CZ20022830A3

CZ20022830A3 - Vysoce čisté lipopeptidy, lipopeptidové micely a způsoby jejich výroby

Info

Publication number: CZ20022830A3
Application number: CZ20022830A
Authority: CZ
Inventors: Thomas J. Kelleher; Jan-Ji Lai; Joseph P. Decourcey; Paul D. Lynch; Maurizio Zenoni; Auro R. Tagliani
Original assignee: Cubist Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 2000-01-20
Filing date: 2001-01-18
Publication date: 2002-11-13
Also published as: CN107082798B; BR0107731A; JP5631439B2; AU3097801A; CN102671181A; CN101240013B; CN102229650B; IL219889A; CA2743326A1; DE60115383D1; AU784937B2; HK1120528A1; ES2799706T3; KR20120065440A; HK1085746A1; US20130280760A1; ES2799702T3; DE60115383T2; CN1404487A; KR20020083151A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká vysoce čistých forem lipopeptidů, včetně antibiotika se silnou gram-pozitivním baktériím, daptomycinu, baktericidní lipopeptidového aktivitou proti zahrnujících kmeny, které jsou resistentní vůči konvenčním antibiotikům. Vynález se také týká způsobů přípravy vysoce čistých forem lipopeptidů. Vynález dále popisuje micely lipopeptidů. Dále se vynález zabývá farmaceutickými přípravky obsahující lipopeptidové micely a způsoby použití těchto přípravků. Předložený vynález se dále zabývá způsoby výroby lipopeptidových micel z neasociovaného monomeru lipopeptidů a přeměnou lipopeptidovým micel na neasociované monomery. Tento vynález se také zabývá způsobem přípravy lipopeptidů s využitím micel, který je snadno rozšiřitelný do průmyslového měřítka.

Dosavadní stav techniky antibiotik. antibiotika,

Rychlý nárůst výskytu gram-positivních infekcí, včetně těch, které jsou způsobeny baktériemi resistentními vůči antibiotikům, vyvolal obnovený zájem o vývoj nových typů Jedním z těchto typů jsou lipopeptidové zahrnující daptomycin. Daptomycin má silnou baktericidní aktivitu in vitro proti klinicky důležitým grampositivním baktériím, způsobujícím vážné, život ohrožující onemocnění. Tyto bakterie zahrnují resistentní pathogeny, jako jsou enterokoky resistentní vůči vankomycinu (VRE), Staphylococcus aureus resistentní vůči methicilinu (MRSAj, \

• · • ·· ·

Staphylococcus aureus s glykopeptidem zprostředkovanou vnímavostí (GISA), stafylokoky negativní vůči koaguláze (CNS) a Streptococcus pneumoniae resistentní vůči penicilinu (PRSP), pro které je jen velmi málo terapeutických alternativ. Viz např. Tally et al., 1999, Exp. Opin. Invest. Drugs 8: 1223-1238, dále zmiňovaný jako „Tally. Inhibiční efekt daptomycinu je rychlý, vykazující koncentračně závislé působení in vitro i in vivo a dále relativně dlouhodobý koncentračně závislý post-antibiotický efekt in vivo.

Daptomycin je popsán v Baltz, Biotechnology of Antibiotics, 2. vydání, ed. W. R. Strohl (New York, Marcel Dekker, Inc.), 1997, str. 415-435, dále označovaný jako „Baltz. Daptomycin, také známý jako LY 146032, je cyklické lipopeptidové antibiotikum, které může být získáno fermentací Streptomyces roseosporus. Daptomycin je členem typu antibiotik Streptomycin roseosporus, majících faktor A21978C₀ a skládá se z dekanoylového postranního řetězce připojenému k N-terminálnímu tryptofanu cyklického peptidu obsahujícího 13 aminokyselin (Obr.l). Daptomycin má vynikající aktivitní profil, protože je vysoce efektivní vůči většině gram-positivních baktérií, je vysoce baktericidní a rychle působící, má nízký podíl resistence a je účinný vůči organismům resistentním proti antibiotikům. Sloučenina byla v současnosti rozvinuta do celé řady přípravků pro léčení vážných infekcí způsobených bakteriemi, zahrnujících (výčet není vyčerpávající) Staphylococcus aureus resistentní vůči methicilinu (MRSA) a enterokoky resistentní vůči vancomycinu (VRE).

Mnoho americký patentů popisuje A-21978C antibiotika a jejich deriváty včetně daptomycinu (LY 146032), stejně jako způsoby výroby a izolace A-21978C antibiotik a jejich derivátů.

• · • ·

United States patenty Re. 32,333, Re. 32,455 a 4.800.157 popisují způsob syntézy daptomycinu kultivací Streptomyces roseosporus NRL 15998 za podmínek aerobní fermentace. United State patent 4.885.243 popisuje upravenou metodu přípravy daptomycinu, při které se fermentační kultura živí dekanou mastnou kyselinou, jejím esterem nebo solí.

United States patenty Re. 32310, Re.32.311, 4.537.717, 4.482.487 a 4.524.135 popisují způsoby deacylace antibiotika A-21978C a reacylace peptidového jádra a antibiotických derivátů připravených tímto způsobem. Všechny tyto patenty popisují čištěné deacylované jádro antibiotika A-21978C nebo jeho deriváty, které se izolují z fermentační kapaliny filtrací a poté čištěním pomocí Diaion HP-20 chromatografie a chromatografie na silikagel/C18.

United States patenty Re. 32.333 a Re. 32.455 popisují způsob čištění, při kterém se filtrát celé fermentační kapaliny čistí mnoha srážecími a extrakčními kroky za vzniku surového komplexu A-21978C. Surový komplex se dále čistí pomocí iontově výměnné chromatografie na IRA-68 a pomocí dvoukolové chromatografie na silikagelu. Individuální A21978C faktory byly separovány pomocí chromatografie na reverzní fázi s využitím silikagelu nebo silikagel/C18. United States patenty Re. 32.333 a Re. 32.455 také popisují, že A-21978C může být čištěn dávkovou chromatografií s využitím Diaion HP-20 pryskyřice, následované chromatografií na silikagelové koloně.

United States patent 4.874.843 popisuje způsob čištění daptomycinu, při kterém se fermentační kapalina zfiltruje a protlačí přes kolonu obsahující pryskyřici HP-20. Po eluování se částečně vyčištěný daptomycin protlačí přes kolonu obsahující HP-20ss a poté se opět separuje na HP-20 pryskyřici. Patent 4.874.843 říká, že finální resoluce a • · · · · · separace daptomycinu ze strukturně podobných sloučenin pomocí této metody je znesnadňována přítomností nečistot, které nejsou identifikovatelné pomocí ultrafialové analýzy fermentační kapaliny. Patent '843 dále říká, že pokusy o odstranění těchto nečistot pomocí silikagelové chromatografie na reverzní fázi, chromatografii na silikagelu s normální fází nebo pomocí iontově výměnné chromatografie nebyly úspěšné při zvyšování čistoty daptomycinu. Patent '843 dále popisuje „reverzní metodu čištění zahrnující kroky kontaktování vodného roztoku fermentačního produktu s nefunkční pryskyřicí ve vodné fázi, fyzikální odstranění vody z pryskyřice, opětovné zvlhčení pryskyřice s polárním organickým rozpouštědlem, promytí pryskyřice organickým rozpouštědlem, eluování fermentačního produktu z pryskyřice zvyšováním polarity rozpouštědla a získání fermentačního produktu. Patent '843 popisuje, že tato metoda upravuje finální čistotu z asi 80% na asi 93% a zvyšuje výtěžek z asi 5% na 35%, ovšem patent '843 nepopisuje typ nečistit přítomných v daptornycínovém preparátu.

United States patent 5.912.226 popisuje identifikaci a izolaci dvou nečistot během přípravy daptomycinu. Daptomycin, cc-aspartylpeptid, se transpeptiduje za vzniku stabilního intermediátu, ve kterém se aspartylová skupina stává anhydrosukcinimidoskupinou (Obr. 3). Patent '226 říká, že přítomnost tohoto intermediátu, označovaného jako anhydro-daptomycin, je zvýšený při pH 4-6. Rehydrace anhydro-sukcinimidové formy poskytuje druhý degradační produkt, obsahující β-aspartylovou skupinu a je označován jako β-isomerní forma daptomycinu (Obr. 2).

Patent 5.912.226 popisuje, že t-BOC derivát anhydrodaptomycinu může být izolován pomocí chromatografie s reverzní fází na koloně obsahující silikagel/C-18, srážením • · ··· · • · · • · · • · · • · · · · · a dalším čištěním pomocí silikagel/C-18 chromatografie s reverzní fází. Patent 5.912.226 také popisuje, že βizomerní forma daptomycinu může být chromatografována na pryskyřici Diaion HP-20ss, odsolena chromatografií na Diaion HP-20 a dále čištěním pomocí chromatografie s reverzní fází na C-18 koloně následované kolonou s HP-20 pryskyřicí v reverzním módu.

Kirsch et al. (Pharmaceutical Research, 6:387-393, 1989, dále označovaný jako „Kirsch) uvedl, že anhydro-daptomycin a β-isomer byly získány při čištění daptomycinu. Kirsch popsal metody minimalizace koncentrace anhydro-daptomycinu a βisomeru prostřednictvím manipulace s hodnotami pH a teplotou. Ovšem Kirsch nebyl schopen stabilizovat daptomycin a zabránit jeho konverzi na anhydro-daptomycin a jeho následné isomerizaci na β-isomer. Kirsch také nebyl schopen zabránit degradaci daptomycinu na další degradační produkty, které nejsou příbuzné s anhydro-daptomycinem a β-isomerem.

Patent '226 říká, že daptomycin může být připraven s využitím popsaných procedur tak, že neobsahuje výše než celkem 2,5% hmotnosti anhydro-daptomycinu a β-isomeru, ovšem neuvádí žádné konkrétní koncentrace dalších nečistot. Ve způsobu popsaném v United States patent 4.874.843 a u přípravy daptomycinu pro klinické testování ve velkém měřítku, byla nejvyšší pozorovaná koncentrace kolem 90 až 93%. Je tedy potřeba komerčně vhodné metody přípravy mnohem čistšího daptomycinu a pokud je to možné, i zvýšeni jeho výtěžku po čištění. Dále by bylo vhodné získávat daptomycin, který by obsahoval méně nebo vůbec žádný anhydro-daptomycin a β-isomerní formu daptomycinu. Bylo by také žádoucí snížit koncentrace dalších nečistot v daptomycinu. Ovšem, v současném stavu techniky není dostupná žádná metoda, která •· ···· by byla schopna dále snížit koncentrace anhydro-daptomycinu, β-isomerní formy a produktu.

dalších nečistot v daptomycinovém

Podstata vynálezu

Předložený vynález řeší zmíněné problémy tím, že poskytuje komerčně zajímavé způsoby přípravy vedoucí k vysokým stupňům čistoty lipopeptidů. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycin nebo lipopeptid příbuzný daptomycinu. V jednom provedení tohoto vynálezu je popsána komerčně vhodná metoda, vedoucí k daptomycinu o stupni čistoty 95-97%. V dalším provedení tohoto vynálezu je popsána komerčně příhodná metoda, která téměř zcela eliminuje hlavní nečistoty anhydro-daptomycin a β-isomer, stejně jako další nečistoty při přípravě daptomycinu. V dalším provedení tohoto vynálezu jsou popsány komerčně přijatelné metody čištění lipopeptidů, včetně daptomycinu nebo lipopeptidů příbuzných s daptomycinem, zahrnující oddělení lipopeptidových micel od nízko molekulárních kontaminantů a separaci lipopeptidových micel od vysokomolekulárních nečistot. Vynález také zajišťuje způsob analýzy čistoty daptomycinu pomocí vysokorozlišovací kapalinové chromatografie a dále detekci a charakterizaci dalších nečistot v daptomycinu, z nichž některé byly dosud neznámé.

Vynález také zajišťuje čištěný daptomycin, který vykazuje čistotu alespoň 98% nebo který je v podstatě zbaven anhydro-daptomycinu a β-isomeru. Vynález zajišťuje čištěný daptomycin, který je prakticky zbaven anhydro-daptomycinu a ♦ # • · * · • 9

který obsahuje mnohem nižší koncentrace β-isomeru a dalších kontaminantů, než bylo možné dosáhnout v současném stavu techniky. Vynález také zajišťuje lipopetidové micely. V preferovaném provedení vynálezu micely zahrnují daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid. Vynález také zajišťuje farmaceutický přípravek zahrnující vysoce čistý daptomycin nebo micely obsahující daptomycinu příbuzný lipopeptid a způsoby využití těchto přípravků.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje strukturu daptomycinu.

Obrázek 2 zachycuje strukturu nečistoty 8, CB-131010 (dříve identifikovaný jako β-isomer, LY 213846).

Obrázek 3 ukazuje strukturu nečistoty 13, CB-130952 (dříve identifikovaný jako anhydro-daptomycin, LY178480).

Obrázek 4	ukazuje předpokládanou	strukturu	nečistoty	1,
CB-131012 (dříve identifikovanou jako	LY212218).
Obrázek 5	ukazuje předpokládanou	strukturu	nečistoty	2,
CB-131011.
Obrázek 6	ukazuje předpokládanou	strukturu	nečistoty	3,
CB-131008 (dříve identifikovanou jako	LY213928).
Obrázek 7	ukazuje předpokládanou	strukturu	nečistoty	4,
CB-131006.
Obrázek 8	ukazuje předpokládanou	strukturu	nečistoty	6,
CB-130989 (dříve identifikované jako LY213827).
Obrázek 9	ukazuje předpokládanou	strukturu	nečistoty	7,

CB-131005.

Obrázek 10 ukazuje předpokládanou strukturu nečistoty

12, CB-131009.

Obrázek 11 ukazuje předpokládanou strukturu nečistoty 14, CB-131078 (dříve identifikovanou jako LY109208).

•4 ··· 4 • 4 4 4944 4444

	8	4 4 4 • 4 4 9 9 9	444 9 ♦ · • 4 94 44 4944
Obrázek	12	ukazuj e	HPLC	chromatogram	přípravy
daptomycinu	(velké	měřítko),	včetně	nečistot 1 až 14	•
Obrázek	13	ukazuj e	HPLC	chromatogram	přípravy
daptomycinu	po čištění na pryskyřici	Poros P150.

Obrázky 14A až 14C ukazují micelární struktury. Obrázek 14A ukazuje sférickou micelu, ve které jsou hydrofobní konce amfifilních molekul orientovány dovnitř směrem ke středu, zatímco hydrofilní hlavy amfifilních molekul jsou směrovány ven z micely a jsou v kontaktu s vodným prostředím. Obrázek 14A ukazuje příklad, ve kterém jsou hydrofilní hlavy s negativním nábojem. Obrázek 14B ukazuje lipidickou dvojvrstvou strukturu, ve které jsou dvě vrstvy amfifilních molekul orientovány tak, že hydrofobní konce každé vrstvy jsou orientovány vůči sobě navzájem, zatímco hydrofilní hlavy jsou na obou stranách dvoj vrstvy a jsou v kontaktu s vodným prostředím. Lipidické dvojvrstvy mohou být buď kulovité nebo rovinné. Obrázek 14C ukazuje liposom, ve kterém je lipidická dvojvrstva, jako třeba ta na Obrázku 14B, ve formě kulovité struktury uzavírající uvnitř vodné prostředí. Hydrofilní hlavy liposomu jsou na vnitřní straně (interiér) a na vnější straně v kontaktu s vodným prostředím (exteriér).

Obrázek 15 ukazuje výsledky pokusu o určení kritické micelární koncentrace (cmc) daptomycinu při pH 4.0.

Obrázek 16 ukazuje distribuci velikosti částic daptomycinových micel pomocí rozptylu světla. Daptomycinové micely mají průměrnou velikost částic 5.4 nm (54 A).

Detailní popis vynálezu

Předmět vynálezu

Jedním z předmětů tohoto vynálezu je zajištění způsobu čištění lipopeptidů, který je snadno rozšiřitelný na měřítko komerční výroby zahrnující unikátní kombinaci anion-výměnné

00 > 0 0 1

I · <

*0 0000

0000 chromatografie a chromatografie využívající hydrofobní interakce. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je popsán způsob výroby čištěného daptomycinu, jehož čistota je vyšší než 95% a který vykazuje snížené koncentrace nečistot ve srovnání s daptomycinem připraveným postupy známými v současném stavu techniky. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu je popsán způsob výroby daptomycinu, využívající snížené hodnoty rozpouštědel ve srovnání se současným stavem techniky. V dalším provedení vynálezu je popsán způsob čištění daptomycinu příbuzných lipopeptidů, majících vyšší než 95% čistotu.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je zajištění způsobu zvyšování koncentrace lipopeptidů, vzniklých vyživováním mikroorganismů fermentační kultury se sníženými koncentracemi mastné kyseliny. Použití nižších koncentrací děkanové kyseliny než bylo popsáno v United States patent 4.885.243 vede ke zlepšení ekonomiky, kromě toho, že se vyrobí vysoce čistá forma daptomycinu nebo daptomycinu příbuzného lipopeptidů. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je popsán způsob zvýšení koncentrace a množství daptomycinu vyrobeného Streptomyces roseosporus, přičemž je minimalizována produkce odpovídajících nečistot. Nižší úroveň kontaminantů ve fermentační kapalině vede k efektivnějšímu získávání a čištění daptomycinu, čímž je zajištěn způsob výroby s vyšším výtěžkem.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je zajištění způsobu čištění daptomycinu nebo daptomycinu příbuzných lipopeptidů, zahrnující použití modifikované pufrem zvýšené anion-výměnné chromatografie. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je popsán způsob výroby daptomycinu s čistotou alespoň 98% nebo takového, který je v podstatě zbaven anhydro-daptomycinu nebo β-isomeru. V dalším preferovaném provedení vynálezu je popsán ·· φφ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφ φφ··

φφφ φ φ φφφφ způsob čištění daptomycinu příbuzných lipopeptidů o čistotě alespoň 98%.

Dalším předmětem vynálezu je zajištění chromatografické metody čištění lipopeptidů, zahrnující novou kombinaci anionvýměnné chromatografie, chromatografie využívající hydrofobní interakce a anion-výměnnou chromatografií zesílenou pufrem.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu je popsán způsob chromatografického čištění daptomycinu nebo daptomycinu příbuzných lipopeptidů. Modifikovaný pufr nečekaně dovoluje separaci anhydro-daptomycinu od daptomycinu, která nebyla možná s využitím dosud známých chromatografických metod.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je zajištění způsobu čištění lipopeptidů, který je snadno rozšiřitelný pro výrobu lipopeptidových micel v komerčním měřítku. V jednom provedení tohoto vynálezu je popsán způsob výroby zahrnující převedení lipopeptidového roztoku z monomerního nemicelárního stavu do micelárního stavu a poté zpátky během čistícího procesu.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu zahrnuje způsob výroby vystavení lipopeptidů takovým podmínkám, při kterých se tvoří micely, separaci lipopeptidových micel od nízkomolekulárních kontaminantů, např. pomocí technik separujících na základě velikosti. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu způsob zahrnuje podrobení lipopeptidů takovým podmínkám, při kterých jsou lipopeptidy v monomerní formě a separaci monomerního lipopeptidů od molekul s vyšší molekulovou hmotností nebo od agregátů, např. pomocí separačních technik dělících na základě různé velikosti. V preferovanějším provedení vynálezu zahrnuje způsob oba kroky: podrobení lipopeptidů podmínkám, při kterých vznikají micely a separace lipopeptidových micel z nízkomolekulárních kontaminantů, a poté podrobení lipopetidových micel podmínkám, při nichž jsou lipopeptidy ve

44

4 4 4 4

4 4

4«

4 • 44 4 • ··

4 • 444 44

444 4 formě monomerů a separace lipopeptidových monomerů od vysokomolekulárních molekul a agragátů. Tyto dva kroky mohou být provedeny v libovolném pořadí. V ještě preferovanějším provedení je separační metodou ultrafiltrace nebo sizeexclusion chromatografie.

Dalším objektem tohoto vynálezu je zajištění vylepšené metody měření čistoty lipopeptidů, včetně daptomycinu, pomocí vysokorozlišovací kapalinové chromatografie (HPLC).

Dalším předmětem tohoto vynálezu je zajištění čištěných lipopeptidů, jako je daptomycin nebo daptomycinu příbuzné lipopeptidy a jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo přípravky je obsahující. V preferovaném provedení tento vynález popisuje daptomycin nebo daptomycinu příbuzné lipopeptidy, čištěné jedním ze způsobů popsaných v tomto vynálezu. Tento vynález se také týká farmaceutických přípravků čištěného lipopeptidů nebo jeho soli a způsobů podávání těchto přípravků. V preferovaném provedení tohoto vynálezu farmaceutický přípravek zahrnuje čištěný daptomycin.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je zajištění lipopeptidových micel a jejich farmaceuticky přijatelných přípravků. V preferovaném provedení se tento vynález týká daptomycinových micel nebo micel z daptomycinu příbuzných lipopeptidů a jejich farmaceuticky přijatelných přípravků. V dalším provedení se vynález také týká způsobu podávání lipopeptidových micel nebo jejich přípravků potřebným pacientům. V preferovaném provedení tohoto vynálezu se lipopetidové micely podávají intravenosně, parenterálně, intramuskulárně nebo místně.

Definice

Pokud není definováno jinak, všechny technické a vědecké termíny použité v tomto vynálezu mají význam, který je

44· > ·· • 4 «

4«

44

4 4 4

4 4

44 4 44 »4 4444 obvyklý pro odborníky v oboru jimž je tento vynález určen. Provedení tohoto vynálezu používá pokud není uvedeno jinak konvenční techniky chemie, biochemie a mikrobiologie a základní terminologii zde použitou.

Termín „izolovaný označuje sloučeninu nebo produkt, který odpovídá sloučenině reprezentující nejméně 10%, s výhodou alespoň 20% nebo 30%, výhodněji alespoň 50%, 60% nebo 70% a nejvýhodněji alespoň 80% nebo 90% sloučeniny přítomné ve směsi.

