CZ303086B6

CZ303086B6 - Zpusob purifikace dvojretezcové DNA užitím imobilizovaného oligonukleotidu

Info

Publication number: CZ303086B6
Application number: CZ20023865A
Authority: CZ
Inventors: Crouzet@Joel; Scherman@Daniel; Wils@Pierre; Blanche@Francis; Cameron@Beatrice
Original assignee: Aventis Pharma S.A.
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2012-03-28
Also published as: WO2001092511A2; SK287662B6; IL152860A0; SK16602002A3; BR0111145A; IL196444A; EP1290156B1; MXPA02011463A; AU6345901A; ES2298239T3; HUP0302565A3; CN1446258A; JP4803945B2; NO20025567L; PL359265A1; KR100853040B1; AU2007202804B2; AU2001263459B2; HU228891B1; DK1290156T3

Abstract

Rešení se týká nového zpusobu purifikace dvojretezcové DNA. Zpusob je založen na tom, že roztok obsahující požadovanou DNA ve smesi s dalšími složkami prochází pres nosic, na který je kovalentne navázaný oligonukleotid schopný hybridizovat se specifickou sekvencí prítomnou v DNA a vytváret s ní trojšroubovicovou strukturu.

Description

Způsob purifikace dvoj řetězcové DNA užitím imobilizovaného oligonukleotidu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového způsobu purifikace DNA. Způsob podle vynálezu umožňuje rychlou purifikaci farmakologicky užitečné dvoj řetězcové DNA. Způsob purifikace podle vynálezu využívá specifické hybridizace mezi sekvencí DNA a oligonukleotidem.

Dosavadní stav techniky

Postupy genové a buněčné terapie prodělávají v současné době pozoruhodný rozvoj. Avšak tyto postupy přinášejí také potřebu produkovat velká množství DNA ve farmaceutické čistotě. Při těchto nových léčebných postupech často léčivo sestává ze samotné DNA nebojí obsahuje, aje proto nezbytné, aby tato DNA mohla být vyráběna v potřebném množství, a aby byla izolována a purifikována takovým způsobem, aby byla vhodná pro použití v humánní medicíně.

V současnosti byla v mnoha publikacích prokázána možnost injekce plazmidové DNA pro účely genové terapie nebo vakcinace, kde bylo ukázáno, že DNA expresní vakcinace, kde bylo ukázáno, že DNA expresní vektory mohou být přijímány různými typy buněk a geny kódované těmito plazmidy mohou být následně exprímovány (Ledley, 1995 Hum. Gene Ther. 6, 1129).

K požadovaným genům pro genové terapie nebo vakcinace patří například nádorové supresorové geny, tzv. „sebevražedné“ geny nebo anti-sense sekvence. Mohou to být také geny kódující proteiny jako je například alfa-fetoprotein AFP (Morinaga, N83. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, S0, 4604), enzymy, hormony, cytokiny, růstové faktory jako je například FGF (Jouanneau et al., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88, 2893) nebo VEGFB (Olofsson B al., 1996, Proceedings 93, 576), koagulační faktory jako ,3-deleted“ faktor VIII (faktor VIII s B delecí) (Truett et al., 1985, DNA 4, 333), apolipoproteiny, neurotransmitery, neurotrofícké faktory, přírodní nebo chimérické imunoglobuliny. A také reportérové geny jako je například gen lacZ kódující βgalaktozidázu z Escherichia coli.

Hlavními úkoly, které je třeba řešit při používání plazmidové DNA jako vektoru pro přenos genů v humánní medicíně jsou i) výroba a ii) čistota produktu jakožto léčiva. Technologie pro produkci plazmidových vektorů s vysokým počtem kopií v hostiteli Escherichia coli byly vyvinuty. Plazmidy používané v současné době jsou buďto plazmidy odvozené z plazmidu ColEl, jako je například pBR322, pUC nebo pBluescript (Lahijaní et al., 1996, Hum. Gene Ther.l, 7, 1971), nebo plazmidy pCOR (Soubrier et al., 1999, Gene Therapy, 6, 1482).

Druhý soubor problémů spojených s použitím plazmidové DNA jako vektoru pro genové terapie je čistota plazmidového vektoru samotného. Současné metody purifikace jako je například ultracentrifugace vCsCl gradientu nebo chromatografie mohou být někdy neúčinné při odstranění kontaminujících složek jako je například hostitelská genomová DNA a RNA nebo proteiny. Konkrétně, hostitelská genomová DNA, jejíž chemická struktura je velmi blízká plazmidové DNA, je mimořádně obtížně odstranitelná s využitím klasické chromatografie. Typické koncentrace hostitelské genomové DNA, které jsou naměřeny v plazmidových preparátech získaných pomocí klasické chromatografie, jsou až 0,5 až 1 %. Tudíž pro přípravu plazmidové DNA jako bezpečného vektoru pro humánní genovou terapii je potřebná technologie purifikace, která sníží obsah hostitelské genomové DNA na mnohem nižší hladiny, typicky 0,1 nebo 0,01 % nebo dokonce nižší.

Předkládaný vynález popisuje nový jednoduchý a obzvláště účinný způsob purifikace DNA. Tento způsob konkrétně umožňuje dosáhnout obzvláště vysoké čistoty současně s vysokým výtěžkem. Způsob podle vynálezu je založen v podstatě na specifické interakci mezi sekvencí vlože- 1 CZ 303086 B6 nou do DNA, která má být purifikována, a oligonukleotidem, který je složen z přírodních nebo modifikovaných bází.

Nedávno bylo ukázáno, že některé oligonukleotidy jsou schopné specifické interakce s širokým žlábkem dvojšroubovice DNA, kdy vzniká lokální trojšroubovicová struktura, která vede k inhibici transkripce cílových genů (Heléne et Toulmé, Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99). Tyto oligonukleotidy selektivně rozpoznávají DNA dvojšroubovici v oligopurinoligopyrimidinové sekvenci, což jsou úseky obsahující oligopurinové sekvence vjednom řetězci a oligopyrimidinové sekvence v druhém komplementárním řetězci, a tam lokálně vytvářejí trojšroubovici. Báze ío tohoto třetího řetězce (oligonukleotidu) vytvářejí vodíkové vazby (Hoogsteenovy nebo reverzní

Hoogsteenovy vazby) s puriny Watson-Crickových párů bází.

Použití tohoto typu interakce k izolaci plazmidu již bylo popsáno v dřívějším stavu techniky. Ito et al. (PN AS 89 (1992) 495) popsali použití biotinylovaného oligonukleotidu schopného rozpoz15 návat konkrétní sekvenci plazmidu a vytvářet s ní trojšroubovici. Takto vytvořené komplexy jsou pak přivedeny do kontaktu s magnetickými perličkami potaženými streptavidinem. Interakce mezi biotinem a streptavidinem pak umožní, aby plazmid byl izolován pomocí magnetické separace perliček a následné eluce. Avšak i tento způsob má některé nevýhody. Konkrétně, dvě po sobě následující specifické interakce jsou potřebné, a sice první mezi oligonukleotidem a plazmi2o dem a druhá mezí biotinylovaným komplexem a streptavidinem potaženými perličkami. A dále, konečný roztok může být kontaminován biotinylovaným i oligonukleotidy, které však nesmějí být ve farmaceutickém přípravku.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález popisuje nový, zlepšený způsob purifikace DNA s využitím tohoto typu interakce. Způsob podle vynálezu užívá zejména oligonukleotidy kovalentně navázané (kondenzované) na nosič. Takový způsob purifikace je obzvláště rychlý a poskytuje i obzvláště vysoké výtěžky a stupeň čistoty. Navíc umožňuje purifikovat DNA z komplexní směsi, která obsahuje konkrétně další nukleové kyseliny, proteiny, endotoxiny (jako jsou například lipopoiysacharidy), nukleázy apod. Použitý nosič může kromě toho být snadno recyklován a DNA získaná způsobem podle vynálezu vykazuje zlepšené vlastnosti z hlediska farmaceutické bezpečnosti. A nakonec, na rozdíl od způsobů ve stavu techniky, způsob podle vynálezu představuje pouze jediný krok.

První aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu purifikace dvojřetězcové (tj. dvojšroubovicové) DNA, který spočívá v tom, že je roztok obsahující DNA smíchanou s dalšími složkami filtrován přes nosič, na který je kovalentně navázán (kondenzován) olígonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici pomocí hybridizace se specifickou sekvencí přítomnou v DNA. Přitom speci40 fleká sekvence může být sekvence přirozeně přítomná ve dvojřetězcové DNA nebo umělá sekvence vnesená do DNA umělým způsobem.

Oligonukleotidy použité v předkládaném vynálezu jsou oligonukleotidy, které hybrídizují přímo s dvoj řetězcovou DNA. Tyto oligonukleotidy mohou obsahovat následující báze:

- thymidin (T), který je schopen vytvářet triplety (trojice) s A.T dublety (dvojicemi, páry bází) ve dvojřetězcové DNA (Rajagopal et al., Biochem 28 (1989) 7859),

- adenin (A), který je schopen vytvářet triplety s A.T dublety ve dvojřetězcové DNA,

- guanin (G), který je schopen vytvářet triplety s G.C dublety ve dvojřetězcové DNA,

- protonovaný cytosin (C+), který je schopen vytvářet triplety s G.C dublety ve dvojřetězcové

DNA (Rajagopal et al., viz výše),

- uráčil (U), ktetý je schopen vytvářet triplety s A.U dublety nebo A.T dublety.

