JP2002355070A - タウ−チューブリンキナーゼをコードするｄｎａ及びその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 タウ−チューブリンキナーゼをコードする新
規なＤＮＡ等を提供する。 【解決手段】ウシ脳由来の特定な塩基配列で表されるＤ
ＮＡ。該ＤＮＡを含む組換えベクター又は組換えＤＮ
Ａ、該ベクターにより形質転換された形質転換体、該形
質転換体又は組換えベクター若しくは組換えＤＮＡを用
いた組換え蛋白質の製造方法、該方法により得られる組
換え蛋白質、該ＤＮＡがコードするアミノ酸配列を用い
て調製された抗体。タウ−チューブリンキナーゼ活性阻
害物質のスクリーニング方法、該スクリーニング方法に
より得られた物質等を含む脳神経系疾患用薬剤、上記Ｄ
ＮＡを含む遺伝子治療用製剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、タウ−チューブリ
ンキナーゼをコードするＤＮＡ及びその利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】アルツハイマー病患者の脳の主要病理所
見の一つとして知られている神経原線維変化（NFT; Neu
rofibrillary tangle）は、線維状物質であるPaired he
licalfilaments（PHF）が蓄積して生じるものであり、
ＰＨＦの主要な成分として過リン酸化されたタウ蛋白質
が知られている（J. Biochem., 99, 1807-1810 (1986);
Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 83, 4913-4917 (198
6)）。ＰＨＦ中のタウ蛋白質については既に２０数種の
リン酸化部位が決定されており（Morishima-Kawashima
et al., J. Bio. Chem., 270, 823-829 (1995); Hange
r, D. P. et al., J.Neuochem., 71, 2465-2476 (199
8)）、そのリン酸化に関わるリン酸化酵素についても、
タウプロテインキナーゼＩ／グリコーゲンシンターゼキ
ナーゼ−３β（TPKI/GSK-3β）（Ishiguro, K. et al.,
J. Biol. Chem., 267, 10897-10901 (1992)）、タウプ
ロテインキナーゼＩＩ／サイクリン−依存キナーゼ（TP
KII/cdk5）（Ishiguro, K. et al., Neurosci. Lett.,
202, 81-84 (1995)）、及びＭＡＰ（Mitogen-activated
protein）キナーゼ（Reynolds, C.H. et al., J. Neur
ochem., 74, 1587-1595 (2000)）等の多くの酵素が報告
されてきた。しかし、ＰＨＦ中のタウ蛋白質の全てのリ
ン酸化部位に関わるリン酸化酵素が明らかにされている
わけではない。

【０００３】Arioka, M.らによって報告されているよう
に（J. Neurochem., 60, 461-468 (1993)）、あるリン
酸化酵素、例えばＴＰＫＩＩ／ｃｄｋ５によってリン酸
化されたタウ蛋白質は、ＰＨＦ中のタウ蛋白質の過リン
酸化に主要に関わっていると考えられているＴＰＫＩ／
ＧＳＫ−３βによるリン酸化を著しく促進することが知
られている。また、ＴＰＫＩ／ＧＳＫ−３β等において
は、その酵素自体のある特定の構成アミノ酸がリン酸化
されることによっても活性が調節されることが知られて
いる（van Weeren, P.C. et al., J. Biol. Chem., 27
3, 13150-13156(1998)）。このように、タウ蛋白質のリ
ン酸化には非常に多くのリン酸化酵素が複雑に関わって
いることが示唆され、その機構には未だ解明されていな
い部分も多い。

【０００４】タウ−チューブリンキナーゼはウシ脳から
精製され、生体内でタウ蛋白質のリン酸化に関与するリ
ン酸化酵素の一つと考えられており、主としてタウ蛋白
質、チューブリン、ＭＡＰ２、α−カゼイン等を基質と
してこれらの基質中のセリン、スレオニン残基をリン酸
化する。特に配列としてアルギニンの前のセリン、スレ
オニン残基を認識してリン酸化し易いという性質を有し
ており、タウ蛋白質においてＳｅｒ−２０８及びＳｅｒ
−２１０を含む断片をリン酸化することが明らかにされ
ている（Takahashi, M. et al., FEBS Letters, 372, 5
9-64 (1995)）。

【０００５】このようなリン酸化酵素の解析は、タウ蛋
白質のリン酸化機構、ＰＨＦの形成及び蓄積機構の解明
を通して、アルツハイマー病をはじめとする脳神経系疾
患の解明にも重要な意味を持つと考えられる。しかしタ
ウ−チューブリンキナーゼにおいては、リン酸化部位の
特定やリン酸化機構の解明を含めて、未だその詳細な解
析が十分ではなく、該キナーゼをコードする遺伝子の解
析及びアミノ酸配列の解析が望まれていた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、タウ−チュ
ーブリンキナーゼをコードするＤＮＡを提供するために
なされたものである。また、本発明は、該ＤＮＡを含む
組換えベクター又は組換えＤＮＡ、該ベクターにより形
質転換された形質転換体、該形質転換体又は組換えベク
ター若しくは組換えＤＮＡを用いた組換え蛋白質の製造
方法、該方法により得られる組換え蛋白質、該ＤＮＡが
コードするアミノ酸配列を用いて調製された抗体等の提
供も目的とする。また更に、タウ−チューブリンキナー
ゼ活性阻害物質のスクリーニング方法、該スクリーニン
グ方法により得られた物質等を含む脳神経系疾患用薬
剤、上記ＤＮＡを含む遺伝子治療用製剤等の提供も目的
とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記のよ
うな現状に鑑みて研究を重ねた結果、ウシ脳から精製し
たタウ−チューブリンキナーゼ蛋白質を用いて該キナー
ゼの部分アミノ酸配列を得、その配列が新規であること
を見いだした。また、該部分配列を用いてタウ−チュー
ブリンキナーゼの完全長ＤＮＡ配列を取得し、塩基配列
を決定した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂
げられたものである。

【０００８】すなわち本発明によれば、（１）配列表の
配列番号：１に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、
（２）配列表の配列番号：１に記載の塩基配列とストリ
ンジェントな条件でハイブリダイズし、かつタウ−チュ
ーブリンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａ、（３）上記（１）又は（２）に記載のＤＮＡを含む
組換えベクター、（４）上記（３）に記載の組換えベク
ターにより形質転換された形質転換体、（５）少なくと
も、プロモーターと上記（１）又は（２）に記載のＤＮ
Ａを有し、該ＤＮＡがプロモーターの下流に連結されて
いることを特徴とするＤＮＡ、

【０００９】（６）上記（３）に記載の組換えベクタ
ー、又は上記（５）に記載のＤＮＡに含まれる鋳型ＤＮ
Ａを転写及び翻訳させて蛋白質を合成させることを特徴
とする、組換え蛋白質の製造方法、（７）転写及び翻訳
が、無細胞転写翻訳系又は生細胞中で行われることを特
徴とする、上記（６）に記載の方法、（８）生細胞中で
行われる転写及び翻訳が、上記（４）に記載の形質転換
体を用いて行われる、上記（６）に記載の方法、（９）
上記（６）〜（８）のいずれかに記載の方法によって得
られる組換え蛋白質、（１０）配列表の配列番号：２に
記載のアミノ酸配列又はその部分配列を有するペプチド
を抗原として調製された抗体、

【００１０】（１１）タウ−チューブリンキナーゼ活性
阻害物質のスクリーニング方法であって、タウ−チュー
ブリンキナーゼ活性を有する蛋白質、被検物質、及びタ
ウ−チューブリンキナーゼの基質を同時に存在させ、又
は順に作用させて、該基質のリン酸化の程度が低下又は
消失した場合に、該被検物質がタウ−チューブリンキナ
ーゼ活性阻害作用を有すると判定することを特徴とする
方法、（１２）上記（１）若しくは（２）に記載のＤＮ
Ａ又は該ＤＮＡが転写されたｍＲＮＡにハイブリダイズ
するアンチセンスオリゴヌクレオチド、（１３）上記
（１）若しくは（２）に記載のＤＮＡ又は該ＤＮＡの部
分断片を含む遺伝子治療用薬剤、（１４）上記（１０）
に記載の抗体を有効成分として含む脳神経系疾患用薬
剤、及び、（１５）上記（１１）に記載の方法によって
選択される物質を製剤化することを特徴とする、脳神経
系疾患用薬剤の製造方法。（１６）上記（１１）に記載
の方法によって選択される物質を有効成分として含む脳
神経系疾患用薬剤、（１７）上記（１２）に記載のアン
チセンスオリゴヌクレオチドを有効成分として含む、脳
神経系疾患用薬剤、が提供される。

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
る。なお、本明細書において、ＤＮＡの単離・調製、ベ
クターの調製等の遺伝子操作、蛋白質の精製等は、特に
明記しない限り、Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual （T. Maniatis et al., Cold Spring Harbor Labo
ratory (1982)）、新生化学実験講座（日本生化学会
編；東京化学同人）等の実験書に記載の方法又はそれに
準じて行うことができる。

【００１２】１．タウ−チューブリンキナーゼをコード
するＤＮＡ 本発明のＤＮＡは、配列番号：１に記載の塩基配列で表
されるものである。また、本発明のＤＮＡは、配列番
号：１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズし、かつタウ−チューブリンキナーゼ活
性を有する蛋白質をコードし得るＤＮＡであればいかな
る塩基配列を有するものであってもよい。本発明のＤＮ
Ａによりコードされるタウ−チューブリンキナーゼ活性
を有する蛋白質（以下これを「タウ−チューブリンキナ
ーゼ蛋白質」と称することがある）とは、基質としてタ
ウ蛋白質及びチューブリンを同程度にリン酸化する活性
を有する蛋白質を意味する。この蛋白質は、通常基質と
してチューブリンをリン酸化する活性が１である時に、
タウ蛋白質をリン酸化する活性を１．３〜１．４倍有す
る。

【００１３】上記配列番号：１に記載の塩基配列とスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡに
は、配列番号：２のアミノ酸配列において１若しくは数
個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加、若しくは
逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつタウ−チューブ
リンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードし得るＤＮＡ
も含まれる。またこれらのＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ゲ
ノムＤＮＡライブラリー、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラ
リー等から調製されたものでも、合成ＤＮＡでもよい。

【００１４】ここで、ストリンジェントな条件でハイブ
リダイズするＤＮＡとは、配列番号：１で表される塩基
配列と７０％以上、好ましくは９０％以上、更に好まし
くは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ
等が挙げられる。また、ストリンジェントな条件下のハ
イブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーシ
ョンの緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６
０〜６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５〜３００ｍ
Ｍ、好ましくは１５〜６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行
う方法に従って行うことができる。塩基配列の置換、欠
失、挿入、付加、逆位等を含むＤＮＡの調製は、それ自
体既知の通常用いられる方法、例えばサイトダイレクテ
ドミュータジェネシスキット（宝酒造製）や、クイック
チェンジサイトダイレクテドミュータジェネシスキット
（STRATAGENE社製）等のキットを用いて容易に行うこと
ができる。

