KR20240045898A - 4r 타우병증의 치료 또는 예방용 펩티드 - Google Patents
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Abstract
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로서 포함하는, 4R 타우병증의 예방, 치료, 또는 개선을 위한 약학 조성물 또는 식품 조성물, 또는 4R 타우병증의 예방, 치료, 또는 개선을 위한 상기 펩티드의 의약 용도 등에 관한 것이다.
Description
본 발명은 4R 타우병증의 치료 또는 예방 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 타우병증을 치료 또는 예방하는데 효과적인 텔로머라제 유래 펩티드, 또는 이를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
신경세포는 신경줄기세포 (neural stem cell)이 분화하여 만들어지는 다양한 종류의 세포이다. 신경줄기세포는 신경세포 (neuron), 신경교세포 (glia), 아스트로사이트 (astrocyte), 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte) 등으로 다양하게 분화하여 신경계 (nervous system)를 이루게 된다.
신경 기능에 이상을 초래하는 것을 신경계 질환이라고 하는데, 뇌졸중, 뇌종양, 간질, 편두통, 수면 질환, 알츠하이머 및 타우병증(tauopathy) 등이 이에 해당한다. 여기서 타우병증은 진핵성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration), 전두측두엽치매(Pick's disease), 전두측두엽 퇴행성 질환(FTLD-tau(frontotemporal lobar degeneration)), 은친화입자병(Argyrophilic grain disease), 아급성 경화성 범뇌영(Subacute sclerosing panencephalitis), 그리스티얀센 증(Christianson syndrome), 뇌염후 파킨슨병(Post-encephalitic parkinsonism), Guadeloupean parkinsonism, 척수소뇌성 운동실조증(Spinocerebellar ataxia type 11), 만성외상뇌질환(Chronic traumatic encephalopathy(includes traumatic brain injury and dementia pugilistica)), ARTAG(aging-related tau astrogliopathy includes globular glial tauopathy), 원발연령관련타우병(PART(primary age-related tauopathy includes tangle-predominant dementia and clinically asymptomatic cases)) 등을 포함하고 있다.
타우병증(taupathy)은 인간의 뇌에서 타우 단백질이 신경원섬유 농축체(neurofibrilary tangle: NFT)로 응집되는 것과 관련된 신경퇴행성 질환을 총칭한다. 타우병증에서는, 우선 타우 단백질에 인(phosphate)이 과도하게 부착되는 변형이 발생하여 타우가 과인산화되면 응집하여 신경원섬유 농축체(NFT)를 형성하게 된다. 이러한 타우 농축체는 일종의 압축된 미세섬유다발(compressed bunch of filaments)로서, 마치 뇌세포 안에 꼬인 실의 덩어리가 존재하는 것처럼 보여진다. 이러한 비정상적인 타우(tau)의 응집은 집합적으로, 타우병증이라고 불리는 신경퇴행성 질환의 주된 특징이다. (Brandt R, Hundelt M, Shahani N (2005) Tau alteration and neuronal degeneration in tauopathies: mechanisms and models. Biochimica. et biophysica. acta. 1739: 331-354).
건강한 신경에서, 타우는 축색돌기(axon)로부터의 성장 및 신경 세포 분극화 (polarization)를 촉진함으로써 마이크로세관 (microtubules)을 안정화하는데 기여한다. 병리학적으로 타우가 과인산화(hyperphosphorylation)되는 경우에, 타우는 마이크로세관으로부터 분리되어 불용성 응집물을 생성한다(Gendron TF, Petrucelli L (2009) The role of tau in neurodegeneration. Mol. Neurodegener. 4: 13).
여러 해에 걸쳐서, 타우 응집에 대한 구조적 골격이 제안된 바 있으며, 10개의 가용성 모노머들로부터 불용성 필라멘트가 형성되고, 이러한 필라멘트가 신경섬유매듭 (neurofibrillary tangles, NFTs)이라 불리우는 고차원 구조로 결합된다는 증거들이 제안된 바 있다. 그러나, 아직까지도 타우병증에 있어서 NFT들의 병리생리학적 중요성, 이러한 과정을 유발하는 원인 및 분자적 메카니즘에 대해서는 그다지 알려진 바가 없다.
타우병증은 그 병증에 기여하는 타우 단백질의 아이소폼, 즉 4R 타우 또는 3R 타우의 우세에 따라 서로 다른 형태의 신경퇴행성 질환이 나타나게 된다(Front. Neurol., 05 November 2020 | https://doi.org/10.3389/fneur.2020.599384; Neuron 90, 941-947, June 1, 2016).
이에 따르면, 특히 4R 타우의 응집이 발생 시, 진핵성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration), 은친화입자병(Argyrophilic grain disease), 및 ARTAG(aging-related tau astrogliopathy includes globular glial tauopathy) 등이 있다.
상기 4R 타우병증과 관련된 질병은 최근 고령화의 진행에 따라 그 수가 증가하고 있지만, 현재까지 이를 효과적으로 치료 혹은 예방할 수 있는 것으로 약물은 없다.
한편, 인간 텔로머라제 역전사 효소 (reverse transcriptase of human telomerase, hTERT) 유래의 16개의 아미노산 펩티드 PEP1(서열번호 1)은 항암, 항염, 및 항산화 등의 효능을 가질 뿐만 아니라 알츠하이머 치료에도 효과적인 것으로 보고되었다(WO2013/167574). 또한, PEP1은 여러 질병을 타겟으로 한 다수의 임상실험에서 독성실험을 완료하고 부작용에 대한 안정성을 확인한 바 있다.
LMTM (WO2021-001306)은 타우 응집 저해제로 알려져 있으며, 현재 타우병증에 대한 임상 3상 진행중이다. 그러나, 특히 4R 타우병증에 대한 구체적인 효능에 대해서 종래 언급된 바가 없다. 또한, LMTM은 타우 응집 저해구간(EC50 = 2.2±0.2 μM)에서 세포 독성(GI50 = 6.4±0.3 μM) 부작용 보고된 바 있다(Yun Kyung Kim et al. Levosimendan inhibits disulfide tau oligomerization ameliorating tau pathology in TauP301L-BiFC mice, https://www.researchsquare.com/article/rs-1906311/v1).
[선행기술문헌]
[특허문헌]
1.WO2013/167574
2. WO2021-001306
[비특허문헌]
1.Brandt R, Hundelt M, Shahani N (2005) Tau alteration and neuronal degeneration in tauopathies: mechanisms and models. Biochimica. et biophysica. acta. 1739: 331-354
2. Gendron TF, Petrucelli L (2009) The role of tau in neurodegeneration. Mol. Neurodegener. 4: 13
3. Front. Neurol., 05 November 2020 https://doi.org/10.3389/fneur.2020.599384
4. Neuron 90, 941-947, June 1, 2016
5. Yun Kyung Kim et al. Levosimendan inhibits disulfide tau oligomerization ameliorating tau pathology in TauP301L-BiFC mice, https://www.researchsquare.com/article/rs-1906311/v1
일 양상은 4R 타우병증의 치료 또는 예방에 효과적인 펩티드를 제공하는 것이다.
다른 일 양상은 상기 펩티드를 포함하는 4R 타우병증의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 일 양상은 상기 펩티드를 포함하는 4R 타우병증의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 일 양상은 4R 타우병증의 치료 또는 예방을 위한 상기 펩티드의 의약 용도를 제공한다.