Termín „lipopeptid označuje molekulu zahrnující lipidovou skupinu kovalentně vázanou na peptidovou skupinu, stejně jako její soli, estery, amidy a ethery. Termín „lipopeptid také zahrnuje chráněné formy lipopeptidů, kde je jedna nebo více aminoskupin, karboxylových skupin nebo hydroxylových skupin ochráněna. Příklady chránících skupin viz např. „Protective Groups in Organic Synthesis (Theodora W. Greene), John Wiley and Sons, New York, 1981. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je lipopetidem antibiotikum. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem LY 303366, echinocandins, pneumocandins, aculeacins, surfactin, plipastatin Bl, amphomycin nebo lipopetidový derivát popsaný v United States patent 5.629.288. Tyto lipopeptidy jsou známé v současném stavu techniky. Viz např. United States patent 5.202.309 a mezinárodní patentovou přihlášku WO 00/08197 preferovaném provedení tohoto vynálezu je daptomycinu příbuzná molekula, včetně daptomycinu, A54145, daptomycinu příbuzný lipopetid popsaný v United States patentech 4.537.717, 4.482.487, Re. 32.311,

Re. 32.310, 5.912.226, v současné době ve znovu podaném

United States ser. č. 09/547.357, mezinárodní patentové přihlášce WO 01/44272, WO 01/44271, které jsou zde všechny

V dalším lipopetid (mimo jiné) • · »φ »»»♦ • * φ • · • φ φ · » φ φ · φ φ φ

ΦΦ ΦΦ • · · · • · ΦΦ • · » φ

ΦΦ ΦΦ zahrnuty jako reference, nebo antibiotikum A-21978, ve kterém je n-dekanoylový postranní řetězec daptomycinu nahrazen noktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, ndodekanoylovým, n~tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem. Daptomycinu příbuzné lipopeptidy popsané ve WO 01/44272, WO 01/44274 a WO 01/44271 se vztahují k syntetickým a semisyntetickým lipopeptidům, kde jsou modifikovány ornithinové nebo kynurinové zbytky nebo postranní řetězec mastné kyseliny. V ještě preferovanějším provedení je lipopeptidem daptomycin. Termín daptomycinu příbuzný lipopeptid označuje sloučeniny výše popsané a jejich soli.

Termín „daptomycin označuje n-dekanoylový derivát antibiotického faktoru A-21978Co nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli. „Daptomycin je synonymum s LY146032. Viz. Obrázek 1.

Termín „anhydro-daptomycin označuje daptomycinový derivát, kde je cc-aspartylová skupina daptomycinu transpeptidována na anhydro-sukcinimidovou skupinu.

Termín „β-isomer nebo „β-isomer daptomycinu označuje daptomycinové deriváty, které obsahují β-aspartylovou skupinu namísto α-aspartylové skupiny. Viz Obrázek 2.

Daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid je „v podstatě čistý, když alespoň 95% vzorku je daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid. S výhodou, daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid je „prakticky čistý, když alespoň 97% vzorku je daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid.

Daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid je „prakticky čistý, když alespoň 98% vzorku je daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid. S výhodou, daptomycin nebo »**· • * · • » • · • 9 · •re· ·· ·· • · ·

A · ·· »* > · · • e • · · ·· e»« daptomycinu příbuzný lipopeptid je „prakticky čistý, když alespoň 99% vzorku je daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid.

Daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid je „prakticky zbaven další látky, když další sloučenina je přítomna v množství, které není vyšší než 1% hmotnosti daptomycinu nebo daptomycinu příbuzného lipopeptidového přípravku.

Daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid je „v podstatě zbaven další sloučeniny, když další sloučenina je přítomna v množství, které není vyšší než 0,5% hmotnosti daptomycinu nebo daptomycinu příbuzného lipopeptidového přípravku.

Daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid je „zbaven další látky, když další sloučenina je přítomna v množství, které není vyšší než 0,1% hmotnosti daptomycinu nebo daptomycinu příbuzného lipopeptidového přípravku. Alternativně, daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid je „zbaven další sloučeniny, když tato sloučenina nemůže být detekována pomocí HPLC za podmínek maximální citlivosti, při kterém je detekční limit přibližně 0,05% nebo nižší množství daptomycinu nebo daptomycinu příbuzného lipopeptidového přípravku. Příklady HPLC metod jsou popsány dále (Tabulka 1 a 2) .

„Čištěný daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid označuje prakticky čistý daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid, v podstatě čistý daptomycin nebo daptomicinu příbuzný lipopeptid nebo jejich soli nebo daptomycin, daptomycinu příbuzný lipopeptid nebo jejich soli, které jsou v podstatě čisté nebo zbavené další sloučeniny.

• 9 • · ·

9 «9 99W9 *9 99 « 9 9 · · · • · 9 9 99 • 9 9 · 9 9 9 «·9· ·· ·« 99 · 9 • 9 999· „Částečně čištěný daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid označuje daptomycin, daptomycinu příbuzný lipopeptid nebo jejich sůl, která má nižší než 90% čistotu.

Čistota daptomycinu, daptomycinu příbuzného lipopeptidu nebo jiného lipopeptidu označuje lipopeptid před jeho formulováním do farmaceutického přípravku. Čistota může být měřena libovolným prostředkem včetně nukleárně magnetické resonance (NMR), plynové chromatografie/hmotnostní spektroskopie (GC/MS), kapalné chromatografie/hmotnostní spektroskopie (LC/MS) nebo mikrobiologickým stanovením. Preferované prostředky pro měření čistoty daptomycinu je analytická vysokorozlišovací kapalinová chromatografie (HPLC).

Termín „micela označuje agregáty amfifilních molekul. Ve vodném prostředí je lipofilní doména molekul agregátů orientována proti interiéru micelu a hydrofilní domény jsou v kontaktu s mediem. Struktury micel zahrnují (výčet není vyčerpávající) sférické, laminární, cylindrické, elipsovité, vesikulární (liposomální), lamerální a kapalné krystaly. Viz Obrázek 14.

Termín „smíšené micely označuje konkrétní typ micely, ve kterém micela obsahuje více než jeden typ amfifilní molekuly. V kontextu tohoto vynálezu smíšené micely obsahují lipopeptid a alespoň jednu další amfifilní molekulu, kterou může být další lipopeptid. Smíšené micely obsahují alespoň 10% lipopeptidu (hmotnostní%). V dalších provedeních obsahují smíšené micely alespoň 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% nebo 90% lipopeptidu.

Termín „micelární roztok označuje roztok, ve kterém více než 50% molekul lipopeptidu v roztoku je přítomno v micelách (hmotnostní údaje). S výhodou, alespoň 60%, 70%, 80%, 90% nebo 95% molekul je ve formě micel. Micelární roztok • · • · · · · · • · · · · · se zachycuje na ultrafiltrační membráně, pokud je vyrobena (cutoff) pro nominální molekulovou hmotnost 10000 dalton.

Termín „kritická micelární koncentrace (cmc) označuje určitou koncentraci molekul, která závisí na teplotě, koncentraci soli a typu amfifilní molekuly. Nad cmc existují v rovnováze neasociované molekuly a micely.

Termín „monomer označuje amfifilní molekulu, která není částí agregátu, ovšem která existuje jako jediná molekula. V kontextu tohoto vynálezu označuje termín monomer neasociovaný lipopeptid.

Termín „monomerní roztok označuje roztok, ve kterém je více než 50% lipopeptidových molekul přítomno ve formě monomeru (hmotnostní údaje). S výhodou, alespoň 60%, 70%, 80%, 90% nebo 95% je přítomno ve formě monomeru. Monomerní roztok není zachycen na ultrafiltrační membráně, pokud je vyrobena (cutoff) pro nominální molekulovou hmotnost 10000 dalton, a spíše touto membránou prochází.

Termín „pufr s nízkou iontovou silou označuje roztok, který má koncentraci soli pod 50 nM, termín „pufr se střední iontovou silou označuje roztok mající koncentraci soli mezi 50 až 250 mM, termín „pufr s vysokou iontovou silou označuje roztok mající koncentraci soli vyšší než 250 mM.

Způsoby výroby čištěných lipopeptidů

Jedno provedení tohoto vynálezu popisuje chromatografickou metodu, která produkuje čištěný lipopeptid komerčně zajímavým způsobem. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid. Způsob chromatografické metody zahrnuje sekvenční použití anion-výměnné chromatografie, chromatografie s hydrofobními interakcemi (HIC) a anion-výměnné • · · · • · chromatografíe k čištění přípravků obsahujících lipopeptid jako je daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu způsob čištění dále zahrnuje změnu fermentačních podmínek, kdy vzniká A21978C obsahující surový produkt pomocí Strptomyces roseosporus, za účelem zvýšení produkce daptomycinu a snížení koncentrace nečistot a odpovídajících kontaminantů, vyráběných fermentační kulturou S. roseosporus.

Preferované provedení způsobu chromatografické metody je popsáno dále:

Streptomyces roseosporus je fermentován s živnou ndekanovou kyselinou, podle popisu v United States patent 4.885.243, s modifikací kdy dekanová kyselina byla udržována na co nejnižších koncentracích bez toho, aby to ovlivnilo celkový výtěžek fermentace. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je udržována zbytková kyselina dekanová během aerobní fermentace na koncentraci nižší než 50 part per milion (ppm). V ještě preferovanějším provedení je udržována zbytková kyselina dekanová během aerobní fermentace na koncentraci nižší než 20 part per milion (ppm) . V preferovaném provedení tohoto vynálezu je udržována zbytková kyselina dekanová během aerobní fermentace na koncentraci přibližně 10 part per milion (ppm). V preferovaném provedení tohoto vynálezu se koncentrace zbytkové děkanové kyseliny měří během fermentace a koncentrace živného roztoku děkanové kyseliny se adjuštuje tak, aby koncentrace zbytkové děkanové kyseliny byla udržována během aerobní fermentace v rámci preferovaných parametrů. Současný stav techniky nepopisuje in sítu konkrétní a nízkou resiudální koncentraci děkanové kyseliny, požadovanou pro dosažení optimální exprese daptomycinu obsahujícího nízké koncentrace nečistot.

• · · · • ·

9» ····

Po fermentaci se extracelulární roztok vyčeří odstraněním mycelia od fermentační kapaliny. Odstranění mycelia od separačními fermentační kapaliny se provádí standardními centrifugace nebo technikami jako je mikrofiltrace. V preferovaném provedení tohoto vynálezu se fermentační kapalina čistí mikrofiltrací s využitím Pall Sep™ membránového systému. V preferovanějším provedení se fermentační kapalina čistí s využitím průmyslové centrifugy jako je Westfalia™, následované dokončením na hlubokém filtru. K odstranění mycelia od fermentační kapaliny mohou být použity další přístroje jako jsou filtrační lisy, rotační bubnové filtry nebo hluboké filtry pro jedno použití za vzniku čiré kapaliny vhodné pro sloupcovou chromatografii ve velkém měřítku.

V dalším provedení může být daptomycin extrahován z fermentace mycelia přímo s využitím organického rozpouštědla jako je butanol předtím než je vyčeřeno separací na odstředivce nebo filtru. Podle tohoto provedení může být pro extrakci použit libovolný alkohol mající čtyři nebo více atomů. Preferovaným rozpouštědlem je n-butanol. Využití organického rozpouštědla vede k dodatečnému čištění daptomycinu ve srovnání s čistě vodnou separací daptomycinu. Například, daptomycin se rozděluje do n-butanolu, je-li butanol použit v koncentracích vyšších než 10% a když je proces prováděn za podmínek, při kterých n-butanol vytváří oddělenou fázi, např. při hodnotách pH 4 až 5, což je blízko isoelektrického bodu daptomycinu (viz Příklad 4).

V dalším provedení se daptomycin vyrábí v imobilizovaném reaktoru, který využívá předem aktivované mycelium pro nefermentační produkci daptomycinu s využitím zdroje energie, s výhodou cukru, základních složek jako jsou aminokyseliny a amoniak a děkanova kyselina. Produkce daptomycinu v reaktoru • · · · · · • · · iontovou silou daptomycinových se čištěný daptomycin s imobilizovaným enzymem se poté provádí pomocí popsaných metod.

Po vyčeření fermentační kapaliny se koncentrace daptomycinu obohacuje (to jest zakoncentrovává se) pomocí anion-výměnné chromatografie. Vyčeřený roztok se nechá nejdříve kontaktovat s anion-výměnnou pryskyřicí za podmínek, kdy se většina daptomycinu váže na anion-výměnnou pryskyřici. Po navázání se pryskyřice promyje vodným pufrem s vhodnou kvůli odstranění nevázaného materiálu a nečistot. Nakonec vázaný na pryskyřici eluuje za podmínek, při nichž daptomycin disociuje z pryskyřice.

Navázání, promytí a eluování může být provedeno podle tohoto vynálezu s využitím pufrů a metod známých v Současném stavu techniky. Například, eluování může býtprovedeno s využitím pufru obsahujícího zvýšenou koncentraci soli ve srovnání s promývacím pufrem, s pufrem, který má nižší hodnotu pH ve srovnání s promývacím pufrem nebo s pufrem, který má jak vyšší koncentraci soli tak i nižší hodnotu pH než má promývací pufr. V preferovaném provedení tohoto vynálezu se daptomycin váže na anion-výměnnou pryskyřici, která byla předtím nechána reagovat s pufrem neobsahujícím žádnou přidanou sůl nebo obsahující pouze nízké koncentrace soli při neutrálním až bazickém pH. Pryskyřice se po navázání daptomycinu promyje trojnásobným objemem vody a poté šesti objemy pufru se středním obsahem soli obsahujícím 30 až 60 mM NaCl. Daptomycin je eluován z kolony s jedním až třemi objemy pufru se zvýšeným obsahem soli nebo s nižším pH obsahujícím 300 až 500 nM NaCl. Vyšší koncentrace chloridu sodného a alternativní soli jako je chlorid draselný bude také eluovat daptomycin z pryskyřice. V preferovaném provedení tohoto vynálezu se používá anionická výměnná pryskyřice s nižším tttt > · · · · · a eluována kontinuálním průtokem. V preferovanějším provedení se používá pryskyřice FP-DA 13 (Mitsubishi).

Anion-výměnná chromatografie může být prováděna pomocí chromatografické kolony nebo může být provedena v dávkovém módu. Pro komerční využití může být preferován dávkový mód. Anion-výměnná pryskyřice může být promyta postupných krokovým gradientem soli nebo gradientem. Vhodný krokový- nebo kontinuální gradient je takový, který dovoluje separaci daptomycinu od kontaminantů.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu se kontinuální solný gradient pohybuje v rozmezí od 0 do 1000 mM NaCl.

V preferovanějším provedení se kontinuální solný gradient pohybuje v rozmezí od 100 do 500 mM NaCl nebo do 0 do 400 mM NaCl. Může být také použita chromatotronová chromatografie (chromatografie s radiálním tokem) podle United States patentů 5.756.680, 4.865.729, 4.840.730 nebo 4.708.782.

Po anion-výměnné chromatografii je daptomycin dále čištěn pomocí chromatografie s hydrofobními interakcemi (HIC) . Jedno z provedení je popsáno v United States patentu 4.874.843, zahrnutém zde jako reference. Eluovaný daptomycinový přípravek se nechá kontaktovat s HIC pryskyřicí za podmínek, kdy většina daptomycinu nebo všechen daptomycin se váže na pryskyřici. Obsah vody pryskyřice s navázaným daptomycinem se sníží kontaktem pryskyřice se zvýšenou koncentrací nepolárního rozpouštědla. Pryskyřice se promyje s vhodným polárním organickým rozpouštědlem za podmínek, kdy nečistoty disociují z pryskyřice zatímco daptomycin zůstává navázán. Nakonec se daptomycinový preparát eluuje za podmínek, při kterých daptomycin disociuje z pryskyřice. Obecně se daptomycin eluuje s využitím rozpouštědel obsahujících pufr s nižší polaritou (vyšší koncentrace ·♦ ·· je HP-20ss specificky organickým polárního rozpouštědla) a/nebo s vyšší hodnotou pH než měl promývací pufr.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu se používá nefunkcionalizovaná pryskyřice HIC, kterou s malými částicemi. Vázaný daptomycin se odstraňuje z HP-20ss pryskyřice s fází s rozpouštědlem jako např. fází obsahující isopropylalkohol, acetonitril, butanol nebo jiné vhodné rozpouštědlo.

V preferovanějším provedení je daptomycin nasycen na pryskyřici, promývanou s acetátovým pufrem obsahujícím 10% acetonitrilu nebo ekvivalentního polárního rozpouštědla jako je isopropylalkohol. Daptomycinem nasycená pryskyřice se promývá s alespoň trojnásobným objemem pufru použitého pro ekvilibraci. Pryskyřice nasycená s daptomycinem se dále zbavuje dalších nečistot promýváním se třemi až šesti objemyacetátového promývacího pufru obsahujícího neeluující koncentraci polárního rozpouštědla. V preferovaném provedení tohoto vynálezu se daptomycinem nasycená pryskyřice promývá se 30% acetonitrilem nebo 45% isopropylalkoholem. Daptomycinem nasycená pryskyřice se eluuje s jedním až třemi pufru obsahujícího 35% nebo více více než 50% isopropylalkoholu.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu se daptomycin eluuje se 35% acetonitrilem při pH 4,0 až 5,0 nebo 55 až 60% isopropylalkoholem. V dalším provedení se daptomycinem nasycená pryskyřice eluuje s jedním až třemi objemy pufru při zvýšeném pH. V tomto provedení se pH pufru postupně zvyšuje, aby došlo k eluování různých sloučenin z kolony při různých hodnotách pH vzhledem k rozdílům v nábojích. Při zvýšeném pH, např. pH 6,0 až 7,0 se eluční koncentrace acetonitrilu snižuje na 10 až 20%. Podobně, při zvýšeném pH, např. 6,0 až 7,0, se eluční koncentrace isopropylalkoholu snižuje na 20 až objemy acetátového acetonitrilu nebo • · · 0 • · · · · 0 · • · · ··· 0 · • •00 · · · • · ·· 00 000 0

25%. Kontrola teploty, při které se provádí chromatografie, má také vliv na koncentraci rozpouštědla. Eluování při nižší teplotě, to jest za podmínek chlazení, vyžaduje zvýšené koncentrace rozpouštědla při všech hodnotách pH.

Po HIC se obsah organického rozpouštědlo v daptomycinovém preparátu sníží pomocí anion-výměnné chromatografie. V preferovaném provedení tohoto vynálezu se používá FP-DA 13, diskutovaný v tomto vynálezu.

Po druhé anion-výměnné chromatografii se čištěný daptomycin depyrogenuje, filtruje a koncentruje za chladících podmínek. Filtrování daptomycinu může být provedeno libovolnou metodou známou v oboru. V jednom provedení se filtrování a depyrogenace provádí pomocí:

i) vyvolání takových podmínek, při kterých je daptomycin v daptomycinovém roztoku v monomerním a nemicelárním stavu, ii) filtrování daptomycinového roztoku za podmínek, při kterých bude daptomycin přecházet přes filtr, ovšem pyrogeny pře filtr nebudou procházet, např. tak, že se daptomycinový roztok udržuje při pH 6,0 až 7,0 a zfiltrováním roztoku přes ultrafiltr, který je nastaven na hodnotu 3000 až 30000 NMW, iii) změnou podmínek daptomycinového roztoku tak, že daptomycin agreguje, např. změnou pH daptomycinového roztoku na 2,5 až 4,5, takže daptomycin tvoří mycely, iv) zfiltrováním daptomycinového roztoku za podmínek, při kterých bude daptomycin zůstávat na filtru, např. zakoncentrováním daptomycinu na ultrafiltru při 30000 NMW nebo méně, jako třeba na reverzní osmotické membráně, a

v) shromážděním depyrogenovaného daptomycinu.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu se daptomycin z kroku (íi) filtruje za tlaku přes ultrafiltr s hranicí molekulové hmotnosti 10000 dalton při pH přibližně 7 až 8. V preferovanějším provedení daptomycin prochází přes filtr, • ·· 4 • · • 44

44 • · · 1

4 ’ ovšem pyrogeny jako třeba lipopolysacharidy (LPS) nikoliv. Po počáteční ultrafiltraci se pH filtrátu sníží na hodnotu 2,5 až 4,5 a filtrát se zkoncentruje na ultrafiltru s hranicí 10000 MWCO na přibližně 120 mg/ml. Za těchto okolností daptomycin zůstává na filtru. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je pH substrátu 3,5. Po zkoncentrování je koncentrace daptomycinu adjustována na 105 mg/ml, je zkontrolována koncentrace endotoxinu a vzorek se plní do viálek za aseptických podmínek.

V dalším provedení se provádí reverzní osmotická nanofiltrace při pH 1,5 až 3,0. Nižší pH a chlazení se používají kvůli zabránění degradace čištěného daptomycinu. Daptomycin může být dále zfiltrován přes 0,2 μιη filtr kvůli snížení bionečistot a poté se lyofilizuje vcelku nebo ve viálkách.

Jako alternativa k výše uvedené ultrafiltračními a koncentračnímu kroku se eluované frakce obsahující daptomycin smíchají s butanolem (buď n-butanol, isobutanol nebo terč.butylalkohol) při pH přibližně 4,5 v poměru vyšším než jedna část butanolu na devět částí daptomycinového roztoku. V preferovaném provedení tohoto vynálezu se jeden díl butanolu smíchá se čtyřmi díly daptomycinového roztoku za vzniku 20% butanolového roztoku. Roztok daptomycinu v butanolu se nechá oddělit na organickou a vodnou fázi. Daptomycin přechází do organická fáze, která se oddělí. Dehydratace daptomycinu v organickém rozpouštědle může stabilizovat daptomycin a zabraňovat degradaci čištěného daptomycinu na anhydrodaptomycin a následnému vzniku βisomeru. Nakonec může být daptomycin vrácen do vodné fáze přídavkem pufru o hodnotě pH 6,5 až 7,5 do roganické fáze. Po zkoncentrování nebo shromáždění daptomycinu se daptomycin lyofilizuje.

