CN102229650B - 高纯度脂肽、脂肽胶束及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高度纯化的达托霉素和含有此化合物的药物组合物。本发明公开了一种纯化达托霉素的方法，包括顺序进行阴离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法和阴离子交换色谱法的步骤。本发明也公开了一种通过改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法纯化达托霉素的方法。本发明也公开了通过玫瑰孢链霉菌发酵产生达托霉素的改进的方法。本发明也公开了分析达托霉素纯度的高压液相色谱法。本发明还公开了脂肽胶束和制备胶束的方法。本发明也公开了用脂肽胶束纯化脂肽抗茵素，如达托霉素的方法。本发明还公开了在治疗方面使用脂肽胶束。

Description

高纯度脂肽、脂肽胶束及其制备方法

本申请是中国发明专利申请(申请日：2001年1月18日；申请号：200810087401.X；发明名称：高纯度脂肽、脂肽胶束及其制备方法)的分案申请。 

发明的技术领域 

本发明涉及高度纯净形式的脂肽，包括达托霉素，它是一种对革兰氏阳性细菌-包括耐受常规抗生素的菌株-具有有力杀菌活性的脂肽抗生素。本发明还涉及用于制备高度纯净形式脂肽的方法。本发明进一步涉及脂肽的胶束。本发明还涉及脂肽胶束的药物组合物和使用这些组合物的方法。本发明还涉及从脂肽的无关联单体制备脂肽胶束和转化脂肽胶束为无关联单体的方法。本发明还涉及利用胶束制备脂肽的方法，该方法容易达到商业生产的规模。 

发明的背景 

革兰氏阳性感染--包括由耐药性细菌导致的那些--发病率的迅速增加已经重新引起人们对开发新型抗生素的兴趣。其中一类是脂肽抗生素，包括达托霉素。达托霉素对临床上有关的革兰氏阳性细菌具有有力的体外杀菌活性，这些细菌导致严重的和危及生命的疾病。这些细菌包括耐药性病原体，例如万古霉素耐受性肠球菌(VRE)、甲氧西林耐受性金黄色葡萄球菌(MRSA)、糖肽中间体易感性金黄色葡萄球菌(GISA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)和青霉素耐受性肺炎链球菌(PRSP)，对它们很少有可供替代的治疗剂。例如参见Tally等，1999，Exp.Opin.Invest.Drugs8：1223-1238，以下称为“Tally”。达托霉素的抑制作用是迅速的、浓度依赖性体外与体内杀菌作用，和相对长效的浓度依赖性体内抗生素后作用。 

Baltz在这本书中描述了达托霉素，即：《抗生素的生物工艺学》(BiotechnologyofAntibiotics)，第二版，编辑：W.R.Strohl(NewYork：MarcelDekker，Inc.)，1997，415-435页，以下称为″Baltz.″。达托霉素，也被称为LY146032，是一种能从玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus))发 酵衍生得到的环状脂肽抗生素。 

达托霉素是玫瑰孢链霉菌(S.Roseosporus)的A-21978C₀因子型抗生素中的一员，它由连接到一个环状13-氨基酸肽的N-末端色胺酸上的癸酰基侧链构成(图1)。达托霉素有很好的作用性，因为它抗多数革兰氏阳性细菌高度有效，并具有高杀菌性和快速作用性，具有低的耐药性几率，能有效地对抗具有抗生素耐药性的生物。现在将此化合物开发成各种制剂以治疗由细菌引起的严重感染，细菌包括--但不限于--甲氧西林耐受性金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(MRSA)和万古霉素耐受性肠球菌(enterococci)(VRE)。 

一个美国专利描述了包括达托霉素(LY146032)的A-21978C抗生素及其衍生物，和制造并分离A-21978C抗生素及其衍生物的方法。 

美国专利Re.32,333、Re.32,455和4,800,157记载了在水下需氧发酵条件下通过培养玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus))NRL15998而合成达托霉素的方法。美国专利4,885,243描述了一种通过用癸脂肪酸或其脂或盐供给发酵培养基养料而合成达托霉素的改进方法。 

美国专利Re.32,310、Re.32,311、4,537,717、4,482,487和4,524,135描述了A-21978C抗生素的脱酰基方法，和此过程中产生的肽核及抗生素衍生物的再酰化方法。所有这些专利都描述了一种纯化的脱酰基的A-21978C抗生素核或其衍生物，它们是通过过滤发酵肉汤而分离，然后用DiaionHP-20色谱法和硅胶/C18色谱法纯化的。 

美国专利Re.32,333和Re.32,455公开了一种纯化方法，用此方法所有发酵肉汤的滤出液通过一系列沉淀和萃取步骤而得到粗的A-21978C化合物。这种粗的化合物进一步在IRA-68上进行离子交换色谱法和两次硅胶色谱法纯化。单独的A-21978C₀因子由反相硅胶或硅胶/C18分离。美国专利Re.32,333和Re.32,455还公开可以通过使用DiaionHP-20树脂的制备色谱法并随后进行硅胶柱色谱法的方法纯化A-21978C。 

美国专利4,874,843描述了一种达托霉素的纯化方法。在此方法中将发酵肉汤过滤并通过一含有HP-20树脂的色谱柱。洗提后，半纯化的达托霉素再通过一含有HP-20ss的色谱柱，最后再用HP-20树脂分离。’843专利指出用此方法从结构相似的化合物中最终拆分和分离达托霉素会受到存在的杂质的阻碍，这些杂质是不能用发酵肉汤的紫外光谱分析辩认的。’843专利进一步指出用硅胶的反相色谱法、硅胶常相色谱法或离子交换色谱法清 除这些杂质的尝试也不能明显提高达托霉素的纯度。’843专利也公开了一种进行纯化的“反相法”，包括使发酵产物的水溶液和一种非功能性树脂在水相中接触，完全除去这种带电树脂中的水，然后用极性有机溶剂再浸湿这种带电树脂，用有机溶剂洗涤树脂，通过提高溶剂的极性从树脂中洗脱发酵产物并将其回收发酵产物。’843专利教导此方法可以将最终纯度从大约80％提高到大约93％，而将产量从大约5％提高到大约35％；但′843专利没有公开制备达托霉素时存在的杂质种类。 

美国专利5,912,226揭示了生产达托霉素时两种杂质产物的鉴定和分离方法。达托霉素，一种α-门冬氨酰肽，经过肽基转移形成一种稳定的中间体，在其中门冬氨酰基团变成了脱水琥珀酰亚胺基(图2)。’226专利指出这种中间体-称为脱水达托霉素-的存在，在pH4-6的条件下更明显。脱水琥珀酰亚胺基型的再水合产生了第二种降解产物，它包含一个β-门冬氨酰基团，被称为达托霉素的β-异构体(图3)。 

’226专利记载，脱水达托霉素的t-BOC衍生物可以由反相硅胶/C-18柱色谱法分离、沉淀，并用反相硅胶/C-18柱色谱法再纯化。’226专利还指出也可以用DiaionHP-20ss树脂色谱法纯化达托霉素β-异构体，并用DiaionHP-20树脂色谱法除盐分，用反相C-18柱随之以反转模式的HP-20树脂进一步纯化。 

Kirsch等(制药研究(PharmaceuticalResearch)，6：387-393，1989，以下称″Kirsch″)声称在达托霉素的纯化过程中产生脱水达托霉素和β-异构体。Kirsch描述了通过控制PH条件和温度条件降低脱水达托霉素和β-异构体水平的方法。然而，Kirsch并不能稳定达托霉素并防止达托霉素转化成脱水达托霉素和随后的变成β-异构体的异构化过程。Kirsch也不能防止达托霉素降解成与脱水达托霉素和β-异构体无关的其他降解产物。 

’226专利声称可以用这些步骤制备达托霉素以使达托霉素只包含不多于2.5％重量的结合的总脱水达托霉素和β-异构体，但它没有指出其它杂质的水平。在美国专利4,874,843讲述的方法中和为临床试验而进行的达托霉素大规模制备中，观察到的达托霉素的最高纯度是大约90％-93％。需要一种商业可行的方法制造更高纯度的达托霉素，并且，如果可能，提高纯化后达托霉素的产量。此外，需要得到只含很少或不含脱水达托霉素和β-异构体型达托霉素的纯化达托霉素。也需要降低达托霉素中其它杂质的水平。但 是本领域没有一种方法已显示能进一步降低脱水达托霉素、β-异构体和其他杂质的水平。 

发明概述 

本发明通过提供商业可行的方法制备高水平的纯化脂肽以解决这些问题。在一优选实施方案中，脂肽是达托霉素或达托霉素-相关的脂肽。在本发明的一个实施方案中，公开了一种商业可行的方法，能产生纯度为95-97％的达托霉素。在另一实施方案中，公开了一种商业可行的方法，几乎全部除去了主要杂质脱水达托霉素和β-异构体及其他达托霉素制剂中的杂质。在本发明的另一实施方案中，公开了纯化脂肽-包括达托霉素或达托霉素-相关的脂肽-的商业可行的方法，包括从低分子量污染物分离脂肽胶束并从高分子量污染物中分离非联合脂肽。本发明也提供了分析达托霉素纯度并检测和鉴定达托霉素中其他杂质的高效液相色谱法(HPLC)色谱法，其中的一些是以前未知的。 

本发明也提供了纯化的达托霉素，其纯度至少为98％或基本上或完全不含脱水达托霉素和β-异构体。本发明提供了纯化的达托霉素其中不含或完全不含脱水-达托霉素，并且与在先技术可能得到的相比，其中的β-异构体和其他污染物的含量非常低。本发明也提供了脂肽胶束。在一优选实施方案中，胶束包含达托霉素或达托霉素-相关的脂肽。本发明也提供了含有高纯度达托霉素或达托霉素-相关的脂肽胶束的组合物及使用这些组合物的方法。 

对附图的简要说明 

图1显示达托霉素的结构。 

图2显示杂质8，CB-131010的结构(以前定义为β-异构体，LY213846)。 

图3显示杂质13，CB-130952的结构(以前定义为脱水-达托霉素，LY178480)。 

图4显示杂质1，CB-131012的预计结构(以前定义为LY212218)。 

图5显示杂质2，CB-131011的预计结构。 

图6显示杂质3，CB-131008的预计结构(以前定义为LY213928)。 

图7显示杂质4，CB-131006的预计结构。 

图8显示杂质6，CB-130989的预计结构(以前定义为LY213827)。 

图9显示杂质7，CB-131005的预计结构。 

图10显示杂质12，CB-131009的预计结构。 

图11显示杂质14，CB-131078的预计结构(以前定义为LY109208)。 

图12显示大量制备包括杂质1-14的达托霉素的HPLC色谱。 

图13显示在PorosP150树脂上纯化后制备达托霉素的HPLC色谱。 

图14(a)-14(c)显示胶束状结构。图14A显示球形胶束，其中双亲分子的疏水尾端朝向球形的中央，双亲分子的亲水头端朝向球形的外部，与水性环境接触。图14(a)显示了一个实施例，其中亲水头端带负电荷。图14(b)显示了一个脂质双分子层结构，其中2层双亲分子集合在一起而使每层的疏水尾端相对定向，同时双分子层每侧的亲水头端与水性环境接触。脂质双分子层可以是球形或平面状。图14(c)显示一种脂质体，其中脂质双分子层，如图14(b)所示，形成围绕水性内部的球形结构。脂质体的亲水头端朝向水性内部和外部的水性环境。 

图15显示测定在pH4.0达托霉素临界胶束状浓度(cmc)的实验结果。 

图16显示通过光散射测定达托霉素胶束的体积分布。达托霉素胶束的平均体积为5.4nm(54A)。 

对发明的详细描述 

发明目的 

本发明的一个目的是提供一种易于商业化生产的纯化脂肽的方法，包括阴离子交换色谱法和疏水色谱法的独特组合。在一优选实施方案中，用此方法制备纯度高于95％的纯化达托霉素，并与在先技术方法制备的达托霉素相比，杂质水平降低。在另一优选实施方案中，用此方法制备达托霉素，与在先技术方法相比，所用溶剂的量降低。在另一优选实施方案中，用此方法制备纯度高于95％的纯化达托霉素相关脂肽。 

本发明的另一个目的是提供一种增加由微生物制备的脂肽的水平的方法，通过供给发酵培养基低水平脂肪酸养料而用微生物制备此脂肽。用低于美国专利4,885,243建议在达托霉素发酵中使用的癸酸水平，除产生高纯度的达托霉素或达托霉素-相关的脂肽外，还增加了经济效益。在一优选实施方案中，用其方法增加玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)产生的达托霉素的浓度和数量，并降低相关污染物的产生。发酵肉汤中低水平的污染物导致达托霉素更有效的回收和纯化，为制备过程提供了高的产量。 

本发明另一目的是提供一种纯化达托霉素或达托霉素相关的脂肽的方 法，包括使用改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法。在一优选实施方案中，用此方法制备达托霉素，其纯度至少为98％并基本上或完全不含脱水-达托霉素或β-异构体。在另一优选实施方案中，用此方法将达托霉素-相关的脂肽纯化到至少98％纯度。 

本发明另一目的是提供一种纯化脂肽的色谱方法，包括阴离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法和改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法的新的组合。在一优选实施方案中，采用色谱法的过程纯化达托霉素或达托霉素-相关的脂肽。改良缓冲液意外地使脱水-达托霉素能够从达托霉素中分离，而在先的色谱方法是不可能的。 

本发明另一目的是提供一种纯化脂肽的方法，易于按比例使用脂肽胶束进行商业制备。在一个实施方案中，此方法包括将脂肽溶液从单体的非胶束状态转化成胶束状态，并在纯化过程中转回原来的状态。在一优选实施方案中，此过程包括将脂肽置于形成胶束的条件中，通过例如体积分离技术，从低分子量的污染物中分离脂肽胶束。在另一优选实施方案中，此方法包括将脂肽置于脂肽以单体形式存在的条件下，并通过例如体积(size)分离技术从高分子量分子中分离单节脂肽分子。在一个优选实施方案中，此方法包括2个步骤：使脂肽置于形成胶束的条件下，并从低分子量污染物中分离脂肽胶束，然后将脂肽胶束置于脂肽以单节形式存在的条件下，从高分子量分子或聚集体中分离脂肽单体。可以任意顺序进行此2个步骤。在一更优选的实施方案中，体积分离技术是超滤法或体积排除色谱法。 

本发明进一步的目的是提供使用高压液相色谱法(HPLC)的改进的方法测定脂肽-包括达托霉素-的纯度。 

本发明另一目的是提供纯化的脂肽，例如达托霉素或达托霉素-相关的脂肽，及其药学可接受的盐或制剂。在一优选实施方案中，本发明通过说明书记载的方法中的一种，提供达托霉素或纯化的达托霉素-相关的脂肽。本发明也提供了纯化的脂肽或其盐的药物组合物及服用这些组合物的方法。在一优选实施方案中，药物组合物包含纯化的达托霉素。 

本发明的另一目的是提供脂肽胶束及其药物可接受的制剂。在一优选实施方案中，本发明提供了达托霉素胶束或达托霉素相关的脂肽胶束及其药学可接受的制剂。在另一实施方案中，本发明也提供了给需要治疗的病人服用脂肽胶束或其药物制剂的方法。在一优选实施方案中，脂肽胶束采用静脉注 射、胃肠外给药、肌内或局部给药的方式。 

定义 

除另外说明，本文所用的所用技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的意义。除另外说明外，采用化学、生物化学和微生物学、基础术语学的常规技术实施本发明。 

术语“分离的”指一种化合物或产品，在混合物中有至少10％，优选至少20％或30％，更优选至少50％、60％或70％，最优选至少80％或90％此化合物。 

术语“脂肽”指一种分子，其中包含共价地与肽部分相连的类似脂质的部分，及其盐、酯、酰胺和醚。术语“脂肽”也包括脂肽的保护型，其中将一或多个氨基、羧基或羟基基团加以保护。见，例如《有机合成中的保护基团(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis)》，TheodoraW.Greene，JohnWiley和Sons，NewYork，1981，其中记载了保护性基团的例子。 

