CZ20011330A3 - Fúzní proteiny interferonu- beta- 1a a jejich použití - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká fúzního polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci X-Y-Z nebo alespoň její část, kterážto sekvence obsahuje aminokyselinovou sekvenci glykosylovaného interferonu-beta (X) , přičemž Y je volitelná spojovací část a Z je polypeptid obsahující alespoň část polypeptidu jiného než je glykosylovaný interferon-beta. Výhodně je X lidský interferon-beta-la. Vynález se také týká mutant interferonu-beta-la.

Dosavadní stav techniky

Použití polypeptidů a proteinů pro systémové léčení specifických nemocí je nyní běžně přijímanou lékařskou praxí. Role, jakou hrají látky tohoto typu v terapii je tak důležitá, že mnohé výzkumy jsou zaměřeny na syntézu velkého množství těchto látek technologií rekombinantní DNA. Mnohé z těchto molekul jsou endogenní molekuly, které jsou velmi účinné a specifické ve svém biologickém účinku.

Hlavním faktorem, který omezuje užitečnost látek proteinového charakteru pro jejich zamýšlené aplikace, je to, že při parenterálním podávání jsou z těla za velmi krátký čas eliminovány. K tomu dochází proto, že jsou metabolizovány proteázami, nebo se na jejich eliminaci podílí běžná clearance metabolickými cestami eliminace proteinů, jako je např. filtrace v ledvinách. Problémy spojené s uvedenými způsoby podávání proteinů jsou ve farmaceutickém průmyslu • ·· · dobře známy a byly proto užity různé strategie, jak je řešit.

Peptidová rodina, která je cílem klinického výzkumu a mnohých snah o zlepšení podávání a bioasimilace, je rodina interferonů. Interferony byly testovány při mnoha nemocech.

Použití humánního interferonů beta, jednoho členu této rodiny, je již zavedeno při léčení roztroušené sklerózy mozkomíšní (selerosis multiplex) .

Dvě formy rekombinantního interferonů beta byly povoleny v Evropě a v USA pro léčení této nemoci. Jedna forma je interferon beta la (ochranná známka AVONEX®, výrobce Biogen, lne., Cambridge, MA). Termíny interferon-beta-la nebo IFN-beta-la nebo IFN-p-la nebo interferon-P-la jsou v popisu vynálezu užívány zcela zaměnitelně. Jinou formou je interferon-beta-lb (ochranná známka BETASERON®, Berlex, Richmond, CA) , dále označovaný jako interferon-beta-lb. Interferon beta-la je produkován v savčích buňkách pomocí přirozené sekvence lidského genu a je glykosylován, zatímco interferon beta-lb je produkován v buňkách E. coli pomocí modifikované sekvence lidského genu, který obsahuje substituci, kde cystein je nahrazen serinem v pozici 17, a není glykosylován.

Již dříve byla přímým způsobem srovnána relativní aktivita in vitro interferonů beta-la a interferonů beta-lb ve funkčním testu a bylo ukázáno, že specifická aktivita interferonů beta-la je přibližně lOx vyšší než specifická aktivita interferonů beta-lb (Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649). Ve studiích, jejichž cílem bylo zjistit strukturní příčiny rozdílných aktivit, byla identifikována glykosylace jako jediný známý strukturní rozdíl mezi uvedeným dvěma produkty, který ovlivňuje specifickou aktivitu. Vliv sacharidů se projevoval zejména účinkem na stabilizaci struktury. Stabilizující účinek sacharidů na strukturu byl evidentní při experimentech s tepelnou denaturací a v analýze

SEC. Nepřítomnost glykosylace také korelovala se zvýšenou agregací a zvýšenou citlivostí k tepelné denaturaci. Enzymatické odstranění sacharidů z interferonu beta-la pomocí PNGázy F vedlo k extenzivní precipitaci deglykosylovaného produktu.

Tyto studie ukazují, že i přes konzervativní aminokyselinovou sekvenci interferonu beta-la a interferonu beta-lb se jedná o odlišné biochemické jednotky a většiny znalostí o interferonu beta-lb nemůže být aplikována na interferon beta-la a naopak.

Podstata vynálezu

Vynález využívá výhod glykosylovaného interferonu-beta ve srovnání s neglykosylovanou formou. Zejména byl vyvinut přípravek obsahující interferon-beta-la se zvýšenou aktivitou vzhledem k interferonu beta-lb, který má také prospěšné vlastnosti fúzního proteinu obecně, aniž by došlo ke ztrátě aktivity ve srovnání s formami interferonu beta-la, které nejsou ve formě fúzního proteinu. Tudíž byly provedeny takové modifikace, že produkty (tj. fúzní proteiny interferonu beta-la) si uchovávají celou nebo většinu své biologické aktivity, a přitom bylo dosaženo následujících vlastností: změněná farmakokinetika a farmakodynamika vedoucí k delšímu biologickému poločasu a změnám tkáňové distribuce (např. schopnost zůstat delší dobu v cévách). Takový přípravek představuje podstatný pokrok v oboru medicíny a farmacie a byl by významným příspěvkem pro léčení nemocí, kde interferon prokázal svou užitečnost jako je např. sclerosis multiplex, fibróza a další zánětlivá a autoimunitní onemocnění, různé druhy rakovin, hepatitida a další virové nemoci a nemoci charakterizované neovaskularizaci. Zejména schopnost zůstávat po delší dobu v cévním systému umožňuje, aby byl interferonbeta la použit k inhibici angiogeneze a potenciálně také k přestoupení hematoencefalické bariéry.

Předkládaný vynález se zejména týká izolovaného polypeptidů, který má aminokyselinovou sekvenci X-Y-Z, kde X je polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, nebo alespoň její část, odpovídající aminokyselinové interferonu-beta, Y je volitelná spojovací část a Z je polypeptid obsahující alespoň část polypeptidů jiného než je interferon-beta. Volitelná část (skupina) Y a nutná část Z jsou navázány buďto na N-nebo C-konec interferonu-beta (X) . Výhodně je X lidský interferon-beta-la.

Ve výhodných provedeních Z je alespoň část konstantního úseku imunoglobulinu a může pocházet z imunoglobulinu vybraného ze třídy IgM, IgG, IgD, IgA a IgE. Pokud je imunoglobulin ze třídy IgG, pak jde o jeden z IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4. Konstantní úsek lidského IgM a IgE obsahuje 4 konstantní úseky, a sice CHI (kloub), CH2, CH3 a CH4, zatímco konstantní úsek lidského IgG, IgA a IgD obsahuje jen 3 konstantní úseky, a sice CHI (kloub), CH2 a CH3. V nejvýhodnějším fúzním proteinu podle vynálezu obsahuje konstantní úsek alespoň úsek kloubu a domény CH2 a CH3.

V jiném provedení je část Z alespoň část polypeptidů, který obsahuje domény podobné imunoglobulinu. K příkladům takových polypeptidů patří CD1, CD2, CD4 a členy hlavních histokompatibilních antigenů I. a II. třídy.

Dalším provedením vynálezu je fúzní protein mající amino-koncový úsek, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci interferonu-beta nebo její část, a karboxy-koncový úsek, který obsahuje alespoň část proteinu jiného než je interferon-beta. Karboxy-koncový úsek je výhodně alespoň část

konstantního úseku imunoglobulinu pocházejícího ze třídy imunoglobulinů IgM, IgG, IgD, IgA nebo IgE. V nejvýhodnějším fúzním proteinu konstantní úsek obsahuje alespoň kloubový úsek a domény CH2 a CH3.

Dalším provedením vynálezu je fúzní protein, jehož interferon-beta část (tj. X ve vzorci uvedeném výše) byla mutována, čímž vznikly muteiny se selektivně zvýšenou antivirovou a/nebo antiproliferační aktivitou nebo s jinými výhodnými vlastnostmi ve srovnání s nemutovanými formami interferonu-beta-la.