또 다른 일 양상은 상기 펩티드를, 4R 타우병증의 치료 또는 예방이 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 4R 타우병증의 치료 또는 예방방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로서 포함하는 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 일 양상은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또 다른 일 양상은, 4R 타우병증의 예방 또는 치료를 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 제공한다.
또 다른 일 양상은, 4R 타우병증의 예방 또는 치료를 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 의약 용도를 제공한다.
또 다른 일 양상은, 4R 타우병증의 예방 또는 치료가 필요한 대상에게, 약학적으로 유효한 양의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 투여하는 단계를 포함하는, 4R 타우병증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상은, 4R 타우병증을 유도한다고 알려진 P301L 돌연변이가 도입된 4R-Tau-BiFC 마우스 모델에서, 즉 4R 타우병증 동물 모델에서, 대조군 및 참조 약물 투약군에 비해 유의미한 운동 수행 능력의 개선을 나타냈으며, 인지 능력 개선 평가에서도 유의미한 개선을 나타내었다. 뿐만 아니라, 상기 4R-Tau-BiFC 마우스 모델에서 뇌조직 이미지 분석 및 뇌 용해물 분석 결과, 대조군 및 참조 약물 투약군에 비해 유의미한 타우-BiFC 형광 강도의 감소, AT8 형광 강도 감소, 및 타우 면역블롯의 감소를 나타내었다. 따라서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상은, 4R 타우병증을 효과적으로 억제하는 것으로 확인되어, 4R 타우병증의 치료, 개선, 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 실험예 2에 따른 PEP1 의 동물 기반 행동 평가를 위한 약물의 투여 용량 및 일정을 도식화한 것이다.
도 2는 4R TauP301L-BiFC 마우스 모델에서의 Rota-rod 테스트를 통한 운동 능력 개선 효능 평가 결과를 나타낸 그래프이다. 투키 다중-비교 검정(Tukey’s multiple-comparisons)을 이용한 양방향 ANOVA 로 분석하였다(*p<0.05; **p<0.01; n.s. 비히클에 대해 무의미).
도 3은 4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 신규 물건 인지 테스트를 통한 인지 능력 개선 효능 평가 결과를 나타낸 그래프이다. 검은색 막대그래프는 학습된 물체, 빨간색 막대그래프는 새로운 물체에 대한 결과값을 나타낸다. 시닥 다중-비교 검정(Sidak’s multiple comparisons test)을 이용한 양방향 ANOVA 로 분석하였다(*p<0.05; ***p<0.0001).
도 4는 실험예 3에 따른 PEP1의 동물 기반 4R-타우병리 억제효능 평가를 위한 약물의 투여 용량 및 일정을 도식화한 것이다.
도 5은 감각운동 피질 영역에서의 (A) Tau-BiFC 이미징 및 (B) AT8 면역형광염색 결과를 촬영한 사진, 및 각각의 형광정도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 운동피질 영역에서의 (A) Tau-BiFC 이미징 및 (B) AT8 면역형광염색 결과를 촬영한 사진, 및 각각의 형광정도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 해마 영역에서의 (A) Tau-BiFC 이미징 및 (B) AT8 면역형광염색 결과를 촬영한 사진, 및 각각의 형광정도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8는 흑색질 영역에서의 (A) Tau-BiFC 이미징 및 (B) AT8 면역형광염색 결과를 촬영한 사진, 및 각각의 형광정도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5 내지 8은 모두 두넷 다중-비교 검정을 이용한 단방향 ANOVA로 분석하였다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n.s. 비히클에 비해 무의미).
도 9 및 10은 7개월령부터 12개월령까지 5개월 간 약물을 투여한 TauP301L-BiFC 마우스 모델의 뇌용해물을 얻어, 가용성 분획 샘플(도 9) 및 비가용성 분획 샘플(도 10)을 가지고, 총 타우 (Tau5) 및 인산화 타우 (pS199, pS396) 항체를 이용한 면역블롯을 진행한 결과를 촬영한 사진 및 그 총 타우(total tau) 및 인산화 타우(phospho tau) 정도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 두넷 다중-비교 검정을 이용한 단방향 ANOVA로 분석하였다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n.s. 비히클에 비해 무의미).
도 2는 4R TauP301L-BiFC 마우스 모델에서의 Rota-rod 테스트를 통한 운동 능력 개선 효능 평가 결과를 나타낸 그래프이다. 투키 다중-비교 검정(Tukey’s multiple-comparisons)을 이용한 양방향 ANOVA 로 분석하였다(*p<0.05; **p<0.01; n.s. 비히클에 대해 무의미).
도 3은 4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 신규 물건 인지 테스트를 통한 인지 능력 개선 효능 평가 결과를 나타낸 그래프이다. 검은색 막대그래프는 학습된 물체, 빨간색 막대그래프는 새로운 물체에 대한 결과값을 나타낸다. 시닥 다중-비교 검정(Sidak’s multiple comparisons test)을 이용한 양방향 ANOVA 로 분석하였다(*p<0.05; ***p<0.0001).
도 4는 실험예 3에 따른 PEP1의 동물 기반 4R-타우병리 억제효능 평가를 위한 약물의 투여 용량 및 일정을 도식화한 것이다.
도 5은 감각운동 피질 영역에서의 (A) Tau-BiFC 이미징 및 (B) AT8 면역형광염색 결과를 촬영한 사진, 및 각각의 형광정도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 운동피질 영역에서의 (A) Tau-BiFC 이미징 및 (B) AT8 면역형광염색 결과를 촬영한 사진, 및 각각의 형광정도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 해마 영역에서의 (A) Tau-BiFC 이미징 및 (B) AT8 면역형광염색 결과를 촬영한 사진, 및 각각의 형광정도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8는 흑색질 영역에서의 (A) Tau-BiFC 이미징 및 (B) AT8 면역형광염색 결과를 촬영한 사진, 및 각각의 형광정도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 도 5 내지 8은 모두 두넷 다중-비교 검정을 이용한 단방향 ANOVA로 분석하였다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n.s. 비히클에 비해 무의미).
도 9 및 10은 7개월령부터 12개월령까지 5개월 간 약물을 투여한 TauP301L-BiFC 마우스 모델의 뇌용해물을 얻어, 가용성 분획 샘플(도 9) 및 비가용성 분획 샘플(도 10)을 가지고, 총 타우 (Tau5) 및 인산화 타우 (pS199, pS396) 항체를 이용한 면역블롯을 진행한 결과를 촬영한 사진 및 그 총 타우(total tau) 및 인산화 타우(phospho tau) 정도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프이다. 두넷 다중-비교 검정을 이용한 단방향 ANOVA로 분석하였다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n.s. 비히클에 비해 무의미).
이하, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술 용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 수치는 명시하지 않아도 “약”의 의미를 포함하는 것으로 간주한다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.
본원에서 용어 “4R 타우병증”은, 타우병증 중에서 타우 단백질의 아이소폼 중 특히 4R 타우의 응집이 우세하여 발생되는 신경퇴행성 질환을 의미하며, 진핵성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration), 은친화입자병(Argyrophilic grain disease), 및 ARTAG(aging-related tau astrogliopathy includes globular glial tauopathy), 등을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.
