wird, unmittelbar vor Verabreichung der Verbindung 1 zerebrospinale Flüssigkeit entnommen, um unter Verwendung der gleichen analytischen Methoden und Prozeduren, die in Schritt (i) verwendet werden, ein pathologisches Vergleichsspiegel für ein PHF-Tau Phosphoepitop festzulegen. Danach wird die Behandlung mit dem Inhibitor eingeleitet, wobei ein Dosierungsschema gemäß Schritt (ii) verwendet wird. Jedem Patienten wird nach mehreren Wochen kontinuierlicher Behandlung mit der jeweiligen Dosis des Inhibitors eine weitere Probe zerebrospinaler Flüssigkeit entnommen, die im direkten Vergleich zur entsprechenden vor Behandlungsbeginn entnommenen Proben des jeweiligen Subjekts analysiert wird. Zu diesem Zweck werden Duplikate der vor der Behandlung entnommenen Proben der zerebrospinalen Flüssigkeit als auch Proben von gesunden Kontrollen (Schritt (i)) wieder gleichzeitig auf derselben ELISA-Platte wie die nach der Behandlung entnommenen Proben getestet, um gleichzeitig die Stabilität und die Reproduzierbarkeit des Tests zu bestätigen.

Schließlich wird in Schritt (iv) die Dosis und/oder das chronische Applikationsschema des Inhibitors als die maximal wirksame chronische Dosis festgelegt, die/das den Spiegel an PHF-Tau-Phosphoepitop unterhalb des „annehmbaren Spiegels" bringt (siehe Schritt (i)) entweder durch Dosis-Eskalation bei einem einzelnen Subjekt oder durch getrennte, feste Dosierungsschemata innerhalb einer Gruppe von Subjekten bestimmt. Jeder höhere Spiegel, der aber niedriger ist als der Spiegel vor der Behandlung des einzelnen Subjekts, ist eine teilweise wirksame Dosis für das einzelne Subjekt.

Bestimmung von wirksamen Konzentrationen für die Inhibition der PHF-artigen Tau Hyperphosphorylierung in einem Zentralnervensystem-Gewebemodell

Die Konzentration, in der die Verbindungen der allgemeinen Formel 1 in situ vorliegen müssen, um die PHF-artige Tau-Hyperphosphorylierung wirksam zu hemmen, wird in einem Gewebemodell von frisch hergestellten metabolisch aktiven Hirnschnitten aus adulten Ratten Hippocampi bestimmt, einem Modell dessen Nutzen für diesen Zweck bisher nicht bekannt war. Authentische PHF-artige Phosphorylierungsreaktionen, die nach allen bekannten molekularen Markern im wesentlichen ununterscheidbar von PHF-Tau aus humanen Alzheimer Hirnen sind, werden in solchen Hirnschnitten sehr schnell durch Anwendung des Phosphataseinhibitors Okadeinsäure (OA) provoziert [Gong et al., Brain Res. Brain Res. Protoc., 6, 134-140 (2001); WO01/57535; WO00/01699].

Es gibt eine große Zahl von Kriterien für die PHF-artige Tau Hyperphosphorylierung, die meisten davon umfassen eine Reaktivität mit einem monoklonalen Antikörper, der spezifische Phosphorylierungsstellen aus den insgesamt mehr als 20 Phosphorylierungsstellen von Tau erkennt, die alle im PHF-Zustand von Tau maximal phosphoryliert sind. Die Mehrzahl dieser Stellen gehören zur Kategorie der sogenannten „Prolin-gerichteten" Stellen, die ausnahmslos durch eine Ser-Pro oder Thr-Pro Sequenzmotiv charakterisiert sind. Die Phosphorylierung dieser Motive hat einen maßgeblichen Einfluß auf die Konformation des Proteins. Stellenspezifische phosphorylierungsabhängige Antikörper, die Phosphorylierungen anzeigen, z.B. an Ser199, Ser202, Thr205, Thr231, Ser235, Ser396, Ser404 und Ser422, sind jetzt von verschiedenen Quellen allgemein erhältlich. Einige wenige Phosphoepitope sind besonders spezifisch für PHF-Tau, da sie in normal phosphoryliertem Tau vollständig fehlen. Beispiele sind das Epitop des monoklonalen Antikörpers (MAK) AT100 mit einem komplexen Epitop, das sowohl von der Phosphorylierung als auch der Konformation abhängig ist, und besonders erwähnenswert der MAK AP422, welcher ausschließlich von der Phosphorylierung von Ser422 von Tau abhängig ist. Die besondere Einfachheit der Epitoprestriktionen des letztgenannten Antikörpers machen diesen zu einem besonders nützlichen diagnostischen Kriterium für alle authentischen PHF-artigen Phosphorylierungsreaktionen sowohl in vitro als auch in vivo [WO01/57535]. Neben dem o.a. Phosphorylierungsmotiv sind auch einige Prolinunabhängige Phosphorylierungsstellen spezifisch mit dem PHF-Tau-Phosphorylierungszustand in Zusammenhang gebracht worden, wie z.B. Ser262, das innerhalb der für die Bindung an Mikrotubuli zuständigen Domäne von Tau liegt.

Ein weiteres hochgradig charakteristisches Kriterium für den PHF-Tau-artigen Phosphorylierungszustand ist die maximal verringerte elektrophoretische Mobiltät auf SDS-PAGE Gelen, die die vereinten die Konformation verändernden Effekte der Gesamtheit aller Prolin-gerichteten Phosphorylierung reflektiert. In diesem Zustand hat PHF-Tau seine Fähigkeit zur Bindung an Mikrotubuli verloren, ein funktioneller Defekt, der durch Dephosphorylierung vollständig rückgängig gemacht werden kann.

In Okadeinsäure-behandelten Hirnschnitten werden die meisten der o.a. pathologischen Marker dargestellt. Zur Detektion aktiver Inhibitorverbindungen werden frisch hergestellte metabolisch aktive, isolierte Schnitte, die in einem physiologischen Puffer (künstliche zerebrospinale Flüssigkeit oder Krebs-Ringer Lösung) ständig mit Sauerstoff versorgt werden, mit einer Konzentrationsreihe der Verbindungen der allgemeinen Formel 1 vorinkubiert. Die Schnitte werden danach in Puffern zur Hemmung sowohl von Kinase- als auch von Phosphatase-Aktivitäten extrahiert, und lösliche Überstände solcher Gewebshomogenate werden dann mittels SDS-PAGE aufgetrennt und dem Western-blotting unterworfen. Die Immunoblots werden nach Standardverfahren mit mono- oder polyklonalen Antikörpern entwickelt, die gegen Stellen-spezifische Phosphorylierungsmotive von Tau gerichtet sind, wie z.B. aber nicht beschränkt auf Thr181, Ser199/Ser202/Thr205 (MAK AT8), Thr212, Thr231 (MAK AT100), Ser235, Ser262, Ser396 (MAK PHF-1), Ser404 und Ser422 (MAK AP422). Die Intensität der Signale kann dann auf die Menge an Gesamt-Tauprotein in der Probe normalisiert werden, der durch parallele Entwicklung einer Kopie des Blots mit einem phosphorylierungsunabhängigen Tau-Antikörper bestimmt wird, gefolgt von Bildung des Quotienten der Intensitäten des entsprechenden Phosphoepitops und der Gesamt-Tau Immunoreaktivität. Dieser Quotient stellt ein genaues quantitatives Maß für den Grad der Phosphorylierung dar, durch die das bestimmte Epitop bestimmt wird. Es ist für den Fachmann leicht zu ersehen, daß eine ähnliche Analyse mit höherer Geschwindigkeit durch ELISA Techniken unter Verwendung der gleichen Art von immunchemischen Reagentien durchgeführt werden kann. Alternativ kann die Analyse auch unter Verwendung von allgemein etablierten Antikörper-Färbemethoden in situ an dünnen gefrorenen Gewebsschnitten oder an mit Formaldehyd, Glutaraldehyd oder ähnlichen modifizierten Fixationsmitteln fixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe durchgeführt werden.

