CZ304357B6

CZ304357B6 - Pevný prostředek pro zástavu krvácení, utěsňování tkáně a lepení tkáně a jeho použití pro chirurgické zákroky

Info

Publication number: CZ304357B6
Application number: CZ2003-2197A
Authority: CZ
Inventors: Dagmar Stimmeder
Original assignee: Takeda Nycomed As
Priority date: 2001-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2014-03-26
Also published as: BG108123A; ME00587A; EA200300821A1; EP1368419A2; DE60207389D1; CN1487843A; HRP20030648B1; HK1058371A1; NO332462B1; NZ527165A; TWI237573B; SK288120B6; DE60203364D1; BG66439B1; SK10352003A3; EE05685B1; KR20030086254A; CZ20032198A3; EA006540B1; HUP0400768A3

Abstract

Pevný prostředek pro zástavu krvácení, utěsňování tkáně a lepení tkáně obsahující kolagenový nosič, fibrinogen a trombin, který se skládá z a) kolagenového nosiče, který má alespoň dvě z fyzikálních vlastností, jimiž jsou modul pružnosti v rozmezí 100 až 500 kPa, hustota 1 až 10 mg/cm.sup.3.n. a průměr dutiny větší než 0,75 mm a menší než 4 mm a/nebo střední průměr dutiny pod 3 mm; přičemž na uvedeném nosiči je rovnoměrně distribuována a zakotvena směs; b) pevného lidského fibrinogenu; a c) pevného lidského trombinu. Tento prostředek pro použití pro chirurgické zákroky v gastrointestinálním traktu, na parenchymových orgánech, v kardiovaskulární chirurgii, chirurgii hrudníku, při chirurgických zásazích v oblasti ucha, nosu a krku, včetně zubní chirurgie, v gynekologické, urologické, cévní, kostní chirurgii a neodkladné chirurgii, neurologické chirurgii, lymfatických, žlučových a cerebrospinálních píštělích, a únicích vzduchu během chirurgie hrudníku a plic.

Description

(57) Anotace:

Pevný prostředek pro zástavu krvácení, utěsňování tkáně a lepení tkáně obsahující kolagenový nosič, fibrinogen a trombin, který se skládá z a) kolagenového nosiče, který má alespoň dvě z fyzikálních vlastností, jimiž jsou modul pružnosti v rozmezí 100 až 500 kPa, hustota 1 až 10 mg/cm³ a průměr dutiny větší než 0,75 mm a menší než 4 mm a/nebo střední průměr dutiny pod 3 mm; přičemž na uvedeném nosiči je rovnoměrně distribuována a zakotvena směs; b) pevného lidského fibrinogenu; a c) pevného lidského trombinu. Tento prostředek pro použití pro chirurgické zákroky v gastrointestinálním traktu, na parenchytnových orgánech, v kardiovaskulární chirurgii, chirurgii hrudníku, při chirurgických zásazích v oblasti ucha, nosu a krku, včetně zubní chirurgie, v gynekologické, urologické, cévní, kostní chirurgii a neodkladné chirurgii, neurologické chirurgii, lymfatických, žlučových a cerebrospinálních píštělích, a únicích vzduchu během chirurgie hrudníku a plic.

Pevný prostředek pro zástavu krvácení, utěsňování tkáně a lepení tkáně a jeho použití pro chirurgické zákroky

Oblast techniky

Předložený vynález se týká pevného absorbovatelného prostředku pro okamžité použití ke slepení tkáně, utěsnění tkáně a k zástavě krvácení, který ve své podstatě zahrnuje nosič pokrytý pevně zakotvenými lidskými složkami fibrinového lepidla, jimiž je lidský fibrinogen a lidský trombin. Tuto zakotvenou kombinaci lze například přímo použít na povrch poranění nebo v oblasti chirurgického zákroku. Při styku s krví, tělesnými tekutinami nebo fyziologickým roztokem tento systém napodobuje konečnou fázi koagulační kaskády, ve které trombin katalyzuje konverzi fibrinogenu na fibrin a aktivaci faktoru XIII za zisku faktoru Xllla. Jakmile vznikne faktor XHIa, tak pomocí kovalentního sesíťování stabilizuje fibrinovou sraženinu.

Povrch poranění a nosič se navzájem slepí prostřednictvím polymerace, jako u dvousložkového lepidla. Během tohoto procesu, který trvá asi 3 až 5 minut, se prostředek podle tohoto vynálezu na plochu poranění s výhodou přitlačuje. Složky prostředku tohoto vynálezu se enzymaticky odbourají během 4 až 6 měsíců po jeho aplikaci.

Dosavadní stav techniky

Existují komerční fibrinová lepidla, která napodobují poslední krok koagulační kaskády a která zahrnují vysoce koncentrovaný fibrinogenový roztok určený ke smíchání s trombinovým roztokem, a to ještě před aplikací na operační poranění. Tyto směsi obsahují inhibitor fibrinolýzy, například aprotinin nebo ε-aminokapronovou kyselinu, aby se předešlo předčasnému rozpuštění fibrinové sraženiny fibrinolytickým enzymem plazminem. Tato dvojsložková fibrinová lepidla jsou cenná při různých operačních postupech, ale je-li krvácení silné, mohou být předtím, než dojde k zástavě krvácení, odplavena. Dvojsložková fibrinová lepidla navíc vyžadují udělat některé přípravné kroky, které zahrnují rozehřátí nebo rozpuštění. Proto jsou pro práci poněkud nepraktická a těžkopádná a nepohodlná a pro úspěšné použití těchto fibrinových lepidel je nutná zkušenost.

Během poslední dekády se použití mnohých fibrinových lepidel stalo v chirurgii při mnoha indikacích metodami volby. Ve většině pokusů s fibrinovými lepidly se však navíc použila kolagenová pletenina, aby se zlepšily hemostatické a adhezivní vlastnosti, což indikuje jejich nevýhody a jejich omezené použití chirurgy.

Kolagen se jako hemostatické činidlo používá již od konce šedesátých let minulého století. Kolagen je u všech savců nejběžnějším strukturním proteinem. Monomemí protein s asi 300 kDa (tropokolagen) se v určitých místech kovalentně sesíťuje. Hotový protein je proto nerozpustný a vytváří charakteristická vlákénka s vysokou pevností v tahu. Byly popsány mnohé podtřídy kolagenu, přičemž nejběžnějším je kolagen typu 1, hlavní kolagenový typ v kůži, šlachách, kostech a rohovce. Kolagen je vláknitý protein zahrnující trojšroubovici o délce asi 290 nm. Pět těchto trojšroubovic (tropokolagenových molekul) je uspořádáno do mikrovlákénka s průměrem asi 3,6 nm. Tato mikrovlákénka mají polární a nepolární segmenty, které jsou snadno dostupné pro specifické interfibrilámí a intrafibrilámí interakce. Mikrovlákénka jsou sbalena do tetragonální mřížky a tvoří subfibrily o průměru asi 30 nm. Tyto subfibrily se poté uspořádají do kolagenového vlákénka, čili základní jednotky pojivové tkáně, která má průměr několika stovek nanometrů a která je proto viditelná ve světle mikroskopu jako tenká čárka.

Kolagen lze použít jako materiál pro utěsnění poranění, eventuálně s potahem obsahujícím fibrinové lepidlo. Fibrinová lepidla, to jest kombinace fibrinogenu, trombinu a aprotininu, se úspěšně terapeuticky používají po mnoho let k lepení tkání a nervů a pro utěsnění povrchů, které slabě

- 1 CZ 304357 B6 krvácejí. Jednou z nevýhod fibrinového lepidla je, že v případě většího krvácení se lepidlo obvykle odplaví již před tím, než dojde k dostatečné polymerizaci fibrinu. K překonání tohoto problému začali chirurgové manuálně aplikovat kapalná fibrinová lepidla na absorbující nosiče, jako je kolagenová pletenina.

Navzdory značnému úspěchu těchto kombinovaných aplikací nebyl tento způsob kvůli některým nevýhodám použit v širokém měřítku. Příprava je totiž relativně těžkopádná, způsob provedení vyžaduje zkušenost a zručný personál a přípravek není ve stavech nouze pohotově k dispozici a doba pro připravuje v rozmezí 10 až 15 minut. Tyto faktory stimulovaly vývoj zlepšeného výrobku, což vedlo k vývoji pevného kombinovaného prostředku kolagenového nosiče pokrytého potahem pevného fíbrinogenu, pevného trombinu a pevného aprotininu, jak je popsáno v patentu EP 0 059 265.

Funkce kolagenového nosiče popsaná v EP 0 059 265 tkví především v roli nosiče, který adsorbuje a který dodává mechanickou stabilitu koagulačnímu přípravku, jímž je potažen.

Tak byl vyvinut výrobek, který kombinuje hemostatické vlastnosti fibrinového lepidla s přínosem kolagenu coby nosiče a tento výrobek se vyrábí pod obchodním názvem TachoComb®. TachoComb® je k použití připravená a snadno aplikovatelná pevná kombinace kolagenové náplasti pokryté následujícími aktivními složkami fibrinového lepidla - lidským fibrinogenem, hovězím trombinem a hovězím aprotininem.

TachoComb® je prodáván od počátku 90. let 20. století firmou Nycomed Pharma a byl použit v klinických pokusech v Evropě u více než 2500 pacientů. Výrobek byl navíc použit u více než 700 pacientů v japonském klinickém programu při mnoha různých indikacích, jako resekcích jater a plic, operacích žlučovodu, operacích sleziny, ledvin a slinivky břišní, ORL operacích, gynekologických operacích a cévních operacích. O produktu TachoComb® bylo zjištěno, že je účinný a bezpečný.

V průběhu provedených klinických pokusů nebyly ohlášeny žádné klinické komplikace spojené s aplikací výrobku TachoComb®. Ve třech japonských studiích se však objevily protilátky proti aprotininu.

Během všech let klinického používání tisíců náplastí TachoComb® bylo nahlášeno celkem pouze 37 spontánních nepříznivých účinků léků (ADR). Šestnáct z těchto ADR by mohlo být teoreticky spojeno s reakcemi na složky náplasti TachoComb® (horečka, pyrexie, eozinotilie, prodloužená protrombinová doba, hypersenzitivita, imunologické nebo alergické reakce). Jeden případ ADR (imunologické odezvy) byl zřejmě spojen s působením výrobku TachoComb®.

Ve WO 97/37 694 (Immuno France S.A.) je ve srovnávacím příkladu 4 popsáno, že když byl použit kolagenový výrobek nebo výrobek TachoComb®, tak za použití výrobku TachoComb®, nedošlo k zástavě smrtelného krvácení, a to v protikladu k zástavě krvácení během 5 minut, v případě použití kolagenového výrobku podle WO 97/37 694, který neobsahoval trombin.

Ve WO 96/40 033 jsou zdůrazněny nevýhody hovězího trombinu použitého ve výrobku TachoComb®, které spočívají v tom, že hovězí nebo jiný druh trombinu může způsobit škodlivou virovou kontaminaci a možný je i přenos nemocí skotu, jako je spongiformní encefalopatie skotu.

-2CZ 304357 B6

Podstata vynálezu

Prvním aspektem předmětu vynálezu v hlavním provedení i) je pevný prostředek pro zástavu krvácení, utěsňování tkáně a lepení tkáně obsahující kolagenový nosič, fibrinogen a trombin, který se skládá z

a) kolagenového nosiče, který má alespoň dvě z fyzikálních vlastností, jimiž jsou modul pružnosti v rozmezí 100 až 500 kPa, hustota 1 až 10 mg/cm³ a průměr dutiny větší než 0,75 mm a menší než 4 mm a/nebo střední průměr dutiny pod 3 mm;

přičemž na uvedeném nosiči je rovnoměrně distribuována a zakotvena směs

b) pevného lidského fibrinogenu; a

c) pevného lidského trombinu.