在一优选实施方案中，脂肽是抗生素。在另一优选实施方案中，脂肽是LY303366、棘白菌素(echinocandins)、肺麦芽毒素(pneumocandins)、阿库来菌素(aculeacins)、枯草菌溶血素(surfactin)、制磷脂菌素B1(plipastatinB1)、安福霉素或美国专利5,629,288公开的脂肽衍生物。这些脂肽在本领域是已知的。见，例如，美国专利5,202,309和国际PCT申请WO00/08197。在另一优选实施方案中，脂肽是达托霉素相关的分子，其中包括达托霉素、A54145、达托霉素-相关的脂肽，公开于美国专利4,537,717、4,482,487、Re.32,311、Re.32,310、5,912,226，现在是美国系列申请No.09/547,357，和登记于1999年12月15日的美国临时申请Nos.60/170,943、60/170,946或60/170,945，及登记于2000年5月30日的美国临时申请No.60/208,222的再次公开，特别将这些结合于此作为参考，或A-21978抗生素，其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链被正-辛酰基、正-壬酰基、正-十一酰基、正-十二酰基、正-酰基或正-十四酰基脂肪酸侧链取代。达托霉素-相关的脂肽公开于60/170,943、60/170,946、60/170,945和60/208,222，涉及合成和半合成脂肽，其中将达托霉素的鸟氨酸或犬尿碱残基或脂肪酸侧链加以修饰。在一个优选实施方案中，脂肽是达托霉素。术语达托霉素-相关的脂肽指上述化合物及其盐。 

术语“达托霉素”指A-21978C₀因子型抗生素的正-癸酰基衍生物或其 药学可接受的盐。 

“达托霉素”与LY146032是同义词。见图1。 

术语“脱水-达托霉素”指达托霉素衍生物，其中α-达托霉素的门冬氨酰基团经过肽基转移成为脱水琥珀酰亚胺基团。见图3。 

术语“β-异构体”或“达托霉素β-异构体”指达托霉素衍生物其中的β-门冬氨酰基代替了α-门冬氨酰基团。见图2。 

当至少样品的95％是达托霉素或达托霉素-相关的脂肽时，达托霉素或达托霉素-相关的脂肽是“基本纯的”。优选地，当至少样品的97％是达托霉素或达托霉素-相关的脂肽时，达托霉素或达托霉素-相关的脂肽是“基本纯的”。 

当至少样品的98％是达托霉素或达托霉素-相关的脂肽时，达托霉素或达托霉素-相关的脂肽是“完全纯的”。 

优选地，当至少样品的99％是达托霉素或达托霉素-相关的脂肽时，达托霉素或达托霉素-相关的脂肽是“完全纯的”。 

当达托霉素或达托霉素-相关的脂肽制剂中另一化合物的量不超过1％时，达托霉素或达托霉素-相关的脂肽“基本不含”另一化合物。 

当达托霉素或达托霉素-相关的脂肽制剂中另一化合物的量不超过0.5％时，达托霉素或达托霉素-相关的脂肽“完全不含”另一化合物。当达托霉素或达托霉素-相关的脂肽制剂中另一化合物的量不超过0.1％时，达托霉素或达托霉素-相关的脂肽“不含”另一化合物。或者，当在测定限度约为达托霉素或达托霉素-相关的脂肽制剂的0.05％的最大敏感度条件下，不能用HPLC检出其他化合物时，达托霉素或达托霉素-相关的脂肽“不含”另一化合物。本文记载了示例性的HPLC方法(表1和2)。 

“纯化”达托霉素或达托霉素-相关的脂肽指基本纯的达托霉素或达托霉素-相关的脂肽；完全纯的达托霉素、或达托霉素-相关的脂肽或其盐，或指基本不含、完全不含或不含另一化合物的达托霉素、达托霉素-相关的脂肽或其盐。 

“部分纯化的”达托霉素或达托霉素-相关的脂肽指达托霉素、达托霉素-相关的脂肽或其盐具有小于90％的纯度。 

达托霉素、达托霉素-相关的脂肽的纯度，或另一脂肽的纯度指在配制药物组合物之前脂肽的纯度。可以用包括核磁共振(NMR)、气相色谱/质谱法 (GC/MS)，液相色谱/质谱法(LC/MS)或微生物测定法的任何方法测定纯度。测定达托霉素纯度优选方法是分析型高压液相色谱法(HPLC)。 

术语“胶束”指双亲分子聚合体。在液相介质中，聚集体分子的亲脂性部分朝向胶束的内部，亲水性部分与介质接触。胶束结构包括但不限于球形、片状、圆筒状、椭圆体状、脂质体状(liposomal)、薄板状和液晶状。见图14。 

术语“混合胶束”指一类特定的胶束其中胶束含有多于单一一类的双亲分子。在本发明的上下文中，混合胶束含有一种脂肽和至少一种可以上另一种脂肽的其他双亲分子。混合胶束含有至少10％重量脂肽。在另一实施方案中，混合胶束含有至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％脂肽。 

术语“胶束溶液”指溶液中多于50％重量的脂肽分子以胶束形式存在。优选地至少60％、70％、80％、90％或95％分子以胶束形式存在。胶束溶液被具有10,000道尔顿的标示(nominal)分子量(NMW)的超滤膜截留。 

术语“临界胶束浓度″(cmc)指一种依赖于温度、盐的浓度和双亲分子的性质和类型的特定的分子浓度。在cmc中，未结合的单体和胶束达到平衡。 

术语“单体”指不属于聚集体部分，而以单个分子存在的双亲分子。在本发明的上下文中，术语单体指未结合的脂肽。 

术语“单体溶液”指溶液中多于50％重量的脂肽分子以单体存在。优选至少60％、70％、80％、90％或95％为单体。 

单体溶液不被具有10,000道尔顿的分子量(NMW)超滤膜截留，而是通过超滤膜。 

术语“低离子强度缓冲液”指盐浓度低于50mM的溶液；术语“中离子强度缓冲液″指盐浓度为50-250mM的溶液；术语“高离子强度缓冲液”指盐浓度高于250mM的溶液。 

制备纯化的脂肽的方法 

本发明的一个实施方案描述了以商业可行的方式生产纯化的脂肽的制备色谱法。在一优选实施方案中，脂肽是达托霉素或达托霉素-相关的脂肽。制备色谱法包括按顺序使用离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法(HIC)和阴离子交换色谱法纯化含有脂肽，例如达托霉素或达托霉素-相关的脂肽的方法。 

在本发明的一个优选实施方案中，纯化方法还包括改变发酵条件，其中 玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)制备含A21978C的粗产品以增加达托霉素产量并降低杂质和玫瑰孢链霉菌(S.roseosporus)发酵培养产生的相关的污染物。 

下面记载了制备色谱法的一个优选实施方案： 

按美国专利4,885,243的记载，用正-癸酸养料发酵玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)，其改进是癸酸养料保持在可能的最低水平，使不致降低发酵的总产量。在一优选实施方案中，在有氧发酵中将残余的癸酸保持在小于50部分/百万(ppm)。在一个优选实施方案中，在有氧发酵中残余癸酸保持在1-20ppm。在一个更优选的实施方案中，在有氧发酵中残余癸酸保持在约10ppm。在一优选实施方案中，测定发酵过程中残余癸酸的浓度，并调整癸酸养料水平使残余癸酸水平持续保持在优选范围内。在先技术未记载就地达到最佳的含有低水平杂质的达托霉素表达所要求的具体而且低的残余常量癸酸浓度。 

发酵后，从发酵肉汤中除去菌丝以使细胞外溶液澄清。优选用任何标准分离技术，例如离心或微滤法从发酵液中除去菌丝。在一优选实施方案中，用微滤法澄清发酵肉汤，例如用PallSep膜系统。在一个优选实施方案中，用工业离心法澄清发酵肉汤，例如Westfalia离心，随后进行最后的深度过滤。 

可以用其他设备，例如过滤压榨机、旋转鼓过滤器或可选的深度过滤器从发酵肉汤中除去菌丝，以制备适用于大规模柱色谱法的澄清的肉汤。 

在另一实施方案中，可以在用溶剂分离离心或过滤净化前用有机溶剂例如丁醇直接从菌丝发酵物中提取达托霉素。根据此实施方案，在提取中可以使用任何有4或多个碳原子的醇。优选的溶剂是正丁醇。与用纯化水分离达托霉素比较，用正丁醇给达托霉素带来初始增加的纯化过程。例如，当所用正丁醇的浓度大于10％，并且此过程是在正丁醇形成分离相的条件下进行的-例如在pH4-5，接近达托霉素的等电点时，达托霉素进入正丁醇中(见实施例4)。 

在另一实施方案中，在使用预活化菌丝的固定反应器中制备达托霉素，对达托霉素非发酵产物使用能量源，优选糖，要素组分，例如氨基酸和氨水，和癸酸。然后用此处记载的方法在固定酶反应器中制备达托霉素。 

净化发酵肉汤后，通过离子交换色谱法使净化溶液中达托霉素的浓度增 加(即浓缩)。先使净化溶液在多数或全部达托霉素与离子交换树脂结合的条件下与离子交换树脂接触。结合后，用适当的离子水缓冲液洗涤树脂以除去未结合的物质和一些达托霉素杂质。最后，在使达托霉素能从树脂上分离的条件下洗脱纯化的达托霉素。 

可以根据本发明，用缓冲液和本领域已知的方法进行结合、洗涤和洗脱步骤。例如，可以用含有比洗涤缓冲液高的盐浓度的缓冲液进行洗脱，此缓冲液的pH低于洗涤缓冲液。在一优选实施方案中，达托霉素与在缓冲液中平衡过的离子交换树脂结合，此缓冲液不含有增加的盐浓度，或含有低盐浓度，pH为中性至碱性。用3倍柱床体积的水，然后用3-6倍柱床体积的含有30-60mMNaCl的中级盐缓冲液清洗加载后的树脂。用1-3柱体积含有300-500mMNaCl的高盐浓度和/或低pH缓冲液洗脱达托霉素。高氯化钠和可选盐，例如氯化钾的浓度也将达托霉素从树脂上洗脱。在一优选实施方案中，使用高流速阴离子交换树脂。在一个优选实施方案中，使用FP-DAl3树脂(Mitsubishi)。 

可以用柱色谱法或可以按间歇方式进行阴离子交换色谱法。对于商业制备，优选使用间歇方式。可以用步进盐梯度或连续的盐梯度清洗和洗脱离子交换树脂。适宜的步进或连续盐梯度是任何允许达托霉素从污染物中分离的盐梯度。在一优选实施方案中，连续的盐梯度是0-1000mMNaCl。在一个优选实施方案中，连续的盐梯度是100-500mMNaCl或0-400mMNaCl。也可以使用美国专利5,756,680、4,865,729、4,840,730或4,708,782记载的径向流(Radialflow)色谱法。 

阴离子交换色谱法后，用疏水相互作用色谱法(HIC)进一步纯化达托霉素制剂。美国专利4,874,843记载了此步骤的一个实施方案，这里并入本文参考。在多数或全部达托霉素能与树脂结合的条件下，使洗脱的水性达托霉素制剂与HIC树脂接触。通过将树脂与增加浓度的非极性溶剂接触，使荷载有达托霉素的树脂的水含量减少。在杂质从树脂上分离，而达托霉素保持结合的条件下，用适当的极性有机溶剂洗涤树脂。最后，在使达托霉素从树脂上分离的条件下洗脱达托霉素。一般地，用与洗涤缓冲液相比具有低极性(高极性溶剂水平)和/或高pH的含有溶剂的缓冲液洗脱达托霉素。 

在一优选实施方案中，HIC的非功能性的树脂是小颗粒HP-20ss(Mitsubishi)。用有机相溶剂，如一种含有异丙醇、乙腈、丁醇的溶 剂或其他溶剂特定地从HP-20ss树脂上分离结合的达托霉素。在一个更优选的实施方案中，达托霉素结合到已在含有10％乙腈或同等的极性溶剂，例如异丙醇的醋酸盐缓冲液中平衡的HP-20ss树脂上。用至少3个柱床体积的平衡缓冲液洗涤荷载达托霉素的树脂。用3-6个柱床体积的含有非洗脱浓度的极性溶剂的醋酸盐洗涤缓冲液清洗荷载达托霉素的树脂，进一步除去另外的杂质。在一优选实施方案中，用30％乙腈或45％异丙醇清洗荷载达托霉素的树脂。用1-3柱床体积的含有35％或更多乙腈或多于50％异丙醇的醋酸盐缓冲液洗脱荷载达托霉素的树脂。在一优选实施方案中，用pH4.0-5.0的35％乙腈或55-60％异丙醇洗脱达托霉素。在另一实施方案中，用1-3柱床体积的有增加的pH的缓冲液洗脱荷载达托霉素的树脂。在此实施方案中，缓冲液的pH逐渐增加，由于电荷的不同而以不同速率从柱上洗脱不同化合物。在提高的pH，例如，pH6.0-7.0，乙腈的洗脱浓度降低到10-20％。类似地，在提高的pH，例如pH6.0-7.0，异丙醇的洗脱浓度降低到20-25％。控制进行色谱法时的温度也影响溶剂浓度。在低温度下的洗脱，即在冷冻条件下，在所有pH条件下都需要增加的溶剂水平。 

HIC后，用离子交换色谱法降低达托霉素制剂中的有机溶剂。在一优选实施方案中，如上所述使用FP-DA13。 

第二离子交换色谱法后，将纯化的达托霉素去除热原(depyrogenated)、过滤并在冷冻条件下浓缩。可以用本领域已知的任何方法过滤达托霉素。在一个实施方案中，可以通过一下步骤过滤并除热原： 

i)使达托霉素溶液处于其中的达托霉素为单体和非胶束状态的条件； 

ii)在达托霉素将通过滤器而热原不通过滤器的条件下过滤达托霉素溶液，例如，使达托霉素溶液在pH6.0-8.0，并用额定值为3,000NMW-30,000NMW的超滤器过滤溶液； 

iii)改变通过滤器的达托霉素溶液使达托霉素聚集，即通过将达托霉素溶液的pH改变为2.5-4.5，使达托霉素形成胶束； 

iv)在使达托霉素保留在滤器上的条件下过滤达托霉素溶液，即，在30,000NMW或更小的超滤器上，例如反渗膜上浓缩达托霉素；并 

v)收集除去热原的达托霉素。 

在一优选实施方案中，在pH约为7-8的加压条件下在10,000道尔顿截止分子量(MWCO)的超滤器上过滤步骤(ii)的达托霉素。在一个优选实施方案 中，达托霉素的初始浓度为小于40mg/ml，更优选地为约31.25mg/mL。在此条件下，达托霉素通过滤器，而热原例如脂多糖类(LPS)不能通过。经过初步的超滤后，滤液的pH降低到pH2.5-4.5，滤液在10,000MWCO的超滤器上浓缩到约120mg/mL。在此条件下，达托霉素保留在滤器上。在一优选实施方案中，滤液的pH为pH3.5。经过随后的浓缩，达托霉素的浓度调整到105mg/mL，检查内毒素水平，并在无菌条件下灌装。 

在另一实施方案中，在pH1.5-3.0进行反渗透纳米过滤。采用低pH和冷冻条件以延缓纯化的达托霉素的降解。可以进一步通过0.2μm的滤器过滤达托霉素，以降低生物负载(bioburden)，然后以散装或小瓶装进行冷冻干燥。 

作为上述超滤和浓缩步骤的一种替代，在pH约为4.5将含有达托霉素的洗脱部分与丁醇混合(正、异或叔丁醇)，比例高于1份丁醇对9份达托霉素溶液。在一优选实施方案中，1份丁醇与4份达托霉素溶液混合得到20％丁醇溶液。使丁醇-达托霉素溶液分离成有机相和水相。达托霉素进入有机相，将其收集。达托霉素在有机溶剂中的脱水作用可以稳定达托霉素并防止纯化的达托霉素降解成脱水-达托霉素，并随后形成β-异构体。最后，向有机相中加入pH6.5-7.5的缓冲剂可以使达托霉素回到水相。浓缩或收集达托霉素后，将达托霉素冷冻干燥。 