Ještě dalším provedením předkládaného vynálezu je izolovaná DNA kódující fúzní protein popsaný výše. Vynález se týká také rekombinantní DNA, která obsahuje izolovanou DNA kódující výše popsaný fúzní protein a expresní kontrolní sekvenci (tj . sekvenci řídící expresi), kde expresní kontrolní sekvence je operativně spojena s DNA. Vynález zahrnuje také hostitelské buňky transformované rekombinantní DNA podle vynálezu.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu přípravy rekombinantního polypeptidů, který spočívá v tom, že se poskytne populace hostitelských buněk podle vynálezu, tato populace hostitelských buněk se kultivuje v podmínkách, kde je exprimován polypeptid kódovaný rekombinantní DNA, a nakonec se tento rekombinantní polypeptid izoluje.

Další aspekt vynálezu se týká fúzního proteinu interferonu-beta-la, který obsahuje interferon-beta-la a další polypeptid, se kterým není v přírodě asociován, v podstatě čisté formě, přičemž fúzní protein (zkráceně fúze) má antivirovou aktivitu, která je přibližně s antivirovou aktivitou interferonu-beta-la postrádajícího další polypeptid.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je farmaceutický • · · · • · · ·

přípravek obsahující terapeuticky účinné množství fúzního proteinu interferonu-beta-la.

Ještě další aspekt vynálezu se týká inhibice angiogeneze a neovaskularizace užitím polypeptidu podle vynálezu.

Popis obrázků

Obr. 1. cDNA sekvence a dedukovaná aminokyselinová sekvence fúze interferonu-beta s histidinovou značkou (také označ. Jako his IFN-beta nebo His₆-značený)

Na obrázku jsou uvedeny úplná DNA sekvence a proteinová sekvence histidinem značeného IFN-beta-la. Štěpená signální sekvence VCAM-1 zanechá 3 zbytky amino-konce (SerGlyGly) upstream od histidinové značky (His₆, pozice 4 až 9) . Sekvence enterokinázové spojky (linkeru) (AspAspAspAspLys) je od histidinové značky oddělena oddělovací sekvencí (spacerem) (SerSerGly, pozice 10 až 12). Přírodní sekvence proteinu IFN-beta-la představuje sekvence Metl8 až Asnl83.

Obr. 2. cDNA sekvence a dedukovaná aminokyselinová sekvence fúze interferonu-beta-la/Fc

Na obrázku jsou uvedeny úplná DNA sekvence a proteinová sekvence fúze lidský IFN-beta-la/myší Fc. Sekvence lidského IFN-beta-la proteinu představuje zbytky 1 až 166 (pozice DNA sekvence 1 až 498) . Sekvence enterokinázové spojky (linkeru) (AspAspAspAspLys) zaujímá aminokyselinové zbytky 167 až 171 (pozice DNA sekvence 499 až 513) . Sekvence těžkého řetězce myšího IgG2a zaujímá aminokyselinové zbytky 172 až 399 (pozice DNA sekvence 514 až 437).

Obr. 3. Vazba mutanty interferonu-beta se substituovaným alaninem na dimerní fúzní protein obsahující extracelulární doménu receptoru interferonu typu I, IFNAR2/Fc

Vazebné afinity alaninem substituované mutanty IFN (Al až E) pro receptor IFNAR2 byly stanoveny postupem jak je popsáno v příkladu 1 (část D) . Histogram představuje vazebné afinity v testu ve srovnání s vazebnými afinitami divokého typu his-IFN-beta (v % d.t., divokého typu). Hodnoty % d.t. byly vypočteny následovně: (afinita divokého typu his-IFNbeta/afinita mutovaného IFN-beta) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro jednotlivé experimenty (n=3) a průměrné hodnoty % d.t. (x) pro experimentální soubor. Mutanty A2, AB1, AB2 a E neváží IFNAR2/FC v koncentraci 500 x vyšší než je EC50 divokého typu (d.t.) his-IFN-beta (*).

Obr. 4. Vazba mutanty interferonu-beta-1 se substituovaným alaninem na povrchový komplex receptoru interferonu typu I (komplex IFNAR1/2) exprimovány na buňkách Daudi z Burkittova lymfomu

Receptorově vazebné vlastnosti mutanty se substituovaným alaninem (Al-E) byly stanoveny pomocí vazebného testu pro povrchový buněčný receptor založeného na analýze FACS, jak byl popsán v příkladu 1 (část D) . Histogram představuje vazebné afinity v testu ve srovnání s vazebnými afinitami divokého typu his-IFN-beta (v % d.t., divokého typu). Hodnoty % d.t. pro každou mutantu byly vypočteny následovně:(afinita divokého typu his-IFN-beta/ afinita mutovaného IFN-beta) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro jednotlivé experimenty a průměrné hodnoty % d.t. (x) pro experimentální soubor.

• ·

Obr. 5. Antivirová aktivita mutant interferonu-beta se substituovaným alaninem

Antivirová aktivit mutant se substituovaným alaninem (Al-E) byla stanovena na lidských buňkách A549 infikovaných EMC virem jak bylo popsáno v příkladu 1 (část E) . Histogram představuje aktivitu v testu ve srovnání s aktivitou divokého typu his-IFN-beta (v % d.t., divokého typu). Hodnoty % d.t. pro každou mutantu byly vypočteny následovně:(koncentrace divokého typu his-IFN-beta(50%cpe)/koncentrace mutovaného IFN-beta (50%cpe) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro vícenásobné pokusy a průměrné hodnoty z pokusného souboru (x) .

Obr. 6. Antiproliferační aktivita mutant interferonu-beta se substituovaným alaninem

Antiproliferační aktivita mutant se substituovaným alaninem (Al-E) byla stanovena na Daudi buňkách Burkittova lymfomu jak bylo popsáno v příkladu 1 (část E) . Histogram představuje aktivity v testu ve srovnání s aktivitou divokého typu his-IFN-beta (v % d.t., divokého typu). Hodnoty % d.t. pro každou mutantu byly vypočteny následovně:(koncentrace divokého typu his-IFN-beta (50% inhibice růstu)/koncentrace mutovaného IFN-beta(50% inhibice růstu) x 100. Jsou uvedeny hodnoty % d.t. (O) pro vícečetné experimenty a průměrné hodnoty % d.t. (x) pro experimentální soubor.

Obr. 7. Relativní antivirové a antiproliferační aktivity mutant interferonu-beta se substituovaným alaninem

Relativní aktivity mutant se substituovaným alaninem (Al-E) v testu antivirové (osa x) a antiproliferační (osa y) aktivit byly srovnány. Pro toto srovnání byly užity hodnoty průměrného % divokého typu his-IFN-beta (% d.t., x) uvedené ♦ · · ·

na obr. 5 a 6. Mutanty, které vykazují koordinované změny v obou aktivitách se objeví přímo na vertikální linii nebo v její blízkosti. Mutanty vykazující ztrátu/přírůstek antivirové aktivity, která není úměrná změně v antiproliferační aktivitě, se objeví výrazně mimo diagonálu (DE1, D, Cl) . Významnost byla stanovena na základě směrodatných odchylek příslušných použité průměrné hodnotě % d. t.

Obr. 8. Antivirová aktivita fúze interferon-beta-la/lg

Aktivita interferonu-beta-la (byl použit AVONEX®) nebo fúze interferon-beta-la/myší Ig2a v koncentracích uvedených na ose x byly hodnoceny v antivirovém testu užitím buněk lidského plicního karcinomu (A549) infikovaných virem EMC. Po dvoudenní inkubaci za přítomnosti viru byly živé buňky obarveny MTT a misky byly vyhodnoceny na čtecím zařízení při 450 nm, a absorbance, která je odrazem životnosti buněk, je uvedena na ose y. Směrodatné odchylky jsou uvedeny jako svislé úsečky. Koncentrace interferonu-beta-la (byl použit jako surový meziprodukt AVONEX®), která poskytla 50 % maxima při 450 nm a tudíž při které došlo k 50% usmrcení buněk virem („50% cytopatický účinek) byla 0,4 pM a 50% cytopatický účinek pro fúzovaný interferon-beta-la byl přibližně 0,15 pM.