Přednostní provedení tohoto aspektu vynálezu zahrnují zejména ii) pevný prostředek podle provedení i), v němž je kolagenovým nosičem kolagenová houba obsahující kolagenový materiál typu I ze savčího, transgenního nebo rekombinantního zdroje;

iii) pevný prostředek podle provedení i) nebo ii), v němž kolagenový nosič má jednu nebo více aktivních stran, kde je přítomen fibrinogen v množství 2 až 10 mg/cm², jako 4,3 až 6,7 mg/cm², přednostně 5,5 mg/cm² a trombin je přítomen v množství 1,5 až 5,5 IU/cm², přednostně 2,0 IU/cm²;

iv) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až iii), který obsahuje fibrinogen, přečištěný z přírodního zdroje;

v) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až iii), který obsahuje transgenní nebo rekombinantní fibrinogen;

vi) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až v),, který obsahuje trombin, přečištěný z přírodního zdroje;

vii) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až v), který obsahuje transgenní nebo rekombinantní trombin;

viii) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až vii), který obsahuje pružný kolagenový nosič, který má alespoň dvě z fyzikálních vlastností, jimiž jsou modul pružnosti v rozmezí 100 až 500 kPa, hustota 1 až 10 mg/cm³ a průměr dutiny větší než 0,75 mm a menší než 4 mm a/nebo střední průměr dutiny pod 3 mm;

a dále obsahuje směs pevného lidského fibrinogenu a pevného lidského trombinu a je prostý antifibrinolytických činidel, jako je aprotinin, ε-arninokapronová kyselina nebo cc2antiplasmin;

pevný lidský fibrinogen a pevný lidský trombin jsou oba zakotveny na nosiči takovým způsobem, že po dvouminutovém třepání vzorku potaženého prostředku na třepačce Vibrofix s frekvencí otáček 1000 min '.je abraze menší než 1,0 mg/cm²;

-3 CZ 304357 B6 a po vložení vzorku potaženého prostředku do endoskopického zařízení a následného vyjmutí z tohoto zařízení, zůstane prostředek nezměněn a vykazuje ztrátu povlaku menší než 20 %, jakožto indikaci pružnosti nosiče a pevné adheze pevného lidského fibrinogenu a pevného lidského trombinu;

přičemž tento materiál je vzduchotěsný a kapalinotěsný a má faktor ohebnosti alespoň 1,25 stanovený testem zahrnujícím fixaci potaženého nosiče na latexovou fólii, třikrát roztažení latexu tlakem a změření plochy potaženého nosiče při třetím roztažení při nejvyšší hodnotě roztažení latexové fólie a porovnání roztažené plochy potaženého nosiče s výchozí plochou potažené oblasti;

Druhým aspektem předmětu vynálezu je pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až viii) pro použití pro utěsňování tkáně (provedení vynálezu ix));

Přednostní provedení tohoto aspektu vynálezu zahrnují zejména

x) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až viii) pro použití pro zástavu krvácení;

xi) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až viii) pro použití pro lepení tkáně;

xii) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení ix) až xi) pro použití pro chirurgické zákroky v gastrointestinálním traktu jako na jícnu, žaludku, tenkém střevě, tlustém střevě, konečníku, na parenchymových orgánech jako jsou játra, slezina, slinivka břišní, ledviny, plíce, nadledvinky, štítná žláza a lymfatické uzliny, v kardiovaskulární chirurgii, chirurgii hrudníku zahrnující chirurgii průdušnice, průdušek a plic, při chirurgických zásazích v oblasti ucha, nosu a krku, tedy ORL, včetně zubní chirurgie, v gynekologické, urologické, cévní, kostní chirurgii, například resekci spongiózy a neodkladné chirurgii, neurologické chirurgii, lymfatických, žlučových a cerebrospinálních píštělích, tedy CSF a únicích vzduchu během chirurgie hrudníku a plic;

xiii) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení ix) až xii), kde nosičem je kolagenová houba sestávající z vláken kolagenu typu I;

xiv) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení ix) až xiii), kde nosič má jednu nebo více aktivních stran, kde je přítomen fibrinogen v množství 2 až 10 mg/cm², jako 4,3 až 6,7 mg/cm², přednostně 5,5 mg/cm² a trombin je přítomen v množství 1,5 až 2,5 IU/cm², přednostně 2,0 IU/cm²;

xv) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení ix) až xiv), kde fibrinogen je přečištěn z přírodního zdroje;

xvi) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení ix) až xiv), kde fibrinogen je transgenní nebo rekombinantní;

xvii) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení ix) až xiv), kde trombin je přečištěn z přírodního zdroje;

xviii) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení ix) až xvi), kde trombin je transgenní nebo rekombinantní;

xix) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až xvii), který je prostý antifibrolytického činidla; a xx) pevný prostředek podle kteréhokoliv z provedení i) až xix), který je prostý aprotininu.

-4CZ 304357 B6

V dalším popisu je vynález příležitostně objasňován v širším kontextu, než odpovídá rozsahu, který je skutečně předmětem tohoto vynálezu. Výslovně se proto uvádí, že do rozsahu vynálezu spadají jen aspekty explicitně uvedené výše, a jen ty jsou také předmětem připojených patentových nároků. Následující popis má jen ilustrativní význam.

Předložený vynález se týká pevného prostředku zahrnujícího ve své podstatě nosič, který má alespoň jednu z následujících fyzikálních vlastností:

modul pružnosti v rozmezí 5 až 100 N/cm, jako 10 až 50 N/cm, hustotu 1 až 10 mg/cm³, jako 2 až 7 mg/cm³, průměr dutiny větší než 0,75 mm a menší než 4 mm a/nebo střední průměr dutiny pod 3 mm a na uvedeném nosiči rovnoměrně distribuovaný a zakotvený

b) pevný fibrinogen a

c) pevný trombin.

Prostředek může mít dvě, tři nebo všechny výše uvedené fyzikální vlastnosti. V současně zvýhodněných provedeních se materiál nosiče vyrobí podle popisu v patentu DK 2001 00 135 a dále v přihlášce s názvem Způsob přípravy kolagenové houby, zařízení pro oddělení části kolagenové pěny a podlouhlá kolagenová houba, podané firmou Nycomed Pharma AS dne 25. ledna 2002, jež si na uvedenou aplikaci nárokuje prioritu. V tomto kontextu by termínu průměr dutiny mělo být porozuměno jako nejdelší přímé vzdálenosti od stěny ke stěně dutiny, to jest nejdelší diagonální přímé vzdálenosti v dutině. Dutiny mohou mít polygonální tvar, jako je oktogonální tvar. Když se nosič rozkrojí, dutiny se rozdělí a vzniknou kaverny . Pevný fibrinogen a pevný trombin jsou zakotvené na nosiči a jejich větší část je v kavernách, čímž se dosáhne v podstatě rovnoměrné distribuce pevného trombinu a pevného fibrinogenu. Díky tomu a díky zakotvení je možno na nosič nanést značná množství fibrinogenu a trombinu, a to v protikladu k situaci, kdy se kapalné prostředky trombinu a fibrinogenu na materiál například nakapou nebo rozpráší.

Příprava pokrytého nosiče

Příprava pokrytého nosiče zahrnuje v podstatě přípravu suspenze aktivních složek, rovnoměrnou distribuci suspenze na nosič, vysušení pokrytého nosiče na pevný prostředek s aktivními složkami ukotvenými na nosiči.

Příprava suspenze s fibrinogenem a trombinem obsahuje přípravu fibrinogenové směsi fibrinogenu a alkoholu jako je ethanol, přípravu trombinové směsi trombinu a alkoholu jako je etanol, smíchání fibrinogenové směsi a trombinové směsi tak, aby se získala uvedená suspenze.

V kroku přípravy směsí lze směs homogenizovat nebo prosévat a získat suspenzi obsahující částice fibrinogenu a trombinu se středním průměrem částic podle Folka a Warda 25 až 100 pm. Teplota je 0 až 12 °C.

Nosičem může být kolagenový nosič, jako je kolagenová houba. Kolagenová houba má splňovat alespoň jedno a s výhodou řadu následujících kriterií, jako je hodnota pH 5,0 až 6,0, obsah mléčné kyseliny maximálně 5 %, obsah amoniaku maximálně 0,5 %, obsah rozpustného protein vypočteného jako obsah albuminu maximálně 0,5 %, obsah síranového popelu maximálně 1,0 %, obsah těžkých kovů maximálně 20 ppm, mikrobiologická čistota s maximálně 10³ CFU/g, obsah kolagenu 75 až 100 %, hustota 1 až 10 mg/cm³, modul pružnosti v rozmezí 5 až 100 N/cm.

-5 CZ 304357 B6

V předloženém zvýhodněném provedení vynálezu se kolagenový nosič vyrobí způsobem popsaným v patentu DK 2001 00 135. V níže uvedené tabulce jsou uvedeny fyzikální vlastnosti tří příkladů kolagenových nosičů.

Příklad	I	II	III
Hodnota pH	5,3	5,1	5,4
Obsah mléčné kyseliny (%)	2,3	2,8	2
Obsah amoniaku (%)	0,1	0,2	0,1
Obsah rozpustného proteinu (%)	0,04	0,05	0,08
Obsah síranového popelu (%)	0,3	0,3	0,3
Mikrobiologická čistota (CFU/g)	<12 až 345	< 18 až 124	< 11 až 33
Obsah kolagenu vztažený ke hmotnosti sušiny (%)	95	95	98
Obsah vody (%)	14	15	16
Modul pružnosti (N/cm)	10,4 až 42,1	15 až 50	12,3 až 41,0
Velikost póru (průměr, střední hodnota) (mm)	2,9	2,1	2,9
Hustota (mg/cm³)	2,9 až 5,3	2,9 až 5,9	2,4 až 5,0

Rovnoměrná distribuce suspenzí se provede buď pomocí zařízení na ponořování, jak je popsáno v US patentech 5 942 278 a 6 177 126 nebo lze suspenzi na nosič nanést pomocí aplikátoru majícího alespoň jednu trysku. Postřikovači aplikátor žene suspenzi tryskou, přičemž nosič a tryska se vůči sobě navzájem relativně pohybují. Aplikátor může obsahovat nebo může být umístěn v blízkosti dopravního pásu, míchací jednotky připojené k pumpě nebo systému pump nebo jiného zásobního zařízení a trysky nebo systému trysek, jež se pohybuje napříč, například v pravých úhlech k dopravnímu pásu. V závislosti na konkrétních charakteristikách prostředí může mít tryska nebo systém trysek různé tvary a velikosti. Trysku nebo systém trysek lze připojit k zásobnímu zařízení pomocí trubic. Zásobní zařízení může přivádět nanášené médium z míchací jednotky k systému trysek. Během procesu nanášení se systém trysek může pohybovat napříč nosičem. Ve své pohotovostní poloze může být držen na jedné straně dopravního pásu. Nanášecí proces může být iniciován světelným čidlem indikujícím přítomnost nosiče na dopravním pásu a podobně může být zastaven i signálem tohoto čidla. Takovýto aplikátor má relativně malý mrtvý objem a snadno se s ním pracuje, snadno se čistí. Navíc má i možnost v kterémkoliv okamžiku přerušit nanášecí proces, je použitelný v relativně širokém rozmezí viskozit a jeho výsledkem je homogenní pokrytí.

Oba systémy nanášejí objem 0,08 až 0,12 ml suspenze na cm² nosiče.

Důležitým krokem je sušení suspenze fibrinogenu, trombinu a alkoholu, aplikované jako mokrý potah na nanášecí povrch nosiče. Příklad tohoto způsobu obsahuje krok vystavení pokrytého nosiče tlaku pod 100 kPa (1000 mbar) tak, aby se získal suchý potažený povrch nosiče a na pokrytém povrchu se zakotvil vysušený potah. Použitím sníženého tlaku a pomocí sníženého tlaku v procesu sušení, udržováním nízké teploty (2 až 10 °C) a relativně vysoké vlhkosti (80 až 95 %)

-6CZ 304357 B6 tak lze získat strukturu a žádané fyzikální vlastnosti nosiče, konkrétně nosiče ve formě kolagenu, jako je kolagenová houba, stejně jako fibrinogenu a trombinu.

Termín „zahrnující ve své podstatě“ znamená, že tyto tři složky jsou všechny podstatné a nutné pro tento vynález. V prostředku však mohou být také přítomna nepodstatná aditiva, jako jsou vápenaté ionty a barvící značkovače jako je riboflavin. Prostředek může dále obsahovat další vhodné složky jako je jedna nebo více farmaceutických aktivních látek, které lze například vybrat ze skupiny sestávající z antibiotických činidel, jako jsou antibakteriální nebo antimykotická aantineoplastická činidla.

Ačkoliv nosičovým materiálem je s výhodou kolagenová houba, která obsahuje materiál kolagenového typu I ze savčích, transgenních nebo rekombinantních zdrojů, může být tento materiál vyroben i z jiných typů kolagenu, to jest kolagenu typu I, II, III, IV, VII a X. Nosičem může být také biodegradabilní polymer jako je polyhyaluronová kyselina, polyhydroxykyselina, například mléčná kyselina, glukonová kyselina, hydroxybutanová kyselina, celulóza nebo želatina.