在本发明的另一实施方案中，用制备色谱法纯化除达托霉素外的脂肽，例如A54145、LY303366、棘白菌素(echinocandins)、肺麦芽毒素(pneumocandins)、阿库来菌素(aculeacin)、枯草菌溶血素(surfactin)、制磷脂菌素B1(plipastatinB1)、安福霉素或美国专利5,629,288公开的脂肽衍生物。在另一实施方案中，用制备色谱法纯化达托霉素-相关的脂肽，包括A54145，或脂肽，公开于美国专利4,537,717、4,482,487、Re.32,311、Re.32,310、5,912,226，现在是美国系列申请No.09/547,357，和登记于1999年12月15日的美国临时申请Nos.60/170,943、60/170,946或60/170,945，及登记于2000年5月30日的美国临时申请No.60/208,222的再次公开，或A-21978抗生素，其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链被正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三烷酰基或正十四烷酰基脂肪酸侧链代替。 

在本发明的另一实施方案中，用“盐浊法(SaltCloudMethod)”[《生殖工程学导报》(GeneticEngineeringNews)，Vo1.19，No.20，1、34和43页，(11 月15日，1999)]纯化达托霉素或其他脂肽。盐浊法是以薄膜为基础的系统，结合有高体积产出量的选择性分离。可以用盐浊法与本文公开的方法结合，或分别地纯化达托霉素或其他脂肽。 

本发明的另一实施方案是关于色谱法，它产生了在先技术的色谱法所不能产生的高度纯化的脂肽。色谱法包含使用改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法以纯化含有脂肽的制剂。在一优选实施方案中，用此方法产生高度纯化的达托霉素或达托霉素-相关的脂肽。部分纯化的达托霉素使用此方法时，产生至少为98％纯度的达托霉素。此方法也产生没有或基本没有脱水-达托霉素的达托霉素。此方法包括一下步骤： 

用本领域已知的任何方法或本文所述的方法制备部分纯化的达托霉素。进一步用改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法纯化达托霉素。在有适当的离子改良缓冲液时，达托霉素结合到离子交换树脂上，其条件是达托霉素以单体和非胶束状态结合到树脂离子上。改良缓冲液含有缓冲剂，例如但不局限于，醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和Tris-HCl，或任何其他良好地保持中性pH的缓冲剂。改良缓冲液还含有一或多种离液剂，包括而不局限于，胍、氨、尿素、强还原剂、苯甲酸盐、抗坏血酸盐或另一种能缓和缓冲剂的离子增强剂，使达托霉素易于从杂质中分离。用适当的离子改良缓冲液洗涤荷载达托霉素的树脂以洗脱杂质，包括脱水-达托霉素。然后在允许达托霉素与结合在树脂上的杂质-包括β-异构体-分离的条件下洗脱达托霉素。 

在一优选实施方案中，改良缓冲液为中性pH(pH6-8)并含有2-6M尿素。在一个进一步优选的实施方案中，离子交换树脂是PorousResinP150或PorousD50(PEBiosystems)。在一个优选实施方案中，离子交换树脂是PorousP150。在一个优选实施方案中，达托霉素结合到低离子强度缓冲液中的树脂上，用低至中离子强度的缓冲液清洗，并用高离子强度的缓冲液洗脱。在一个优选实施方案中，达托霉素结合到含有6M尿素的pH7.0的Tris缓冲液中的PorousP150树脂上。用3倍柱床体积的Tris缓冲液或其他适宜的缓冲液清洗荷载达托霉素的PorousP150树脂，缓冲液中所含的盐浓度可以除去污染物和脱水-达托霉素而不洗脱达托霉素。用Tris缓冲液或其他适宜的缓冲液从PorousP150树脂上洗脱达托霉素，洗脱缓冲液中盐的浓度能够使另外的杂质-包括显著量的β-异构体-仍结合在柱上。在另一优选实施方案中，使用PorosP150，并且达托霉素结合在含有2M尿素的pH6.0的醋酸盐 缓冲液中的树脂上。按上述相似的方法洗涤荷载达托霉素的PorosP150树脂并洗脱，不同点在于使用含有2M尿素的pH6.0醋酸盐缓冲液。可以用HPLC或UV检测器测定产品部分。 

可以通过柱色谱法或以间歇式方式进行改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法。也可以使用径向流(Radialflow)色谱法，如美国专利5,756,680、4,865,729、4,840,730或4,708,782所述。可以用步进盐梯度或连续盐梯度洗涤和洗脱改良缓冲液增强的阴离子交换树脂。适宜的步进或连续盐梯度是任何允许达托霉素与包括但不局限于脱水-达托霉素和β-异构体的杂质分离的盐梯度。在一优选实施方案中，连续盐梯度是0-1000mMNaCI。在一个优选实施方案中，盐梯度是100-500mMNaCl或0-400mMNaCl。 

在本发明的另一实施方案中，使用改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法纯化除达托霉素外的脂肽。这些脂肽化合物包括但不局限于：A54145、LY303366、棘白菌素(echinocandins)、肺麦芽毒素(pneumocandins)、阿库来菌素(aculeacin)、枯草菌溶血素(surfactin)和制磷脂菌素B1(plipastatinB1)(Tsuge等，1996，微生物学文献集(Arch.Microbiol.)165：243-51)和美国专利5,629,288所述的脂肽衍生物。在另一实施方案中，用改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法纯化达托霉素-相关的脂肽，例如A54145或脂肽，公开于美国专利4,537,717、4,482,487、Re.32,311、Re.32,310、5,912,226，现在是美国系列申请No.09/547,357和登记于1999年12月15日的美国临时申请Nos.60/170,943、60/170,946或60/170,945，及登记于2000年5月30日的美国临时申请No.60/208,222的再次公开，或A21978抗生素，其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链被正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三烷酰基或正十四烷酰基脂肪酸侧链代替。 

在本发明的另一实施方案中，使用色谱法步骤的新组合以纯化达托霉素或达托霉素相关的脂肽。此方法包括离子交换色谱法、小颗粒反相色谱法和改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法。纯化方法还可以包含改变用玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)制备含A21978C的粗产品的发酵条件。这些方法产生纯度至少为98％的达托霉素或达托霉素相关的脂肽。在一优选实施方案中，此方法产生纯度高于99％的达托霉素或达托霉素-相关的脂肽。 

制备色谱法的一个优选实施方案记载如下： 

如美国专利4,885,243所述，用正癸酸原料发酵玫瑰孢链霉菌 (Streptomycesroseosporus)，其改进是癸酸原料保持在不减少如上所述的发酵的总产量的可能最低水平。在另一选择的实施方案中，只要最终能产生达托霉素核附带的正癸酰基基团，可以使用不同的原料。这些原料的例子是但不局限于，癸酸酰胺、包括丁基酯的癸酸酯，椰子油或棕榈油的粗来源、动物来源的癸酸、癸酸的各种盐、和石化产品来源的癸酸。发酵后，按上述方法澄清细胞外溶液。在一个选择实施方案中，在如上所述用溶剂分离离心机或过滤进行澄清前可以用有机溶剂如正丁醇从菌丝中提取达托霉素。澄清发酵肉汤后，如上所述先用离子交换色谱法，然后通过HIC使达托霉素在澄清后的溶液中富集。 

完成HIC后，用本领域已知的任何方法减少达托霉素制剂中的有机溶剂。在一优选实施方案中，如上所述，用离子交换色谱法减少有机溶剂。应在与改良缓冲液增强的色谱法所需的缓冲液相容的缓冲液中将达托霉素从柱上洗脱。或者，可以采用反渗透法或用10,000MWCO过滤器的过滤法，用改良缓冲液代替洗脱缓冲液。在另一优选实施方案中，用蒸发法或在缓冲液中稀释的方法减少有机溶剂。在一第三优选的实施方案中，用在pH1.5-4.0的反渗透或pH2.5-4.5的超滤除去反相色谱法的溶剂和残余的盐。产物可以冷冻以批量储藏，或冷冻干燥，然后在水中或改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法所用的缓冲液中再水化。 

用上述改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法进一步纯化达托霉素。 

在改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法后，将纯化的达托霉素过滤并在冷冻条件下浓缩。可以用本领域已知的任何方法过滤达托霉素。在一优选实施方案中，如上所述将达托霉素除去热原并浓缩。或者，可以在pH1.5-4的冷却条件下用反渗法浓缩达托霉素。用低pH和冷却条件延缓纯化达托霉素的降解。 

作为一种选择，或除上述过滤和浓缩步骤外，从改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法得到的含有达托霉素的洗脱部分可以与丁醇(正、异或叔丁醇)在大约pH4.5混合，其比例高于1份丁醇对9份达托霉素溶液。在一优选实施方案中，1份丁醇与4份达托霉素溶液混合，得到20％丁醇溶液。使丁醇-达托霉素溶液分离成有机相和水相。达托霉素进入有机相，将其收集。达托霉素在有机溶剂中脱水可以稳定达托霉素，并防止纯化的达托霉素降解成脱水-达托霉素并随后形成β-异构体。 

浓缩并收集达托霉素后，将达托霉素冷冻干燥。 

在本发明的另一实施方案中，如上所述用制备色谱法纯化除达托霉素外的脂肽。 

脂肽胶束的形成及其应用方法

本发明的另一实施方案提供了脂肽胶束，形成脂肽胶束的方法和利用脂肽胶束进行脂肽纯化和制备药学组合物的方法。在一优选实施方案中，脂肽是达托霉素-相关的分子，特别包括，达托霉素，A54145，美国专利4,537,717、4,482,487、Re.32,311、Re.32,310、5,912,226中公开的达托霉素-相关的脂肽，现在作为美国系列申请No.09/547,357、于1999年12月15日申请的美国临时申请Nos.60/170,943、60/170,946或60/170,945，于2000年5月30日申请的美国临时申请Nos.60/208,222的再次公开，或A-21978抗生素，其中达托霉素的正癸酰基侧链被正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三烷酰基或正-十四烷酰基侧链代替。在一个更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素。 

胶束是双亲分子的聚集体。在水性介质中，分子的亲脂性部分朝向胶束内部，分子的亲水性部分与水性介质接触。在含有双亲分子的溶液中，当分子的浓度足够高时，自动形成胶束。 

胶束的形成使溶液的一些重要的物理性质产生变化，包括渗透压、浊度、电导率、表面张力、共离子和抗衡离子活性(当是离子型双亲性分子时)、折光率、UV和NMR光谱、部分摩尔体积、粘度、扩散系数、和染料增溶作用。可以通过测定一或多个这些胶束依赖性的物理性质作为双亲分子浓度的参数而确定cmc。可以通过动态激光散射、超速离心、粘度和/或低角度X-射线散射实验确定胶束的体积和形状。胶束也可以以液态晶相的形式存在。 

当脂肽的浓度高于脂肽的cmc时，脂肽可以聚集成胶束。Cmc依赖于脂肽的性质和含有脂肽的水溶液的温度、盐浓度和pH。与脂肽的性质相关，通过在亲脂性碳链中加入CH₂基团而降低脂肽的cmc。因此在特定的盐浓度、温度和pH产生达托霉素的cmc，那么结构中正癸酰基脂肪酸侧链被正辛酰基或正壬酰基脂肪酸侧链代替的A-21978类抗生素将有更高的cmc，而结构中正癸酰基脂肪酸侧链被正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三烷酰基或正十四烷酰基脂肪酸侧链代替的A-21978抗生素将有低于达托霉素的cmc。 

在本发明的一个实施方案中，可以通过加入或减去脂肽的一个CH2基 团而控制脂肽的cmc。在一优选实施方案中，脂肽是A-21978，其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链被正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三烷酰基或正十四烷酰基脂肪酸侧链代替。在另一实施方案中，可以按说明书的指示计算脂肽大致的cmc。给出脂肽例如达托霉素的cmc，可以计算结构中正癸酰基脂肪酸侧链被正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三烷酰基或正十四烷酰基脂肪酸侧链代替的相关的脂肽的大致cmc。可以通过本领域技术已知的方法完成上述内容。 

在另一优选实施方案中，给出一种脂肽的cmc，可以计算含有相关的肽部分的脂肽的大致cmc。在一优选实施方案中，给出达托霉素的cmc和在先技术的教导，可以容易地确定相关的脂肽例如A54145的cmc，它是美国专利4,537,717、4,482,487、Re.32,311、Re.32,310、5,912,226中公开的达托霉素-相关的脂肽，现在作为美国系列申请No.09/547,357、于1999年12月15日申请的美国临时申请Nos.60/170,943、60/170,946或60/170,945，于2000年5月30日申请的美国临时申请Nos.60/208,222的再次公开。 

在本发明的另一实施方案中，通过改变含有脂肽的溶液的温度而改变脂肽的cmc。脂肽的cmc通常随溶液温度的增加而增加。因此，降低温度可以促进胶束形成，升高温度会阻碍其形成。例如，含有脂肽的溶液可以在4℃形成胶束，因为在此温度cmc降低，脂肽浓度高于cmc；然而，同样的脂肽溶液在20℃可以是单节的，因为cmc随温度而增加，脂肽浓度此时低于cmc。因此，在一优选实施方案中，脂肽浓度在一个温度下高于cmc，而在另一较高温度下低于cmc。在一更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素或达托霉素-相关的分子，例如上述记载的种类。在一更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素。 

在另一优选实施方案中，在脂肽的纯化中利用通过用不同温度影响cmc而控制形成脂肽胶束的能力。在一更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素或相关的分子，例如以上所记载的。在一个更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素。在另一优选实施方案中，用通过改变温度而控制脂肽胶束形成的能力制备药物组合物，它们在某一温度条件下为胶束状，在其他温度条件下为单节的。在一优选实施方案中，药物组合物含有达托霉素或如上所述的达托霉素-相关的脂肽。在另一优选实施方案中，药物组合物含有达托霉素。 

在本发明的另一个实施方案中，加入电解质而减少离子脂肽的cmc。在 一优选实施方案中，在含脂肽的溶液中加入盐，例如NaCl，以降低脂肽胶束中带电基团之间的排斥力。在一优选实施方案中，脂肽是达托霉素或上述达托霉素-相关的分子。例如，达托霉素的肽部分含有3个天门冬氨酸残基和一个L-苏-3-甲基谷氨酸残基(3-MG)，在中性pH条件下它们都带电。因此加入电解质，例如NaCl或同等的盐，将降低达托霉素的cmc。在一优选实施方案中，盐浓度至少为100mM。在一更优选的实施方案中，盐浓度为150mM-300mM盐。在一甚至更优选的实施方案中，盐是NaCl。 

加入其他脂肽的电解质也会观察到cmc的降低，例如含有天门冬氨酸残基、3-MG残基或其他带电残基的达托霉素相关分子。因此，在一优选实施方案中，在溶液中加入盐以降低达托霉素相关的脂肽的cmc，例如A54145，美国专利4,537,717、4,482,487、Re.32,311、Re.32,310、5,912,226中公开的达托霉素-相关的脂肽，现在作为美国系列申请No.09/547,357、于1999年12月15日申请的美国临时申请Nos.60/170,943、60/170,946或60/170,945，于2000年5月30日申请的美国临时申请Nos.60/208,222的再次公开，或A21978抗生素，其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链被正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三烷酰基或正十四烷酰基脂肪酸侧链代替。在另一实施方案中，降低盐浓度以增加离子脂肽的cmc。在一优选实施方案中，离子脂肽是达托霉素或上述达托霉素-相关的脂肽。 

在另一优选实施方案中，在脂肽的纯化中利用通过改变电解质浓度影响cmc而控制形成脂肽胶束的能力。在一更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素或上述达托霉素-相关的分子。在一更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素。在另一优选实施方案中，利用通过电解质浓度而控制形成脂肽胶束的能力制备药物组合物，它们在某一电解质浓度是胶束状，而在其它电解质浓度是单节的。在一优选实施方案中，药物组合物含有达托霉素或上述达托霉素-相关的脂肽。在另一优选实施方案中，药物组合物含有达托霉素。 