발명자들은 텔로머라제로부터 유래 펩티드인 PEP1(이하, “GV1001”이라고도 함)이 4R 타우병증의 억제에 효과적임을 밝혀냈다. 보다 구체적으로, 4R 타우병증을 유도한다고 알려진 P301L 돌연변이가 도입된 4R-Tau-BiFC 마우스 모델(즉 4R 타우병증의 동물 모델)(Acta Neuropathol (2017) 133:665-704)을 이용한 행동 시험 및 뇌 조직 분석을 통해서, PEP1이 4R 타우병증의 원인이 되는 4R 타우의 형성 및 4R 타우의 과인산화를 억제하고(실험예 3), 4R 타우병증의 동물 모델에서 실제로 운동능력 및 인지능력을 개선시키는 것을 확인하였다(실험예 2).
보다 구체적으로 설명하면, 실험예 2에서, 7개월령부터 12개월령까지 5개월 간 약물을 투여한 4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 Rota-rod 테스트를 통한 운동 능력 개선 효능 평가 결과(도 2), PEP1 1, 2 mg/kg 투약군에서 비히클 및 참조 화합물 LMTM에 비해 유의미한 운동 수행 능력의 향상을 나타냈다. 또한, 4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 신규 물건 인지 테스트를 통한 인지 능력 개선 효능 평가 결과(도 3), 비히클 및 참조 화합물 LMTM에 비해 새로운 물체에 대한 유의미한 인지 능력 개선을 보였다.
또한, 실험예 3에서, 7개월령부터 12개월령까지 5개월 간 약물을 투여한 4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 뇌조직을 이용하여 (A) Tau-BiFC 이미징 및 (B) AT8 면역형광염색을 진행하였다. Tau-BiFC 형광으로 표현되는 타우 올리고머 형성에 따른 4R-타우병리가 우세하게 나타나는 감각운동피질(somatosensory cortex), 운동피질 (Motor cortex), 해마 (Hippocampus, CA1), 흑색질 영역에서 Tau-BiFC 형광정도를 정량 분석한 결과(도 5 - 도 8), PEP1 투여군이 비히클 및 참조 화합물 LMTM 투여군에 비해 유의미한 유의미하게 형광강도가 감소하여, 타우 올리고머 형성 억제 효능을 보였다. 또한, 타우 과인산화 항체인 AT8 (phospho-Tau S202/T205)를 이용한 면역형광염색을 진행한 경우에도, PEP1 투여군이 비히클 및 참조 화합물 LMTM 투여군에 비해 유의미하게 AT8 형광강도가 감소하여, 4R 타우 과인산화 억제 효능을 보였다. 또한, 7개월령부터 12개월령까지 5개월 간 약물을 투여한 TauP301L-BiFC 마우스 모델의 뇌용해물을 얻어, i) 가용성 분획 샘플 및 ii) 불용성 분획 샘플을 가지고, 총 타우 (Tau5) 및 인산화 타우 (pS199, pS396) 항체를 이용한 면역블롯을 진행한 결과(도 9 및 도 10), 가용성 분획 샘플에서 PEP1 투여군이 비히클 및 참조 화합물 LMTM 투여군에 비해 유의미하게 총 타우 및 인산화 타우 정도가 감소하였고, 불용성 분획 샘플에서 PEP1 투여군이 비히클 및 참조 화합물 LMTM 투여군에 비해 유의미하게 불용성 타우 응집물의 형성 억제 효능을 보였다.
본 발명은 일 양상에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로서 포함하는 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양상에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로서 포함하는 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편인 펩티드이다.
상기 4R 타우병증은, 진핵성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration), 은친화입자병(Argyrophilic grain disease), 및 ARTAG(aging-related tau astrogliopathy includes globular glial tauopathy로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 4R 타우의 응집이 우세하여 발생되는 임의의 신경퇴행성 질환을 포함한다.
본 명세서에 개시된 펩티드는 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 펩티드는, 서열번호 1을 포함하는 펩티드 또는 그 단편들과 1개 이상의 아미노산, 2개 이상의 아미노산, 3개 이상의 아미노산, 4개 이상의 아미노산, 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산 또는 7개 이상의 아미노산이 변화된 펩티드를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 아미노산 변화는 펩티드의 물리화학적 특성이 변경되도록 하는 변화에 속한다. 예를 들어, 펩티드의 열안정성을 향상시키고, 기질 특이성을 변경시키고, 최적의 pH를 변화시키는 등의 아미노산 변화가 수행될 수 있다.
본 명세서에서 "아미노산"이라 함은 자연적으로 펩티드로 통합되는 22개의 표준 아미노산들 뿐만 아니라 D-아이소머 및 변형된 아미노산들을 포함한다. 이에 따라, 일 구체예에서 상기 펩티드는 D-아미노산을 포함하는 펩티드일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 펩티드는 번역 후 변형 (post-translational modification)된 비표준 아미노산 등을 포함할 수 있다. 번역 후 변형의 예는 인산화 (phosphorylation), 당화 (glycosylation), 아실화(acylation) (예컨대, 아세틸화 (acetylation), 미리스토일화(myristoylation) 및 팔미토일화 (palmitoylation)를 포함), 알킬화 (alkylation), 카르복실화 (carboxylation), 히드록실화(hydroxylation), 당화반응 (glycation), 비오티닐화 (biotinylation), 유비퀴티닐화 (ubiquitinylation), 화학적 성질의 변화 (예컨대, 베타-제거 탈이미드화, 탈아미드화) 및 구조적 변화 (예컨대, 이황화물 브릿지의 형성) 를 포함한다. 또한, 상기 펩티드는 펩티드 컨쥬게이트를 형성하기 위한 가교제 (crosslinker)들과의 결합과정에서 일어나는 화학 반응들에 의해 생기는 아미노산의 변화, 예컨대 아미노기, 카르복시기 또는 사이드 체인에서의 변화와 같은 아미노산의 변화를 포함한다.
상기 펩티드는 자연 그대로의 공급원으로부터 동정 및 분리된 야생형 펩티드일 수 있다. 한편, 상기 펩티드는 서열번호 1의 펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 포함하는, 인공 변이체일 수 있다. 인공 변이체에서 뿐만 아니라 야생형 폴리펩티드에서의 아미노산 변화는 단백질의 폴딩 (folding) 및/또는 활성에 유의한 영향을 미치지 않는 보존성 아미노산 치환을 포함한다. 보존성 치환의 예들은 염기성 아미노산 (아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파르트산), 극성 아미노산 (글루타민 및 아스파라긴), 소수성 아미노산 (루신, 이소로이신, 발린 및 메티오닌), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 및 작은 아미노산 (글리신, 알라닌, 세린 및 트레오닌)의 군의 범위 내에 있다. 일반적으로 특이적 활성을 변경시키지 않는 아미노산 치환이 본 분야에 공지되어 있다. 가장 흔하게 발생하는 치환은 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, 및 Asp/Gly, 그리고 이들과 반대인 것들이다. 보존적 치환의 또 다른 예는 하기 표 1의 치환을 포함한다.
펩티드의 생물학적 특성에 있어서의 실재적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 천연 잔기는 통상의 측쇄 특성에 기준하여 다음 그룹으로 구분된다:
(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족: trp, tyr, phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환함으로써 이루어질 것이다. 펩티드의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 상기 펩티드에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다.
펩티드의 다른 유형의 아미노산 변이체는 항체의 글리코실화 패턴이 변화된 것이다. 변화란 의미는 펩티드에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 펩티드 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 나타낸다.
펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라긴 측쇄에 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다.
펩티드로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 수행된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
또한, 유효성분인 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드는 세포 내 독성이 낮고, 생체 내 안정성이 높다는 장점을 가진다.