【００１５】本発明のＤＮＡは、例えば次のように調製
し、その塩基配列を決定することができる。まず、
（１）動物細胞等からタウ−チューブリンキナーゼ蛋白
質を精製し、（２）得られたタウ−チューブリンキナー
ゼ蛋白質を蛋白質分解酵素により消化して、（３）それ
ぞれの部分断片についてアミノ酸配列の解析を行う。次
に、（４）前記（３）で得られたアミノ酸配列よりこれ
をコードする塩基配列を推定して、推定した塩基配列を
有するプライマー等を作製し、これを用いてｃＤＮＡラ
イブラリー等をスクリーニングし、（５）目的とする塩
基配列を有するＤＮＡを取得して、このＤＮＡの塩基配
列を解析する。以下、上記した本発明のＤＮＡの調製方
法について、各工程を更に詳述する。

【００１６】（１）タウ−チューブリンキナーゼ蛋白質
の精製 タウ−チューブリンキナーゼ蛋白質の分離精製に用いら
れる試料としては、活性を維持した状態で該蛋白質が得
られるものであれば特に制限はないが、例えば、動物の
脳等から直接分離精製することができる。該蛋白質の分
離精製に用いられる動物としては、体内にタウ−チュー
ブリンキナーゼを発現している動物であればいかなる動
物でも用いることができる。具体的には、例えばウシ、
ラット、マウス等の哺乳動物が挙げられ、中でも安価で
大量に分離精製を行うことができる点から、ウシの脳が
好ましく用いられる。

【００１７】ウシの脳からタウ−チューブリンキナーゼ
蛋白質を抽出精製する方法としては、一般的に用いられ
る生物試料からの酵素等の蛋白質の抽出精製法を用いる
ことができる。用いる抽出精製方法は、上記したタウ−
チューブリンキナーゼ活性を十分に維持したまま該蛋白
質を得られる方法であればいかなるものでもよいが、中
でも発明者らによって報告されている、FEBS Letters,
372, 59-64 (1995)に記載の方法を用いるのが好まし
い。

【００１８】また、精製工程においては各画分のタウ−
チューブリンキナーゼ活性を測定しながら行うことが好
ましい。タウ−チューブリンキナーゼ活性の測定方法と
しては、タウ−チューブリンキナーゼにより基質である
タウ蛋白質やチューブリン等がリン酸化される程度が測
定できる方法であればいかなるものでも用いることがで
きる。例えば、発明者らによって報告されている、FEBS
Letters, 372, 59-64(1995)に記載の方法に準じて、タ
ウ−チューブリンキナーゼ活性を有する蛋白質を含む溶
液中に最終濃度２００μＭの［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（Amer
sham Pharmacia Biotech社製）、及び基質として０．２
〜０．３ｍｇ／ｍｌのタウ蛋白質又はチューブリンを加
え、３０℃で反応を行いながら、液体シンチレーション
カウンター等を用いて取り込まれる［γ−³²Ｐ］量を経
時的に測定することによってリン酸化の程度を算定する
方法等が挙げられる。

【００１９】ここで得られるタウ−チューブリンキナー
ゼ蛋白質の精製度は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気
泳動において該蛋白質のバンドが明確に分離できる程度
であればよい。具体的な精製方法としては、例えば、公
知の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、電気泳動法等を組み合わせて用いることができ
る。特に、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、
電気泳動法等の組み合わせが好ましい。また、電気泳動
に供する画分の濃縮、脱塩においては、タウ−チューブ
リンキナーゼのように生体内での存在量が少ない蛋白質
の場合には、特にＹ字型ゲル（一ノ瀬ら；平成１０年度
日本生化学会）を用いるのが好ましい。

【００２０】（２）タウ−チューブリンキナーゼ蛋白質
の蛋白質分解酵素による消化 上記（１）において精製されたタウ−チューブリンキナ
ーゼ蛋白質を用いてアミノ酸配列解析を行うための前処
理として、酵素消化等を行うことができる。酵素消化
は、例えば、細胞工学別冊８：新細胞工学実験プロトコ
ール（豊島久眞男、山本雅；秀潤社；３０４−３０９
（１９９３））に示されているように、In Gel Digesti
on法等により行うこともできるし、直接チューブ等の容
器内で混合することにより行ってもよい。消化に用いら
れる酵素としては、リジルエンドプロテアーゼ、Ｖ８プ
ロテアーゼ、エンドプロテアーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプ
ロテアーゼＡｒｇ−Ｃ、トリプシン、キモトリプシン等
の蛋白質分解酵素が挙げられるが、これらの中で基質特
異性、安定性、界面活性剤存在下での活性等の点から、
リジルエンドペプチダーゼを用いるのが好ましい。

【００２１】消化により断片化されて生じたポリペプチ
ドは、そのペプチド鎖数又は疎水性により分離を行うこ
とができる。分離法としては、例えば、逆相高速液体ク
ロマトグラフィー（逆相HPLC）、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、薄相クロマト
グラフィー、ペーパークロマトグラフィー、濾紙電気泳
動法、キャピラリー電気泳動法等の一般的にペプチドの
分離に用いられる方法を用いることができるが、中でも
精度や再現性、用いた試料の回収等の点から、逆相ＨＰ
ＬＣを用いるのが特に好ましい。

【００２２】（３）タウ−チューブリンキナーゼのアミ
ノ酸配列解析 上記（２）において精製分離されたポリペプチドは、例
えばパルスリキッドフェイスアミノ酸シークエンサー
（Applied Biosystems社製）等のアミノ酸配列分析用機
器を用いてそのアミノ酸配列を分析し、更にその結果を
市販の解析ソフト等を用いて解析して、配列を決定する
ことができる。かくして得られるポリペプチドとして、
ウシ脳由来のタウ−チューブリンキナーゼをリジルエン
ドペプチダーゼＡＰ−１で消化することにより得られる
アミノ酸残基数２０及び１９のポリペプチド（配列番
号：３及び４）が挙げられる。

【００２３】（４）タウ−チューブリンキナーゼをコー
ドするＤＮＡの単離 上記（３）で得られたアミノ酸配列から、それをコード
する塩基配列を推定し、推定した塩基配列を有する合成
オリゴヌクレオチドをプライマーとして作製する。得ら
れたプライマーを用いてｃＤＮＡライブラリー等を鋳型
にしたＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片を増幅させるこ
とによりタウ−チューブリンキナーゼをコードするＤＮ
Ａが取得できる。用いられるプライマーとしては、例え
ば、配列番号：３及び４に記載のアミノ酸配列に基づい
て設計された、配列番号：５及び６に記載のオリゴヌク
レオチド等が挙げられる。また、特に好ましいプライマ
ーとして、後述するマウス脳由来のタウ−チューブリン
キナーゼをコードするＤＮＡ（配列番号：１）に基づい
て設計された配列番号：１６及び１７に記載のオリゴヌ
クレオチドが挙げられる。ｃＤＮＡライブラリーとして
は、目的の動物細胞等からｍＲＮＡを精製して、ポリ−
Ｔプライマー等を用いてｃＤＮＡに転写し、これを適当
なベクターにクローニングして作製したものでも、市販
のｃＤＮＡライブラリーでもよい。また、上記動物細胞
等からｍＲＮＡを精製して転写したｃＤＮＡ、及びその
市販品を用いてもよい。プライマーとして用いる合成オ
リゴヌクレオチドは、それ自体公知の通常用いられる方
法によって作製することができる。

【００２４】（５）タウ−チューブリンキナーゼをコー
ドするｃＤＮＡの塩基配列解析 上記（４）で得られたＤＮＡ断片は、これを適当なベク
ターに挿入して組換えベクターを作製し、このベクター
について適当なシークエンス用プライマーと、オートシ
ークエンサー用ＰＣＲシークエンスキット、例えばTher
mo Sequenase fluorescent labelled primer cycle seq
uencing kit（Amersham Pharmacia Biotech社製）等を
用いてシークエンスのためのＤＮＡ合成反応を行い、こ
れを適当なオートＤＮＡシークエンサー、例えばＡＬＦ
ｒｅｄ ＤＮＡシークエンサー（Amersham Pharmacia B
iotech社製）等を用いて解析し、該組換えベクター中に
挿入されたＤＮＡの塩基配列を特定することができる。

【００２５】得られた塩基配列が、オープンリーディン
グフレーム（ORF）の全長を含んでいることを市販の塩
基配列解析ソフト等を用いて解析する。塩基配列にＯＲ
Ｆの全長が含まれていなかった場合は、既知の５’ＲＡ
ＣＥ又は３’ＲＡＣＥ法等を用いて上記ｃＤＮＡライブ
ラリーからＯＲＦの全長を含むｃＤＮＡを取得すること
ができる。ここで、３’ＲＡＣＥに用いられるプライマ
ーとして、例えば配列番号：８、９及び１０に記載のオ
リゴヌクレオチド、５’ＲＡＣＥに用いられるプライマ
ーとして、例えば配列番号：１２、１３及び１４に記載
のオリゴヌクレオチドが挙げられる。かくして得られる
タウ−チューブリンキナーゼをコードするＤＮＡとし
て、例えば、配列番号：１に記載のマウス脳由来の長さ
９６３ｂｐのＤＮＡが挙げられる。

【００２６】２．転写翻訳に用いる組換えベクター又は
ＤＮＡ、形質転換体及び組換え蛋白質 本発明のＤＮＡは、これを適当なプロモーターの下流に
連結させたＤＮＡを作製し、それを転写及び翻訳させる
ことにより組換え蛋白質を取得することができる。上記
ＤＮＡの転写及び翻訳は、生細胞中又は無細胞転写翻訳
系により行うことができる。具体的には、例えば、転写
及び翻訳を生細胞中で行う場合には、本発明のＤＮＡを
適当な発現ベクター、若しくは適当なベクターに適当な
プロモーターとともに挿入して組換えベクターを作製
し、この組換えベクターを用いて適当な宿主微生物を形
質転換したり、適当な培養細胞に導入することにより形
質転換体を作製する。これらの形質転換体を適当な方法
により培養し、培養物から適当な精製方法を用いて精製
することにより組換え蛋白質を取得することができる。

【００２７】（１）組換えベクター及び形質転換体、該
形質転換体による組換え蛋白質の製造 組換えベクターの作製に用いるベクターは、本発明のＤ
ＮＡが適当な宿主微生物の形質転換体又は培養細胞の形
質転換体により発現されるものであれば特に制限はない
が、通常それぞれの宿主微生物又は培養細胞に適したプ
ロモーターが挿入されている市販の蛋白質発現用ベクタ
ーを用いる。また、プラスミドベクター、ファージベク
ターともに用いることができる。具体的には、宿主微生
物が大腸菌の場合には、例えばｐＧＥＸ（Amersham Pha
rmacia Biotech社製）、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（STRATA
GENE社製）等が挙げられ、好ましくはｐＧＥＸが用いら
れる。酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッション
ベクター（STRATAGENE社製）等が、昆虫細胞の場合で
は、例えば、ＢａｃＰＡＫ６（Clontech社製）等が用い
られる。動物細胞の場合では、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ
（STRATAGENE社製）、ｐＳＶＫ３（Amersham Pharmacia
Biotech社製）等が挙げられる。これらのベクターへの
本発明のＤＮＡの挿入は、該ＤＮＡをベクター中のプロ
モーターの下流に該ＤＮＡがコードする蛋白質のアミノ
酸配列がフレームシフトしないで翻訳されるように連結
して行えばよい。