Obr. 9. Měření antivirové aktivity interferonu-beta v plazmě myší ošetřených fúzí interferonu-beta-la/Fc nebo interferonem-beta-la

Myším bylo injikováno buďto 50000 jednotek interferonubeta-la (surový meziprodukt AVONEX®) nebo 50000 jednotek fúze interferonu-beta-la/Fc. Krev z těchto zvířat byla získána retroorbitálním odběrem v různých časech po injekci, jak ukazuje osa x. Pro každý časový bod byla odebrána krev alespoň ze třech myší, byla připravena plazma a zamražena až do stanovení aktivity interferonu-beta v antivirovém testu s buňkami lidského plicního karcinomu (A549) po infekci virem encefalomyokarditidy. Živé buňky byly obarveny roztokem MTT, destičky byly pak změřeny ve 450 nm ke stanovení absorbance, která je odrazem životnosti buněk a aktivity interferonubeta. Na každé destičce byly také připraveny standardní (kalibrační) křivky užitím interferonu-beta-la jako AVONEX® a byly použity ke kvantitativnímu stanovení aktivity interferonu-beta v každém vzorku. Na grafu jsou ukázána data z jednotlivých zvířat.

Obr. 10. Úplná DNA sekvence a proteinová sekvence otevřených čtecích rámců přímé fúze lidského IFN-beta a lidského IgGIFc (ZL5107) .

Obr. 11. Úplná DNA sekvence a proteinová sekvence otevřeného čtecího rámce fúzního proteinu „lidský IFN-beta/G4S linker/lidský IgGIFc (ZL6206).

Všechna odborná literatura citovaná v popisu je formou odkazu zahrnuta do popisu, pokud není uvedeno jinak. V popisu vynálezu jsou užívány následující termíny:

I. Definice

Interferon (zkráceně označovaná také jako IFN) je malý, druhově specifický, jednořetězcový polypeptid, který se tvoří v buňkách savců jako reakce na expozici různých induktorům jako jsou např. viry, polypeptidy, mitogeny apod.

Nejvýhodnější interferon podle vynálezu je glykosylovaný ····

lidský interferon-beta, který je glykosylován na 80. zbytku (Asn80) a výhodně je připraven technikami rekombinantní DNA. Výhodný glykosylovaný interferon je označován interferonbeta-la (nebo také IFN-beta-la, IFN-p-la, interferon beta la nebo interferon-P-la, přičemž všechny uvedené názvy jsou užívány zaměnitelně). Termín interferon-beta-la podle vynálezu zahrnuje i mutované formy interferonu (viz příklad 1) za předpokladu, že i tyto mutanty jsou glykosylované na 80. zbytku (Asn80). Metody přípravy proteinů technikami rekombinantní DNA jsou známy, včetně přípravy různých interferonů, viz např. patenty U.S. č. 4 399 216, 5 149 636 a 5 179 017 (Axel et al.) a 4 470 461 (Kaufman).

Výhodné interferon-beta-la polynukleotidy, které lze užít podle předkládaného vynálezu, byly odvozeny ze sekvencí interferonu divokého typu různých obratlovců, výhodně savců, a byly získány metodami, které jsou odborníkovi známé a byly popsány, viz např. patent U.S. 5 641 656 (udělený 24.6.1997, DNA kódující ptačí interferonový pro-protein typu I a zralý ptačí interferon typu I), patent U.S. 5 605 688 (25. února 1997 - rekombinantní psí a koňské interferony typu I), patent U.S. 5 231 176 (27. července 1993, DNA molekula kódující lidský leukocytární interferon), patent U.S. 5 071 761 (10. 12. 1991, DNA sekvence kódující subsekvence lidských lymfoblastoidních interferonů LyIFN-alfa-2 a LyIFN-alfa-3), patent U.S. 4 970 161 (13. listopadu 1990, DNA sekvence kódující lidský interferon gama), patent U.S. 4 738 931 (19. dubna 1988, DNA sekvence obsahující gen lidského interferonu beta), patent U.S. 4 695 543 (22. září 1987, lidský gen alfainterferonu Gx-1) a U.S. 4 456 748 (26. června 1984, DNA sekvence kóduj ící subsekvence různých přirozeně se vyskytujících leukocytových interferonů).

Ve vynálezu se mohou užít také mutanty interferonu···· beta-la. Mutace se připravují v oboru známými metodami cílené mutageneze. Kromě toho vynález poskytuje funkčně ekvivalentní polynukleotidy interferonu-beta-la, které kódují funkčně ekvivalentní polypeptidy interferonu-beta-la.

První polynukleotid interferonu-beta-la je funkčně ekvivalentní ve srovnání s druhým polynukleotidem interferonu-beta-la, pokud splňuje alespoň j ednu z následujících podmínek:

a) funkčně ekvivalentní je první polynukleotid, který hybridizuje s druhým polynukleotidem za standardních hybridizačnich podmínek a/nebo je degenerovanou sekvenci vzhledem k sekvenci druhého polynukleotidu, nejvýhodněji kóduje mutantu interferonu mající (terapeutickou) aktivitu interferonu-beta-la,

b) funkčně ekvivalentní je první polynukleotid, který kóduje expresi aminokyselinové sekvence kódované druhým polynukleotidem.

Lze shrnout, že obecný termín interferon zahrnuje, avšak není omezen pouze na ně, všechna agens uvedená v předchozím textu, a také jejich funkční ekvivalenty. Termín funkční ekvivalent v popisu vynálezu se týká proteinu interferonu-beta-la nebo polynukleotidu kódujícího interferon-beta-la, který má stejný nebo lepší prospěšný účinek na savčího příjemce jako původní interferon, k němuž se funkční ekvivalent vztahuje. Odborníkovi je zřejmé, že funkčně ekvivalentní protein může být připraven rekombinantni technikou, tj. expresí funkčně ekvivalentní DNA. Tudíž předmětem předkládaného vynálezu jsou také interferony kódované přirozeně se vyskytující DNA, a také kódované DNA, která se přirozeně nevyskytuje, ale kóduje stejný protein jako je kódován přirozeně se vyskytující DNA. Díky degeneraci nukleotidových kódujících sekvencí se mohou užít jiné polynukleotidy pro kódování interferonů. K nim patří celé nebo části výše uvedených sekvencí, které byly změněny substitucí různých kodonů, které kódují stejný aminokyselinový zbytek v sekvenci, jde tedy o umlčenou záměnu. Takové změněné sekvence se považují za ekvivalenty těchto sekvencí. Tak např. Phe (F) je kódován dvěma kodony, a sice TTC nebo TTT, Tyr (Y) je kódován TAC nebo TAT a His (H) je kódován CAC nebo CAT. Na druhé straně Trp (W) je kódován jediným kodonem TGG. Tudíž je jasné, že pro danou sekvenci DNA kódující konkrétní interferon existuje mnoho degenerovaných DNA sekvencí, které ho kódují. Tyto degenerované sekvence jsou také předmětem předkládaného vynálezu.

Fúze (také fúzní polypeptid nebo fúzní protein) označuje kolineární spojení dvou nebo více proteinů nebo jejich fragmentů prostřednictvím peptidové kostry, a to výhodně tak, že se exprimuje polynukleotidové molekula kódující tyto proteiny. K výhodným fúzním proteinům patří interferon-beta-la nebo jeho fragment kovalentně spojený s druhou částí, která je odlišná od interferonů. Specificky fúzní protein nebo fúze interferon-beta/Ig je protein obsahující molekulu interferonu-beta podle předkládaného vynálezu (tj. interferonu-beta-la) , N-konec nebo C-konec je řetězce, přičemž část navázán nebo její fragment, jejíž na N-konec imunoglobulinového imunoglobulinu je interferon-beta/Ig protein interferon-beta/Fc, molekulu interferonu-beta

N-konce

Druhem nahrazen fúzního což j e podle spoj enou proteinu je fúzní protein obsahující předkládaného vynálezu (tj . interferon-beta-la) s alespoň částí konstantní domény imunoglobulinu. Výhodná Fc fúze obsahuje obsahující molekulu interferonu-beta podle vynálezu spojenou s fragmentem protilátky obsahujícím C ·

koncovou doménu těžkého imunoglobulinového řetězce.