서열 번호 1의 아미노산 서열의 펩티드는 하기 표 2과 같다. 하기 표 2의 "이름"은 펩티드를 구별하기 위해 명명한 것이다. 하기 표 2에서, 서열 번호 2의 펩티드는 인간 텔로머라제의 전장 펩티드를 나타낸다. 일 구체예에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 서열 번호 2의 펩티드를 포함한다. 일 구체예에서, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩티드를 포함한다. 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드는 텔로머라제에 포함된 펩티드 중 해당 위치의 펩티드를 선별해 합성한 "합성 펩티드"를 포함한다. 서열번호 2는 전장 텔로머라제의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
[표 2]
일 구체예에서, 상기 약학 조성물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 (comprising) 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80%이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드를 0.01 mg/mL 내지 100 mg/mL, 바람직하게는 0.1 mg/mL 내지 10 mg/mL의 농도로 포함할 수 있으나 치료대상별로 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다. 상기 범위 또는 그 이하의 범위로 포함하는 경우 본 발명의 의도한 효과를 나타내기에 적절할 뿐만 아니라, 조성물의 안정성 및 안전성을 모두 만족할 수 있으며, 비용 대비 효과의 측면에서도 상기 범위로 포함하는 것이 적절할 수 있다.
상기 약학 조성물은 인간, 개, 닭, 돼지, 소, 양, 기니아피그 또는 원숭이를 포함하는 모든 동물에 적용될 수 있다.
상기 약학 조성물은 경구, 직장, 경피, 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 골수 내, 경막 내, 피내 또는 피하 등으로, 바람직하게는 복강 내, 피내, 혈관 또는 피하로, 보다 바람직하게는 피하로 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 제형은 정제, 환제, 연질 또는 경질 캅셀제, 과립제, 산제, 액제 또는 유탁제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비경구 투여를 위한 제형은 주사제, 점적제, 로션, 연고, 겔, 크림, 현탁제, 유제, 좌제, 패취 또는 에어로졸일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 필요에 따라 희석제, 부형제, 활택제, 결합제, 붕해제, 완충제, 분산제, 계면 활성제, 착색제, 향료 또는 감미제 등의 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 약학 조성물은 당해 기술분야에 공지된 통상적인 약제학적 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 병용 투여될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 1종 이상의 추가의 치료제는 종래 신경 퇴행성 질환의 치료제로서 공지된 유효성분이다. 상기 "병용 투여"는 일 양상에 따른 약학 조성물 및 1종 이상의 추가의 치료제를 치료할 개체 또는 환자에게 동시에 혹은 시간 차를 두고 상이한 시점에서 임의의 순서로 투여하는 것을 의미한다. 따라서, 각 성분은 별도로 투여될 수도 있고, 목적하는 치료 효과를 제공하도록 충분히 근접한 시간으로 투여될 수도 있다.
상기 약학 조성물의 투여량은 투여받을 대상의 연령, 성별, 체중, 병리 상태 및 그 심각도, 투여 경로 또는 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 이의 1일 투여 용량은 예를 들어, 0.0001 mg/kg/일 내지 100 mg/kg/일, 바람직하게는 0.001 mg/kg/일 내지 10 mg/kg/일, 더 바람직하게는 0.001 mg/kg/일 내지 1 mg/kg/일이 될 수 있으나, 용량에 따른 효과의 차이를 보이는 경우 이를 적절히 조절할 수 있다.
상기 약학 조성물의 유효 성분의 투여 용량 및 투여 간격의 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 예를 들어, 인간에 대한 단위 투여 용량은 60 kg 성인을 기준으로 체중 kg 당 약 0.1 내지 100mg, 보다 구체적으로는 약 0.1 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 30 mg, 또는 0.5 mg 내지 10 mg 이 투여될 수 있으며, 투여 간격은 1일 1회 내지 4회, 또는 주 1회 내지 4회 등이 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 일 양상에 있어서, 4R 타우병증의 예방 또는 치료를 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 제공한다.
본 발명은 또 다른 일 양상에 있어서, 4R 타우병증의 예방 또는 치료를 위한, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 의약 용도를 제공한다.
본 발명은 또 다른 일 양상에 있어서, 4R 타우병증의 예방 또는 치료가 필요한 대상에게, 약학적으로 유효한 양의 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드, 및 이들의 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 투여하는 단계를 포함하는, 4R 타우병증의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
상기 열거된 양상에 따른 4R 타우병증의 예방 또는 치료를 위한 펩티드, 4R 타우병증의 예방 또는 치료를 위한 의약 용도, 및 상기 4R 타우병증의 치료 또는 예방 방법의 상세는 앞서 설명한 본 발명의 일 양상에 따른 약학 조성물에 대한 상기 설명이 그대로 적용될 수 있다.
또한, 상기 열거된 양상에 따른 4R 타우병증의 예방 또는 치료를 위한 펩티드, 4R 타우병증의 예방 또는 치료를 위한 의약 용도, 및 상기 4R 타우병증의 치료 또는 예방 방법에 사용되는 투여용법은, 앞서 설명한 개체 또는 환자의 치료 또는 예방에 유효한 양으로서 상기 약학 조성물의 투여량, 투여간격, 투여 횟수 등 에 대한 설명이 그대로 적용될 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
실험예 1: 펩티드 PEP-1의 합성
인간 텔로머라제로부터 선별된 하기의 서열 번호 1 (PEP-1)을 가지는 하기 화학식 1의 구조식을 갖는 16개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 합성하였다.
<화학식 1>
서열번호 1의 펩티드 PEP 1은 종래에 알려진 고상 펩티드 합성법에 따라 제조하였다. 구체적으로, 펩티드들은 ASP48S(Peptron, Inc., 대한민국 대전)를 이용하여 Fmoc 고상 합성법(solid phase peptide synthesis, SPPS)을 통해 C-말단부터 아미노산 하나씩 커플링함으로써 합성하였다. 다음과 같이, 펩티드들의 C-말단의 첫번째 아미노산이 수지에 부착된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Ala-2-chloro-Trityl Resin
NH2-Arg(Pbf)-2-chloro-Trityl Resin
펩티드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-term이 Fmoc으로 보호(protection)되고, 잔기는 모두 산에서 제거되는 Trt, Boc, t-Bu (t-butylester), Pbf (2,2,4,6,7-pentamethyl dihydro-benzofuran-5-sulfonyl) 등으로 보호된 것을 사용하였다. 예컨대 다음과 같다:
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacetic acid.
커플링 시약(Coupling reagent)으로는 HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate] / HOBt [N-Hydroxxybenzotriazole] /NMM [4-Methylmorpholine] 를 사용하였다. Fmoc 제거는 20%의 DMF 중 피페리딘(piperidine in DMF)을 이용하였다. 합성된 펩티드를 Resin에서 분리 및 잔기의 보호기 제거에는 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) [TFA (trifluoroacetic acid) /TIS (triisopropylsilane) / EDT (ethanedithiol) / H2O=92.5/2.5/2.5/2.5] 를 사용하였다.
아미노산 보호기가 결합된 출발 아미노산이 고상 지지체에 결합되어 있는 상태를 이용하여 여기에 해당 아미노산들을 각각 반응시키고 용매로 세척한 후 탈보호하는 과정을 반복함으로써 각 펩티드를 합성하였다. 합성된 펩티드를 수지로부터 끊어낸 후 HPLC로 정제하고, 합성 여부를 MS로 확인하고 동결 건조하였다.
PEP 1의 구체적인 합성 과정을 설명하면 다음과 같다.