【００２８】本発明のＤＮＡを発現させるためのプロモ
ーターとしては、宿主微生物又は培養細胞が保有するプ
ロモーターを挙げることができるが、これに限られるも
のではなく、具体的には宿主微生物が大腸菌の場合はＴ
３、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いること
ができ、酵母の場合にはｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ
１プロモーター等が挙げられる。また動物培養細胞の場
合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が
挙げられる。

【００２９】作製された本発明の組換えベクターは、通
常用いられる公知の方法に従って任意の宿主微生物又は
培養細胞等に導入され、形質転換体を作製することがで
きる。形質転換法としては、宿主微生物が大腸菌の場合
には、例えば、エレクトロポレーション法（Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 81, 7161 (1984)）及びヒートショ
ック法（J. Mol. Biol., 53, 154 (1970)）等が挙げら
れる。酵母の場合には、例えば、エレクトロポレーショ
ン法、酢酸リチウム法、及びスフェロプラスト法等、動
物培養細胞の場合にはエレクトロポレーション法、ＤＥ
ＡＥデキストラン法（Science, 215, 166 (1982)）、リ
ン酸カルシウム法（Science, 221, 551(1983)）、及び
ウィルスベクター法（Cell, 37, 1053 (1984)）等が挙
げられる。またファージ粒子を用いる場合には、例え
ば、アデノウィルスやレトロウィルス等を用いたインビ
トロパッケージング法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
72,581 (1975)）等が挙げられる。更に、上記した発現
ベクターを用いる方法の他に、プロモーターを連結した
本発明のＤＮＡ断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入
する相同組換え技術（A.A. Vertes et al., Biosci. Bi
otechnol. Biochem.,57, 2036 (1993)）や、あるいはト
ランスポゾンや挿入配列（A.A. Vertes et al., Molecu
lar Microbiol., 11, 739 (1994)）を用いて形質転換体
を作製することもできる。

【００３０】ベクターを導入する宿主としては、本発明
のＤＮＡがコードする蛋白質が体内で生成されるもので
あれば特に制限されないが、例えば大腸菌、酵母、バキ
ュロウィルス（節足動物多角体ウィルス）−昆虫細胞、
動物培養細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌では
ＢＬ２１、ＸＬ−１Ｂｌｕｅ、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（STRA
TAGENE社製）等が好ましく、酵母では例えばＳＰ−Ｑ０
１（STRATAGENE社製）等、バキュロウィルスでは例えば
ＡｃＮＰＶ（J. Biol. Chem., 263, 7406 (1988)）とそ
の宿主であるＳｆ−９（J. Biol. Chem., 263, 7406 (1
988)）等が挙げられる。また動物培養細胞としては、マ
ウス繊維芽細胞Ｃ１２７（J. Virol., 26, 291-298 (19
78)）やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ（Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)）、アフリカ
ミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７（ATCC CRL 1651）等が
挙げられる。中でも、大腸菌ＢＬ２１が好ましく用いら
れる。

【００３１】得られた本発明の形質転換体は、それぞれ
適した培地により培養される。培地中には該形質転換体
の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血
清及び耐性スクリーニングに用いられる薬剤等が含有さ
れる。具体的には、形質転換体の宿主が大腸菌の場合に
は、例えばＬＢ培地（Difco社製）等を用いるのが好ま
しく、酵母の場合にはＹＰＤ培地（Genetic Engineerin
g, 1, 117, Plenum Press (1979)）等、宿主が昆虫細胞
及び動物細胞の場合は、２０％以下の牛胎児血清（FC
S）を含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１
６４０培地（SIGMA社製）、１０％ＦＣＳを含有する低
グルコースＤＭＥＭ培地等を用いることができる。形質
転換体の培養は通常温度２０〜４５℃、ｐＨは５〜８の
範囲で行われ、必要に応じて通気や攪拌が行われる。こ
れら以外の培地組成あるいは培養条件下でも、本発明の
形質転換体が生育し、挿入されたＤＮＡがコードする蛋
白質が生成されるのであれば、いかなるものでもよい。

【００３２】上記のように培養された形質転換体は、培
養後にこれを集め、適当な緩衝液中に懸濁し、超音波、
リゾチーム及び／又は凍結融解等の方法によって菌体あ
るいは細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過等の方法を
用いて蛋白質粗抽出液を取得するか、あるいは形質転換
体の培養上清を得て、これらを更に適当な精製方法を組
み合わせて精製することにより、本発明の組換え蛋白質
を取得することができる。このうち、蛋白質発現用ベク
ターに精製用のタグ等がついているもの、例えばｐＧＥ
Ｘ（Amersham Pharmacia Biotech社製）等を用いた場合
には、アフィニティクロマトグラフィーにより簡便に精
製することができる。

【００３３】（２）無細胞転写翻訳系による組換え蛋白
質の製造 本発明の組換え蛋白質は、無細胞転写翻訳系を用いて発
現させて製造することもできる。ここで無細胞転写翻訳
系とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡから
蛋白質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そ
こに鋳型となり得るＤＮＡを加えることによりそのＤＮ
Ａがコードしている蛋白質が合成され得るあらゆる系を
意味する。具体例としては、真核細胞及びバクテリア細
胞又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された
転写翻訳系が挙げられる。好ましい転写翻訳系として
は、例えば、ウサギ網状赤血球、小麦胚芽、大腸菌から
の抽出液（大腸菌Ｓ３０抽出液）に基づいて調製された
転写翻訳系等が挙げられる。無細胞転写翻訳は、ＴＮＴ
Ｓｙｓｔｅｍｓ（Promega社製）等の市販のキットを
用いることもできる。転写及び翻訳は、それぞれ順に行
っても、同時に行ってもよく、キットを用いる場合には
各キットに示された方法に従って行えばよい。

【００３４】このような無細胞転写翻訳系を用いて組換
え蛋白質を発現させる場合に用いられる組換えＤＮＡ
は、鋳型となる本発明のＤＮＡが前記した適当なプロモ
ーターの下流に連結され、その制御下にありさえすれ
ば、いかなるものでもよい。また、本発明のＤＮＡが適
当な無細胞転写翻訳系用のベクター等に組み込まれた環
状ＤＮＡでもよいし、直鎖ＤＮＡでもよい。本発明に用
いられる無細胞転写翻訳系用のベクターとしては、例え
ば前記したベクターから用いる無細胞転写翻訳系に適し
たものを選択すればよい。またプロモーターとしては、
例えば前記したプロモーターから用いる無細胞転写系に
おいて用いられるＲＮＡ合成酵素が認識できるものを選
択すればよい。具体的には、例えば、ＲＮＡポリメラー
ゼＩを用いる場合には、Ｔ３、Ｔ７等が好ましい。

【００３５】かくして、上記組換えＤＮＡ又はベクター
に含まれる鋳型ＤＮＡの転写及び翻訳、すなわち蛋白質
合成反応を上記無細胞転写翻訳系で行った後、適当な精
製方法を組み合わせて精製することにより組換え蛋白質
を取得することができる。精製方法としては、前記した
とおり、通常生化学的に用いられる蛋白質の精製方法を
応用することができる。ここで、生細胞（形質転換体）
中、又は無細胞転写翻訳系による組換え蛋白質の発現
は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法等で分
離を行い、クマシーブリリアントブルー（CBB）等で染
色したり、又は抗タウ−チューブリンキナーゼ抗体によ
り検出する等、一般的に用いられる蛋白質検出法を用い
て確認することができる。

【００３６】（３）組換え蛋白質 かくして得られる本発明の組換え蛋白質は、前記した本
発明のＤＮＡがコードするものであればいかなるもので
あってもよい。また、例えば配列番号：２に記載のアミ
ノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、
欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からな
るものであっても、該組換え蛋白質が上記したタウ−チ
ューブリンキナーゼ活性を有する蛋白質であれば、いず
れのものでもよい。

【００３７】また、一般的に、発現された蛋白質は生体
内に存在する蛋白質分解酵素により切断（プロセッシン
グ）が起こることが知られている。当然のことながら本
発明の蛋白質も、タウ−チューブリンキナーゼ活性を有
するものであれば、切断されたアミノ酸配列の部分断片
であっても本発明の範囲に含まれる。更に、得られる組
換え蛋白質が遊離体の場合には、公知の方法あるいはそ
れに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に
塩の場合には、遊離体又は他の塩に変換することができ
る。このような塩も本発明の組換え蛋白質に含まれる。
また、該蛋白質に、精製前又は後に適当な蛋白質修飾酵
素を作用させることによって任意に修飾を加えたり、ポ
リペプチド鎖を部分的に除去する等の操作を行って、修
飾蛋白質とすることができる。これらの修飾蛋白質も、
タウ−チューブリンキナーゼ活性を有するものであれば
本発明の範囲に含まれる。

【００３８】３．抗タウ−チューブリンキナーゼ抗体 本発明の抗タウ−チューブリンキナーゼ抗体は、配列番
号：２に記載のアミノ酸配列又はその部分配列を有する
ペプチドを抗原として調製することができる。抗体の調
製方法としては通常用いられる公知の方法を用いること
ができ、抗原として用いられる部分配列についても、公
知の方法に従って抗原性が高くエピトープ（抗原決定
基）として適した配列を選択して用いればよい。

【００３９】エピトープを選択する方法としては、例え
ば「Epitope Adviser（富士通九州システムエンジニア
リング社製）」等の市販の解析ソフトを用いて目的のア
ミノ酸配列を解析し、立体構造上外面に露出していてエ
ピトープとなり易い形状を形成している配列を推定して
選択する方法等が好ましく用いられる。また、例えばあ
る特定の動物種に特異的に結合する抗体を作製する場合
には、他の動物のタウ−チューブリンキナーゼ蛋白質の
アミノ酸配列とホモロジーの低い部分を選択して用いれ
ばよい。

【００４０】本発明の抗体を調製するための抗原として
用いられる部分配列としては、配列番号：２に記載のア
ミノ酸配列に含まれる部分配列であれば任意に選択する
ことができる。例えば、配列番号：１８に記載の配列、
配列番号：２に記載のアミノ酸配列に含まれる部分配列
Ｍｅｔ１−Ａｒｇ２５、Ａｓｐ３７−Ａｓｎ４６、Ｓｅ
ｒ１０７−Ｓｅｒ１１５、Ｇｌｙ１２２−Ｓｅｒ１３
１、Ｌｙｓ２９８−Ａｌａ３２０等が挙げられる。この
中でも、「Epitope Adviser」を用いて解析した結果高
い総合値を示した配列として、配列番号：１８に記載の
配列及びＬｙｓ２９８−Ａｌａ３２０が好ましく、配列
番号：１８に記載の配列が特に好ましい。抗原として用
いるペプチドは、天然物から抽出精製したものでも合成
ペプチドでもよい。ペプチドの合成方法は、それ自体既
知の通常用いられる方法を用いることができる。

【００４１】調製されたペプチドは公知の方法に従って
適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギやマ
ウス等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり
抗体価を高めるために抗原ペプチドの他にアジュバント
等を加えて免疫を行うのが好ましい。免疫後、適宜試験
的に採血を行ってウエスタンブロッティング等の方法で
抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物か
ら採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処
理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。ま
た、必要に応じて、公知の方法に従い血清から抗体成分
を精製した精製抗体を取得することもできる。また、該
動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法
に従って融合させ、適宜ウエスタンブロッティング等の
方法で抗体価を確認して抗体産生能の高いハイブリドー
マを選択し、これを培養することにより、モノクローナ
ル抗体を得ることも可能である。