Ve zvýhodněném provedení tohoto vynálezu prostředek obsahuje nosič, který má jednu nebo více aktivních stran, kde je přítomen fibrinogen v množství 2 až 10 mg/cm², jako 4,3 až 6,7 mg/cm², s výhodou 5,5 mg/cm² a kde je přítomen trombin v množství 1,0 až 5,5 IU/cm², s výhodou 2,0 IU/cm². Fibrinogen a/nebo trombin je s výhodou lidský, například přečištěný z přírodního zdroje, a to pomocí způsobů známých odborníkům v oboru nebo transgenní nebo rekombinantní lidský fibrinogen a/nebo trombin vyráběný způsoby známými odborníkům v oboru.

Výrobky podle předchozích děl v oboru, jako je TachoComb®, Beriplast® a TissueSeal®, všechny obsahují aprotinin nebo podobná antifibrinolytická činidla. Aprotinin lze získat pouze z hovězího zdroje. Předmětem výzkumu předkladatelů tohoto vynálezu je vyvinout prostředek s vylepšeným nosičovým materiálem a který má pouze složky lidského, rekombinantního nebo transgenního původu. Proto byl rozvíjen výzkum se vztahem k nosičovému materiálu, a proto bylo zkoumáno, zda by bylo možné nahradit hovězí trombin lidským trombinem a vyhnout se užití aprotininu. Předkladatelné tohoto vynálezu pracovali na tomto cíli dvoustupňovým procesem.

Nejprve byl jako následný produkt po výrobku TachoComb® vyvinut TachoComb H, kde byl například hovězí trombin nahrazen lidským trombinem. S výrobkem TachoComb H byly provedeny klinické testy, a to terapeutické konfirmační (fáze lila) klinické testy pro indikace zástavy krvácení, slepení tkáně a utěsnění tkáně. Dosud nepublikované výsledky získané v těchto studiích potvrdily účinnost a bezpečnost výrobku TachoComb H při kontrole prýštění krve a úniku vzduchu, čímž tento výrobek účinkoval jako pomocná terapie při zástavě krvácení, slepení tkáně a utěsnění tkáně během operace. Konkrétně bylo při cévní a jatemí chirurgii přesvědčivě prokázáno, že TachoComb H je účinný při lokální zástavě krvácení, což se projevilo jako významné snížení doby do zástavy krvácení ve srovnání s kontrolními pokusy.

Také bylo zjištěno, že TachoComb H může být schopen zmenšit rozsah plicních defektů, což vede k rychlejšímu vyřešení úniku vzduchu a může být vhodný při utěsňování velkých plicních trhlin a u rozedmy plic.

TachoComb® a TachoComb H však oba jako integrální součást výrobku obsahují aprotinin. Aprotinin byl považován za nutný k inhibici možné přeměny malých množství plazminogenu na plazmin ve fibrinogenové složce a k prevenci předčasného rozkladu fibrinové sraženiny, zvláště za hyperfibrinolytických podmínek.

Aby otestovali hypotézu, že aprotinin je nezbytný, provedli předkladatelé tohoto vynálezu nové pokusy. Pokusy in vitro prokázaly antifibrinolytickou ochranu aprotininu ve sraženině a že TachoComb® bez aprotininu (TachoComb S) se nerozpustil během velmi krátké doby. Proto byly navrženy zátěžové modely pokusů na zvířatech a TachoComb S byl porovnán s výrobkem

-7 CZ 304357 B6

TachoComb H, aby se prokázala podobná účinnost. Ve všech modelech byly jak TachoComb H, tak TachoComb S použity jako jediný prostředek pro zástavu krvácení.

Aby se vyzkoumala účinnost a histopatologický charakter tohoto zvýhodněného provedení předloženého vynálezu prostředku TachoComb S ve srovnání s prostředkem TachoComb H, byly provedeny čtyři obsáhlé experimentální série. TachoComb S nebo TachoComb H se aplikovaly na orgány jater, sleziny, slinivky břišní nebo mozku/mozkových plen psů, prasat nebo králíků. Pokusy byly navrženy takovým způsobem, aby se podobaly normálním operačním podmínkám, silně zatěžkávajícím podmínkám a hyperfibrinolytickým podmínkám.

V těchto čtyřech studiích získané výsledky neprokázaly jakýkoliv relevantní rozdíl mezi výrobky TachoComb S a TachoComb H. Oba výrobky se s ohledem na účinnost při zástavě krvácení a uzavírání poranění chovaly podobně, v to zahrnujíc velmi zatěžkávající stavy, jako bylo při zvýšeném vnitřním tlaku v orgánech nebo při hyperfibrinolýze indukované lokální aplikací r-tPA.

Z toho lze odvodit, že preklinický program navržený pro vyhodnocení paušální nutnosti přítomnosti aprotininu, jakožto složky výrobku TachoComb H, prokázal podobnou účinnost výrobků TachoComb H a TachoComb S. Oba výrobky byly úspěšně použity jako jediný prostředek k zastavení krvácení, slepení tkáně a utěsnění tkáně při všech experimentálních podmínkách. V průběhu pokusů na zvířatech nebyly zaznamenány žádné nežádoucí tkáňové reakce. V důsledku toho byl aprotinin z prostředku předloženého vynálezu vyloučen.

Očekává se, že prostředek tohoto vynálezu bude klinicky vykazovat stejné hemostatické vlastnosti, stejné výsledky při lepení tkáně a utěsňování tkáně jako jeho předchůdci a že bude mít stejné nebo dokonce ještě uspokojivější vlastnosti z hlediska svého bezpečnostního profilu. Nepřítomnost aprotininu, který je v současnosti k dispozici pouze z hovězích zdrojů, dodává výrobku větší bezpečnost ve vztahu k hypersenzitivním reakcím. V tomto smyslu by mělo být poznamenáno, že protilátky proti aprotininu se objevily ve třech japonských studiích. S prostředkem bez aprotininu se žádná taková imunologická odezva nepředpokládá.

V tomto zvýhodněném provedení se vynález týká prostředku pro zástavu krvácení, utěsnění tkáně a slepení tkáně, kteiý obsahuje ohebný nosič, který má alespoň jednu z následujících fyzikálních vlastností, a to modul pružnosti v rozmezí 5 až 100 N/cm, jako je 10 až 50 N/cm, hustotu 1 až 10 mg/cm³, jako 2 až 7 mg/cm³, průměr dutiny větší než 0,75 mm a menší než 4 mm a/nebo střední průměr dutiny pod 3 mm a který dále obsahuje pevný fibrinogen a pevný trombin a neobsahuje žádné antifibrinolytické činidlo jako je aprotinin, ε-aminokapronová kyselina nebo a₂antiplasmin, přičemž pevný fibrinogen a pevný trombin jsou zakotveny na nosiči takovým způsobem, že když se vzorkem pokrytého materiálu 2 minuty třepe na třepačce Vibrofix při frekvenci 1000 otáček za minutu, je abraze menší než 1,0 mg/cm² a jestliže se pokrytý nosičový materiál ponoří do endoskopického zařízení a poté se vyndá, je materiál v podstatě nezměněn a má ztrátu potahovacího materiálu menší než 20 %, jakožto indikaci ohebnosti nosiče a pevné adheze pevného fibrinogenu a pevného trombinu a uvedený materiál je v podstatě vzduchotěsný a kapalinotěsný a má faktor pružnosti alespoň 1,25, jak se určí testem obsahujícím fixaci pokrytého nosiče na latexovou fólii, trojnásobné tlakové roztažení latexu a při třetím roztažení změření plochy pokrytého nosiče v bodu největšího roztažení latexové fólie a porovnání roztažené plochy pokrytého nosiče s výchozí plochou pokryté plochy.

Zvýhodněné provedení vynálezu, kde fibrinogen a trombin jsou lidské, například přečištěné z přírodního zdroje nebo transgenní nebo rekombinantní lidský fibrinogen a trombin, je takové provedení, kde je k dispozici těsnicí fibrinové lepidlo pouze nehovězího původu, spolu se zakotvenou kombinací aktivních složek pokrývajících ohebný nosič a které má několik výhod: Připravenost k okamžitému použití, není potřeba doba pro rozehřátí nebo přípravný postup, snadno se aplikuje přímo na většinu ploch tkání a orgánů, je možná endoskopická aplikace, nejsou žádné problémy s podtékáním krve nebo odplavením z cílové plochy, kombinuje se lepivý účinek fibri-8CZ 304357 B6 nového uzavírání a mechanické podpory ohebného nosiče, prostředek je vysoce ohebný a odolává velkému natahování a stlačování, účinně se zastavuje krvácení a tkáně se utěsní během 3 až 5 minut, prostředek má příznivý bezpečnostní profil, to jest neobsahuje hovězí složky, je biodegradabilní a zanechává pouze menší tkáňové jizvy, lze jej skladovat při 2 až 8 °C a má očekávanou skladovatelnost 36 měsíců nebo při laboratorní teplotě alespoň po dobu 2 let.

Důvod pro vývoj zvýhodněného prostředku tohoto vynálezu se odvozuje od přání zbavit se hovězí složky, aby se předešlo jakémukoliv, dokonce i teoretickému riziku přenosu nemocí z krav na člověka, které zahrnují přenosné spongiformní encefalopatie (TSEs). Aktivní složky, tedy fibrinogen a trombin, tak mají lidský původ a hovězí aprotinin, tedy inhibitor fibrinolytického enzymu plasminu, se odstranil. Výhodou zvýhodněného prostředku tohoto vynálezu neobsahujícího žádné hovězí složky je tak to, že bylo vyloučeno riziko přenesení nemocí prostřednictvím hovězího materiálu, které zahrnují bovinní spongiformní encefalopatii (BSE).

Podobně jako jiná fibrinová lepidla pracuje i prostředek tohoto vynálezu prostřednictvím napodobování posledního kroku kaskády koagulace krve. Směs fibrinogenu a trombinu tvoří na povrchu ohebného nosiče zakotvenou pevnou vrstvu. Při kontaktu s tekutinami, např. krvácejícím povrchem, tělesnými tekutinami nebo fyziologickým roztokem, se složky vrstvy rozpustí, difundují do kavit poranění a začnou reagovat.

Polymerizační proces vytváří silnou adhezi mezi povrchem poranění a náplastí nosiče. Během doby nutné pro zalepení, to jest 3 až 5 minut, by prostředek tohoto vynálezu měl s výhodou být jemně přitlačován na povrch poranění. Nosičová náplast tvoří mechanickou oporu, která dovoluje poranění tamponovat. Náplast udržuje koagulační složky na místě, když poranění silně krvácejí a zabraňuje potenciálnímu obnovení krvácení. Mechanizmus účinku zahrnuje konverzi fibrinogenu trombinem na fibrin, a to odštěpením peptidů. Monomery fibrinu spontánně polymerizují na fibrinová vlákna vytvářející viskózní a elastickou sraženinu, která lepí nosičovou náplast k povrchu poranění. Fibrinová matrice následně slouží jako základní konstrukce pro migraci fibrinoblastu (obrázek 8).

Povrch poranění a nosič se navzájem slepí prostřednictvím polymerizace, jako u dvoj složkového lepidla. Mechanická stabilita nosičové náplasti dodává hemostatickému účinku fibrinové sraženiny i tampónový účinek. Aktivní složky jsou navíc přítomny pouze na povrchu nosiče vystaveného poraněné ploše a díky efektu tampónového účinku a díky jemnému tlaku tak nosičem nedifundují. V důsledku toho a v protikladu k situaci, kdy se používá většina fibrinových lepidel, zde nedochází k adhezi poraněné plochy pokryté prostředkem tohoto vynálezu na jiné orgány nebo jejich části, když se prostředek tohoto vynálezu použije.

Na rozdíl od kyanakrylátových lepidel a lepidel na bázi želatiriy-rezorcinu-formaldehydu (GRF), jež jsou pro parenchymovou tkáň vysoce histotoxická, pevný prostředek tohoto vynálezu se fyziologicky odbourává a v průběhu týdnů nebo měsíců po aplikaci je nahrazen tkání, a to hlavně cestou dvou mechanizmů:

1. Fibrinová sraženina se odbourává částečně fibrinolýzou a částečně buněčnou fagocytózou.

2. Nosič se odbourává vrstvu po vrstvě absorptivní granulační tkání a převádí se na pseudokapsle zahrnující endogenní pojivovou tkáň.