Bemerkenswerterweise verhindern die Verbindungen der allgemeinen Formel 1, und insbesondere die Verbindungen der Formeln 2 und 3 die Provokation des gesamten Spektrums aller dieser PHF-Marker durch Okadeinsäure, trotz der sehr allgemeinen Natur der Phosphorylierungseffekte, die durch Phosphatase-Inhibition hervorgerufen werden. Die Verbindungen sind im wesentlichen in der Lage, das normale physiologische Muster der Tau-Phosphorylierung in Hirnschnitten, das dem in vivo Phosphorylierungsmuster ähnlich ist, festzubehalten und zu bewahren. Die Potenz der Verbindungen reicht von IC₅₀ Werten von 200 nM (wie im Falle der Verbindungen der Formeln 2 und 3) bis >10 μM. Die detaillierte Analyse des Dosis-Wirkungs-Verhaltens zeigt ebenso überraschend, dass alle PHF-Tau Marker durch die aktiven Verbindungen mit ziemlich ähnlichen IC₅₀ Werten kotitriert werden, was andeutet, dass die PHF-Tau-Hyperphosphorylierung kein so heterogenes Ereignis ist, wie man es aufgrund der Natur des stimulierenden Mittels Okadeinsäure erwarten könnte. Die Tau-Hyperphosphorylierung wird im Allgemeinen bei Konzentrationen, die 10-fach über dem IC₅₀ liegen, vollständig unterdrückt. Jedoch ist bei solch vollständig wirksamen Konzentrationen das normale Hintergrundphosphorylierungsmuster noch nicht beeinflusst, was auf eine gewisse Selektivität der Verbindungen in vivo für die pathologische Tau-Hyperphosphorylierungsereignisse im Unterschied zu den physiologischen Tau-Phosphorylierungsereignissen hinweist. Aus diesen Daten kann abgeleitet werden, dass z.B. für Verbindungen der Formel 2 oder 3 eine Konzentration im Gehirn von wenigstens 1 μM für die vollständige Unterdrückung der PHF-artigen Tau Hyperphosphorylierung wünschenswert ist.

Die spezifische Wirksamkeit von Verbindungen der allgemeinen Formel 1 für die im Zusammenhang mit Tauopathien auftretende Phosphorylierung ist keine häufig beobachtete Eigenschaft der Indolocarbazol-Verbindungsklasse. Bestimmte Indolocarbazol-Kinaseinhibitoren des Standes der Technik, wie z.B. CEP-1347 (ein substituiertes K252a-Derivat), oder auch die Stammverbindung Staurosporin sind in dem Hirnschnitt-Hyperphosphorylierungsmodell inaktiv, obwohl diese Kinaseinhibitoren, insbesondere der letztgenannte, nicht sehr spezifisch sind und eine Reihe von Kinasen mit hoher Potenz inhibieren. Im Hinblick darauf konnte die Wirksamkeit der spezifischen Strukturen von Verbindungen der allgemeinen Formel 1 nicht vorhergesehen werden.

Bestimmung der Dosierung zur Erreichung wirksamer Konzentrationen von Verbindungen der allgemeinen Formel 1 im Zentralnervensystem in vivo

Das Potential einer limitierten Gruppe von Verbindungen, die mit den Verbindungen der allgemeinen Formel 1 verwandt sind, als Inhibitoren der Tau-Hyperphosphorylierung, wurde bereits in WO00/01699 erkannt. Die physikochemischen Eigenschaften dieser Serie von Verbindungen sind jedoch sehr schlecht, weshalb zur Applikation der Verbindungen non-GRAS Vehikel (Generally Regarded As Save gemäß FDA Richtlinien) erforderlich sind. Zudem übersteigt selbst unter spezialisierten Applikationsbedingungen die orale Bioverfügbarkeit der Verbindungen des Standes der Technik normalerweise nicht 10% in Ratten [WO95/22331]. Im Zusammenhang mit diesen ungünstigen Eigenschaften steht möglicherweise eine unattraktiv kurze Halbwertszeit in Ratten nach i.v. Applikation von ungefähr 1 Std.. Hirn/Plasma-Verhältnisse, die in vivo als die Konzentration der Verbindung im Hirn im Vergleich zur Konzentration im Plasma zu einem gegeben Zeitpunkt bestimmt sind, sind ebenfalls schlecht und werden noch schlechter, wenn GRAS-Vehikel eingesetzt werden, was auf einen nicht hinnehmbaren Einfluß des Vehikels auf diese Parameter hinweist. Chronische in vivo Experimente zur Inhibition der neurofibrillären Pathologie in authentischen Modellen, wie z.B. in transgenen Mäusen mit human pathogenen Tau-Mutationen, können mit solchen Verbindungen nicht durchgeführt werden.

Unglücklicherweise scheinen die limitierenden Faktoren der o.g. Verbindungen des Standes der Technik hinsichtlich ihrer pharmazeutischen Nützlichkeit bei den Kinaseinhibitoren der Indolocarbazolklasse relativ häufig zu sein. Es wurde auch berichtet, dass Derivate des Naturstoffs K252a keine orale Bioverfügbarkeit von über 10% aufweisen. K252a selbst hat in Ratten eine maximale orale Bioverfügbarkeit von 13% und Hirn/Plasma-Verhältnisse von weit unter 1.

Im Hinblick auf diese bekannten Schwierigkeiten und da chronische Wirksamkeitsstudien in Tiermodellen oder an menschlichen Subjekten sehr zeitaufwendig und teuer sind, ist es wünschenswert, in geeignet angelegten pharmakokinetischen Studien die Zentralnervensystem-Exposition durch Verbindungen der allgemeinen Formel 1 in Abhängigkeit der Dosierung zu beurteilen. Die wirksame Konzentration, die im oben beschriebenen Gewebe-Modell bestimmt wird, definiert die Zielexposition in vivo. Überraschenderweise verbesserten repräsentative Verbindungen der allgemeinen Formel 1, besonders wenn sie in Form ihrer Salze appliziert wurden, die orale Bioverfügbarkeit gegenüber den oben zitierten Beispielen um das 2- bis 3-fache, und Hirn/Plasma-Verhältnisse erreichten oder überschritten sogar den Wert 1, was möglicherweise auf einen aktiven Aufnahmemechanismus über die Blut-Hirnschranke hindeutet. Dieser Befund ist für die Applikation dieser Kinaseinhibitoren im Zentralnervensystem von besonderer Bedeutung, da ihre Kinaseselektivität nicht sehr hoch ist. Daher erlauben selbst moderate Verbesserungen der Hirnpenetration eine niedrigere Exposition peripherer Gewebe und vermindern so das Risiko von Nebenwirkungen außerhalb des Zentralnervensystems aufgrund einer moderaten Kinaseselektivität. Ebenso wichtig ist, dass eine zufriedenstellende Applikation im allgemeinen ausschließlich mit GRAS-Vehikeln durchgeführt werden könnte. Vermutlich im Zusammenhang mit verbesserten physikochemischen Eigenschaften werden auch Halbwertszeiten in einen zufriedenstellenderen Bereich von bis zu mehreren Stunden im Falle der Verbindung der Formel 3 nach i.v. Applikation in Ratten verbessert. Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass ähnliche Studien auf andere Spezies ausgedehnt werden können, z.B. Mäuse. Im Falle von menschlichen Subjekten kann zur Bewertung der Penetration der Verbindung in das Zentralnervensystem auf nicht-invasive bildgebende Verfahren zurückgegriffen werden, z.B. nach für MRI Studien geeigneter Isotopenmarkierung einer Verbindung der allgemeinen Formel 1.