【００４２】本発明の抗体は、ウエスタンブロッティン
グや組織免疫染色等に用いることができる。また、タウ
−チューブリンキナーゼに結合する性質を有することか
ら、タウ−チューブリンキナーゼ活性を阻害してタウ蛋
白質のリン酸化を阻害し、その結果ＰＨＦ形成を阻害す
ると考えられる。従って、本発明の抗体はアルツハイマ
ー病等の脳神経系疾患用薬剤の有効成分ともなり得る可
能性がある。

【００４３】４．タウ−チューブリンキナーゼ活性阻害
物質のスクリーニング タウ−チューブリンキナーゼ活性を有する蛋白質により
基質となる蛋白質がリン酸化されることを利用して、例
えば、タウ−チューブリンキナーゼによる基質となる蛋
白質のリン酸化を阻害又は抑制する物質のスクリーニン
グを行うことが可能である。このようなスクリーニング
は、少なくとも、（１）タウ−チューブリンキナーゼ活
性を有する蛋白質、（２）被検物質、及び（３）タウ−
チューブリンキナーゼの基質、の存在下で行うことがで
きる。これらは同時に混合してもよいし、それぞれ順に
作用させてもよく、またその順番は不同であってもよ
い。

【００４４】タウ−チューブリンキナーゼ活性を有する
蛋白質としては、天然から抽出精製したものでも、本発
明の組換え蛋白質等を用いてもよい。いずれの場合もタ
ウ−チューブリンキナーゼ蛋白質の精製度は、溶液中に
他の酵素等の蛋白質の混在が少なく、かつ高いタウ−チ
ューブリンキナーゼ蛋白質濃度を有することが好ましい
が、該溶液がスクリーニングを行うのに十分なタウ−チ
ューブリンキナーゼ活性を有してさえいれば、特に制限
はない。タウ−チューブリンキナーゼの基質としては、
タウ−チューブリンキナーゼによるリン酸化を受けるも
のであればいずれのものでもよいが、例えばタウ蛋白質
やチューブリン等を用いることができる。またこれらの
基質となる蛋白質は、天然物でも合成ペプチドでもよ
い。

【００４５】スクリーニングの方法としては、例えば、
溶液中にタウ−チューブリンキナーゼ活性を有する蛋白
質、被検物質、及びタウ−チューブリンキナーゼの基質
を存在させて、前記した方法で該基質のリン酸化の程度
を測定することにより行うことができる。ここで上記被
検物質の存在によって該基質のリン酸化の程度が低下又
は消失した場合に、該被検物質はタウ−チューブリンキ
ナーゼ活性阻害作用を有すると判定する。

【００４６】５．脳神経系疾患用薬剤及び遺伝子治療用
製剤 本発明のスクリーニング方法によりタウ−チューブリン
キナーゼ活性に対して阻害作用を有すると判定された物
質は、アルツハイマー病等の脳神経系疾患用薬剤の有効
成分として有用である。このような物質とは、合成物、
天然物、低分子化合物、蛋白質、糖質等のいかなるもの
でもよく、生理学的に許容されるそれらの塩、水和物並
びに溶媒和物等であってもよい。生理学的に許容される
それらの塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩等の鉱酸
類の塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、ｐ−トルエンスルホ
ン酸塩等の有機酸の塩、グリシン等のアミノ酸の塩等を
挙げることができる。

【００４７】本発明のＤＮＡ又は該ＤＮＡが転写された
ｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌク
レオチドは、細胞等に移入することにより翻訳抑制作用
を示し、タウ−チューブリンキナーゼ蛋白質の産生を抑
制するため、アルツハイマー病等の脳神経系疾患用薬剤
の有効成分として有用である。このようなアンチセンス
オリゴヌクレオチドとしては、適当なベクターとＲＮＡ
ポリメラーゼ等を用いて作製したものでもよいし、合成
オリゴヌクレオチド等を用いることもでき、ＲＮＡ、Ｄ
ＮＡ、又はそれらを修飾したものなど、細胞のｍＲＮＡ
の相補的領域に結合して翻訳を阻害するものであればい
かなるものでもよい。

【００４８】本発明の抗体、本発明のスクリーニング方
法により得られたタウ−チューブリンキナーゼ活性阻害
作用を有する物質、並びにアンチセンスオリゴヌクレオ
チドは、いずれもアルツハイマー病等の脳神経系疾患用
薬剤の有効成分として有用である。これらは、それ自体
単独で脳神経系疾患等の患者に投与することもできる
が、これらの有効成分の１種又は２種以上を含むことも
でき、また、薬理学的に許容される製剤用添加物等を用
いて医薬品組成物として調製し、これを投与するのが好
ましい。このような医薬品組成物としては、錠剤、カプ
セル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、丸剤、リポソーム製
剤、トローチ、舌下剤、液剤、乳剤、懸濁剤等の経口投
与剤の他、注射剤、座剤、軟膏、貼付剤などの非経口投
与用の製剤も挙げることができる。

【００４９】いずれも通常当業界で繁用される方法を用
いて調製することができるが、例えば、経口投与用の錠
剤又はカプセル剤は、通常は単位投与物として提供さ
れ、結合剤、充填剤、希釈剤、打錠剤、滑沢剤、崩壊
剤、着色剤、香味剤及び湿潤剤のような通常の製剤用担
体を添加して製造することができる。錠剤は、この当業
界で周知の方法に従って、例えば、腸溶性コーティング
剤等を用いてコーティングすることができ、例えばセル
ロース、マンニトール、又はラクトース等の充填剤；澱
粉、ポリビニルポリピロリドン、澱粉誘導体、又はナト
リウム澱粉グリコラート等の崩壊剤；ステアリン酸マグ
ネシウム等の滑沢剤；ラウリル硫酸ナトリウム等の湿潤
剤を用いて製造してもよい。

【００５０】経口投与用の液剤は、例えば水性又は油性
懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ剤又はエリキシ
ル剤等の他、使用前に水又は適当な媒体により再溶解さ
れうる乾燥製剤として提供される。このような液剤に
は、通常の添加剤、例えばソルビトール、シロップ、メ
チルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロー
ス、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミ
ニウムゲル又は水素化食用脂肪のような沈殿防止剤、レ
シチン、ソルビタンモノオレート、アラビアゴムのよう
な乳化剤、アーモンド油、精製ココナッツ油、油状エス
テル（例えばグリセリンのエステル）、プロピレングリ
コール、エチルアルコールのような（食用油も包含しう
る）非水性媒体、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のメチルエス
テル、エチルエステル、若しくはプロピルエステル、又
はソルビン酸のような保存剤及び必要に応じて通常の香
味剤又は着色剤を配合することができる。

【００５１】経口投与用の製剤は、混合、充填、又は打
錠などの当業界で周知の方法により製造することができ
る。また、反復配合操作を用いて多量の充填剤等を使用
した製剤中に有効成分を分布させてもよい。非経口投与
用の製剤は、一般には有効成分である化合物と滅菌媒体
とを含有する液体担体投与用製剤として提供される。非
経口投与用の溶剤は、通常、化合物を媒体に溶解させて
滅菌濾過し、次に適当なバイアル又はアンプルに充填し
て密封することにより製造される。安定性を高めるため
に組成物を凍結させた後にバイアル中に充填し、水を真
空下で除去してもよい。非経口懸濁液は実質的に非経口
溶液の場合と同じ方法で製造されるが、有効成分を媒体
に懸濁させてエチレンオキシド等により滅菌することに
より好適に製造できる。また、有効成分が均一分布とな
るように必要に応じて界面活性剤、湿潤剤等を添加して
もよい。

【００５２】有効成分である物質の投与量は、物質の活
性の強度、治療や予防の目的、患者の症状、体重、年齢
や性別等を考慮して適宜決定すればよい。また、１日あ
たり１〜数回に分けて投与するのが望ましい。

【００５３】本発明のＤＮＡ又は該ＤＮＡの部分断片
は、遺伝子治療用薬剤として用いることもできる。この
場合、本発明のＤＮＡ又はその部分断片を単独で投与し
てもよいし、レトロウィルスベクター、アデノウィルス
ベクター、アデノウィルスアソシエイテッドウィルスベ
クター等の適当なベクターに挿入してこれを投与しても
よい。製剤の形態としては、ＤＮＡについてはそのまま
で、又は、吸収促進のための補助剤等の薬理学上繁用さ
れる担体とともに製剤化して、遺伝子銃やハイドロゲル
カテーテル等を用いて投与することができる。

【００５４】

【実施例】以下、実施例により本発明を説明するが、本
発明はこれの実施例より何ら限定されるものではない。
なお、下記の実施例において用いた略語の正式名称は、
以下の通りである。 TTK : Tau-tubulin kinase MAP(s) : Microtuble associated protein(s) PCR : Polymerase Chain Reaction PBS : Phosphate Buffered Saline HPLC : High-Performance Liquid Chromatography SDS : Sodium Dodecyl Sulfate GST : Glutathion-S-transferase

【００５５】実施例１ ＴＴＫをコードするＤＮＡの塩
基配列解析 （１）ウシ脳からのＴＴＫ蛋白質の精製及び濃縮 ＴＴＫ蛋白質は、ウシ脳のＭＡＰｓの調製方法を改良し
て本発明者らが開発した、FEBS Letters, 372, 59-64
(1995)に記載の方法に従って精製した。すなわち、三菱
化学社中標津（なかしべつ）血清センターより提供され
たウシ脳を適量のバッファーＡ（100mM MES-NaOH, pH6.
5, 0.5mM Mg-acetate, 1mM EGTA）でホモジナイズし、I
shiguro, K. et al., J. Biol. Chem., 267, 10897-109
01 (1992)に記載の方法に従ってＭＡＰｓ画分を調製し
て、その上清をＴＴＫの調製に供した。ＭＡＰｓ画分と
は、タウ蛋白質やタウ−プロテインキナーゼＩ（TPKI）
等の、微小管結合蛋白質（MAPs）やそれに関わる種々の
酵素が含まれることが明らかになっている画分である。

【００５６】得られたＭＡＰｓ画分の上清を、ＰＣバッ
ファー（20mM MES-NaOH, pH6.8, 5mM Mg-acetate, 1mM
EGTA）で平衡化したホスホセルロースゲル（P11; Whatm
an社製）と混合し、得られたゲルを０．１Ｍ ＮａＣｌ
を含むＰＣバッファーで洗浄してカラム（3.6 × 30c
m）に充填して、０．１−１．０Ｍ ＮａＣｌでリニア
グラディエントを作製したＰＣバッファー１０００ｍｌ
でカラムクロマトグラフィーを行った。各画分について
ＴＴＫ活性測定を行い、ＴＴＫが多く含まれる画分を分
取した。すなわち、最終濃度２００μＭの［γ−³²Ｐ］
ＡＴＰ（AmershamPharmacia Biotech社製）、及び、基
質として０．２〜０．３ｍｇ／ｍｌのタウ蛋白質及びチ
ューブリンを加え、３０℃で反応を行いながら液体シン
チレーションカウンターを用いて取り込まれる［γ−³²
Ｐ］量を経時的に測定し、リン酸化の程度を算定した。
その結果、タウ蛋白質及びチューブリンをリン酸化する
ＴＴＫ活性は０．３−０．５Ｍ ＮａＣｌの画分に高い
ことが確認された。