Termín fúzní protein znamená také protein interferonubeta chemicky vázaný prostřednictvím mono- nebo heterofunkční molekuly ke druhé části, která je odlišná od proteinu interferonu-beta, a je připraven de novo z purifikovaného protein, jak bude dále popsáno.

Termín rekombinantní znamená v popisu vynálezu protein pocházející z rekombinantních savčích expresních systémů. Protein exprimovaný ve většině bakteriálních kultur, jako je např. E. coli, bude bez glykanů, a proto takový expresní systém není výhodný. Protein exprimovaný v kvasinkách může obsahovat oligosacharidové struktury, které jsou odlišné od struktur exprimovaných v savčích buňkách.

Termín biologicky aktivní užívaný v předkládaném popisu jako charakteristika interferonu-beta-la znamená, že příslušná molekula sdílí s provedeními vynálezu zde popsanými homologii v sekvenci aminokyselin dostatečnou k tomu, že vykazuje antivirovou aktivitu při měření in vitro antivirovým testem stejného typu, jaký jev příkladu 1 (viz popis dále).

Termín léčivý přípravek nebo farmaceutický přípravek v popisu vynálezu označuje přípravky obsahující proteiny podle vynálezu a další fyziologicky kompatibilní přísady. Léčivý/farmaceutický přípravek dále obsahuje excipienty jako je např. voda, minerály a nosiče jako např. proteiny.

Termín účinné množství činidla nebo přípravku označuje takové množství, které poskytuje požadovaný výsledek nebo projevuje vliv na určité onemocnění, které je léčeno.

Aminokyselina je monomerní jednotka peptidů, polypeptidu nebo proteinu. Existuje dvacet aminokyselin, které se nacházejí v přirozeně se vyskytujících peptidech, polypeptidech nebo proteinech, a všechny jsou L-isomery.

Vynález zahrnuje také analogy aminokyselin a D-isomery • ♦ · ♦ ·· ···« • · ·

aminokyselin tvořících proteiny a jejich analogy.

Derivátizovaná aminokyselina je přírodní aminokyselina nebo aminokyselina nevyskytující se v přírodě, kde normálně se vyskytující postranní řetězce nebo koncové skupiny (nebo cukerná část v případě interferonu-beta-la) jsou modifikovány chemickou reakcí. K takovým modifikacím patří např. gamakarboxylace, beta-karboxylace, PEGylace, sulfatace, sulfonace, fosforylace, amidizace, esterifikace, N-acetylace, karbobenzylace, tosylace a další modifikace, které jsou odborníkům známy. Takže derivátizovaný polypeptid je polypeptid obsahující jednu nebo více derivátizovaných aminokyselin a/nebo jeden nebo více derivátizovaných cukrů, pokud jde o glykosylovaný polypeptid.

Protein je polymer složený v podstatě z kterýchkoliv z dvaceti proteinových aminokyselin. I když termín polypeptid se často užívá k označení relativně velkých polypeptidů a termín peptid se často užívá k označení relativně malých polypeptidu, použití těchto termínů v oboru se často překrývá a je proměnné. V tomto textu se užívá termín protein k označení peptidů, proteinů i polypeptidů, pokud není výslovně uvedeno jinak.

Funkční ekvivalent aminokyselinového zbytku je aminokyselina, která má podobné fyzikálně-chemické vlastnosti, jako aminokyselinový zbytek, který byl nahrazen funkčním ekvivalentem.

Termín mutanta (případně mutace) označuje jakoukoliv změnu v genetickém materiálu organismu, konkrétně je to jakákoliv změna (tj. delece, substituce, adice nebo alterace) v polynukleotidové sekvenci divokého typu nebo jakákoliv změna v proteinu divokého typu. Termín mutein se užívá zaměnitelně s termínem mutanta.

Termín divoký typ označuje přirozeně se vyskytující ♦ · · · · · polynukleotidovou sekvenci exonu proteinu nebo její část, nebo aminokyselinovou sekvenci proteinu nebo její část, tak jak se normálně vyskytuje in vivo.

Standardní hybridizačni podmínky jsou podmínky definované koncentrací solí a teplotou v podstatě shodné s podmínkami 0,5 x SSC až 5 x SSC a 65 °C, a to jak pro vlastní hybridizaci tak i promývání. Termín standardní hybridizační podmínky zde užívaný je proto operační definice zahrnující celou řadu různých hybridizačnich podmínek. Podmínky s vysokou stringencí (přísností) znamenají např. hybridizaci v pufru pro screening plaků (0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll 400, 0,2% hovězí sérový albumin (BSA), 50mM Tris-HCl (pH 7,5), 1M NaCl, 0,1% hydrogenfosforečnan sodný, 1% SDS) s 10% dextransulfátem a 100 pg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 65 °C po 12 až 2 0 hodin a promývání v 75mM NaCl/7,5mM citrát sodný (0,5 x SSC)/1% SDS při 65 °C. Podmínky s nízkou stringencí jsou např. hybridizace v pufru pro screening plaků s 10% dextransulfátem a 110 μg/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 55 °C po 12 až 20 hodin a promývání v 300mM NaCl/30mM citrát sodný (2,0 x SSC)/1% SDS při 55 °C (viz Current Protocols in Molecular Biology, John Willey and Sons, lne., New York, 6.3.1. 6.3.6., 1989).

Expresní kontrolní sekvence je polynukleotidová sekvence, která řídí a reguluje expresi genů, když je s těmito geny operativně spojena.

Operativně spojena znamená v případě polynukleotidové sekvence (DNA, RNA), že je operativně spojena s expresní kontrolní sekvencí, když expresní kontrolní sekvence řídí a reguluje transkripci a translaci této polynukleotidové sekvence. Termín operativně spojena znamená, že před f «444 • 4 · t · · sekvencí, která má • ··*· »4 4 • *

4 4

444 být exprimována, že sekvence je dovoluje expresi expresní kontrolní polypeptidu je ve polynukleotidovou vhodný startovací správném čtecím polynukleotidové sekvence pod kontrolou sekvence, a tudíž produkci požadovaného kódovaného izolovanou polynukleotidovou sekvencí.

Expresní vektor je polynukleotid, většinou DNA plazmid nebo fág (jako nejběžnější příklady z dalších), který dovoluje expresi alespoň jednoho genu, když je vektor vnesen do hostitelské buňky. Vektor může hostitelské buňce.

ale nemusí být schopen replikace v

Termín zaměnitelně izolovaný (užívaný s termínem v podstatě kyselin, tj . polynukleotidových znamená RNA v předkládané čistý), pokud se sekvencí, přihlášce týká které část nebo DNA polynukleotid, nebo syntetický svého původu nebo zacházení polynukleotidy se kterými je je přítomen v hostitelské buňce jako s nukleovou cDNA nukleových kódují polypeptidy, genomového polynukleotidu, polynukleotid, který v důsledku s ním: I) není spojen se všemi spojen v přírodě (např.

expresní vektor nebo jeho část), II) je spojen kyselinou nebo jinou chemickou skupinou, které se těch, se kterými se v přírodě.

polynukleotidová in ví tro např.

II) syntetizovaná chemicky, klonováním nebo IV) purifikované, např.

je spojen v přírodě, nebo III)

Jako izolovaná odlišují od nevyskytuj e se dále označuje sekvence, která je : I) amplifikovaná metodou polymerázové řetězové reakce (PCR), III) rekombinantně připravená gelovou štěpením a separaci.

Takže v podstatě čistá nukleová kyselina je kyselina která není bezprostředně souvisle spojena nebo oběma sekvencemi, se kterými je normálně spojena v přírodně se vyskytujícím genomu organismu, ze nukleová s j ednou souvisle • · · · • · * · · ·

	• •	• • • • • ·	• · · · • · · · • · · · · · • · · · ·· · ·
			18
kterého je	izolována.	v	podstatě čistá	DNA	je také
rekombinantní	DNA, která	je	částí hybridního	genu	kódujícího

další sekvence.