Dieses Verhalten zusammen mit der günstigen Tau-Hyperphosphorylierungsinhibitor-Aktivität beweist, dass Verbindungen der allgemeinen Formel 1, und insbesondere der Formeln 2 und 3, für die Behandlung chronischer Erkrankungen des Zentralnervensystems, die durch die Alzheimersche Krankheit und die Gruppe der Tauopathien im allgemeinen repräsentiert werden, in einem klinisch möglichen Dosierungsbereich (z.B. 5-20 mg/kg) verwendbar sind.

Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen, die durch authentische neurofibrilläre Pathologie charakterisiert sind, in experimentellen Tiermodellen

Im allgemeinen wird die neurofibrilläre Pathologie niemals in irgendeinem relevanten Ausmaß in keiner Wildtyp-Spezies außer dem Menschen beobachtet. Dies hat die Untersuchung dieses Typs von Neurodegeneration bis zu einem Grade so stark behindert, dass sogar die Relevanz dieses Phänomens als Teil eines primären Krankheitsmechanismus in Zweifel gezogen wurde. Mit der Entdeckung, dass bestimmte Tauopathien mit dem gesamten Spektrum von biochemischen Abnormalitäten und neuronaler Fehlfunktion von einer Vielzahl von singulären Tau-Mutationen ausgehen können, war die kausale Rolle von Tau in solchen Krankheitsprozessen bewiesen. Zudem erlaubte die Einführung von human pathogenen Taumutationen in transgene Mäuse die Modellierung authentischer Pathologie in kleinen experimentellen Tieren, wodurch der Weg für schlüssige Wirknachweise für therapeutische Agentien geebnet wurde. Die Rolle pathologischer Tau-Phosphorylierungen im Zusammenhang mit der Bildung von Paired Helical Filaments bei der Kausalität des Krankheitsprozesses blieb jedoch unklar, d.h. es war nicht offensichtlich, ob abnormale Tau-Phosphorylierung in der Kausalkette, die neurotoxische Tau-Aggregation produziert, upstream oder downstream anzusiedeln war, oder ob sie lediglich ein Epiphenomen der Tau-Pathologie darstellte. Eine Wirksamkeit von Inhibitoren der Tau-Hyperphosphorylierung bei neurofibrillaren degenerativen Erkrankungen könnte vernünftigerweise nur erwartet werden, wenn die Tau-Hyperphosphorylierung sowohl upstream als auch kausal für die Aggregation wäre.

Beispielhaft für eine vererbliche Tauopathie verursacht die Mutation P301L im Tau-Protein (eine Mutation im „Angelpunkt"-Bereich einer der Repeatdomänen der Mikrotubuli-Bindungsregion) eine vererbliche Form der FTDP (Frontallappendemenz mit Parkinson) bei Menschen um das Alter von 50 bis 60 Jahren [Hutton et al., Nature 393, 702-705 (1998)]. Transgene Mäuse, die Träger einer solchen mutierten Form menschlichen Tau-Proteins sind, und bei denen die Expression durch einen Prion-Promoter auf Proteinwerte, die denen von endogenem Maus-Tau ähnlich sind, gebracht wird, erliegen einem motorischen Phänotyp ähnlich der ALS (amytrophe Lateralsklerose) mit Einsetzen der Krankheit bei einem Alter zwischen 8 und 12 Monaten [Lewis et al., Nature Genet. 25, 402-405 (2000)]. Dieser Phänotyp unterscheidet sich von dem menschlichen Gegenpart (hauptsächlich frontale Pathologie), weil in diesen Mäusen die neurofibrilläre Pathologie hauptsächlich im Rückenmark und Teilen des Rautenhirns/Stammhirns verteilt ist, die primär das motorische System betreffen. Dieser Unterschied ist jedoch von Vorteil, da der Read-out von motorischen Funktionsdefiziten auf sehr viel robustere Weise durchführbar ist als andere subtilere Defizite, wie Gedächtnis oder psychiatrische Phänotypen, die bei Mäusen zugänglich sind. Daher kann man sehr objektive Tests zur Bestimmung des Beginns der Pathologie in solchen Mäusen benutzen. Für motorische Defizite kann man z.B. eine Kombination von einem „wire hang test" und einem „beam balance test" oder auch andere ähnliche Tests, die im Stand der Technik bekannt sind, die auf die Hinterbein-Funktion ansprechen, bequem in regelmäßigen Intervallen anwenden, um die Fähigkeiten der transgenen Mäusen ab einem Alter von etwa 8 Monaten zu überwachen. Stringente Kriterien für den „Onset" werden aus wiederholtem Versagen in einer Kombination solcher Tests in einer solchen Weise aufgestellt, um die Identifizierung falscher Positive auszuschließen, d.h. Mäuse, die sich nach der Erfüllung dieser Kriterien zeitweise wieder erholen. Deswegen sind die Daten aus Wirknachweisstudien mit Mäusen diese Phänotyps wie der P301L transgenen Maus, sehr zuverlässig und haben eine Vorhersagekraft für die klinische Anwendbarkeit in der humanen Pathologie.

Die P301L-tau transgenen Mäuse verfallen sehr rasch 2-3 Wochen nach dem Onset in einen todgeweihten Zustand aufgrund einer außergewöhnlich aggressiv fortschreitenden Pathologie, die um Größenordnungen schneller verläuft als in humanen Patienten mit oder ohne Mutationen von Tau, wo die Tauopathie in der Regel über mehrere Jahre voranschreitet, wie auch im Falle der Alzheimerschen Krankheit. Daher stellen transgene Mausmodelle dieser Art auch sehr „harte" Modelle dar, bei denen wirksame Arzneimittel leicht übersehen werden können. Auf der anderen Seite falls eine Wirksamkeit in einem solch fordernden Modell tatsächlich beobachtet wird, muß dies als ein hoch signifikantes Ergebnis einstuft werden. Andere weniger aggressive transgene Mausmodelle basierend auf humanem Wildtyp Tau sind kürzlich entwickelt worden, z.B. durch Genersatz-Strategien, wobei das endogene Mausgen durch ein humanes genomisches Taukonstrukt ersetzt wurde, um die Expression des ganzen humanen Komplements von 6 Tau-Spliceisoformen zu ermöglichen [Andorfer et al., J. Neurochem., 86, 582-590 (2003)]. Solche Mäuse haben ihren Onset in einem höheren Alter, eine langsamere Progression und mildere, komplexere Phänotypen. Sie könnten für die Erprobung weniger wirksamer therapeutischer Strategien brauchbar sein, allerdings auf Kosten viel langwierigerer Testabläufe, und sie benötigen anspruchsvollere Read-outs. Abgesehen von Erwägungen zur Nützlichkeit ist jedoch der Nachweis, dass authentische Tau-Pathologie in Tieren ohne pathogene Mutationen auch hervorgerufen werden kann, insofern von Bedeutung, als die überwiegende Mehrzahl der Tauopathien wie auch die Alzheimersche Krankheit nicht durch Mutationen verursacht werden. Offensichtlich haben Tauopathien wie die Alzheimersche Krankheit, einen multifaktoriellen Ursprung, aber enden immer in einem gemeinsamen malignen Prozeß der Tau-Pathologie.