·· ·· φφ φφ • · · · φφφφ φ φ φφ φ φ · • ..··♦·*·· φ • · · φ φ φ φ φφφ • · · · φ · · · φφ φφ φφφφ

LY303366, surfactin,

V dalším provedení tohoto vynálezu se používá chromatografická metoda pro čištění lipopeptidů jiných než dqaptomycinu, jako jsou třeba A54145, echinocandiny, pneumocandiny, aculeacin, plipastatin Bl, amphomycin nebo lipopeptidový derivát popsaný v United States patentu 5.629.288. V dalším provedení se používá způsob čištění pomocí chromatografie pro čištění daptomycinu příbuzných lipopeptidů, včetně A54145 nebo lipopeptidů popsaného v United States patentech 4.537.717,

4.482.487, Re. 32.311, Re. 32.310, 5.912.226, který je v současné době vydány jako United States Seriál. No. 09/547.357, International PCT Applications WO 01/44272, WO 01/44274 a WO 01/44271 nebo antibiotika A-21978, kde je ndekanoylový postranní řetězec daptomycinu nahrazen noktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, ndodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem.

V dalším provedení tohoto vynálezu je použita „Salt Cloud Method (Genetic Engineering News, vol. 19, č. 20, str. 1, 34 a 43, (15. listopadu 1999)) při čištění daptomycinu nebo jiných lipopeptidů. Metoda „Salt Cloud je systém založený na membráně, který kombinuje selektivní separaci s vysokoobjemovou propustností. Metoda „Salt Cloud může být použita ve spojení s procesními kroky popsanými v tomto vynálezu nebo může být použita odděleně k čištění daptomycinu nebo jiných lipopeptidů.

Další provedení tohoto vynálezu se zabývá chromatografickou metodou, která produkuje vysoce čistý lipopeptid, nedosažitelný metodami známými v současném stavu techniky. Chromatografická metoda zahrnuje použití anionvýměnné chromatografie s modifikovaným pufrem k čištění preparátů obsahujících lipopeptid. V preferovaném provedení

99

4 4 4 • 4 · • 4 ·<·4

I ·* ♦ 4 * «4

494« tohoto vynálezu se metoda používá k produkci vysoce čistého daptomycinu nebo daptomicinu příbuzného lipopeptidů. Tato metoda, je-li použita na částečně čištěný daptomycin, produkuje daptomycin o čistotě alespoň 98%. Tento způsob také produkuje daptomycin, který je zbaven nebo prakticky zbaven anhydro-daptomycinu. Metoda zahrnuje následující kroky:

Částečně čištěný daptomycin se připraví libovolnou metodou známou v současném stavu techniky. Daptomycinový preparát se poté dále čistí pomocí anion-výměnné chromatografie zesílené modifikovaným pufrem. Daptomycin je navázán na anion-výměnnou pryskyřici v přítomnosti vhodného iontově modifikovaného pufru, za podmínek, při kterých se daptomycin váže na pryskyřici v monomerním nemicelárním stavu. Modifikovaný pufr zahrnuje pufrovací činidlo jako je např. (výčet není limitující) acetát, fosfát, citrát a TrisHCl nebo libovolné jiné pufrovací činidlo, které dobře pufruje při neutrálním pH. Modifikovaný pufr dále zahrnuje jedno nebo více chaotropických činidel, včetně (bez omezení) guanidinu, amoniaku, močoviny, silně redukční činidla, benzoát, askorbát nebo jiné činidlo zvyšující iontovou sílu, schopné modifikovat pufr tak, aby byl daptomycin snadno oddělen od nečistot. Daptomycinem napuštěná pryskyřice se promývá s vhodným iontově modifikovaným pufrem kvůli vymytí nečistot včetně anhydro-daptomycinu. Daptomycin se poté eluuje za podmínek, dovolujících separaci daptomycinu od nečistot, které zůstávají navázané k pryskyřici, včetně βisomeru.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu je modifikovaný pufr při neutrálním pH (pH = 6 až 8) a obsahuje 2 až 6 M močovinu. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu se používá anion-výměnná pryskyřice Porous Resin P150 nebo Porous D50 (PE Biosystems). Ve více preferovaném provedení

9999

tohoto vynálezu se používá anion-výměnná pryskyřice Porous P150. V preferovaném provedení tohoto, vynálezu se daptomycin váže na pryskyřici v pufru majícím nižší iontovou sílu, promyje se s pufrem o nízké až střední iontové síle a eluuje se s pufrem o vysoké iontové síle. V jednom z preferovaných provedení se daptomycin váže na pryskyřici Porous P150 v Tris pufru o pH 7,0 obsahujícím močovinu. Pryskyřice Porous P150 s navázaným daptomycinem se promyje trojnásobným objemem Tris pufru nebo jiného vhodného pufru obsahujícího takovou koncentraci soli, která odstraní kontaminanty a anhydrodaptomycin bez toho, aby byl eluován daptomycin. Daptomycin se eluuje z pryskyřice Porous P150 s Tris pufrem nebo jiným vhodným pufrem se zvýšeným obsahem solí, které nechají další nečistoty včetně významného podílu β-isomeru vázané na koloně. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu se používá pryskyřice Porous P150 a daptomycin se váže na pryskyřici v pufru o pH 6,0 obsahujícím 2M močoviny. Pryskyřice Porous P150 s navázaným daptomycinem se promyje a eluuje podobně jako ve výše popsané metodě, s tou výjimkou, že se použije acetátový pufr o pH 6,0 obsahující 2M močoviny. Frakce produktu mohou být měřeny pomocí HPLC nebo pomocí UV spektroskopie.

Anion-výměnná chromatografie s modifikovaným pufrem může být prováděna pomocí sloupcové chromatografie nebo může být provedena v dávkovém módu.

Může být také použita chromatografie s radiálním tokem, podle popisu v United States patentech 5.756.680, 4.865.729, 4.840.730 nebo 4.708.782. Anion-výměnná pryskyřice s modifikovaným pufrem může být promývána a eluována s krokovým solným gradientem nebo s kontinuálním solným gradientem. Vhodný krokový nebo kontinuální gradient je takový, který dovoluje separaci daptomycinu od nečistot, φ φ φφφ» •Φ φφ φφ φ φ φ φφφφ «φφφ • Φ φφφφ φφ ♦ ♦ ··· ·· ί * ; ί .

včetně (výčet není limitující) anhydro-daptomycinu a βisomeru. V preferovaném provedení tohoto vynálezu se používá kontinuální solný gradient od 0 do 1000 mM NaCl. V preferovanějším provedení se používá solný gradient 100 až 500 mM NaCl nebo 0 až 400 mM NaCl.

V dalším provedení tohoto vynálezu se používá anionvýměnná chromatografíe s modifikovaným pufrem pro čištění lipopeptidových sloučenin jiných než daptomycinu. Tyto lipopeptidové sloučeniny zahrnují (bez omezení) A54145, LY303366, echinocandiny, pneumocandiny, aculeacin, surfactin a plipastatin Bl (Tsuge et al. , 1996, Arch. Microbiol. 165: 243-51) a lipopeptidové deriváty uvedené v United States patentu 5.629.288. V dalším provedení se používá anionvýměnná chromatografíe s modifikovaným pufrem pro čištění daptomycinu příbuzných lipopeptidů jako jsou A54145 nebo lipopeptidů popsaných v United States patentech 4.537.717, 4.482.487, Re. 32.311, Re. 32.310, 5.912.226, v současné době vydaných jako United States Seriál. N. 09/547.357, International PCT přihlášky WO 01/44272, WO 01/44274 a WO 01/44271 nebo antibiotika A-21978, ve kterých je ndekanoylový postranní řetězec daptomycinu nahrazen noktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, ndodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem.

V dalším provedení tohoto vynálezu se používá nová kombinace chromatografických kroků k čištění daptomycinu nebo daptomycinu příbuzných lipopeptidů. Způsob zahrnuje anionvýměnnou chromatografií, chromatografií na reverzní fázi s malou velikostí částic a anion-výměnnou chromatografií s modifikovaným pufrem. Čistící metoda může dále zahrnovat změnu fermentačních podmínek, při kterých je surový produkt obsahující A21978C produkován pomocí Streptomyces

4« • 4 4 4

4 44 • 4 ·44 4

4 4

4444 4* ·

4444 roseosporus. Tyto metody produkují daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid, mající alespoň 98% čistotu.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu metoda produkuje daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid, který má vyšší než 98% čistotu.

Preferované provedení způsobu chromatografické metody je popsáno dále:

Streptomyces roseosporus je fermentován s přídavkem děkanové kyseliny, podle popisu v United States patentu 4.885.243, s tou modifikací, že se dekanová kyselina udržuje na co nejnižší koncentraci bez toho, že by to mělo negativní vliv na celkový výtěžek fermentace jak bylo popsáno výše.

V alternativním provedení mohou být použity jiné živné látky, pokud zajišťují n-dekanoylovou skupinu pro adici na daptomycinové jádro. Příklady těchto živných látek jsou (bez omezení)amid kyseliny děkanové, estery děkanové kyseliny včetně butylesterů, surové zdrojě kokosového nebo palmového oleje, živočišné zdroje děkanové kyseliny, různé soli děkanové kyseliny a petrochemické zdroje děkanové kyseliny. Po fermentaci se extracelulární kapalina vyčeří podle výše uvedeného popisu. V alternativním provedení může být daptomycin extrahován od mycelia s využitím organického rozpouštědla jako je n-butanol, před tím než se provede vyčeření na centrifuze nebo filtru podle výše uvedeného popisu. Po vyčeření fermentační kapaliny je koncentrace daptomycinu ve vyčeřeném roztoku obohacena nejdříve pomocí anion-výměnné chromatografie a poté pomocí HIC jak bylo popsáno výše.

Po provedení HIC se obsah rozpouštědla v daptomycinovém preparátu snižuje libovolnou metodou známou v oboru.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu se obsah organického rozpouštědla snižuje pomocí anion-výměnné chromatografie

4· • 4 4 · » ♦

4» 4«··

4 4 4 4

4 4 4 *

podle výše uvedeného popisu. Daptomycin by měl být z kolony eluován pufrem, kompatibilním s pufrem požadovaným pro anionvýměnnou chromatografii s modifikovaným pufrem. Alternativně, eluční pufr může být zaměněn za modifikovaný pufr pomocí reverzní osmosy nebo filtrací přes filtr s hranicí 10000 MWCO. V dalším provedení se obsah organického rozpouštědla snižuje odpařením nebo naředěním v pufru. Ve třetím preferovaném provedení tohoto vynálezu se rozpouštědlo z chromatografie na reverzní fázi a zbytková sůl odstraňují s využitím reverzní osmosy při pH 1,5 až 4,0 nebo ultrafiltrací při pH 2,5 až 4,5. Vznikající produkt může být zmrazen pro skladování ve velkém nebo sušen lyofilizací a poté rehydratován ve vodě nebo v pufru používaném pro anionvýměnnou chromatografii s modifikovaným pufrem.

Daptomycin je dále čištěn pomocí anion-výměnné chromatografie s modifikovaným pufrem jak bylo popsáno výše.

Po anion-výměnné chromatografie s modifikovaným pufrem je čištěný daptomycin filtrován a zkoncentrován za chlazení. Filtrování daptomycinu může být provedeno libovolnou známou metodou v současném stavu techniky. V preferovaném provedení tohoto vynálezu se daptomycin depyrogenuje a koncentruje podle výše uvedeného popisu. Alternativně, daptomycin může být zkoncentrovánpomocí reverzní osmosy za chlazení při pH 1,5 až 4. Nižší pH a chlazení se používají kvůli zabránění degradace čištěného daptomycinu.

Jako alternativa k výše uvedené filtraci a koncentraci nebo kromě těchto kroků, mohou být frakce obsahující daptomycin z anion-výměnné chromatografie s modifikovaným pufrem smíchány s butanolem (buď n-butanolem, isobutanolem nebo terč.butylalkoholem) při pH přibližně 4,5 v poměru vyšším než jeden díl butanolu na devět dílů daptomycinového roztoku. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je jeden

9«

9 «9 »»«*

I • 9 ♦

9 · ♦ 9*· 99

9« ♦«

9 9 9 • 9 ·<

9 9 9

9 9 · • 9 99

·»»· díl butanolu smíchán se čtyřmi díly daptomycinového roztoku za vzniku 20% butanolového roztoku. Butanolový roztok daptomycinu se nechá rozdělit na organickou a vodnou fázi. Daptomycin přechází do organické fáze, která je sebrána. Dehydratace daptomycinu v organickém rozpouštědle může stabilizovat daptomycin a zabraňovat degradaci čištěného daptomycinu na anhydro-daptomycin a následnému vzniku βizomeru.

Po zkoncentrování nebo sebrání daptomycinu je daptomycin lyofilizován.

V dalším provedení tohoto vynálezu se používá chromátografická metoda pro čištění lipopeptidů jiných než je daptomycin, jako jsou lipopeptidy popsané výše.

Vznik lipopeptidových micel a způsoby jejich použití

Další provedení tohoto vynálezu popisuje lipopeptidové micely, způsoby výroby lipopeptidových micel a způsoby použití lipopeptidových micel pro čištění lipopeptidů a farmaceutické přípravky. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycinu příbuzná molekula, včetně (mimo jiné) daptomycinu, A54145 a daptomycinu příbuzného lipopeptidů popsaného v United States patentech 4.537.717, 4.482.487, Re. 32.311, Re. 32.310, 5.912.226, který je v současné době vydány jako United States Seriál. No. 09/547.357, International PCT Applications WO 01/44272, WO 01/44274 a WO 01/44271 nebo antibiotika A-21978, kde je ndekanoylový postranní řetězec daptomycinu nahrazen noktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, ndodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem. V preferovanějším provedení je lipopeptidem daptomycin.

44 «4 4

4 *

4 4 ·

4 4 4

4* «4«· « · * • · *

• « · «44« 44

Λ 4 4 4

4 4« *4 4444

Micely jsou agregáty amfifilních molekul. Ve vodném prostředí se lipofilní části molekul orientují dovnitř interiéru micely a hydrofilní části molekul jsou v kontaktu s vodným prostředím. Micely se tvoří spontánně v roztoku obsahujícím amfifilní molekuly, pokud je koncentrace molekul dostatečně vysoká.

Vznik micel způsobuje změny v některých makroskopických fyzikálních vlastnostech roztoku, včetně změn v osmotickém tlaku, turbiditě, elektrické vodivosti, povrchovém napětí, iontových a proti-iontových aktivitách (v případě, že amfifilní molekuly jsou iontové), indexu lomu, UV a NMR spektrech, parciálním molárním objemu, viskozitě, difůzním koeficientu a rozpustnosti barev. Cmc může být určena měřením jedné nebo více fyzikálních vlastností závislých na tvorbě micel, jako funkce koncentrace amfifilní sloučeniny. Velikost a tvar micel může být určen dynamickým rozptylem laserového záření, ulreacentrifugací, viskozitou a/nebo rentgoenovou spektroskopií pod nízkým úhlem. Micely mohou existovat v kapalně krystalických fázích.

Lipopeptidy mohou agregovat do micel tehdy, když koncentrace lipopeptidů je vyšší než cmc daného lipopeptidů. Cmc je závislá na druhu lipopeptidů a teplotě, koncentraci soli a pH vodného roztoku obsahujícího lipopeptid. S ohledem na druh ůipopeptidu, cmc lipopeptidů se sníží přidáním CH2 skupiny k lipofilnímu uhlíkovému řetězci. Máme-li tedy cmc pro daptomycin při konkrétní koncentraci soli, teplotě a pH, potom antibiotikum typu A-21978, kde je dakanoylový postranní řetězec mastné kyseliny nahrazen n-oktanoylovým nebo nonanoylovým postranním řetězcem bude mít vyšší cmc, zatímco antibiotikum A-21978, kde je dakanoylový postranní řetězec mastné kyseliny nahrazen n-undekanoylovým, n-dodekanoylovým, ·* » « · • * ·

• · · •••4 ·· ·· ♦ t » » » · • 9 ·· • · · ·· ···· n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem bude mít nižší cmc ve srovnání s daptomycinem.

V jednom provedení tohoto vynálezu může být cmc lipopeptidů měněno přidáním nebo odebráním CH2 skupiny lipopeptidů. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem A-21978, ve kterém je n-dekanoylový postranní řetězec mastné kyseliny nahrazen n-oktanoylovým, nnonanoylovým, n-undekanoylovým, n-dodekanoylovým, ntridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem.

V dalším provedení lze vypočítat přibližnou hodnotu cmc lipopeptidů podle uvedených specifikací. Máme-li hodnotu cmc lipopeptidů jako je daptomycin, lze přibližně vypočítat hodnotu cmc příbuzného lipopeptidů, ve kterém je ndekanoylový postranní řetězec mastné kyseliny nahrazen noktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, ndodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem. Výpočet může být proveden způsoby známými odborníkům v oboru.

V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu, máme-li hodnotu cmc lipopeptidů, můžeme přibližně spočítat cmc lipopeptidů, který obsahuje odpovídající peptidovou skupinu.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu, máme-li hodnotu cmc pro daptomycin, lze jednoduše spočítat hodnotu cmc pro odpovídající lipopeptid jako je A54145, daptomycinu příbuzný lipopeptid popsaný v United States patentech 4.537.717, 4.482.487, Re. 32.311, Re. 32.310, 5.912.226, které jsou v současné době vydány jako United States Seriál. No. 09/547.357, International PCT Applications WO 01/44272, WO 01/44274 a WO 01/44271.

V dalším provedení tohoto vynálezu se cmc lipopeptidů mění změnou teploty roztoku obsahujícího lipopeptid. Cmc lipopeptidů obvykle vzrůstá se vzrůstající teplotou roztoku.

• · • ·

Tvorba micel je tedy zvýšena při snížené teplotě a je zabráněna při zvýšené teplotě. Například, roztok obsahující lipopeptid může tvořit micely při 4 °C, protože teplota cmc je snížena a koncentrace lipopeptidu je nad hodnotou cmc, ovšem, stejný roztok lipopeptidu může být monomerní při 20 °C, protože hodnota cmc se zvýšila s rostoucí teplotou a koncentrace lipopeptidu je pod cmc. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je tedy koncentrace lipopeptidu vyšší než cmc při jedné teplotě, a je nižší než hodnota cmc při jiné vyšší teplotě. V preferovanějším provedení je lipopeptidem daptomycin nebo daptomycinu příbuzná molekula jako třeba výše popsané deriváty. V ještě preferovanějším provedení je použitým lipopeptidem daptomycin.

V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu se schopnost manipulace se vznikem micel lipopeptidu provádí s využitím různých teplot, které ovlivňují hodnotu cmc při čištění lipopeptidu. V ještě preferovanějším provedení je lipopeptidem daptomycin nebo příbuzná molekula, jako třeba deriváty popsané výše. V ještě preferovanějším provedení je lipopeptidem daptomycin. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu se schopnost manipulovat se vznikem lipopeptidových micel pomocí změny teploty používá při výrobě farmaceutických přípravků, které jsou za určité teploty micelární a jsou monomerní za jiné teploty. V preferovaném provedení tohoto vynálezu zahrnují farmaceutické přípravky daptomycin nebo daptomycinu příbuznou molekulu, podle výše uvedeného popisu. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu zahrnuje farmaceutický přípravek daptomycin.

V dalším provedení tohoto vynálezu se používá přídavek elektrolytu pro zvýšení cmc iontového lipopeptidu. V preferovaném provedení tohoto vynálezu se sůl, jako třeba NaCl, přidává do roztoku obsahujícího lipopeptid, kvůli • ·

snížení repulze mezi nabitými skupinami v lipopeptidových micelách. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycin nebo daptomycinu příbuzná molekula, jako třeba výše uvedené deriváty. Například, peptidová skupina daptomycinu obsahuje tři zbytky asparagové kyseliny a L-threo-3-methylglutamové kyseliny (3-MG), které budou všechny nabité při neutrálním pH. Přídavek elektrolytu jako třeba NaCl nebo podobné soli, tedy bude zvyšovat cmc hodnotu daptomycinu. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je koncentrace soli nejméně 100 mM. V ještě preferovanějším provedení je koncentrace soli 150 mM až 300 mM. V ještě preferovanějším provedení je solí NaCl.

Snížení hodnoty cmc je také pozorováno při přídavku elektrolytu do jiných lipopeptidů, jako třeba u molekul příbuzných daptomycinu, které obsahují zbytky asparagové kyseliny, 3-MG zbytky nebo jiné nabité skupiny.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu se tedy sůl přidává do roztoku za účelem snížení cmc daptomycinu příbuzného lipopeptidů, jako třeba A54145, daptomycinu příbuzného lipopeptidů popsaného v v United States patentech 4.537.717, 4.482.487, Re. 32.311, Re. 32.310, 5.912.226, které jsou v současné době vydány jako United States Seriál. No. 09/547.357, International PCT Applications WO 01/44272, WO 01/44274 a WO 01/44271 nebo antibiotika A-21978, ve kterém je n-dekanoylový postranní řetězec mastné kyseliny nahrazen noktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, ndodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem. V dalším provedení se koncentrace soli snižuje za účelem zvýšení cmc iontového lipopeptidů.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu je iontovým lipopeptidem daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid podle výše uvedeného popisu.

• · • e • · ·· * .

• · · · • · · · ··

V dalším provedení se schopnosti manipulace se vznikem micel lipopeptidu pomocí změny koncentrace elektrolytu, a tím i ovlivňování cmc, využívá k čištění lipopeptidu. V ještě preferovanějším provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycin nebo daptomycinu příbuzná molekula, jako třeba deriváty popsané výše. V ještě preferovanějším provedení je lipopeptidem daptomycin. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu se schopnosti manipulovat s tvorbou lipopeptidových micel pomocí koncentrace elektrolytu, používá k výrobě farmaceutických přípravků, které jsou micelární při určité koncentraci elektrolytu a které jsou monomerní při jiné koncentraci elektrolytu. V preferovaném provedení tohoto vynálezu zahrnuje farmaceutický přípravek daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid, podle výše uvedeného popisu.