在本发明的另一实施方案中，控制含有脂肽的溶液的pH以影响脂肽的cmc。在一优选实施方案中，脂肽是达托霉素或达托霉素-相关的分子，例如上述记载的。在一个更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素。在一个实施方案中，控制pH使脂肽的浓度高于在某一pH的cmc，并低于在另一pH的cmc。例如，对于达托霉素，在温度20-25℃的水中，在pH4.0的cmc非常低于pH6.0或7.5的cmc。在pH4.0，在此条件下的cmc约为400μg/mL。 见图15。另外，在pH6.5，即使150mg/mL的达托霉素，其中的达托霉素也是单节的(其中盐浓度是150mM-300mMNaCl，温度是4℃)。因此，对于达托霉素，pH4.0的cmc低于在高pH或低pH溶液中的cmc。不同pH水平下cmc的改变也可以用于其他带电脂肽，包括上述相关的达托霉素的脂肽。 

在另一优选实施方案中，在脂肽的纯化中利用通过改变pH而影响cmc，从而控制脂肽胶束形成的能力。在一优选实施方案中，脂肽是达托霉素或达托霉素-相关的分子，如上所述者。在一甚至更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素。在另一优选实施方案中，利用通过pH控制形成脂肽胶束的能力而制备药物组合物，它们在特定的pH是胶束状，的达托霉素-相关的脂肽，或A-21978抗生素--其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链由正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三烷酰基或正十四烷酰基脂肪酸侧链替换。在一更优选实施方案中，脂肽是达脱霉素。 

在本发明的另一实施方案中，胶束--无论其是混合的或只含有一种脂肽分子--都含有治疗上有用的脂肽。在一优选实施方案中，脂肽是抗生素。在一更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素。在浓度为1mg/mL，pH大约为4.0，达脱霉素在水中形成约为5.4nm 

的胶束。见图16。 

在另一优选实施方案中，胶束包括一种或多种不同种类的治疗物质。在一个实施方案中，治疗物质可以在溶液中与脂肽混合，因而从脂肽中形成胶束而治疗物质被限制于疏水内核中。在另一实施方案中，治疗物质与脂肽和一种或多种双亲分子混合，因而由脂肽和其它双亲分子形成混合胶束而在疏水内核中发现治疗物质。在一优选实施方案中，治疗物质是抗生素、抗炎剂或抗真菌剂。在一更优选的实施方案中，治疗物质是以下公开的抗生素和抗真菌剂。在另一优选实施方案中，治疗物质的疏水环境中可溶，但不溶于水溶液。 

在本发明的另一实施方案中，脂肽可以形成脂质体，它是囊状胶束，其中球形的脂质双层包围着一个水性内核。见图14，c部分。脂质体对于治疗用途是有利的，因为它们可以轻易地与质膜融合，可以用于将物质限制在它们的内部水性室中。这些物质可以是只溶于水溶液的物质。在一个实施方案中，溶液包含脂肽和另一可通过超声波处理生成脂质体的双亲分子。在另一实施方案中，单独的脂肽可以超声波降解生成脂质体。在一优选实施方案中，脂质体包括达托霉素或达托霉素-相关的脂肽，如A54145，是美国专利 4,537,717、4,482,487、Re.32,311、Re.32,310、5,912,226中公开的达托霉素-相关的脂肽，现在作为美国系列申请No.09/547,357、于1999年12月15日申请的美国临时申请Nos.60/170,943、60/170,946或60/170,945，于2000年5月30日申请的美国临时申请Nos.60/208,222的再次公开，或A-21978抗生素，其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链由正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三酰或正十四酰脂肪酸侧链替换。在一更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素。 

在另一优选实施方案中，在脂质体内部的水性室中有一种或多种治疗物质。在一优选实施方案中，此治疗物质是抗生素、抗炎剂或抗真菌剂。在一更优选的实施方案中，此治疗物质是下面公开的抗生素或抗真菌剂。在另一优选实施方案中，此治疗物质可溶于水溶液。在另一优选实施方案中，药物组合物含有脂质体。 

在一优选实施方案中，药物组合物含有脂肽胶束或含有治疗物质的脂肽胶束。脂肽胶束可以是球形的胶束、混合胶束或脂质体。含有脂肽胶束的药物组合物可以使注射或静脉注射给药时的局部炎症降低到最小。在一个实施方案中，药物组合物包括盐、用来维持一定pH的缓冲液和胶束。在另一个实施方案中，药物组合物含有一种或多种稳定胶束和/或稳定脂肽或其它治疗物质的药剂。在一个实施方案中，药物组合物也含有一种或多种治疗物质。在一优选实施方案中，此治疗物质是抗生素、抗炎剂或抗真菌剂。在一更优选的实施方案中，此治疗物质是以下公开的抗生素或抗真菌剂。此治疗物质可以是加入胶束中的治疗物质之外的物质，或者可以是组成胶束的治疗剂。 

可以将药物组合物干燥或冻干，在此情况下当任一种水溶液--如水或缓冲液--添加到药物组合物中时将形成胶束。在一优选实施方案中，药物组合物是冻干的，并包括再形成胶束时的盐的生理浓缩物，和维持pH值的缓冲液，在此pH下，当加入无菌水或其它缓冲液时，在室温自然地形成胶束。在一更优选的实施方案中，药物组合物含有达托霉素或相关的脂肽，如上述公开的达托霉素-相关的脂肽A54145，或A-21978抗生素，其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链由正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三酰或正十四酰脂肪酸侧链替换。在一更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素。在另一实施方案中，药物组合物是溶于水的。当使用脂质体时这是优选的。在一优选实施方案中，药物组合物含有脂质体的稳定剂。 

在本发明的另一方面，将胶束溶液分离和/或纯化。在一个实施方案中，通过超滤将胶束从较小的取代基中分离。根据胶束的体积选择超滤膜。通常，10,000NMW或30,000NMW的膜足以保留胶束并使较小的取代基，如污染物通过。在另一实施方案中，可以使用透析、密度梯度离心法或体积排除色谱法分离和/或纯化胶束。这些方法在此领域中广为人知。在一个实施方案中，胶束纯度高于30％，此处的纯度是通过将胶束的重量与单节形式的脂肽或其它分子的重量相比较测定得到的。在一优选实施方案中，胶束纯度高于50％、60％、70％、80％、90％或95％。 

在本发明的另一方面，形成脂肽胶束然后通过改变温度、pH值、电解液浓度和/或脂肽浓度将其分离的能力提供了一种纯化脂肽的方法。在一个实施方案中，此方法包括在脂肽形成胶束的条件下从低分子量的污染物中纯化脂肽然后利用体积选择技术，如超滤或体积排除色谱法将胶束从污染物中分离。在此发明的另一实施方案中，此方法包括在脂肽形成胶束的条件下浓缩脂肽然后利用体积选择技术浓缩它们。在一个更优选的实施方案中此方法包括作为单独步骤的纯化和浓缩。 

在本发明的另一实施方案中，此方法包括在脂肽是单节的条件下从高分子量的污染物--包括热原物质(如脂多糖)中--纯化脂肽，然后利用体积选择技术将单节脂肽溶液从高分子量的污染物中分离。在一优选实施方案中，如上讨论，体积选择技术是超滤法。在另一优选实施方案中，脂肽是达托霉素或相关的脂肽，如上公开的达托霉素-相关的脂肽如A54145或A-21978抗生素一其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链由正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三酰或正十四酰脂肪酸侧链替换。在一更优选的实施方案中，脂肽是达托霉素 

下面讨论用胶束纯化达托霉素的色谱法的优选实施方案： 

如上记载，利用正癸酸原料发酵玫瑰孢链霉菌。发酵后，如上记载澄清细胞外溶液。 

然后，如上记载将澄清制剂加到阴离子交换树脂上，如FP-DA13。用1-3柱体积的含有300-500mMNaCl的提高的盐缓冲液将达托霉素从树脂柱中洗脱。 

用酸将洗脱的达托霉素制剂的pH值调节为2.5-5.0。在一优选实施方案中，此酸是稀释的磷酸。在pH2.5-4.7,300-500mMNaCI和温度为2-15℃的条 件下，达托霉素形成胶束。 

通过10,000-30,000NMW的超滤膜将达托霉素制剂过滤。在超滤时，用含有30mM乙酸钠，pH3.5的缓冲液，在温度最高为15℃的条件下清洗达托霉素制剂。由于洗脱条件，初始的盐浓度是300mMNaCl，但盐浓度随清洗进行而降低。由于达托霉素处于胶束状，它保留在过滤器中而小于10,000-30,000(取决于所使用的过滤器)的杂质则通过过滤器。所得到的达托霉素的纯度大约为85-90％。 

作为一可选的步骤，可以稀释达托霉素制剂，将其pH升高到6.5以使达托霉素转化成单节状态。然后使达托霉素制剂通过10,000NMW的超滤膜。此可选的步骤显著降低热原物质含量。 

分析达托霉素纯度的方法

本发明的另一实施方案提供了测定达托霉素纯度的分析方法。 

在以前的技术中，许多与达托霉素共同纯化的污染物不能被确认或辨别，因为显示和测量杂质的能力受到分析方法和可使用设备的限制。见，如美国专利4,874,843和Kirsch等人(的记载)。更加敏感的分析型HPLC系统和技术的发展使分辨由在先技术的方法制备出的达托霉素批量产品中存在的几种污染物变为可能。更高分辨率的HPLC方法显示由在先技术方法纯化的达托霉素被已被确认的杂质污染，如脱水达托霉素和β-异构体，和其他在实施在先技术方法时与达托霉素共同纯化(并在已建立的HPLC检测条件下与达托霉素共同洗脱)的未知的污染物。现在确认这些污染物使开发清除这些污染物的方法变为可能。 

如上讨论，脱水-达托霉素和β-异构体曾经被记载为在制备达托霉素时总是反复出现的杂质。利用此处记载的HPLC分析，辨别出了其它大约十二种在生产达托霉素时产生的杂质，其中有些是以前未曾鉴别出的。利用美国专利4,874,843公开的方法未能在纯化后清除这些杂质。鉴别出了至少10种这些化合物(见，例如图2-11)。并且，这些化合物中的至少6种并非形成脱水-达托霉素和达托霉素的β-异构体形式的反应的直接结果，而是在发酵或纯化达托霉素时由其它不相关的过程产生的化合物。下面记载的本发明中的方法也可以显著降低这些杂质的水平(见实施方案)。 

本领域中已知的任何方法都可以用来测定达托霉素制剂中其它化合物的量。确认达托霉素污染物的方法包括但不限于质谱法、红外线光谱法、毛 细管电泳和核磁共振光谱法。测定达托霉素制剂中其它化合物的量的一种优选方法是HPLC。 

在本发明中使用两种方法来测定达托霉素杂质。与第二种方法相比，第一种方法的分辨率稍低。在两种方法中都使用了带有PENelson’sTurbochrom软件4.1版本的岛津或HPHPLC系统。表1概括了第一解决方法，表2概括了第二解决方法： 

表1 

1.溶剂传送系统： 

模式：等度(Isocratic)泵 

流速：1.5mL/min 

运行时间：30分钟 

2.溶剂A：pH4.5的0.5％NH₄H₂PO₄中的34％乙腈 

溶剂B：pH4.5的0.5％NH₄H₂PO₄中的20％乙腈 

目标条件是在15.0±0.5分钟时保留达托霉素。溶剂B可以与溶剂A一起使用以调节HPLC的流动相条件实现所要求的保留时间。 

3.自动取样冷却器：5(4-6)℃ 

4.注射体积：5μL-75μL(20μL正常) 

5.柱：IB-SIL(Phenomenex)，C-8，5μ，4.6mm×250mm(或等同物) 

6.预柱：IB-SIL(Phenomenex)，C-8，5μ，4.6mm×30mm(或等同物) 

7.检测波长：214nm 

8.柱温度：环境温度 

9.积分：可以测定峰面积的计算机系统或积分器 

表2 

1.溶剂传送系统： 

模式：等度(Isocratic)泵 

流速：1.5mL/min 

运行时间：75分钟 

2.溶剂A：pH3.25的0.45％NH₄H₂PO₄中的20％乙腈 

溶剂B：pH3.25的0.45％NH₄H₂PO₄中的50％乙腈 

目标条件是在pH3.25的0.45％NH₄H₂PO₄中大约35％乙腈(50％溶剂B)，以在第36.0±1.5分钟时保留达托霉素；但是，可以使用溶剂比来调节 HPLC流动相组合以实现所要求的时间。 

3.自动取样冷却器：5(4-6)℃ 

4.注射体积：5μL-75μL(20μL正常) 

5.柱：IB-SIL(Phenomenex)，C-8，5μ，4.6mm×250mm(或等同物) 

6.预柱：IB-SIL(Phenomenex)，C-8，5μ，4.6mm×30mm(或等同物) 

7.检测波长：214nm 

8.柱温：25(22-28)℃ 

9.积分：可以测定峰面积的计算机系统或积分器 

纯化的脂肽、药物组合物及其使用方法

本发明的另一个目标是提供纯化的脂肽，和盐、酯、酰胺、醚及其保护形式，同时提供含有纯化的脂肽或其盐的药物制剂。在一优选实施方案中，脂肽是上面记载的达托霉素或达托霉素-相关的脂肽。本发明更进一步的目标是提供包含脂肽胶束的药物组合物。在一优选实施方案中，脂肽胶束是包含达托霉素或一种或多种达托霉素-相关的脂肽的胶束。所有此处涉及的脂肽胶束不仅指所有脂肽胶束，还特别地考虑到达托霉素，或相关的脂肽，如上述公开的达托霉素-相关的脂肽A54145，或A-21978抗生素，其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链被正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三烷酰基或正十四烷酰基脂肪酸侧链代替。并且，所有此处涉及的脂肽胶束特别考虑上述讨论的球形胶束、混合胶束和脂质体。 

纯化的脂肽、其药学可接受的盐或脂肽胶束可以配制为口服、静脉内、肌内、皮下、气雾剂、局部用药或胃肠外给药的形式以治疗或预防疾病，特别是细菌感染。在一优选实施方案中，纯化的脂肽是纯化的达托霉素或达托霉素-相关的脂肽。此处涉及的“纯化达托霉素”、“纯化达托霉素相关的脂肽”或“纯化脂肽”包括它们制药学上可接受的盐。可以使用任何制药学上可接受的，与达托霉素或所感兴趣的脂肽相容的载体或赋形剂配制达托霉素、达托霉素-相关的脂肽或其它脂肽胶束。见，例如《药物添加剂手册》(HandbookofPharmaceuticalAdditives)：根据商品名称、化学药品、功能和生产者对多于6000种产品的国际指南，Ashgate出版公司，M.Ash和I.Ash编辑，1996；Merck索引：化学药品、药物和生物制剂的百科全书，S.Budavari编辑，年刊；《Remington’s制药科学》(Remington’sPharmaceuticalSciences)，Mack出版公司，Easton，PA；Martindale：《药物参考大全》 (TheCompleteDrugReference)，K.Parfitt编辑，1999；和Goodman&Gilman’s《治疗的药物基础》(ThePharmaceuticalBasisofTherapeutics)，Pergamon出版社，NewYork，NY，L.S.Goodman等编辑；这些文章的内容在此引用作为参考，以对用于人体治疗的各种抗菌剂的给药方法进行一般描述。本发明中的纯化的达托霉素、达托霉素-相关的脂肽或其它脂肽胶束可以与通常的制药载体和赋形剂混合而以以下形式使用：片剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、糯米纸囊剂(wafers)、霜剂和其它类似形式。达托霉素、达托霉素-相关的脂肽和脂肽胶束可以如在此讨论的一样，和其它治疗剂和抗生素混合。含有本发明化合物的此组合物含有大约0.1到大约90％重量的活性化合物，更通常的含量是从大约10到大约30％。 

本发明的组合物可以用控制释放系统(如胶囊)或持续释放系统(如生物可侵蚀的基质)传送。在美国专利No.4,452,775(授予Kent)、5,239,660(授予Leonard)、3,854,480(授予Zaffaroni)中记载有示例性的适用于本发明组合物给药的延迟释放传递系统。 