Die hier offenbarten Verbindungen sind hinreichend wirksam, um in dem aggressiven P301L-tau transgenen Mausmodell getestet zu werden. Unmittelbar vor dem erwarteten Onsetfenster, d.h. ab einem Alter von etwa 8 Monaten bei P301L-tau transgenen Mäusen, wird eine Verbindung wie etwa die Verbindung der Formel 3, vorzugsweise in Form ihres Salzes zweimal täglich einer geeigneten tau-mutierten transgenen Maus durch orale Gavage verabreicht, im Falle der Verbindung der Formel 3 in Dosen im Bereich von 10 mg/kg bis 20 mg/kg. Es ist für einen Fachmann ersichtlich, dass die Dosierung einer jeweiligen Verbindung gemäß den Ergebnissen der oben beschriebenen Titration im Hirnschnittmodell und der pharmakokinetischen Studien angepasst werden kann. Die Verbindung kann in Form eines Feststoffs in einer Vielzahl von im Stand der Technik bekannter fester Formulierungen, oder aber auch gelöst in einer minimalen Menge einer Flüssigkeit, wie PEG-400, zur optimalen Dispersion verabreicht werden. Während der Behandlung werden die motorischen Fähigkeiten von behandelten und unbehandelten P301L-tau transgenen Mäusen kontinuierlich bewertet durch einen einfachen „Wire Hang Test" in Kombination mit einem „Beam Balance Test". Man zeichnet das Mittel der Zeiten der jeweiligen Onsets in der behandelten und der unbehandelten Gruppe auf und bestimmt die Signifikanz unter Verwendung der entsprechenden Varianzen, z.B. mittels eines gängigen ANOVA statistischen Tests. Die Mäuse werden geopfert, wenn (i) sie einen todgeweihten Zustand erreicht haben, oder (ii) am Ende des experimentellen Behandlungsfensters, gewöhnlich nicht länger als 3 Monate. Zusätzliche Bestätigung der Wirksamkeit der Behandlung wird dann post-mortem erhalten durch biochemische und histologische Standardbewertung der PHF-Tau-Hyperphosphorylierung und der Bildung von neurofibrillären Tangles. Zur Analyse der biochemischen PHF-Phosphorylierungsmarker werden Aliquote von frischem Gewebe aus dem Rückenmark oder aus anderen betroffenen Teilen des Zentralnervensystem extrahiert und die Menge an pathologisch phosphoryliertem Tau wird durch Western-blotting mit diagnostischen MAKs, wie AP422 oder anderen im Stand der Technik phosphoepitopabhängigen Antikörpern, bestimmt, ähnlich der Analyse, die mit den Hirnschnitten durchgeführt wird (s.o.). Weitere Aliquote dieser Gewebe werden für die histologische Standardbewertung von aggregiertem Tau in der Form neurofibrillärer Tangles oder Neuropil-Threads durch geeignete Silberfärbemverfahren (z.B. Gallyas Färbung) oder durch Immunhistochemie mit Phosphoepitop-sensitiven MAKs (z.B. AT8) als Dünnschnitte präpariert. Ein Vergleich entweder von Tangledichten oder von densitometrischen Maßen bei behandelten Tieren und Kontrolltieren erlaubt die Bestätigung der Wirksamkeit auf der pathologischen Ebene.

Gemäß all den obigen funktionellen und pathologischen Kriterien sind Verbindungen der allgemeinen Formel 1, aber insbesondere die Verbindung der Formel 3, signifikant wirksam sowohl hinsichtlich der Verzögerung des Onset der Pathologie und des Krankheitsphänotyps, im Falle der Verbindung der Formel 3 um mindestens 6 Wochen, als auch hinsichtlich der Verlangsamung des Fortschreitens der Krankheit in diesem aggressiven Modell.

Zusammenfassend ist es überraschend, dass ein in vitro Hirnschnitt-Gewebemodell mit einem vollständig artifiziellen Verfahren der biochemischen Provokation (z.B. durch Okadeinsäure) sich in der vorliegenden Erfindung als derartig genau prädiktiv für die Wirksamkeit in einem pathologischen Modell erwiesen hat, das durch Tau-Protein-Aggregation mit einer noch unverstandenen Pathogenese charakterisiert ist, und bei dem sehr unterschiedliche Zeiträume eine Rolle spielen (Stunden im Vergleich zu Wochen/Monaten). Daher sollte dieser Aspekt der Erfindung die Identifizierung und relevante Dosierung therapeutischer Agentien, die bei der Behandlung von durch neurofibrilläre Degeneration charakterisierten Zentralnervensystem Krankheiten verwendbar sind, erheblich erleichtern.

Behandlung humaner Patienten, die an Alzheimerscher Krankheit oder anderen Formen von Tauopathie leiden

Die klassische Alzheimersche Krankheit ist durch die Koexistenz von zwei Arten von pathologischen Proteinablagerungen in den Gehirnen betroffener Subjekte charakterisiert. Einer der Hauptmerkmale ist die im wesentlichen extrazelluläre Ablagerung von Aβ, einem kurzen aggregierenden Peptid, das von dem Membranprotein APP stammt. Das andere Merkmal ist per definitionem die intrazelluläre Aggregation von abnormal hyperphosphoryliertem Tau in Form von PHFs (Tauopathie). In mehreren transgenen Mauslinien mit ausschließlicher Ablagerung von Aβ wurde keine Neurodegeneration festgestellt. Andererseits hatten mehrere transgene Mauslinien mit mutiertem Tau, die neurofibrilläre Tangles hatten, alle ausnahmslos massive neurodegenerative Phänotypen. Dies spiegelt die Verhältnisse beim Menschen wieder, wo Gehirne nicht-dementer älterer Patienten oft extensive Aβ Pathologie bei Abwesenheit anderer pathologischer Merkmale, wie neurofibrilläre Tangles, Lewy Körper oder vaskuläre Anormalitäten zeigen. Im Unterschied dazu ist das Vorkommen einer hohen Dichte von neurofibrillären Tangles in einer beliebigen Hirnregion immer mit schwerwiegenden funktionellen Defiziten, die von den betroffenen Hinrregionen abhängen, korreliert, selbst wenn keine anderen pathologischen Merkmale vorliegen („reine Tauopathie").