Prostředek tohoto vynálezu je vhodný pro zástavu krvácení, slepení tkáně a utěsnění tkáně, zvláště při chirurgických zásazích v gastrointestinálním systému jako na jícnu, žaludku, tenkém střevě, tlustém střevě, konečníku, na parenchymových orgánech jako jsou játra, slezina, slinivka břišní, ledviny, plíce, nadledvinky, štítná žláza a lymfatické uzliny, v kardiovaskulární chirurgii, chirurgii hrudníku zahrnující chirurgii průdušnice, průdušek nebo plic, při chirurgických zásazích v oblasti ucha a krku (ORL) zahrnujících zubní chirurgii, v gynekologické, urologické, kostní (například resekci spongiózy) chirurgii a neodkladné chirurgii, neurologické chirurgii, chirurgii

-9CZ 304357 B6 lymfatických, žlučových a cerebrospinálních (CSF) pištěli a únicích vzduchu během chirurgie hrudníku a plic. Předložený vynález se tak také týká použití popsaných prostředků pro výše uvedené účely.

Mělo by být zdůrazněno, že prostředek tohoto vynálezu jev podstatě vzduchotěsný a kapalinotěsný, což je důvodem pro to, že tento výrobek je zvláště vhodný v léčení lymfatických, žlučových a cerebrospinálních (CSF) pištěli a únicích vzduchu během plicní a hrudní chirurgie. Navíc, protože je tento výrobek v podstatě kapalinotěsný, je vysoce užitečný v chirurgii vysoce krvácivých orgánů jako jsou játra a slezina a pro chirurgii například v gastrointestinálním traktu.

Výrobek tohoto vynálezu se aplikuje tehdy, když běžnými metodami nelze kontrolovat krvácení nebo lymfatický, žlučový, vzduchový nebo CSF únik nebo když by tyto metody přinesly nepříznivé výsledky.

Nosičem je s výhodou kolagenová houba, pletenina nebo náplast, kteréžto termíny se v tomto popisu a nárocích používají jako synonyma. Složky, tedy kolagen, fibrinogen a trombin, mají s výhodou savčí původ. Pevné složky jsou s výhodou lidského původu. Kolagen, fibrinogen a trombin mohou být buď přečištěné z přírodního zdroje nebo rekombinantní nebo transgenní lidský fibrinogen a/nebo trombin.

V současnosti je zvýhodněným zdrojem kolagenu kůň. Aby se předešlo virovému přenosu kolagenovou náplastí v důsledku kontaminace koňskými viry, které jsou pro člověka patogenní, jsou jako preventivní prostředky důležité jednak vhodný výběr zdrojového materiálu a jednak inaktivace potenciálně patogenních činidel ve výrobním procesu.

Popis obrázků

Obrázek 1

1.1 Opraskm®: nepokrytý/pokrytý

1.2 Pokrytý Opraskin®: ponoření do endoskopického zařízení

1.3 Pokrytý Opraskin®: rozvinutý po ponoření do endoskopického zařízení Obrázek 2

2.1 Willospon® forte: nepokrytý/pokrytý

2.2 Pokrytý Willospon® forte, ponoření do endoskopického zařízení

2.3 Pokrytý Willospon® forte: rozvinutý po ponoření do endoskopického zařízení Obrázek 3

3.1 Willospon® Spezial: nepokrytý/pokrytý

3.2 Pokrytý Willospon® Spezial: ponoření do endoskopického zařízení

-10CZ 304357 B6

3.3 Pokrytý Willospon® Spezial: rozvinutý po ponoření do endoskopického zařízení

Obrázek 4

4.1 Ethisorb® Patch: nepokrytý/pokrytý

4.2 Pokrytý Ethisorb® Patch: ponoření do endoskopického zařízení

4.3 Pokrytý Ethisorb® Patch: rozvinutý po ponoření do endoskopického zařízení

Obrázek 5

5.1 Tabotamp® NU Knit: nepokrytý/pokrytý

5.2 Pokrytý Tabotamp® NU Knit: ponoření do endoskopického zařízení

5.3 Pokrytý Tabotamp® NU Knit: rozvinutý po ponoření do endoskopického zařízení

Obrázek 6

6.1 Houba Nycomed: nepokrytá/pokiytá (laboratorní vzorek)

6.2 Pokrytá houba Nycomed (laboratorní vzorek): ponoření do endoskopického zařízení

6.3 Pokrytá kolagenová houba Nycomed (laboratorní vzorek): rozvinuta po ponoření do endoskopického zařízení

6.3 Pokrytá kolagenová houba Nycomed (výrobní vzorek = TachoComb®): rozvinuta po ponoření do endoskopického zařízení

Obrázek 7

endoskopický nástroj: Endodock®

Obrázek 8

Krevní koagulace a degradace sraženiny a nosičové náplasti. Aktivní složky pokrytí nosiče jsou znázorněny v šedých stínovaných rámečcích.

Příklady provedení vynálezu

Níže uvedené příklady I až IV popisují různé postupy přípravy pokryté kolagenové houby s růz 5 nými fibrinogenovými a trombinovými základními materiály.

- 11 CZ 304357 B6

Fibrinogenové základní materiály

Složka	% z celkového obsahu látek
Přípravek A	Přípravek B	Přípravek C
Lidský fíbrinogen	36 až 52	42 až 47	36 až 52
Lidský albumin	16 až 24	20 až 24	16 až 24
Celkový protein	52 až 76	62 až 71	52 až 76
Chlorid sodný	8 až 14	0	8 až 14
Citrát trisodný	2 až 4	1 až 3	2 až 4
Arginin (hydrochlorid)	15 až 26	15 až 21	15 až 26
Glycin	0	6 až 9	1 až 2
Histidin	0	3až5	0
Sachardsa	0	0	1 až 2
Zbytková vlhkost	<2	2 až 4	<1,5

Trombinové základní materiály

Přípravek	Aktivita (IU/mg látky)	Zbytková vlhkost	Další látky, aditiva
Lidský trombin A	360 až 540	<3 %	Lidský albumin, chlorid sodný, citrát sodný
Lidský trombin B	7 až 10	<3%	Lidský albumin, chlorid sodný,
			citrát sodný
Lidský trombin C	35 až 60	<3 %	Lidský albumin, chlorid sodný, octan sodný, glycin

Příklad I

V tomto příkladu obsahuje suspenze lidský fibrinogenový přípravek B a lidský trombinový přípravek B.

Použitím následujících množství a parametrů se získal výsledný objem suspenze 3500 ml:

Fibrinogenová směs: 2800 ml ethanolu (94% při 2 až 8 °C), 492,5 g lidského fibrinogenového přípravku B, 493,5 mg riboflavinu. Fibrinogenová směs byla udržována za míchání 8 až 16 hodin při 2 až 8 °C.

- 12 CZ 304357 B6

Trombinová směs: 100 ml ethanolu (100% při -30 °C), 12,27 g lidského trombinového přípravku B. Trombinová směs byla udržována 8 až 16 hodin při -30 °C.

Suspenze: 157 ml trombinové směsi se přidalo k fíbrinogenové směsi. K doplnění na výsledný objem suspenze 3500 ml se přidal 94% ethanol při 2 až 8 °C.

Vlastnosti suspenze:

1. Koncentrace ethanolu: 94,3 %

2. Sedimentační chování:

a) sedimentační objem po 5 minutách od počátku: 98 % testového objemu

b) sedimentační objem po 24 hodinách od počátku: 64 % testového objemu

3. Velikost částice (střední průměr podle Folka a Warda): 56,4 ± 1,3 μηι

Nosiče ve formě kolagenových proužků byly pokryty suspenzí. Za následujících podmínek se v chladicí komoře nejprve preinkubovalo 48 proužků kolagenové houby: Teplota 5,2 °C, absolutní vlhkost 4,8 g vody na kg, vzduchu, inkubační doba 18,5 hodiny.

Pokryté proužky kolagenové houby se vysušily následujícím způsobem:

Pokryté proužky se inkubovaly 15 minut při teplotě 5,2 °C a absolutní vlhkosti 4,8 g vody na kg vzduchu.

Poté se za sníženého tlaku pokryté proužky vysušily v sušicí komoře za následujících podmínek sušení:

Vzduchové podmínky: teplota 5,2 °C, absolutní vlhkost 4,8 g vody na kg vzduchu, průtok vzduchu odsávacím ventilem 23 m³ za hodinu, tlak 5,9 kPa (59 mbar), doba sušení 4 hodiny.

Když se proužky 2 minuty třepalo na třepačce Vibrofix při frekvenci 800 až 1200 otáček za minutu, došlo k abrazi získaného pokrytí proužků kolagenové houby o asi 0,2 mg/cm².

Příklad II

V tomto příkladu obsahuje suspenze lidský fibrinogenový přípravek C a lidský trombinový přípravek C.

Fibrinogenová směs: 2252 ml ethanolu (94% při 2 až 8 °C), 370,7 g lidského fíbrinogenového přípravku C, 493,5 mg riboflavinu. Fibrinogenová směs byla udržována za míchání 8 až 16 hodin při 2 až 8 °C.

Trombinová směs: 188 ml ethanolu (100% při -30 °C), 12 vialek lidského trombinového přípravku C (10 650 IU/viaIku)/l 2 ml vody po injekci. Trombinová směs byla udržována 8 až 16 hodin při -30 °C.

Suspenze: 164,5 ml trombinové směsi se přidalo k fíbrinogenové směsi. K doplnění na výsledný objem suspenze 3500 ml se při 2 až 8 °C přidal 94 % ethanol.

- 13 CZ 304357 B6

Vlastnosti suspenze:

1. Koncentrace ethanolu: 94,1 %

2. Sedimentační chování:

a) sedimentační objem po 5 minutách od počátku: 94 % testového objemu

b) sedimentační objem po 24 hodinách od počátku: 71 % testového objemu

3. Velikost částice (střední průměr podle Folka a Warda): 49,2 ± 0,93 pm

Nosiče ve formě kolagenových proužků byly pokryty suspenzí. Za následujících podmínek se v chladicí komoře nejprve preinkubovalo 48 proužků kolagenové houby: Teplota 4,8 °C, relativní vlhkost 90,3 %, inkubační doba 22,25 hodiny.

Pokryté proužky kolagenové houby se vysušily následujícím způsobem:

Pokryté proužky se inkubovaly 13 minut při teplotě 4,9 °C a absolutní vlhkosti 4,8 g vody na kg vzduchu.

Poté se za následujících podmínek sušení pokryté proužky vysušily za sníženého tlaku v sušicí komoře:

Vzduchové podmínky: teplota 5,2 °C, absolutní vlhkost 4,9 g vody na kg vzduchu, průtok vzduchu odsávacím ventilem 25 m³ za hodinu, tlak 6 kPa (60 mbar), doba sušení 4 hodiny.

Když se 2 minuty třepalo proužky na třepačce Vibrofix při frekvenci 800 až 1200 otáček za minutu, došlo k abrazi získaného pokrytí proužků kolagenové houby o asi 0,3 mg/cm².

Příklad III

Použitím následujících množství a parametrů se získal výsledný objem suspenze 780 ml:

Fibrinogenová směs: 700 ml ethanolu (94% při 2 až 8 °C), 84,2 g lidského fibrinogenového přípravku C, 110 mg riboflavinu. Fibrinogenová směs byla udržována za míchání 8 až 16 hodin při 2 až 8 °C.

Trombinová směs: 35 ml ethanolu (100% při — 30 °C), 0,54 g lidského trombinového přípravku C.

Trombinová směs se udržovala 8 až 16 hodin při -30 °C.

Suspenze: 23,0 ml trombinové směsi se přidalo k fibrinogenové směsi.

K doplnění na výsledný objem suspenze 780 ml se při 2 až 8 °C přidal 100 % ethanol.

Vlastnosti suspenze:

1. Koncentrace ethanolu: 94 %

2. Sedimentační chování:

- 14CZ 304357 B6

a) sedimentační objem po 5 minutách od počátku: 92 % testového objemu

b) sedimentační objem po 24 hodinách od počátku: 72 % testového objemu

3. Velikost částice (střední průměr podle Folka a Warda): 60,5 ± 0,5 pm

Nosiče ve formě kolagenových proužků se pokryly suspenzí. Za následujících podmínek se v chladicí komoře nejprve preinkubovalo 8 proužků kolagenové houby: Teplota 6,0 °C, relativní vlhkost 85 %, inkubační doba 18,5 hodiny.

Pokryté proužky kolagenové houby se vysušily následujícím způsobem: Pokryté proužky se inkubovaly 45 minut při teplotě 5 °C a relativní vlhkosti 85 %. Poté se za následujících podmínek sušení pokryté proužky vysušily za sníženého tlaku v sušicí komoře:

Vzduchové podmínky: teplota 5 °C, relativní vlhkost 85 %, průtok vzduchu odsávacím ventilem

1,2 m³ za hodinu, tlak 3,5 kPa (35 mbar), doba sušení 4 hodiny.