1) 커플링
NH2-Lys(Boc)-2-chloro-Trityl Resin 에 보호된 아미노산(8당량)와 커플링 시약 HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량) 을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
2) Fmoc 탈보호
20%의 DMF 중의 피페리딘(piperidine in DMF) 을 가하고 상온에서 5분 간 2회 반응하고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
3) 1과 2의 반응을 반복적으로 하여 펩티드 기본 골격을 만들었다.
4) 절단(Cleavage): 합성이 완료된 펩티드 Resin에 절단 칵테일(Cleavage Cocktail) 을 가하여 펩티드를 Resin에서 분리하였다.
5) 얻어진 mixture에 Cooling diethyl ether를 가한 후, 원심 분리하여 얻어진 펩티드를 침전시킨다.
6) Prep-HPLC로 정제 후, LC/MS로 분자량을 확인하고 동결하여 powder로 제조하였다.
실험예 2: GV1001의 동물 기반 행동 평가
실험예 2-1: 실험 진행의 개요
실험 동물 및 이에 대한 약물의 투여는 하기 표 3 및 도 1에 나타낸 바와 같이 수행하였다.
실험예 2-2: 실험방법
1) Rota-rod 테스트 방법
(1) 3일간의 적응훈련을 진행한 뒤, 4일 차에 행동 실험을 진행한다.
(2) 실험 진행 1시간 전, 행동 실험이 진행될 공간을 실험쥐들이 적응할 시간을 준다.
(3) 적응 훈련 기간동안 5 rpm, 15 rpm, 20/25 rpm 의 속도의 트레드밀 위에서 360초 동안 강제로 걷게 한다. 이 때, 균형을 잃고 바닥에 떨어진 실험쥐를 다시 강제로 걷게 해 준다.
(4) 적응 훈련 이후 트레드밀을 480초 동안 5 rpm에서 35 rpm까지 점차적으로 속도를 증가시켜서 행동 실험을 진행한다. 트레드밀이 돌아가게 하였을 때, 실험쥐가 균형을 잃고 바닥에 떨어질 때까지의 시간(초)를 측정한다.
2) 신규 물건 인지 테스트 방법
(1) 1일 차에 새로운 개방공간에 대한 적응훈련을 진행한다. 2일 차에는 해당 개방공간에 추가된 유사한 두 물체에 대한 적응 시간을 준 뒤, 3일 차에 새롭게 교체된 물체에 대한 인지 능력을 평가하는 실험을 진행한다.
(2) 실험 진행 1시간 전, 행동 실험이 진행될 공간에 실험쥐들이 적응할 시간을 준다.
(3) 1일 차, 40x40cm 크기의 개방공간에 실험쥐를 노출시킨 뒤, 10분 동안 행동을 평가한다.
(4) 2일 차, 동일한 개방공간에 유사한 두 개의 물체를 놓은 뒤, 10분 동안 물체를 학습할 수 있도록 한다.
(5) 3일 차, 동일한 개방공간에서 학습된 두 개의 물체 중 하나를 새로운 물체로 교체한다. 이 때, 교체된 물체에 대한 인지 능력을 평가한다.
실험예 2-3: 행동 실험 결과
1) Rota-rod 테스트를 통한 운동 능력 개선 평가 실험
4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 Rota-rod 테스트를 통한 운동 능력 개선 효능 평가 결과를 하기 표 4 및 도 2에 나타내었다. 7개월부터 12개월까지 5개월 간 약물을 투여한 TauP301L-BiFC 마우스 모델을 이용하여 실험을 진행하였다. 투키 다중-비교 검정(Tukey’s multiple-comparisons)을 이용한 양방향 ANOVA 로 분석하였다(*p<0.05; **p<0.01; n.s. 비히클에 대해 무의미).
상기 표 4 및 도 2 에 따르면, 4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 운동 수행 결과는 다음과 같다.
- 11.6~12.1 개월령, 투약 59회차 형질전환 마우스 모델에서의 운동 수행 평가를 진행하였다. Rota-rod 트레드밀에서의 운동 수행 능력 실험 결과, 비히클에 비해 약물군에서 상대적으로 높은 운동 수행 능력을 보였다.
- 참조 화합물인 LMTM 투약군 (15 mg/kg)의 경우에 운동 수행 능력 향상의 경향성을 보였지만, 유의미한 차이는 보이지 않았다.
- GV1001 1, 2 mg/kg 투약군에서 비히클에 비해 유의미한 운동 수행 능력 향상을 나타내었다. GV1001 0.1 mg/kg 투약군의 경우, 운동 수행 능력 향상은 관찰되었지만, 비히클에 비해 통계적으로 유의미한 차이는 보이지 않았다.
2) 신규 물건 인지 테스트를 통한 인지 능력 개선 평가 실험
4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 신규 물건 인지 테스트를 통한 인지 능력 개선 효능 평가 결과를 도 3에 나타내었다. 7개월부터 12개월까지 5개월 간 약물을 투여한 TauP301L-BiFC 마우스 모델을 이용하여 실험을 진행하였다. 검은색 막대그래프는 학습된 물체, 빨간색 막대그래프는 새로운 물체에 대한 결과값을 나타낸다. 시닥 다중-비교 검정(Sidak’s multiple comparisons test)을 이용한 양방향 ANOVA 로 분석하였다(*p<0.05; ***p<0.0001).
도 3 에 따르면, 4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 인지 능력 비교 결과는 다음과 같다.
- 12.1~12.4 개월령, 투약 62회차 형질전환 마우스 모델에서의 인지 능력 평가 실행하였다. 형질 전환 마우스 모델을 통해 학습된 물체를 새로운 물체로 교체한 뒤 보이는 행동을 통해 인지 능력을 평가하였다. 비히클에 비해 투약군의 행동 실험 결과, 새로운 물체를 탐색한 시간이 학습된 물체에 비해 길게 나타났다.
- 참조 화합물인 LMTM 투약군 (15 mg/kg)은 새로운 물체에 대한 유의미한 인지 능력 개선을 보였다.
- GV1001 1 mg/kg 투약군의 경우, 약물에 의한 유의미한 인지 능력 개선을 보였다. 0.1 mg/kg 투약군에서는 비히클과 큰 차이를 보이지 않았다. 2 mg/kg 투약군에서는 인지 능력 개선의 경향을 보였지만, 통계적으로 유의미한 차이를 나타내지 않았다.
실험예 3: GV1001의 동물 기반 4R-타우병리 억제효능 평가
실험예 3-1: 실험 진행의 개요
실험 동물 및 이에 대한 약물의 투여는 하기 표 5 및 도 4에 나타낸 바와 같이 수행하였다.
사용된 실험 시약은 다음과 같다.
1)
뇌 조직 분석 (Tissue analysis)
2) 뇌 용해물 분석 (immunoblots)
실험예 3-2: 실험방법
A. TauP301L-BiFC mouse 기반 뇌조직 이미지 분석 실험 프로토콜
1) 뇌 조직 샘플링 실험 방법
(1) 1일차, 63회의 투약 일정이 종료된 TauP301L-BiFC 마우스 모델을 마취하여 심장개복 수술을 준비한다.
(2) TauP301L-BiFC 마우스 모델의 심장으로 Saline을 주입, Purfusion 펌프 기계를 사용하여 체내 혈액을 제거한다.
(3) 마우스의 뇌를 적출한 뒤, 무게를 측정한다.