Die gegenwärtigen Daten im Stand der Technik weisen stark darauf hin, dass die Tauopathie das primäre maligne pathologische Merkmal ist, selbst in solchen Indikationen, in denen andere pathologische Marker koexistieren. Die Behandlung mit Inhibitoren der Tau-Hyperphosphorylierung ist daher bei all diesen Krankheiten angezeigt, inbesondere bei der Alzheimerschen Krankheit. Während die klinische Diagnose von vielen der prominenteren reinen Tauopathien, wie der frontotemporalen degeneration, der corticobasalen Degeneration oder der Pickschen Krankheit oft ziemlich klar ist wegen ihrer einzigartigen Symptomatologie [Kertesz A., Neurologist, 9, 311-317 (2003)], ist die eindeutige Diagnose der klassischen Alzheimerschen Krankheit schwieriger, da eine kleinere Gruppe klinisch entsprechend diagnostizierter Patienten oft durch einen signifikanten Beitrag von cerebrovaskulärer Arteriosklerose oder Lewy Einschlusskörperpathologie zusammen mit Aβ Pathologie gekennzeichnet ist, was zu einer ähnlichen Symptomatologie wie die klassische Alzheimersche Krankheit führt, welche durch eine Neurodegeneration dominiert ist, die durch neurofibrilläre Tangles angetrieben wird.

Um zu überprüfen, ob für einen klinisch durch standardisierte psychometrische Testschemata oder durch in der gegenwärtigen Praxis vorherrschende bildgebende Verfahren mit der Alzheimerschen Krankheit diagnostizierten Patient tatsächlich eine Behandlung mit Verbindungen der allgemeinen Formel 1 angezeigt ist, werden zusätzlich spezifische Biomarkertests durchgeführt, die sich auf eine Rolle des Tau-Proteins bei der Krankheit beziehen. Vermutlichen Patienten wird zerebrospinale Flüssigkeit durch Lumbarpunktion entnommen, und die Mengen an Tau-Proteinen werden durch allgemein erhältliche ELISA Tests bestimmt. Erhöhte Mengen bestätigen die Diagnose für die Alzheimersche Krankheit [Andreasen et al., Neurology, 53, 1488-94 (1999)]. Die diagnostische Sicherheit wird weiter erhöht durch die Messung spezifischer Phosphoepitope, wie z.B. solche die von Thr231-Phosphorylierung abhängig sind, was auf eine prominente Beteiligung der Tau-Phosphorylierungspathologie in den entsprechenden Alzheimer Patienten hindeutet [z.B. Hampel et al., Arch. Gen. Psychiatry, 61, 95-102 (2004)].

Ein Subjekt, das durch eines oder durch eine Summe der obigen Kriterien mit der Alzheimerschen Krankheit oder mit einer anderen Tauopathie diagnostiziert wurde, wird z.B. mit einer ein- oder zweimaligen täglichen Dosis von 100 bis 1000 mg einer Verbindung der allgemeinen Formel 1 behandelt, die oral oder rektal verabreicht werden kann. Die genaue Dosierung bei einem einzelnen Patienten wird von verschiedenen Faktoren abhängen, wie dem Alter und dem Gewicht des Patienten als auch dem Schweregrad der Erkrankung, und wird vorteilhaft durch den Gebrauch des gleichen Tau-Phosphoepitop ELISA Tests in zerebrospinaler Flüssigkeit bestimmt, der für die Diagnose verwendet wurde (s.o.). Vor Beginn der Behandlung wird eine Probe zerebrospinaler Flüssigkeit von mehreren ml durch Lumbarpunktur entnommen um den Basisspiegel von pathologischen Tau-Phosphorylierungsmarkern für den Patienten zu bestimmen. Der Patient wird dann mit mit einem eskalierendem Dosisschema behandelt. Nach vier Wochen der Behandlung mit einer jeweiligen bestimmten Dosis wird eine weitere Probe zerebrospinaler Flüssigkeit entnommen zur wiederholten Bestimmung des Tau-Phosphoepitopspiegels. Die minimale ausreichende Dosis für diesen Patienten ist diejenige, bei der das Tau-Phosphoepitopspiegel auf das bei gesunden Kontrollen der gleichen Altersgruppe vorkommende durchschnittliche Spiegel zurückgeführt wird. Dieser Test kann für einzelne Dosen lediglich zu Bestätigungszwecken durchgeführt werden. Geeignete Antikörper für solche Teste erkennen die Phosphorylierung von Tau an den folgenden Stellen, die aber nicht auf diese beschränkt sind: Thr181, Ser199, Ser202, Thr205, Ser235 und Ser396, insbesondere aber Thr231 und Ser422, oder auch eine Kombination solch spezifischer Phosphorylierungsstellen wie Thr231/Ser235 etc.. Die Dauer der Behandlung ist für den Zeitraum der Erkrankung, für gewöhnlich den Rest des Lebens. Die Verbindungen können als pharmazeutisch verträgliche Salze verabreicht werden, die aus anorganischen oder organischen Säuren gebildet werden, die die folgenden beinhalten, aber nicht auf diese beschränkt sind: Chlorid, Sulfat, Phosphat, Mesylat, p-Toluolsulfonat, Formiat, Acetat, Benzoat, Salicylat, Malat, Tartrat, Citrat, Lactat, etc.

Pharmazeutische Zusammensetzungen für die orale Applikation können inaktive Zutaten enthalten, wie Zucker, z.B. Lactose oder Sorbitol, Cellulosepräparationen, wie z.B. Methylcellulose, verschiedene Formen der Stärke, Gelatine, Cyclodextrine, Polyvinylpyrrolidone, Talk, Stearinsäure oder deren Salze, Polyethylenglycol in verschiedenen Stufen der Polymerisation, wie z.B. PEG400. Alternativ können trocken gefüllte Gelatinekapseln mit oder ohne häufig verwendete Weichmacher verwendet werden.

Für die rektale Verabreichung können die Zusammensetzungen auch inaktive Zutaten als Grundstoff für Suppositorien enthalten. Zu diesen gehören Triglyceride, Paraffine, PEG oder höhere Alkohole, sind aber nicht darauf beschränkt.

Die folgenden Beispiele illustrieren die vorstehende Erfindung, implizieren aber keine Beschränkung des Umfangs, die über das vorstehende hinausgeht.

In den Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet:

CaCl₂:: Calciumchlorid
CO₂:: Kohlendioxid
DMSO:: Dimethylsulfoxid
ECL:: Enhanced Chemoluminescence
EDTA:: Ethylendiamintetraessigsäure
EGTA:: Ethylenglykol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraessigsäure
HEPES:: N-2-Hydroxyethyl-piperazin-N'-2-ethansulfonsäure
IC₅₀:: halbmaximale inhibitorische Konzentration
i.v.:: intravenös
HPLC:: Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie
h:: Stunde
KCl:: Kaliumchlorid
kg:: Kilogramm
KH₂PO₄:: Kaliumdihydrogenphosphat
MgSO₄:: Magnesiumsulfat
min:: Minute
ml:: Milliliter
μM:: Mikromolar
mM:: Millimolar
mm:: Millimeter
MAK:: Monoklonaler Antikörper
NaCl:: Natriumchlorid
NaHCO₃:: Natriumhydrogencarbonat
nM:: Nanomolar
OD:: Optische Dichte
PAK:: Polyklonaler Antikörper
PEG:: Polyethylenglykol
PHF:: Paired Helical Filaments
PMSF:: p-Methylphenylsulfonylfluorid
P301L mutant tau: Tau mit Prolin in Position 301 substituiert durch Leucin
4RON Splice-isoform: Tau mit 4 Mikrotubuli Repeatbindungsdomänen und keinem N-terminalen Insert
SDS-PAGE:: Natriumdodecylsulfat Gelelektrophorese
Ser:: Serin
Thr:: Threonin