Příklad IV

V tomto příkladu obsahuje suspenze lidský fibrinogenový přípravek A a lidský trombinový přípravek A.

Použitím následujících množství a parametrů se získal výsledný objem suspenze 3120 ml:

Fibrinogenová směs: 2540 ml ethanolu (100% při 2 až 8 °C), 311,6 g lidského fibrinogenového přípravku A, 440 mg riboflavinu. Fibrinogenová směs byla udržována za míchání 8 až 16 hodin při 2 až 8 °C.

Trombinová směs: 210 ml ethanolu (100% při -30 °C), 229 g lidského trombinového přípravku A.

Suspenze: 87,3 ml vody pro injekci se přidalo k fibrinogenové směsi.

K fibrinogenové směsi se přidala trombinová směs.

K doplnění na výsledný objem suspenze se při 2 až 8 °C přidal 100 % ethanol.

Vlastnosti suspenze:

1. Koncentrace ethanolu: 97 %

2. Sedimentační chování:

a) sedimentační objem po 5 minutách od počátku: 95,6 % testového objemu

b) sedimentační objem po 24 hodinách od počátku: 63,5 % testového objemu

3. Velikost částice (střední průměr podle Folka a Warda): 51,8 ± 0,8 pm

Nosiče ve formě kolagenových proužků se pokryly suspenzí. Za následujících podmínek se v chladicí komoře nejprve preinkubovalo 48 proužků kolagenové houby: Teplota 6,5 °C, relativní vlhkost 90 %, inkubační doba 22,5 hodiny.

- 15 CZ 304357 B6

Pokryté proužky kolagenové houby se vysušily následujícím způsobem: Pokryté proužky se inkubovaly 10 minut při teplotě 6,5 °C a 90% relativní vlhkosti. Poté se za následujících podmínek sušení pokryté proužky vysušily za sníženého tlaku v sušicí komoře:

Vzduchové podmínky: teplota 6,5 °C, 90% relativní vlhkost, průtok vzduchu odsávacím ventilem 21 m³ za hodinu, tlak 5,8 kPa (58 mbar), doba sušení 4 hodiny.

Když se 2 minuty třepalo proužky na třepačce Vibrofix při frekvenci 800 až 1200 otáček za minutu, došlo k abrazi získaného pokrytí proužků kolagenové houby o asi 0,1 mg/cm².

Příklad 1

Aprotinin jako složka výrobku TachoComb®

In vitro studium antifibrinolytické aktivity za vymývacích podmínek podobných situaci in vivo

Cílem tohoto výzkumu bylo ukázat účinnost aprotininu jako složky výrobku TachoComb H za hyperfibrinolytických podmínek použitím testových modelů in vitro.

TachoComb S je bělavá, pokrytá houbovitá náplast. Tato náplast pěnového suchého kolagenu se použije jako nosič aktivních pevných složek. Velikost náplasti je 9,5 cm x 4,8 cm x 0,5 cm. Aktivní strana je zbarvena žlutě. 1 cm² náplasti TachoComb S (tloušťka 0,5 cm) zahrnuje:

kolagen koňského původu 2,1 mg pokrytý lidským fibrinogenem 5,5 mg lidským trombinem 2,0 IU riboflavinem (žlutá barva coby značkovač pokryté plochy) 16,5 pg

Experimentální in vivo testy pro nalezení dávky potvrdily, že výše uvedené koncentrace trombinu a fibrinogenu mají maximální adhezivní sílu (viz příklad 3).Byl porovnán výrobek TachoComb H obsahující lidský trombin, lidský fibrinogen a aprotinin s výrobkem TachoComb S obsahujícím jako aktivní složky pouze lidský trombin a lidský fibrinogen.

Pro kvantitativní určení účinnosti za hyperfibrinolytických podmínek byly vyvinuty dva testové modely, přičemž tyto podmínky by mohly být považovány za odpovídající operačním podmínkám a tyto podmínky dovolily provést množství nutných testů k demonstraci významného účinku.

V testovém modelu 1 se testový vzorek nanesl na syntetickou tkaninu, coby adhezivní povrch. Do tkaniny byl vyříznut definovaný otvor, aby se simulovala například perforace krevní cévy. Proces utěsňování byl vystaven dvěma různým fibrinolytickým roztokům (inkubačním roztokům), které působily na otvor. Jeden z těchto roztoků dále obsahoval antifibrinolytickou složku a2-antiplasmin.

Složení inkubačních roztoků:

Všechny látky se zředily pufrem 1: 50 mM trometamol, 100 mM NaCl, 2,5 mM CaCl₂, 2mg/ml BSA (neobsahující proteázu), 0,5 mg/ml azidu sodného.

Inkubační roztok I (1 μΜ plasminogen, 1 nM tkáňový plasminogenový aktivátor (tPA), 1 μΜ a₂-antiplasmin)

-16CZ 304357 B6 μΐ pufru 1, pH 7,4 μΐ plasminogenového roztoku (konc. 4,9 μΜ aktivita lidského plasminogenu dle Coachrom) μΐ roztoku tPA (50 nM)

100 μΐ a₂-antiplasminového roztoku (2,5 μΜ)

Inkubační roztok II (1 μΜ plasminogen, 1 nM tkáňový plasminogenový aktivátor)

149 μΐ pufru 1, pH 7,4, 51 μΐ plazminogenového roztoku (konc. 4,9 μΜ aktivita lidského plazminogenu dle Coachrom) μΐ roztoku tPA (50 nM)

Aby se simuloval vymývací efekt, měnil se inkubační roztok ve dvouhodinových periodách. Při této příležitosti byla kontrolována i adheze. Vzorek se vystavil tlaku 5 kPa (50 mbar). Doba, za kterou se vzorek pod tlakem < 5 kPa (50 mbar) oddělí, se zaznamenala.

Testový model 2 se provedl pro demonstraci fibrinolytického účinku poškozené střevní tkáně. Testový vzorek se nanesl na prasečí střevo (ex vivo) coby adhezní povrch. Do střeva byl vyříznut definovaný otvor, aby se inkubačnímu roztoku umožnilo přijít do styku s fibrinovou sraženinou a simulovat vymývací efekt. V zaznamenaných časech se vyměnil inkubační roztok a v tomto okamžiku se vzorek vystavil tlaku 5 kPa (50 mbar). Doba, za kterou se vzorek pod tlakem < 5 kPa (50 mbar) oddělil, se zaznamenala.

Výsledky odhalily značné rozdíly mezi výrobkem TachoComb H obsahujícím aprotinin a výrobkem TachoComb S bez aprotininu.

V testovaném modelu 1 při použití inkubačního roztoku obsahujícího tkáňový plasminogenový aktivátor, plasminogen a cc₂-antiplasmin byla doba fibrinolýzy pro TachoComb H 41,2 ± 7,3 hodiny, ve srovnání s 12,8 ± 2,8 hodinami pro TachoComb S.

V testovaném modelu 1 při použití inkubačního roztoku obsahujícího pouze tkáňový plasminogenový aktivátor a plasminogen byla doba fibrinolýzy pro TachoComb H 31,6 ± 5,3 hodiny, ve srovnání s 8,3 ± 1,8 hodinami pro TachoComb S.

V testovaném modelu 2 byla doba do uvolnění výrobku TachoComb H 78,4 ± 16,3 hodiny, ve srovnání s 6,5 ±1,8 hodinami pro TachoComb S.

V testovém vzorku lze ještě pozorovat hodně fibrinu. Vzorek se ale pod tlakem uvolnil z povrchu střeva, neboť síla adheze mezi fibrinovou sraženinou a povrchem střeva se zeslabila.

V obou modelech byl velmi jasně demonstrován antifibrinolytický účinek aprotininu, jakožto aktivní složky ve výrobku TachoComb H.

V testovém modelu 1 bylo prodloužení doby fibrinolýzy v důsledku přítomnosti aprotininu coby aktivní složky výrobku TachoComb H 320 % pro inkubační roztok I obsahující a₂-antiplasmin a 380 % pro inkubační roztok II bez a₂-antiplasminu. Testový model 1 také ukázal další antifibrinolytický účinek a₂-antiplasminu prostřednictvím prodloužení doby fibrinolýzy pro TachoComb H z 31,6 hodiny na 41,2 hodiny (130 %) a pro TachoComb S z 8,3 hodiny na 12,8 hodiny (154%).

- 17CZ 304357 B6

Příklad 2

Porovnání pokryté houby Nycomed (TachoComb S) sjinými nosičovými výrobky pokrytými 5 identicky jako TachoComb S

Adheze vrstvy

Postup

1. Pokrytí různých nosičů

Obchodní jméno	Materiál	Vyrobeno/Dodáváno
Opraskin®	Kolagenová houba	Lohmann, Posilách 2343, D-56513 Neuwied
Willospon® forte	Kolagenová houba (telecí)	Will-Pharma, Postbus 30, NL 1160 AA Zwanenburg
Willospon® Spezial	Želatinová houba	Will-Pharma, Postbus 30, NL 1160 AA Zwanenburg
Ethisorb® Patch	Polyglactin910/Polydioxanon	Johnson/Johnson (výrobce) Ethicon, Robert-Koch-Str. 1 D-22851 Norderstedt
Tabotamp® NU Knit	Oxidovaná regenerovaná celulosa	Johnson/Johnson (výrobce) Ethicon, Robert-Koch-Str. 1 D-22851 Norderstedt
Collagen sponge Nycomed	Koňská kolagenová houba	Nycomed Austría Sankt-Peter-Str. 25 A-4021 Linec

Pokrývači suspenzí TachoComb S byla potažena plocha o rozměrech 2 cm x 4,5 cm. Množství 15 suspenze pro pokrytí odpovídalo popisu pro TachoComb (5,5 mg fibrinogenu/cm²). Vzorky se vysušily.

1. Z každého pokrytého nosiče byl připraven vzorek o rozměrech 1 cm x 4 cm.

2. Adheze vrstvy bylo testováno následujícím způsobem.

Popis způsobu Přístrojové vybavení

Analytické váhy (přesnost měření ± 0,5 mg)

Třepačka Vibrofix kombinovaná s upevňovacím zařízením

- 18CZ 304357 B6

Pravítko s milimetrovým dělením

Stopky, skalpel, zkumavky s vnitřním průměrem 2 cm opatřené uzávěrem

Postup

Pomocí skalpelu se z pokrytého nosiče vyřízla pokrytá plocha o rozměrech 4 cm x 1 cm. Vzorek se umístil do zvážené zkumavky s uzávěrem. Poté se 2 minuty třepalo na třepačce Vibrofix (frekvence 1000 otáček za minutu).

Proužek se vyndal a převážením se zjistilo zbylé množství krycího materiálu (abraze v mg/cm²). Výpočet hmotnost zbytku (mg) - tára (mg) Abraze (mg/cm²) =-4 cm²

Výsledky

Nosič	Látka	Abraze (mg/cm²)
Opraskin®	lyofilizovaný kolagen	2,1
Willospon® forte (3 mm)	lyofilizovaný kolagen	1,2
Willospon® Spezial (1 mm)	želatina	2,1
Ethisorb® Patch (ZVP609)	polyglactin/ dioxanon	14,3
Tabotamp® NU Knit	oxidovaná celuldsa	9,2
Collagen sponge Nycomed	kolagen, pěnový	0,15

Komentář

Žádný nosič kromě kolagenové houby Nycomed není po pokrytí pružný. Vzorek se musí vyříznout velmi opatrně. Když je vystřihnut pomocí nůžek, dojde k odloupnutí velkého množství potahového materiálu, neboť vrstva je sama o sobě neohebná. Mezi potahovým materiálem a nosičem Ethisorb® Patch nebylo téměř žádné spojení. Když se trochu zatřepalo, veškeré pokrytí se odlouplo jako koberec. Rozdíl mezi kolagenovou houbou Nycomed a ostatními nosičovými materiály je zcela jasný.

Pružnost zvlhčeného pokrytého nosiče

Postup

1. Pokrytí různých nosičů

Krycí suspenzí TachoComb S se pokryla plocha o rozměrech 2 cm x 4,5 cm každého nosiče. Množství pokrývači suspenze odpovídalo popisu pro TachoComb (5,5 mg fibrinogenu/cm²). Vzorky se vysušily.

2. Z každého pokrytého nosiče se připravil vzorek o ploše 5 až 7 cm². Byla určena přesná výchozí plocha vysušeného vzorku.

-19CZ 304357 B6

3. Vzorek se zvlhčil a položil na elastickou latexovou fólii upevněnou ke speciálnímu zařízení, jak je podrobně popsáno pod nadpisem Postup. Poté se na latexovou fólii vyvinul tlak, při kterém se roztáhla. Po dvou roztaženích a uvolněních se fólie roztáhla potřetí. Plocha nosiče se změřila v bodě nejvyššího roztažení.