Výhodně, olígonukleotid podle předkládaného vynálezu obsahuje homopyrimidinovou sekvenci bohatou na cytosin a specifická sekvence přítomná v DNA je hornopurin-homopyrimidinová

sekvence. Přítomnost cytosinů umožňuje vytvořit trojšroubovici, která je stabilní v kyselém pH, kde jsou cytosiny protonovány, a je destabilizovaná v alkalickém pH, kde cytosiny jsou neutralizovány. Aby se mohla vytvořit trojšroubovice hybridizací, je důležité, aby oligonukleotid a specifická sekvence přítomná v DNA byly komplementární. Aby byl získán co nej lepší výtěžek a bylo dosaženo co nejlepší selektivity, oligonukleotid a specifická sekvence, které jsou použity ve způsobu podle předkládaného vynálezu, jsou plně komplementární. Mohou to být např. konkrétně oligonukleotid poly(CTT) a specifická sekvence poly(GAA). Jako příklad lze zmínit oligonukleotid mající sekvenci:

5-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(GAGG(CTT)₇, SEKVENCE ID. Č. 1), io ve které báze GAGG netvoří trojšroubovici, ale umožňují, že oligonukleotid je vzdálen od spojovacího ramínka. Také lze uvést oligonukleotid mající sekvenci:

(CTT)₇ (SEKVENCE ID. Č. 26).

Tyto oligonukleotidy jsou schopny vytvářet trojšroubovici se specifickou sekvencí obsahující komplementární jednotky (GAA). Požadovaná specifická sekvence pak může konkrétně být úsek obsahující 7, 14 nebo 17 GAA jednotek, jak je popsáno v příkladech.

Další sekvence, které jsou zajímavé z hlediska předkládaného vynálezu je specificky následující sekvence:

5'-Λ AGGG AGGG AGGAGAGG A A-3 (SEKVENCE ID. Č. 5). io Tato sekvence vytváří trojšroubovici s oligonukleotidy

5AAGGAGAGGAGGGAGGGAA3 (SEKVENCE ID. Č. 6) nebo 5 -TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 7).

V tomto případě se oligonukleotid váže v antiparalelní orientaci k polypurinovému řetězci. Tyto trojšroubovice jsou stabilní pouze v přítomnosti Mg²⁺ (Vasquez et al., Biochemistry, 1995, 34,

7243 až 725 í, Beal a Dervan, Science, 1991,251, 1360 až 1363).

Jak již bylo uvedeno výše, specifická sekvence může být sekvence přirozeně přítomná v dvojřetězcové DNA nebo umělá sekvence do DNA vnesená uměle. Zvláště výhodný je podle předklá30 daného vynálezu oligonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici se sekvencí přirozeně přítomnou v dvoj řetězcové DNA, například v replikačním počátku plazmidu nebo v markerovém genu.

V této souvislosti původce prováděl analýzy plazmidových sekvencí, a ukázal, že některé úseky těchto DNA, konkrétně v replikačním počátku, mohou obsahovat homopurin—homopyrimídinové úseky. Syntéza oligonukleotidu, které jsou schopné vytvářet trojšroubovici těmito přírodními homopurin—homopyrimidinovými úseky, výhodně umožňuje, aby byl způsob podle předkládaného vynálezu aplikován na nemodifikované plazmidy, konkrétně komerčně dostupné plazmidy typu pUC, pBR322, pSV apod. K homopurin-homopyrimidinovým sekvencím přirozeně přítomným v dvoj řetězcové DNA patří například sekvence obsahující celou nebo část sekvence: 5-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3' (SEKVENCE ID. Č. 2), přítomné v replikačním počátku plazmidu E. coli ColEl. V tomto případě oligonukleotid vytvářející trojšroubovici má sekvenci:

-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3' (SEKVENCE ID. Č. 3) a váže se střídavě ke dvěma řetězcům dvoj šroubo vice, jak bylo popsáno v Beal and Dervan (J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 4976 až 4982) a Jayasena and Johnston (Nucleic Acids Res. 1992, 20, 5279 až 5288). Také lze uvést sekvenci:

-GAAAAAGGAAGAG-3' (SEKVENCE ID. Č. 4) z genu β-laktamázy z plazmidu pBR322 (Duval-Valentin et al.. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1992, 89, 504 až 508).

Dvě další cílové sekvence, které mohou vytvářet trojšroubovicové struktury s konkrétními oligonukleotidy byly identifikovány v replikačních počátcích ColEl a pCOR. Plazmidy odvozené

- 3 CZ 303086 B6 z ColEl obsahují homopurinový 12-mer (mající sekvenci 5-AGAAAAAAAGGA-3' SEKVENCE ID. Č. 27) ležící v protisměru („upstream“) od RNA-Π transkriptu účastnícího se v replikaci plazmidu (Lacatena et al., 1981, Nátuře, 294, 623). Tato sekvence vytváří stabilní trojšroubovicovou strukturu s komplementárním 12-memím oligonukleotidem se sekvencí 5'5 TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 28). Kostra pCOR obsahuje homopurinový úsek 14 nerepetitivních bází se sekvencí (5-AAGAAAAAAAAGAA-3) (SEKVENCE ID. Č. 29) lokalizovaný v A+T bohatém segmentu v počátku replikonu pCOR (Levchenko et al., 1996, Nucleic Acids Res., 24, 1936). Tato sekvence vytváří stabilní trojšroubovicovou strukturu s komplementárním 14-merním oligonukleotidem sekvence 5-TTC TTTTTTTTCTT-3' (SEKto VENC E ID. Č. 30). Odpovídající oligonukíeotidy 5 -TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 28) a 5 -TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 30) účinně a specificky zacilují své odpovídající komplementární sekvence lokalizované v replikačním počátku ColEl ori nebo pCOR (oři γ). Skutečně jednoduchá nekanonická triáda (T*GC nebo C*AT) může vést k úplné destabilizaci trojšroubovicové struktury.

Použití oligonukleotidu schopného vytvořit trojšroubovici se sekvencí přítomnou v replikačním počátku nebo markerovém genu je obzvláště výhodné, jelikož to umožňuje pomocí stejného oligonukleotidu purifi kovat jakoukoliv DNA obsahující uvedený počátek replikace nebo uvedený mar keřový gen. Tudíž není nutné modifikovat plazmid nebo dvoj řetězcovou DNA, aby do ní byla

2o vložena umělá specifická sekvence.

Přestože plně komplementární sekvence jsou výhodné, je zřejmé, že některé neshody („mismatches“) mohou být tolerovány mezi sekvencí oligonukleotidu a sekvencí přítomnou v DNA, pokud nevedou k příliš velké ztrátě afinity. Např. lze uvést sekvenci 5-AAAAAAGG25 GAATAAGGG-3' (SEKVENCE ÍD. Č. 8) přítomnou v genu β-laktamázy v E. coli. V tomto případě thymin, který přerušuje polypurinovou sekvenci může být rozpoznáván guaninem třetího řetězce, čímž se vytvoří G*TA triplet, který je stabilní, když je obklopen dvěma triplety T*AT (Kiessling et al., Biochemistry, 1992, 31, 2829 až 2834).

V konkrétním výhodném provedení vynálezu oligonukíeotidy obsahují sekvence (CCT)_n, sekvence (CT)_n nebo sekvence (CTT)_n, kde n je celé číslo 1 až 15, včetně. Zvláště výhodné je použití sekvence typu (CT)_n nebo (CTT)_n. Původce vynálezu ukázal, že výtěžek purifikace byl ovlivněn množstvím (počtem) C v oligonukleotidu. Konkrétně, jak je ukázáno v příkladu 7, výtěžek purifikace se zvyšuje, když oligonukleotid obsahuje méně cytosinů. Je jasné, že oligonukíeotidy podle vynálezu mohou také kombinovat (CCT), (CT) nebo (CTT) jednotky.

Oligonukíeotidy podle vynálezu mohou být přírodní (složené z nemodifikovaných přírodních bází) nebo chemicky modifikované. Zejména oligonukíeotidy mohou výhodně obsahovat určité chemické modifikace, které jim poskytují rezistenci k nukleázám nebo zesilují ochranu proti nukleázám nebo zvyšují afinitu pro specifickou sekvenci.

Oligonukleotid podle předkládaného vynálezu znamená také jakýkoliv sled nukleosidů, ve kterém byla modifikována kostra s cílem, aby byl odolnější vůči nukleázám. K takovým modifikovaným oligonukleotidům patří fosforothioátové oligonukíeotidy, které jsou schopné vytvářet trojšroubovice s DNA (Xodo et al., Nucleic Acids. Res., 1994, 22, 3322 až 3330), a také oligonukleotidy obsahující formacetálovou nebo methylfosfonátovou kostru (Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc., 1991, 1 13, 7767 až 7768). Je také možné použít oligonukíeotidy syntetizované s aanomery nukleotidů, které také vytvářejí trojšroubovici s DNA (Le Doan et al, Nucleic Acids, Res., 1987, 15, 7749 až 7760). Další modifikací kostry je fosforamidátová vazba, kterou popsali

Gryaznov and Chen, poskytuje oligonukíeotidy vytvářející obzvláště stabilní trojšroubovici s DNA (J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143 až 3144). K dalším modifikacím kostry patří použití ribonukleotidů, 2'-O-methylribózy, fosfod i esterů apod. (Sun and Héléne, Curr. Opin ion Struct. Biol., 116, 3143 až 3144). A nakonec lze uvést, že kostra založená na fosforu může být nahrazena polyamidovou kostrou, jako je tomu v případě PNA (peptidové nukleové kyseliny), které mohou také vytvářet trojšroubovici (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497 až 1500, Kim et al.,

-4CZ 303086 B6

J. Am. Chem. Soc., 1993,115, 6477 až 6481), nebo kostrou založenou na guanidinu, jako je tomu u DNG (deoxyribonukleoguanidin, viz Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1995, 92. 6097 až 6101), nebo polykat iontový mi analogy DNA, které také mohou vytvářet trojšroubovici.