【００５７】この画分を更に分画するために、S-Sephar
ose（Pharmacia LKB BiotechnologyAB社製）を充填した
カラム（1.7 × 9.0cm）を用いたクロマトグラフィーを
行った。まずＰＣバッファーでS-Sepharoseを平衡化及
び洗浄（100ml）し、更に別のバッファー（20mM HEPES-
NaOH, pH8.2, 5mM Mg-acetate, 1mM EGTA, 0.05M NaCl;
100ml）で洗浄してから、０．０５−０．３Ｍ ＮａＣ
ｌのリニアグラディエントを作製した同バッファー２０
０ｍｌで分画を行った。前述の方法と同様にＴＴＫ活性
測定を行ったところ、０．２５Ｍ ＮａＣｌの画分にＴ
ＴＫ活性を有する蛋白質が得られたことが確認された。
この画分をYM-10 Diaflo membrane（Amicon社製）によ
り濃縮して、Ｇ３０００ＳＷカラム（7.5 × 600mm; To
soh社製）を接続したＨＰＬＣを用いて分離を行った。
平衡化は０．３Ｍ ＮａＣｌを加えたバッファーＢ（10
0mM MES-NaOH, pH6.5, 5mM Mg-acetate, 1mM EGTA）に
より行い、２ｍｌずつ分画した。最も高いＴＴＫ活性を
有する画分は分子量約３２ＫＤａ付近の７８番目の画分
（Fr.78）に得られた。

【００５８】上記で得られた画分のうち、ＴＴＫ活性を
有していたＦｒ．７７−７９を回収して、AF-heparin T
oyopeal 650 column（0.7 × 1.5cm; Tosoh社製）にて
更に分画した。カラムはリン酸ナトリウムバッファー
（20mM Sodium phosphate, pH7.6, 5mM Mg-acetate, 1m
M EGTA）を用いて充填し、０．０３Ｍから０．５Ｍまで
の段階的なＮａＣｌグラディエントを作製してカラムク
ロマトグラフィーを行った。最初の９ステップ（0.03M,
0.07M, 0.11M, 0.15M, 0.19M, 0.23M, 0.27M, 0.31M,
0.35M NaCl）は各濃度２ｍｌずつ、最後の３ステップ
（0.4M, 0.45M, 0.5M NaCl）は１ｍｌずつ送液すること
とし、分画された画分の回収は１ｍｌずつ行った。得ら
れた各画分のＴＴＫ活性を測定した結果、ＴＴＫ活性を
有する蛋白質は、０．５Ｍ ＮａＣｌを含むバッファー
により流出したＦｒ．１７〜１９に単一のピークとして
得られたことが解った。

【００５９】このようにして得られた画分を、ロート型
ゲル法（W. Staudenmann et al., Sample handling for
proteome analysis. Electrophoresis, 19, 901-908）
を改良したＹ字型ゲル（一ノ瀬ら；平成１０年度日本生
化学会）を用いた電気泳動に供し、更に分離及び濃縮を
行った。すなわち、Ｙ字型ゲルを用いたＳＤＳ−５％ア
クリルアミドゲル電気泳動（18mA, 6.5hrs）を行って濃
縮し、泳動後のゲルをクマシーブリリアントブルー（CB
B）染色して確認された２８〜４０ＫＤａ付近の蛋白質
のバンドを切り出した。次に切り出したゲルを脱染液
（20% MeOH, 7% Acetate）に浸して脱染した後、バッフ
ァー（125mM Tris-HCl, pH6.8, 0.1% SDS,1.5mM DTT,
0.5% 2-Mercaptoethanol, 1mM EDTA, 10% Sucrose）中
で細断した。細断したゲルは、そのまま試料として通常
の平板ゲルを用いたＳＤＳ−９％アクリルアミドゲル電
気泳動（10mA, 3hrs）に供し、泳動後のゲルをＣＢＢ染
色した。その結果、３２ＫＤａ付近の蛋白質がシングル
バンドとして確認された。

【００６０】（２）ＴＴＫ蛋白質の蛋白質分解酵素によ
る消化 上記（１）で確認された目的のバンドを含むゲルを切り
出してバッファー（100mM Tris-HCl, pH9.0）中で細断
し、リジルエンドペプチダーゼＡＰ−１（WAKO社製）を
０．３μｇ加えて、３７℃で終夜、消化を行った。消化
により得られたペプチドを含む試料溶液は、遠心分離
（15000rpm, 5min）によりゲルを除去してＨＰＬＣにイ
ンジェクションし、分離精製を行った。ＨＰＬＣの固相
としては逆相カラム（C8 column; 2.1 × 150mm; Inert
sil; GL Sciences Inc., Tokyo社製）を用い、これに移
動相として０−７０％アセトニトリルのリニアグラディ
エントを作製した０．１％トリフロロ酢酸１０ｍｌを送
液し、カラムクロマトグラフィーを行って、溶出した試
料をピークごとに全て分取した。また、試料とは別にコ
ントロールとして、蛋白質を含まないＳＤＳ−９％アク
リルアミドゲルを細断して同様に調製したものを用いて
ＨＰＬＣによるクロマトグラフィーを行い、ゲルやリジ
ルエンドペプチダーゼ等の目的の蛋白質以外のものに由
来するパターンを測定した。

【００６１】（３）ＴＴＫペプチドのアミノ酸配列解析 上記（２）で得られた各フラクションを、アミノ酸配列
解析装置パルスリキッドフェイスアミノ酸シークエンサ
ー（ABI 492 cLC protein sequencer; AppliedBiosyste
ms社製）を用いて分析及び解析した。この際、まず上記
（２）で試料及びコントロールを測定して得られた結果
を比較することによって、試料由来のペプチドが含まれ
るフラクションを推定し、これを選択して分析及び解析
を行った。その結果、配列Ｂ−１（配列番号：３）及び
Ｂ−４（配列番号：４）を得た。

【００６２】（４）ＰＣＲ法を用いたＴＴＫ遺伝子配列
の解析 上記（３）で得られたペプチドＢ−１とＢ−４のアミノ
酸配列に基づき、２９残基の混合プライマー（配列番
号：５及び６）を作製し、マウス脳より精製したｍＲＮ
Ａを鋳型として作製したｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを
行い、約４００塩基の増幅ＤＮＡ断片を得た。酵素とし
てはAmpli Taq DNA polymerase（PERKIN ELMER社製）、
サーモサイクラーとしてはGene Amp PCR Systems 9600
（PERKIN ELMER社製）を用いた。増幅ＤＮＡ断片は、PC
R-Script Amp Cloning Kit（STRATAGENE社製）を用い
て、pPCR-Script Amp SK(+)プラスミドベクター（STRAT
AGENE社製）に挿入され、大腸菌ＤＨ５−α株（TOYOBO
社製）にヒートショック法を用いて形質転換して、得ら
れた形質転換体よりキアゲンミニプレップキット（QIAG
EN社製）を用いて環状プラスミドＤＮＡを精製した。操
作は全て各キットに収載の方法に従った。このプラスミ
ドに挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を、蛍光ラベルM-
13forward primer及びreverse primer（Amersham Pharm
acia Biotech社製）と、Thermo Sequenase fluorescent
labelled primer cycle sequencing kit（Amersham Ph
armacia Biotech社製）を用いて反応させ、ＡＬＦｒｅ
ｄ ＤＮＡシークエンサー（Amersham Pharmacia Biote
ch社製）を用いて解析した。その結果、配列番号：７に
記載の４１９塩基のＤＮＡ配列が得られた。

【００６３】次に、得られた配列番号：７に記載の４１
９塩基のＤＮＡ配列に基づいて新たに３つのセンスプラ
イマー（プライマー１〜３）を作製し、Marathon-Ready
cDNA: Mouse brain（CLONTECH社製）を用いて、該キッ
ト中のｃＤＮＡを鋳型として３’ＲＡＣＥ法を実行し
た。まず上記ｃＤＮＡを鋳型にして、プライマー１（配
列番号：８）のみを用いたＰＣＲを行った。得られたＰ
ＣＲ産物に対して更に、プライマー２（配列番号：９）
とキットに添付されたアダプタープライマーＡＰ−１を
用いたＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片をアガロ
ースゲル電気泳動で確認後、これを鋳型として、更にプ
ライマー３（配列番号：１０）とキットに添付されたア
ダプタープライマーＡＰ−２を用いたＰＣＲを行い、約
１２００塩基のＤＮＡ断片を得た。これらの操作は全て
キットに収載の方法に従った。増幅されたＤＮＡ断片
は、ｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙプラスミドベクター（Prom
ega社製）に挿入後、これを大腸菌ＤＨ５−α株（TOYOB
O社製)に形質転換して、キアゲンミニプレップキット
（QIAGEN社製）を用いて環状プラスミドＤＮＡを精製し
た。得られたプラスミドＤＮＡを用いて前記の方法と同
様に塩基配列解析を行ったところ、配列番号：１１に記
載のＤＮＡ配列を得た。このＤＮＡ配列は先に得られた
配列番号：７に記載の４１９塩基の配列と３４５塩基が
完全に一致し、かつ、終始コドンＴＧＡを含んでいるこ
とが解った。

【００６４】前記の方法と同様に、この配列番号：１１
に記載のＤＮＡ配列に基づいて新たに３つのアンチセン
スプライマー（プライマー４〜６）を作製し、Marathon
-Ready cDNA: Mouse brain（CLONTECH社製）を用いて、
該キット中のｃＤＮＡを鋳型として５’ＲＡＣＥ法を実
行した。まず上記ｃＤＮＡを鋳型にして、プライマー６
（配列番号：１２）のみを用いたＰＣＲを行った。得ら
れたＰＣＲ産物に対して更に、プライマー５（配列番
号：１３）とキットに添付されたアダプタープライマー
ＡＰ−１を用いたＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動で確認後、これを鋳型とし
て再度プライマー４（配列番号：１４）とキットに添付
されたアダプタープライマーＡＰ−２を用いたＰＣＲを
行い、約８５０塩基のＤＮＡ断片を得た。これらの操作
は全てキットに収載の方法に従った。増幅されたＤＮＡ
断片はｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙプラスミドベクター（Pr
omega社製）に挿入後、これを大腸菌ＤＨ５−α株（TOY
OBO社製)に形質転換し、キアゲンミニプレップキット
（QIAGEN社製）を用いて環状プラスミドＤＮＡを精製し
た。得られたプラスミドＤＮＡを用いて前記の方法と同
様に塩基配列解析を行い、配列番号：１５に記載のＤＮ
Ａ配列を得た。このＤＮＡ配列は、先に得られた配列番
号：７に記載の４１９塩基の配列を含み、かつ、開始コ
ドンＡＴＧを含んでいることが解った。