V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu zahrnuje farmaceutický prostředek daptomycin.

V dalším provedení tohoto vynálezu se manipuluje s pH roztoku obsahujícího lipopeptid za účelem ovlivnění cmc lipopeptidu. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid, jako třeba výše popsané struktury. V ještě preferovanějším provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycin.

V jednom provedení tohoto vynálezu je manipulováno s pH tak, abykoncentrace lipopeptidu byla vyšší než hodnota cmc při jednom pH a byla nižší než cmc při jiném pH. Například, pro daptomycin je hodnota cmc při pH 4 ve vodě o teplotě 2é až 25 °C mnohem menší než při pH 6,0 až 7,5. Při pH 4,0 je cmc za těchto podmínek přibližně 400 gg/ml. Viz. obrázek 15. Daptomycin je dále monomerní dokonce při 150 mg/ml při pH 6,5 (přičemž koncentrace soli je 150 mM až 300 mM NaCl a teplota je 4 °C) . Takže pro daptomycin je hodnota cmc při pH 4,0 menší než u roztoků buď při vyšším pH nebo při nižším pH.

♦ »

Změna cmc při různých hodnotách pH může být také použita pro další nabité lipopeptidy, včetně lipopeptidů, které jsou příbuzné daptomycinu podle výše uvedeného popisu.

V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu se schopnost manipulování se vznikem micel lipopeptidů změnou pH kvůli ovlivnění cmc používá k čištění lipopeptidů.

V preferovanějším provedení je lipopeptidem daptomycin nebo daptomycinu příbuzná molekula, jako třeba výše uvedené deriváty. V ještě preferovanějším provedení je lipopeptidem daptomycin. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu se schopnost manipulování se vznikem micel lipopeptidů změnou pH používá k výrobě farmaceutických přípravků, které jsou micelární při určitém pH a monomerní při jiném pH.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu farmaceutický přípravek zahrnuje daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid podle výše uvedeného popisu. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu zahrnuje farmaceutický přípravek daptomycin.

V dalším aspektu tohoto vynálezu může být lipopeptid částí smíšené micely. Smíšená micela je taková, kde lipopeptid vytváří micelu s jedním nebo více typy amfipatických molekul. Příklady amfipatických molekul zahrnují (bez omezení) mastné kyseliny se středním nebo dlouhým řetězcem, fosfoglyceridy (fosfolipidy), sfingomyelin, glykolipidy a cholesterol. V jednom provedení mohou být být do micely zabudovány alkoholy se střední délkou řetězce, kde zmenšují elektrostatickou repulzi a sterické bránění, čímž se snižuje cmc lipopeptidů. V dalším provedení může být použit přídavek jednoho nebo více typů amfipatických molekul kvůli změně struktury micely z micely sférické (viz Obrázek 14, část a) na planární lipidickou dvojvrstevnatou strukturu (viz Obrázek 14, část b) nebo na strukturu liposomu (viz Obrázek ·· ·· , » . <

I · ·♦ ····

14, část c) . Obecně, smíšené micely zahrnující fosfolipidy a/nebo glykolipidy budou způsobovat přeměnu sférických micel na lipidické dvojvrstevnaté struktury, které slouží jako permeabilní bariéry pro ionty a většinu polárních molekul.

V dalším provedení může být směsná micela vytvořena ze dvou nebo více různých lipopeptidů. Například, smíšené micela může být tvořena z daptomycinu a dalšího lipopeptidů jako třeba A54145 nebo daptomycinu příbuzného lipopeptidů podle výše uvedeného popisu. V dalším provedení může směsná micela zahrnovat lipopeptid společně s jedním nebo více terapeuticky užitečných amfipatických molekul, jako jsou antibiotika, protizánětlivá nebo protihoubová činidla, která jsou známa odborníkům v oboru. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid jako třeba A54145, daptomycinu příbuzné lipopeptidy popsané výše nebo antibiotikum A-21978, ve kterém je n-dekanoylový postranní řetězec mastné kyseliny nahrazen n-oktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, ndodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem.

V preferovanějším provedení je lipopeptidem daptomycin.

V dalším provedení tohoto vynálezu zahrnují micely, ať již směsné nebo z jednoho typu lipopeptidové molekuly, lipopeptid, který je terapeuticky užitečný. V preferovanějším provedení je lipopeptidem daptomycin. Daptomycin vytváří micely o velikosti přibližně 5,4 nm (54 Á) při koncentraci 1 mg/ml při pH přibližně 4,5 ve vodě. Viz Obrázek 16.

V dalším provedení tohoto vynálezu zahrnují micely jeden nebo více různých typů terapeutických látek. V jednom z provedení tohoto vynálezu může být terapeutická látka smíchána s lipopeptidem v roztoku tak, že vzniká micela lipopeptidů a terapeutická látka je uzavřena v hydrofobním ···· *♦ interiéru. V dalším provedení tohoto vynálezu se terapeutická látka smíchá s lipopeptidem a jednou nebo více amfipatickými molekulami tak, že vznikají smíšené micely z lipopeptidu a dalších amfipatických molekul a terapeutická látka se nachází v hydrofobním interiéru. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je terapeutickou látkou antibiotikum, protizánětlivé nebo protihoubové činidlo. V preferovanějším provedení tohoto vynálezu je terapeutickou látkou antibiotikum nebo protihoubové činidlo popsané výše. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu je terapeutická látka rozpustná v hydrofobním prostředí, ale není rozpustná ve vodném roztoku.

V další provedení tohoto vynálezu mohou být lipopeptidy formovány do liposomů, což jsou vesiculy, v nichž sférické lipidické dvojvrstvy ohraničují vodný interiér. Viz Obrázek 14, část c. Liposomy jsou výhodné pro terapeutické použití protože snadno fúzují s plasmatickou membránou a mohou být také použity k zachycení látek v jejich vnitřním vodném prostředí. Látky mohou být takové, které jsou ve vodě rozpustné. V jednom provedení tohoto vynálezu může být sonifikován roztok obsahující lipopeptid a další amfipatickou molekulu za vzniku liposomů. V dalším provedení tohoto vynálezu může být sonifikován samotný lipopeptid za vzniku liposomů. V preferovaném provedení tohoto vynálezu může být sonifikován roztok obsahující daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid jako třeba A54145, lipopeptid popsaný v United States patentech 4.537.717, 4.482.487, Re. 32.311, Re. 32.310, 5.912.226, v současné době vydané jako United States Seriál. No. 09/547.357, International PCT Applications WO 01/44272, WO 01/44274 a WO 01/44271 nebo antibiotika A-21978, kde je n-dekanoylový postranní řetězec daptomycinu nahrazen n-oktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, n• · dodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem. V preferovanějším provedení je lipopeptidem daptomycin.

V dalším provedení tohoto vynálezu zahrnují liposomy jednu nebo více terapeutických látek v jejich vnitřním vodném prostoru. V preferovaném provedení tohoto vynálezu jsou terapeutickou látkou antibiotika, protizánětlivá nebo protihoubová činidla. V ještě preferovanějším provedení je terapeutickou látkou antibiotikum nebo protihoubové činidlo podle níže uvedeného popisu. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu je terapeutické činidlo rozpustné ve vodném roztoku. V dalším preferovaném provedení tohoto vynálezu obsahuje farmaceutický přípravek liposomy.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu zahrnuje farmaceutický přípravek lipopeptidové uspořádání micelárního typu obsahující terapeutickou látku. Lipopeptidové uspořádání micelárního typu mohou být sférické micely, smíšené micely nebo liposomy. Farmaceutické přípravky zahrnující lipopeptidické micely mohou minimalizovat lokální podráždění v místě injekce nebo při intravenosním podávání. V jdenom provedení tohoto vynálezu zahrnuje farmaceutický přípravek sůl, pufr k udržení určitého pH a micely. V dalším provedení tohoto vynálezu zahrnuje farmaceutický přípravek jedno nebo více činidel ke stabilizaci micel a/nebo ke stabilizaci lipopeptidu nebo další terapeutické látky. V jednom provedení tohoto vynálezu farmaceutický přípravek také zahrnuje jednu nebo více terapeutických látek. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je terapeutickou látkou antibiotikum, protizánětlivé nebo protihoubové činidlo. V ještě preferovanějším provedení tohoto vynálezu je terapeutickou látkou antibiotikum nebo protihoubové činidlo popsané níže. Terapeutická látka může být přítomna kromě terapeutické ·· ·« • » · ·

substance zabudované do micely nebo může být terapeutickým činidlem, které je zabudováno do micely.

Farmaceutický přípravek může být sušený nebo lyofilizovaný, přičemž v takovémto případě dochází ke vzniku micel poté, kdy je k farmaceutickému přípravku přidán vodný roztok jako je voda nebo pufr. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je farmaceutický přípravek lyofilizován a obsahuje fyziologickou koncentraci soli po rekonstituci a pufr, který udržuje takové pH, při kterém se spontánně tvoří micely při laboratorní teplotě, když se přidá sterilní voda nebo další pufr. V ještě preferovanějším provedení tohoto vynálezu zahrnuje farmaceutický přípravek zahrnuje daptomycin nebo odopvídající lipopeptid jako je A54145, daptomycinu příbuzné lipopeptidy popsané výše nebo antibiotikum A-21978, ve kterém je n-dekanoylový postranní řetězec daptomycinu nahrazen n-oktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, ndodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem. V ještě preferovanějším provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycin. V další provedení tohoto vynálezu je farmaceutický přípravek vodný. Je preferováno použití liposomů. V preferovaném provedení tohoto vynálezu zahrnuje farmaceutický přípravek stabilizační činidlo pro liposomy.

V dalším aspektu tohoto vynálezu se micelární roztok izoluje a/nebo čistí. V jednom provedení tohoto vynálezu se micely izolují od menších substituentů ultrafiltrací. Výběr ultrafiltrační membrány bude záviset na velikosti micel. Obecně, membrány typu 10000 NMW nebo 30000 NMW budou dostatečné pro sebrání micel, přičemž dovolí menším substituentům jako jsou kontaminanty procházet. V dalším provedení tohoto vynálezu mohou být micely izolovány a/nebo čištěny dialýzou, centrifugací na základě hustotního ·* ·· • » » :

gradientu nebo size-exclusion chromatografií. Tyto metody jsou velmi dobře známy v oboru. V jednom provedení tohoto vynálezu mají micely vyšší než 30% čistotu, kde čistota je měřena jako hmotnost micel ve srovnání s hmotností monomerní formy lipopeptidů nebo jiné molekuly. V preferovaném provedení tohoto vynálezu mají micely vyšší čistotu než 50%, 60%, 70%, 80%, 90% nebo 95%.

V dalším aspektu tohoto vynálezu schopnost lipopeptidů tvořit micely a poté disociovat změnou teploty, pH, koncentrace elektrolytu a/nebo koncentrace lipopeptidů poskytuje způsob čištění lipopeptidů. V jednom provedení metoda zahrnuje čištění lipopeptidů od nízkomolekulárních kontaminantů vystavením lipopeptidů takovým podmínkám, při kterých lipopeptidy tvoří micely a poté separaci micel od kontaminantů pomoci techniky selektivní na velikost jako je ultrafiltrace nebo size-exclusion chromatografie. V dalším provedení tohoto vynálezu je popsána metoda zahrnující zkoncentrování lipopeptidů tím, že se lipopeptidy vystaví podmínkám, při kterých lipopeptidy tvoří micely a poté se zkoncentrovávají pomocí velikostně-selektivní techniky.

V ještě preferovanějším provedení tohoto vynálezu zahrnuje metoda jak čištění tak i zkoncentrování v jediném kroku.

V dalším provedení tohoto vynálezu zahrnuje způsob čištění lipopeptidů od vysokomolekulárních kontaminantů, včetně pyrogenů (např. lipopolysacharidů) lipopeptid vystaví podmínkám, při kterých v monomerní formě a poté separaci monomerního lipopeptidového roztoku od vysokomolekulárních kontaminantů pomocí velikostně-selektivní techniky. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je velikostně-selektivní technikou ultrafiltrace jak bylo popsáno výše. V dalším provedení tím, že se je lipopeptid

tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycin nebo příbuzný lipopeptid jako je A54145, daptomycinu příbuzný lipopeptid popsaný výše nebo antibiotikum A-21978, ve kterém je ndekanoylový postranní řetězec mastné kyseliny nahrazen noktanoylovým, n-nonanoylovým n-undekanoylovým, dodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem. V ještě preferovanějším provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycin.

Preferované provedení způsobu chromatografického dělení s využitím micel za účelem získání čistého daptomycinu je popsáno dále:

Streptomyces roseosporus se fermentuje s živnou kyselinou n-dekanovou podle výše uvedeného popisu. Po fermentaci se extracelulární kapalina vyčeří podle výše uvedeného popisu.

Vyčeřený roztok se poté aplikuje na anion-výměnnou pryskyřici, jako je FP-DA 13, podle výše uvedeného popisu. Daptomycin se eluuje z kolony s jedním až třemi objemy pufru se zvýšeným obsahem soli, obsahujícím 300 až 500 mMNaCl.

Eluovaný daptomycinový preparát se adjustuje při pH 2,5 až 5,0 s využitím kyseliny. V preferovaném provedení je kyselinou kyselina fosforečná. Při pH 2,5 až 4,7, koncentraci NaCI od 300 až 500 mM NaCI a teplotě od 2 do 15 °C tvoří daptomycin micely.

Daptomycinový preparát se zfiltruje na ultrafiltrační membráně s hranicí 10000 až 30000 NMW. Během ultrafiltrace se daptomycinový preparát promývá s pufrem obsahujícím 30 mM acetátu sodného při pH 3,5 a teplotě do 15 °C. Počáteční koncentrace soli je 300 mM NaCI vzhledem k podmínkám eluce, ovšem jak pokračuje promývání koncentrace soli se snižuje. Protože daptomycin je v micelární formě, je zadržován na filtru zatímco nečistoty menší než 10000 až 30000 (v • * 4 44 4 • « «

4 • ·

99 · *·

4 •

4 závislosti na použitém filtru) procházejí přes filtr. Takto získaný daptomycinový preparát má čistotu 85-90%.

Jako případný krok může být daptomycin naředěn a jeho pH nastaveno až na 6,5 za účelem převedení daptomycinu na monomerní formu. Daptomycinový preparát poté prochází přes ultrafiltrační membránu s hranicí 10000 NMW. Tento nepovinný krok významně snižuje obsah pyrogenů.

Způsoby analýzy čistoty daptomycinu

Další provedení tohoto vynálezu popisuje analytické metody měření čistoty daptomycinu.

V současném stavu techniky jsou mnohé kontaminanty, které se čistí společně s daptomycinem, nerozlišeny nebo neidentifikovány, protože možnosti jejich vizualizace a měření nečistot byly omezeny analytickými metodami a požadovaným vybavením. Viz např. United States patent 4.874.843 a Kirsch et al. Rozvoj citlivějších analytických HPLC systémů a technik dovoluje rozlišení mnoha kontaminantů, které existují v daptomcinových várkách připravených metodami současného stavu techniky. Vyšší rozlišení HPLC metod demonstruje, že daptomycin čištěný metodami současného stavu techniky je kontaminován s dříve identifikovanými nečistotami, jako je anhydro-daptomycin a β-isomer, a dalšími dříve neznámými kontaminanty, které se čistí společně s daptomycinem (a eluují společně při dříve popsaných detekčních podmínkách) během čištění na základě metod současného stavu techniky. Identifikace těchto kontaminantů nyní dovoluje vývoj metod vedoucích k eliminaci těchto kontaminantů.

Jak bylo probráno výše, anhydro-daptomycin a b-isomer byly popsány dříve jako nečistoty, které se vytrvale a konsistentně vyskytovaly během přípravy daptomycinu.

• 9

9 * • · • ♦

9

9999

S využitím HPLC analýzy popsané v tomto vynálezu bylo rozlišeno dalších přibližně dvanáct nečistot, vyprodukovaných během výroby daptomycinu, přičemž některé z nich nebyly dříve identifikovány. Tyto nečistoty nebyly odstraněny po čištění pomocí metody popsané v United States patentu 4.874.843. Alespoň deset z těchto nečistot bylo identifikováno (viz. např Obrázek 2 až 11) . Kromě toho, alespoň šest z těchto sloučenin není přímým výsledkem reakce produkující anhydrodaptomycin a β-isomer z daptomycinu, spíše jde o sloučeniny produkované jinými nepříbuznými procesy, ke kterým dochází během fermentace nebo čištění daptomycinu. Způsob čištění podle tohoto vynálezu také významně snižuje koncentrace mnoha těchto nečistot (viz Příklady).

K měření množství dalších sloučenin v daptornycínovém použity techniky daptomycinových kontaminantů hmotnostní spektroskopii, infračervenou kapilární elektroforézu a nukleární magnetickou resonanční spektroskopii. Preferovaný způsob měření množství dalších sloučenin v daptomycinovém preparátu je HPLC.

K měření daptomycinových nečistot podle tohoto vynálezu byly použity dvě metody. První metoda je s lehce nižším rozlišením než metoda druhá. V obou metodách byl použit Shimadzu nebo HP HPLC systém s PE Nelson's Software verze 4.1.První rezoluční metoda v tabulce 1 a „druhá resoluční metoda je popsána v tabulce 2 :

Tabulka 1

1.

libovolné Způsoby zahrnuj í metody známé identifikace (bez omezení) spektroskopii, preparátu mohou být v současném stavu

Turbochrom je shrnuta

Systém k dodávce rozpouštědla: Mód: isokratické pumpování Rychlost toku: 1,5 ml/min ·· «··« » · · ► · · > · ·

9· ···· ·

• ·

99·· *·

9 · · · ··

9 · ·

9 9 ·

99

Doba experimentu: 30 min

2. Rozpouštědlo A: 34% acetonitril v 0,5% NH4H2PO4 při pH 4,5

Rozpouštědlo B: 20% acetonitril v 0,5% NH4H2PO4 při pH 4,5

Cílovými podmínkami je udržet daptomycin při 15,0 +/-0,5 min. Rozpouštědlo B může být použito společně s rozpouštědlem A kvůli adjustaci HPLC mobilní fáze za účelem dosažení požadovaného retenčního času.

3. Chladič autosampleru: 5 (4 až 6) °C

4. Nastříknutý objem: 5 μΐ až 75 μΐ {20 μΐ normálně)

5. Kolona: IB-SIL (Phenomenex), C-8, (nebo ekvivalent) μιη, 4,6 x 250 mm

6. Předkolonka: IB-SIL (Phenomenex), C-8, 5 μιη, 4,6 x 30 mm (nebo ekvivalent)

7. Detekční vlnová délka: 214 nm

8. Teplota kolony: laboratorní

9. Integrace: Počítačový systém nebo integrátor schopný měření plochy píku.

Tabulka 2

1. Systém k dodávce rozpouštědla: Mód: isokratické pumpování Rychlost toku: 1,5 ml/min Doba experimentu: 75 min »» »··· • 44 4 • 4 · ·

44

4 4

4 · » 4 ** ♦ · * * · .

· · · · ·« 4444

2. Rozpouštědlo A: 20% acetonitril v 0,45% NH4H2PO4 při pH

3,25

Rozpouštědlo B: 50% acetonitril v 0,45% NH4H2PO4 při pH

3,25

Cílovými podmínkami je přibližně 35% acetonitril v 0,45% NH₄H₂PO₄ při pH 3,25, aby byl daptomycin udržen při 36,0 +/1,5 min. Ovšem, poměr rozpouštědel bude použit kvůli adjustaci HPLC mobilní fáze za účelem dosažení požadovaného retenčního času.

3. Chladič autosampleru: 5 (4 až 6) °C

Nastříknutý objem:

μΐ až 75 μΐ (20 μΐ normálně)

5. Kolona: IB-SIL (Phenomenex), C-8, 5 μτη, 4,6 x 250 mm (nebo ekvivalent)

6. Předkolonka: IB-SIL (Phenomenex), C-8, 5 μαι, 4,6 x 30 mm (nebo ekvivalent)

7. Detekční vlnová délka: 214 nm

8. Teplota kolony: 25 (22 až 28) °C

Čištěné lipopeptidy, farmaceutické přípravky je obsahující a způsoby jejich využití

Dalším předmětem tohoto vynálezu je zajištění čištěných lipopeptidů, stejně jako jejich solí, esterů, amidů, etherů a chráněných forem, stejně jako farmaceutických přípravků •» «··ϊ obsahujících čištěné lipopeptidy nebo jejich soli. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je lipopeptidem daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid podle výše uvedeného popisu. Dalším předmětem tohoto vynálezu je zajištění farmaceutických prostředků obsahujících lipopeptid v uspořádání micelárního typu. V preferovaném provedení tohoto vynálezu lipopeptidové micely jsou micely zahrnující daptomycin nebo jeden nebo více daptomycinu příbuzných lipopeptidu. Všechny zde uvedené reference na lipopeptidové micely označují nejen všechna lipopeptidové uspořádání micelárního typu, ale také konkrétně předpokládají daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid jako je A54145, daptomycinu příbuzné lipopeptidy popsané výše nebo antibiotikum A-21978, ve kterém je n-dekanoylový postranní řetězec mastné kyseliny nahrazen n-oktanoylovým, nnonanoylovým, n-undekanoylovým, n-dodekanoylovým, ntridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem. Dále všechny reference na lipopeptidická uspořádání micelárního typu specificky předpokládají sférické nebo smíšené micely a liposomy, jak bylo diskutováno výše.