此组合物包含常用的载体和赋形剂，如玉米淀粉或凝胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和褐藻酸。此组合物可以包含交联羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、玉米淀粉、羟乙酸淀粉钠和海藻酸。 

片剂粘合剂可以包括阿拉伯树胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮(Povidone)、羟丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。 

可以使用的润滑剂包括硬脂酸镁或其它硬脂酸金属盐、硬脂酸、硅氧烷流体、滑石、蜡、油和胶态二氧化硅。 

也可以使用如薄荷油、鹿蹄草油、樱桃调味料或类似物作为调味剂。也需要加入调色剂以使药剂有更美观的外观或帮助鉴别产品。 

对于口服用药，固体制剂，如片剂和胶囊特别有用。也可以发明持续释放或包有肠溶衣的制剂。对于儿科和老年病的应用，悬浮液、糖浆和可咀嚼的片剂特别适合。对于口服给药，药物组合物使用例如片剂、胶囊、悬浮液或液体的形式。药物组合物优选制成含有治疗有效量的活性成分的剂量单位形式。这样的剂量单位的例子是片剂和胶囊。为治疗目的，这些片剂和胶囊除含有活性成分外，还可以含有常规的载体，如粘合剂，如阿拉伯树胶、凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇或黄芪胶；填充剂，如磷酸钙、糖胶、乳糖、玉米淀粉、山梨醇或蔗糖；润滑剂，例如硬脂酸镁、聚二乙烯、二氧化硅或 滑石；崩解剂，如马铃薯淀粉，调味或调色剂，或可接受的湿润剂。口服液体制剂通常是水或油溶液、悬浮液、乳剂、糖浆或酏剂形式，可以包含常规的添加剂，如悬浮剂、乳化剂、非水性剂、防腐剂、调色剂和调味剂。口服液体制剂可以包括脂肽胶束或单节形式的脂肽。液体制剂的添加剂的例子包括阿拉伯树胶、杏仁油、乙醇、分馏椰子油、凝胶、葡萄糖糖浆、甘油、氢化食用脂肪、卵磷脂、甲基或丙基对-羟基苯甲酸酯、丙二醇、山梨醇或山梨酸、卵磷脂、甲基纤维素、甲基或丙基对-苯甲酸酯、丙二醇、山梨醇或山梨酸。 

对于静脉内(IV)应用，可以将水溶性的达托霉素、达托霉素-相关的脂肽或其它脂肽溶解在任何一种常用的静脉用流体中，并灌注给药。对于脂肽胶束，在脂肽的浓度高于其cmc的条件下，将脂肽溶解到静脉用制剂中。本领域的普通技术人员可以遵循本发明的教导改变pH值、温度和盐浓度以得到含有脂肽胶束的静脉溶液。并且，还可以通过超声波处理(sonicate)脂肽溶液以得到脂肽脂质体。静脉用制剂可以包括载体、赋形剂或稳定剂，包括但不限于钙、人血清蛋白、柠檬酸盐、醋酸盐、氯化钙、碳酸盐和其它盐。静脉用流体包括但不限于生理学盐水或Ringer’s溶液。也可以将达托霉素或达托霉素-相关的脂肽置于注射器、套管、导管和管线中。 

胃肠外给药制剂可以是水性或非水性等渗无菌溶液或悬浮液。这些溶液或悬浮液可以由含有一种或多种在口服给药制剂中提到的载体的无菌粉末或颗粒制成。对于胃肠外给药特别可取的是脂肽胶束。化合物可以溶解在聚乙二醇、丙二醇、乙醇、玉米油、苯甲醇、氯化钠，和/或各种缓冲液中。对于肌内制剂，可以将脂肽化合物的无菌制剂或此化合物适合的可溶盐形式，如盐酸盐，溶解到药物稀释液如注射用水(WFI)、生理盐水或5％葡萄糖中给药。 

对于胃肠外给药特别需要脂肽胶束，因为它们不大可能在注射部位不会引起局部炎症。不希望限制于任何理论，可能脂肽胶束比单节的脂肽引起更少的局部炎症，因为在注射时可能引起炎症的脂质尾隐藏在胶束的内部，而与脂质尾相比不易引起局部炎症的肽核暴露在组织中。可以遵循本发明的教导制备用于肌内和肠胃外制剂的脂肽胶束以得到含有脂肽胶束的制剂。并且，可以通过超声波处理(sonicate)脂肽溶液以得到脂肽脂质体。也可以将此化合物的合适的不溶形式在水基或药学可接受的油基--如长链脂肪酸酯如油 酸乙酯中制备成悬浮液给药。 

可以通过在能进行生物降解的聚合物，如聚交酯-聚乙交酯(polylactide-polyglycolide)内形成化合物的微囊基质来制造可注射的储存剂型(Injectable depot forms)。可以根据药物与聚合物的比率和所使用的特定聚合物的性质来控制药物的释放速率。其它能进行生物降解的聚合物的例子包括聚(邻位酯)和聚合(酸酐)。也通过将此药物围入与身体组织相容的微乳液中而制备储备可注射(Depot injectable)的制剂。 

为局部应用，本发明的化合物和胶束也可以制备成用于皮肤、鼻和喉粘膜的适宜剂型，并可以采用霜剂、软膏、液体喷雾剂或吸入剂、锭剂或喉涂剂的剂型。这些局部制剂还可以包括化学物质，例如二甲基亚砜(DMSO)以促进活性成分的表面渗透。对于局部制剂，达托霉素、达托霉素-相关的脂肽、其适宜的盐或脂肽胶束的无菌制剂可以以霜剂、软膏、喷雾剂或其他局部敷料的形式给药。局部制剂也可以采取浸有纯化的达托霉素、达托霉素-相关的脂肽或脂肽胶束组合物的绷带的剂型。 

用于耳或眼，本发明的化合物可以是用疏水或亲水性基质制成的液体或半液体剂型，例如软膏、霜剂、洗剂、涂剂或粉末。 

对于直肠给药，本发明的化合物可以以与常规载体--如可可脂、蜡或其它甘油酯混合的栓剂形式给药。 

对于气溶胶制剂，可以在吸入器，例如计量吸入器和喷雾器中使用纯化的达托霉素或达托霉素-相关的脂肽或此化合物的盐型的无菌制剂。脂肽胶束的无菌制剂也可以用于气溶胶制剂。气溶胶制剂对于治疗呼吸系统感染特别有用，例如肺炎和窦性(sinusbased)感染。 

或者，本发明的化合物可以为粉末的形式用于当传递时在适当的药剂学可接受的载体中的重构。如果粉末形式要作为脂肽胶束重构，此粉末可以由缓冲液和/或盐构成，因而用特定数量的无菌水或盐水进行的重构会使此脂肽形成胶束。或者，考虑到用于重构脂肽以得到胶束的药剂学可应用的载体的数量和种类，此粉末剂型中可以有操作说明。在另一实施方案中，此化合物的单位剂量剂型可以是此化合物、它的盐或脂肽胶束的溶液，分散于灭菌、密封的安瓿中的适当稀释液中。单位剂量中此化合物的浓度可以改变，例如，从大约1％到大约50％，这取决于所使用的化合物及其溶解性和医师所需要的剂量。如果组合物包含单位剂量，优选每一单位剂量含有50-500mg 的活性物质。对于成人治疗，根据疗程和给药频率，每日所使用的剂量范围优选从100mg到3g。 

另一方面，本发明提供了一种治疗感染的方法，特别是那些在人体和其它动物身上由革兰氏阳性细菌引起的感染。术语“治疗”一词用来指预防感染和控制宿主动物被感染后已形成的感染。已形成的感染可以是急性的或慢性的。此方法包括给人或其它动物服用有效剂量的本发明化合物。有效剂量通常大约在0.1-25mg/kg之间的纯化的达托霉素、达托霉素-相关的脂肽或药剂学可接受的盐。达托霉素或达托霉素-相关的脂肽可以是单节的或是部分脂肽胶束。优选剂量是约1-25mg/kg的纯化的达托霉素或达托霉素-相关的脂肽或其药剂学可接受的盐。更优选的剂量是约1-12mg/kg的纯化达托霉素或其药剂学可接受的盐。 

在一个实施方案中，本发明提供了一种对接受者用治疗有效量的达托霉素或其它抗菌脂肽治疗感染，特别是在由革兰氏阳性细菌引起的感染的方法。达托霉素或抗菌脂肽可以是单节的或存在于脂肽胶束中。授予Rogers的美国专利No.5,041,567和PCT专利申请号为EP94/02552(公开号WO95/05384)的文献记载了传递抗菌剂的示例性的过程，其文件的所有内容完全结合在此作为参考。此处使用的术语“治疗有效量”指根据本发明能预防发作、减轻症状或停止细菌感染发展的达托霉素或抗菌脂肽的量。术语“治疗”被定义为对接受者给以治疗有效量的本发明化合物以防止感染的发生和控制或消除感染。此处记载的术语“接受者”指哺乳动物、植物或细胞培养物。在一优选实施方案中，接受者是需要脂肽化合物治疗的人或其它动物患者。 

脂肽抗生素化合物可以以单一的每日剂量或每日多剂量给药。此治疗体系可以要求长期服药，如数天或2-4星期。每次给药剂量或给药总量取决于例如这些因素：感染的性质和严重性、患者的年龄和一般健康状况、患者对抗生素的耐受性和此感染中涉及的微生物。在申请日为1999年9月24日的美国系列申请No.09/406,568中公开了一种给药方法，结合于此作为参考，它要求申请日为1998年9月25日的美国临时申请Nos.60/101,828和1999年3月24日的60/125,750作为优先权。 

本发明的方法包括给需要的患者服用能有效降低或消除革兰氏阳性细菌感染的数量的纯化达托霉素或其他脂肽抗生素或其药物组合物。达托霉素 或脂肽抗生素既可以是单节的也可以存在于脂肽胶束中。此抗生素可以通过口服、肠胃外、吸入、局部、直肠、鼻、口腔、阴道等途径给药，或通过植入储药囊、外置泵或导尿管的方式给药。可以将此抗生素制成用于眼或气雾剂用途。纯化的达托霉素、脂肽抗生素或其药物组合物也可以直接注射或给药到脓肿处、心室或关节内。胃肠外给药包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、脑池内(cisternal)、鞘膜内、肝内、伤口内(intralesional)和颅内注射或灌注。在一优选实施方案中，达托霉素或其他脂肽通过静脉注射、皮下注射或口服给药。 

也可以用本发明的方法治疗细菌感染的病人，其感染是由于任何种类的革兰氏阳性细菌引起或加剧的。在一优选实施方案中，根据本发明的方法给患者服用纯化的达托霉素、达托霉素-相关的脂肽、其他脂肽或其药物组合物。在另一优选实施方案中，会由以下细菌引起和加剧细菌感染，但并不仅限于这些种：甲氧西林易感的和抗甲氧西林的葡萄球菌(包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcushominis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)和凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase-negativestaphylococci))、糖肽中间体易感性金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(GISA)、青霉素易感性和抗青霉素的链球菌(包括肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)、鸟链球菌(Streptococcusavium)、牛链球菌(Streptococcusbovis)、乳链球菌(Streptococcuslactis)、血链球菌(Streptococcussangius)和C组链球菌、G组链球菌及亚急性链球菌(viridansstreptococci))、肠球菌(包括万古霉素易感性和抗万古霉素菌株，如粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)和屎肠球菌Enterococcusfaecium))、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、梭状梭菌(Clostridiumclostridiiforme)、无害梭菌(Clostridiuminnocuum)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、多枝梭菌(Clostridiumramosum)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、杰氏棒状杆菌(Corynebacteriumjeikeium)、双歧杆菌(Bifidobacteriumspp.)、产气真杆菌(Eubacteriumaerofaciens)、迟缓真杆菌(Eubacteriumlentum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)、植物乳杆菌 (Lactobacilllusplantarum)、乳球菌(Lactococcusspp.)、明串珠菌(Leuconostocspp.)、小球菌(Pediococcus)、厌氧消化链球菌(Peptostreptococcusanaerobius)、不解糖消化链球菌(Peptostreptococcusasaccarolyticus)、大消化链球菌(Peptostreptococcusmagnus)、微小消化链球菌(Peptostreptococcusmicros)、普氏消化链球菌(Peptostreptococcusprevotii)、产生消化链球菌(Peptostreptococcusproductus)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)和放线菌(Actinomycesspp.)。 

在体外试验中，达托霉素抵抗传统的“耐受性”菌株的抗菌活性可以与其抵抗传统的“易感性”菌株相比。并且达托霉素抵抗易感菌株的最小抑制浓度值(MIC)一般低于万古霉素4倍。因而，在一优选实施方案中，根据本发明的方法，将纯化的达托霉素、达托霉素相关的脂肽抗生素或其药物组合物对表现出对包括万古霉素在内的其它抗生素具有抗药性的患者给药。并且，不同于糖肽抗生素，达托霉素显示出对抗革兰氏阳性生物的快速的、与浓度相关的杀菌活性。从而，在一优选实施方案中，根据本发明的方法对需要快速产生抗菌疗效的患者给予纯化的达托霉素、脂肽抗生素或其药物组合物。 

本发明的方法可以用于身体任何器官或组织的革兰氏阳性细菌感染。这些器官或组织包括但不限于骨骼肌、皮肤、血流、肾、心脏、肺和骨。本发明的方法可以用于治疗而不仅限于皮肤和软组织感染、菌血症和尿道感染。本发明的方法可以用来治疗团体获得呼吸道感染，包括但不限于耳炎、窦炎、慢性支气管炎和肺炎，包括由抗药性肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)或流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)引起的肺炎。本发明的方法也可以用来治疗包括不同种类的革兰氏阳性细菌的混合感染，或包括革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌--包括需氧菌、caprophilic或厌氧菌--的混合感染。这些感染包括腹内感染和产科/妇产科感染。本发明的方法可以用于医院感染的减缓治疗，包括但不限于肺炎、腹内败血症、皮肤和软组织感染，及骨骼和关节感染。本发明的方法也可以用来治疗以下感染，包括但不限于：心内膜炎、肾炎、脓毒性关节炎和骨髓炎。在一优选实施方案中，以上记载的任何疾病都可以用纯化的达托霉素、脂肽抗生素或其药物组合物来治疗。此外，既可以用单节的，也可以用胶束状的达托霉素或脂肽抗生素来治疗这些疾病。 

达托霉素、达托霉素-相关的脂肽或其他脂肽也可以加入人的饮食或动物饲料中给药。如果作为总摄食量的一部分来给药，达托霉素或其他脂肽的量可以少于食物重量的1％，优选不超过食物重量的0.5％。对于动物的饮食，达托霉素或脂肽可以加入通常的食品中，或加入预混合料中。 

除达托霉素或其他脂肽抗生素之外，可以同时服用一种或多种抗真菌剂和/或一或多种抗生素来实施本发明的方法。同时服用达托霉素或其他脂肽抗生素之外的抗真菌剂和抗生素对于治疗由不同种类革兰氏阳性细菌引起的混合感染、由革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌引起的混合感染，或由细菌和真菌引起的混合感染是有用的。并且，达托霉素或其他脂肽抗生素可以改善一种或多种同时服用抗生素的毒性。已显示服用达托霉素和氨基甙类能改善由氨基甙类引起的肾毒性。在一优选实施方案中，一种抗生素和/或抗真菌剂可以与纯化的达托霉素、其它脂肽抗生素，或在含有纯化与达托霉素或其它脂肽抗生素的组合物中同时服用。 

其它治疗剂与达托霉素或其他脂肽抗生素同时给药可以通过单节或胶束状的达托霉素或脂肽抗生素进行。如前所述，球形的脂肽胶束可以用来增溶显示出低水溶性的药剂。另外，脂肽脂质体可以用来俘获脂质体囊中溶于水介质的药剂。根据以下说明书的教导，本领域的普通技术人员都能制造含有治疗药剂，如抗炎剂、抗真菌剂和其它抗生素的脂肽胶束。 