Popis způsobu

Přístrojové vybavení/Chemikálie

Peristaltická pumpa (IKA PA-SF)

Nádobka na vyrovnání tlaku (3 výstupy)

Tlakoměr VDO (0 až 25 kPa (0 až 250 mbar))

Skleněná nálevka (průměr otvoru 1 : 30 mm, otvoru 2:15 mm

Silikonové trubičky a sponky, latexové rukavice (Semper med), skalpel, pravítko s milimetrovým dělením, nůžky Fyziologický roztok

Postup

Ke třem výstupům tlakové vyrovnávací nádobky se pomocí silikonových trubiček vzduchotěsně připojilo následující vybavení:

a) peristaltická pumpa

b) tlakoměr

c) skleněná nálevka/otvor 2

Z latexové rukavice se vyřízl dvojitý proužek a rozměrech 8 cm x 8 cm. Tento proužek se vzduchotěsně upevnil ke skleněné nálevce/otvor 1.

Skalpelem se vyřízla plocha asi 5 až 7 cm² pokryté plochy pokrytého nosiče. Změřila se plocha vzorku (výchozí plocha). Pokrytí vzorku se zvlhčilo fyziologickým roztokem a vzorek se položil na latexovou fólii. Poté se na latexovou fólii vzorek ručně asi 1 minutu přitlačoval.

Latexová fólie se pomocí peristaltické pumpy roztáhla tlakem 7 kPa (70 mbar). To se dvakrát opakovalo, vždy s následným uvolněním tlaku na latexovou fólii. Při třetím roztažení se změřila plocha (délka a šířka) pokrytého nosiče, a to v bodě největšího roztažení latexové fólie.

Výpočet plocha nosiče při třetím roztažení Faktor pružnosti = výchozí plocha vzorku

-20CZ 304357 B6

Výsledky

Nosič	Látka	Faktor pružnosti
Opraskin®	lyofilizovaný kolagen	1,78
Willospon® forte (3 mm)	lyofilizovaný kolagen	1,53
Willospon® Spezial (1 mm)	želatina	1,79
Ethisorb® Patch (ZVP609)	polyglactin/dioxanon	1,0
Tabotamp® NU Knit	oxidovaná celulósa	1,15
Collagen sponge Nycomed	kolagen, pěnový	1,55

Komentář

Pružnost zvlhčené kolagenové houby Nycomed (TachoComb S) je jednou z důležitých vlastností výrobku. Pružnost je nezbytná v chirurgii hrudníku a břišní dutiny. Po přilepení by měl být nosič schopný sledovat například roztahovací a stahovací pohyby plic nebo střev. Zvláště Ethisorb® nevykazoval pružnost vůbec žádnou. Z pokrytí se uvolňoval okamžitě. Pokrytý Willospon® Spezial a Opraskin® vykazovaly během testu strukturní defekty.

Použití pokrytého nosiče v endoskopické chirurgii

Postup

1. Pokrytí různých nosičů

Krycí suspenzí TachoComb S se pokryla plocha o rozměrech 2 cm x 4 cm každého nosiče. Množství krycí suspenze odpovídalo popisu pro TachoComb (5,5 mg fibrinogenu/cm²). Vzorky se vysušily.

2. Zacházení se vzorky pokrytého nosiče pro použití v endoskopické chirurgii a ztráta pokrytí v důsledku tohoto zacházení se zdokumentovaly prostřednictvím digitálního fotografického vybavení.

Popis způsobu

Přístrojové vybavení

Edodock: Endoskopický nástroj uzpůsobený pro použití prostředku TachoComb® v endoskopické chirurgii (viz obrázek 7). Digitální fotografické vybavení.

Seznam studovaných nosičů

Nosič	Nosičový materiál
Opraskin®	lyofilizovaný kolagen
Willospon® forte (3 mm)	lyofilizovaný kolagen
Willospon® Spezial (1 mm)	želatina

-21 CZ 304357 B6

Ethisorb® Patch (ZVP609)	polyglactin/ dioxanon
Tabotamp® NU Kmt	oxidovaná celuldsa
Collagen sponge Nycomed	kolagen, pěnový

Postup

Sejmuté obrázky všech nosičů

1. obrázek: Dokumentace nepokrytých a pokrytých nosičových vzorků

2. obrázek: Pokryté vzorky se ponoří do endoskopického zařízení (Endodock).

Vzorek se musí ručně zploštit, aby ho bylo možno obalit kolem vodícího „kolíku“. Poté se vzorek opatrně ponoří do ocelové trubičky o průměru 10 mm.

Dokumentace vzorku částečně ponořeného do trubičky zařízení Endodock.

3. obrázek: Vzorek se opatrně vyndá ven. Poté se vzorek rozvine. Pokrytí, které se v důsledku tohoto zacházení se vzorkem oddělí, se shromáždí vedle vzorku. Zdokumentuje se rozvinutý vzorek po ponoření do endoskopického zařízení a úbytek pokrytí v důsledku tohoto zacházení se vzorkem.

Komentář

Použití prostředku TachoComb S (pokrytá koňská kolagenová houba/Nycomed) v endoskopické chirurgii je nejnáročnější aplikací výrobku. Tacho Comb S se ponoří do endoskopického zařízení. Trubička tohoto vybavení má obvykle průměr 10 až 13 mm. Pro ponoření do trubičky se TachoComb S zploští a poté obalí kolem vedoucího „kolíku“ a poté se opatrně ponoří do trubičky. Proto musí být spojení potahu s nosičem a i vlastní spojení silné, ale aby výrobek zůstal dostatekně ohebný v suchém stavu, aby se mohl ohýbat a rolovat. Když se TachoComb S vnáší do operovaného místa, opatrně se vyjme z trubičky. Poté se musí rozvinout a umístit na povrch poranění. To často vyžaduje nějaké úpravy. Proto by adheze vrstvy k nosiči měla být dostatečně silná, aby toto zacházení vydržela.

Výsledky

Výsledky jsou k vidění na připojených obrázcích 1 až 6. Odhad odpadlého krycího materiálu je následující:

Opraskin®	30 až 40 %
Willospon® forte (3 mm)	60 až 70 %
Willospon® Spezial (1 mm)	50%
Tabotamp® NTJ Knit	60 až 70 %
Ethisorb® Patch	95%
Collagen sponge Nycomed	<5%

-22CZ 304357 B6

Protože Ethisorb® je velmi neohebný nosič, je adheze potahu velmi špatná. Proto při tomto průzkumu ztratil pokrytý Ethisorb® téměř veškeré pokrytí. Ve srovnání s pokrytou kolagenovou houbou od firmy Nycomed měly všechny ostatní studované nosiče pokrývaný povrch hladký. Proto pokrytí leží na nosiči jako „rovný koberec“. To vede k poněkud neohebné struktuře suchých pokrytých nosičů. Ohýbání nebo rolování v něm často způsobuje praskliny.

Po ponoření pokrytých nosičů do trubičky endoskopického zařízení a poté rozvinutí vzorku ztratily všechny nosiče vyjma kolagenové houby firmou Nycomed poměrně hodně z pokrytí, takže velké plochy zůstaly bez pokrývacího materiálu.

Struktura a zrnitost kolagenové houby firmy Nycomed je základem vysoké ohebnosti výrobku TachoComb S za podmínek vysušení nebo zvlhčení. Kolagenová houba firmy Nycomed je pěnová a má uvnitř mnohoúhelníkové dutiny. Na povrchu jsou tyto dutiny přeříznuty a vznikají kaverny. Tyto kaverny zvětšují povrch k pokrytí. Během pokrývání se pokrývači suspenze distribuuje rovnoměrně na strukturovaný povrch. Během sušení se roztok obsahující jak fibrinogen, tak trombin, zakotví jako pevné látky do těchto kaveren. Proto se může TachoComb S nařezat do žádaných velikostí a lze ho ponořit do endoskopického vybavení s pouze malou ztrátou pokrývacího materiálu nebo zcela beze ztrát.

Ve srovnání se všemi ostatními studovanými nosiči je velkou výhodou suchého prostředku TachoComb S jeho vysoká ohebnost.

Příklad 3

Testy k nalezení dávek aktivních složek

Dávka aktivních složek byla nalezena prostřednictvím dvou různých experimentálních modelů, ve kterých byla měřena síla adheze: pevnost v tahu na krysích játrech, sílu adheze ke krysí ledvině při zvýšeném tkáňovém tlaku.

A. Pevnost v tahu na krysích játrech

Na levém laloku jater zanestetizované krysy se udělalo poranění o rozměrech 1 cm x 1 cm a 1 mm hluboké, aby se získalo mokvavé krvácení. Poranění se uzavřelo kouskem prostředku TachoComb S o rozměrech 1 cm x 1 cm, který se spojil s pružinovými váhami. Byl měřen tah, při kterém se TachoComb S odtrhl.

B. Sílu adheze ke krysí ledvině při zvýšeném tkáňovém tlaku

Uřezáním asi jedné čtvrtiny hmotnosti levé ledviny zanestetizované krysy se udělalo hladké, silně krvácející poranění. Poranění se uzavřelo testovými proužky prostředku TachoComb S. Uzavřením žilního odtoku a čerpáním isotonického roztoku citrátové soli (pH 7,2) do ledviny se zvýšil tkáňový tlak. Byl měřen tlak, při kterém se TachoComb S začal uvolňovat.

-23 CZ 304357 B6

Tabulka 1

Síla adheze prostředku TachoComb S obsahujícího různá množství fibrinogenu

Složení vrstvy	Síla adheze (průměr ± směrodatná odchylka)
Fibrinogen, mg/cm²	Trombin, IU/cm²	Pevnost v tahu na krysích játrech, N/cm² n = 5	Síla adheze ke krysí ledvině při zvýšeném tkáňovém tlaku, kPa, n = 5
0	0	0,20 ± 0,02	4,7 ± 0,9
0	2,40	0,20 ± 0,03	6,3 ± 1,6
1,30	1,73	0,30 ± 0,06	8,1 ± 1,2
2,92	1,85	0,39 ± 0,05	10,1 + 1,3
5,10	1,87	0,39 ± 0,03	11,0 ± 1,3
7,22	1,82	0,38 ± 0,02	9,7 ± 1,3
10,02	1,75	0,40 ± 0,07	8,7 ± 1,0

Tabulka 2

Síla adheze prostředku TachoComb S obsahujícího různá množství trombinu

Složení vrstvy	Síla adheze (průměr ± směrodatná odchylka)
Fibrinogen, mg/cm²	Trombin, IU/cm²	Pevnost v tahu na krysích játrech, N/cm² n=5	Síla adheze ke krysí ledvině při zvýšeném tkáňovém tlaku, kPa, n = 5
0	0	0,20 ± 0,02	4,7 ± 0,9
6,15	0	0,27 ±0,01	5,7 ±1,0
4,72	0,92	0,39 ± 0,02	8,4 ± 0,9
5,10	1,87	0,39 ± 0,03	11,0 ± 1,3
4,78	4,95	0,35 ± 0,02	9,7 ± 0,9
4,70	9,63	0,30 ± 0,02	10,9 ± 1,3
4,75	19,83	0,27 ± 0,03	9,1 ±2,0

Získané výsledky odhalily značné rozdíly mezi několika variacemi. Optimální rozmezí pro lidský 10 trombin bylo 0,9 až 10 IU/cm² s konstantním obsahem lidského fibrinogenu 5 mg/cm². Optimální

-24CZ 304357 B6 rozmezí pro lidský fibrinogen bylo 2,9 až 7,2 mg/cm² s konstantním obsahem lidského trombinu 2 IU/cm².

Tyto testy in vivo potvrdily, že jak koncentrace fibrinogenu (4,3 až 6,7 mg/cm²), tak koncentrace trombinu (1,5 až 2,5 IU/cm²), které se používají vjiných přípravcích TachoComb (TachoComb® a TachoComb H) mají také za výsledek maximální adhezní sílu pro TachoComb S.

Příklad 4

Účinnost prostředku TachoComb S při utěsňování lézí sleziny a jater u psů

Cílem tohoto výzkumu bylo srovnat hemostatickou účinnost prostředku TachoComb H (obsahujícího aprotinin) s prostředkem TachoComb S (bez aprotininu) na lézích sleziny a jater u psů. K napodobení mokvavého krvácení bylo vybráno říznutí a propíchnutí (0,5 cm hluboké) sleziny. K napodobení silně krvácejícího povrchového poranění (2 až 3 cm²) byla provedena resekce konečku horního jatemího laloku. Byla použita náplast prostředku TachoComb H nebo TachoComb S, jakožto jediného prostředku pro zástavu krvácení z ran (ze stejné série použité na léze sleziny a jater u stejného psa). Pitva se provedla po 48 hodinách od operace, neboť to je perioda s nejvyšším rizikem obnoveného krvácení v klinické praxi.