Thymin třetího řetězce může také být nahrazen 5-bromuracilem, který zvyšuje afinitu oligonukleotidu pro DNA (Povsic and Dervan, J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 3059 až 3061). Třetí řetězec může také obsahovat jiné než přírodní báze, ke kterým patří například 7—deaza-2'-deoxyxanthosin (Milligan et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21, 327 až 333), l-(2-deoxy {p-D-ribofuranosyl)-3~methyl-5-amino-lH-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-on (Koh and Dervan. T. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1470 až 1478), 8-oxoadenin, 2—aminopurin, 2'-O-methylpseudoisocytidin nebo jakékoliv další modifikace, které jsou odborníkům známy (pro přehled viz Sun and Héléne, Curr. Opinion Struct. Biol., 1993, 3, 345 až 356).

Další typy modifikací oligonukleotidů mají za cíl zvláště zlepšení interakce a/nebo afinity mezi oligonukleotidem a specifickou sekvencí. Nej výhodnější modifikací podle vynálezu je methylace cytosinového oligonukleotidů (viz Příklad 5). Oligonukleotidy takto methylované mají významnou vlastnost, a sice že vytvářejí stabilní troj Šrouboví co vou strukturu se specifickou sekvencí při pH blízkém neutrálnímu (> 5). To tedy umožňuje pracovat pri vyšších pH hodnotách, než co umožňovaly oligonukleotidy ze stavu techniky, jinými slovy při takových pH hodnotách, kdy riziko degradace plazmidové DNA je mnohem menší.

Délka oligonukleotidů výhodného pro použití ve způsobu podle vynálezu je alespoň 3 báze a výhodněji 5 až 30 bází. Výhodně se užívá oligonukíeotid délky větší než 10 bází. Délku si může odborník snadno upravit pro každý jednotlivý případ podle požadované selektivity a stability interakce.

Oligonukleotidy podle vynálezu mohou být syntetizovány jakoukoliv známou technikou. Konkrétně mohou být připraveny užitím syntetizátorů nukleových kyselin. Ale samozřejmě mohou být užity jakékoliv další způsoby odborníkovi známé.

Aby byla možná kovalentní vazba na nosič, oligonukíeotid podle vynálezu je obecně funkctonalizován. Tedy je modifikován thiolovou, aminovou nebo karboxylovou terminální skupinou na 5' nebo 3' konci. Konkrétně přidání thiolové, aminové nebo karboxylové skupiny umožňuje například kondenzací oligonukleotidů na nosič nesoucí dtsulfidovou, maleimidovou, aminovou, karboxylovou, esterovou, epoxidovou, bromkyanovou nebo aldehydovou skupinu. Ke kondenzaci dochází tím, že se vytvářejí disulfidické, thioetherové, esterové, amidové nebo aminové vazby mezi oligonukleotidem a nosičem. Samozřejmě může být použit jakýkoliv další způsob odborníkovi známý, jako je například použití bifunkčního kondenzačního činidla.

Navíc, aby se zlepšila hybridizace s kondenzovaným oligonukleotidem, může být výhodně použit oligonukíeotid obsahující sekvenci bází zvanou „raménko“ („arm“) a „oddělovač“ („spacer). Použití raménka umožňuje, aby se oligonukíeotid navázal ve zvolené vzdálenosti na nosič, což zlepšuje podmínky interakce s DNA. Raménko výhodně sestává z lineárního uhlíkového řetězce, obsahujícího 1 až 18, a výhodně 6 nebo 12 skupin (CH₂), a aminovou skupinu, která dovoluje vazbu na kolonu (nosič). Raménko je navázáno na fosfát oligonukleotidů nebo „spaceru“, který je složen z bází, které ne interferuj i s hybridizaci. Tedy „spacer“ může obsahovat purinové báze. Jako příklad lze uvést „spacer“ obsahující sekvenci GAGG. Raménko výhodně sestává z lineárního řetězce obsahujícího 6 nebo 12 atomů uhlíku.

Pro realizaci předkládaného vynálezu mohou být použity různé typy nosičů. Mohou to být funkcionalizované chromatografieké nosiče, volné nebo naplněné v koloně, funkcionalizované povrchy plastů nebo funkcionalizované chromatografické nosiče, volné nebo naplněné v koloně, funkcionalizované povrchy plastů nebo funkcionalizované latexové perličky, magnetické nebo jiné. Výhodně jsou použity chromatografické nosiče. Tak například jako chromatografické nosiče může být využita agaróza, akiylamid nebo dextran, a také jejich deriváty (jako je například

-5 CZ 303086 B6

Sephadex, Sepharose, Superose atd.), polymery jako je například poly(styren/divinylbenzen) nebo například „roubované“ nebo „neroubované“ křemičitany. Chromatografická kolona pak může pracovat difúzním nebo perfúzním způsobem.

Pro dosažení lepšího výtěžku purifikace je obzvláště výhodné použít na plazmidu sekvenci obsahující několik pozic hybridizujících s oligonukleotidem. Přítomnost několika hybridizujících pozic vede ke stimulaci interakce mezi danou sekvencí a oligonukleotidem, což vede ke zlepšení výtěžku purifikace. Tedy pro oligonukleotid obsahující n opakování (repetic) motivů (CCT), (CT) nebo (CTT), je výhodné použití DNA sekvence obsahující alespoň n komplementárních io motivů, a výhodně n+1 komplementárních motivů. Sekvence nesoucí n+1 komplementárních motivů umožňuje dvě pozice hybridízace s oligonukleotidem. Výhodně DNA sekvence obsahuje až 11 hybridizačních pozic, tedy n+10 komplementárních motivů.

Způsob podle předkládaného vynálezu může být použit k purifikaci jakéhokoliv typu dvojřetěz15 cové DNA. Například kruhové DNA, jako je například plazmid, obecně nesoucí jeden nebo více genů, které mají terapeutický význam. Plazmid může také nést počátek replikace, markerový gen apod. Způsob podle vynálezu může být aplikován přímo na buněčný lyzát. V takovém provedení, plazmid amplifikovaný pomocí transformace a následně v buněčné kultuře, je purífikován přímo po lýze buněk. Způsob podle vynálezu může také být aplikován na čiré lyzáty, tedy na supema2o tant získaný po neutralizaci a centrifugací buněčného lyzátu. Může být také samozřejmě aplikován na roztok prepurifikovaný některou ze známých metod. Způsob podle předkládaného vynálezu také umožňuje, aby byla lineární nebo kruhová DNA nesoucí požadované sekvence purifikována ze směsi obsahující různé DNA s odlišnými sekvencemi. Způsob podle vynález může také být použit pro purifikaci dvoj řetězcové DNA.

Buněčný lyzát může být lyzát z prokaryotických nebo eukaryotických buněk.

Jako příklady vhodných prokaryotických buněk lze uvést bakterie E. coli, B. subtilis, S. typhimurium nebo Streptomyces. Pokud jde o eukaryotické buňky, jako příklady lze zmínit živočišné buňky, kvasinky, houby apod., obzvláště pak kvasinky Kluyveromyces nebo Sacharomyces nebo buňky COS, CHO, Cl27, NIH3T3, apod.

Způsob podle vynálezu je obzvláště výhodný, neboť umožňuje získat velmi rychle a velmi jednoduše plazmidovou DNA ve vysoké čistotě. Konkrétně, jak je ilustrováno v příkladech, způsob podle vynálezu umožňuje oddělit požadovanou plazmidovou DNA účinně od kontaminujících složek, jako jsou například fragmenty chromozomové DNA, endotoxiny, proteiny, nukleázy apod. Obzvláště pak způsob podle vynálezu umožňuje přípravu dvojřetězcové DNA, konkrétně DNA plazmidového původu, mající obsah chromozomové DNA nižší nebo nejvýše rovný 0,5 %. Ještě výhodněji DNA preparáty získané způsobem podle vynálezu měly obsah chromozomové

DNA nejvýše 0,2 %.

Tedy předkládaný vynález popisuje přípravky obsahující plazmidovou DNA, která může být použita farmaceuticky, konkrétně v genové nebo buněčné terapii. V této souvislosti předmětem vynálezu je i farmaceutický přípravek obsahující dvoj řetězcovou DNA, lineární nebo plazmido45 vého původu, připravenou způsobem popsaným výše.

Předkládaný vynález se tedy také týká preparátu plazmidové DNA mající obsah chromozomové DNA menší nebo rovný 0,5 %, výhodně menší nebo rovný 0,2 %, a ještě výhodněji menší nebo rovný 0,1 %, a nejvýhodněji menší nebo rovný 0,01 %. Jak je podrobněji uvedeno v příkladech níže, krok trojšroubovicové afinitní interakce byl zaveden do puriflkačního procesu založeného na klasických chromatografických krocích. Tento afinitní krok významně zlepšuje čistotu takto získaných plazmidových preparátů, bez ohledu na jejich počáteční čistotu. Vytvoření trojšroubovicové struktury mezi oligonukleotidem (kovalentně navázaným na chromatografickém nosící) a požadovaným plazmidem, který má být purífikován, je založeno na přítomnosti sekvence v plazmidu, která může vytvářet s oligonukleotidem troj šrouboví co vou strukturu. Tato trojšrou-6CZ 303086 B6 bovicová struktura je stabilní pouze v kyselém pH, kde cytosinové oligonukleotidy jsou protonovány. Pak je plazmidová DNA eluována z kolony jednoduše zvýšením pH na neutrální hodnotu.