可以与达托霉素或其他脂肽抗生素共同给药的抗菌剂包括但不限于：青霉素及相关药物、碳青霉烯、头孢菌素及相关的药物、氨基甙类、杆菌肽、短杆菌肽、莫匹罗星、氯霉素、甲砜霉素、夫西地酸钠(fusidatesodium)、林可霉素、氯林肯霉素、大环内酯、新生霉素、多粘菌素、利福霉素、壮观霉素、四环素、万古霉素、替考拉宁、链阳性菌素、包括璜胺药物的抗叶酸剂、甲氧苄氨嘧啶及其与乙胺嘧啶的组合、包括硝基呋喃、乌洛托品杏仁酸盐和乌洛托品马尿酸盐的合成抗菌剂、硝基咪唑、喹诺酮、氟喹诺酮、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、对氨基水杨酸(PAS)、环丝氨酸、卷曲霉素、乙硫异烟胺、原磺酰胺(prothionamide)、氨硫脲(thiacetazone)、紫霉素、扁枝衣霉素、糖肽、glycylcylcline、ketolides、噁唑烷酮；亚胺培南(imipenen)、丁胺卡那霉素、奈替米星、磷霉素、庆大霉素、头孢曲松、Ziracin、LY333328、CL331002、HMR3647、Linezolid、Synercid、氨曲南和甲硝唑、依匹普林(Epiroprim)、OCA-983、GV-143253、Sanfetrinem钠、CS-834、比阿培南、A-99058.1、 A-165600、A-179796、KA159、DynemicinA、DX8739、DU6681；Cefluprenam、ER35786、Cefoselis、Sanfetrinemcelexetil、HGP-31、头孢匹罗、HMR-3647、RU-59863、Mersacidin、KP736、Rifalazil；Kosan、AM1732、MEN10700、Lenapenem、B02502A、NE-1530、PR39、K130、OPC20000、OPC2045、Veneprim、PD138312、PD140248、CP111905、硫培南、ritipenamacoxyl、RO-65-5788、Cyclothialidine、Sch-40832、SEP132613、micacocidinA、SB-275833、SR-15402、SUNA0026、TOC39、卡芦莫南、头孢唑兰、Cefetametpivoxil和T3811。 

在一优选实施方案中，根据本发明能够与达托霉素共同给药的抗菌剂包括但不限于：亚胺培南、丁胺卡那霉素、奈替米星、磷霉素、庆大霉素、头孢曲松、替考拉宁、Ziracin、LY333328、CL331002、HMR3647、Linezolid、Synereid、氨曲南和甲硝唑。 

可以与达托霉素或其他脂肽抗生素共同用药的抗真菌剂包括但不限于：Caspofungen、Voriconazole、舍他康唑、IB-367、FK-463、LY-303366、Sch-56592、Sitafloxacin、DB-289多烯烃，如两性霉素、制霉菌素、Primaricin；唑系(azoles)，如氟康唑、伊曲康唑和酮康唑；丙烯胺，如萘替芬和特比萘芬；和抗代谢物如氟胞嘧啶。其它抗真菌剂包括但不限于：Fostel等人在《今日药物发现》5∶25-32(2000)公开的种类，此处引用作为参考。Fostel等人公开的抗真菌化合物包括Corynecandin、Mer-WF3010、Fusacandins、Artrichitin/LL 15G256γ、粪壳菌素、Cispentacin、Azoxybacillin、Aureobasidin和Khafrefungin。 

达托霉素或其他脂肽抗菌素，包括达托霉素相关的脂肽，可以根据此方法给药直到细菌感染被根除或降低。在一个实施方案中，服用达托霉素或其他脂肽3天到6个月。在一优选实施方案中，服用达托霉素或其他脂肽7到56天。在一个更优选的实施方案中，服用达托霉素或其他脂肽7到28天。在一个更优选的实施方案中，服用达托霉素或其他脂肽7到14天。如果需要，达托霉素或其他脂肽可以被服用更长或更短时间。 

本发明具体涉及以下方面： 

1.完全纯净的达托霉素。 

2.纯度至少为98％的达托霉素。 

3.基本没有脱水-达托霉素并基本没有达托霉素的β-异构体的达托霉 素。 

4.根据项3所述的达托霉素，其完全没有脱水-达托霉素。 

5.根据项3所述的达托霉素，其没有脱水-达托霉素。 

6.基本没有任一杂质1-14的达托霉素。 

7.根据项6所述的达托霉素，其中完全没有任一杂质1-14。 

8.根据项1-7中任一项所述的达托霉素，其中用HPLC测定达托霉素的纯度。 

9.一种含有达托霉素的药物组合物，其中的达托霉素选自完全纯的达托霉素、纯度至少为98％的达托霉素、基本没有脱水-达托霉素和基本没有达托霉素β-异构体的达托霉素、完全没有脱水-达托霉素和基本没有达托霉素β-异构体的达托霉素、没有脱水-达托霉素和基本没有达托霉素β-异构体的达托霉素、基本没有杂质1-14的达托霉素，和完全没有杂质1-14的达托霉素。 

10.项9所述的药物组合物，还含有一和多种抗生素、一或多种抗真菌剂，或一种抗生素和一种抗真菌剂。 

11.纯化达托霉素的方法，其中达托霉素选自完全纯的达托霉素、纯度至少为98％的达托霉素、基本没有脱水-达托霉素和基本没有达托霉素β-异构体的达托霉素、完全没有脱水-达托霉素和基本没有达托霉素β-异构体的达托霉素、没有脱水-达托霉素和基本没有达托霉素β-异构体的达托霉素、基本没有杂质1-14的达托霉素，和完全没有杂质1-14的达托霉素； 

包括以下步骤： 

a)提供脱水-达托霉素和β-异构体总量至少为2.5％的达托霉素制剂； 

b)在有改良缓冲液的情况下使达托霉素制剂结合在阴离子交换树脂上，条件是使达托霉素以单体和非胶束状态结合在阴离子交换树脂上； 

c)在有改良缓冲液的情况下清洗阴离子交换树脂，条件是洗脱脱水-达托霉素但保留达托霉素；并且 

d)在有改良缓冲液的情况下洗脱达托霉素，条件是使达托霉素与β-异构体分离。 

12.项11所述的方法，其中的阴离子交换树脂是PorosD50或PorosP150。 

13.项11或12所述的方法，其中的离子改良缓冲液含有摩尔浓度为 2-6M的尿素，pH为6.0-7.0。 

14.项11所述的方法，还包括过滤和浓缩洗脱的达托霉素的步骤。 

15.纯化达托霉素的方法，其中达托霉素选自完全纯的达托霉素、纯度至少为98％的达托霉素、基本没有脱水-达托霉素和基本没有达托霉素β-异构体的达托霉素、完全没有脱水-达托霉素和基本没有达托霉素β-异构体的达托霉素、没有脱水-达托霉素和基本没有达托霉素β-异构体的达托霉素、基本没有杂质1-14的达托霉素，和完全没有杂质1-14的达托霉素；包括以下步骤： 

a)用正癸酸原料发酵玫瑰孢链霉菌，在发酵肉汤中产生达托霉素； 

b)澄清发酵肉汤； 

c)使发酵肉汤经过阴离子交换色谱法以得到富含达托霉素的制剂； 

d)使富集的达托霉素制剂经过疏水相互作用色谱法以得到半纯化的达托霉素制剂；并且 

e)使半纯化的达托霉素制剂经过改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法以得到纯化的达托霉素。 

16.根据项15所述的方法，其中步骤a)调节正癸酸以达到发酵过程中正癸酸的剩余浓度为每百万份中不大于50份(ppm)。 

17.根据项15所述的方法，其中步骤b)所述的澄清包括用含有丁醇的缓冲液提取发酵肉汤。 

18.根据项15所述的方法，其中步骤c)的阴离子交换色谱法在FP-DA13树脂上进行。 

19.根据项15所述的方法，其中步骤d)的疏水相互作用色谱法在HP-20ss树脂上进行。 

20.根据项19所述的方法，其中疏水相互作用色谱法在中性pH下进行，并且溶剂浓度低于在酸性pH下进行疏水相互作用色谱法时所用的溶剂浓度。 

21.根据项20所述的方法，其中通过改变树脂的pH，不经过除去溶剂的步骤而回收HP-20ss树脂。 

22.根据项15所述的方法，其中步骤e)的改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法在PorosD50或Poros150树脂上进行。 

23.根据项22所述的方法，其中步骤e)的改良缓冲液增强的阴离子交 换色谱法包括以下步骤： 

i)将步骤d)得到的半纯化的达托霉素制剂置于适于改良缓冲液增强的阴离子交换色谱法的缓冲液中； 

ii)在有改良缓冲液的情况下将达托霉素制剂结合到阴离子交换树脂上，条件是使其中的达托霉素以单体和非胶束的状态结合到阴离子交换树脂上； 

iii)在有改良缓冲液的情况下清洗阴离子交换树脂，条件是洗脱脱水-达托霉素而保留达托霉素；并且 

iv)在有改良缓冲液的情况下洗脱达托霉素，条件是使达托霉素与β-异构体分离。 

24.根据项23所述的方法，其中的清洗和洗脱步骤包括使用连续盐梯度或步进盐梯度。 

25.根据项15所述的方法，其中的清洗和洗脱步骤包括使用连续盐梯度或步进盐梯度。 

26.根据项15所述的方法，其中通过连续流动色谱法或径向流色谱法进行此方法。 

27.根据项15所述的方法，在步骤e)前还包括阴离子交换色谱法的步骤。 

28.根据项15所述的方法，还包括过滤和/或浓缩达托霉素的步骤。 

29.根据项15所述的方法，还包括对达托霉素除热原的步骤。 

30.根据项29所述的方法，还包括冷冻干燥达托霉素的步骤。 

31.用项11-30中任一项的方法制备的达托霉素。 

32.一种分离的化合物，选自：CB131012，CB-131011，CB-131008，CB-131006，CB-130989，CB-131005，CB131009和CB-131078。 

33.一种治疗病人感染的方法，包括给需要的病人有效量的项9或10所述的药物组合物的步骤。 

34.根据项33所述的方法，包括给需要的病人同时服用除达托霉素外的抗菌剂的步骤。 

35.根据项34所述的方法，其中所述的抗菌剂选自青霉素及其相关药物、碳青霉烯类、头孢菌素及相关的药物、氨基甙类、杆菌肽、短杆菌肽、莫匹罗星、氯霉素、甲砜霉素、夫西地酸钠、林可霉素、氯林肯霉素、大环内酯、新生霉素、多粘菌素、利福霉素、壮观霉素、四环素、万古霉素、替 考拉宁、链阳性菌素、包括璜胺药物的抗叶酸剂、甲氧苄氨嘧啶及其与乙胺嘧啶的组合、包括硝基呋喃、乌洛托品杏仁酸盐和乌洛托品马尿酸盐的合成抗菌剂、硝基咪唑、喹诺酮、氟喹诺酮、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、对氨基水杨酸(PAS)、环丝氨酸、卷曲霉素、乙硫异烟胺、原磺酰胺、氨硫脲、紫霉素、扁枝衣霉素、糖肽、glycylcylcline、ketolides、噁唑烷酮；亚胺培南、丁胺卡那霉素、奈替米星、磷霉素、庆大霉素、头孢曲松、Ziracin、LY333328、CL331002、HMR3647、Linezolid、Synercid、氨曲南和甲硝唑、依匹普林、OCA-983、GV-143253、Sanfetrinem钠、CS-834、比阿培南、A-99058.1、A-165600、A-179796、KA159、DynemicinA、DX8739、DU6681；Cefluprenam、ER35786、Cefoselis、Sanfetrinemcelexetil、HGP-31、头孢匹罗、HMR-3647、RU-59863、Mersacidin、KP736、Rifalazil；Kosan、AM1732、MEN10700、Lenapenem、B02502A、NE-1530、PR39、K130、OPC20000、OPC2045、Veneprim、PD138312、PD140248、CP111905、硫培南、ritipenamacoxyl、RO-65-5788、Cyclothialidine、Sch-40832、SEP132613、micacocidinA、SB-275833、SR-15402、SUNA0026、TOC39、卡芦莫南、头孢唑兰、头孢他美新戊酰氧甲酰和T3811。 

36.根据项33所述的方法，其中所述的抗菌剂选自亚胺培南、丁胺卡那霉素、奈替米星、磷霉素、庆大霉素、替考拉宁、Ziracin、LY333328、CL331002、HMR3647、Linezolid和Synercid、氨曲南，和甲硝唑组成的组。 

37.根据项33所述的方法，包括给需要的病人同时服用抗真菌剂的步骤。 

38.根据项37所述的方法，其中所述的抗真菌剂选自：多烯烃、唑类、丙烯胺、抗代谢产物、Fusacandins和粪壳菌素。 

39.根据项37所述的方法，其中所述的抗真菌剂选自两性霉素、制霉菌素、Primaricin、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、萘替芬、特比萘芬、氟胞嘧啶、Corynecandin、Mer-WF3010、Artrichitin/LL 15G256γ、Cispentacin、Azoxybacillin、Aureobasidin和Khafrefungin。 

40.一种纯化达托霉素的方法，包括以下步骤： 

a)用正癸酸原料发酵玫瑰孢链霉菌，在发酵肉汤中产生达托霉素； 

b)澄清发酵肉汤； 

c)使发酵肉汤经过阴离子交换色谱法以得到富含达托霉素的制剂； 

d)使富集的达托霉素制剂经过疏水相互作用色谱法以得到半纯化的达托霉素制剂；并且 

e)使半纯化的达托霉素制剂经过阴离子交换色谱法以得到纯化的达托霉素。 

41.根据项40所述的方法，其中调节步骤a)的正癸酸原料使在发酵过程中达到正癸酸的浓度不高于每百万份中50份(ppm)。 

42.根据项40所述的方法，其中步骤b)所述的澄清包括过滤或离心和深度过滤。 

43.根据项40所述的方法，其中步骤c)的阴离子交换色谱法在FP-DA13树脂上进行。 

44.根据项40所述的方法，其中步骤d)的疏水相互作用色谱法在HP-20ss树脂上进行。 

45.根据项44所述的方法，其中的疏水相互作用色谱法在中性pH，并且溶剂浓度低于在酸性pH下进行疏水相互作用色谱法时所用的溶剂浓度。 

46.根据项45所述的方法，其中通过在酸性pH装载柱并在中性pH条件下洗脱柱而回收HP-20ss树脂。 

47.根据项40所述的方法，其中步骤e)的阴离子交换色谱法在FP-DAl3树脂上进行。 

48.根据项40所述的方法，其中使用步骤e)的阴离子交换色谱法以降低从步骤b)得到的溶剂的水平。 

49.根据项40所述的方法，其中清洗和洗脱步骤包括采用连续的盐梯度。 

50.根据项40所述的方法，其中清洗和洗脱步骤包括采用步进的盐梯度。 

51.根据项40所述的方法，其中通过连续流动色谱法进行此方法。 

52.根据项40所述的方法，还包括过滤和/或浓缩达托霉素步骤。 

53.根据项40所述的方法，还包括通过超滤除去达托霉素中热原的步骤。 

54.根据项53所述的方法，其中所述的除热原包括以下步骤： 

i)使达托霉素溶液处于其中的达托霉素为单体和非胶束状态的条件； 

ii)在达托霉素将通过滤器而热原不通过滤器的条件下过滤达托霉素溶 液； 

iii)改变通过滤器的达托霉素溶液使达托霉素聚集； 

iv)在使达托霉素保留在滤器上的条件下过滤达托霉素溶液；并 

v)收集达托霉素。 

55.根据项53所述的方法，还包括冷冻干燥达托霉素的步骤。 

56.根据项23所述的方法，通过径向流色谱法进行此方法。 

57.一种脂肽胶束，所包含的脂肽选自：达托霉素、A54145、达托霉素-相关的脂肽和A-21978抗生素，其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链被正-辛酰基、正-壬酰基、正-十一酰基、正-十二酰基、正-酰基或正-十四酰基脂肪酸侧链取代。 