Úplné zástavy krvácení bylo dosaženo s oběma výrobky. Nebyl pozorován jediný případ sekundárního krvácení při pitvě po 48 hodinách od operace, a to ani při běžném pozorování a ani při histologickém vyšetření.

Když se s ohledem na zástavu krvácení a hojení poranění vyhodnocovaly slezinné a jatemí léze pokryté příslušnými náplastmi, tak také histologicky nebyly zaznamenány žádné rozdíly mezi psy, jimž byl aplikován TachoComb H nebo TachoComb S. Po operaci nebyl pozorován žádný případ sekundárního krvácení.

Údaje krevního obrazu ukázaly podobné výsledky pro obě zkoumané skupiny, s malým nárůstem počtu bílých krvinek 48 hodin po operaci. Co se týká kteréhokoliv z vyhodnocovaných parametrů, tak u nich nebyly zaznamenány žádné rozdíly mezi oběma skupinami nebo mezi dobami vyhodnocení. Také koagulační testy neodhalily žádné rozdíly ve vztahu k přítomnosti nebo nepřítomnosti aprotininu. Po 48 hodinách od operace bylo evidentní zvýšení obsahu fibrinogenu v krvi u obou skupin, které se zkoumaly. Zvýšení počtu bílých krvinek a obsahu fibrinogenu v krvi lze přičíst zánětlivé odezvě na operační poranění a oba efekty nejsou považovány za toxický vedlejší účinek prostředků TachoComb H nebo S.

Lze tak učinit závěr, že TachoComb S (bez aprotininu) vykazuje stejnou účinnost jako TachoComb H (obsahující aprotinin) v působení na mokvavá a silně krvácející parenchymová poranění u psů. Stabilita sraženiny za vybraných podmínek nebyla ovlivněna přítomností nebo nepřítomností aprotininu.

Příklad 5

Srovnání hemostatického účinku, těsnicího účinku na poranění a rezistence absorbovatelných prostředků TachoComb S a TachoComb H: Experimentální studie na prasatech Účel studie

Tento test byl navržen pro určení okamžité účinnosti a krátkodobé odolnosti hemostatické pleteniny na lézi sleziny provedené u prasete

-25 CZ 304357 B6

Materiál a způsoby

V této studii bylo použito 24 bachyní prasete. Náhodně byly testovány 2 skupiny hemostatické pleteniny: TachoComb H s aprotininem a TachoComb S bez aprotininu.

V operačním dnu se zvířatům aplikovala pletenina, která přímo utěsnila standardizovaný řez 2 cm x 3 cm, který byl chirurgicky vytvořen na spodní části sleziny.

Byl vyhodnocen okamžitý a hemostatický účinek pleteniny, a to spočtením počtu puchýřů a změřením doby nutné k zástavě krvácení. Byla zaznamenána adheze prostředků TachoComb H a S.

Po 72 hodinách bylo zvýšením vnitřního tlaku ve slezině (sevřením cévních žil) zkoumáno krátkodobé fungování a odolnost obou materiálů.

Když tlak dosáhl téměř stálého stavu, tak se pro zvýšení tepenného tlaku intravenózně podal jednorázově adrenalin (0,02 mg nebo 0,04 mg), a to buď ve spojení s infuzí dobutaminchlorhydrátu nebo bez ní. Při použití těchto farmakologických látek bylo u každého zvířete jako důsledek zvýšeného krevního tlaku zaznamenáno prasknutí léze, která byla opravena prostředky TachoComb HaS.

Výsledky

Mezi jednotlivými léčebnými působeními nebyl během doby operace sleziny zaznamenán žádný rozdíl v hemostatickém účinku.

Při druhém prohlédnutí po 72 hodinách byl i makroskopický vzhled obou pletenin identický.

Mezi oběma experimentálními skupinami nebyly významné rozdíly v měření akutního tlaku a odolnosti vůči prasknutí.

Neobjevilo se žádné prasknutí materiálu. Krvácení lézí bylo pozorováno u 4 zvířat s prostředkem TachoComb S a 2 zvířat s prostředkem TachoComb H (s jedním dalším puchýřem ve skupině 4).

Histologické vyšetření ukázalo, že aprotinin může mít ochranný účinek na strukturu pleteniny, kdy se zdálo, že aprotinin modifikuje mikroskopickou strukturu prostřednictvím zmenšení degradace pleteniny. Nebyla pozorována žádná specifická buněčná struktura.

Závěr

Byl prostudován okamžitý hemostatický účinek 2 prostředků TachoComb, S a H, a to ve standardizovaném modelu léze sleziny na 24 prasatech.

Oba materiály se chovají podobně co do účinnosti, přilnavosti k lézi a komplianci sparenchymem. Jejich účinnost byla impresivní.

Jejich odolnost biodegradaci a proteolýze byla studována v 72. hodině po operaci prostřednictvím zvýšení vnitřního tlaku ve slezině (mechanickými a farmakologickými prostředky) a zaznamenala se lokální odolnost pletenin výrobků TachoComb HaS. Mezi oběma materiály nebyl prokázán žádný významný rozdíl. Histopatologické nálezy se však ukázaly, že proteolytická degradace prostředku TachoComb S se projevila trochu více než u prostředku TachoComb H. TachoComb S nebo TachoComb H se použila jako jediný prostředek pro zástavu krvácení k uzavření silně krvácejících slezinných lézí u prasat (povrch léze 2 cm x 3 cm, 3 až 5 mm hluboké, n = 12 na skupinu). Po 72 hodinách byl vnitřní tlak ve slezině dále zvýšen podvázáním slezinné žíly (žil). Poté se vnitřní tlak ve slezině dále zvýšil injekcí adrenalinu. Prasata byla sledována, zda se ne-26CZ 304357 B6 objeví známky nového krvácení nebo se pod náplastí neobjeví krevní puchýře. Po pitvě byla provedena histopatologie vzorků (místa léze překrytá prostředky TachoComb H a S).

Prostředky TachoComb Sa TachoComb H měly podobnou účinnost, přilnavost k lézi akomplianci k parenchymu.

Příklad 6

Porovnání hemostatického těsnicího účinku na poranění a odolnosti absorbovatelných prostředků TachoComb S a TachoComb H: Pokusná studie na prasatech v modelu akutní pankreatitidy

Účel studie

Tento test byl navržen pro zhodnocení okamžité účinnosti a krátkodobé odolnosti hemostatické pleteniny na slezinné lézi indukované u prasete v modelu akutní pankreatitidy Materiály a způsoby

V této studii se použilo 20 bachyní prasete. Náhodně byly testovány 2 skupiny hemostatické pleteniny. TacoComb H s aprotininem a TachoComb S bez aprotininu.

V operačním dnu se zvířatům aplikovala pletenina přímo utěsňující standardizovanou lézi o rozměrech 2 cm x 3 cm, která se chirurgicky vytvořila na spodní část sleziny.

Byl vyhodnocen okamžitý hemostatický účinek pleteniny, a to spočtením množství puchýřků a měřením doby nutné k zástavě krvácení. Byla zaznamenána přilnavost prostředků TachoComb H a S.

Poté se použitím sterilní stříkačky propíchl žlučník a odebrala se žluč a 10 ml žluči se injektovalo do Wirsungova vývodného kanálku, aby se indukovala pankreatitida. Hladiny enzymů v krvi se monitorovaly před operací a denně i po operaci (hladiny lipázy a amylázy).

Na pankreatickém parenchymu na jeho napojení ke střevu se umístily malé kousky prostředků TachoComb H a S.

Po 72 hodinách bylo prozkoumáno krátkodobé fungování a odolnost k enzymatickému rozkladu prostředků TachoComb H a S, a to zvýšením vnitřního tlaku ve slezině (stisknutím žilních cév a farmakologickými prostředky).

Když tlak dosáhl téměř ustáleného stavu, tak se pro zvýšení tepenného tlaku intravenózně podal jednorázově adrenalin (0,02 mg nebo 0,04 mg), a to buď ve spojení s promytím dibutaminchlorhydrátem rychlostí 0,3 až 0,6 mg/min nebo bez něj.

Při použití těchto farmakologických látek bylo u každého zvířete jako důsledek zvýšeného krevního tlaku zaznamenáno prasknutí léze, která byla opravena prostředky TachoComb H a S. Výsledky

Na slezině se oba materiály chovají podobně v okamžité hemostatické účinnosti, přilnavosti k lézi a komplianci k parenchymu. Jejich účinnost byla velmi impresivní.

Obě pleteniny byly při makroskopickém prozkoumání nezměněny i ve třetím dni, ačkoliv enzymatické podmínky byly náročné, zvláště během druhého dne v krvi a ještě ve čtvrtém dni v peritoneální tekutině.

-27CZ 304357 B6

V 72. hodině po zvýšení tlaku ve slezině nebyly zaznamenány žádné významné změny v odolnosti obou materiálů.

Jedno prasknutí materiálu se objevilo ve skupině prostředku TachoComb S. Krvácení léze bylo pozorováno u 1 zvířete s prostředkem TachoComb S a u 2 zvířat s prostředkem TachoComb H (s jedním puchýřem ve skupině prostředku TachoComb H).

Histopatologické nálezy neindikovaly žádný významný rozdíl v degradaci prostředku TachoComb S ve srovnání s prostředkem TachoComb H. Na slezině nebyl pozorován žádný specifický buněčný profil. Kousky prostředků TachoComb H a S na pankreatických vzorcích v těsném kontaktu s vysokou koncentrací pankreatického enzymu nevykazovaly žádnou větší změnu.

Závěr

Závěrem lze konstatovat, že co se týká odolnosti k prasknutí, tak za podmínek prostředí zvýšených pankreatických enzymů nebyl zaznamenán žádný jasný rozdíl mezi prostředky TachoComb S a TachoComb H.

Nebyl detegován ani žádný makroskopický, ani mikroskopický důkaz modifikace obou pletenin prostředků TachoComb H a S.

Hemostatická účinnost prostředků TachoComb S a TachoComb H byla studována ve standardizovaném modelu léze sleziny (povrch léze 2 cm x 3 cm, ca 3 mm hluboké, n = 10/skupinu) na prasatech s akutní pankreatitidou indukovanou zpětnou injekcí žluči do Wirsungova vývodného kanálku a následným podvázáním vývodu z pankreasu. Malé kousky prostředků TachoComb H a S byly také použity na pankreas na straně podvázání vývodu z pankreasu. Po 72 hodinách od operace se zvýšil vnitřní tlak ve slezině podvázáním slezinné žíly a intravenózně se podal adrenalin. Prostředky TachoComb S a TachoComb H se s ohledem na hemostatickou účinnost, přilnavost k lézi a odolnost vůči zvýšenému tlaku uvnitř sleziny chovaly podobně, a to navzdoiy značnému zvýšení hladin pankreatických enzymů (20 až lOOnásobný nárůst amylázy alipázy v krvi a 10 až lOOnásobný nárůst pankreatických enzymů v peritoneální tekutině ve srovnání se základními hladinami). Histopatologické nálezy neindikovaly žádný významný rozdíl v degradaci prostředků TachoComb S a TachoComb H. Na slezině nebyl pozorován žádný specifický buněčný profil. Dokonce i prostředky TachoComb H a S na pankreatických vzorcích po úzkém kontaktu s vysokými koncentracemi pankreatických enzymů nejevily žádné větší rozdíly v přilnavosti prostředků TachoComb H a S, a histopatologie neodhalila žádné větší rozdíly.

V tomto vysoce zatěžujícím modelu akutní pankreatitidy u prasat tak nebyly žádné konkrétní makroskopické rozdíly mezi prostředky TachoComb S a TachoComb H.

Příklad 7

Komparativní studie reakce mozkové tkáně a efektivity resorbovatelného prostředku TachoComb H a TachoComb S: Experimentální studie na modelu s králíky za podmínek normální koagulace a podmínek lokální hyperfibrinolýzy

Cílem této studie bylo porovnat účinnost prostředků TachoComb S a TachoComb H po neurochirurgické aplikaci. Králíkům se provedly mozkové léze za normálních koagulačních podmínek (reakce mozkové tkáně = BTR, n = 12 králíků, vybráno n = 10) a za hyperfíbrinolytických podmínek (HP) za lokální aplikace r-tPa (η = 10 králíků). Byly provedeny tři kortikální léze na hemisféru (celkem 6 lézí na zvíře, vyvrtaná mozková léze byla 3 mm hluboká a s průměrem 4 mm).