Přípravky mohou obsahovat plazmidovou DNA, která je bez jakéhokoliv nosiče, je tzv. „ nahá“, nebo je spojená s transportním nosičem, jako jsou například liposomy, nanočástice, kationtové lipidy, polymery, rekombinantní viry nebo proteiny apod.

V jednom provedení vynálezu byl být způsob podle vynálezu použit k purifi kován i jednoho typu dvoj řetězcové DNA ze směsi obsahující dva nebo více odlišných typů dvoj řetězcové DNA s odlišnými sekvencemi. Takový způsob může být aplikován přímo na buněčný lyzát, kdy plázni id amplifikovaný pomocí transformace a následně v buněčné kultuře, je purifikován přímo po lýze buněk. Způsob podle vynálezu může také být aplikován na čirý lyzáty, tedy na supematant získaný po neutralizaci a centrifugací buněčného lyzátu. Způsob podle vynálezu může být samozřejmě také užit na roztok, který byl prepuri ti kován.

Přesněji řečeno, způsob purifikace první dvojřetězcové DNA z roztoku obsahujícího první a druhou dvojřetčzcovou DNA, obsahuje (i) průchod roztoku přes první nosič obsahující kovalentně kondenzovaný oligonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici s druhou dvojřetčzcovou DNA hybrid i žací se specifickou sekvencí v této DNA, (i i) získání roztoku, který prošel přes první nosič, a který je obohacen o nenávaznou první dvoj řetězcovou DNA, a (iii) průchod získaného roztoku přes druhý nosič obsahující kovalentně kondenzovaný oligonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici hybridi žací se specifickou sekvencí v první dvojřetězcové DNA. Po volitelném kroku promytí je první dvojřetězcová DNA eluována z druhého nosiče. Využitím tohoto způsobu dvojité purifikace může být získána první dvojřetězcová DNA z druhého nosiče bez jakékoliv detekovatelné hladiny druhé dvojřetězcové DNA.

Ve specifickém provedení předkládaného vynálezu je první dvojřetězcová DNA molekula plazmid pCOR mající specifickou sekvenci:

AAGAAAAAAAAGAA -3' (SEKVENCE ID. Č. 29), která tvoří stabilní trojšroubovicovou strukturu s oligonukleotidem majícím sekvenci:

-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 30).

Druhá dvojřetězcová DNA molekula je plazmid odvozený z plazmidu ColEl obsahující specifickou sekvenci:

AGAAAAAAAGGA-3 (SEKVENCE ID. Č. 27), která tvoří trojšroubovicovou strukturu s oligonukleotidem majícím sekvenci:

5-TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 28).

Tudíž s využitím způsobu dvojité purifikace podle předkládaného vynálezu je plazmid pCOR výhodně purifikován z roztoku obsahujícího další plazmidy, jako jsou například plazmidy odvozené z plazmidy ColEl.

Předkládaný vynález bude ještě podrobněji popsán v následující části přihlášky, obsahující příklady, které je třeba považovat za ilustrativní a neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Obecné metody klonování a molekulární biologie použité v příkladech

Tradiční metody molekulární biologie, jako je například štěpení restrikčními enzymy, gelová elektroforéza, transformace E. coli, precipítace nukleových kyselin apod., jsou popsány v odborné literatuře (viz např. Maniatis et al., Τ., E. F. Fritsch, and J. Sambrook, 1989. Molecular

-7CZ 303086 B6

Cloning: Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, Ausubel F. M., R. Brent, R. E. Kinston, D. D. Moore, J. A. Smith, J. G. Seidman and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecuiar biology 1987 až 1988. John Wiley and Sons, New York.). Nukleotidové sekvence byly stanoveny metodou termi5 nace prodlužování řetězce podle publikovaného protokolu (Ausubel et al., 1987).

Restrikční enzymy byly zakoupeny od firmy New England Bioiabs, Beverly, MA (Biolabs).

K provedení ligace byly DNA fragmenty inkubovány v pufru obsahujícím 50 mM Tris-HCl, iu pH 7,4, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 2 mM ATP, v přítomnosti DNA ligázy z fága T4 (Biolabs).

Oligonukleotidy byly syntetizovány chemickou syntézou s použitím fosforamiditů, kdy fosforamidity byly chráněny β poloze kyanoethylovou skupinou (Sínha, N. D., J. Biemat, J. McManus and H. Koster, 1984. Polymer support oligonucleotide synthesis, XVIII: Use of β-cyanoethylN,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of

DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the finál product. Nucl. Acids Res., 12, 4539 až 4557: Giles, J. W. 1985. Advances in automated DNA synthesis. Am. Biotechnol., Nov./Dec.). Pro syntézu byl užit automatický DNA syntetizátor Biosearch 8600 podle návodu výrobce.

2o Ligo vaně DNA nebo DNA, které byly testovány na účinnost transformace, byly užity k transformaci následujícího kmene kompetentních buněk:

E. coli DH5a ÍF/endAl, hsdR17, supE44, thi—1, recA1, gyrA96, relAl, Δ (lacZYA-arqF)U169, deoR, O80dlac lacZAM15)] (projakýkoliv plazmid ColEl), nebo

E. coli XAC-pir (pro jakýkoliv plazmid odvozený z plazmidu pCor).

Minipreparace plazmidové DNA byla prováděna podle protokolu Kleina et al., 1980.

Pro kultivaci kmenů E, coli bylo užito médium LB (Maniatis et al., 1982). Kmeny byly inkubovány ve 37 °C. Bakterie byly naneseny na misky s LB médiem s přídavkem vhodného antibio30 tiká.

Příklad 1

1.1. Příprava kolony

Kolona, která byla použita, byla 1 ml HiTrap kolona aktivované NHS (N-hydroxysukinimidem, Pharmacia) připojená k peristaltické pumpě (výstup < 1 ml/min.). Použitý specifický oligonukleotid obsahoval NH₂ skupinu na 5' konci, a měl následující sekvenci:

w 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 1)

V příkladu byly užity následující pufry:

Kondenzační (vazebný) pufr: 0,2 M NaHCO₃, 0,5 M NaCl, pH 8,3.

Pufr A: 0,5 M ethanolamin, 0,5 M NaCl, pH 8,3.

Pufr B: 0,1 M acetát, 0,5 M NaCl, pH 4.

Postup

Kolona byla promyta 6 ml 1 mM HCI a oligonukleotid naředěný kondenzačním pufřem (50 nmol v 1 ml) byl pak nanesen na kolonu a ponechán po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Kolona pak byla promyta třikrát 6 ml pufru A a pak 6 ml pufru B. Oligonukleotid byl takto navázán kovalentně na kolonu prostřednictvím CONH vazby. Kolona byla uložena ve 4 °C v PBS, 0,1 % NaN₃ a může být použita alespoň čtyřikrát.

-8CZ 303086 B6

1.2. Konstrukce plazmidu

Následující dva oligonukleotidy byly syntetizovány. Oligonukleotid 4817 (SEKVENCE ID.

Č. 9):

5-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3' Oligonukleotid 4818 (SEKVENCE ID. Č. 10):

5-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG3' io

Tyto oligonukleotidy, když jsou hybridizovány a klonovány do plazmidu. vnášejí homopurin— homopyrimidinovou sekvenci (GAA)₁₇ (SEKVENCE ID. Č. 33) do odpovídajícího plazmidu, jak bylo popsáno výše.

i5 Sekvence odpovídající těmto dvěma hybridizovaným oligonukleotidům byla klonována do víceěetného klonovacího místa plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), který nese gen rezistence k ampicilinu. Pro tento účel byly oligonukleotidy hybridizovány následujícím způsobem: jeden pg každého oligonukleotidů byl vnesen do 40 μί pufru obsahujícího 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl₂. Tato směs byla zahřívána na 95 °C a pak byla přenesena do teploty místnosti, kdy teplota směsi pomalu klesala. Deset ng směsi hybridizovaných oligonukleotidů bylo ligováno s 200 ng plazmidu pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolia CA) naštěpeným BamHI a EcoRl v 30 μί objemu. Po ligací byl alikvot reakční směsi transformován do DH5ct. Transformační směs byla nanesena na misky s L médiem s přídavkem ampicilinu (50 mg/1) a X-gal (20 mg/1). Rekombinantní klony by měly projevit absenci modrého zabarvení na

2? tomto médiu, na rozdíl od rodičovského plazmidu (pBKS+). který dovoluje ct-komplementaci fragmentu ω z β—galaktozidázy E. coli. Po minipreparaci plazmidové DNA ze 6 klonů, všechny vykazovaly zmizení Pstl místa lokalizovaného mezi EcoRl a BamHI místy pBKS+ a zvýšení molekulární hmotnosti 448—bp Pvull pásu obsahující vícecetné klonovací místo. Jeden klon byl vybrán a odpovídající plazmid byl nazván pXL2563. Klonovaná sekvence byla verifikována sekw věncováním s použitím primeru -20 (5 -TGACCGGCAGCAAAATG-3' (SEKVENCE ID. Č. 11)) (Viera J. a J. Messing. 1982. pUC plasmids, M13mp7-derived systém for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19, 259 až 268) pro plazmid pBKS+ (Stratagene Cloning Systeme, La Jolla CA). Plazmid pXL2563 byl purifikován pomocí soupravy Wizard Megaprep Kit (Promega Corp. Madison, WT) podle protokolu výrobce. Tento preparát plazmidové DNA byl pak použit v následujících příkladech.