【００６５】次に、ＯＲＦの全長を含ＤＮＡ断片を得る
ために、配列番号：７、１１、及び１５に記載のＤＮＡ
配列を解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ（ソフトウェア開発株
式会社製）を用いて連結し、得られた配列に含まれる
５’末端の配列に基づいて新たにプライマー７（配列番
号：１６）を、３’末端の配列に基づいてプライマー８
（配列番号：１７）を作製して、Marathon-Ready cDNA:
Mouse brain（CLONTECH社製）を用いて、該キット中の
ｃＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲを行いＤＮＡ断片を得た。
増幅されたＤＮＡ断片はｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙプラス
ミドベクター（Promega社製）に挿入後、これを大腸菌
ＤＨ５−α株（TOYOBO社製)に形質転換し、キアゲンミ
ニプレップキット（QIAGEN社製）を用いて環状プラスミ
ドＤＮＡを精製した。得られたプラスミドＤＮＡを用い
て、前記の方法と同様にこのＤＮＡ断片の塩基配列解析
を行った。その結果、本発明のＴＴＫ蛋白質をコードす
る完全長ｃＤＮＡ配列（配列番号：１）であることが確
認された。また、得られた塩基配列を対応するアミノ酸
配列に変換して、コードされる蛋白質のアミノ酸配列
（配列番号：２）を確認した。

【００６６】実施例２ 抗ＴＴＫ抗体「ＴＴＫ−Ｃ」の
作製 ＴＴＫのＣ末側のアミノ酸配列（配列番号：１８）のＮ
末にシステイン残基（Cys）を付加した合成ペプチド１
０ｍｇに、１０ｍＭリン酸バッファー（pH7.2)１ｍｌを
加えて溶解した。活性化ＫＬＨ（Imject Maleimide Act
ivated KeyholeLimpet Hemocyanin; Pierce社製）のバ
イアルに直接ＭｉｌｌｉＱ（MILLIPORE社製）水１ｍｌ
を加えて溶解し、その半量を前記ペプチド溶液に加え
て、ｐＨ７〜７．５に調整した後、室温で２時間マグネ
チックスターラーを用いて撹拌しながら反応させた。反
応終了後、反応液を２ＬのＰＢＳを用いて４回透析し
た。透析後、反応溶液にＰＢＳを加えて１０ｍｌにメス
アップして、チューブに１ｍｌずつ分注して−２０℃に
凍結保存し、これを抗原溶液として用いた。

【００６７】調製した抗原溶液１ｍｌを、フロイントの
コンプリートのアジュバント（Freund's Adjuvant; SIG
MA社製) １．１ｍｌと混合してエマルジョンを調製し、
体重２〜２．５ｋｇのウサギの背筋６〜８カ所にわたっ
て注射することにより免疫を行った。１ヶ月後、同様に
抗原溶液０．５ｍｌをフロイントのインコンプリートの
アジュバント（SIGMA社製) ０．５５ｍｌと混合して調
製したエマルジョンで２度目の注射を行い、この操作を
更に２回繰り返した。最後の免疫から２週間後、ウサギ
の耳より約３０ｍｌの採血を行った。採取した血液は３
７℃で３０分間加温した後、４℃で一晩放置し、遠心分
離（3,000rpm, 10min）を行って抗血清約１５ｍｌを得
た。

【００６８】得られた抗血清は、抗原として用いた前記
合成ペプチドをカップリングさせたSepharose 4B（Amer
sham Pharmacia Biotech社製）を用いて精製を行った。
まず、抗血清１０ｍｌを分取し、同量の結合用バッファ
ー（ImmunoPure Gentle Ag/Ab Binding Buffer; Pierce
社製）及び１ｍｌのSepharose 4Bと混合して、４℃で一
晩攪拌しながら反応を行った。反応終了後、遠心分離
（3,000rpm, 5min）を行って上清を除去し、得られたSe
pharose 4Bをムロマックカラム（7 × 60mm; 室町化学
工業社製）に充填した。これを結合用バッファー２０ｍ
ｌで洗浄し、次いで溶出用バッファー（ImmunoPure Gen
tle Ag/Ab Elution Buffer; Pierce社製)１０ｍｌで溶
出を行い、カラムから流出するバッファーをフラクショ
ンコレクターで回収した（10drops/tube）。各フラクシ
ョンの吸光度２８０ｎｍの値を分光光度計を用いて測定
し、大きな値を示したフラクション（Fr.2-7）を１Ｌの
ＰＢＳで４回透析した。得られた抗体溶液は、再度分光
光度計により測定した吸光度２８０ｎｍの値を換算して
蛋白質濃度を求め、これを抗ＴＴＫ抗体「ＴＴＫ−Ｃ」
とした。

【００６９】実施例３ 発現プラスミドの作製、及び組
換え蛋白質の発現・精製 （１）発現プラスミドの作製 実施例１の（４）で得られた配列番号：１に記載のＤＮ
Ａ配列を含むＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙプラ
スミドベクター（Promega社製）に挿入して作製したプ
ラスミドＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩに
より消化し、配列番号：２のアミノ酸番号１１〜３２０
で表されるアミノ酸をコードするＤＮＡ断片を得た。

【００７０】（２）組換え蛋白質の発現 次に、大腸菌用発現ベクターｐＧＥＸ−６ｐ−２（Amer
sham Pharmacia Biotech社製）を制限酵素ＳｍａＩ及び
ＸｈｏＩにより消化し、上記のＤＮＡ断片を、Ｔ４−Ｄ
ＮＡリガーゼ（Promega社製）を用いて挿入し、蛋白質
発現組換えベクターを調製した。この組換えベクターを
ヒートショック法により大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに形
質転換してプラスミドＤＮＡを得たのち、再度大腸菌Ｂ
Ｌ２１にエレクトロポレーション法により形質転換し
た。得られた形質転換体は１００μｇ／ｍｌのAmpicill
in（SIGMA社製）を含む４ｍｌのＬＢ培地に接種し、３
０℃で１２〜１６時間好気的に培養した。培養後、これ
に新しい培地を加えて計４０ｍｌとし、更に３０℃で４
時間培養した後、発現ベクターｐＧＥＸ−６ｐ−２のプ
ロモーター転写活性誘導剤であるＩＰＴＧ（isopropyl-
1-thio-β-D-galactopyranoside; Promega社製）を最終
濃度１ｍＭになるように加え、再び２０℃で２０時間培
養した。

【００７１】培養後の菌体を遠心分離（5,000rpm, 1mi
n）により回収して２ｍｌのソニケーションバッファー
（50mM Tris-HCl, pH8.5, 50mM NaCl, 1mM EDTA, 5mM D
TT, 1%Triton X-100）に懸濁し、これをソニケーター
（ULTEA Sonic Homogenizer UH-50; SMT社製）を用いて
超音波処理（Channel 5, 30sec, 4times）した。次に、
超音波処理により破砕した菌体を遠心分離（13,000rpm,
1min）し、回収した上清と沈殿物をそれぞれサンプル
バッファー（0.2M Tris-HCl, pH6.8, 6% SDS, 30% Glyc
erol, 7.5% 2-Mercaptoethanol）により変性処理（100
℃, 5min）して、ＳＤＳ−９％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動を行った。泳動後のゲルをＣＢＢ染色すること
により、分子量６２ＫＤａの、ＴＴＫ蛋白質とＧＳＴ蛋
白質の融合蛋白質を確認した。

【００７２】（３）組換え蛋白質の精製 上記（２）で得られた融合蛋白質を、Bulk GST Purific
ation Modules（Amersham Pharmacia Biotech社製）を
用いて精製した。精製は、（ｉ）GST Sepharose4B（Ame
rsham Pharmacia Biotech社製）に吸着させた融合蛋白
質をそのまま回収する方法、及び、（ｉｉ）GST Sephar
ose 4Bへの吸着後にプロテアーゼ処理を行って組換えＴ
ＴＫ蛋白質のみを回収する方法の２通りを行った。

【００７３】（ｉ）融合蛋白質の回収 上記（２）で得られた融合蛋白質を含む上清１ｍｌを、
８０μｌのGST Sepharose 4Bの入ったエッペンドルフチ
ューブに加えて混合し、ミニディスクローターで回転さ
せながら４℃で１時間反応させた。反応後、遠心分離
（15000rpm, 3min）を行い、融合蛋白質を吸着したGST
Sepharose 4Bを沈殿として得て、３００μｌのＰＢＳで
３回洗浄した。得られた沈殿に１５０μｌの溶出バッフ
ァー（50mMTris-HCl, pH8.0, 0.15M NaCl, 10mM 還元型
グルタチオン, 0.1% Triton X-100）を加え、４℃で１
０分間、ミニディスクローターで回転させながら反応さ
せ、反応終了後、遠心分離（15,000rpm, 3min）を行
い、溶出した融合蛋白質を上清として得た。沈殿には更
に溶出バッファーを等量（150μｌ）加えて同様の溶出
操作を２回行い、それぞれ別のチューブに回収した。

【００７４】得られた溶出画分を前述のサンプルバッフ
ァーにより変性後、ＳＤＳ−９％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動を行って泳動後のゲルをＣＢＢ染色すること
により、約６２ＫＤａの、ＴＴＫ蛋白質とＧＳＴ蛋白質
の融合蛋白質が得られたことを確認した（図１：Ａのｌ
ａｎｅ４ )。また、ＰＢＳで洗浄した洗液（ｌａｎｅ
２）、及び融合蛋白質溶出後の２回の溶出操作では融合
蛋白質がほとんど含まれないことが確認された（ｌａｎ
ｅ５及び６）。

【００７５】（ｉｉ）組換えＴＴＫ蛋白質の回収 上記（２）で得られた融合蛋白質を含む上清１ｍｌを、
８０μｌのGST Sepharose 4Bの入ったエッペンドルフチ
ューブに加えて混合し、ミニディスクローターで回転さ
せながら４℃で１時間反応させた。反応後、遠心分離
（15,000rpm, 3min）を行い、融合蛋白質を吸着したGST
Sepharose 4Bを沈殿として得て、３００μｌのクレー
ブバッファー（50mM Tris-HCl, pH7.5, 0.15M NaCl, 1m
M EDTA, 1mM DTT）で３回洗浄した。遠心分離（15,000r
pm, 3min）を行って十分にバッファーを除いた沈殿に、
２．５ＵｎｉｔのPreScission Protease（PSP; Amersha
m Pharmacia Biotech社製）を４５μｌのクレーブバッ
ファーに溶解したものを添加し、４℃で終夜、ミニディ
スクローターで回転させながら反応を行った。ＰＳＰは
ＧＳＴ蛋白質と挿入ＤＮＡ由来の蛋白質との結合を切断
する酵素であり、反応終了後、遠心分離（15,000rpm, 3
min）により切断された蛋白質を含む反応液を上清とし
て回収した。沈殿は、更に１００μｌのクレーブバッフ
ァーで３回溶出させ、最後に１００μｌの前記溶出バッ
ファーにより洗浄した。これらは全て別の画分としてチ
ューブに回収した。