Titration von Tau-Hyperphosphorylierungsinhibitoren in einem hippocampalen Rattenhirnschnitt-Modell
Erwachsene männliche Wistar Ratten von ungefähr 300 g Gewicht (3 Monate alt) wurden kurz mit CO₂ betäubt und dekapitiert. Die Gehirne wurden innerhalb von 2 min entnommen und der Hippocampus wurde mit einem stumpfen Spatel herausgeschält. Die Hippocampi wurden dann mittels eines Mcllwain Gewebehackers in 0.45 mM dicke Schnitte geschnitten und in einen eiskalten Krebs-Bicarbonatpuffer (pH 7.0) mit niedriger Calciumkonzentration gelegt: 124 mM NaCl, 3,33 mM KCl, 0,01 mM CaCl₂, 1,25 mM KH₂PO₄, 1,33 mM MgSO₄, 25,7 mM NaHCO₃, 10 mM D-Glukose und 20 mM HEPES. 5-8 Schnitte werden in ein Röhrchen mit 5 ml Puffer mit wenig Calcium verbracht und für mindestens 30 min bei 33-34°C unter mit Wasser gesättigter Oxygenierung (95% O₂, 5% CO₂) inkubiert. Nach 30 min wurde die Lösung durch einen Puffer mit einer physiologischen Calciumkonzentration (1,3 mM) ersetzt und weitere 30 min inkubiert. Nach einer Gesamtäquilibrierungszeit von wenigstens einer Stunde wurden die Schnitte für 15 min mit Konzentrationen der Verbindung der allgemeinen Formel 1 von bis zu 10 μM vorinkubiert. Geeignete Verdünnungen der Verbindung der allgemeinen Formel 1 wurden aus 10 mM Vorratslösungen in DMSO so hergestellt, dass die Endkonzentration von DMSO in der Inkubationslösung 0,5% betrug. Danach wurden die Schnitte für 1 Stunde einer Konzentration von 1 μM Okadeinsäure ausgesetzt. Nach dieser Behandlung wurde der Puffer entfernt, und die Schnitte wurden für 10-20 Sekunden in einem Volumen von 0,5 ml „Homogenisierungsbuffer" (100 mM KH₂PO₄, pH 6,5, 2 mM EGTA, 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF und 2 μM Okadeinsäure) der ein Proteaseinhibitor-Cocktail: 100 μM PMSF, 10 μg/ml Aprotinin, 10 μM Leupeptin, 6 μg/ml Pepstatin und 40 μM Chymostatin, enthält, mit Ultraschall behandelt. Die Homogenate wurden für 30 min bei 16.000 × g zentrifugiert, die Überstände wurden gesammelt, für 5 min auf 100°C erhitzt und erneut zentrifugiert. Aliquote hitzestabiler Überstände normalisiert auf Proteingehalt wurden auf 10% SDS-PAGE analysiert und anschließend erfolgte Immunoblotting mit den MAK AT8 (anti-Ser202/Thr205; 1:200), AP422 (anti-Ser422; 1:5.000), AT100 und den PAK anti-Ser262 and anti-Thr231. Die Blots wurden mittels ECL (Amersham Life Sciences) entwickelt und einem Kodak X-OMAT AR Film ausgesetzt. Die Bildung von Phosphoepitopen wurde durch densitometrische Analyse der richtig exponierten Filme (OD < 1,5) quantifiziert durch Bildung des Intensitätsverhältnisses aus dem entsprechenden Phosphoepitop und der Gesamt-Taulimmunoreaktivität, die mit dem MAK Tau-1 (1:5.000) nach gründlicher Dephosphorylierung der Tau-Proteine auf dem Blot, die durch extensive Inkubation der Schwesterblots mit hohen Konzentrationen von Kälberdarm-Phosphatase erreicht wurde, bestimmt wurde.
Oberflächliche Bewertung der Inhibition der Tau-Hyperphosphorylierung wurde bei einer Konzentration von 10 μM der Verbindung durchgeführt, woran sich eine detaillierte Titration der Verbindungen bei Konzentrationsbereichen von 30 nM bis 10 μM anschließt. IC₅₀ Werte sind definiert als die Konzentration der Verbindung der allgemeinen Formel 1, bei der das wie oben bestimmte Phosphoepitop-Intensitätsverhältnis um 50% reduziert war relativ zum dem Wert einer positiven Kontrolle, den man mit Okadeinsäure alleine in der Abwesenheit eines Inhibitors erzielte. Die Verbindungen der Formeln 2 und 3 wiesen IC₅₀ Werte von ungefähr 200 nM für AP422, AT8, AT100 und anti-Thr231 auf. Der IC₅₀ für das Ser262 Phosphoepitop lag etwas höher (400 nM).
Beispiel 2
Bestimmung der Dosierung für den erforderlichen Gehirnspiegel in vivo bei der Verbindung der Formel 3
Zwei Gruppen (n = 3) von über Nacht gefasteten Wistar Ratten, die 240-270 g wogen, wurden 10 mg/kg des Hydrochlorid der Verbindung der Formel 3 in einem Vehikel von 1,5 ml/kg PEG 400 Macrogol Ph. Eur. durch die femorale Vene i.v. appliziert. Die Applikation geschah unter Anästhesie, initiiert mit 3,5% Isofluran/O₂, dann aufrechterhalten bei 1 % während der Applikation der Verbindung und dem Abnähen der Vene. 200 μl des Lokalanästhetikums Lidocain wurden lokal verabreicht. 1 Stunde nach Applikation der Verbindung wurden 200 μl Blut durch einen Schnitt in der Schwanzvene erhalten. Unmittelbar nach der Blutentnahme wurden die Ratten nach kurzer CO₂ Anästhesie dekapitiert. Gehirne und das Rückenmark wurden entfernt und gewogen. Plasma erhielt man durch Zentrifugation des Schwanzvenenbluts bei 13.000 × g für 20 min bei 4°C.
Extraktion der Verbindung der Formel 3 aus Plasma
In einem Glasröhrchen wurde jede aus einem gleichen Volumen Blut erhaltene Plasmaprobe mit 200 μl konzentrierter Ammoniaklösung und 200 μl gesättigter NaCl Lösung gemischt. Die Mischung wurde mit 2 ml Ethylacetat (HPLC Reinheit) durch heftiges Vortexen für 1 min extrahiert, um eine feine Emulsion zu bilden. Nach durch Zentrifugieren bei 4.000 × g für 5-10 min bei Raumtemperatur beschleunigter Phasentrennung wurde die organische Phase mit einer Glaspipette gesammelt und in einem Glasröhrchen in einem Vakuumverdampfer bei 50-60°C eingedampft. Die wässrige Phase wurde ein zweites Mal in identischer Weise extrahiert, und die organische Phase wurde mit dem ersten Extrakt vereint.
Extraktion der Verbindung der Formel 3 aus dem Gehirn
Eine Hälfte eines Rattenhirns wurde in ein Glasröhrchen mit konischem Boden verbracht und in 500 μl gesättigter NaCl Lösung mittels Ultraschall (Bandelin Sonoplus UW 2070, Berlin) bei 55% Leistung für 20 Sekunden bei 4°C homogenisiert. 200 μl konzentrierte Ammoniaklösung wurde den Proben zugegeben. Die Extraktion erfolgte dann mit 2 × 2 ml Ethylacetat (HPLC Reinheit) wie bei den Plasmaproben. Für Rückenmarkproben kam eine ähnliche Vorgehensweise zur Anwendung.
Bestimmung der Extraktionsausbeute und Erstellung der Standardkurve für die Verbindung der Formel 3