Čištěné lipopeptidy, jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo lipopeptidové micely mohou být formulovány pro orální, intravenosní, intramuskulární, subkutánní, aerosolové, místní nebo parenterální podávání pro terapeutické nebo profylaktické léčení nemocí, obzvláště bakteriálních nemocí. V preferovaném provedení tohoto vynálezu čištěný lipopeptid je čištěný daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid. Odkazy na „čištěný daptomycin, „čištěný daptomycinu příbuzný lipopeptid nebo „čištěný lipopeptid zahrnují jejich farmaceuticky přijatelné soli. Daptomycin, daptomycinu příbuzný lipopeptid nebo jiné lipopeptidové micely mohou být formulovány s využitím »4 4444

4444 ř 44 «4 4 ·» « 4 4

4 · libovolného excipientu, s lipopeptidem farmaceuticky přijatelného nosiče nebo který je kompatibilní s daptomycinem nebo našeho zájmu. Viz např. Handbook of

Pharmaceutical Additives: An International Guide to More than 6000 Products by Trade Name, Chemical, Function, and Manuf acturer, Ashgate Publishíng Co., eds. M. Ash a I. Ash, 1996, The Merck Index: An Enycclopedia of Chemicals, Drugs and Biologicals, ed. S. Budavari, Annual, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA; Martindale: The Complete Drug Reference, ed. K. Parfitt,

1999; a Goodman & Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Pergamon Press, New York, NY, ed. L. S. Goodman et al. , jejichž obsah je zde zahrnut jako reference pro obecný popis způsobů podávání různých antimikrobiálních činidel v lidské terapii. Čištěný daptomycin, daptomycinu příbuzný lipopeptid nebo jiný lipopeptidové micely podle tohoto vynálezu mohou být smíchány s konvenčními farmaceutickými nosiči a excipienty a mohou být použity ve formě tablet, kapslí, elixírů, suspenzí, syrupů, oplatek, krémů a podobně. Daptomycin, daptomycinu příbuzný lipopeptid nebo jiné lipopeptidové micely mohou být smíchány s dalšími terapeutickými činidly a antibiotiky jak bylo diskutováno v textu. Přípravky budou obsahovat sloučeninu podle tohoto vynálezu v množství od 0,1 do 90% hmotnosti aktivní sloučeniny a obecněji od 10 do asi 30%.

Přípravky podle tohoto vynálezu mohou být podávány s využitím kontrolovaného uvolňování (např. kapsle) nebo pomocí systémů s odloženým uvolňováním (např.

biodegradovatelné matrice). Příklady systémů se zpožděným uvolňováním pro dodání léčiv, které jsou vhodné pro podávání přípravků podle tohoto vynálezu jsou popsány v U.S. Patent »· *·*· ···· ·· •· ·*.

• · · · ♦ · • · · i · · · «* ·· ·* ** • · · ϊ • · * * • · · >« ···· no. 4.452.775 (Kent), 5.239.660 (Leonard), 3.854.480 (Zaffaroni).

Přípravky mohou obsahovat běžné nosiče a excipienty, jako jsou obilný škrob nebo želatina, laktosa, sacharosa, mikrokrystalická celulosa, divápenatý, chlorid sodný a kaolin, mannitol, fosfát alginová kyselina. Přípravky mohou obsahovat sodnou sůl kroskaramelosy, mikrokrystalickou celulosu, obilný škrob, sodný škrobglykolát a alginovou kyselinu.

Tabletová pojívá, která mohou být použita zahrnují akacii, methylcelulosu, natrium-karboxymethylcelulosu, polyvinylpyrrolidon (Povidon), hydroxypropylmethylcelulosu, sacharosu, škrob a ethylcelulosu.

Lubrikanty, které mohou být použity, zahrnují stearát horečnatý nebo jiné metalické stearáty, kyselinu stearovou, silikonovou kapalinu, talek, vosky, oleje a koloidní oxid křemičitý.

Mohou být také použita chuťová činidla jako je pepermint, olej wintergreen, cherry a pod. Může být vhodné přidávat barvící činidlo, aby vznikla dávková forma vzhledově estetičtější nebo aby byl produkt identifikován.

Pro orální použití jsou prakticky užitečné tuhé formulace jako jsou tablety a kapsle. Také mohou být vhodné prostředky s odloženým účinkem nebo preparáty potažené pro průchod střevem. Pro pediatrické a geriatrické aplikace jsou obzvláště vhodné suspenze, syrupy a žvýkací tablety. Pro orální podávání jsou farmaceutické přípravky ve formě např. tablet, kapslí, suspenzí nebo kapalin. Farmaceutické přípravky jsou s výhodou připravovány ve formě dávkových forem obsahujících terapeuticky účinné množství aktivní složky. Příklady těchto dávkových forem jsou tablety a kapsle. Pro terapeutické účely mohou tablety a kapsle kromě .*·.···:

.· . 5 ····*··* ··»· aktivní složky obsahovat konvenční nosiče jako jsou pojivá, např. akáciovou gumu, želatinu, polyvinylpyrrolidon, sorbitol nebo tragacant; pojivá jako např. fosfát vápenatý, glycin, laktosa, kukuřičný škrob, sorbitol nebo sacharosa; lubrikanty jako např. stearát horečnatý, polyethylenglykol, silikát nebo talek; desintegrační činidla jako např. bramborový škrob, chuťová nebo barvící činidla nebo akceptovatelná smáčecí činidla. Orální kapalné přípravky jsou obecně ve formě vodných nebo olejových roztoků, suspenzí, emulzí, syrupů nebo elixírů a mohou obsahovat konvenční aditiva jako jsou suspenzní činidla, emulgační činidla, nevodná činidla, preservativa, barvící činidla a chuťová činidla. Orální kapalné přípravky mohou obsahovat lipopeptidové micely nebo monomerní formy lipopeptidů. Příklady přídavných látek pro kapalné přípravky zahrnují akácii, mandlový olej, ethylalkohol, frakcionizovaný glukosový syrup, glycerin, lecithin, methylcelulosu, kokosový olej, želatina, hydrogenované jedlé tuky, methyl- nebo propyl-parahydroxybenzoát, propylenglykol, sorbitol nebo kyselina sorbová.

Pro intravenosní (IV) použití může být vodo-rozpustná forma daptomycinu, daptomycinu příbuzného lipopeptidů nebo jiného lipopeptidů rozpuštěna v libovolné běžně používané intravenosní kapalině a podávána infuzí. Pokud jde o lipopeptidové micely, lipopeptid se rozpustí v intravenosní formulaci za podmínek, při kterých je lipopeptid přítomný při koncentracích nad jeho cmc. Odborník v oboru může měnit hodnoty pH, teplotu nebo koncentraci soli podle popisu ve vynálezu za účelem získání intravenosního roztoku lipopeptidové micely. Dále může být roztok sonifikován za zahrnuj ícího lipopeptidový lipopeptidových liposomů. Intravenosní účelem získání formulace mohou • 999 ·

obsahovat nosiče, excipienty nebo stabilizátory včetně (bez omezení) vápníku, albuminu lidského séra, citrátu, acetátu, chloridu vápenatého, uhličitanu a dalších solí. Intravenosní kapaliny zahrnují (bez oemezení) fyziologický roztok nebo Ringerův roztok. Daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid může být také ..umístěn do injektorů, kanuly, katetrů a vedení.

Formulace pro parenterální podávání může být ve formě vodných nebo nevodných isotonických sterilních roztoků nebo suspenzí pro injektování. Tyto roztoky nebo suspenze mohou být připraveny ze sterilních prášků nebo granulí majících jeden nebo více nosičů zmíněných u použití pro orální podávání. Lipopeptidové micely mohou být obzvláště vhodné pro parenterální podávání. Sloučeniny mohou být rozpuštěny v polyethylenglykolu, propylenglykolu, ethanolu, obilném oleji, benzylalkoholu, chloridu sodném a/nebo různých pufrech. Pro intramuskulární přípravky mohou být sterilní formulace lipopeptidové sloučeniny nebo jejich vhodné rozpustné solné formy, např. hydrochloridová sůl, rozpuštěny a podávány ve farmaceutickém ředidle jako je voda pro injekce (WFI), fyziologický slaný roztok nebo 5% glukosa.

Lipopeptidové micely mohou být obzvláště výhodné pro parenterální podávání, protože je pravděpodobné, že nebudou způsobovat žádné lokální podráždění v místě injekce. Bez toho aniž bychom se cítili být nějak vázáni teorií, je pravděpodobné, že lipopeptidové micely budou způsobovat menší lokální podráždění než monomerní lipopeptidy, protože které mohou při injekci způsobovat nasměrovány dovnitř micely, zatímco peptidové jádro, u něhož je menší pravděpodobnost místního podráždění než u lipidických ocásků, bude vystaveno směrem ke tkáním. Lipopeptidové micely mohou být připraveny pro lipidické ocásky, podráždění, budou • · ··· · ·· ·· > ♦ · 1 ft · · · ·· ·· intramuskulární a parenterální přípravky podle popisu v tomto vynálezu za vzniku přípravku obsahujícího lipopeptidové micely. Dále může být lipopeptidový roztok sonifikován za účelem získání lipopeptidových liposomů. Vhodná nerozpustná forma sloučeniny může být také připravena a podávána jako suspenze ve vodném základu nebo farmaceuticky přijatelné olejové bázi, např. ester dlouhé mastné kyseliny, jako třeba ethyloleát.

Injektovatelné depotní formy mohou být vyrobeny zabudováním mikroenkapsulovaných matricí sloučeniny v biodegradovatelných polymerech jako je polyaktidepolyglykolid. V závislosti na poměru léčiva k polymeru a druhu konkrétního použitého polymeru může být řízena rychlost uvolňování léčiva. Příklady dalších biodegradovatelných polymerů zahrnují póly(orthoestery) a póly(anhydridy). Depotní injektovatelné přípravky se také připravují uzavřením léčiva v mikroemulzích, které jsou kompatibilní s tělními tkáněmi.

Pro místní použití mohou být sloučeniny a micely podle tohoto vynálezu připraveny ve vhodné formě k aplikaci na kůži nebo sliznice nosu a krku a mohou mít formu krémů, mazání, kapalných sprejů nebo inhalantů, bonbonů nebo krčních mazání. Tyto místní formulace mohou dále zahrnovat chemické sloučeniny jako je dimethylsulfoxid (DMSO) kvůli usnadnění povrchové penetrace aktivní složky. Jako místní přípravky mohou být podávány sterilní přípravky daptomycinu, daptomycinu příbuzného lipopeptidů, jejich vhodné solné formy nebo lipopeptidové micely ve formě krémů, mazání, sprejů nebo dalších přípravků pro místní aplikaci. Přípravky pro místní použití mohou být také ve formě bandáží, které byly impregnovány s čištěným daptomycinem, daptomycinu příbuzným ·· «0

0 0 0 0

0 · dlipopeptidem nebo přípravkem obsahujícím lipopeptidové micely.

Pro aplikace do očí nebo uší mohou být sloučeniny podle tohoto vynálezu přítomny v kapalné nebo polokapalné formě formulované v hydrofobních nebo hydrofílních základech jako mazání, lotion, nátěry nebo prášky.

Pro rektální podávání mohou být sloučeniny podle tohoto vynálezu podávány ve formě čípků, kde jsou smíchány s konvenčními nosiči jako je kakaové máslo, vosk nebo jiný glycerid.

Pro aerosolové přípravky mohou být sterilní formulace čištěného daptomycinu nebo daptomycinu příbuzného lipopeptidů nebo solných forem těchto sloučenin použity v inhalátorech jako jsou inhalátory s měřenou dávkou a rozprašovače. Pro aerosolové přípravky mohou být také použity sterilní formulace lipopeptidových micel. Aerosolizované formy mohou být obzvláště užitečné pro léčení respiračních infekcí jako je pneumonie a infekce dutin.

Alternativně, sloučeniny podle tohoto vynálezu mohou být v práškové formě pro rekonstituci ve vhodném farmaceuticky přijatelném nosiči v čase použití. Má-lí být prášková forma rekonstituována ve formě lipopeptidových micel, může prášek obsahovat pufr a/nebo sůl tak, aby rekonstituce s určitým množstvím sterilní vody nebo solanky vedla ke vzniku micel. Alternativně, prášková forma může obsahovat instrukce týkající se množství a typu farmaceuticky přijatelného nosiče, který má být použit na rekonstituci lipopeptidů, aby byly získány micely. V dalším provedení jednotková dávková forma sloučeniny podle tohoto vynálezu může být roztok sloučeniny, její soli nebo lipopeptidových micel ve vhodném ředidle ve sterilních hermeticky uzavřených ampulích. Koncentrace sloučeniny v dávkové formě se může lišit, např.

«· ·· • » · · • · · • · « · • · ···· ·· ·· ·· ·· ···· od 1% do asi 50%, v závislosti na použité sloučenině a její rozpustnosti a na dávce vyžadované lékařem. Jestliže přípravek obsahuje dávkové formy, každá dávková forma s výhodou obsahuje od 50 do 500 mg aktivní látky. Pro léčení dospělých pacientů dávky s výhodou obsahují od 100 mg do 3 g denně, v závislosti na způsobu podávání a frekvenci podávání.

V dalším aspektu se vynález zabývá způsobem léčení infekcí, obzvláště takových, které jsou způsobeny grampositivními bakteriemi u lidí a u zvířat. Termín „léčení je použit k označení jak prevence infekce tak i kontroly již projevené infekce poté co byl živočich infikován. Projevená infekce může být akutní nebo chronická. Způsob léčení zahrnuje podávání lidem nebo jiným živočichům účinné množství sloučeniny podle tohoto vynálezu. Účinná dávka je obecně mezi 0,1 a asi 25 mg/kg čištěného daptomycinu, daptomycinu příbuzného lipopeptidů nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli. Daptomycin nebo daptomycinu příbuzný lipopeptid může být v monomerní formě nebo může být částí lipopeptidových micel. Preferovaná dávka je od asi 1 do asi 12 mg/kg čištěného daptomycinu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.

V jednom provedení tohoto vynálezu je popsán způsob léčení infekcí, obzvláště takových, které jsou způsobeny gram-positivními baktériemi u subjektu s terapeuticky účinným množstvím daptomycinu nebo jiným antibakteriálním lipopeptidem. Daptomycin nebo antibakteriální lipopeptid může být monomerní nebo ve formě lipopeptidových micel. Příklady způsobů podávání antibakteriálních činidel jsou popsány v U. S. Patent č. 5.041.567 (Rogers) a v PCT patentové přihlášce EP94/02552 (publikace č. WO 95/05384), jejichž obsah je zde zahrnut jako reference. V tomto vynálezu označuje termín „terapeuticky účinné množství množství daptomycinu nebo • · · · antibakteriálního lipopeptidu podle tohoto vynálezu, které zabraňuje počátku bakteriální infekce, zmírňuje její symptomy nebo zastavuje rozvoj bakteriální infekce. Termín „léčení je definován jako podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny podle tohoto vynálezu subjektu, jak za účelem prevence výskytu infekce a kontroly nebo eliminace infekce. Termín „subjekt v tomto vynálezu definuje savce, rostlinu nebo buněčnou kulturu. V preferovaném provedení tohoto vynálezu je subjektem lidský nebo zvířecí pacient potřebný léčení lipopeptidovou sloučeninou.

Lipopeptidová antibiotická sloučenina může být podávána jako jediná denní dávka nebo ve vícenásobných dávkách za den. Režim léčení může vyžadovat podávání během dlouhé časové periody, např. několik dní nebo od dvou do čtyř týdnů. Množství v podávané dávce nebo celkové podávané množství bude záviset na takových faktorech jako jsou druh a závažnost infekce, věk a obecné zdraví pacienta, tolerance pacienta k antibiotikům a mikroorganismům nebo na mikroorganismech zahrnutých v infekci. Způsob podávání je popsán v International PCT Application WO 00/18419.

Způsob podle tohoto vynálezu zahrnuje podávání čištěného daptomycinu nebo jiného lipopeptidového antibiotika nebo jejich farmaceutického přípravku pacientům v množství, které je dostatečné pro redukování nebo eliminaci infekce způsobené gram-positivními bakteriemi. Daptomycin nebo lipopeptidové antibiotikum mohou být monomery nebo mohou být přítomny ve formě micel. Antibiotikum může být podáváno orálně, parenterálně, inhalací, místně, rektálně, nasálně, bukálně, vaginálně nebo pomocí implantovaného zásobníku, externí pumpou nebo kateterem. Antibiotikum může být připraveno pro oftalmické nebo aerosolové použití. Čištěný daptomycin, lipopeptidové antibiotikum nebo jejich farmaceutické • · • ·· přípravky mohou být přímo injektovány nebo podávány do abscesu, orgánové dutiny nebo kloubů. Parenterální podávání zahrnuje subkutánní, intravenosní, intramuskulární, intraartikulární, intra-synoviální, cisternální, intratheciální, intrahepatické, intralesionální a intrakraniální injekce nebo infuze.

V preferovaném provedení tohoto vynálezu se daptomycin nebo jiný lipopeptid podává íntravenosně, subkutánně nebo orálně.

Způsob léčení podle tohoto vynálezu může být použit pro léčení pacientů majících bakteriální infekce, které jsou způsobené nebo zhoršené působením libovolného typu grampositivních baktérií. V preferovaném provedení se čištěný daptomycin, daptomycinu příbuzný lipopeptid, jiný lipopeptid nebo farmaceutický přípravek je obsahující podává pacientovi v rámci způsobu léčení podle tohoto vynálezu. V dalším provedení mohou být bakteriální infekce způsobené nebo zhoršené působením baktérií zahrnujících (bez omezení) stafylokoky vnímavé a stafylokoky resistentní na methicilín (včetně Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus saprophyticus a stafylokoky negativní na koagulázu), Staphylococcus aureus středně vnímavý na (GISA), streptokoky vnímavé a resistentní k (včetně Streptococcus pneumoniae, Streptococcus

Strepiococcus agalactiae, Streptococcus avium, glykopeptid penicilinu pyogenes,

Streptococcus bovis, Streptococcus lactis, Streptococcus sangius a Streptococci skupiny C, Streptococci skupiny G a viridans streptococci), enterokoky (včetně kmenů vnímavých a resistentních k vankomycinu jako jsou Enterococeus faecalis and Enterococeus faecium), Clostridíum difficile, Clostridíum • * ··· · • · · · clostridiiformě, Clostridium innocuum, Clostridium perfringens, Clostridium ramosum, Haemophilus influenzae, Listeria monocytogenes, Corynebacterium jeikeium, Bifidobacterium spp., Eubacterium aerofaciens, Eubacterium lentum, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacilllus plantarum, Lactocoecus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus, Peptostrepiococcus

Peptostreptococcus asaccarolyticus, magnus, Peptostreptococcus micros, anaerobius, Peptostreptococcus Peptostreptococcus Propionibacterium productus, prevotii, Peptostreptococcus acnes a flctinomyces spp.

Protibakterální aktivita daptomycinu proti klasicky „resistentním kmenům je srovnatelná s aktivitou proti klasicky „vnímavým kmenům při in vitro experimentech. Kromě toho, hodnoty minimální inhíbíční koncentrace (MIC) pro daptomycin vůči vnímavým kmenům je typicky čtyřikrát nižší než aktivita vankomycinu. V preferovaném provedení se tedy čištěný daptomycin, daptomycinu příbuzné lipopeptidové antibiotikum nebo jejich farmaceutické přípravky podávají pacientům, kteří vykazují bakteriální infekce, které jsou resistentní vůči antibiotikům včetně vankomycinu. Kromě toho, narozdíl od glykopeptidových antibiotik, daptomycin vykazuje rychlou koncentračně závislou baktericidní aktivitu proti gram-positivním organismům. V preferovaném způsobu léčení vynálezu se tedy čištěný daptomycin, podle tohoto lipopeptidové antibiotikum nebo jejich farmaceutické přípravky podávají pacientům vyžadujícím rychlou terapii pomocí antibiotik.

Způsob léčení podle tohoto vynálezu může být použit pro gram-positivní bakteriální infekce libovolných tělních orgánů nebo tkání. Tyto orgány nebo tkáně zahrnují (bez omezení) skeletální svaly, kůži, krevní oběh, ledviny, srdce, žaludek • » »♦ ·♦«· · * ·· • · 9 9 9 · * 9

9999 99 9 « 999 +9 999 9 9

9· 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 ·9 9· 9999 a kosti. Způsob léčení podle tohoto vynálezu může být použit pro léčení (bez omezení) kůže a infekcí měkkých tkání, bakterémie a infekcí vylučovacího traktu. Způsob léčení podle tohoto vynálezu může být použit pro léčení infekcí dýchacího traktu vzniklých nákazou ve společnosti včetně (bez omezení) otitis media, sinusitis, chronické bronchitidy a pneumonie, způsobené lékově-resistentními Streptococcus pneumoniae nebo Haemophilus influenzae. Způsob léčení podle tohoto vynálezu může být použit pro léčení smíšených infekcí zahrnujících různé druhy gram-positivních baktérií nebo zahrnujících jak gram-positivní tak i gram-negativní bakterie, včetně aerobních, kaprofilních nebo anerobních bakterií. Tyto typy infekcí zahrnují intra-abdominální infekce a porodnickogynekologické infekce. Způsoby léčení podle tohoto vynálezu mohou být použity v sestupné terapii nemocničních infekcí, včetně (bez omezení) pneumonie, intra-abdominální sepse, infekcí kůže a měkkých tkání a infekcí kostí a kloubů.

Způsob léčení podle tohoto vynálezu může být také použit pro léčení infekcí zahrnujících (bez omezení) endokarditis, nefritis, septickou arthritis a osteomyelitis. V preferovaném provedení může být libovolná výše popsaná nemoc léčená s využitím čištěného daptomycinu, lipopeptidového antibiotika nebo jejich farmaceutického přípravku. Dále mohou být nemoci léčeny s využitím daptomycinových nebo lipopeptidových antibiotik buď v monomerní nebo micelární formě.

Daptomycin, daptomycinu příbuzný lipopeptid nebo jiný lipopeptid mohou být také podávány v dietě nebo výživě pacientů nebo zvířat. Jsou-li podávány jako část celkového dietního příjmu, může být množství daptomycinu nebo jiného lipopeptidu menší než 1% hmotnosti potravy a s -výhodou ne více než 0,5% hmotnosti. Dietou zvířat mohou být normální

99 » 9 · 9

I · « ·· 9999 potraviny, do nichž může být daptomycin nebo lipopeptid přidán nebo zamíchán.