58.项57的脂肽胶束，其中的脂肽是达托霉素。 

59.项57的脂肽胶束，其中的脂肽胶束是球形、层状、圆筒形或囊状胶束。 

60.项59所述的脂肽胶束，其中的脂肽胶束是球形胶束或一种脂质体。 

61.项57所述的脂肽胶束，其中的脂肽胶束是混合胶束。 

62.一种药物组合物，包含的脂肽选自：达托霉素、A54145、达托霉素-相关的脂肽和A-21978抗生素，其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链被正-辛酰基、正-壬酰基、正-十一酰基、正-十二酰基、正-酰基或正-十四酰基脂肪酸侧链取代； 

其中脂肽胶束是球形、层状、圆筒形或囊状胶束或混合胶束。 

63.项62所述的药物组合物，其中药物组合物还含有一或多种治疗剂。 

64.项63所述的药物组合物，其中的治疗剂选自抗炎剂、抗真菌剂和抗生素。 

65.项63所述的药物组合物，其中的治疗剂结合在胶束的内部或形成胶束的一部分。 

66.项64所述的药物组合物，其中所述的抗菌剂选自：青霉素及相关药物、碳青霉烯类、头孢菌素及相关的药物、氨基甙类、杆菌肽、短杆菌肽、莫匹罗星、氯霉素、甲砜霉素、夫西地酸钠、林可霉素、氯林肯霉素、大环内酯、新生霉素、多粘菌素、利福霉素、壮观霉素、四环素、万古霉素、替考拉宁、链阳性菌素、包括璜胺药物的抗叶酸剂、甲氧苄氨嘧啶及其与乙胺嘧啶的组合、包括硝基呋喃、乌洛托品杏仁酸盐和乌洛托品马尿酸盐的合成 抗菌剂、硝基咪唑、喹诺酮、氟喹诺酮、异烟肼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、对氨基水杨酸(PAS)、环丝氨酸、卷曲霉素、乙硫异烟胺、原磺酰胺氨硫脲、紫霉素、扁枝衣霉素、糖肽、glycylcylcline、ketolides、噁唑烷酮；亚胺培南、丁胺卡那霉素、奈替米星、磷霉素、庆大霉素、头孢曲松、Ziracin、LY333328、CL331002、HMR3647、Linezolid、Synercid、氨曲南和甲硝唑、依匹普林、OCA-983、GV-143253、Sanfetrinem钠、CS-834、比阿培南、A-99058.1、A-165600、A-179796、KA159、DynemicinA、DX8739、DU6681；Cefluprenam、ER35786、Cefoselis、Sanfetrinemcelexetil、HGP-31、头孢匹罗、HMR-3647、RU-59863、Mersacidin、KP736、Rifalazil；Kosan、AM1732、MEN10700、Lenapenem、B02502A、NE-1530、PR39、K130、OPC20000、OPC2045、Veneprim、PD138312、PD140248、CP111905、硫培南、ritipenamacoxyl、RO-65-5788、Cyclothialidine、Sch-40832、SEP132613、micacocidinA、SB-275833、SR-15402、SUNA0026、TOC39、卡芦莫南、头孢唑兰、头孢他美新戊酰氧甲酰和T3811。 

67.根据项66所述的药物组合物，其中所述的抗菌剂选自亚胺培南、丁胺卡那霉素、奈替米星、磷霉素、庆大霉素、替考拉宁、Ziracin、LY333328、CL331002、HMR3647、Linezolid和Synercid、氨曲南，和甲硝唑组成的组。 

68.根据项64所述的组合物，其中所述抗真菌剂选自多烯烃、唑类(azoles)、丙烯胺、抗代谢产物、Fusacandins和粪壳菌素。 

69.根据项68所述的组合物，其中所述的抗真菌剂选自两性霉素、制霉菌素、Primaricin、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、萘替芬、特比萘芬、氟胞嘧啶、Corynecandin、Mer-WF3010、Artrichitin/LL15G256γ、Cispentacin、Azoxybacillin、Aureobasidin和Khafrefungin。 

70.一种治疗病人感染的方法，包括给需要的病人服用有效量的项62-69中任一项所述的药物组合物。 

71.根据项70所述的方法，其中的药物组合物含有达托霉素。 

72.根据项70所述的方法，还包括将除脂肽外的抗真菌剂、抗炎剂或抗生素对需要的病人给药。 

73.一种纯化选自：达托霉素、A54145、达托霉素-相关的脂肽和A-21978抗生素的脂肽抗生素的方法，其中达托霉素的正癸酰基脂肪酸侧链被正-辛酰基、正-壬酰基、正-十一酰基、正-十二酰基、正-酰基或正-十四酰基脂肪 酸侧链取代，此方法包括以下步骤： 

a)使脂肽制剂为单体和非胶束状态； 

b)改变脂肽溶液的条件使脂肽形成胶束； 

c)从低分子量材料中分离脂肽胶束；并且 

d)收集脂肽胶束。 

74.根据项73所述的方法，其中的脂肽是达托霉素。 

75.根据项73所述的方法，通过超滤法从低分子量材料中分离其中的脂肽胶束。 

76.根据项75所述的方法，用10,000或30,000标示分子量(NMW)的膜进行其中的超滤过程。 

77.根据项73所述的方法，还包括以下步骤： 

e)使步骤d)中收集的脂肽处于其中的脂肽胶束分离成脂肽单体的条件下； 

f)从高分子材料中分离脂肽单体；并 

g)收集脂肽单体。 

78.根据项73所述的方法，其中采用阴离子交换色谱法或重复的疏水色谱法以产生步骤a)的脂肽制剂。 

79.一种纯化达托霉素的方法，包括以下步骤： 

a)在发酵肉汤中用正癸酸原料发酵玫瑰孢链霉菌，产生达托霉素； 

b)澄清发酵肉汤； 

c)使发酵肉汤经过间歇式或柱色谱法以得到富含达托霉素的制剂； 

d)改变达托霉素溶液的条件使达托霉素形成胶束； 

e)从低分子量材料中分离达托霉素胶束；并 

f)收集达托霉素胶束。 

80.根据项79所述的方法，还包括以下步骤： 

f)使步骤e)收集的达托霉素处于其中的达托霉素胶束分离成达托霉素单体的条件下； 

g)从高分子量材料中分离达托霉素单体；并 

h)收集达托霉素单体。 

81.根据项79所述的方法，其中间歇式或柱色谱法是阴离子交换色谱法或重复疏水色谱法。 

82.根据项81所述的方法，其中用FP-DA13树脂进行所述的阴离子交换色谱法，用HP-20andHP-20ss树脂进行重复疏水相互作用色谱法。 

83.根据项73所述的方法，其中是通过改变脂肽溶液的温度、电解质浓度、pH或溶剂浓度中的一或多种因素而达到所述的改变的。 

84.根据项83所述的方法，其中pH从中性或碱性变为pH约2.5-4.7。 

85.根据项83所述的方法，其中的温度从至少15℃变为2-10C。 

86.一种制备含有脂肽胶束的药物组合物的方法，其中的胶束所含的脂肽选自：达托霉素、A54145、达托霉素-相关的脂肽和A-21978抗生素，其中正癸酰基脂肪酸侧链被正辛酰基、正壬酰基、正十一烷酰基、正十二烷酰基、正十三烷酰基或正十四烷酰基脂肪酸侧链代替，此方法包括以下步骤： 

a)使脂肽为单体状态；并 

b)加入将脂肽转变成胶束的药学可接受的溶液以形成药物组合物。 

87.根据项86所述的方法，其中的单体形式的脂肽为干燥或冷冻干燥状态。 

88.根据项86所述的方法，其中的单体形式的脂肽是溶液状态。 

89.根据项86所述的方法，其中药学可接受的溶液包含电解质、缓冲液或溶剂中的一或多种。 

90.根据项89所述的方法，其中的缓冲液将药物组合物的pH保持在pH2.5-4.5之间。 

91.根据项86所述的方法，还包括在药物组合物中加入一或多种治疗剂的步骤。 

92.根据项91所述的方法，其中的治疗剂是另一种抗生素、一种抗炎剂、一种抗真菌剂或在药物组合物中加入它们中的任何组合。 

93.根据项92所述的方法，其中的抗生素、抗炎剂或抗真菌剂结合在脂肽胶束中。 

94.根据项92所述的方法，其中的抗生素、抗炎剂或抗真菌剂不结合在脂肽胶束中。 

为能更充分地理解本发明，现提出下列实施方案。这些实施方案的目的只是为了说明本发明，而在任何方面都不能理解为对本发明范围的限制。 

实施例1 

在受控制的癸酸原料发酵条件下进行玫瑰孢链霉菌(S.roseosporus)NRRL菌株15998的发酵培养使抗生素的产出最优化而使污染物的产出最小。用气体色谱法测定残留癸酸原料的量，从诱导开始(大约在第30小时)到收获结束，目标的残留水平是10ppm癸酸。将培养物离心，并随后分析澄清的肉汤，用HPLC测定生成的达托霉素。产物滴定度一般在每公升发酵肉汤2.1-2.6克之间。 

既可以用Pall-Sep的微孔过滤法也可以使用完全商业规模的离心和深度过滤法收获发酵产物。将澄清的肉汤加到阴离子交换树脂-三菱FP-DA13上，然后在pH6.5下用30mMNaCl清洗并在pH6.0-6.5下用300mMNaCl洗脱。或者，在pH6.5用60mMNaCl清洗FP-DAl3柱，并在pH6.0-6.5下用500mMNaCl洗脱。洗脱物加到HIC树脂-HP-20ss上，用30％乙腈清洗，并在pH4.0-5.0下用35％乙腈洗脱。或者，用45％的异丙醇清洗HIC树脂，并用55-60％的异丙醇洗脱。洗出物加到FP-DA13树脂上，并如前述进行清洗和洗脱。最终的阴离子交换步骤可以减少三分之一或更多的溶剂。在pH1.5-2.5下用0.2μm的过滤器进行反渗(Reverse osmosis diafiltration)和浓缩，然后将达托霉素的制剂冷冻。在无菌灌装之前用注射水(WFI)进行最终的反转渗透透过过滤以清洗达托霉素并调节它的浓度。然后将瓶装或散装的达托霉素冻干。 

实施例2 

通过玫瑰孢链霉菌(S.roseosporus)的发酵培养生产达托霉素，并用美国专利4,885,243记载的方法以微孔过滤从5500升发酵肉汤中提纯出部分纯化的达托霉素(9.9Kg)。用美国专利4,874,843记载的方法将此部分纯化的达托霉素进一步提纯，得到纯度为91％的大量达托霉素的制剂。经过HPLC分析，这种达托霉素制剂含有14种杂质(见实施例10)。将达托霉素制剂加到含有6M尿素的pH7.0的Tris缓冲液中的PorosP150阴离子交换树脂(PE生物系统(PEBiosystems))上，使其与树脂结合。在开始同一缓冲液中NaCl梯度洗脱之前，用三个柱体积量的缓冲液清洗树脂。或者，可以用30mMNaCl的固定盐水平有效地从柱中清除污染物。在0-1000mMNaCl梯度之间，在大约300mMNaCl时从树脂上洗脱纯化的达托霉素。根据“第一”HPLC方法测定，洗脱的达托霉素的纯度高于99％。这种纯化的达托霉素只含有一种可检测的达托霉素污染物。不能检出脱水-达托霉素和β-异构体(少于0.01 ％污染物)。未确认的污染物的水平高于0.1％并低于0.5％。 

实施例3 

按实施例2记载的方法制备大批量纯度为91％的达托霉素制剂。将这种达托霉素制剂加到存在于含有6M尿素的pH7.0醋酸盐缓冲液中的PorosD50阴离子交换树脂上(PE生物系统)。按实施例2记载的同样方式清洗并洗脱PorosD50阴离子交换树脂。根据“第二”HPLC方法测定，从柱中洗脱的达托霉素的纯度为96.92％。本发明的产品只含有最初的14种杂质中的两种(少于0.5％污染)。在纯化的达托霉素制剂中不能检出脱水-达托霉素(少于0.01％污染，准确定量少于0.05％)。 

实施例4 

按实施例2记载的方法制备含达托霉素的发酵肉汤。用微孔过滤法使其澄清。在pH4.5下，用20％正丁醇或异丁醇萃取此澄清的产物(一份丁醇对4份澄清溶液)。再次萃取此澄清的产物，使部分纯化达托霉素的产量高于澄清溶液中达托霉素总量的90％。通过添加pH6.5水性缓冲液从丁醇相中回收达托霉素，添加体积是丁醇体积的一半或更多，将达托霉素从丁醇相萃取到水相。此丁醇萃取步骤产生部分纯化的达托霉素制剂，相对于澄清溶液其纯度是5倍，浓度是10倍。 

然后按美国专利No.4,874,843记载的方法将这种达托霉素水性制剂纯化，得到了纯度为91％的达托霉素。达托霉素含有14种杂质。将此达托霉素制剂加到存在于含有6M尿素的pH7.0醋酸盐缓冲液中的PorosD50阴离子交换树脂上。在同一缓冲液中，开始用从0-1000mM的NaCl梯度洗脱之前，先用3个离子交换树脂床体积的含有6M尿素的pH7.0Tris缓冲液清洗树脂。大约在300mMNaCl，从树脂上洗脱纯化的达托霉素。用“第二”HPLC方法测定，达托霉素的纯度为98％。 

实施例5 

按实施例2记载的方法发酵达托霉素。5500升发酵肉汤含有13公斤达托霉素。在pH4.5，用20％正丁醇直接萃取发酵肉汤，将达托霉素分离到丁醇内。用正丁醇再次萃取发酵肉汤以得到高于发酵肉汤内总达托霉素90％的产量。用pH6.5的醋酸盐水溶液缓冲液萃取此丁醇相，得到达托霉素，其纯度是发酵肉汤的5倍(35％)而浓度是10倍。按美国专利4,885,243中记载的方法微孔过滤这种水相达托霉素，然后按美国专利4,874,843的方法纯化。 用这种方法可以得到纯度约为91％的达托霉素。按在先技术，用HPLC法测定达托霉素含有14种杂质。将此达托霉素制剂加到存在于含有6M尿素的pH7.0醋酸盐缓冲液中的PorosD50阴离子交换树脂柱上。按实施例2的指示清洗并洗脱此树脂。用第二种HPLC法测定，此色谱法步骤的产品的纯度大约是98％-99％。 

实施例6 

用玫瑰孢链霉菌(S.roseosporus)的发酵培养基制备达托霉素，不同是，在用微孔过滤或离心过滤法澄清时，降低了残留癸酸的供给量，以将发酵物的质量改善到10％纯度。在发酵过程中，监测并定时调整癸酸水平以使残留癸酸的水平保持在少于50ppm，优选地，在1-10ppm之间。按美国专利4,885,243记载的方法将发酵肉汤经微孔过滤以从5500升发酵肉汤中生产出12.1公斤部分纯化的达托霉素。在中性pH的醋酸盐缓冲液中澄清的发酵肉汤与阴离子交换剂，FP-DA13(三菱)，结合，在含有30mMNaCl的醋酸盐缓冲液中清洗，随后在300mMNaCl用醋酸盐缓冲液洗脱。此阴离子交换步骤制备纯度高于70％的达托霉素。按美国专利4,874,843的方法，并改进地使用HP-20ss树脂将这种部分纯化的达托霉素进一步纯化。特别地，将这种部分纯化的达托霉素装载于存在于含有10％乙腈的醋酸盐缓冲液中的HP-20ss树脂上，在醋酸盐缓冲液中用含有30％乙腈的醋酸盐缓冲液清洗，并用40％乙腈洗脱，根据第二HPLC法测定，可以得到纯度约为94-96％的达托霉素。按实施例5记载的方法，使用PorosD50树脂对此产品进行改进的缓冲液增强的阴离子交换色谱法处理。达托霉素的纯度高于99％并且只含有按在先技术方法生产出的14种杂质中的两种。 