(4) 조직 염색 실험에 사용될 뇌를 4% PFA 용액에 담가 24시간 동안 고정시킨다.
(5) 2일차, Fixation이 끝난 뇌 조직을 20% Sucrose 용액에 담가 24시간 동안 수분을 제거한다.
(6) 3일차, 뇌 조직을 30% Sucrose 용액에 담가 48시간 동안 수분을 제거한다.
(7) 5일차, 수분이 제거된 뇌 조직을 꺼내서 여분의 수분을 제거해준 뒤, 만들어둔 mold 안에 뇌조직과 동결조직 포매제 (OCT compound)를 함께 넣어 조직을 보호시키면서 드라이아이스로 뇌조직을 최대한 빠르게 얼린다. 얼린 뇌조직 mold는 -80˚C 디프리져에 보관한다. 이후, 동결 절편용 Cryostat을 사용하여 두께 30μm 단위로 조직을 잘라, 0.05% 아자이드화 나트륨 용액에 보관한다.
2) 뇌조직 AT8 면역형광염색 실험 방법
(1) 1일차, Cryosection이 진행 된 30μm 두께의 뇌 조직 샘플을 뇌 영역별로 선별한 뒤, PBS 용액에 담가 10분간 3회 세척한다.
(3) 3.7% Formaldehyde에서 5분간 고정시킨다.
(4) PBS 용액에 10분간 3회 세척한다.
(5) 뇌 조직 샘플을 0.3% PBS-T 용액에서 permeabilization 시킨다.
(6) 5% BSA in PBS 용액에 담가 1시간 동안 Blocking 한다.
(7) 1차 항체 (AT8)를 1:200 비율로 희석시킨 3% BSA, 0.1% Tween-20 in PBS 용액에 뇌조직을 넣어 O/N binding 시킨다.
(8) 2일차, 뇌조직을 PBS 용액에 담가 10분간 3회 세척한다.
(9) 2차 항체를 1:500으로 희석시킨 3% BSA, 0.1% Tween-20 in PBS 용액에 뇌조직을 넣어 1시간 동안 실온에서 binding 시킨다.
(10) 뇌조직을 PBS 용액에 담가 10분간 1회 세척한다.
(11) 1:2000 비율로 희석된 Hoechst (stock conc. 1mg/mL) in PBS 용액에 뇌조직을 담가 nuclei를 염색한다.
(12) 뇌조직을 PBS 용액에 담가 10분간 3회 세척한다.
(13) 슬라이드 스캐너를 사용해서 뇌조직 형광 이미징을 진행한다.
3) Tau-BiFC imaging을 위한 뇌조직 지질염색 실험 방법
(1) 1일차, Cryosection이 진행 된 30μm 두께의 뇌 조직 샘플을 사용하여 Sudan Black B 염색을 진행한다.
(2) 0.05% Sudan Black B in 70% EtOH 용액을 O/N 동안 저어준 뒤 0.22μm 필터를 통해서 입자를 거른다.
(3) 선별한 뇌 조직 샘플을 D.W.에 담가 5분간 3회 세척한다.
(4) 준비된 0.05% Sudan Black B 용액에 뇌조직을 담가 10분간 염색을 진행한다.
(5) Sudan black B에 염색된 뇌조직을 0.1% PBS-T 용액에 담가 30초 간격으로 세척하며 염색 정도를 조절한다.
(6) D.W.에서 5분간 3회 세척한다.
(7) 0.2 μg/mL 농도의 Hoechst in D.W. 용액에 뇌조직을 담가 20분 동안 nuclei염색을 진행한다.
(8) D.W.에서 5분간 3회 세척한다.
(9) 슬라이드 스캐너를 사용해서 Tau-BiFC 이미징을 진행한다
4) 뇌조직 형광 이미징 분석 방법
(1) 염색된 뇌 조직의 형광 이미지를 얻기 위해 Zeiss Axio Scan (Zeiss,
Oberkochen, Germany)을 사용하여 뇌조직 슬라이드를 스캔한다.
- BiFC 형광: λex=460-490 nm, λem=500-550 nm
- AT8 형광: λex=620-640 nm, λem=650-700 nm
- Hoechst 형광: λex=330-375 nm, λem=430-470 nm
(3) 이미징을 통해 얻은 부위 별 뇌 조직의 형광 수치를 Image J software (NIH)를 통해 계산한다.
나. TauP301L-BiFC mouse 기반 뇌 용해물 분석 실험 프로토콜
1) 뇌 용해물(Soluble fraction) 샘플링 실험 방법
(1) 투약이 종료된 TauP301L-BiFC 마우스모델을 마취하여 심장개복수술을 준비한다.
(2) TauP301L-BiFC 마우스모델의 심장으로 Saline을 주입, Perfusion 펌프기계를 사용하여 체내 혈액을 제거한다.
(3) 혈액 제거 후, 뇌를 적출하고 무게를 잰다.
(4) 적출한 뇌에 1mL RIPA buffer (w/ protease/phosphatase inhibitor cocktail)를 넣고 균질화(homogenization) 한다.
(5) 균질화된 뇌 용해물을 ep-tube에 옮긴 뒤, 4℃ orbital shaker에서 2시간동안 incubation한다.
(6) 4℃에서 20분 동안 13,000rpm으로 원심분리 후, 상층액(Soluble fraction)을 새 ep-tube에 모아 -80℃에 보관한다.
(7) 면역블롯 샘플 준비를 위해, Bradford 단백질 정량 방법으로 soluble fraction 샘플의 농도를 정량한다.
(8) 각 샘플에 RIPA buffer와 4X SDS Laemmli sample buffer (w/ 2.5% β-mercaptoethanol for reducing condition)를 추가하여, 최종 농도가 2mg/mL이 되도록 만들어준다.
(9) 샘플을 97℃에서 5분 동안 끓여준다.
2) 뇌 불용해물 (Insoluble fraction) 샘플링 실험 방법
(1) 상층액 (Soluble fraction)을 옮기고 남은 pellet을 1mL의 1M Sucrose, DNaseⅠ(conc. 1mg/mL) in RIPA buffer로 풀어준다.
(2) 4℃에서 20분 동안 13,000rpm으로 원심분리 후, 상층액을 제거한다.
(3) pellet을 2% SDS 용액 (1mL per gram of tissue)으로 resuspension한 후, 실온에서 1시간 동안 incubation한다.
(4) 실온에서 1분 동안 13,000rpm으로 원심분리 후, 상층액(Insoluble fraction)을 모아 새 ep-tube에 옮기고 동량의 2x SDS Laemmli sample buffer (w/ 2.5% β-mercaptoethanol for reducing condition)를 넣어준다.
(5) 샘플을 97℃에서 5분 동안 끓여준다.
3) 타우 면역블롯 실험 방법
(1) 1일차: 20μg의 뇌 용해물 샘플 (Soluble/Isoluble fractions)을 10% SDS-PAGE gel에 로딩한다.
(2) 80V에서 30분, 90V로 바꾸어서 1시간 동안 전기영동을 진행한다.
- SDS-PAGE running buffer: 1X Tris/Glycine/SDS buffer in 3’D.W.
(3) Transfer tray 사이즈에 맞게 잘라둔 PVDF Membrane을 100% Methanol에 1분, autoclaved 3’DW에 3분, 그리고 차갑게 둔 1X Transfer buffer에 10분 동안 담가둔다.
- Transfer buffer: 1X Tris/Glycine buffer w/ 20% Methanol in 3’D.W.