Termín izolovaný (užívaný v předkládané přihlášce zaměnitelně s termínem v podstatě čistý), pokud jde o polypeptidy, znamená polypeptid nebo jeho část, který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním: I) je přítomen v hostitelské buňce jako expresní produkt úseku expresního vektoru, nebo II) je spojen s jinými proteiny nebo chemickými skupinami, než se kterými je spojen v přírodě, nebo III) nevyskytuje se v přírodě. Jako izolovaný se dále označuje polypeptid, který I) byl chemicky syntetizován, II) byl exprimován v hostitelské buňce a purifikován od asociovaných proteinů. Výhodně je izolovaný polypeptid purifikován také od dalších látek, jako jsou např. protilátky nebo gelová matrix (polyakrylamid), které se užívají k purifikaci.

Heterologní promotor je promotor, který v přírodě není spojen s genem nebo purifikovanou nukleovou kyselinou.

	Termín homologní	je	zde	užíván jako synonymum
pro	identický	a týká	se	sekvenční podobnosti	dvou
polypeptidů nebo	molekul	nebo	dvou	nukleových kyselin.	Když
je	jedna určitá	pozice	ve	dvou	srovnávaných sekvencích

obsazena stejnou baží nebo aminokyselinou (např. pozice ve dvou molekulách DNA je obsazena adeninem nebo pozice ve dvou polypeptidech je obsazena lysinem) , pak dvě srovnávané molekuly jsou v této pozici homologní. Procento homologie mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu shodných nebo homologních pozic sdílených dvěma sekvencemi dělený celkovým počtem pozic a vynásobený 100. Tak např. jestliže 6 z 10 pozic je shodných nebo-li homologních, pak tyto sekvence jsou z 60 % homologní. Nebo např. DNA sekvence CTGACT a CAGGTT sdílejí 50% homologii (3 pozice ze 6 jsou shodné). Obecně se • · · ·

9··· srovnání provádí, když jsou sekvence vzájemně přiřazeny tak, aby bylo dosaženo maximální homologie. Takové přiřazení a srovnání lze provést metodou, kterou publikoval Needleman et al. (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970), a která je standardně implementována v příslušných počítačových programech jako je např. program Align (DNAstar, lne.). Homologní sekvence sdílejí shodné nebo podobné zbytky aminokyselin, kde podobné aminokyselinové zbytky jsou konzervativní substituce nebo tzv. povolené bodové mutace odpovídajících aminokyselinových zbytků vzhledem k odpovídající přiřazené referenční sekvenci. V tomto smyslu konzervativní substituce aminokyselinového zbytku v referenční sekvenci znamená substituci aminokyselinou, která je fyzikálně nebo funkčně podobná odpovídajícímu zbytku v referenční sekvenci, tedy např. má podobnou velikost, tvar, elektrický náboj, chemické vlastnosti včetně schopnosti vytvářet kovalentní nebo vodíkové vazby apod. Zvláště výhodné jsou kovalentní substituce, které splňují kritéria definovaná jako přijatelné bodové mutace v publikaci Dayhoff et al. , Atlas of Protein Sequence and Structure 5, Suppl. 3, Chapter 22: 352-354, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington D.C., 1978.

Termíny polynukleotidová sekvence a nukleotidová sekvence jsou užívány v popisu zaměnitelně.

Termíny angiogeneze a neovaskularizace jsou užívány v nej širším významu a znamenají vytváření nových krevních cév. Zejména angiogeneze se týká také vytváření nových krevních cév v místě nádoru.

Termíny IFNAR2, IFNAR1 a IFNAR1/2 označují proteiny, které tvoří interferonový receptor typu I na povrchu buněk. Extracelulární část (ektodoména) receptoru

IFNAR2 sama může vázat interferon beta nebo alfa.

Při provádění předkládaného vynálezu byly použity • · · · • · • ♦ • · • · buněčných • · • · • · kultur, rekombinantní DNA standardní metody buněčné biologie, molekulární biologie, mikrobiologie, proteinové chemie a imunologie, které jsou odborníkům známy. Tyto metody byly publikovány v odborné literatuře. Viz např. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition.

(Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I and II (D.N. Glover, ed.), 1985; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; U.S. Patent No. 4,683,195 (Mullis et al. ,);

Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed) . Alan R. Liss, lne., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al. , eds), Academie Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos,eds.),1987, Cold Spring Harbor Laboratory;

Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academie Press. London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouše Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986.

II. Produkce a exprese fúzních proteinů

Předkládaný vynález se týká systému pro vytváření fúzních proteinů interferonu-beta-la. Vynález se zejména týká těchto proteinů a také molekul rekombinantní DNA používaných pro jejich produkci.

Polypeptidy podle vynálezu lze produkovat různými metodami, které jsou odborníkům známy. Tak např. interferon21 beta-la úplné délky nebo zkrácený interferon-beta-la mohou být připraveny známými metodami rekombinantní DNA užitím cDNA (viz dále).

Gen kódující požadovaný polypeptid interferonu-beta-la může být konstruován na základě aminokyselinové sekvence požadovaného polypeptidu. Pro syntézu genu se pak užijí standardní metody. Tak např. aminokyselinové sekvence se užije pro konstrukci zpětně přeloženého genu. Oligomer DNA obsahující nukleotidovou sekvenci kódující interferon-beta-la může být syntetizován v jediném kroku. Alternativně může být připraveno několik menších oligonukleotidu kódujících části požadovaného interferonu-beta-la a ty se pak ligací spojí dohromady. Výhodně se DNA sekvence kódující interferon-betala připraví jako několik samostatných oligonukleotidů, které se následně navzájem pospojují (viz příklad 2). Jednotlivé nukleotidy typicky obsahují 5'- nebo 3'-přesahy (přesahující úseky), které umožňují spojení na základě komplementarity.

Po sestavení výhodné geny budou charakteristické tím, že budou rozpoznávány restrikčními endonukleázami (včetně jedinečných restrikčních míst pro přímé vkládání do klonovacího nebo expresního vektoru) , preferovaným využitím kodonů vzhledem k hostitelskému expresnímu organismu, který se bude užívat (výhodně savčí buňky) , a tím, že po transkripci produkují stabilní a účinně translatovanou RNA. Správné sestavení lze ověřit sekvencováním, restrikčním mapováním a nebo expresí biologicky aktivního polypeptidu ve vhodném hostiteli.

Savčí cDNA pro interferon-beta může být izolována pomocí vhodné DNA sekvence lidského interferonu-beta-la jakožto sondy pro screening konkrétní savčí cDNA knihovny mezidruhovou hybridizací. V předkládaném vynálezu byl užit interferon-beta ze savců jako jsou např. primáti, člověk, • · · · • · · · • · interferon-beta sice užitím myš, pes, kočka, kráva, kůň a prase. Savčí lze získat mezidruhovou hybridizací, a jednořetězcové cDNA pocházející DNA lidského interferonu-beta jakožto hybridizační sondy k izolaci cDNA pro interferon-beta ze savčích cDNA knihoven. K metodám, které mohou být použity pro izolaci a klonování sekvencí interferonového genu, patří metody popsané ve výše citovaných patentech USA. Relevantní je zejména patent U.S. 4,738,931 (19. Duben 1988), popisující DNA obsahující gen lidského interferonu-beta.

Předkládaný vynález se také týká molekul rekombinantní DNA, které obsahují výše uvedené sekvence DNA.