Způsob léčení podle tohoto vynálezu může být prováděn při současném podávání jednoho nebo více protihoubových činidel a/nebo jednoho nebo více antibiotik jiných než daptomycin nebo dalších lipopeptidových antibiotik. Současné podávání protihoubových činidel a antibiotik jiných než daptomycin nebo jiných lipopeptidových antibiotik může být užitečné při léčení smíšených infekcí, jako jsou infekce způsobené gram-positivními bakteriemi, infekce zpsobené grampositivními a gram-negativními bakteriemi nebo infekce způsobené jak bakteriemi tak i houbami. Kromě toho, daptomycin nebo jiné lipopeptidové antibiotikum může zlepšit profil toxicity jednoho nebo více současně podávaných antibiotik. Bylo prokázáno, že podávání daptomycinu a aminoglykosidu může zlepšit renální toxicitu způsobenou aminoglykosidem. V preferovaném provedení tohoto vynálezu může být antibiotikum a/nebo protihoubové činidlo podáváno společnšě s čištěným daptomycinem, jiným lipopeptidovým antibiotikem nebo s farmaceutickými přípravky zahrnujícími čištěný daptomycin nebo jiné lipopeptidové antibiotikum.

Společné podávání jiného terapeutického činidla s daptomycinem nebo jiným lipopeptidovým antibiotikem může být prováděno s využitím daptomycinu nebo lipopeptidového antibiotika buď v monomerní nebo v micelární formě. Jak bylo diskutováno výše, sférické lipopeptidové micely mohou být použity k rozpuštění činidla, které vykazuje nízkou rozpustnost ve vodě. Kromě toho, lipopeptidové liposomy mohou být použity k uzavření činidla, která jsou rozpustná v vodných médiích uvnitř liposomu. Následováním popisu vynálezu bude odborník v oboru schopen připravit micely

99

9 9 9 « « 9 ·· ·»

I ♦ · I » · ·· ► · ··99 obsahující terapeutická činidla jako jsou protizánětlivá činidla, protihoubová činidla nebo jiná antibiotika.

Antibakterální činidla a jejich třídy, které mohou být podávány společně s daptomycinem nebo jinými lipopeptidovými antibiotiky zahrnují (bez omezení) peniciliny a příbuzná léčiva, karbapenemy, cefalosporiny a příbuzná léčiva, aminoglycosidy, bacitracin, gramicidin, mupirocin, chloramfenikol, thiamfenikol, natrium-fusidat, lincomycin, clindamycin, makrolidy, novobiocin, polymyxiny, rifamyciny, spektinomycin, tetracykliny, vankomycin, teikoplanin, streptograminy, činidla proti listové kyselině včetně sulfonamidů, trimethoprim a jeho kombinace a pyrimethamin, synthetické antibakteriální činidla včetně nitrofuranů, methenamin mandelát a methenamin hippurát, nitroimidazoly, chinolony, fluorochinolony, isoniazid, ethambutol, pyrazinamid, para-aminosalicylová kyselina (PAS), cykloserin, capreomycin, ethionamid, prothionamid, thiacetazon, viomycin, eveminomycin, glykopeptid, glycylcylcline, ketolidy, oxazolidinon; imipenen, amikacin, netilmicin, fosfomycin, gentamicin, ceftriaxon, Ziracin, LY 333328, CL 331002, HMR 3647, Linezolid, Synercid, Aztreonam a Metroriidazol, Epiroprim, OCA-983, GV-143253, Sanfetrinem sodium, CS-834, Biapenem, A-99058.1, A-165600, A-179796, KA 159, Dynemicin A, DX8739, DU 6681; Cefluprenam, ER 35786, Cefoselis, Sanfetrinem celexetil, HGP-31, Cefpirom, HIvm-3647, RU-59863, Mersacidin, KP 736, Rifalazil; Kosan, AM 1732, MEN 10700, Lenapenem, BO 2502A, NE-1530, PR 39, K130, OPC 20000, OPC 2045, Veneprim, PD 138312, PD 140248, CP 111905, Sulopenem, ritipenam acoxyl, RO-65-5788, Cyclothialidine, Sch-40832, SEP 132613, micacocidin A, SB-275833, SR-15402, .SIJN A0026, TOC 39, carumonam, Cefozopran, Cefetamet pivoxil a T 3811.

φ φ φ

• » φ ·Φ ·

·· φ φ •Φ ·φφ·

V preferovaném provedení tohoto vynálezu, antibalteriální činidlo, které může být podáváno společně s daptomycinem, zahrnuje (bez omezení) imipenen, amikacin, netilmicin, fosfomycin, gentamicin, ceftriaxon, teicoplanin, Ziracin, LY 333328, CL 331002, HMR 3647, Linezolid, Synercid, Aztreonam a Metronidazol.

Antibakteriální činidlo, které může být podáváno společně s daptomycinem nebo jiným lipopeptidovým antibiotikem zahrnuje (bez omezení) Caspofungen, Voriconazol, Sertaconazol, IB-367, FK-463, LY-303366, Sch-56592, Sitafloxacin, DB-289 polyeny, jako třeba Amphotericin, Nystatin, Primaricin; azoly, jako třeba Fluconazol, Itraconazol a Ketoconazol; allylaminy, jako třeba Naftifin a Terbinafin; a anti-metabolity jako třeba Flucytosin. Další protihoubová činidla zahrnují (bez omezení) ta, která jsou popsaná ve Postel et al., Drug Discovery Today 5: 25-32 (2000), zahrnutém zde jako reference. Fostel et al. popisuje protihoubová činidla zahrnující Corynecandin, Mer-WF3010, Fusacandins, Artrichitin/LL 15G256y, Sordarins, Cispentacin, Azoxybacillin, Aureobasidin a Khafrefungin.

Daptomycin nebo jiné lipopeptidové antibiotikum, včetně daptomycinu-příbuzných lipopeptidů, mohou být podávány podle tohoto vynálezu až do vymizení bakteriální infekce nebo do jejího zredukování. V jednom provedení tohoto vynálezu daptomycin nebo jiný lipopeptid je podáván po dobu od 3 dnů do 6 měsíců. V preferovaném provedení se daptomycin nebo jiný lipopeptid podává 7 až 56 dní. V ještě preferovanějším tohoto vynálezu se daptomycin nebo jiný lipopeptid podává 7 až 28 dnů. V ještě preferovanějším provedení se daptomycin nebo jiný lipopeptid podává 7 až 14 dní. Daptomycin nebo jiný lipopeptid může být podáván po kratší nebo delší dobu, je-li to potřeba.

·» ·♦♦· ·♦·· »* ·♦ 44 44

9 9 4 4 4 4 4 4

4 44 4 4 ·

4 9 4 4 4 4 9 4 4

4 4 4 4 4 4 4 ·· 44 4444

Za účelem plného pochopení tohoto vynálezu následují příklady provedení tohoto vynálezu. Tyto příklady jsou uvedeny za účelem ilustrace a v žádném případě nejsou zamýšleny jako omezující pro rozsah tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Fermentace kultury S. roseosporus NRRL kmen 15998 byla prováděna za podmínek kontrolovaného přísunu děkanové kyseliny při koncentracích optimalizovaných pro produkci antibiotika, přičemž byl minimalizován vznik kontaminantů. Zbytková koncentrace kyseliny děkanové byla měřena pomocí plynové chromatografie a cílová zbytková koncentrace byla 10 ppm děkanové kyseliny od nastartování indukce až do sběru (přibližně 30 h) . Centrifugace kultury a následná analýza vyčeřené kapaliny bylo použito pro měření produkce daptomycinu pomocí HPLC. Titr sebrané kapaliny byl typicky mezi 2,1 a 2,6 g na litr fermentační kapaliny.

Fermentace byla zpracována buď mikrofiltrací s využitím Pall-Sep nebo pomocí průmyslové centrifugy a hlubokého filtru. Vyčeřený roztok byl aplikován na anion-výměnnou pryskyřici, Mitsubishi FP-DA 13, promyt s 30 mM NaCl při pH 6,5 a eluován Se 300 mM NaCl při 6,0 až 6,5. Alternativně, FP-DA 13 kolona byla promyta se 60 mM NaCl při pH 6,5 a eluována s 500 mM NaCl při pH 6,0 až 6,5. Eluát byl aplikován na HIC pryskyřici, HP~20ss, promyt se 30% acetonitrilem a eluován se 35% acetonitrilem při pH 4,0 až 5,0. Alternativně, HIC pryskyřice byla promyta se 45% isopropylalkoholem a eluována s 55 až 60% isopropylalkoholu. Eluát byl aplikován na FP-DA 13 pryskyřici a byl promyt jako předtím. Konečný • 4 4 44 4 ♦ ♦ 44 44 44 «444 444*

4444 4 · 4

444 44 444 4 4

4444 4 · 4

4 · ♦ · 44 4444 anion-výměnný krok redukuje rozpouštědlo o jednu třetinu nebo více. Byla provedena reverzní osmotická diafiltrace a zkoncentrování při pH 1,5 až 2,5 s využitím 0,2 μιη filtru a daptomycinový preparát byl zmražen. Finální reverzní osmotická diafiltrace byla prováděna s vodou pro injekce (WFI) kvůli vymytí daptomycinu a kvůli nastavení jeho koncentrace před plněním ve sterilních podmínkách. Viálky nebo velké objemy daptomycinu byly poté lyofylizovány.

Příklad 2

Daptomycin byl vyroben ve fermentační kultuře S. roseosporus a částečně čištěný daptomycin (9,9 kg) byl čištěn pomocí mikrofiltrace z 5500 1 fermentační kapaliny pomocí metody popsané v United States patentu 4.885.243. Částečně čištěný daptomycin byl dále čištěn pomocí metody popsané v US. Pat. č. 4.874.843 a vznikl daptomycinový preparát o čistotě 91%. Daptomycinový preparát byl aplikován na Poros P150 anion-výměnnou pryskyřici (PE Biosystems) v Tris pufru pH 7,0 obsahujícím 6H močovinu a byl ponechán navázat se na pryskyřici. Pryskyřice byla promyta se třemi objemy pufru před započetím NaCI gradientu v tom samém pufru.

Alternativně, kontaminanty mohou být účinně odstraněny z kolony s fixní úrovní 30 mM NaCI. K eluování čištěného daptomycinu z pryskyřice došlo při koncentraci přibližně 300 mM NaCI během 0 na 1000 mM NaCI gradientu. Daptomycin eluovaný z kolony měl čistotu vyšší než 99% (měřeno HPLC „první metodou). Čištěný daptomycin obsahoval pouze jednu detekovatelnou daptomycinovou nečistotu. Anhydro-daptomycin a β-isomer byly nedetekovatelné (méně než 0,01% kontaminace). Koncentrace neidentifikovaných nečistot byla vyšší než 0,1% a nižší než 0,5%.

44

4 4444 44«·

4 4 «4 44 4 • *«4 44 444 4 4 • ·· 4444 444

444« ·« ·♦ ·· 44 4444

4 · «* ·

Příklad 3

Daptomycinový preparát s čistotou 91% byl připraven podle popisu v Příkladu 2. Produkt byl aplikován na Poros D50 anion-výměnnou pryskyřici (PE Biosystems) v acetátovém pufru pH 7,0 obsahujícím 6M močovinu. Poros D50 pryskyřice byla promyta a eluována stejným způsobem jako bylo popsáno v Příkladu 2. Daptomycin eluovaný z kolony měl čistotu 96,92% (měřeno HPLC „druhou metodou). Produkt podle tohoto vynálezu obsahoval pouze dvě z počátečních čtrnácti nečistot (méně než 0,5% kontaminantů). Anhydro-daptomycin nemohl být detekován v čištěném daptomycinovém preparátu (méně než 0,01% kontaminace a s přesným obsahem méně než 0,05%) .

Příklad 4

Fermentační kapalina obsahující daptomycin byla vyrobena podle popisu v Příkladu 2. Fermentační. kapalina byla vyčeřena mikrofiltrací. Vyčeřený produkt byl extrahován se 20% nbutanolu nebo iso-butanolu při pH4,5 (jedna část butanolu na čtyři části vyčeřeného roztoku). Byla provedena následná extrakce vyčeřeného roztoku za vzniku částečně čištěného daptomycinu s čistotou vyšší než 90% celkového obsahu daptomycinu ve vyčeřeném roztoku. Daptomycin byl získán z butanolové fáze přídavkem vodného pufru o pH 6,5 v objemu rovném jedné polovině nebo více objemu butanolu kvůli extrakci daptomycinu z butanolové fáze do fáze vodné. Butanolový extrakční krok vedl k částečně čištěnému daptomycinovému preparátu, který byl čištěný pětkrát a zkoncentrován desetkrát vzhledem k vyčeřenému roztoku.

Vodný daptomycinový preparát byl čištěn metodou popsanou v US. patentu 4.874.843, což vedlo k daptomycinu o 91% čistotě. Daptomycin obsahoval čtrnáct nečistot. Produkt byl aplikován na Poros D50 pryskyřici v Tris pufru při pH 7,0 • 4 ·«·· • 4 · 4 • · 44

4«

4 4 • 4

4

4444 obsahujícím 6M močovinu. Pryskyřice byla promyta s třemi objemy Tris pufru při pH 7,0 obsahujícím 6M močovinu před zahájením NaCl gradientu od 0 do 1000 mM ve stejném pufru. K eluování čištěného daptomycinu z pryskyřice došlo při přibližně 300 mM NaCl. Daptomycin měl 98% čistotu (měřeno „druhou HPLC metodou.

Příklad 5

Daptomycin byl fermentován podle popisu v Příkladu 2. 5500 1 fermentační kapaliny obsahovalo 13 kg daptomycinu.

Fermentační kapalina byla přímo extrahována s 20% n-butanolem při pH 4,5, což vedlo k převedení daptomycinu do butanolu. Byla provedena opakovaná extrakce fermentační kapaliny s butanolem za vzniku daptomycinu o celkové čistotě vyšší než 90% ve fermentační kapalině. Butanolová fáze byla extrahována s vodným acetátovým pufrem při pH 6,5 což vedlo k daptomycinu pětinásobně čištěnému (35%) a desetinásobně zkoncentrovanému vzhledem k fermentační kapalině. Vodný daptomycin byl mikrofiltrován metodou popsanou v United States petentu 4.885.243, a poté čištěn pomocí metody popsané v US. Pat. 4.874.843. Tato metoda vedla k daptomycinu o čistotě přibližně 91%. Daptomycin obsahoval 14 nečistot pomocí HPLC metody používané v současném stavu techniky. Produkt byl aplikován na kolonu s pryskyřicí Poros D50 v acetátovém pufru při pH 7,0 obsahujícím 6M močovinu. Promytí a eluování pryskyřice bylo provedeno podle popisu v Příklad 2. Produkt chromatografického kroku měl přibližně 98 až 99% čistotu (měřeno „druhou HPLC metodou.

Příklad 6

Daptomycin byl vyroben fermentací kultury S. roseosporus s tou výjimkou, že byla použita snížená zbytková koncentrace ·

«0 0

0000 •0 0» 00 10 0 0 0 0 » « 00 ·· živné kyseliny děkanové, za účelem zlepšení kvality fermentace na přibližně 10% čistotu po vyčeření pomocí mikrofiltrace nebo centrifugace. Koncentrace děkanové kyseliny byla monitorována a periodicky adjustována za účelem udržení zbytkové koncentrace děkanové kyseliny na úrovni nižší než 50 ppm a s výhodou mezi 1 až 10 ppm během fermentace. Fermentační kapalina byla mikrofiltrována metodou popsanou v United States patentu 4.885.243 za vzniku 12,1 kg částečně čištěného daptomycinu z 5500 1 fermentační kapaliny. Vyčeřená fermentační kapalina byla navázána na anion-výměnnou pryskyřici FP-DA 13 (Mitsubishi) v acetátovém pufru při neutrálním pH, promyta s acetátovým pufrem obsahujícím 30 mM NaCl a následně eluována s acetátovým pufrem 300 mM NaCl. Tento krok s anion-výměnnou pryskyřicí vedl k daptomycinu s čistotou vyšší než 70%. Tento částečně čištěný daptomycin byl dále čištěn pomocí meetody popsané v United States patentu 4.874.843 s tou modifikací, že byla použita pryskyřice HP-20ss. Částečně čištěný daptomycin byl navázán na pryskyřici HP-20ss v acetátovém pufru obsahujícím 10% acetonitrilu, byl promyt s acetátovým pufrem obsahujícím 30% acetonitril a byl eluován se 40% acetonitrilem v acetátovém pufru, což vedlo k daptomycinu s čistotou od asi 94 do 96% (měřeno „druhou HPLC metodou). Produkt byl podroben anionvýměnné chromatografii s modifikovaným pufrem s využitím pryskyřice Poros D50 podle popisu v Příkladu 5. Daptomycin měl čistotu vyšší než 99% a obsahoval pouze dvě ze čtrnácti nečistot vyrobených metodou techniky.

známou v současnem stavu

Příklad 7

Daptomycinový preparát s čistotou podle popisu v Příkladu 2. Produkt

93% byl připraven byl aplikován na «· »·»»♦ »» ·» 99 99

9 999· 9999

9· 99·· 99 9 · · · 99 999 · · · · «999 «99 • •99 99 99 9« 99 9999 pryskyřici Poros P150 (PE Biosystems) v acetátovém pufru pH 6,0 obsahujícím 2M močoviny. Pryskyřice Poros P150 byla promyta s trojnásobkem objemu pufru. Daptomycin byl eluován z pryskyřice s využitím 0 až 400 mM NaCl gradientu v acetátovém pufru pH 6,0, obsahujícím 2M močoviny. Daptomycin byl eluován mezi 150 a 300 mM NaCl. Daptomycin eluovaný z kolony měl čistotu 99,0 až 99,5% (měřeno „první HPLC metodou). Daptomycin obsahoval stopová množství čtyř nečistot, jejichž obsah byl menší než 1% celkového daptomycinu. V čištěném daptomycinovém preparátu anhydrodaptomycin nemohl být detekován (méně než 0,02% kontaminace).

Příklad 8

Daptomycinový preparát s čistotou 93% byl připraven podle popisu v Příkladu 2. Produkt byl aplikován na pryskyřici Poros P150 (PE Biosystems) v acetátovém pufru pH 6,0, obsahujícím 2M močovinu. Kolona byla promyta se šestinásobným objemem 60 mM NaCl v acetátovém pufru pH 6,0, obsahujícím 2M močoviny („promývací pufr). Promývací pufr se může pohybovat v rozmezí od 50 do 75 mM NaCl. Promytí odstranilo v podstatě všechen anhydro-daptomycin. Daptomycin byl eluován s šestnácti objemy 250 mM NaCl v acetátovém pufru pH 6,0, obsahujícím 2M močovinu. Čistota daptomycinu je 98,5 až 99,5% (měřeno „první HPLC metodou).

Příklad 9

Daptomycinový preparát popsaný · v Příkladu 2 byla připravena s využitím metody, která významně snížila koncentraci rozpouštědla požadovaného pro provedení HP-20ss chromátografie. Nečekaně, rozpouštědlo pro eluování daptomycinu, 40% acetonitril nebo 55 až 60% isopropylalkohol, bylo sníženo na 12% a 25%, když HP-20ss chromátografie byla o 9999 ••«β «* ··

9 9 ♦ · prováděna při neutrálním pH raději než pří kyselém pH jak bylo popsáno v United States patentu 4.874.843. V preferovaném provedení tohoto vynálezu mohou být použity změny pH k recyklování HP-20ss pryskyřice bez odstranění rozpouštědla.

Po eluování z FP-DA13 kolony při pH 6,5-7,0 byl daptomycin navázán na ekvilibrovanou kolonu HP-20ss, jako třeba na kolonu ekvilibrovanou v 60 mM acetátu při pH 6,6. Kolona byla promyta s pěti až osmi objemy (objem sloupce pryskyřice = CBV) promývacího pufru. Příkladem promývacího pufru je 5% isopropylalkohol/60mM acetát při pH 6,6. Daptomycin byl eluován z kolony s elučním pufrem. Příkladem

CBV

25% elučního pufru jsou dva až tři objemy isopropylalkohol/60 mM acetát pří pH 6,6. Kolona byla promyta s vymývacím pufrem. V jednom provedení tohoto vynálezu byla kolona vymyta s jedním CBV 40% isopropylalkohol/60 mM acetát při pH 6,6 až 7,0. Daptomycinový roztok byl adjustován na pH

3,5 až 4,0 a byl znovu navázán na kolonu HP-20ss pryskyřice za účelem zvýšení čistoty. V jednom provedení tohoto vynálezu je daptomycin, eluovaný z kolony HP-20ss pryskyřice při pH 6,5, adjustován na pH 3,5 s využitím 0,25M fosforečné kyseliny. Daptomycinový roztok byl znovu navázán na dříve vymytou kolonu HP-20ss, která byla ekvilibrována v 60 mM acetátu při pH 3,5. Kolona byla promyta s pH adjustačním o pH 6,5. Příklad pH adjustačního pufru je pět 5% isopropylalkohol/60 mM acetát při pH 6,6.

Daptomycin byl eluován s elučním pufrem a může být dále čištěn pomocí anion-výměnné chromatografie nebo jiné čistící metody, pokud je to vyžadováno. HP-20ss kolona byla vymyta s vymývacím pufrem a vyčištěna před opětovným použitím. Příklad čistícího procesu zahrnuje promytí se třemi objemy (CBV) 0,5 M NaOH, promytí s jedním objemem vody a poté pufrem např až osm CBV ·· • φ φ φ φ φ φ φ φ • φφφ <9 *··· ···« φφ φ · « · » · ·» ♦ φ φ φ φ· φφ promytí s 0,25Μ fosforečnou kyselinou před ekvilibrací. Kolona může být uskladněna v 0,5 M NaOH.