1.2. Purifikace plazmidu

Vybavení

Plazmid pXL2563 (popsaný v části 1.2) byl purifikován na HiTrap koloně s kondenzovaným oligonukleotidem, jak bylo popsáno v části 1.1., z roztoku, který také obsahoval plazmid pBKS+. Pufry použité při této purifíkaci byly následující:

Pufr F: 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5 až 5.

Pufr Ε: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Postup

Kolona byla promyta 6 ml pufru F a plazmidy (20 pg pXL2563 a 20 pg pBKS+ ve 400 pl pufru F) byly naneseny na kolonu a inkubovány po dobu 2 hodin pří teplotě místnosti. Kolona pak byla promyta 10 ml pufru F a eluce pak byla provedena pufrem E. Plazmidy byly detekovány po elektroforéze na 1% agarózovém gelu po obarvení ethidiumbromidovém barvení. Podíl plazmidu v roztoku byl stanoven pomocí měření jejich transformační aktivity na E. coli.

-9CZ 303086 B6

Výsledky

Z výchozí směsi obsahující 30 % pXL2S63 a 70 % pBKS+ byl na výstupu z kolony získán roztok obsahující 100 % pXL2563. Čistota stanovená pomocí poměru OD pri 260 a 280 nm stoupla z hodnoty 1,9 na 2?5, což ukazuje, že kontaminující proteiny byly tímto způsobem odstraněny.

Příklad 2

2.1. Popis purifikace plazmidové DNA

Kondenzace oligonukleotidu (SEKVENCE ID. Č. 1: 5 -GAGGCTTCTFCTTCTTCTTCTTCTT-3' na kolonu byla provedena jak bylo popsáno v příkladu 1. Pro kondenzaci byl oligonukleotid modifikován na 5' konci aminoskupinou navázanou k fosfátovému spaceru pomocí raménka obsahujícího 6 atomů uhlíku (Modified Oligonucleotides Eurogentec SA, Belgium). Plazmid pXL2S63 byl purifikován pomocí soupravy Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) podle protokolu výrobce. Pufry použité v tomto příkladu byly následující:

Pufr F: 0 až 2 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 4,5 až 5.

Pufr E: 1 M TrisHCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Kolona byla promyta 6 ml pufru F a 100 μΐ plazmidů pXL25563 naředěného ve 400 μΐ pufru F bylo naneseno na kolonu a inkubováno po dobu l hodiny pri teplotě místnosti. Kolona pak byla promyta 10 ml pufru F a eluce pak byla provedena pufrem E. Byl měřen obsah genomové nebo chromozomové DNA E. coli přítomné ve vzorcích plazmidů před a po průchodu kolonou s oligonukleotidem. Plazmid byl kvantifikován měřením optické denzity při 260 nm.

V tomto příkladu bylo navázání provedeno v pufru, jehož molarita, pokud jde o NaCl, se měnila od 0 do 2 M (pufr F). Výtěžek purifikace se snižoval, když se snižovala molarita NaCl. pH vazebného pufru se může měnit v rozmezí 4,5 až 5, přičemž výtěžek purifikace je lepší pri 4,5. Je také možné použít jiný eluční pufr s bazickým pH: eluce v takovém případě byla provedena pufrem obsahujícím 50 mM borát, pH 9, a 0,5 mM EDTA.

2.2, Kondenzace oligonukleotidu

Kondenzace oligonukleotidu (SEKVENCE ID. Č. 1: 5-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3') na kolonu byla provedena jak bylo popsáno v příkladu 1. Plazmid pXL2S63 byl purifikován pomocí soupravy Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) podle protokolu výrobce. Pufry použité v tomto příkladu byly následující:

Pufr F: 0,1 M NaCl, 0,2 M acetát, pH 5.

Pufr E: 1 M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Kolona byla promyta 6 ml pufru F a 100 μΐ plazmidů pXL2563 naředěného ve 400 μΐ pufru F bylo naneseno na kolonu a inkubováno po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Kolona pak byla promyta 10 ml pufru F a eluce pak byla provedena pufrem E. Byl měřen obsah genomové nebo chromozomové DNA £. coli přítomné ve vzorcích plazmidů před a po průchodu kolonou s oligonukleotidem. Genomová DNA byla kvantifikována pomocí PCR s použitím primerů pro gen galK z E. coli podle následujícího protokolu:

Sekvence primerů byly popsány v Debouck et al. (Nucleic Acids Res. 1985, 13, 1841 až 1853):

5'-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3' (SEKVENCE ID. Č. 24), a 5-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3' (SEKVENCE ID. Č. 25).

- 10CZ 303086 B6

Reakční médium obsahovalo v 25 μΐ PCR pufru (Promega France, Charbonniéres): 1,5 mM MgCb, 0,2 mM dXTP (Pharmacia, Orsay), 0,5 μΜ primery, 20 U/ml Taq polymerázy (Promega). Reakce byla prováděna v následujících krocích:

- 5 minut v 95 °C

- 30 cyklů: 10 sekund v 95 °C, 30 sekund v 60 °C, 1 minuta v 78 °C

- 10 minut v 78 °C.

Amplifikovaný DNA fragment velikosti 124 párů bází byl separován elektroforézou na 3% agarózovém gelu v přítomnosti SybrGreen I (Molecular Probes, Eugene, USA) a pak kvantifikován vtažením k referenční čisté genomové DNA, Sigma, katalog. Č. D4889).

Ve vzorku nanášeném na kolonu byl obsah chromozomové DNA 1 %, zatímco ve vzorku po puriťikaci na oligonukleotidové koloně byl obsah chromozomové DNA 0,2 %.

Příklad 3

Purifikace z Čirého lyzátu

Tento příklad popisuje purifikaci plazmidové DNA z čirého lyzátu bakteriální kultury, a sice v tzv. „minipreparačním“ měřítku: 1,5 ml kultury kmenu DH5a obsahujícího plazmid pXL2563 po kultivaci přes byl stočen a pelet byl resuspendován ve 100 μΐ pufru: 50 mM glukóza, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. Bylo přidáno 200 μΐ 0,2 M NaOH, 1 % SDS, zkumavky pak byly promíchány obracením, pak bylo přidáno 150 μΙ 3 M acetátu draselného, pH 5, a zkumavky pak byly opět promíchány obracením. Po centrifugací byl odebrán supematant a nanesen na kolonu s oligonukleotidem připravenou jak bylo popsáno v příkladu 1 navázání, promývání a eluce byly shodné jako v příkladu 1. Přibližně 1 μg plazmidu byl izolován z 1,5 ml kultury. Získaný plazmid byl analyzován elektroforézou na agarózovém gelu a barvením ethidiumbromidem, přičemž výsledkem byl jediný pás „nadšroubovicové“ kruhové DNA. Žádné stopy vysokomolekulární (chromozomové) DNA nebo RNA nebyl detekovatelné v plazmidu puntíkovaném tímto způsobem. Poměr optických denzit ve 260 a 280 nm byl vyšší než 2.

Příklad 4

4.1.

Tento příklad popisuje purifikaci plazmidové DNA prováděnou ve stejných podmínkách jako v příkladu 3, přičemž výchozím materiálem bylo 20 ml bakteriální kultury kmenu DH5a obsahujícího plazmid pXL2563. Buněčný pelet byl odebrán do 1,5 ml pufru: 50 mM glukóza, 25 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. Lýze byla provedena 2 ml 0,2 M NaOH, 1 % SDS a následná neutralizace 1,5 ml 3 M acetátu draselného, pH 5. DNA pak byla precipitována 3 ml 2-propanolu a pelet byl pak rozpuštěn v 0,5 ml pufru: 0,2 M acetát sodný, pH 5, 0,1 M NaCl, a nanesen na kolonu s oligonukleotidem připravenou jak bylo popsáno v příkladu 1. Navázání, promytí kolony a eluce byla prováděny shodně jako v příkladu 1, s výjimkou toho, že promývací pufr měl molaritu, pokud jde o NaCl, 0,lM. Přibližně 16 pg plazmidové DNA bylo získáno. Získaný plazmid byl analyzován elektroforézou na agarózovém gelu a barvením ethidiumbromidem, přičemž výsledkem byl jediný pás „nadšroubovicové“ kruhové DNA. Žádné stopy vysokomolekulámí (chromozomové) DNA nebo RNA nebyl detekovatelné v plazmidu puntíkovaném tímto způsobem. Štěpení plazmidu restrikčními enzymy poskytlo jediný pás odpovídající očekávané velikosti 3 kilobáze. Koncentrace proteinů ve vzorcích se snížila ze 125 pg/ml u čirého lyzátu na méně než l pg/ml v purifikovaném plazmidu (Micro-BCA test, Pierce). Koncentrace endotoxinu, stanovená pomocí testu LAL (Biosepra) byla až lOx nižší v purifikovaném plazmidu ve srovnání s čirým lyzátem.

- 11 CZ 303086 B6

4.2.

Použitý plazmid obsahuje kazetu obsahující cytomegalo virový promotor, gen kódující luciferázu a homopurinhomopyrimidinovou sekvenci (GAA)_]7 (SEKVENCE ID. Č. 33) pocházející z plazmidu pXL2563. Kmen DH1 (Maniatis et al., 1989) obsahující tento plazmid byl kultivován 7 litrovém fermentoru. Čirý lyzát byl připraven z 200 gramů buněk: buněčný pelet byl resuspendován ve 2 litrech pufru: 25 mM Tris, pH 6,8, 50 mM glukóza, 10 mM EDTA, ke kterému pak byly přidány 2 litry pufru: 0,2 M NaOH, 1 % SDS. Lyzát byl neutralizován přidáním 1 litru 3M acetátu draselného. Po diafiltraci byly 4 ml zahuštěného lyzátu naneseny na 5 ml HiTrap-NHS io kolonu s navázaným oligonukleotidem majícím sekvenci: 5-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' SEKVENCE [D. Č. 1), a sice způsobem popsaným v příkladu 1.1. pro mývání a eluce byly prováděny stejně jako v příkladu 1. Přibližně 400 mikrogramů plazmidu bylo získáno. Hladina genomové DNA v tomto vzorku, měřená technikou popsanou v příkladu 2.2, byla 0,1 %.