Molekuly rekombinantní DNA podle vynálezu jsou schopné řídit expresi polypeptidu podle vynálezu v hostiteli, který je jimi transformován. Aby bylo dosaženo exprese, musí sekvence DNA kódující fúzní polypeptid podle vynálezu být operativně spojena s expresní kontrolní sekvencí. Aby bylo dosaženo odpovídající transkripce rekombinantního konstruktu podle vynálezu, do rekombinantního vektoru se výhodně vloží vhodná sekvence promotor/enhanceru, za předpokladu, že sekvence promotor/enhancer je schopna řídit transkripci sekvence nukleové kyseliny kódující glykosylovaný interferonbeta. K promotorům, které se mohou užít k řízení exprese fúzních proteinů založených na imunoglobulinu patří, aniž by tento výčet byl omezující, časný promotor SV40 (Benoist a Chambon, 1981, Nátuře 290:304-310), promotor obsažený v 3'koncové dlouhé terminální repetici (LTR) viru Rousova sarkomu (Yamamoto, et al. , 1980, Cell 22:787-797), thymidinkinázový promotor z herpes viru (Wagner et al. , 1981, Proč.

Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), regulační sekvence metallothioninového genu (Brinster et al., 1982, Nátuře

296:39-42), rostlinné expresní vektory obsahující promotor nopalinsyntetázy (Herrera-Estrella et al., Nátuře 303:209·· · ·

213) nebo 3 5S RNA promotor z viru mozaiky květáku (Gardner, et al. , 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871), a také promotor fotosyntetického enzymu ribulózabisfofátkarboxylázy (HerreraEstrella et al., 1984, Nátuře 310:115-120); promotorové elemety z kvasinek nebo jiných hub jako je např. Gal4 promotor, promotor ADC (alkoholdehydrogenázy), promotor PGK (fosfoglycerolkinázy), promotor alkalické fosfatázy, a také následující zvířecí transkripční kontrolní úseky, které vykazují tkáňovou specifitu a byly užity u transgenních zvířat: kontrolní úsek genu elastázy I, který je aktivní v buňkách pankreatu (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al. , 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425515); zesilovače (enhancery) nebo promotory genu pro insulin, které jsou aktivní v beta-buňkách pankreatu (Hanahan, 1985, Nátuře 315:115-122); enhancery nebo promotory imunoglobulinových genů, které jsou aktivní v lymfatických buňkách (Grosschedl et al. , 1984, Cell 38:647-658; Adames et al. , 1985, Nátuře 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:14361444); úsek promotoru a enhanceru časných genů cytomegaloviru (Boshart et al. , 1985, Cell 41:521530); kontrolní úsek myší virus nádoru prsní žlázy, který je aktivní v buňkách varlat a prsu, a lymfatických a žírných buňkách (Leder et al. , 1986, Cell 45:485-495); kontrolní úsek albuminového genu, který je aktivní v játrech (Pinkert et al. , 1987, Genes and Devel. 1:268-276); kontrolní úsek genu pro alfafetoprotein, který je aktivní v játrech (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol.

5:1639-164	8; Hammer	et	al. , 1987, Science	235	:53-58);
kontrolní	úsek genu	alfa	1-antitrypsinu,	který	je	aktivní
v játrech	(Kelsey et	al,	1987, Genes and	Devel.	1:161-171);
kontrolní	úsek beta	-globi nového genu,	který	je	aktivní

v myeloidních buňkách (Mogram et al. , 1985, Nátuře 315:33824

340; Kollias et al. , 1986, Cell 46:89-94); kontrolní úsek genu pro myelinový bazický protein, který je aktivní v oligodendrocytech mozku (Readhead et al. , 1987, Cell 48:703-712); kontrolní úsek lehkého řetězce 2 myosinu, který je aktivní v kosterním svalstvu (Sani, 1985, Nátuře 314:283286); a kontrolní úsek genu hormonu uvolňujícího gonadotropiny, který je aktivní v hypothalamu (Mason et al. , 1986, Science 234:1372-1378). Prokaryotické expresní systémy, jako např. LAC promotor nebo beta-laktamázový promotor (Villa-Kamaroff, et al. , 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) nejsou výhodné pro předkládaný vynález, neboť takto exprimovaný interferon-beta by nebyl glykosylováný. Nicméně prokaryotické expresní systémy, které umožní glyksoylaci interferonu-beta buďto v prokaryotickém nebo eukaryotickém hostiteli, jsou také předmětem předkládaného vynálezu.

Expresní vektory, které mohou být použity, jsou například, aniž by však tento výčet byl omezující, následující vektory nebo jejich deriváty: lidské nebo zvířecí viry jako je virus vakcínie, vektory založené na adenovierch nebo retrovirech, hmyzí viry jako bakuloviry, kvasinkové vektory, bakteriofagové vektory (např. lambda) a plazmidové a kosmidové DNA vektory, abychom jmenovali alespoň některé. Specificky k užitečným expresním vektorům pro výhodné eukaryotické hostitele patří vektory obsahující expresní kontrolní sekvence z SV40, hovězího papillomaviru a cytomegaloviru. Uvnitř každého specifického vektoru se vyberou různá místa pro vložení požadované DNA sekvence. Tato místa jsou většinou definována restrikčními endonukleázami, které v těchto místech štěpí DNA. Odborníkovi je toto dobře známo. Je také jasné, že daný expresní vektor užitečný pro vynález nemusí mít restrikční endonukleázová místa pro • · · ·

inzerci vybraného fragmentu DNA. Místo toho se vektor spojí s fragmentem alternativním způsobem.

Expresní vektor, místo vybrané pro inzerci vybraného fragmentu DNA a operativní spojení k expresní kontrolní sekvenci jsou určeny mnoha různými faktory jako je např. počet míst štěpitelných konkrétním restrikčním enzymem, velikost polypeptidu, citlivost polypeptidu k proteolytické degradaci apod. Výběr vektoru a inzerčních míst pro danou DNA je pak dán balancí těchto faktorů.

Rekombinantní konstrukty podle vynálezu se vnesou do buněk, které jsou schopné exprimovat fúzní protein, metodami, které jsou odborníkům známy.

K těmto metodám patří transformace (např. metodou s DEAE-dextraném nebo kalciumfosfátem), transfekce, mikroinj ekce, infekce, vstřelování do buňky a elektroporace buňky. Může být užita jakákoliv hostitelská buňka, za předpokladu, že sekvence rekombinantní nukleové kyseliny bude adekvátně transkribována do RNA v buňkách tohoto typu a že tyto buňky jsou schopny glykosylovat protein. Kromě toho jakékoliv konstrukty rekombinantní nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být užity k vytvoření transgenních zvířat, s výjimkou člověka, schopných produkovat fúzní proteiny založené na imunoglobulinu. Ve výhodném provedení vynálezu jsou hostitelské buňky savčí buňky jako jsou např. buňky COS nebo CHO.

Úspěšnou inkorporaci těchto polynukleotidových konstruktů do daného expresního vektoru je možno identifikovat obecně třemi možnými postupy: (a) DNA-DNA hybridizací, (b) přítomností či absencí funkcí markerových genů, a (c) expresí vložené sekvence. V prvním z uvedených případů se přítomnost genu interferonu-beta-la v expresním vektoru detekuje hybridizací DNA-DNA užitím sondy, která • ··· ·♦ ····

obsahuje sekvence homologní s vloženým genem fúzního proteinu. Ve druhém případě se rekombinantní systém vektor/hostitel identifikuje a selektuje na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti určité markerové funkce (např. thymidinkinázová aktivita, resistence k antibiotikům jak např. G418, transformovaný fenotyp, vytváření okluzních tělísek u bakuloviru apod.) způsobené vložením cizorodého genu do vektoru. Tak např. když je polynukleotid vložen do vektoru tak, že přerušuje sekvenci markerového genu, rekombinanty obsahující inzert jsou identifikovány na základě absence funkce markerového genu. Ve třetím případě je rekombinantní expresní vektor identifikován testováním exprese cizorodého genového produktu z rekombinantního vektoru. Takové testy jsou např. založeny na fyzikálních nebo funkčních vlastnostech genového produktu v biologických testovacích systémech.

Je třeba mít na paměti, že ne všechny kombinace hostitel/expresní vektor fungují se stejnou účinností při expresi DNA kódující polypeptid podle vynálezu. Avšak odborník může provést konkrétní výběr kombinace hostitel/expresní vektor při uvážení principů stanovených v předkládaného vynálezu aniž by se odchýlil od vynálezecké myšlenky předkládaného vynálezu.