Příklad 10

Velký daptomycinový preparát připravený podle popisu v Příkladu 2 byl charakterizován pomocí semi-preparativní HPLC a charakterizovány pomocí kapalinové chromatografie/hmotnostní spktroskopie (LC/MS) s využitím jak positivního tak i negativního módu. Profil nečistot velkého daptomycinového preparátu před chromatografií na anionvýměnné pryskyřici Poros P150 je uveden v Tabulce 3 a chromatogram velkého daptomycinového preparátu je uveden na Obrázku 12.

Tabulka 3

Identifikační číslo nečistoty	Retenční čas	Pozorovaná molekulární	Lilly identifikační číslo	Cubist identifikační číslo	% celkové plochy pomocí HPLC
1	7.96	1638	LY212218	CB-131012	>0.5%, <1.0%
2	9.11	1638		CB-131011	<0.5%, >0.1%
3	11.54	745	LY213928	CB-131008	>0.5%, <1.0%
4	12.28	1624		CB-131006	<0.5%, >0.1%
5	13.10	1618		Neznámý-l	<0.5%, >0.1%
6	14.43	587	LY213827	CB-130989	>0.5%, <1.0%
7	14.43	1606		CB-131005	>0.5%, <1.0%
8	15.10	1620	LY213846	CB-1310I0	>1.0%, <4.0%
Dapto- mycin	16.68	1620	LY14603 2	CB-109187	>90%
9	17.92	874		Neznámý-2	<0.5%, >0.1%
10	19.57	1810		Neznámý-3	<0.5%, >0.1%
11	19.57	1635		Neznámý-4	<0.5%, >0.1%
12	20.93	859		CB-131009	<0.5%, >0.1%
13	23.11	1602	LY178480	CB-130952	>1.0, <4.0%
14	24.53	1634	LY 109208	CB-131078	<0.1

Nečistota 1 (CB-131012), která eluuje přibližně při 7,96 min (molekulární hmotnost: 1638). Předpokládá se, že jde o •φ φφ φφ •· φφφφ » · · • · • · • · · φφφφ φφ ·· • · · • ·· » « e φ · · ·· • · · · • · · • · · · φ > « «φ φφφφ produkt hydrolýzy laktonu daptomycinu (Obrázek 4). Zdá se, že výsledky jsou v souhlase s LY212218, identifikovaném dříve Lilly jako derivát daptomycinu s otevřeným decylovým kruhem.

Nečistota 2 (CB-131011), která eluuje přibližně při 9,11 min (molekulární hmotnost: 1638). Předpokládá se, že jde také o produkt hydrolýzy laktonu β-isomeru daptomycinu (Obrázek 5).

Nečistota 3 (CB-131008), která eluuje přibližně při 11,54 min (molekulární hmotnost: 745). Předpokládá se, že jde o lineární lipopeptid skládající se z řetězce pěti aminokyselin obsahujícího tryptofan, asparagin, aspartát, threonin a glycin s řetězcem děkanové kyseliny (Obrázek 6) . Zdá se, že výsledky jsou v souhlase s LY213928, identifikovaném dříve Lilly.

Nečistota 4 (CB-131006), která eluuje přibližně při 12,28 min (molekulární hmotnost: 1624). Předpokládá se, že jde o oxidovaný analog daptomycinu, ve kterém byla aminokyselina tryptofan oxidována na kyanurovou kyselinu (Obrázek 7).

Nečistota 5, která eluuje přibližně při 13,10 min (molekulární hmotnost: 1618). Její struktura zatím nebyla určena.

Nečistota 6 (CB-130989) a Nečistota 7 (CB-131005), které společně eluují přibližně při 14,43 min. Zdá se, že CB-130989 (MW: 587) je shodná s LY213827, lineárním lipopeptidem skládajícím se z řetězce tří aminokyselin obsahujícího tryptofan, asparagin a aspartát, s řetězcem děkanové kyseliny (Obrázek 8) , jak bylo dříve identifikováno Lylly. CB-131005 (molekulární hmotnost: 1606) odpovídá daptomycinovému • · · · analogu, ve kterém dekanová kyselina postrádá jednu methylovou skupinu (Obrázek 9).

Nečistota 8 (CB-131010), která eluuje přibližně při 15,10 min (molekulární hmotnost: 1620) se shoduje s LY213846 (b-isomer)

jak bylo β-isomeru	dříve identifikováno je vyšší než 1%.	Lilly	(Obrázek 2	) Koncentrace
Nečistota	9, která eluuje	přibližně při	17,92 min
(molekulární hmotnost: 874).	Její	struktura	zatím nebyla

určena.

Nečistoty 10 a 11, která společně eluují přibližně při 19,57. Jejich struktura zatím nebyla určena.

Nečistota 12 (CB-131009), která eluuje přibližně při 20,93 min (molekulární hmotnost: 859) . Předpokládá se, že jde o lineární lipopeptid skládající se z řetězce šesti aminokyselin obsahujícího tryptofan, asparagin, aspartát, threonin, glycin a ornithin, s řetězcem děkanové kyseliny (Obrázek 10).

Nečistota 13 (CB-130952), která eluuje přibližně při 23,11 min (molekulární hmotnost: 1602). Předpokládá se, že jde o anhydro-daptomycin (Obrázek 3) a zdá se, že jde o stejnou sloučeninu jako LY178480. Koncentrace anhydro-daptomycinu je vyšší než 1%.

Nečistota 14 (CB-131078), která eluuje přibližně při 24,53 min (molekulární hmotnost: 1634). Zdá se, že se shoduje s LY109208, který byl dříve identifikován Lilly jako • « · · · · • » daptomycinový analog obsahující jednu methylovou skupinu navíc v řetězci děkanové kyseliny (Obrázek 11).

Velký daptomycnový preparát může být čištěn na Poros P150 podle popisu v Příkladech 2 nebo 7 až 8 nebo může být čištěn na Poros D50 podle výše uvedeného popisu v Příkladech 3 až 5. Po čištění na Poros P150 podle popisu v Příkladu 2 vykazuje chromatogram (Obrázek 13), že čistota daptomycinu je vyšší než 99,0%, přičemž koncentrace β-isomeru a anhydrodaptomycinu je pod detekčním limitem (méně než 0,05% celkově). Je zde pouze jedna nečistota, která je přítomna v množství vyšším než 0,1% ovšem zároveň méně než 0,5%.

Příklad 11

Fermentace kultury S. roseosporus NRRL kmen 15998 byla prováděna za podmínek kontrolovaného přísunu děkanové kyseliny při koncentracích optimalizovaných pro produkci antibiotika, přičemž byl minimalizován vznik kontaminantů. Zbytková koncentrace kyseliny děkanové byla měřena pomocí plynové chromatografie a cílová zbytková koncentrace byla 10 ppm děkanové kyseliny od nastartování indukce až do sběru (přibližně 30 h). Centrifugace kultury a následná analýza vyčeřené kapaliny bylo použito pro měření produkce daptomycinu pomocí HPLC. Titr sebrané kapaliny byl typicky mezi 1,0 a 3,0 g na litr fermentační kapaliny.

Fermentace byla zpracována buď mikrofiltrací s využitím Pall-Sep nebo pomocí průmyslové centrifugy a hlubokého filtru. Vyčeřený roztok byl aplikován na anion-výměnnou pryskyřici, Mitsubishi FP-DA 13, promyt s 30 mM NaCl při pH

6,5 a eluován se 300 mM NaCl při 6,0 až 6,5. Alternativně, FP-DA 13 kolona byla promyta se 60 mM NaCl pří pH 6,5 a eluována s 500 mM NaCl při pH 6,0 až 6,5. pH bylo adjustováno • · · · • · na 3,0 až 4,8 a teplota byla nastavena na 2 až 15 °C. Za těchto okolností tvoří daptomycin micely. Micelární daptomycinový roztok byl čištěn promýváním micelárního preparátu zatímco byl preparát zachycen na ultrafiltru s využitím 10000 NMW filtru (AG Technology Corp. UF duté vlákno nebo ekvivalent) v libovolné konfiguraci. Daptomycinové micely byly zachyceny na filtru, ovšem velké množství nečistot bylo eliminováno, protože prošli přes 10000 NMW filtr. Ultrafiltrace daptomycinových micel zvýšila čistotu daptomycinu ze 40% na přibližně 80% nebo vyšší.

Eluát byl aplikován na HIC pryskyřici, HP-20ss, promyt se 30% acetonitrilem a eluován se 35% acetonitrilem při pH 4,0 až 5,0. Alternativně, HIC pryskyřice byla promyta s 20 až 30% isopropylalkoholem a eluována se 30 až 40% isopropylalkoholu při pH 3,5 až 6,5. Eluát byl aplikován na FP-DA 13 pryskyřici a byl promyt jako předtím. Konečný anionvýměnný krok redukoval rozpouštědlo o jednu třetinu nebo více. Byla provedena reverzní osmotická diafiltrace a zkoncentrování při pH 1,5 až 2,5 s využitím 0,2 μπι filtru a daptomycinový preparát byl zmražen. Finální reverzní osmotická diafiltrace byla prováděna s vodou pro injekce (WFI) kvůli vymytí daptomycinu a kvůli nastavení jeho koncentrace před plněním ve sterilních podmínkách. Viálky nebo velké objemy daptomycinu byly poté lyofylizovány.

Příklad 12

Lyofilizovaný daptomycin čištěný podle popisu v libovolných výše uvedených příkladech, jako třeba v Příkladu 11, byl rekonstituován ve fyziologickém solném roztoku (přibližně 140 mM NaCl) při pH 4,0 až 5,0. Za těchto okolností je daptomycin přítomný ve formě micel a může být • · « · použit pro injekce nebo pro intravenosní, parenterální, orální nebo místní podávání.

Příklad 13

Daptomycin byl vyroben fermentaci a fermentační kapalina byla vyčeřena mikrofiltrací podle popisu v Příkladu 11. Vyčeřená kapalina byla aplikována na anion-výměnnou pryskyřici, Mitsubishi FP-DA 13, promyta s 30 mM NaCI při pH

6,5 a eluována s 300 mM NaCI při pH 6,0 až 6,5 za vzniku daptomycinového preparátu o čistotě přibližně 40%. Eluát byl adjustován na pH 3,5 pomocí ředěné kyseliny fosforečné, takže prakticky všechen daptomycin tvořil micely. Micelární přípravek byl nanesen na 10000 NMW ultrafiltrační membránu. Daptomycinový preparát byl promyt se 30 mM acetátu sodného při pH 3,5 a teplotě do 15 °C. Redukce objemu a promytí snížilo koncentraci kontaminantů, což vedlo k čistotě daptomycinového preparátu o čistotě 85%. Daptomycinový preparát může být dále čištěn s využitím libovolné výše popsané metody.

Příklad 14

Daptomycin byl vyroben fermentaci a fermentační kapalina byla vyčeřena mikrofiltrací a frakcionací na FP-DA 13 podle popisu v Příkladu 11. Eluát byl adjustován na pH 3,5 pomocí ředěné kyseliny fosforečné tak, že prakticky všechen daptomycin tvořil micely. Micelární přípravek byl nanesen na 10000 NMW ultrafiltrační membránu. Daptomycinový preparát byl promyt se 30 mM acetátu sodného při pH 3,5 a teplotě do 15 °C. Redukce objemu a promytí snížilo koncentraci kontaminantů, což vedlo k čistotě daptomycinového preparátu o čistotě 80 až 90%. Daptomycinový preparát může být dále čištěn s využitím libovolné výše popsané metody.

• « ··· ·

Příklad 15

Daptomycin byl vyroben fermentací a fermentační kapalina byla vyčeřena mikrofiltrací podle popisu v Příkladu 11. Preparát byl čištěn pomocí chromatografie s hydrofobními interakcemi podle popisu v United States patentu 4.874.843, který je zde zahrnutý jako reference. Čistota daptomycinu byla 93% s viditelnými nečistotami na HPLC chromatogramu a měřitelným pyrogenem. Produkt byl naředěn s vodou a jeho pH bylo adjustováno na pH 6,5 s NaOH nebo jeho ekvivalentem. Daptomycinový přípravek byl zfiltrován přes 10000 NMW ultrafiltrační membránu. Za těchto okolností je daptomycin monomerní a prochází přes ultrafiltrační membránu. Vzniklý produkt vykazuje 93% čistotu, ovšem několik nečistot, které byly přítomny v množstvích 0,1 až 0,2% byly odstraněny ultrafiltrační membránou. Kromě toho byl redukován obsah pyrogenu na nedetekovatelnou úroveň.

Příklad 16

Daptomycinový přípravek o čistotě 93% byl připraven podle popisu v Příkladu 15. Daptomycinový přípravek byl převeden do micelárního stavu snížením pH na 4,7 pomocí HC1 nebo ekvivalentu a ochlazením daptomycinového přípravku na 2 až 5 °C. Produkt byl zkoncentrován ze 400 1 na tři litry a na finální koncentraci přibližně 100 mg/ml pomocí filtrace na 10000 NMW ultrafiltrační membráně. Za těchto okolností byl daptomycin zadržen membránou. To vedlo k velkému zvýšení daptomycinové koncentrace. Čistota byla přibližně 93%.

Příklad 17

Daptomycinový preparát v Příkladu 16. Vialky byly daptomycinu a lyofilizovány.

byl připraven podle popisu naplněny s přibližně 250 mg Daptomycin byl rekonstituován

44

4 4 4 ♦ · ♦

4 4 •4 4444

v 50 ml sterilní 150 mM solance při pH 4,0 až 5,0 pro podávání lidem nebo zvířecím pacientům. Dávka daptomycinu, která má být podávána, bude záviset na druhu infekce, věku a hmotnosti pacienta a druhu zvířete. Při pH 4,0 až 5,0 bude daptomycin ve 150 mM solance přítomen v micelárním stavu, který je rozpustný a vhodný pro intravenosní, intramuskulární nebo parenterální podávání. Formulace bude minimalizovat lokální podráždění vzhledem k lipopeptidické povaze daptomycinu.

Příklad 18

Daptomycinové micel byly vyrobeny s využitím daptomycinu při koncentraci 1,0 mg/ml ve vodě při pH 4,0 při teplotě 25 °C. Velikost daptomycinových micel byla změřena s využitím Zetasizer™ (Malvern Instruments, Model 3000 HS) . Rychlost počítání 36,3, typem cely byla kapilární cela, detekční úhel (deg) byl 90 ° a vlnová délka (nm) byla 633. Výsledky naznačují, že průměr micel byl 54 Á, což je asi dvakrát větší než je průměr monomerní daptomycinové molekuly. Viz Obrázek 18 .

Všechny publikace a patentové přihlášky citované v tomto vynálezu jsou zde zahrnuty jako reference. Ačkoliv předložený vynález byl v některých detailech popsán pomocí ilustrací a příkladů pro lepší pochopení a srozumitelnost, odborníkovi v oboru bude zřejmé, že ve světle tohoto vynálezu mohou být provedeny určité změny a modifikace aniž bychom se vzdálili duchu a rozsahu připojených nároků.

Claims

Patentové nároky

1. Daptomycinový preparát, vyznačující se tím, že je v podstatě čistý.
2. Daptomycinový preparát, vyznačující se tím, že má alespoň 98% čistotu.
3. Daptomycinový preparát, vyznačující se tím, že je v podstatě zbaven anhydro-daptomycinu a v podstatě zbaven β-isomeru daptomycinu.
4. Daptomycinový preparát podle nároku 3, vyznačující se tím, že je v podstatě zbaven anhydro-daptomycinu.
5. Daptomycinový preparát podle nároku 3, vyznačující se tím, že je zbaven anhydrodaptomycinu .
6. Daptomycinový preparát podle nároku,v yznačuj ící se t i m, že je prakticky zbaven každé z nečistot 1 až 14 uvedených v Tabulce 3 a na Obrázcích 2 až 11.
7. Daptomycinový preparát podle nároku 6, vyznačující se tím, žejev podstatě zbaven každé z nečistot 1 až 14.
8. Daptomycinový preparát podle nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že daptomycinové nečistoty jsou měřeny pomocí HPLC.

4 4 4444

44 ·4 44 44

44 4 4444 444*

44 44 44 44 4 * 444 4 4 · · 4 4 ·

4 44 4444 444

4444 44 44 44 4· 4444
9. Farmaceutický přípravek obsahující daptomycin, vyznač ující se tím, že daptomycin je vybrán ze skupiny obsahující v podstatě čistý daptomycin, daptomycin mající alespoň 98% čistotu, daptomycin prakticky zbavený anhydrodaptomycinu a prakticky zbavený β-isomeru daptomycinu, daptomycin v podstatě zbavený anhydro-daptomycinu a prakticky zbavený β-isomeru daptomycinu, daptomycin zbavený anhydrodaptomycinu a prakticky zbavený β-isomeru daptomycinu, daptomycin prakticky zbavený nečistot 1 až 14 a daptomycin v podstatě zbavený nečistot 1 až 14.
10. Farmaceutický přípravek podle nároku 9, vyznačující se tím, že dále obsahuje jedno nebo více antibiotik, jedno nebo více protihoubových činidel nebo jak antibiotikum tak i protihoubové činidlo.
11. Způsob čištění daptomycinu, vyznačující se tím, že daptomycin je vybrán ze skupiny obsahující v podstatě čistý daptomycin, daptomycin mající alespoň 98% čistotu, daptomycin prakticky zbavený anhydro-daptomycinu a prakticky zbavený β-isomeru daptomycinu, daptomycin v podstatě zbavený anhydro-daptomycinu a prakticky zbavený βisomeru daptomycinu, daptomycin zbavený anhydro-daptomycinu a prakticky zbavený β-isomeru daptomycinu, daptomycin prakticky zbavený nečistot 1 až 14 a daptomycin v podstatě zbavený nečistot 1 až 14;

a zahrnující kroky:

a) pořízení daptomycinového preparátu obsahujícího dohromady alespoň 2,5% anhydro-daptomycinu a β-isomeru;

b) navázání daptomycinového preparátu na anion-výměnnou pryskyřici v přítomnosti modifikovaného pufru za podmínek,

44 44

4 4 4 4

4 4 «

4 4 4

4 4 4

44 4444 • 4 • 4 4♦ ·*

4 4 »·«· 44 kdy se daptomycin váže na anion-výměnnou pryskyřici v monomerním nemicelárním stavu;

c) promytí anion-výměnné pryskyřice v přítomnosti modifikovaného pufru za podmínek, kdy se eluuje anhydrodaptomycin, ale nikoliv daptomycin; a

d) eluování daptomycinu v přítomnosti modifikovaného pufru za podmínek dovolujících separaci daptomycinu od β-isomeru daptomycinu.
12. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 11, vyznačující se tím, že anion-výměnná pryskyřice je Poros D50 nebo P150.
13. Způsob čištění daptomycinu podle nároků 11 a 12, vyznačující se tím, že iontový modifikovaný pufr obsahuje močovinu v 2 až 6 molární koncentraci a jeho pH je 6,0 až 7,0.
14. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 11, vyznačující se tím, že dále obsahuje krok filtrace a zkoncentrování eluovaného daptomycinu.
15. Způsob čištění daptomycinu, vyznačující se tím, že daptomycin je vybrán ze skupiny obsahující v podstatě čistý daptomycin, daptomycin mající alespoň 98% čistotu, daptomycin prakticky zbavený anhydro-daptomycinu a prakticky zbavený β-isomeru daptomycinu, daptomycin v podstatě zbavený anhydro-daptomycinu a prakticky zbavený βisomeru daptomycinu, daptomycin zbavený anhydro-daptomycinu a prakticky zbavený β-isomeru daptomycinu, daptomycin prakticky

00 00

0 0 0 0 • 0 · •0 ·*>» • 0 · • · • · 0 0 0 «000 00 ·» · * • 0 0 0 • * 00

0 0 0 0

0 0 0 0 «00 00 «000 zbavený nečistot 1 až 14 a daptomycin v podstatě zbavený nečistot 1 až 14; a zahrnující kroky:

a) fermentace Streptomyces roseosporus s živnou kyselinou děkanovou za vzniku daptomycinu ve fermentační kapalině;

b) vyčeření fermentační kapaliny;

c) podrobení fermentační kapaliny anion-výměnné chromatografii za vzniku obohaceného daptomycinového preparátu;

d) podrobení obohaceného daptomycinového preparátu chromatografii s hydrofobními interakcemi za vzniku částečně čištěného daptomycinového preparátu; a

e) podrobení částečně čištěného daptomycinového preparátu anion-výměnné chromatografii s modifikovaným pufrem za vzniku čištěného daptomycinu.
16. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 15, vyznačující se tím, že živná n-dekanová kyselina v kroku a) je regulována tak, aby bylo během fermentace dosaženo residuálni koncentrace n-dekanové kyseliny nikoliv vyšší než 50 part per milion (ppm).
17. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 15, vyznačující se tím, že vyčeření v kroku b) zahrnuje extrakci fermentační kapaliny s pufrem obsahujícím butanol.
18. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 15, vyznačující se tím, že anion-výměnná chromatografie v kroku c) se provádí na pryskyřici FP-DA 13.
19. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 15, r9 »»r*

99 »9 9* *9 • * · · 9 99 9 • · 9 · · · ·

81 9 9 • 99» 9· ··<· 999 ·· 99 99 99 9999 vyzná čující se tím, že chromatografie s hydrofobními interakcemi v kroku d) se provádí na pryskyřici HP-20ss. 20. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 19, vyzná čující se tím, že chromatografie s hydrofobními interakcemi se provádí při pH 6,0 až 7,0 a

koncentrace použitého rozpouštědla je snížená ve srovnání s chromatografií s hydrofobními interakcemi prováděnou při pH 4,0 až 5,0.
21. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 20, vyznačující se tím, že částečně čištěný daptomycin je eluován s acetonitrilem o koncentraci 10 až 20%.
22. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 20, vyznačující se tím, že částečně čištěný daptomycin je eluován s isopropylalkoholem o koncentraci 20 až 25%.
23. Způsob čištění daptomycinu podle nároků 20, 21 nebo 22, vyznačující se tím, že pryskyřice HP-20ss se recykluje změnou pH pryskyřice bez kroku odstraňování rozpouštědla.
24. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 15, vyznačující se tím, že anion-výměnná chromatografie s modifikovaným pufrem v kroku e) se provádí na pryskyřici Poros D50 nebo Poros P150.
25. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 24, • · · · • 9 9 · <» ·* • * vyznačující se tím, že anion-výměnná chromátografie s modifikovaným pufrem v kroku e) zahrnuje kroky:

i) zajištění částečně čištěného daptomycinového preparátu z kroku d) v pufru vhodném pro anion-výměnnou chromatografii s modifikovaným pufrem;

ii) navázání daptomycinového preparátu na anion-výměnnou pryskyřici v přítomnosti modifikovaného pufru za takových podmínek, kdy se daptomycin váže na anion-výměnnou pryskyřici v monomerním nemicelárním stavu;

iii) promývání anion-výměnné pryskyřice v přítomnosti modifikovaného pufru za podmínek, kdy se eluuje anhydrodaptomycin, ovšem daptomycin je zadržován; a iv) eluování daptomycinu v přítomnosti modifikovaného pufru za podmínek dovolujících separaci daptomycinu od β-isomeru daptomycinu.
26. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 25, vyznačující se tím, že promývací a eluční krok zahrnují použití kontinuálního solného gradientu nebo krokového solného gradientu.
27. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 15, vyznačující se tím, že buď jeden nebo oba kroky c) a e) zahrnují použití kontinuálního solného gradientu nebo krokového solného gradientu.
28. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 15, vyznačující se tím, že se provádí pomocí chromarografie s kontinuálním tokem nebo pomocí chromátografie s radiálním tokem.