Příklad 5

Použití modifikovaného oligonukleotidu

2» Tento příklad popisuje použití oligonukleotidu nesoucího methylované cytosiny. Sekvence použitého oligonukleotidu byla následující:

5'-GAGG^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT^MeCTT^McCTT^MeCTT^Me-3^ř (SEKVENCE ID. Č. 12)

Tento oligonukleotid má NH₂ skupinu na 5' konci, ^MeC = 5-methylcytosin. Tento oligonukleotid umožňuje, že plazmid pXL2563 je purifikován v podmínkách příkladu 1 s vazebným pufrem pH 5 (riziko degradace plazmidu je tím sníženo).

Příklad 6

Ve výše uvedených příkladech použitý oligonukleotid je modifikován na 5'-konci aminoskupinou připojenou k fosfátu prostřednictvím raménka obsahujícího 6 atomů uhlíku: ΝΗ_?-(Ε4Ε)ό V tomto příkladu je aminoskupina připojena k fosfátu 5-koncové části prostřednictvím raménka obsahujícího 12 atomů uhlíku: NH₂-(CH₂)i₂.

Kondenzace oligonukleotidu a průchod kolonou jsou prováděny jak popsáno v příkladu 2 s pufrem F: 2M NaCI, 0,2M acetát, pH 4,5. Tento oligonukleotid umožňuje dosáhnout lepší výtěžky purifikace: je dosažen 53% výtěžek, zatímco s oligonukleotidem obsahujícím 6 atomů uhlíku je tento výtěžek 45 % za stejných podmínek.

Příklad 7

Při následování klonovací strategie popsané v příkladu 1.2, byly konstruovány další dva plazmidy 45 nesoucí homopurin-homopyrimidinové sekvence: plazmid pXL2725, který obsahuje sekvenci (GGA)|6, (sekvence id. č. 34) a plazmid pXL2726, který obsahuje sekvenci (GA)₂₅ (sekvence id. Č. 35).

Příklad 7.1

Konstrukce plazmidu

Plazmidy pXL2725 a pXL2726, analogické k plazmidu pXL2563, byly konstruovány podle klo55 novací strategie popsané v příkladu 1.2, s použitím následujících párů oligonukleotidů:

- 12 CZ 303086 B6

5986: 5'-GATCC(GA)₂₅GGG-3 5987: 5'-AATTCCC(TC)₂₅G-3' 5981: 5'-GATCC(GGA)i₇GG-3 5982: 5'-AATT(CCT)₁₇CCG-3' (SEKVENCE ID. Č. 13) (SEKVENCE ID. Č. 14) (SEKVENCE ID. Č. 15) (SEKVENCE ID. Č. 16)

Pár oligonukleotidů 5986 a 5987 byl použit ke konstrukci plazmidu pXL2726 klonováním oligonukleotidů do míst BamHI a EcoRI z pBKS+ (Stratagene Cloning System, La Jolla CA), zatímco oligonukleotidy 5981 a 5982 byl použity pro konstrukci plazmidu pXL2725. Byly použity stejné experimentální podmínky jako pro konstrukci plazmidu pXL2563 a byly změněny pouze páry oligonukleotidů. Podobně byly klonované sekvence ověřeny sekvencováním plazmidu. To umožnilo zjistit, že plazmid pXL2725 má modifikaci vzhledem k očekávané sekvenci: místo sekvence GGA opakované 17krát je zde GGAGA(GGA)₁₅ (SEKVENCE ID. Č. 17).

Příklad 7.2

Příprava kolon a purifikace

Oligonukleotidy tvořící troj šroubovice s těmito ho mop uri novým i sekvencemi byly kondenzovány ke kolonám HiTrap podle techniky popsané v příkladu 1.1. Oligonukleotid sekvence 5 -AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 18) byl použit pro purifikaci plazmidu pXL2725 a oligonukleotid sekvence 5-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 19) byl použit pro purifikaci plazmidu pXL2726.

Dvě kolony takto získané umožnily, že odpovídající plazmidy byly purifikovany podle techniky popsané v příkladu 2 s následujícími pufry:

Pufr F: 2M NaCl, 0,2M acetát, pH 4,5.

Pufr Ε: 1M Tris-HCl, pH 9, 0,5 mM EDTA.

Dosažené výtěžky byly 23 a 31 % pro pXL2725 a pXL2726, v daném pořadí.

Příklad 8

Tento příklad ilustruje vliv délky specifické sekvence přítomné v plazmidu na výtěžek purifikace.

Příklad 8.1

Konstrukce plazmidu

Reportérovy gen použitý v těchto experimentech k demonstraci aktivity přípravků podle vynálezu je gen kódující luciferázu (Luc).

Plazmid pXL2621 obsahuje kazetu obsahující cytomegalovirový (CMV) promotor o velikosti 661 bp, extrahovaný z pcDNA3 (Invitrogen Corp., San Diego, CA) Štěpením restrikčními enzymy Mlul a Hindi11, klonovaným v protisměru od genu kódujícího luciferázu, do míst Mlul a HindlII, do základního vektoru pGL (Promega Corp., Madison, WI). Tento plazmid byl konstruován s použitím standardních technik molekulární biologie.

Plazmidy pXL2727-l a pXL2727-2 byly konstruovány následujícím způsobem:

- 13 CZ 303086 B6

Dva mikrogramy plazmid pXL2621 byly linearizovány s BamHI, enzym byl inaktivován ošetřením po dobu 10 minut v 65 °C, současně byly oligonukleotidy 6006 a 6008 hybridizovány, jak bylo popsáno pro konstrukci plazmidu pXL2563.

6006: 5-GATCT(GAA)|₇CTGCAGATCT-3 (SEKVENCE ID. Č. 20)

6008: 5'-GATCAGATCTGCAG(TTC),₇A-3' (SEKVENCE ID. Č. 21).

Tento hybridizační směs byla klonována na BamHI konce plazmidu pXL2621 a, po transformaci do DH5a, rekombinantní klony byly identifikovány Pstl enzymatickou restrikční analýzou, protože oligonukleotidy vnesly Pstl místo. Dva klony byly vybrány a nukleotidové sekvence klonovaného fragmentu byla ověřena s použitím primeru (6282, 5 -ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3' (SEKVENCE ID. Č. 22)) jako primeru pro sekvencování (Viera J. A J. Messing, 1982. The pUC plasmids an M13mp7-derived systém for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19: 259 až 268).

První klon (pXL2727-l) obsahuje sekvenci GAA opakovanou 1 Okřát. Druhý (pXL2727-2) obsahuje sekvenci 5—GAAGAAGAG(GAA)₇GGAAGAGAA-3 (SEKVENCE ID. Č. 23).

Příklad 8.2

Příprava kolon a purifikace

Byla použita kolona, jako je popsaná v příkladu 1 a byl kondenzován oligonukleotid 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 1).

Plazmid pXL2727-l nese 14 repetic sekvence GAA. Oligonukleotid popsaný výše, který obsahuje pouze 7 repetic odpovídající hybridizační sekvence CTT, může tudíž hybridizovat s plazmidem v 8 odlišných polohách. Plazmid pXL2727-2, na rozdíl od toho má hybridizující sekvenci (GAA)₇ (SEKVENCE ID. Č. 36) stejné délky, jako je délka oligonukleotidu vázaného ke koloně. Tento oligonukleotid může tudíž hybridizovat pouze v jedné poloze na pXL2727-2.

Experiment je totožný s pokusem popsaným v příkladu 2, s následujícími pufry:

Pufr F: 2M NaCl, 0,2M acetát, pH 4,5.

Pufr E: IM Tris-HCl, pH 9, 0,5mM EDTA.

Výtěžek purifikace je 29 % s plazmidem pXL2727-l a 19 % s pXL2727-2.

Příklad 8.3

In vitro transfekce savčích buněk

Použité buňky byly NIH 3T3 buňky inokulované den před experimentem na 24—jamkové kultivační destičky v počtu 50 000 buněk/jamka. Plazmid je naředěn ve 150mM NaCl a smíchán s lipofektantem RPP115335. Byl použit poměr pozitivních nábojů lipofektantu/negativních nábojů DNA rovnající se 6. Směs byla vortexována, ponechána deset minut při teplotě místnosti, naředěna v médiu bez fetálního telecího séra, a pak přidána k buňkám v poměru 1 pg DNA na kultivační jamku. Po dvou hodinách ve 37 °C bylo přidáno 10% (objem/objem) fetální telecí sérum a buňky byly inkubovány po dobu 48 hodin ve 37 °C v přítomnosti 5% CO₂. Buňky byly dvakrát promyty s PBS a luciferázová aktivita byla měřena podle popsaného protokolu (Promega kit, Promega Corp. Madison, WI) na luminometru Lumat LB9501 (EG a G Berthold, Evry). Plazmid pXL2727-l, purifikovaný jak popsáno v příkladu 8.2, poskytl výtěžky transfekce dva- 14CZ 303086 B6 krát větší než byly výtěžky získané se stejným plazmidem purifíkovaným s použitím soupravy Wizard Megaprep (Promega Corp. Madison, WI).