100 μl Plasma bzw. 0,5 g Hirngewebehomogenat in gesättigter NaCl Lösung, erhalten von Kontrollratten, wurden mit der Verbindung der Formel 3 in solchen Mengen versetzt, dass Konzentrationen im Bereich von 1 ng/ml bis 5 μg/ml entstanden. Die mit Verbindung versetzten Hirn- oder Plasmaproben wurden dann der oben beschriebenen Extraktion und Behandlung unterzogen. Die quantitative Analyse der Extrakte erfolgte durch HPLC mit Fluoreszenzdetektion. Nach dem Eindampfen der vereinten organischen Extrakte verbliebene Rückstände wurden in 300 μl Acetonitril aufgenommen, und 100 μl wurden bei einer Flussrate von 0,75 ml/min auf eine 5 μm RP18 Select B 12,5 × 4,6 mm Säule (Merck) injiziert. Die Elution erfolgte isokratisch bei einer Temperatur von 40°C mit 60:40 (v/v) Acetonitril/Wasser. Die Fluoreszenzdetektion und Quantifizierung über die Peakfläche wurde mittels eines G1321A Detektors (Agilent Tech 1100 Serie) bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 284 nm bzw. 476 nm durchgeführt. Die Peakflächen wurden verglichen mit denen, die nach Injektion von mehreren Konzentrationen eines reinen Standards, die von einer Stammlösung der Verbindung der Formel 3 in Acetonitril (HPLC Reinheit) abgeleitet wurden, erhalten wurden, um die Extraktionsausbeuten zu bestimmen, die in der Regel bei 90-95% lagen. Die Standardkurve erhielt man durch Auftragen der Mengen an reinem Standard in μg über die Fluoreszenz-Peakflächen.
Beispiel 3
Eine Kohorte von 61 transgenen Mäusen gleichen Alters, homozygot für die 4RON Spliceisoform des humanen P301L-mutant tau Transgens (JNPL3 Linie, erhältlich von Taconic Farms, NY) wird in zwei Gruppen unterteilt, die 30 Mäuse umfasst, die eine Behandlung mit der Verbindung der Formel 3 erhalten sollen und 31 Mäuse, die nur Vehikel erhalten sollen, oder alternativ keiner Behandlung unterzogen werden sollen (Kontrollen).
Das Therapieschema in der Behandlungsgruppe wurde initiiert sobald die erste Maus Anzeichen von motorischen Defizite zeigte, für gewöhnlich ungefähr 8 Monate nach der Geburt; dieses Tier wird danach von der Kontrollgruppe ausgeschlossen, so daß deren Größe auf 30 Mäuse verringert wurde. Das Behandlungsschema umfaßt die Applikation einer Dosis von 10 mg/kg der Verbindung der Formel 3, in Form einer Lösung des Hydrochloridsalzes in PEG 400 Macrogol Ph. Eur. in einer Konzentration von ungefähr 5 mg/ml zweimal täglich durch orale Gabe. Die Verbindung wird frühmorgens und spätabends Mäusen verabreicht, die mindestens 6 Stunden vor der Verabreichung des Medikaments kein Futter mehr erhielten. Gleichzeitig mit dem Beginn der Arzneimittelbehandlung wurde ein regelmäßiges Testschema für motorische Fähigkeiten mit stringenden formalen Kriterien für den Onset der Krankheit wie unten beschrieben aufgenommen. Sowohl die Behandlung als auch der Test werden für einen Zeitraum von wenigstens 3 Monaten fortgesetzt, wonach alle Mäuse geopfert werden, die bis dahin noch nicht nach Onset der Krankheit todgeweiht sind. Der todgeweihte Zustand ist erreicht, wenn die Mäuse nicht mehr in der Lage sind sich selbst zu ernähren.
Der Test für motorische Fähigkeiten besteht aus täglicher Bewertung der Mäuse in einem Wire Hang Test und einem Beam Balance Test, jeweils im Duplikat durchgeführt während derselben Testsitzung, aber nicht in unmittelbarer Abfolge für die jeweilige Maus, um Ermüdung zu vermeiden. Der Wire Hang Test erfordert einfach die Fähigkeit der Maus sich an einem umgekehrten Käfiggitter mind. 60 Sekunden lang festzuhalten, nachdem man nur das Festhalten an dem Gitter mit den Vorderfüßen zuließ. Für den Beam Balance Test müssen Mäuse einen schmalen erhöhten Stab zwischen zwei Plattformen überqueren. Um sich früh ankündigende Zeichen von Problemen mit den Hinterbeinen zu detektieren, wird die für das Überqueren benötigte Zeit als auch die Zahl der Ausrutscher mit den Hinterbeinen aufgezeichnet.
Um einen Kompromiss zu erzielen zwischen der Stringenz der Kriterien einerseits, und andererseits aber der Empfindlichkeit für den Zeitpunkt des Onsets ohne Kontamination durch falsche Positive, d.h. Mäuse, bei denen eine Erholung der Leistung auftritt, nachdem sie scheinbar an den Kriterien gescheitert sind, wird verlangt, dass kranke Mäuse entweder bei mind. einem der Tests im Duplikat an zwei aufeinander folgenden Tagen scheitern, oder bei beiden Tests bei wenigstens einem der Duplikattests an zwei aufeinander folgenden Tagen scheitern.
Die Zeiten der Onsets werden für die behandelte Gruppe gegenüber der Kontrollgruppe in einer Überlebenskurve aufgetragen. Mittlere Zeiten des Onsets mit ihren Standardabweichungen werden verglichen, um die statistische Signifikanz des Behandlungseffekts zwischen den beiden Gruppen durch einen one-way ANOVA mit Fisher's post-hoc Test zu ermitteln. Tiere, die aus nicht in Zusammenhang stehenden Gründen sterben, d.h. ohne die typischen Symptome der Tauopathie zu zeigen, werden von der Analyse ausgeschlossen.
Nach dem Opfern wird das Zentralnervensystem Gewebe jeder Maus für die biochemische Analyse von Tau-Phosphorylierungseffekten und der histologischen Bewertung der Tau-Pathologie durch neuropathologische Standardmethoden entnommen. Eine Hälfte jedes Stammhirns und Rückenmarks wird der Extraktion im „Homogenisierungspuffer" und Quantifizierung von PHF-artig phosphoryliertem Tau durch Western-blot Analyse von Homogenat-Überständen mit Phosphoepitop Antikörpern vorzugsweise mit dem MAK AP422 gemäß Beispiel 1 unterworfen. Da nur das transgene humane Tau an dem pathologischen Phosphorylierungsprozeß teilnimmt, muß die Normalisierung auf das gesamte humane Tau erfolgen. Dazu wird ein von Phosphorylierungen unabhängiger MAK mit Spezifität für humanes Tau, wie etwa HT7, eingesetzt, um den endogenen Maus-Tauhintergrund zur Bildung des Intensitätsverhältnisses von Tau-Phosphoepitopen und Gesamt-Tau auszuschließen. Die andere Hälfte des Gewebes wird mit 4% Formaldehyd fixiert und dann geschnitten. Sequentielle Schnitte von Stammhirn und Rückenmarkgewebe werden mit der Gallyas Silberfärbemethode auf neurofibrilläre Tangles [Munoz, Biotech. Histochem., 74, 311-320 (1999)] und mit in der humanen Neuropathologie allgemein gebräuchlichen Phosphoepitop-MAKs wie PHF-1 oder AT8 angefärbt. Sowohl neurofibrilläre Tangles werden in mehreren Schnitten des gleichen Gewebes innerhalb definierter mikroskopischer Felder ausgezählt. Zusätzlich wird die diffusere Anfärbung im Neuropil auf Grund von Neuropil Threads (die ebenfalls aus Paired Helical Filaments bestehen) semi-quantitativ durch Bewertung mit 0, +, ++, +++ blind ausgewertet. Neurofibrilläre Tangle Dichten als auch Neuropil Thread Werte werden dann statistisch verglichen zwischen der behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe durch ANOVA Analyse mit Fisher's post-hoc Test.