(4) 100V에서 1시간 20분 동안 Wet-Transfer를 진행한다.
(5) 5% BSA in TBS-T (w/ 0.1% Tween-20) 용액에 membrane을 담가 상온에서 1시간 동안 blocking을 진행한다.
(6) 1차 항체가 포함된 2.5% BSA in TBS-T (w/ 0.1% Tween-20) 용액에 membrane을 담가 4℃, orbital shaker에서 O/N 동안 binding을 진행한다.
- Anti-Tau (Tau5) antibody (ab80579, 1:5000)
- Anti-Tau (phospho S199) antibody (ab109390, 1:5000)
- Anti-Tau (phospho S396) antibody (ab81268, 1:5000)
(7) 2일차: Membrane을 TBS-T (w/ 0.1% Tween-20) 용액에 담가 10분간 3회 세척한다.
(8) 2차 항체가 포함된 2.5% BSA in TBS-T (w/ 0.1% Tween-20) 용액에 membrane을 담가 실온에서 1시간 동안 binding 진행한다.
- Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) secondary antibody (ab6789, 1:10000)
- Goat Anti-Rabbit IgG H&L (HRP) secondary antibody (ab6721, 1:10000)
(9) Membrane을 TBS-T (w/ 0.1% Tween-20) 용액에 담가 10분간 3회 세척한다.
(10) HRP substrate인 ECL solution을 사용하여 ChemiDoc을 통해 Membrane의
band를 detection한다.
(11) Detection된 Band의 intensity는 Image J software (NIH)를 통해 정량화 한다.
실험예 3-3: GV1001의 동물 기반 4R-타우병리 억제효능 평가 결과
A. Tau-BiFC 이미징 및 AT8 면역형광염색을 통한 타우병리 개선효능 평가 결과
7개월령부터 12개월령까지 5개월 간 약물을 투여한 TauP301L-BiFC 마우스 모델의 뇌조직을 이용하여 (A) Tau-BiFC 이미징 및 (B) AT8 면역형광염색을 진행하였다.
감각운동 피질, 운동피질, 해마, 및 흑색질 영역에서의 (A) Tau-BiFC 이미징 및 (B) AT8 면역형광염색 결과를 촬영한 사진, 및 각각의 형광정도를 정량 분석한 결과를 그래프로 도시한 결과를 각각 도 5(감각운동 피질), 도 6(운동피질), 도 7(해마), 및 도 8(흑색질 영역)에 나타내었다. 또한, 해당 결과를 하기 표 8에 나타내었다. 두넷 다중-비교 검정을 이용한 단방향 ANOVA로 분석하였다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n.s. 비히클에 비해 무의미).
4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 뇌조직 이미징 분석 결과 (Tau-BiFC)
- 7개월령부터 12개월령까지 5개월간 63회 약물을 투여한 TauP301L-BiFC 마우스 모델의 뇌조직을 얻었으며, 뇌조직의 자가형광을 지질염색(Sudan black B stain)으로 제거한 뒤, Tau-BiFC 형광 이미징을 진행하였다.
- 기존 12개월령 TauP301L-BiFC 마우스 모델의 뇌 내, Tau-BiFC 형광으로 표현되는 타우 올리고머 형성에 따른 4R-타우병리가 우세하게 나타나는 감각운동피질(somatosensory cortex), 운동피질 (Motor cortex), 및 해마 (Hippocampus, CA1) 영역에서 Tau-BiFC 형광정도를 정량 분석한 결과, 비히클 군 대비 GV1001 약물군이 유의미하게 타우 올리고머 형성 억제 효능을 보였다.
- 또한, 상기 실험예 2에서 운동수행능력 평가 결과 GV1001약물군에서 비히클군에 비해 유의미한 운동 수행 능력 향상을 보였기 때문에, 추가적으로 뇌의 기저핵 (Basal ganglia)에 위치하여 신체 동작 제어에 중요한 역할을 하는 부위인 흑색질 (Substantia Nigra)의 Tau-BiFC 형광정도도 확인하였다. 그 결과, 비히클 군 대비 GV1001 0.1mpk 및 2mpk 약물군에서 유의미하게 Tau-BiFC 형광정도가 감소하였다. 즉, 타우 올리고머 형성 억제 효능을 보였다.
- 참조 화합물인 LMTM 투약군 (15mpk)의 경우, 운동피질, 해마, 흑색질 영역에서 비히클 군 대비 유의미한 Tau-BiFC 형광정도의 감소, 즉 타우 올리고머 형성 억제 효능을 보였다.
구체적으로 살펴보면,
감각운동피질 (somatosensory cortex) 영역에서, 비히클 군 대비 GV1001 0.1mpk, 1mpk, 2mpk 약물군에서 각각 0.71 배, 0.68 배, 0.63 배로 유의미하게 Tau-BiFC 형광정도가 감소하였음을 확인하였다.
운동피질 (Motor cortex) 영역에서, 비히클 군 대비 GV1001 1mpk, 2mpk 약물군에서 각각 0.56 배, 0.73 배로 유의미하게 Tau-BiFC 형광정도가 감소하였음을 확인하였다.
해마 (Hippocampus, CA1) 영역에서, 비히클 군 대비 GV1001 1mpk, 2mpk 약물군에서 각각 0.77 배, 0.54 배로 유의미하게 Tau-BiFC 형광정도가 감소하였음을 확인하였다.
흑색질 (Substantia Nigra) 영역에서, 비히클 군 대비 GV1001 0.1mpk, 2mpk 약물군에서 각각 0.56 배, 0.68 배로 유의미하게 Tau-BiFC 형광정도가 감소하였음을 확인하였다.
4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 뇌조직 이미징 분석 결과 (AT8 면역형광염색)
- 7개월령부터 12개월령까지 5개월간 63회 약물을 투여한 TauP301L-BiFC 마우스 모델의 뇌조직을 얻었다. 타우 과인산화 항체인 AT8 (phospho-Tau S202/T205)을 이용한 면역형광염색을 진행 후, 뇌조직 형광 이미징을 통해, 감각운동피질(Somatosensory cortex), 운동피질 (Motor cortex), 해마 (Hippocampus, CA1) 및 흑색질 (Substantia Nigra) 영역에서 AT8 형광정도를 정량 분석하였다. 그 결과, 비히클 군 대비 GV1001 약물군이 유의미하게 타우 과인산화 억제 효능을 보였다.
- 참조 화합물인 LMTM 투약군 (15mpk)의 경우, 감각운동피질, 운동피
질, 해마 영역에서 비히클 군 대비 유의미한 AT8 형광정도의 감소, 즉 타우 과인산화 억제 효능을 보였다. 구체적으로 살펴보면,
감각운동피질 (somatosensory cortex) 영역에서, 비히클 군 대비 GV1001
0.1mpk, 1mpk, 2mpk 약물군에서 각각 0.75 배, 0.63 배, 0.61 배로 유의미하게 AT8 형광정도가 감소하였음을 확인하였다.
운동피질 (Motor cortex) 영역에서, 비히클 군 대비 GV1001 0.1mpk, 1mpk,
2mpk 약물군에서 각각 0.74 배, 0.74 배, 0.50 배로 유의미하게 AT8 형광정도가 감소하였음을 확인하였다.
해마 (Hippocampus, CA1) 영역에서, 비히클 군 대비 GV1001 1mpk, 2mpk
약물군에서 각각 0.64 배, 0.66 배로 유의미하게 AT8 형광정도가 감소하였음을 확인하였다.