Výhodné provedení předkládaného vynálezu zahrnuje fúzní proteiny a sekvence DNA, které tyto proteiny kódují. Tyto fúzní proteiny mají amino-koncový úsek charakterizovaný aminokyselinovou sekvencí interferonu-beta-la a karboxykoncový úsek obsahující doménu proteinu jiného než je interferon-beta-la. Generický vzorec výhodného fúzního proteinu je protein mající aminokyselinovou sekvenci X-Y-Z, kde X je polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, nebo alespoň její část, odpovídající aminokyselinové sekvenci • · · ·

lidského interferonu-beta, Y je volitelná spojovací část (linker) a Z je polypeptid obsahující alespoň část polypeptidu jiného než je lidský interferon-beta. V jednom provedení část Z je část polypeptidu, který obsahuj imunoglobulinu podobnou doménu. K příkladům takových polypeptidů patří CD1, CD2, CD4 a členy I. a II. třídy antigenů hlavního histokompatibilního systému (pro příklady těchto polypeptidů viz také přihlášku U.S. 5 565 335, Capon et al.).

Část Z obsahuje např. několik histidinových zbytků, nebo výhodné Fc úsek imunoglobulinu, přičemž Fc je definován jako fragment protilátky obsahující C-koncovou doménu těžkého řetězce imunoglobulinu.

V nejvýhodnějším provedení fúzního proteinu podle vynálezu je polypeptid interferonu-beta-la fúzován prostřednictvím svého C-konce s alespoň částí Fc úseku imunoglobulinu. Interferon-beta-la tak vytváří amino-koncovou část a Fc vytváří karboxy-koncovou část fúzního proteinu. V těchto fúzních proteinech je výhodně omezen na kloubový úsek konstantní domény a domény CH2 a CH3. Fc fragment těchto fúzních protein může být také omezen na část kloubového úseku, která je schopna tvořit intermolekulární disulfidické můstky, a domény CH2 a CH3, nebo odpovídající funkční ekvivalent. Takové konstantní úseky mohou pocházet z jakéhokoliv savce (výhodně člověka) a mohou být získány z jakékoliv třídy a/nebo izotypu protilátky včetně IgA, IgD, IgM, IgE and IgGI, IgG2, IgG3 a IgG4.

Molekuly rekombinantni nukleové kyseliny kódující Ig fúze lze připravit jakoukoliv metodou v oboru známou (viz

Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A Laboratory to

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

N.Y.) nebo užitím veřejně dostupných klonů. Metody přípravy • 9 9 9

9999 genů, které kódují konstantní úseky těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinu, byly popsány např. v Robinson, R. et al., mezinárodní patentová přihláška PCT publikovaná jako W087/02671. Sekvence cDNA kódující molekulu interferonu nebo její fragment může být přímo spojena s DNA sekvencí kódující konstantní úsek těžkého řetězce imunoglobulinu nebo může být spojena prostřednictvím spojovací sekvence (linkeru). V jiném provedení vynálezu je rekombinantní expresní systém vytvořen tak, že obsahuje sekvenci kódující interferon-beta ve správném čtecím rámci se syntetickým úsekem pro kloubovou oblast protilátky. Kromě toho může být potřebné vložit, jako část rekombinantního vektorového systému, nukleové kyseliny odpovídající 3'-koncový úsek lemující imunoglobulinový gen obsahující místa pro štěpení a polyadenylaci RNA a downstream sekvence. A dále může být potřebné vložit signální sekvenci do polohy upstream od kódující sekvence imunoglobulinového fúzního proteinu, aby se umožnila sekrece fúzní molekuly z buněk transformovaných rekombinantním vektorem.

Předkládaný vynález poskytuje dimerní fúzní molekuly a také monomerní nebo multimerní molekuly obsahující fúzní proteiny. Takové multimerní molekuly mohou být připraveny užitím takových Fc úseků Ig molekul, nebo jejich částí, které jsou obvykle multivalentní jako jsou např. pentamery IgM nebo dimery IgA. Je zřejmé, že polypeptid J řetězce je potřebný pro vytvoření a stabilizaci pentamerů IgM a dimerů IgA. Alternativně multimery fúzních proteinů interferonu-beta-la mohou být připraveny užitím proteinu s afinitou k Fc úseku Ig molekul, jako je např. protein A. Tak např. mnohé fúzní proteiny interferon-beta-la/imunoglobulin mohou být navázány na agarózové perličky s proteinem A.

• · · ·

9999

Tyto polyvalentní formy jsou užitečné, neboť.

maj í mnoho vazebných míst pro receptor interferonu-beta-la.

Např.

bivalentní rozpustný interferon-beta-la je složen ze dvou tandemově se opakujících sekvencí aminokyselin 1 až 166 v sekvenci id. č. 2 (nebo kódovaných úsekem 1 až 498 sekvence id. č. 1) (část X v generickém vzorci) oddělených spojovacím úsekem (část Y) , a tato repetice je spojena s alespoň částí konstantní domény imunoglobulinu (část Z). Pozměněné polyvalentní formy mohou být zkonstruovány, např. chemickým navázáním fúze interferon-beta-la/lg na klinicky přijatelnou nosičovou molekulu, polymer vybraný ze skupiny obsahující Ficoll, polyethylenglykol nebo dextran, a sice obvyklými metodami konjugace. Alternativně může být interferon-beta-la chemicky konjugován s biotinem, a tento konjugát biotin interferon-beta-Fc se pak naváže na avidin, čímž vznikne tetravalentní molekula avidin/biotin/interferon-beta. Fúze interferon-beta-la/lg může být také kovalentně navázána na dinitrofenol (DNP) nebo trinitrofenol (TNP), a výsledný konjugát pak precipitován pomocí anti-DNP nebo anti-TNPIgM, čímž se vytvoří dekamerní konjugáty s valencí 10 pro vazebná místa k receptoru interferonu-beta.

Proteiny interferonu-beta-la a jejich fragmenty a fúzní proteiny podle vynálezu mohou být izolovány a purifikovány obvyklými metodami, jako je např. extrakce, precipitace, chromatografie, afinitní chromatografie, elektroforéza apod. Např. interferonové proteiny a jejich fragmenty se mohou purifikovat tak, že se jejich roztok nanese na kolonu obsahující imobilizovaní receptory interferonů (viz např. patent USA č. 4,725,669). Navázané molekuly interferonů se pak eluují užitím chaotropní soli nebo užitím vodného roztoku kyseliny octové. Imunoglobulinové fúzní proteiny mohou být purifikovány tak, že procházejí přes obsahující imobilizovaný ····

protein A nebo protein G, které selektivně váží úsek Fc fúzního proteinu (viz např. Reis, K. J.,

Immunol.

132:30983102 (1984);

PCT přihláška publikovaná jako

W087/00329).

Chimérická protilátka se pak eluuje užitím chaotropní soli nebo užitím vodného roztoku kyseliny octové.

Alternativně se molekuly fúzního proteinu interferonu a imunoglobulinu pro získání v podstatě čistého proteinu purifikují na koloně s anti-interferonovou protilátkou nebo na koloně s anti-imunoglobulinovou protilátkou.

Termínem v podstatě čistý je míněn protein zbavený nečistot, které jsou s ním v přirozeném stavu spojeny. V podstatě čistý stav je možné dokázat výskytem jediného pásu při elektroforéze.

Příkladem užitečného fúzního proteinu interferon-beta la/Ig podle vynálezu je protein sekvence id. č. 2, který je secernován v buněčné kultuře eukaryotických buněk obsahujících expresní plazmid pCMG261 (viz příklad 2). Tento protein se skládá ze zralého lidského interferonu-beta-la fúzovaného s částí kloubového úseku a konstantními doménami CH2 a CH3 myšího Ig. Přitom obsahuje úsek myšího imunoglobulin dostatečný k tomu, aby byl rozpoznán Fc vazebným proteinem, a sice proteinem A.