Claims

Verwendung einer Indolocarbazol-Verbindung der allgemeinen Formel 1 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon
wobei R₁ entweder COOR (R = H, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl) oder CONHR₄ (R₄ = H, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl) ist; R₂ und R₃ unabhängig voneinander H, F, Methyl, OH, NH₂ oder NR₅R₆ (mit R₅ und R₆ unabhängig voneinander H oder Methyl) ist; und Z entweder (H,H) oder O ist; für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung einer neurodegenerativen und/oder demenziellen Erkrankung, welche durch die molekulare Pathologie des Mikrotubuli-assoziierten Proteins Tau bestimmt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die Krankheit die Alzheimersche Krankheit, Frontallappendegeneration, Picksche Krankheit, Parkinsonismus mit Demenz, corficobasale Degeneration, Argyrophilic Grains Disease, oder supranucleare Palsy ist.
Verwendung gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Indolocarbazol-Verbindung eine Verbindung der Formel 2 oder 3 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon ist.
Verfahren zur Behandlung oder Verhinderung einer neurodegenerativen und/oder dementiellen Erkrankung, die durch die molekulare Pathologie des mikrotubuliassozierten Proteins Tau bestimmt ist, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung der allgemeinen Formel 1 oder eines pharmazeutisch verträglichen Salzes davon an ein behandlungsbedürftiges Subjekt beinhaltet
wobei R₁ entweder COOR (R = H, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl) oder CONHR₄ (R₄ = H, Methyl, Ethyl oder Cyclopropyl) ist; R₂ und R₃ unabhängig voneinander H, F, Methyl, OH, NH₂ oder NR₅R₆ (mit R₅ und R₆ unabhängig voneinander H oder Methyl) ist; und Z entweder (H,H) oder O ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Krankheit die Alzheimersche Krankheit, Frontallappendegeneration, Picksche Krankheit, Parkinsonismus mit Demenz, corticobasale Degeneration, Argyrophilic Grains Disease oder supranucleare Palsy ist.
Verfahren gemäß Anspruch 4 oder 5, wobei die Indolocarbazol-Verbindung eine Verbindung der Formel 2 oder 3 oder ein pharmazeutisch verträgliches Salz davon ist
Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der neurofibrillären Degeneration und ihrer Wirksamkeit umfassend: (i) Inkubation von metabolisch aktivem Hirnschnittgewebe aus einem Gehirn eines Säugers mit Kandidatverbindungen in verschiedenen Konzentrationen; (ii) Provokation der Tau-Hyperphosphorylierung mit einem PP2A Inhibitor; (iii) Quantifizierung von Tau-Phosphoepitopen im Gewebe oder in Gewebsextrakten durch ein immunchemisches Verfahren; und (iv) Vergleich der Phosphoepitop-Provokation in dem Hirnschnittgewebe, das unterschiedliche Konzentrationen einer Inhibitorverbindung ausgesetzt war, mit der von unbehandeltem Kontrollgewebe.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei der PP2A-Inhibitor Okadeinsäure ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7 oder 8, wobei das immunchemische Verfahren die Immunhistochemie von fixiertem oder gefrorenem Gewebe, Western-blotting oder ELISA ist.
Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten Dosierung eines Inhibitors der Paired Helical Filament-artigen Tau-Hyperphosphorylierung zur Behandlung einer Erkrankung, die durch die neurofibrilläre Pathologie charakterisiert ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Titration des Inhibitors in durch einen PP2A-Inhibitor stimulierten Hirnschnitten zur Bestimmung von wirksamen Gewebskonzentrationen; und (ii) pharmakokinetische Bewertung des Dosierungsschemas zur Erzielung wirksamer Konzentrationen im Zentralnervensystem des Subjekts.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei der Inhibitor der Paired Helical Filament-artigen Tau-Hyperphosphorylierung eine Verbindung der allgemeinen Formel 1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei der PP2A-Inhibitor Okadeinsäure ist.
Verfahren zur Bestimmung einer geeigneten Dosierung eines Inhibitors der Paired Helical Filament-artigen Tau-Hyperphosphorylierung zur Behandlung einer Erkrankung, die durch neurofibrilläre Pathologie charakterisiert ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (i) Bestimmung des normalen Spiegels eines Paired Helical Filament-artigen Tau-Phosphoepitops in der zerebrospinalen Flüssigkeit von gesunden Kontrollsubjekten der gleichen Altersgruppe; (ii) Steigern der Dosierung eines Inhibitors in einem einzelnen unter einer Form von neurofibrillärer Degeneration leidenden Subjekt in Intervallen von mehreren Wochen, oder Verabreichen ansteigender Dosen eines Inhibitors, der gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 identifiziert wurde, an einzelne Subjekte; (iii) immunchemische Bewertung der Verringerung des Paired Helical Filamentartigen Tau Phosphoepitope in der zerebrospinalen Flüssigkeit des gleichen Subjekts unmittelbar vor Beginn der Behandlung und nochmal nach mehreren Wochen kontinuierlicher Dosierung des Inhibitors; und (iv) Vergleich des Spiegels von Paired Helical Filament-artiger Phosphoepitop in zerebrospinaler Flüssigkeit vor und nach dem Beginn der Behandlung eines unter einer Form von neurofibrillärer Degeneration leidenden individuellen Subjekts, und Bestimmung der Dosis als die wirksame Dosis, bei der der Spiegel des Paired Helical Filament-artigen Tau-Phosphoepitops in den Bereich reduziert wurde, der bei gesunden Kontrollen der gleichen Altersgruppe vorkommt.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei der Inhibitor der Paired Helical Filament-artigen Tau-Hyperphosphorylierung eine Verbindung der allgemeinen Formel 1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei die immunchemische Bewertung durch einen ELISA-Test durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei das pathologische Tau-Phosphoepitop im Zusammenhang mit der Phosphorylierung der Aminosäuren Thr231 oder Ser422 steht, nummeriert gemäß der Aminosäuresequenz der längsten humanen Splice Isoform (4R2N) des humanen Tauproteins im Zentralnervensystem