Příklad 9

Purifikace plazmidů odvozených z pCOR

Následující příklad ukazuje purifikaci plazmidů odvozených z pCOR s použitím trojšroubovicové io afinitní chromatografie. Bylo ukázáno, že tato technologie odstraňuje látky kontaminující nukleové kyseliny (konkrétně hostitelskou genomovou DNA a RNA) na stupeň, který by nebyl dosažen obvyklými chromatografickými metodami.

Trojšroubovicový afinitní gel byl syntetizován s použitím Sephacryl 5-1000 SF (Amersham15 Pharmacia Biotech) jako chromatografického nosiče (matrice). Sephacryl 5-1000 byl nejdříve aktivován jodistanem sodným (3mM, teplota místnosti, 1 hodina) v 0,2M acetátu sodném (pH 4,7). Pak byl oligonukleotid kondenzován přes svou 5'-NH₂ koncovou skupinu k aldehydovým skupinám aktivovaného nosiče redukční aminaci v přítomnosti kyseliny askorbové (5 mM), jak bylo popsáno dříve pro kondenzaci proteinů (Homsey et al., J. Immunol. Methods, 1986, 93,

83 až 88). Homopyrimidinový oligonukleotid použitý pro tyto experimenty (od firmy Eurogentec, purifikovaný HPLC) měl sekvenci, která byla komplementární ke krátké sekvenci 14-meru homopurinu (5'-AAGAAAAAAAAGAA-3) (sekvence id. č. 29) přítomné v počátku replikace (oriy) plazmidu pCOR (Soubrier et al., Gene Therapy, 1999, 6, 1482 až 1488). Jak diskutováno výše, sekvence homopyrimidinového oligonukleotidu byla 5 '-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEK25 VENCE ID. Č. 30).

Následující plazmidy byly podrobeny chromatografii: pXL3296 (pCOR bez transgenu, 2,0 kbp), pXL3179 (pCOR-FGF, 2,4 kbp), pXL3579 (pCOR-VEGFB, 2,5 kbp), pXL3678 (pCOR-AFP, 3,7 kbp), pXL3227 (pCOR-lacZ, 5,4 kbp) a pXL3397 (pCOR-Β delece FVIII, 6,6 kbp). Všechny io tyt plazmidy byly purifikovány dvěma kroky iontoměničové (aniontové) chromatografie z čirých lyzátů získaných jak bylo popsáno v příkladu 4. Plazmid pBKS+ (pBluescript II KS + od firmy

Stratagene), plazmid odvozený z ColEl, purifikovaný ultracentrífugac í v CsCl byl také studován. Všechny použité plazmidy byly v topologickém stavu nadšroubovice („supercoil“) (> 95 %).

V každém experimentu purifikace plazmidové DNA bylo 300 pg plazmidové DNA v 6 ml 2M NaCl, 0,2M acetátu draselném (pH 5,0) naneseno při průtokové rychlosti 30 cm/h na afinitní kolonu obsahující výše uvedený oligonukleotid 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 30). Po promytí kolony 5 objemy stejného pufru byl vázaný plazmid eluován s 1M Tris/HCl, 0,5mM EDTA (pH 9,0) a kvantifikován UV (260 nm) a iontoměničovou chromatografii s kolonou Millipore Gen-Pak (Marquet et al., BioPharm, 1995, 8, 26 až 37). Výtěžky plazmidů ve sbíraných frakcích byly 207 pg pro pXL3296. 196 pg pro pXL3179, 192 pg pro pXL3579, 139 pg pro pXL3678, 97 pg pro pXL 3227 a 79 pg pro pXL 3397.

Nebyla detekována žádná vazba plazmidu (< 3 pg), když pBKS byl podroben chromatografii na této koloně. To ukazuje, že oligonukleotid 5-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 30) vytváří stabilní trojšroubovicové struktury s komplementární 14-memí sekvenci 5-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEKVENCE ID. Č. 29) přítomnou v pCOR (oriy), ale ne s blízce příbuznou sekvencí 5 -AGAAAAAAAGGA-3' (SEKVENCE ID. Č. 27) přítomnou v pBKS. To ukazuje, že zavedení jedné nesouhlasné triády (T*GC v tomto případě) má za následek kompletní destabi50 lizací trojšroubovicové struktury.

Co se týče kontrol, nebyla pozorována žádná vazba plazmidu (< 1 pg), když byl pXL3179 podroben chromatografii na prázdné koloně syntetizované ve zcela obdobných podmínkách, ale bez oligonukleotidu.

- 15CZ 303086 B6

Provozováním této metody s afínitní purifikační kolonou v podmínkách zde uvedených byl stupeň kontaminace hostitelskou genomovou DNA redukován z 2,6 na 0,07 % při přípravě pXL3296. Podobně byl stupeň kontaminace hostitelskou DNA redukován z 0,5 na 0,008 % při přípravě pXL3179, když byl vzorek podroben ehromatografií na stejné afínitní koloně. Kromě toho, stupeň kontaminace RNA byl značně redukován z 43 % RNA na 0,2 % RNA v případě pXL3179 s použitím této afínitní purifikační kolony.

Kromě toho, výtěžek plazmidu PXL3579 byl menší než 8 %, když byl olígonukleotid 5-TTCTTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 30) nahrazen oligonukleotidem 5'-TTTTTTTTCTT-3' (SEKVENCE ID. Č. 31) na afínitní koloně. Zatímco olígonukleotid, jak uveden v sekvenci id. č. 31, byl komplementární k části VEGFB sekvence v pXL3579 (tj. nukleotidy 379 až 389 relativně k ATG), nenastala významná trojšroubovicová afinita. To ukazuje, že tato afínitní purifikace vyžaduje nenáhodnou homopurin-homopyrimidinovou DNA sekvencí.

Příklad 10

Purifikace plazmidu odvozeného z ColEl

Následující příklad ukazuje purifikaci plazmidů odvozených z ColEl s použitím trojšroubovicové afínitní chromatografie. Bylo ukázáno, že tato technologie odstraňuje látky znečišťující nukleové kyseliny (konkrétně hostitelskou genomovou DNA a RNA) na stupeň, kterého není možné dosáhnout obvyklými chromatografickými metodami.

Trojšroubovícový afínitní gel byl syntetizován kondenzací oligonukleotidu majícího sekvenci (SEKVENCE ID. Č. 28): 5-TCTTTTTTTCCT-3' na jodistanem oxidovaný Sephacryl 5-1000 SF, jak bylo popsáno v příkladu 9.

Plazmidy pXL3296 (pCOR bez transgenu) a pBKS, plazmid odvozený z ColEl, byly podrobeny ehromatografií na 1 ml koloně obsahující olígonukleotid 5'-TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 28) za podmínek popsaných v příkladu 9. Výtěžky plazmidů v sebrané frakci byly 175 pg pro pBKS a <1 pg pro _PXL3296. To ukazuje, že olígonukleotid 5 -TCTTTTTTTCCT-3' (SEKVENCE ID. Č. 28) vytváří stabilní trojšroubovicové struktury s komplementární 12-merní sekvencí (5-AGAAAAAAAGGA-3) (SEKVENCE ID. Č. 27) přítomnou v pBKS, ale ne s velmi blízce příbuznou 12-memí sekvencí (5'-AGA A AAA A AAG A-3') (SEKVENCE ID. Č. 32) přítomnou v pCOR. To ukazuje, že zavedení jedné nesouhlasné triády (C*AT v tomto případě) může mít za následek kompletní destabilizaci trojšroubovicové struktury.

Příklad 11

Metoda dvojité purifikace

Následující příklad ukazuje purifikaci molekuly nadšroubovicové dvojřetězcové DNA, jako je například pXL3296, ve směsi obsahující další nadšroubovicovou dvoj řetězcovou molekulu, jako je například pBSK, s použitím trojšroubovicové afínitní chromatografie. Obě dvojřetězcové DNA molekuly mohou mít podobnou velikost, ale každá DNA molekula obsahuje unikátní sekvenci, která je schopna vytvoření trojšroubovice s odlišnou cílovou sekvencí. Jak bylo již diskutováno drive, molekuly jako například pXL3296 obsahují sekvenci 5-AAGAAAAAAAAGAA-3' (SEKVENCE ID Č. 29), ale neobsahují sekvenci 5 AGAAAAAAAGGA-3' (SEKVENCE ID. Č. 27). Na rozdíl od toho molekuly, jako je například pBSK, obsahují sekvenci id. č. 27, ale neobsahují sekvenci id. č. 29.

- 16CZ 303086 B6

V prvním kroku směs obsahující pXL3296 a pBSK byla nanesena na první afínitní kolonu obsahující oligonukleotid 5-TC TTTTTTTCCTT-3 (SEKVENCE ID. Č. 28), jako je například kolona popsaná v příkladu 10. Roztok byl filtrován přes první kolonu, která zadržela navázané DNA molekuly. Ve druhém kroku byly nevázané DNA molekuly z prvního kroku naplněny na druhou afínitní kolonu obsahující oligonukleotid (SEKVENCE ID. Č. 30): 5-TTCTTTTTTTTCTT-3', jako je například kolona popsaná v příkladu 9. Druhá kolona pak byla promyta a vázané molekuly byly eluovány, jak bylo popsáno v příkladu 9. Z druhé kolony byly eluovány pouze pXL3296 molekuly. V eluátu (tj. roztoku, který byl eluován z kolony) nebyly z druhé kolony detekovány žádné molekuly pBSK.