【００７６】得られた各画分をサンプルバッファーによ
り変性後、ＳＤＳ−９％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行い、泳動後のゲルをＣＢＢ染色した。反応液に約
３６ＫＤａのＴＴＫ蛋白質、約２６ＫＤａのＧＳＴ蛋白
質、及び約４６ＫＤａの余剰ＰＳＰ蛋白質が含まれるこ
とが確認された（図１：Ａのｌａｎｅ９)。次いで３回
行った溶出操作による画分にはそれらの蛋白質はほとん
ど含まれておらず（ｌａｎｅ１０から１２）、溶出バッ
ファーを用いた洗浄操作でもほとんど見られなかった
（ｌａｎｅ１３）ため、発現された蛋白質は最初の反応
液に十分に回収されたことがわかった。一方、図１：Ａ
のｌａｎｅ４、９、及び１０と同じ画分をサンプルバッ
ファーにより変性処理して、ＳＤＳ−９％ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、泳動後のゲルをセミドライ
ブロッター（日本泳動社製）を用いてニトロセルロース
膜にブロット（160mA, 1hr）した。この膜を、実施例２
で作製した抗ＴＴＫ抗体「ＴＴＫ−Ｃ」（反応濃度：約
15μg/ml）を用いて免疫染色して、ＰｒｏｔＢｌｏｔウ
エスタンブロットＡＰシステム（Promega社製）により
検出した。その結果、図１：Ｂのｌａｎｅ３において融
合蛋白質の約６２ＫＤａのバンドが、また、図１：Ｂの
ｌａｎｅ４及び５においては組換えＴＴＫ蛋白質の約３
６ＫＤａのバンドが検出され、蛋白質が十分に精製され
たことが確認された。

【００７７】実施例４ 組換えＴＴＫ蛋白質のキナーゼ
活性の測定 上記実施例３で得られた融合蛋白質及び組換えＴＴＫ蛋
白質のＴＴＫ活性を次の方法で測定した。まずコントロ
ールとして、ＴＴＫ蛋白質をコードするＤＮＡ配列が挿
入されていない点を除いては前記の方法と同様に調製し
た発現ベクターを用いて、同様の方法で形質転換、蛋白
質の発現、及びBulk GST Purification Modules（Amers
ham Pharmacia Biotech社製）よる精製を行って、ＧＳ
Ｔ蛋白質のみが含まれる溶出画分を調製した。実施例３
で得られた各溶出画分は前処理として、バッファーＢ
（100mM MES-NaOH, 5mM 酢酸マグネシウム, 1mM EGTA,
5mM 2-mercaptoethanol, Protease Inhibitors）を用い
て４℃で終夜透析を行った。透析後の画分及びコントロ
ールの画分にそれぞれ、最終濃度２００μＭの［γ−³²
Ｐ］ＡＴＰ（Amersham Pharmacia Biotech社製）及び
０．３ｍｇ／ｍｌのタウ蛋白質又はチューブリンを基質
として加え、３０℃で反応を行って、２時間後、４時間
後、７時間後にそれぞれ適当量の反応液を３ＭＭ濾紙
（Whatman社製）にスポットした。この濾紙を洗浄液（5
% TCA, 0.25% Na₂WO₄, 0.5% ピロリン酸ナトリウム, pH
2.0）で洗浄した後、冷エタノール及びジエチルエーテ
ルで更に洗浄してから乾燥させ、液体シンチレーション
カウンターを用いて［γ−³²Ｐ］を測定し、リン酸の取
り込み量を算出した。取り込まれたリン酸の量をＴＴＫ
活性として縦軸に、反応時間を横軸にプロットしてグラ
フを作成した（図２）。

【００７８】この結果より、融合蛋白質の溶出画分（図
２：Ａ）、及び酵素消化によりＴＴＫ蛋白質とＧＳＴ蛋
白質が混合して含まれる溶出画分（図２：Ｂ）は共に、
発現された組換えＴＴＫ蛋白質がタウ蛋白質及びチュー
ブリンを同程度リン酸化することが確認された。更に、
チューブリンをリン酸化する活性が１である時に、タウ
蛋白質をリン酸化する活性を１．３〜１．４倍有するこ
とが確認された。

【００７９】

【発明の効果】本発明のタウ−チューブリンキナーゼを
コードするＤＮＡ、組換え蛋白質、抗体等の提供によ
り、アルツハイマー病等の患者脳におけるタウ蛋白質の
過リン酸化やＰＨＦの蓄積、神経細胞の傷害等に関する
メカニズムの解明が可能になる等、未だに不明な点の多
いこのような脳神経系疾患の病因解明が可能となる。ま
た、本発明の抗体、本発明のスクリーニング方法により
得られたタウ−チューブリンキナーゼ活性阻害作用を有
する物質、並びにアンチセンスオリゴヌクレオチド等
は、いずれもアルツハイマー病等の脳神経系疾患用薬剤
となり得ると考えられる。

【００８０】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> The complete DNA sequence of Tau-Tubulin Kinase and the use thereo f <130> J06248 <140> <141> <160> 18 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００８１】 <210> 1 <211> 963 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(963) <400> 1 atg agt gga gga gga gag cag cca gat atc ctc agt gtt gga atc ctg 48 Met Ser Gly Gly Gly Glu Gln Pro Asp Ile Leu Ser Val Gly Ile Leu 1 5 10 15 gtc aaa gaa aga tgg aaa gtg tta aga aag att gga ggt ggg ggc ttt 96 Val Lys Glu Arg Trp Lys Val Leu Arg Lys Ile Gly Gly Gly Gly Phe 20 25 30 gga gaa att tac gat gcc ttg gac atg ctc acc agg gag aat gtg gcg 144 Gly Glu Ile Tyr Asp Ala Leu Asp Met Leu Thr Arg Glu Asn Val Ala 35 40 45 ctg aag gtg gag tca gct cag cag cca aag cag gtt ctg aag atg gag 192 Leu Lys Val Glu Ser Ala Gln Gln Pro Lys Gln Val Leu Lys Met Glu 50 55 60 gtt gct gtg ttg aag aaa ctg caa ggg aaa gac cat gtt tgt aga ttt 240 Val Ala Val Leu Lys Lys Leu Gln Gly Lys Asp His Val Cys Arg Phe 65 70 75 80 att ggc tgt ggg aga aat gat cgt ttc aac tac gtg gtc atg caa ttg 288 Ile Gly Cys Gly Arg Asn Asp Arg Phe Asn Tyr Val Val Met Gln Leu 85 90 95 cag gga cgg aat ctg gca gat ctc cga cgt agc caa tcc cgg ggc aca 336 Gln Gly Arg Asn Leu Ala Asp Leu Arg Arg Ser Gln Ser Arg Gly Thr 100 105 110 ttc act att agc act acc ctt cgt ctt ggg aaa cag att ctg gag tct 384 Phe Thr Ile Ser Thr Thr Leu Arg Leu Gly Lys Gln Ile Leu Glu Ser 115 120 125 att gaa agc ata cat tct gtg gga ttc ctt cac aga gac atc aaa ccg 432 Ile Glu Ser Ile His Ser Val Gly Phe Leu His Arg Asp Ile Lys Pro 130 135 140 tca aac ttc gcc atg gga cgt ttc ccc agt acg tgt agg aaa tgt ttc 480 Ser Asn Phe Ala Met Gly Arg Phe Pro Ser Thr Cys Arg Lys Cys Phe 145 150 155 160 atg ctt gat ttt ggc ttg gct cga caa ttt act aat tcc tgt ggt gac 528 Met Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg Gln Phe Thr Asn Ser Cys Gly Asp 165 170 175 gtc aga cca cct cgt gct gtg gca ggc ttt cga ggg aca gtt cgt tgt 576 Val Arg Pro Pro Arg Ala Val Ala Gly Phe Arg Gly Thr Val Arg Cys 180 185 190 gca tca atc gat gct cat cgg aac agg gaa atg gga aga cat gat gac 624 Ala Ser Ile Asp Ala His Arg Asn Arg Glu Met Gly Arg His Asp Asp 195 200 205 ctt tgg tct tta ttc tac atg ttg gtg gag ttt gtg gtt ggc caa ctg 672 Leu Trp Ser Leu Phe Tyr Met Leu Val Glu Phe Val Val Gly Gln Leu 210 215 220 cct tgg aga gaa ata aag gac aag gag caa gta ggc tcc att aag gag 720 Pro Trp Arg Glu Ile Lys Asp Lys Glu Gln Val Gly Ser Ile Lys Glu 225 230 235 240 aga tat gac cac agg ctc atg tta aaa cac ctc cct cca gaa ttc agc 768 Arg Tyr Asp His Arg Leu Met Leu Lys His Leu Pro Pro Glu Phe Ser 245 250 255 acc ttt ctt gac cat att tcc tct ttg gat tat ttt aca aaa ccg gac 816 Thr Phe Leu Asp His Ile Ser Ser Leu Asp Tyr Phe Thr Lys Pro Asp 260 265 270 tac cag ctt cta aca tcc gtg ttt gac aat agc atc aag acc ttt gga 864 Tyr Gln Leu Leu Thr Ser Val Phe Asp Asn Ser Ile Lys Thr Phe Gly 275 280 285 gta att gag agt gac ccg ttt gac tgg gag aag agt gga act gat ggc 912 Val Ile Glu Ser Asp Pro Phe Asp Trp Glu Lys Ser Gly Thr Asp Gly 290 295 300 tcc ctg aca acc acc acc acc tct gcc acc cct cag tgc aca ccc gct 960 Ser Leu Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ala Thr Pro Gln Cys Thr Pro Ala 305 310 315 320 tga 963

【００８２】 <210> 2 <211> 320 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Ser Gly Gly Gly Glu Gln Pro Asp Ile Leu Ser Val Gly Ile Leu 1 5 10 15 Val Lys Glu Arg Trp Lys Val Leu Arg Lys Ile Gly Gly Gly Gly Phe 20 25 30 Gly Glu Ile Tyr Asp Ala Leu Asp Met Leu Thr Arg Glu Asn Val Ala 35 40 45 Leu Lys Val Glu Ser Ala Gln Gln Pro Lys Gln Val Leu Lys Met Glu 50 55 60 Val Ala Val Leu Lys Lys Leu Gln Gly Lys Asp His Val Cys Arg Phe 65 70 75 80 Ile Gly Cys Gly Arg Asn Asp Arg Phe Asn Tyr Val Val Met Gln Leu 85 90 95 Gln Gly Arg Asn Leu Ala Asp Leu Arg Arg Ser Gln Ser Arg Gly Thr 100 105 110 Phe Thr Ile Ser Thr Thr Leu Arg Leu Gly Lys Gln Ile Leu Glu Ser 115 120 125 Ile Glu Ser Ile His Ser Val Gly Phe Leu His Arg Asp Ile Lys Pro 130 135 140 Ser Asn Phe Ala Met Gly Arg Phe Pro Ser Thr Cys Arg Lys Cys Phe 145 150 155 160 Met Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg Gln Phe Thr Asn Ser Cys Gly Asp 165 170 175 Val Arg Pro Pro Arg Ala Val Ala Gly Phe Arg Gly Thr Val Arg Cys 180 185 190 Ala Ser Ile Asp Ala His Arg Asn Arg Glu Met Gly Arg His Asp Asp 195 200 205 Leu Trp Ser Leu Phe Tyr Met Leu Val Glu Phe Val Val Gly Gln Leu 210 215 220 Pro Trp Arg Glu Ile Lys Asp Lys Glu Gln Val Gly Ser Ile Lys Glu 225 230 235 240 Arg Tyr Asp His Arg Leu Met Leu Lys His Leu Pro Pro Glu Phe Ser 245 250 255 Thr Phe Leu Asp His Ile Ser Ser Leu Asp Tyr Phe Thr Lys Pro Asp 260 265 270 Tyr Gln Leu Leu Thr Ser Val Phe Asp Asn Ser Ile Lys Thr Phe Gly 275 280 285 Val Ile Glu Ser Asp Pro Phe Asp Trp Glu Lys Ser Gly Thr Asp Gly 290 295 300 Ser Leu Thr Thr Thr Thr Thr Ser Ala Thr Pro Gln Cys Thr Pro Ala 305 310 315 320