흑색질 (Substantia Nigra) 영역에서, 비히클 군 대비 GV1001 2mpk 약물군에서 0.42 배로 유의미하게 AT8 형광정도가 감소하였음을 확인하였다.
B. TauP301L-BiFC mouse 기반 뇌용해물 분석 결과
7개월령부터 12개월령까지 5개월 간 약물을 투여한 TauP301L-BiFC 마우스 모델의 뇌용해물을 얻어, 1) 가용성 분획 샘플 및 2) 비가용성 분획 샘플을 가지고, 총 타우 (Tau5) 및 인산화 타우 (pS199, pS396) 항체를 이용한 면역블롯을 진행한 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었으며, 그 총 타우 및 인산화 타우 정도를 정량 분석한 결과를 나타낸 그래프와 함께 나타내었다. 또한, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다. 두넷 다중-비교 검정을 이용한 단방향 ANOVA로 분석하였다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, n.s. 비히클에 비해 무의미).
4R TauP301L-BiFC 마우스모델에서의 뇌용해물 활용 타우 면역블롯 분석 결과
- 7개월령부터 12개월령까지 5개월간 63회 약물을 투여한 TauP301L-BiFC 마우스 모델의 뇌용해물-가용성 분획과 비가용성 분획을 확보하였다. 이를 활용하여 총 타우 (Tau5) 및 인산화 타우 (pS199, pS396) 항체를 사용한 타우 면역블롯을 진행하였다. 총 타우 및 인산화 타우 밴드 강도를 정량 분석하였다.
- TauP301L-BiFC 마우스 모델의 뇌용해물 타우 면역블롯 수행 시, 인간 Tau-BiFC (hTau-VN173, hTau-VC155)는 85kDa와 76kDa 사이즈의 밴드를 보이며, 마우스 Tau는 50-70kDa 사이즈의 밴드를 보였다.
- 가용성 분획을 활용한 타우 면역블롯 결과, 비히클 군 대비 GV1001 약물군에서 유의미하게 총 타우 및 인산화 타우 정도가 감소하였다. 즉, 가용성 타우 올리고머 및 인산화 타우 형성 억제 효능을 보였다.
- 또한, 불용성 분획을 활용한 타우 면역블롯 결과에서도 비히클 군 대비 GV1001 약물군에서 유의미하게 총 타우 정도가 감소하였다. 즉, GV1001 약물의 불용성 타우 응집물 의 형성 억제 효능을 보였다.
- 참조 화합물인 LMTM 투약군 (15mpk)의 경우, 비히클 군 대비 마우스 총 타우 및 인산화 타우 수준이 유의미하게 감소하였다.
구체적으로 살펴보면, 가용성 분획은 다음과 같았다.
- 총 타우의 경우, 비히클 군 대비 GV1001 2mpk 약물군에서 0.79 배로 유의미하게 Total hTau가 감소하였으며, GV1001 0.1mpk, 1mpk, 2mpk 약물군에서 각각 0.77 배, 0.69 배, 0.71 배로 유의미하게 Total mTau가 감소하였다.
- 인산화 타우 (pS199)의 경우, 비히클 군 대비 GV1001 0.1mpk, 2mpk 약물군에서 각각 0.74 배, 0.57 배로 유의미하게 hTau pS199가 감소하였고, GV1001 0.1mpk, 1mpk, 2mpk 약물군에서 각각 0.58 배, 0.56 배, 0.46 배로 유의미하게 mTau pS199가 감소하였다.
- 인산화 타우 (pS396)의 경우, 비히클 군 대비 GV1001 0.1mpk, 1mpk, 2mpk 약물군에서 각각 0.67 배, 0.68 배, 0.51 배로 유의미하게 hTau pS396이 감소하였고, GV1001 0.1mpk, 1mpk, 2mpk 약물군에서 각각 0.62 배, 0.62 배, 0.50 배로 유의미하게 mTau pS199가 감소하였다.
불용성 분획은 다음과 같았다.
- 비히클 군 대비 GV1001 0.1mpk, 1mpk, 2mpk 약물군에서 각각 0.19 배, 0.34 배, 0.29 배로 유의미하게 총 타우 수준이 감소하였다.
본 명세서에서 사용된 용어들은 특정 구체예들을 설명하기 위한 목적으로만 의도된 것이지 본 발명을 한정하고자 하는 의도가 아니다. 명사 앞에 개수가 생략된 용어는 수량을 제한하고자 하는 것이 아니라 언급된 명사 물품이 하나 이상 존재하는 것을 나타내는 것이다. 용어 "포함하는", "갖는", 및 "함유하는"은 열린 용어로 해석된다 (즉, "포함하지만 이에 한정되지는 않는"의 의미).
수치의 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 수치들을 개별적으로 언급하는 것을 대신하는 쉬운 방법이기 때문이며, 그것이 아님이 명시되어 있지 않는, 각 별개의 수치는 마치 개별적으로 명세서에 언급되어 있는 것처럼 본 명세서에 통합된다. 모든 범위의 끝 값들은 그 범위 내에 포함되며 독립적으로 조합 가능하다.
본 명세서에 언급된 모든 방법들은 달리 명시되어 있거나 문맥에 의해 명백히 모순되지 않는 한 적절한 순서로 수행될 수 있다. 어느 한 실시예 및 모든 실시예 또는 예시적 언어 (예컨대, "~과 같은")를 사용하는 것은, 청구범위에 포함되어 있지 않는 한, 단지 본 발명을 더 잘 기술하기 위함이지 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 명세서의 어떤 언어도 어떤 비청구된 구성요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 해석되어서는 아니된다. 다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용되는 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 갖는 사람에 의해 통상 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예들은 본 발명을 수행하기 위해 발명자에게 알려진 가장 최적의 모드를 포함한다. 바람직한 구체예들의 변이들이 앞선 기재를 읽으면 당업자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 당업자들이 그러한 변이를 적절히 이용하길 기대하고, 발명자들은 본 명세서에 기재된 것과 다른 방식으로 본 발명이 실시되기를 기대한다. 따라서, 본 발명은, 특허법에 의해 허용되는 것과 같이, 첨부된 특허청구범위에서 언급된 발명의 요지의 균등물 및 모든 변형들을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변이들 내에서 상기 언급된 구성요소들의 어떤 조합이라도 여기서 반대로 명시하거나 문맥상 명백히 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다. 본 발명은 예시적인 구체예들을 참조하여 구체적으로 나타내어지고 기술되었지만, 당업자들은 하기 청구범위에 의해 정의되는 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서도 형태 및 디테일에서 다양한 변화가 행해질 수 있음을 잘 이해할 것이다.
Claims (6)
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로서 포함하는 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편인 펩티드를 포함하는 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 4R 타우병증은 진핵성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration), 은친화입자병(Argyrophilic grain disease), 및 ARTAG(aging-related tau astrogliopathy includes globular glial tauopathy) 로부터 선택되는 것인 4R 타우병증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 상기 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 펩티드 또는 그 단편인 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 약학적으로 유효한 양으로 포함하는 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 단편은 3개 이상의 아미노산으로 구성된 단편인 펩티드를 포함하는 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
- 청구항 4 또는 5에 있어서, 상기 4R 타우병증은 진핵성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 피질기저핵변성(Corticobasal degeneration), 은친화입자병(Argyrophilic grain disease), 및 ARTAG(aging-related tau astrogliopathy includes globular glial tauopathy) 로부터 선택되는 것인 4R 타우병증의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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