-28 CZ 304357 B6

Série BTR

Na dvě ze tří lézí na hemisféru se postupně působilo prostředkem TachoComb H nebo TachoComb S a jedna léze na hemisféru byla pro kontrolu ponechána prázdná. Po utěsnění lézí prostředkem TachoComb H nebo TachoComb S byla při velkém zvětšení měřena doba krvácení, a to při kontinuálním omývání fyziologickým roztokem při malém průtoku. Když se dosáhlo zástavy krvácení u všech lézí, indukoval se vysoký tepenný tlak intravenózní injekcí adrenalinu (0,01 mg/kg adrenalinu), a tak se střední tepenný tlak (MAP) zvýšil na alespoň 15,6 kPa (120 mm rtuťového sloupce). Během tohoto postupu se stále sledovalo, zda nedojde k obnovení krvácení. Po snížení MAP na normální hodnoty byla kůže uzavřena. Doba do pitvy byla 3 a 7 dnů (n = 5 králíků na skupinu). U třech zvířat bylo před pitvou ve třetím dnu provedeno zobrazení pomocí magnetické rezonance. Při pitvě se místa lézí zběžně prohlédla a byly odebrány vzorky pro histopatologii.

Série HF

Po provedení lézí podle návodu v sérii BTR se na lézi nakápla r-tPA (0,3 mg r-tPA v 0,5ml fyziologického roztoku na lézi), a to před tím, než se všechny léze utěsnily buď prostředkem TachoComb S nebo TachoComb H. Doba krvácení se měřila při vysokém zvětšení a kontinuálním omývání fyziologickým roztokem při nízkém průtoku. Pitva s hrubým prohlédnutím se uskutečnila v prvém dnu (n = 7) a třetím dnu (n = 3). Na vzorcích odebraných ve třetím dnu bylo z komparativních důvodů provedeno histopatologické vyšetření.

Během průběhu celé studie nebyly evidentní žádné rozdíly mezi prostředky TachoComb S a TachoComb H, a to ani s ohledem na účinnost utěsnění, toleranci na zvýšený MAP a trvání doby krvácení, ani s ohledem na histopatologii. U všech zvířat došlo k těžkému krvácení při sérii HF nejenom v místě léze, ale i pod kůží celého obličeje. Přes tyto těžké podmínky měl TachoComb S při srovnání s prostředkem TachoComb H opět podobnou účinnost.

Příklad 8

Neurochirurgická aplikace prostředků TachoComb H a TachoComb S: Reakce mozkové tkáně a hemostatická účinnost

Tekutá fibrinová lepidla se ve velkém měřítku používají v neurochirurgii. O reakci mozkové tkáně na TachoComb® neexistují žádné rozsáhlé údaje a použití antifibrinolytických činidel (to jest aprotininu) je dosud kontroverzní.

Předmět studie

Provedení studie bylo zaměřeno na dva hlavní body: Prvým předmětem bylo vyhodnocení krátkodobé lokální reakce mozkové tkáně po aplikaci prostředků TachoComb H (TCH) a TachoComb S (TCS) na kortikálních lézích ve srovnání se slepými kontrolními pokusy na lézích (CL), a to použitím histologických metod a moderních zobrazovacích technik.

Druhým předmětem bylo prostudovat hemostatickou účinnost výrobků TachoComb H a S za podmínek normální koagulace (skupina BTR) a po lokálně indukované silné hyperfibrinolýze (skupina HF) a vyhodnotit, zda aprotinin má nějaký vliv na hemostatické kvalitativní vlastnosti a sílu adheze přípravku.

-29CZ 304357 B6

Materiál a způsob

Ve studii bylo po 22 mladých králících, kterým se provedly tři kortikální léze na každé hemisféře. Dvanáct zvířat bylo použito ke studiu reakce mozkové tkáně (BTR) a deset ve skupině s hyperfibrinolytickými podmínkami (HF).

U zvířat na BTR byly dvě léze postupně vyplněny prostředkem TachoComb H nebo TachoComb S, zatímco třetí zůstala prázdná jako kontrolní vzorek. Byla měřena doba krvácení a bylo sledováno obnovení krvácení v důsledku indukovaného zvýšení tepenného tlaku. Ve třetím a sedmém dnu po operaci je zvířata zabila a provedlo se histopatologické vyšetření. U třech zvířat z BTR skupiny se pro vyhodnocení otoku mozku provedlo i zobrazení magnetickou rezonancí, a to ve třetím dnu po operaci, těsně před jejich utracením.

U zvířat v HF studii, u kterých se předem indukovaly těžké fibrinolytické podmínky pomocí rekombinantního tkáňového plasminogenového aktivátoru (r-tPA), se na všechny tři léze jedné hemisféry působilo prostředkem TachoComb H a na druhou hemisféru prostředkem TachoComb S. Změřila se doba krvácení a u třech zvířat se ve třetím dnu provedlo histologické vyšetření.

Výsledky

Za normálních koagulačních podmínek (zvířata ve studii BTR) byla zástava krvácení s TCH a TCS významně rychlejší (P < 0,001), než bez žádného hemostatického činidla. Bylo prokázáno, že mezi dobami krvácení při užití obou výrobků není významného rozdílu (P = 0,294), ale že tyto doby jsou významně kratší než u lézí ve slepých pokusech (P < 0,001).

Během indukované arteriální hypertenze se obnovené krvácení objevilo u 1 z 24 lézí s TCH, 3 z 24 lézí s TCS a 19 a 24 kontrolních lézí. Přítomnost hemostatického činidla tak shodně zabraňovala obnovení krvácení během silně zvýšeného tepenného tlaku (χ² = 16,3, P > 0,001). Důsledkem nepřítomnosti TCH nebo TCS během vzrůstu tepenného tlaku bylo 80% riziko obnovení krvácení.

Statistická analýza dob krvácení ve skupině s hyperfibrinolytickými podmínkami (zvířata s HF) prokázala, že mezi dobami krvácení při použití obou výrobků (znaménkový pořadový test: P = 0,927 a T-test: P = 0,4102) není žádný rozdíl.

Nakonec byla významnost rozdílu mezi hemostatickou účinností stejného výrobku za obou koagulačních situací vyloučena i podle intervalu spolehlivosti 99,73 % (D < 3sdD = ns).

Závěr

Prostředky TachoComb H a TachoComb S neindukují žádné specifické histologické změny v mozkové tkáni. Oba výrobky mají dobrou biokompatibilitu s mozkovým parenchymem, neboť neindukují větší tkáňovou reakci než samotná léze. Morfologicky nebyly patrné žádné nepříznivé účinky spojené s kombinací výrobků. Histologické vyšetření neodhalilo rozdíly mezi oběma výrobky ani za podmínek normální koagulace, ani za podmínek silně narušené koagulace. Prostředky TachoComb Ha TachoComb S mají stejnou hemostatickou účinnost a adhezivní sílu jak za podmínek normální koagulace, tak za podmínek hyperfibrinolýzy. Existuje tak přesvědčivý důkaz, že aprotinin nemá vliv na hemostatické kvalitativní vlastnosti a sílu přilnavosti, a to ani za podmínek silně narušené koagulace.

Ve srovnání s literaturou dosáhnou prostředky TachoComb H a S mnohem rychlejší zástavy krvácení než oxidovaná celulóza a kolagenová pletenina.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Pevný prostředek pro zástavu krvácení, utěsňování tkáně a lepení tkáně obsahující kolagenový nosič, fibrinogen a trombin, vyznačující se tím., že se skládá z

a) kolagenového nosiče, který má alespoň dvě z fyzikálních vlastností, jimiž jsou modul pružnosti v rozmezí 100 až 500 kPa, hustota 1 až 10 mg/cm³ a průměr dutiny větší než 0,75 mm a menší než 4 mm a/nebo střední průměr dutiny pod 3 mm; přičemž na uvedeném nosiči je rovnoměrně distribuována a zakotvena směs

b) pevného lidského fibrinogenu; a

c) pevného lidského trombinu.
2. Pevný prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že kolagenovým nosičem je kolagenová houba obsahující kolagenový materiál typu I ze savčího, transgenního nebo rekombinantního zdroje.
3. Pevný prostředek podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že kolagenový nosič má jednu nebo více aktivních stran, kde je přítomen fibrinogen v množství 2 až 10 mg/cm², jako 4,3 až 6,7 mg/cm², přednostně 5,5 mg/cm² a trombin je přítomen v množství 1,5 až 5,5 IU/cm², přednostně 2,0 IU/cm².

4. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 obsahuje fibrinogen, přečištěný z přírodního zdroje. až 3, vyznačující s e tím, že 5. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 obsahuje transgenní nebo rekombinantní fibrinogen. až 3, vyznačuj ící s e tím, že 6. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 obsahuje trombin, přečištěný z přírodního zdroje. až 5, vyznačující s e tím, že 7. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 obsahuje transgenní nebo rekombinantní trombin. až 5, vyznačující s e tím, že 8. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující s e tím, že

obsahuje pružný kolagenový nosič, který má alespoň dvě z fyzikálních vlastností, jimiž jsou modul pružnosti v rozmezí 100 až 500 kPa, hustota 1 až 10 mg/cm³ a průměr dutiny větší než 0,75 mm a menší než 4 mm a/nebo střední průměr dutiny pod 3 mm;

a dále obsahuje směs pevného lidského fibrinogenu a pevného lidského trombinu a je prostý antifibrinolytických činidel, jako je aprotinin, ε-aminokapronová kyselina nebo a₂-antiplasmin;

pevný lidský fibrinogen a pevný lidský trombin jsou oba zakotveny na nosiči takovým způsobem, že po dvouminutovém třepání vzorku potaženého prostředku na třepačce Vibrofix s frekvencí otáček 1000 min \ je abraze menší než 1,0 mg/cm²;

-31 CZ 304357 B6 a po vložení vzorku potaženého prostředku do endoskopického zařízení a následného vyjmutí z tohoto zařízení, zůstane prostředek nezměněn a vykazuje ztrátu povlaku menší než 20 %, jakožto indikaci pružnosti nosiče a pevné adheze pevného lidského fibrinogenu a pevného lidského trombinu;

přičemž tento materiál je vzduchotěsný a kapalinotěsný a má faktor ohebnosti alespoň 1,25 stanovený testem zahrnujícím fixaci potaženého nosiče na latexovou fólii, třikrát roztažení latexu tlakem a změření plochy potaženého nosiče při třetím roztažení při nejvyšší hodnotě roztažení latexové fólie a porovnání roztažené plochy potaženého nosiče s výchozí plochou potažené oblasti.

9. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro použití pro utěsňování tkáně.

10. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro použití pro zástavu krvácení.

11. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro použití pro lepení tkáně.

12. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 9 až 11 pro použití pro chirurgické zákroky v gastrointestinálním traktu jako na jícnu, žaludku, tenkém střevě, tlustém střevě, konečníku, na parenchymových orgánech jako jsou játra, slezina, slinivka břišní, ledviny, plíce, nadledvinky, štítná žláza a lymfatické uzliny, v kardiovaskulární chirurgii, chirurgii hrudníku zahrnující chirurgii průdušnice, průdušek a plic, při chirurgických zásazích v oblasti ucha, nosu a krku, tedy ORL, včetně zubní chirurgie, v gynekologické, urologické, cévní, kostní chirurgii, například resekci spongiózy a neodkladné chirurgii, neurologické chirurgii, lymfatických, žlučových acerebrospinálních píštělích, tedy CSF a únicích vzduchu během chirurgie hrudníku a plic.

13. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 9 až 12, kde nosičem je kolagenová houba sestávající z vláken kolagenu typu I.

14. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 9 až 13, kde nosič má jednu nebo více aktivních stran, kde je přítomen fibrinogen v množství 2 až 10 mg/cm², jako 4,3 až 6,7 mg/cm², přednostně 5,5 mg/cm² a trombin je přítomen v množství 1,5 až 2,5 IU/cm², přednostně 2,0 IU/cm².

15. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 9 až 14, kde fibrinogen je přečištěn z přírodního zdroje.

16. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 9 až 14, kde fibrinogen je transgenní nebo rekombinantní.

17. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 9 až 16, kde trombin je přečištěn z přírodního zdroje.

18. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 9 až 16, kde trombin je transgenní nebo rekombinantní.

19. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18, který je prostý antifibrolytického činidla.

20. Pevný prostředek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 19, který je prostý aprotininu.