【００８３】 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 3 Ile Met Pro Ser Glu Phe Gly Glu Ile Tyr Glu Ala Met Asp Leu Leu 1 5 10 15 Thr Xaa Glu Xaa 20

【００８４】 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 4 His Tyr Met Leu Asp Phe Gly Leu Ala Arg Gln Tyr Thr Xaa Thr Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Val

【００８５】 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 5 garttyggng aratntayga rgcnatgga 29

【００８６】 <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 6 tantgnckng cnarnccraa rtcnarcat 29

【００８７】 <210> 7 <211> 419 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 gagtttggag aaatgtacga agccatggac atgctcacca gggagaatgt ggcgctgaag 60 gtggagtcag ctcagcagcc aaagcaggtt ctgaagatgg aggttgctgt gttgaagaaa 120 ctgcaaggga aagaccatgt ttgtagattt attggctgtg ggagaaatga tcgtttcaac 180 tacgtggtca tgcaattgca gggacggaat ctggcagatc tccgacgtag ccaatcccgg 240 ggcacattca ctattagcac tacccttcgt cttgggaaac agattctgga gtctattgaa 300 agcatacatt ctgtgggatt ccttcacaga gacatcaaac cgtcaaactt cgccatggga 360 cgtttcccca gtacgtgtag gaaatgtttc atgcttgatt ttggcctcgc tcgccagta 419

【００８８】 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 8 tggagaaatt tacgatgcct tggacatgc 29

【００８９】 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 9 ggagaatgtg gcgctgaagg tggagtcagc tcagc 35

【００９０】 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 10 gcagccaaag caggttctga agatggagg 29

【００９１】 <210> 11 <211> 1185 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 gcagccaaag caggttctga agatggaggt tgctgtgttg aagaaactgc aagggaaaga 60 ccatgtttgt agatttattg gctgtgggag aaatgatcgt ttcaactacg tggtcatgca 120 attgcaggga cggaatctgg cagatctccg acgtagccaa tcccggggca cattcactat 180 tagcactacc cttcgtcttg ggaaacagat tctggagtct attgaaagca tacattctgt 240 gggattcctt cacagagaca tcaaaccgtc aaacttcgcc atgggacgtt tccccagtac 300 gtgtaggaaa tgtttcatgc ttgattttgg cttggctcga caatttacta attcctgtgg 360 tgacgtcaga ccacctcgtg ctgtggcagg ctttcgaggg acagttcgtt gtgcatcaat 420 cgatgctcat cggaacaggg aaatgggaag acatgatgac ctttggtctt tattctacat 480 gttggtggag tttgtggttg gccaactgcc ttggagagaa ataaaggaca aggagcaagt 540 aggctccatt aaggagagat atgaccacag gctcatgtta aaacacctcc ctccagaatt 600 cagcaccttt cttgaccata tttcctcttt ggattatttt acaaaaccgg actaccagct 660 tctaacatcc gtgtttgaca atagcatcaa gacctttgga gtaattgaga gtgacccgtt 720 tgactgggag aagagtggaa ctgatggctc cctgacaacc accaccacct ctgccacccc 780 tcagtgcaca cccgcttgac ccctgctgct atcggaattg caaatgccac ccccatccca 840 ggagacttgc ttcgagaaat cacagatgaa gtgtttccca gatgaacagc ttagtgatgg 900 ggagaatgga atccctgttg gtgtatcacc agataaattg cctggtatct ctggggcacc 960 cacgccctca ggaaaaggat gtctgggaag agatggatat caacaagaac aagataaagc 1020 tgggaatttg caaagcagct actgaagaag aaaatagcca tggtcaagta aatggcatac 1080 tcaatgctcc aagccttggt tcaccaattc gtgtccgatc agagattact cagccagaca 1140 gagatgtaga cctgcccggg cggccgctcg agccctatag tgagt 1185

【００９２】 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 12 gagcctgtgg tcatatctct ccttaatgg 29

【００９３】 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 13 ctccaaggca gttggccaac cacaaactcc accaac 36

【００９４】 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 14 gtcttcccat ttccctgttc cgatgagc 28

【００９５】 <210> 15 <211> 834 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 15 actcactata gggctcgagc ggccgcccgg gcaggtgggg atgggcaggc ggtggcgggc 60 ccgcctgctg agcggtgact cctgccggtg cggaccctga gctagaccct cgtcctccgt 120 cagaratcct gcgtccgccg cggcccaggt taaatggaat ccacccttgg gaagctagat 180 gcctgtgata gctgttttga cctcatcagg gttttgcaat gagtggagga ggagagcagc 240 cagatatcct cagtgttgga atcctggtca aagaaagatg gaaagtgtta agaaagattg 300 gaggtggggg ctttggagaa atttacgatg ccttggacat gctcaccagg gagaatgtgg 360 cgctgaaggt ggagtcagct cagcagccaa agcaggttct gaagatggag gttgctgtgt 420 tgaagaaact gcaagggaaa gaccatgttt gtagatttat tggctgtggg agaaatgatc 480 gtttcaacta cgtggtcatg caattgcagg gacggaatct ggcagatctc cgacgtagcc 540 aatcccgggg cacattcact attagcacta cccttcgtct tgggaaacag attctggagt 600 ctattgaaag catacattct gtgggattcc ttcacagaga catcaaaccg tcaaacttcg 660 ccatgggacg tttccccagt acgtgtagga aatgtttcat gcttgatttt ggcttggctc 720 gacaatttac taattcctgt ggtgacgtca gaccacctcg tgctgtggca ggctttcgag 780 ggacagttcg ttgtgcatca atcgatgctc atcggaacag ggaaatggga agac 834

【００９６】 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 16 gcaatgagtg gaggaggaga gcagccag 28

【００９７】 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 17 caggggtcaa gcgggtgtgc actgagg 27

【００９８】 <210> 18 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 18 Ser Asp Pro Phe Asp Trp Glu Lys Ser Gly Thr Asp Gly Ser Leu Thr 1 5 10 15 Thr Thr Thr Thr Ser Ala Thr 20

【００９９】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の組換え蛋白質精製の確認のために行っ
たＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の写真であ
る。図中、ＡはゲルをＣＢＢ染色した結果を示し、Ｂは
泳動後のゲルをニトロセルロース膜に転写して抗体「Ｔ
ＴＫ−Ｃ」による免疫染色を行った結果を示す。「Ｍ」
は分子量マーカーを示す。

【図２】本発明の組換え蛋白質のタウ−チューブリン活
性を測定した結果を、縦軸にＴＴＫ活性、横軸に反応時
間をプロットして示した図である。図中、Ａは融合蛋白
質の溶出画分を用いた結果を示し、Ｂは組換えＴＴＫ蛋
白質を切断した溶出画分を用いた結果を示す。それぞ
れ、黒丸はタウ蛋白質、白丸はチューブリンを基質とし
たときの値を示し、実線は組換えＴＴＫ蛋白質を用いた
測定の結果を、点線はコントロール（ＧＳＴ蛋白質のみ
を発現させた画分）を用いた測定の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 25/00 ４Ｃ０８５ 48/00 25/28 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 25/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 ４Ｃ０８７ 25/28 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/12 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/48 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 9/12 5/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ａ６１Ｋ 37/48 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA10 BA43 CA02 CA04 DA06 EA04 GA11 HA12 4B050 CC01 CC03 DD11 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR07 QS24 QS28 4B065 AA26X AA90Y AB01 AC14 BA02 CA29 CA46 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 CA01 CA18 DC01 DC32 NA15 ZA011 ZA151 ZA161 4C085 AA13 AA14 BB11 CC04 CC12 CC13 DD23 DD63 EE06 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA15 ZA16 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA01 ZA15 ZA16 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 DA86 DA89 EA50 FA71 FA74 GA21

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号：１に記載の塩基配列
   で表されるＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表の配列番号：１に記載の塩基配列
   とストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつタ
   ウ−チューブリンキナーゼ活性を有する蛋白質をコード
   するＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のＤＮＡを含む組
   換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の組換えベクターにより
   形質転換された形質転換体。
5. 【請求項５】 少なくとも、プロモーターと請求項１又
   は２に記載のＤＮＡを有し、該ＤＮＡがプロモーターの
   下流に連結されていることを特徴とする組換えＤＮＡ。
6. 【請求項６】 請求項３に記載の組換えベクター又は請
   求項５に記載の組換えＤＮＡに含まれる鋳型ＤＮＡを転
   写及び翻訳させて蛋白質を合成させることを特徴とす
   る、組換え蛋白質の製造方法。
7. 【請求項７】 転写及び翻訳が、無細胞転写翻訳系又は
   生細胞中で行われることを特徴とする、請求項６に記載
   の方法。
8. 【請求項８】 生細胞中で行われる転写及び翻訳が、請
   求項４に記載の形質転換体を用いて行われる、請求項６
   に記載の方法。
9. 【請求項９】 請求項６〜８のいずれかに記載の方法に
   よって得られる組換え蛋白質。
10. 【請求項１０】 配列表の配列番号：２に記載のアミノ
    酸配列又はその部分配列を有するペプチドを抗原として
    調製された抗体。
11. 【請求項１１】 タウ−チューブリンキナーゼ活性阻害
    物質のスクリーニング方法であって、（１）タウ−チュ
    ーブリンキナーゼ活性を有する蛋白質、（２）被検物
    質、及び（３）タウ−チューブリンキナーゼの基質、を
    同時に存在させ、又は順に作用させて、該基質のリン酸
    化の程度が低下又は消失した場合に、該被検物質がタウ
    −チューブリンキナーゼ活性阻害作用を有すると判定す
    ることを特徴とする方法。
12. 【請求項１２】 請求項１若しくは２に記載のＤＮＡ又
    は該ＤＮＡが転写されたｍＲＮＡにハイブリダイズする
    アンチセンスオリゴヌクレオチド。
13. 【請求項１３】 請求項１若しくは２に記載のＤＮＡ又
    は該ＤＮＡの部分断片を含む遺伝子治療用薬剤。
14. 【請求項１４】 請求項１０に記載の抗体を有効成分と
    して含む脳神経系疾患用薬剤。
15. 【請求項１５】 請求項１１に記載の方法によって選択
    される物質を製剤化することを特徴とする、脳神経系疾
    患用薬剤の製造方法。
16. 【請求項１６】 請求項１１に記載の方法によって選択
    される物質を有効成分として含む脳神経系疾患用薬剤。
17. 【請求項１７】 請求項１２に記載のアンチセンスオリ
    ゴヌクレオチドを有効成分として含む脳神経系疾患用薬
    剤。