Seznam sekvencí <140>

<141>

<150> 09/580,923 <151> 2000-05-26 <160> 36 < 170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 25 <212> DNA *'213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 1 gaggcttctt cttcttcttc ttctt <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 2 cttcccgaag ggagaaagg <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid

- 17 CZ 303086 B6 <400> 3 gaagggcttc cctctttcc <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Umělá sekvence io <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 4 gaaaaaggaa gag <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 5 aagggaggga ggagaggaa <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 6 aaggagagga gggagggaa <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <22 0>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 7 ttggtgtggt gggtgggtt

- 18CZ 303086 B6 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 8 aaaaaaggga ataaggg 17 <210> 9 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 9 gatccgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagg 58 <210> 10 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 10 aattccttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcg 58 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 11 tgaccggcag caaaatg 17 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence

- 19CZ 303086 B6 <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <220>

<223> Všechny cytosiny (C) v sekvenci jsou methylované <400> 12 gaggcttctt cttcttcctc ttctt 25 <210> 13 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 13 gatccgagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagaggg 58 <210> 14 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 14 aattccctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcg 58 <210> 15 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 15 gatccggagg aggagyagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggagg 58 <210> 16 <211> 58 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

-20CZ 303086 B6 syntetický oligonukleotid <400> 16 aattcctcct cctcctcctc ctcctcctcc tcctcctcct cctcctcctc ctcctccg 58 <210> 17 <211> 50 <212> DNA <213> Umělá sekvence io <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 17 ggagaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga 50

20	<210> <211> <212> <213>	18 25 DNA Umělá sekvence
25	<220> <223>	Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid
	<400> 18 aatgcctcct cctcctcctc ctcct
30	<210> <211> <212> <213>	19 26 DNA Umělá sekvence
35	<220> <223>	Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid
40	<400> 19 agtgctctct ctctctctct ctctct
45	<210> <211> <212> <213>	20 66 DNA Umělá sekvence

<220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid

-21 CZ 303086 B6 <400> 20 gatctgaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaactgc 60 agatct 66 <210> 21 <211> 66 <212> DNA <213> Umělá sekvence io <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 21 gatcagatct gcagttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 60 tcttca <210> 22 <21l> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 22 acagtcataa gtgcggcgac g <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 23 gaagaagagg aagaagaaga agaagaagaa ggaagagaa 40 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid

-22CZ 303086 B6 <400> 24 ccgaattctg gggaccaaag cagtttc· 27 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 25 ccaagcttca ctgttcacga cgggtgt 27 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 26 cttcttctto ttcttcttct t 21 <210> 27 <211> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 27 agaaaaaaag ga 12 <210> 28 <21l> 12 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 28 tctttttttc ct 12

-23 CZ 303086 B6

<210>	29
<211>	14
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence
<220>
<223>	Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid
<400>	29
aagaaaaaaa agaa
<210>	30
<211>	14
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence
<220>
<223>	Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid
<400>	30
ttcttttttt tctt
<210>	31
<211>	11
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence
<220>
<223>	Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid
<400>	31
ttttttttcc t
<210>	32
<211>	12
<2Í2>	DNA
<213>	Umělá sekvence
<220>
<223>	Popis umělé sekvence: syntetický oligonukleotid
<400>	32
agaaaaaaaa ga
<210>	33
<211>	51
<212>	DNA
<213>	Umělá sekvence

-24CZ 303086 B6 <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 33 gaagaagaag aagaagaaga agaagaagaa gaagaagaag aagaagaaga a 51 <210> 34 <211> 48 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 34 ggaggaggag gaggaggagg aggaggagga ggaggaggag gaggagga 48 <210> 35 <211> 50 <2I2> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 35 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga 50 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence:

syntetický oligonukleotid <400> 36 gaagaagaag aagaagaaga a 21

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob purifikace dvojřetězcové DNA z roztoku obsahujícího dvoj řetězcovou DNA smíchanou s dalšími složkami, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy roztok prochází přes nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici s dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí přítomnou v dvojřetězcové DNA, přičemž

-25 CZ 303086 B6 kovalentně navázaný oligonukíeotid obsahuje sekvenci TCTTTTTTTCCT (SEKVENCE ID. Č. 28) nebo TTCTTTTTTn CTT (SEKVENCE ID. Č. 30).
2. Způsob purifikace dvoj řetězcové DNA z roztoku obsahujícího dvoj řetězcovou DNA smíchanou s dalšími složkami, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy roztok prochází přes nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí přítomnou v dvoj řetězcové DNA, přičemž specifická sekvence přítomná v dvoj řetězcové DNA obsahuje sekvenci AGAAAAAAAGGA (SEKVENCE ID. Č. 27) nebo AAGAAAAAAAAGAA (SEKVENCE ID. Č. 29).
3. Způsob purifikace první dvojřetězcové DNA z roztoku obsahujícího první dvoj řetězcovou DNA a druhou dvouřetězcovou DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy (I) roztok prochází přes první nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s druhou dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí v této druhé DNA, (II) získá se roztok, který prošel přes první nosič, a (III) získaný roztok prochází přes druhý nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s první dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí v této první DNA, přičemž specifická sekvence přítomná v první dvojřetězcové DNA obsahuje sekvenci AAGAAAAAAAAGAA (SEKVENCE ID. Č. 29) a specifická sekvence přítomná druhé dvojřetězcové DNA obsahuje sekvenci AGAAAAAAAGGA (SEKVENCE ID. Č. 27).
4. Způsob purifikace první dvojřetězcové DNA z roztoku obsahujícího první dvojřetězcovou DNA a druhou dvojřetězcovou DNA, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy (I) roztok prochází přes první nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s druhou dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí v této druhé DNA, (II) získá se roztok, který prošel přes první nosič, a (lil) získaný roztok prochází přes druhý nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s první dvojřetězcovou DNA hybridizaci se specifickou sekvencí v této první DNA, přičemž oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s první dvojřetězcovou DNA obsahuje sekvenci TTCTTTTTTTTCTT (SEKVENCE ID. Č, 30) a oligonukíeotid schopný vytvořit trojšroubovici s druhou dvojřetězcovou DNA obsahuje sekvenci TCTTTTTTTCCT (SEKVENCE ID. Č. 28).
5. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že roztok je buněčný lyzát.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že buněčný lyzát je čirý lyzát.
7. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že dvoj řetězcová DNA je prepurifikovaná.
8. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že specifická sekvence byla uměle vložena do dvojřetězcové DNA.
9. Způsob podle nároků 1,2,3 nebo 4, vyznačující se tím, že specifická sekvence je přirozeně přítomna v dvojřetězcové DNA.
10. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že oligonukíeotid je navázán na nosič prostřednictvím disulfidické, thioetherové, esterové, amidové nebo aminové vazby.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že oligonukíeotid je navázán na kolonu prostřednictvím raménka obsahujícího uhlíkový řetězec (CH₂)_n, kde n je celé číslo 1 až 18 včetně, přičemž raménko je navázáno k oligonukleotidů prostřednictvím fosfátu a na kolonu prostřednictvím amidové vazby.

-26CZ 303086 B6
12. Způsob podle nároků 1, 2. 3 nebo 4, vyznačující se tím, že oligonukleotid obsahuje alespoň jednu chemickou modifikaci, která mu poskytuje rezistenci k nukleázám nebo ho chrání proti nukleázám nebo zvyšuje jeho afinitu ke specifické sekvenci.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že alespoň jeden z cytosinů v oligonukleotidu je methylovaný.
14. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že dvojřetězcová DNA je kruhová DNA.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že kruhová DNA je plazmid.
16. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že specifická sekvence přítomná v dvoj řetězcové DNA obsahuje několik pozic pro hybridizaci s oligonukleotidem.
17. Způsob podle nároků 1, 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že nosič je funkcionalizovaný chromatografický nosič, funkcionalizovaný plastový povrch nebo jsou to funkcionalizované latexové perličky.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že nosič je funkcionalizovaný chromatografický nosič.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že purifikovaná dvojřetězcová DNA má obsah chromozomové DNA menší nebo rovný 0,5 %.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že purifikovaná dvojřetězcová DNA má obsah chromozomové DNA menší nebo rovný 0,01 %.
21. Způsob purifikace dvojřetězcové RNA z roztoku obsahujícího dvoj řetězcovou RNA smíchanou s dalšími složkami, vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy roztok prochází přes nosič obsahující kovalentně navázaný oligonukleotid schopný vytvořit trojšroubovici s dvojřetězcovou RNA hybridizaci se specifickou sekvencí přítomnou v dvojřetězcové RNA, přičemž oligonukleotid obsahuje sekvenci TCTTTTTTTCCT (SEKVENCE ID. Č. 28) nebo sekvenci TTCTTTTTTTTCTT (SEKVENCE ID. Č. 30).
22. Způsob podle nároku 1 nebo 3, vyznačující se tím, že kovalentně navázaný oligonukleotid obsahuje sekvenci TCTTTTTTTCCT (SEKVENCE ID. Č. 28).
23. Způsob podle nároku 1 nebo 3, vyznačující se tím, že kovalentně navázaný oligonukleotid obsahuje sekvenci TCTTTTTTTTCTT (SEKVENCE ID. Č. 30).
24. Způsob podle nároku 2 nebo 4, vyznačující se tím, že specifická sekvence přítomná v dvojřetězcové DNA obsahuje sekvenci AGAAAAAAAGGA (SEKVENCE ID. Č. 27).
25. Způsob podle nároku 2 nebo 4, vyznačující se tím, že specifická sekvence přítomná v dvojřetězcové DNA obsahuje sekvenci AAGAAAAAAAAGAA (SEKVENCE ID. Č.