实施例7 

按实施例2记载的方法生产纯度为93％的达托霉素制剂。将此产品加到存在于含有2M尿素的pH6.0醋酸盐缓冲液中的Poros P150阴离子交换树脂(PE生物系统)上。用三柱体积量的缓冲液清洗这种PorosP150树脂。在此含有2M尿素的pH6.0醋酸盐缓冲液中用0-400mMNaCl的梯度将达托霉素从树脂中洗脱出来。在150-300mMNaCl之间洗脱出达托霉素。按第一HPLC法测定，从柱中洗出的达托霉素的纯度是99.0-99.5％。达托霉素含有痕量的4种杂质，其含量少于达托霉素总量的1％。从纯化的达托霉素制剂中未检出脱水-达托霉素(小于0.02％污染度)。 

实施例8 

按实施例2记载的方法生产纯度为93％的达托霉素制剂。将此产品加到存在于含有2M尿素的pH6.0醋酸盐缓冲液中的PorosP150阴离子交换树脂(PE生物系统)上。用6柱体积量的存在于含有2M尿素的pH6.0醋酸盐缓冲液中的60mMNaCl(“清洗缓冲液”)清洗此柱。清洗缓冲液可以在50-75mMNaCl之间变化。此清洗实际上可除去所有脱水-达托霉素。用16柱体积量的存在于含有2M尿素的pH6.0醋酸盐缓冲液中的250mMNaCl洗脱达托霉素。按“第一”HPLC方法测定，达托霉素的纯度为98.5-99.5％。 

实施例9 

使用一种显著地降低了进行HP-20ss色谱法所需的溶剂浓度的方法制备实施例2中记载的达托霉素制剂。出乎意料的是，当在中性pH条件下进行HP-20ss色谱法，而不是如美国专利4,874,843所记载在酸性pH条件下进行时，洗脱达托霉素所用溶剂，40％的乙腈或55-60％异丙醇酒精分别降低到12％和25％。在一优选实施例中，可以使用pH转换重复利用HP-20ss树脂而不需清除溶剂。 

在pH6.5-7.0，从FP-DA13树脂柱洗脱之后，达托霉素装载于平衡-如在pH6.6的60mM醋酸盐中平衡-的HP-20ss树脂柱上。用5-8柱床体积量(CBV)的清洗缓冲液清洗此树脂柱。一种示例性的清洗缓冲液是pH6.6的5％异丙醇/60mM醋酸盐。用洗脱缓冲液将达托霉素从树脂柱中洗出。一种示例性的洗脱缓冲液是pH6.6的2-3CBV25％异丙醇/60mM醋酸盐。用解吸缓冲液使树脂柱解吸。在一个实施例中，用pH6.6-7.0的1CBV40％异丙醇/60mM醋酸盐解吸树脂柱。调整达托霉素溶液至pH3.5-4.0并再次装载于HP-20ss树脂柱以进一步提高纯度。在一个实施例中，用0.25M磷酸将从pH6.5的HP-20ss树脂柱洗脱的达托霉素调整到pH3.5。再将此达托霉素溶液装载于预解吸并在pH3.5的60mM醋酸盐中平衡过的HP-20ss树脂柱。用pH调节缓冲液清洗树脂柱以使pH为6.5。一种示例性的pH调节缓冲液是5-8份CBV的pH6.6的5％异丙醇/60mM醋酸盐。用洗脱缓冲液洗脱达托霉素，如果需要，进一步用阴离子交换法或其他纯化方法纯化。在再利用之前，用解吸缓冲液解吸并清洁HP-20ss树脂柱。一种示例性的清洁过程包括用3份CBV0.5MNaOH清洗，用1份CBV水清洗，然后在平衡之前用0.25M磷酸清洗。此树脂柱可以保存在0.5MNaOH中。 

实施例10 

通过半制备的HPLC法和使用正离子和负离子模式的液体色谱/质谱(LC/MS)法鉴定按实施例2的记载制备的大量达托霉素。色谱法分析前在Poros P150阴离子交换树脂上的大量达托霉素的杂质曲线列于表3，大量达托霉素制剂的色谱如图12所示。 

表3 

杂质1(CB-131012)，大约在第7.96分钟洗脱，推测(MW：1638)为达托霉素的一种内酯水解产品(图4)。这些结果看来与以前由Lilly鉴定的LY212218--一种达托霉素的癸基开环衍生物--相符。 

杂质2(CB-131011)，大约在第9.11分钟洗脱，推测(MW：1638)也是β -异构体的一种内酯水解产品(图5)。 

杂质3(CB-131008)，大约在第11.54分钟洗脱，推测(MW：745)为由包括色氨酸、天冬酰胺、门冬氨酸盐、苏氨酸和带有癸酸链的甘氨酸的5个氨基酸的链肽构成的线性脂肽(图6)。此结果看来符合以前由Lilly鉴定的LY213928。 

杂质4(CB-131006)，大约在第12.28分钟洗脱，推测(MW：1624)为一种达托霉素的氧化类似物，其中氨基酸中的色氨酸氧化成了犬尿氨酸(图7)。 

杂质5，大约在第13.10分钟洗脱，尚未鉴定出(MW：1618)的结构。 

杂质6(CB-130989)和杂质7(CB-131005)在大约第14.43分钟共同洗脱。CB-130989(MW：587)看来符合以前由Lilly鉴定的LY213827，为一个由三个氨基酸--色氨酸、天冬酰胺和带有癸酸链的天门冬氨酸盐一组成的链构成的线性脂肽(图8)，CB-131005(MW：1606)相当于一个达托霉素类似物，其中癸酸缺少一个甲基(图9)。 

杂质8(CB-131010)，在大约第15.10分钟洗脱，(MW：1620)看来符合以前由Lilly鉴定的LY213846(β-异构体)(图2)。β-异构体的水平高于1％。 

杂质9，在大约第17.92分钟洗脱，尚未鉴定出(MW：874)的结构。 

杂质10和11，在大约第19.57分钟共同洗脱，尚未鉴定出结构。 

杂质12(CB-131009)，在大约第20.93分钟洗脱，推测(MW：859)为一种由六氨基酸--色氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸盐、苏氨酸、甘氨酸和有一个癸酸链的鸟氨酸--组成的链构成的线性脂肽(图10)。 

杂质13(CB-130952)，在大约第23.11分钟洗脱，推测(MW：1602)为与LY178480相同的脱水-达托霉素(图3)，脱水-达托霉素的水平高于1％。 

杂质14(CB-131078)，在大约第24.53分钟，(MW：1634)与以前由Lilly鉴定的LY109208相同，是一种在癸酸链中含有一个另外的甲基的达托霉素类似物(图11)。 

批量达托霉素可以按上述实施例2，或7-8的记载用Poros P150纯化，或按上述实施例3-5的记载用Poros D50纯化。在按实施例2用PorosP150纯化后，色谱分析(图13)显示达托霉素的纯度高于99.0％，同时β-异构体和脱水-达托霉素低于检测水平(少于总量的0.05％)。有一种未确定的杂质，其含量大于0.1％但小于0.5％。 

实施例11 

在受控制的癸酸供给发酵条件下进行玫瑰孢链霉菌(S.roseosporus)NRRL菌株15998的发酵培养以优化抗生素的生成而使污染物的生成最小。用气体色谱法测定残留癸酸原料的量，从感应开始(大约在第30小时)到结束的目标残留水平是10ppm癸酸。将此培养基离心，随后通过HPLC分析澄清的肉汤，测定达托霉素的生成。收获物的值一般是每升发酵肉汤1.0到3.0克。 

既可以用Pall-Sep进行微孔过滤法也可以使用完全商业规模的离心和深度过滤法收获发酵物。将澄清的肉汤加载到阴离子交换树脂-三菱FP-DA13上，然后用pH6.5的30mMNaCl清洗，并用pH6.0-6.5的300mMNaCl洗脱。或者，用pH6.5的60mMNaCl清洗FP-DA13柱，并用pH6.0-6.5的500mMNaCl洗脱。将pH值调节到3.0-4.8，温度调节到2-15℃。在此条件下达托霉素形成胶束。使其保留在使用任意结构的10,000NMW过滤器(AG技术公司，UF中空光纤或相当物)的超滤器上，洗涤以纯化胶束状达脱霉素的溶液。达托霉素胶束被过滤器保留，但大量杂质因为通过10,000NMW过滤器而被除去。通过达托霉素胶束的超滤，达托霉素的纯度从大约40％提高到80％或更高。 

将洗脱液加到HIC树脂上，HP-20ss，用30％乙腈清洗，并用pH4.0-5.0的35％乙腈洗脱。或者，用20-30％异丙醇清洗HIC树脂，并用pH3.5-6.5的30-40％异丙醇洗脱。在增加溶剂和更高的6.0-7.5pH值条件下，达托霉素恢复成单一的、非胶束状态。将洗脱液加到FP-DA13树脂柱上，并如前进行清洗和洗脱。最终的阴离子交换步骤将溶剂减少三分之一或更多。用0.2μm过滤器在pH1.5-2.5进行反渗和浓缩并将达托霉素制剂冻结。在灭灌装菌前用注射水(WFI)实施最终反渗过滤以清洗达托霉素并调节其浓度。将瓶装和散装的达托霉素冻干。 

实施例12 

按前述任一实施例，如实施例11的记载纯化冻干的达托霉素，将冻干的达托霉素在pH4.0-5.0的生理盐水(大约140mMNaCl)中再生。在此条件下，达托霉素以胶束形式存在，可以用于注射或静脉内、肠胃外、口服或局部给药。 

实施例13 

按实施例11记载的方法通过发酵和用微孔过滤澄清肉汤制备达托霉 素。将澄清的肉汤用于阴离子交换树脂，三菱FP-DA13，并用pH6.5的30mMNaCl清洗，然后用pH6.0-6.5的300mMNaCl洗脱以得到大约纯度为40％的达托霉素制剂。用稀释的磷酸将洗脱液的pH值调节到3.5，这样实际上所有的达托霉素形成了胶束。将此胶束制剂加载于10,000NMW超滤膜。在高达15℃的温度下，用pH3.5的30mM乙酸钠清洗此达托霉素制剂。减少的体积和清洗降低了污染物水平，使达托霉素制剂的纯度达到了85％。可以用本文记载的任何一种方法进一步纯化达托霉素制剂。 

实施例14 

按实施例11记载的方法通过发酵，用微孔过滤从肉汤中澄清，用FP-DA13树脂分离制备达托霉素。用稀释的磷酸将洗脱液的pH值调节到3.5，这样实际上所有的达托霉素形成了胶束。将此胶束制剂加载于10,000NMW超滤膜。在高达15℃的温度下，用pH3.5的30mM乙酸钠清洗此达托霉素制剂。体积减少和清洗降低了污染物水平，使达托霉素制剂的纯度达到了80-90％。可以本文处记载的任何一种方法进一步纯化达托霉素制剂。 

实施例15 

按实施例11记载的方法通过发酵和用微孔过滤从肉汤中澄清来制备达托霉素。按结合在本文中作为参考的美国专利4,874,843记载的方法，用疏水反应色谱法纯化此制剂。在此方法中，使用了HP-20和HP-20ss树脂的重复柱色谱法。达托霉素的纯度是93％，带有在HPLC下可见的杂质和可测出的热原物质。将此制品在水中稀释，并用NaOH或等同物将其调节为pH6.5。将达托霉素制剂通过10,000NMW超滤膜过滤。在此条件下，达托霉素是单体状，并通过超滤膜。所得产品的纯度保持在93％，但超滤膜除去了几种含量为0.1-0.2％的杂质。此外，热原物质的含量降到了不能检出的水平。 

实施例16 

按实施例15记载的方法制备约93％纯度的达托霉素制剂。通过用HCl或等同物降低pH至4.7而使达托霉素制剂转化成胶束状态，并将达托霉素制剂冷却到2-5℃。用10,000NMW超滤膜过滤，将产物从400升浓缩到3升，并达到约100mg/ml的最终浓度。在此条件下，膜将达托霉素截留。导致达托霉素浓度大幅度增加。纯度约为93％。 

实施例17 

按实施例16记载的方法制备达托霉素制剂。瓶中装入约250mg达托霉素并将其冻干。将达托霉素重新溶解在50mlpH为4.0-5.0的无菌150mM盐水中，给人或动物患者服用。达托霉素的给药剂量依赖于感染的性质、患者的年龄和体重及动物的物种。在pH4.0-5.0的150mM盐水中，达托霉素为胶束状，这是可溶的，并适于静脉注射、肌内注射和胃肠外注射。此制剂由于达托霉素的脂肽性质而使任何局部刺激降到最低。 

实施例18 

在pH4.0及25℃的水中用浓度为1.0mg/mL的达托霉素制备达托霉素胶束。用Zetasizer^TM(Malvem Instruments，Model3000HS)测定达托霉素胶束体积。计数速度为36.3，单元类型是毛细管样单元，检测角度是90°，波长是633(nm)。结果显示胶束直径是54 

，约为单个的单节达托霉素分子直径的2倍。见图16。 

将本说明书引用的所有公开出版物和专利申请结合于此作为参考，如同将每个独立的公开出版物或专利申请特别地和各自地结合作为参考。虽然为达到清楚理解的目的已采用说明和实施例的方式，已比较详细地描述了上述发明，对本领域普通技术人员显而易见的是，根据本发明的教导，可以作出某些变化和改进而不背离附带的权利要求的实质范围。 

Claims (6)

1.纯化脂肽的方法，包括以下步骤：

a.在发酵肉汤中用正癸酸原料发酵玫瑰孢链霉菌以产生达托霉素；

b.澄清发酵肉汤；

c.使经澄清的发酵肉汤经过阴离子交换色谱法以得到富含达托霉素的制剂，其中所述阴离子交换色谱法包括以下步骤：(1)将经澄清的发酵肉汤加载到FP-DA13树脂上，(2)用pH为6.5的30mMNaCl清洗，且用pH为6.0-6.5的300mM NaCl洗脱；

d.将所述富含达托霉素的制剂从单体的非胶束状态转化成胶束状态，此过程包括将其置于形成胶束的条件下，所述条件包括将所述富含达托霉素的制剂调节到pH为3.0-4.8且温度为2-15℃；

e.通过使用10,000NMW过滤器的超滤法从低分子量的污染物中分离达托霉素胶束；

f.将所述达托霉素胶束加载到HP-20ss疏水相互作用色谱法(HIC)树脂上；

g.所述HIC树脂用20-30%异丙醇清洗；

h.用pH为3.5-6.5的30-40%异丙醇洗脱；和

i.在增加溶剂和pH为6.0-7.5的条件下使达托霉素恢复成非胶束状态。

2.生产纯化的达托霉素的方法，所述方法包括以下步骤：

a.在受控制的癸酸供给发酵条件下进行玫瑰孢链霉菌NRRL菌株15998的发酵培养以优化达托霉素的生成而使污染物的生成最小；

b.将澄清的肉汤加载到阴离子交换树脂FP-DA13上；

c.用pH为6.5的30mM NaCl清洗；

d.用pH为6.0-6.5的300mM NaCl洗脱；

e.将pH值调节到3.0-4.8且将温度调节到2-15℃，在此条件下达托霉素形成胶束；

f.使其保留在使用10,000NMW过滤器的超滤器上，洗涤以纯化胶束状达脱霉素的溶液，达托霉素胶束被过滤器保留。

3.权利要求2的方法，还包括：

g.将达脱霉素胶束加到HIC HP-20ss树脂上；

h.用20-30%异丙醇清洗HIC树脂；

i.用pH为3.5-6.5的30-40%异丙醇洗脱；和

j.在增加溶剂和更高的6.0-7.5的pH值条件下，达托霉素恢复成单一的非胶束状态。

4.权利要求3的方法，还包括：

k.将洗脱液加载到FP-DA13树脂柱上且如权利要求2的步骤c)和d)中所定义的那样进行清洗和洗脱；

l.用0.2μm过滤器在pH1.5-2.5进行反渗和浓缩。

5.权利要求4的方法，其还包括在灭菌灌装前用注射水实施最终反渗过滤以清洗达托霉素并调节其浓度，然后将达托霉素冻干。

6.权利要求5的方法，其还包括将冷冻干燥的达托霉素在pH为4.0-5.0的生理盐水中再生。

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