• · • · • ·
29. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 15, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok anion-výměnné chromatografíe před krokem e).
30. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 15, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok filtrace a/nebo koncentrace daptomycinu.
31. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 15, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok depyrogenace daptomycinu.
32. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 31, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok lyofilizace daptomycinu.
33. Daptomycin vyrobený způsobem podle některého z nároků 11 až 32 .
34. Izolovaná sloučenina vybraná ze skupiny obsahující CB131011, CB-131006, CB-131005 a CB-131009.
35. Způsob léčení infekcí u pacientů, vyznačuj ící se t í m, že se potřebným pacientům podává účinné množství farmaceutického přípravku podle některého z nároků 9 nebo 10.
36. Způsob léčení podle nároku 35, vyznačuj ící se t í m, že se potřebným pacientům současně podává antibakteriální činidlo jiné než daptomycin.
37. Způsob léčení podle nároku 36, vyznačuj ící tím, že zmíněné antibakteriální činidlo je vybráno ze • » • ·· ·

9 · isoniazid, kyselina skupiny obsahující peniciliny a příbuzná léčiva, karbapenemy, cefalosporiny a příbuzná léčiva, aminoglycosidy, bacitracin, gramicidin, mupirocin, chloramfenikol, thiamfenikol, natriumfusidat, lincomycin, clindamycin, makrolidy, novobiocin, polymyxiny, rifamyciny, spektinomycin, tetracykliny, vankomycin, teikoplanin, streptograminy, činidla proti listové kyselině včetně sulfonamidů, trimethoprim a jeho kombinace a pyrimethamin, synthetická antibakteriální činidla včetně nitrofuranů, methenamin mandelát a methenamin hippurát, nitroimidazoly, chinolony, fluorochinolony, ethambutol, pyrazinamid, para-aminosalicylová /PAS), cykloserin, capreomycin, ethionamid, prothionamid, thiacetazon, glykopeptid, glycylcylcline, imipenen, amikacin, ceftriaxon, Ziracin, eveminomycm, oxazolidinon;

viomycm, ketolidy a netilmicin, fosfomycin, gentamicin, LY 333328, CL 331002, HMR 3647,

Linezolid, Synercid, Aztreonam a Metroriidazol, Epiroprim, OCA-983, GV-143253, Sanfetrinem sodium, CS-834, Biapenem, A99058.1, A-165600, A-179796, KA 159, Dynemicin A, DX8739, DU 6681; Cefluprenam, ER 35786, Cefoselis, Sanfetrinem celexetil, HGP-31, Cefpirom, HMR-3647, RU-59863, Mersacidin, KP 736, Rifalazil; Kosan, AM 1732, MEN 10700, Lenapenem, BO 2502A, NE-1530, PR 39, K130, OPC 20000, OPC 2045, Veneprim, PD 138312, PD 140248, CP 111905, Sulopenem, ritipenam acoxyl, RO-65-5788, Cyclothialidine, Sch-40832, SEP 132613, micacocidin A, SB-275833, SR-15402, SUN A0026, TOC 39, carumonam, Cefozopran, Cefetamet pivoxil a T 3811.
38. Způsob léčení podle nároku 36, vyznačuj ící se t í m, že zmíněné antibakteriální činidlo je vybráno ze skupiny obsahující imipenen, amikacin, netilmicin, fosfomycin, gentamicin, ceftriaxon, teicoplanin, Ziracin, LY • · · · • ·

333328, CL 331002, HMR 3647, Linesolid, Synercid, Aztreonam a Metronidazol.
39. Způsob léčení podle nároku 35, vyznačuj ící se t í m, že se potřebným pacientům současně podává protihoubové činidlo.
40. Způsob léčení podle nároku 39, vyznačuj ící se t i m, že zmíněné protihoubové činidlo je vybráno ze skupiny obsahující polyeny, azoly, allylaminy, antimetabolity, Fusacandiny a Sordariny.
41. Způsob léčení podle nároku 39, vyznačuj ící se t i m, že zmíněné protihoubové činidlo je vybráno ze skupiny obsahující Amphotericin, Nystatin, Primaricin; Fluconazol, Itraconazol, Ketoconazol, Naftifin, Terbinafin, Flucytosin, Corynecandin, Mer-WF3010, Artrichitin/LL 15G256y, Cispentacin, Azoxybacillin, Aureobasidin nebo Khafrefungin.
42. Způsob čištění daptomycinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

a) fermentace Streptomyces roseosporus s živnou děkanovou kyselinou za vzniku fermentační kapaliny;

b) vyčeření fermentační kapaliny;

c) podrobení fermentační kapaliny anion-výměnné chromatografii za vzniku obohaceného daptomycinového preparátu;

d) podrobení obohaceného daptomycinového preparátu chromatografii s hydrofobními interakcemi za vzniku částečně čištěného daptomycinového preparátu; a

e) podrobení částečně čištěného daptomycinového preparátu anion-výměnné chromatografii za vzniku čištěného daptomycinu.

• · • · · · ··········· * · ···· · · ·
43. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že živná n-dekanová kyselina v kroku a) je regulována tak, aby bylo během fermentace dosaženo residuální koncentrace n-dekanové kyseliny nikoliv vyšší než 50 part per milion (ppm).
44. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že zmíněné vyčeření v kroku b) zahrnuje filtraci nebo centrifugaci a hlubokou filtraci.
45. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že anion-výměnná chromatografie v kroku c) se provádí na pryskyřici FP-DA 13.
46. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že chromatografie s hydrofobními interakcemi v kroku d) se provádí na pryskyřici HP-20ss.
47. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 46, vyznačující se tím, že chromatografie s hydrofobními interakcemi se provádí při neutrálním pH a koncentrace použitého rozpouštědla je snížená ve srovnání s chromatografií s hydrofobními interakcemi prováděnou při kyselém pH.
48. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 47, vyznačující se tím, že pryskyřice HP-20ss se recykluje naplněním kolony při kyselém pH a eluováním kolony při neutrálním pH.

• · · ·· · · · · * ·· ·· • ·· · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ····
49. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že anion-výměnná chromatografie v kroku e) se provádí na FP-DA 13 pryskyřici.
50. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že se anion-výměnná chromatografie v kroku e) používá k redukci koncentrace rozpouštědla z kroku d).
51. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že buď jeden nebo oba kroky c) nebo e) zahrnují použití kontinuálního solného gradientu.
52. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že buď jeden nebo oba kroky c) nebo e) zahrnují použití krokového solného gradientu.
53. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že se provádí pomocí chromatografie s kontinuálním tokem.
54. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok filtrace a/nebo koncentrování daptomycinu.
55. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok depyrogenace daptomycinu s využitím ultrafiltrace.
56. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 55, • · • · · ··· · * ·· ·· • · · · · · · A • · A A AA A · A vyznačující se tím, že zmíněná depyrogenace zahrnuje kroky

i) zajištění daptomycinové roztoku za takových podmínek, při kterých je daptomycin v monomerním a nemicelárním stavu, ii) filtrování daptomycinového roztoku za podmínek, při kterých bude daptomycin přecházet přes filtr, ovšem pyrogeny pře filtr procházet nebudou, iii) změna podmínek daptomycinového roztoku prošlého filtrem tak, že daptomycin agreguje, iv) filtrování daptomycinového roztoku za podmínek, při kterých bude daptomycin zůstávat na filtru,

v) shromáždění daptomycinu.
57. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 55, vyznačující se tím, že dále zahrnuje krok lyofilizace daptomycinu.
58. Způsob čištění daptomycinu podle nároku 42, vyznačující se tím, že se provádí pomocí chromatografie s radiálním tokem.
59. Lipopeptidové uspořádání micelárního typu, vyznačující se tím, že lipopeptid je vybrán ze skupiny obsahující daptomycin, A54145, daptomycinu příbuzný lipopeptid a antibiotikum A-21978, ve kterém je ndekanoylový postranní řetězec daptomycinu nahrazen noktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, ndodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem.

·· ·· • · · ♦ • ♦ ·

9 9 9
60. Lipopeptidové uspořádání micelárního 59, vyznačující se tím, daptomycin.

typu podle nároku že lipopeptidem je
61. Lipopeptidové uspořádání micelárního typu podle nároku 59, vyznačující se tím, že lipopeptidové uspořádání micelárního typu je sférická, laminární nebo cylindrická micela, lipidické vesikulum nebo liposom.
62. Lipopeptidové uspořádání micelárního typu podle nároku 61, vyznačující se tím, že lipopeptidové uspořádání micelárního typu je sférická micela, lipidické vesikulum nebo liposom.
63. Lipopeptidové uspořádání micelárního typu podle nároku 59, vyznačující se tím, že lipopeptidová micela je směsná micela.
64. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje lipopeptidové micely, kde lipopeptid je vybrán ze skupiny obsahující daptomycin, A54145, daptomycinu příbuzný lipopeptid a antibiotikum A-21978, ve kterém je ndekanoylový postranní řetězec daptomycinu nahrazen noktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, ndodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo n-tetradekanoylovým postranním řetězcem;

přičemž lipopeptidová micela je sférická, laminární nebo cylindrická nebo vesikulum nebo směsná micela.
65. Farmaceutický přípravek podle nároku 64, vyznačující se tím, že dále zahrnuje jedno nebo více terapeutických činidel.

999 9 • 9 99 «9 9«

9 9 · 9 « 9 · · 9 · 9

99 99 99 9 ⁹⁰ . : :: : : :

9999 ·9 ·· 99 99 9999
66. Farmaceutický přípravek podle nároku 65, vyznačující se tím, že terapeutické činidlo je vybráno ze skupiny obsahující protizánětlivé činidlo, protihoubové činidlo a antibiotikum.
67. Farmaceutický přípravek podle nároku 65, vyznačující se tím, že terapeutické činidlo je zabudováno uvnitř micely nebo tvoří část micely.
68. Farmaceutický přípravek podle nároku 66, vyznačující se tím, že antibakteriální činidlo je vybráno ze skupiny obsahující peniciliny a příbuzná léčiva, karbapenemy, cefalosporiny a příbuzná léčiva, aminoglycosidy, bacitracin, gramicidin, mupirocin, chloramfenikol, thiamfenikol, natrium-fusidat, lincomycin, clindamycin, makrolidy, novobiocin, polymyxiny, rifamyciny, spektinomycin, tetracykliny, vankomycin, teikoplanin, streptograminy, činidla proti listové kyselině včetně sulfonamidů, trimethoprim a jeho kombinace a pyrimethamin, synthetická antibakteriální činidla včetně nitrofuranů, methenamin mandelát a methenamin hippurát, nitroimidazoly, chinolony, fluorochinolony, isoniazid, ethambutol, pyrazinamid, para-aminosalicylová kyselina (PAS), cykloserin, capreomycin, ethionamid, prothionamid, thiacetazon, viomycin, eveminomycin, glykopeptid, glycylcylcline, ketolidy a oxazolidinon; imipenen, amikacin, netilmicin, fosfomycin, gentamicin, ceftriaxon, Ziracin, LY 333328, CL 331002, HMR 3647, Linezolid, Synercid, Aztreonam a Metroriidazol, Epiroprim, OCA-983, GV-143253, Sanfetrinem sodium, CS-834,

Biapenem, A-99058.1, A-165600, A-179796, KA 159, Dynemicin A, DX8739, DU 6681; Cefluprenam, ER 35786, Cefoselis, Sanfetrinem celexetil, HGP-31, Cefpirom, HMR-3647, RU-59863, • 4 444 · • · 9

4 44

Mersacidin, KP 736, Rifalazil; Kosan, AM 1732, MEN 10700, Lenapenem, BO 2502A, NE-1530, PR 39, K130, OPC 20000, OPC 2045, Veneprim, PD 138312, PD 140248, CP 111905, Sulopenem, ritipenam acoxyl, RO-65-5788, Cyclothialidine, Sch-40832, SEP 132613, micacocidin A, SB-275833, SR-15402, SUN A0026, TOC 39, carumonam, Cefozopran, Cefetamet pivoxil a T 3811.
69. Farmaceutický přípravek podle nároku 68, vyznačující se tím, že zmíněné antibakteriální činidlo je vybráno ze skupiny obsahující imipenen, amikacin, netilmicin, fosfomycin, gentamicin, teicoplanin, Ziracin, LY333328, CL331022, HMR3647, Linesolid a Synercid, Aztreonam a Metronidazol.
70. Farmaceutický přípravek podle nároku 66, vyznačující se tím, že zmíněné protihoubové činidlo je vybráno ze skupiny obsahující polyeny, azoly, allylaminy, antimetabolity, Fusacandiny a Sordariny.
71. Farmaceutický přípravek podle nároku 66, vyznačující se tím, že zmíněné protihoubové činidlo je vybráno ze skupiny obsahující Amphotericin, Nystatin, Primaricin; Fluconazol, Itraconazol, Ketoconazol, Naftifin, Terbinafin, Flucytosin, Corynecandin, Mer-WF3010, Artrichitin/LL 15G256y, Cispentacin, Azoxybacillin, Aureobasidin a Khafrefungin.
72. Způsob léčení infekcí u pacientů, vyznačuj ící se t i m, že se potřebným pacientům podává účinné množství farmaceutického přípravku podle nároků 64 až 71.

• · ··· ·
73. Způsob léčení podle nároku 72, vyznačuj ící se t í m, že farmaceutický přípravek obsahuje daptomycin.
74. Způsob léčení podle nároku 72, vyznačuj ící se t i m, že se potřebným pacientům dále současně podává protihoubové činidlo, protizánětlivé antibiotikum jiné než lipopeptid.

činidlo nebo
75. Způsob čištění lipopeptidového antibiotika, vyznačující se tím, že lipopeptidové antibiotikum je vybráno ze skupiny obsahující daptomycin, A54145, daptomycinu příbuzný lipopeptid a antibiotikum A21978, ve kterém je n-dekanoylový postranní řetězec daptomycinu nahrazen n-oktanoylovým, n-nonanoylovým, nundekanoylovým, n-dodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo ntetradekanoylovým postranním řetězcem;

zahrnující kroky:

i) zajištění lipopeptidového preparátu v monomerním a nemicelárním stavu;

ii) změna podmínek lipopeptidového roztoku tak, že lipopeptid tvoří micely;

iii) separace lipopeptidových micel od nízkomolekulárního materiálu; a ív) shromáždění lipopeptidových micel.
76. Způsob čištění lipopeptidového antibiotika podle nároku 75,vyznačující se tím, že lipopeptidem je daptomycin.
77. Způsob čištění lipopeptidového antibiotika podle nároku

75, vyznačující tím, že lipopeptidové φφ «φφφ

ΦΦ ΦΦ «V ·· φ · φ φφφφ φφφφ φφ φφφφ φφ φ φ φφφ φφ φφφ φ φ φ φφ φφφφ φφφ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφφφ micely jsou separovány od nízkomolekulárního materiálu pomocí ultrafiltrace.
78. Způsob čištění podle nároku 77, vyznačuj ící se t í m, že se ultrafiltrace provádí s využitím membrán o nominální molekulové hmotnosti 10000 nebo 30000.
79. Způsob čištění podle nároku 75, vyznačuj ící se t í m, že dále zahrnuje kroky:

e) podrobení lipopeptidů sebraného v kroku d) podmínkám, při kterých lipopeptidové micely disociují na lipopeptidové monomery;

f) separace lipopeptidových monomerů od vysokomolekulárního materiálu; a

g) sebrání lipopeptidového monomeru.
80. Způsob čištění podle nároku 75, vyznačuj ící se t í m, že se používá anion-výměnná chromatografíe nebo opakovaná hydrofobní chromatografíe za vzniku lipopeptidového preparátu z kroku a).
81. Způsob čištění daptomycinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

a) fermentace Streptomyces roseosporus s živnou n-dekanovou kyselinou za vzniku daptomycinu ve fermentační kapalině;

b) vyčeření fermentační kapaliny;

c) podrobení fermentační kapaliny dávkové nebo kolonové chrmatografii za vzniku obohaceného daptomycinového preparátu;

d) změna podmínek daptomycinového roztoku tak, že daptomycin vytváří micely;

φφ φφ φ * φ φ φ

ΦΦ φφφφ φ φ φ φφ φ φ φ φ φ φ φ • · · * φφ φφφ · φ • φφ φφφφ φφφ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφφφ

e) separace daptomycinových micel od nízkomolekulárního materiálu; a

f) sebrání daptomycinových micel.
82. Způsob čištění podle nároku 81, vyznačuj ící se t í m, že dále zahrnuje kroky:

f) podrobení daptomycinu sebraného v kroku e) podmínkám, při kterých daptomycinové micely disociují na daptomycinové monomery;

g) separace daptomycinových monomerů od vysokomolekulárního materiálu; a

h) sebrání daptomycinových monomerů.
83. Způsob čištění podle nároku 81, vyznačuj ící se t í m, že zmíněná dávková nebo kolonová chromatografíe je anion-výměnná chromatografíe nebo opakovaná chromatografíe s hydrofobními interakcemi.
84. Způsob čištění podle nároku 83, vyznačuj ící se t í m, že se anion-výměnná chromatografíe provádí s využitím pryskyřice FP-DA 13 a zmíněná opakovaná chromatografíe s hydrofobními interakcemi se provádí na pryskyřici HP-20 a HP-20ss.
85. Způsob čištění podle nároku 75, vyznačuj ící se t 1 m, že se mění jedna nebo více teplot, koncentrace elektrolytu, pH nebo koncentrace rozpouštědla lipopeptidového roztoku.
86. Způsob čištění podle nároku 85, vyznačuj ící se t í m, že se pH mění z neutrální hodnoty na hodnotu pH přibližně 2,5 až 4,7.

• 4 »4 44 44 *4 • 44 4 4 ·»·

4 i 44 4 4 ·

4 44 444 4 4 •4*4 44

44 44 4444
87. Způsob čištění podle nároku 85, vyznačuj ící se t i m, že se mění teplota z alespoň 15 °C na teplotu 2 až 10 °C.
88. Způsob výroby farmaceutického přípravku obsahujícího lipopeptidové micely, vyznačující se tím, že micely zahrnují lipopeptid vybraný ze skupiny obsahující daptomycin, Ά54145, daptomycinu příbuzný lipopeptid a antibiotikum A-21978, ve kterém je n-dekanoylový postranní řetězec daptomycinu nahrazen n-oktanoylovým, n-nonanoylovým, n-undekanoylovým, n-dodekanoylovým, n-tridekanoylovým nebo ntetradekanoylovým postranním řetězcem;

a zahrnující kroky:

a) zajištění lipopeptidů v monomerní formě; a

b) přidání farmaceuticky přijatelného roztoku, který převádí lipopeptid na micely za vzniku farmaceutického přípravku.
89. Způsob výroby podle nároku 88, vyznačuj ící se t i m, že lipopeptid v monomerní formě je v suchém nebo lyofilizovaném stavu.
90. Způsob výroby podle nároku 88, vyznačuj ící se t i m, že lipopeptid v monomerní formě je v roztoku.
91. Způsob výroby podle nároku 88, vyznačuj ící se t í m, že farmaceuticky přijatelný roztok zahrnuje libovolný jeden nebo více elektrolytů, pufr nebo rozpouštědlo.
92. Způsob výroby podle nároku 91, vyznačuj ící se t i m, že pufr udržuje pH farmaceutického přípravku na hodnotách 2,5 až 4,5.

»9 ·»*·

9« 9* • · · • « 9* «9 9* • 9 9 • 9 • 9 · ·· *«
93. Způsob výroby podle nároku 88, vyznačuj ící se t i m, že dále zahrnuje krok přidání jednoho nebo více terapeutických činidel k farmaceutickému přípravku.
94. Způsob výroby podle nároku 93, vyznačuj ící farmaceutického že terapeutické činidlo přidávané do přípravku je další antibiotikum, protizánětlivé činidlo, protihoubové činidlo nebo jejich libovolná kombinace.
95. Způsob výroby podle nároku 94, vyznačuj ící se t í m, že antibiotikum, protizánětlivé činidlo nebo protihoubové činidlo je zabudováno v lipopeptidové micele.
96. Způsob výroby podle nároku 94, vyznačuj ící se t i m, že antibiotikum, protizánětlivé činidlo nebo protihoubové činidlo není zabudováno v lipopeptidové micele.