Další fúzní proteiny podle vynálezu obsahující lidský interferon-beta-1 jsou uvedeny: (a) jako sekvence id. č. 3 a

4, ukazující cDNA a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci his-označené fúze interferonu-beta-la (také ukázána na obr.

1), a (b) sekvence id. č. 1 pro cDNA kódující fúzní protein interferon-beta-la/lg se sekvencí id. č. 2 (ukázán také na obr. 2).

Výhodné proteiny interferonu-beta-la podle vynálezu obsahující novou spojovací sekvenci DNA id. č. 5 a aminokyselinovou sekvenci id. č. 6 představující kodony 11 • ♦·*

Φ* «·φ V tripletů na obou stranách spoje mezi lidského

DNA interferonu-beta a

DNA kódující konstantní úsek lidského imunoglobulinu (viz příklad

5: sekvence id.

a 42) .

Specificky, sekvence id. č. 5 kódující lidský interferonbeta-la končí nukleotidovým tripletem 568-570 (AAC) a DNA kódující konstantní úsek lidského IgGl začíná tripletem (GAC) počínaje nukleotidem č. 574 v sekvenci id. č. 41. Odpovídající dedukovaná aminokyselinová spojovací sekvence je uvedena jako sekvence id. č. 6 a je založena na sekvenci id. č. 42. Byla definována i další jedinečná spojovací sekvence, která zahrnuje linkerovou sekvenci ve výsledném DNA konstruktu (viz příklad 5: sekvence id. č. 43 a 44) . Tato sekvence spojovací DNA a příslušná aminokyselinová sekvence jsou uvedeny jako sekvence id. č. 7 a 8, které ukazují kodony 11 tripletů na obou stranách spoje přímo mezi koncem sekvence interferonu-beta-la (nukleotid č. 570 v sekvenci id. č. 43) a sekvencí linkeru (nukleotidy 571 až 585 v sekvenci id. č. 43, GGGGS v sekvenci id. č. 8).

Spojovací DNA sekvence mohou být užity jako DNA sondy a jsou to minimální DNA potřebné pro hybridizaci za standardních podmínek s jakoukoliv DNA sekvencí kódující fúzní protein interferon-beta-la/Ig. Nicméně za předpokladu, že celá sonda hybridizuje s oběma stranami spojovací sekvence a obě strany spoje interferon-beta/konstantní úsek se podílejí na hybridizaci, mohou existovat i menší sekvence. Navíc odborníkovi je zřejmé, že DNA sekvence větší než sekvence id. č. 7 jsou také vhodné pro hybridizaci. Odborník může snadno otestovat, zda konkrétní sonda, jak např.

sekvence id.

č. 5 nebo 7, je stranách spojení, a to tak, j ednořetězcového sense schopna hybridizace na obou že označí 5'-konec buďto oligonukleotidů nebo jednořetězcového anti-sense oligonukleotidů vhodně značeným >· 4···

9·· • A·'» ·« • e· • ·· • « · · « ·· • ·· fosfátem z ATP užitím polynukleotidkinázy. Sekvence podle vynálezu musí hybridizovat s oběma, a tudíž být označena oběma oligonukleotidovými sondami. Odborníkovi je také zřejmé, že vynález zahrnuje také plně degenerované sekvence kódující spojovací sekvenci id. Č. 5 nebo 7.

III. Další varianty interferonových fúzních polypeptidů

K derivátům proteinů podle vynálezu patří také různé strukturní formy primárních proteinů, které si uchovávají biologickou aktivitu. Díky přítomnosti ionizovatelné aminoskupiny a karboxylové skupiny mohou být fúzní proteiny interferonu-beta např. ve formě kyselých nebo bazických solí, nebo mohou být v neutrální formě. Jednotlivé aminokyselinové zbytky mohou být modifikované oxidací nebo redukcí. A dále primární aminokyselinová struktura (včetně N- a/nebo Ckoncových úseků) nebo glykanová část interferonu-beta mohou být modifikovány (derivatizovány) vytvářením kovalentních nebo agregovaných konjugátů s jinými chemickými skupinami, jako jsou např. glykosylové skupiny, polyalkylenglykolové polymery jako např. polyethylenglykol (PEG: viz současně projednávané přihlášky stejného přihlašovatele č. 60/104,491 a 60/720,237), lipidy, fosfáty, acetylové skupiny apod., a nebo vytvářením mutací aminokyselinových sekvencí.

K dalším derivátům interferonu-beta/lg patří kovalentní nebo agregované konjugáty interferonu-beta nebo j eho fragmentů s jinými proteiny nebo polypeptidy, které jsou připojeny syntézou v rekombinantní kultuře jako dodatečné

C- nebo N-konce. Tak např. konjugovaný peptid může být signální (nebo tzv.

vedoucí) sekvence v N-koncovém úseku proteinu, která při translaci (kotranslačně) nebo po translaci (posttranslačně) směruje

přenos proteinu z místa jeho syntézy do místa jeho působení uvnitř buňky nebo vně buněčné membrány nebo buněčné stěny (např. vedoucí sekvence alfa-faktoru kvasinek). Receptorové proteiny interferonu-beta mohou obsahovat peptidy přidané pro usnadnění purifikace nebo identifikace interferonu-beta (např. fúze histdin/interferon-beta-la) . Aminokyselinová sekvence interferonu-beta může být také spojena s peptidem Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (DYKDDDDK) (Hopp et al. , Bio/Technology 6:1204, 1988.) Tato sekvence je silně antigenní a poskytuje epitop revezibilně vázaný specifickou monoklonální protilátku, což umožňuje rychlé testování a snadné čištění exprimovaného rekombinantního proteinu. Tato sekvence je také specificky štěpena enterokinázou z hovězí sliznice v místě zbytku bezprostředně následujícím po dvojici Asp-Lys.

K dalším analogům patří fúzní proteiny interferonu-beta s Fc nebo jejich biologicky aktivní fragmenty, jejich sekvence interferonu-beta se liší od sekvencí uvedených jako sekvence id. č. 2, 4, 6 nebo 8 jednou nebo více konzervativními záměnami aminokyselin nebo jednou či více nekonzervativními záměnami, a nebo delecemi nebo inzercemi, které nenarušují biologickou aktivitu izolovaného proteinu. Ke konzervativním substitucím typicky patří substituce jedné aminokyseliny druhou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi, jako jsou např. substituce v rámci následujících skupin: valin, alanin a glycin; leucin a isoleucin; kyselina asparagová a glutamová, asparagin a glutamin; serin a threonin; lysin a arginin; a fenylalanin a tyrosin. K nepolárním hydrofobním aminokyselinám patří alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin. K polárním neutrálním aminokyselinám patří glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. K pozitivně nabitým (bazickým) aminokyselinám patří arginin, lysin a histidin. K negativně nabitým (kyselým) aminokyselinám patří kyselina asparagová a kyselina glutamnová. Další konzervativní substituce jsou odborníkovi jasné. Tak např. pro konzervativní substituci aminokyseliny alaninu je možné vybrat kteroukoliv z aminokyselin jako je D-alanin, glycin, beta-alanin, L-cystein a D-cystein. Pro lysin lze vybrat jako náhradu kteroukliv z aminokyselin D-lysin, arginin, D-arginin, homo-arginin, methionin, D-methionin, ornitin a D-ornitin. Obecně substituce, u kterých se dá očekávat, že způsobí změny ve funkčních vlastnostech izolovaných polypeptidů, jsou případy, kdy: (i) polární zbytek, např. serin nebo threonin, je nahrazen (nebo se užije k nahrazení) hydrofobním zbytkem, např. leucinem, isoleucinem, fenylalaninem nebo alaninem (ii) cysteinový zbytek je nahrazen (nebo se užije k nahrazení) jiným zbytkem a nebo (iii) zbytek mající elektropozitivní vedlejší řetězec např. lysin, arginin nebo histidin, je nahrazen (nebo se užije k nahrazení) zbytkem majícím elektronegativní vedlejší řetězec, jako je např. kyselina glutamová nebo asparagová, nebo (iv) zbytek mající objemný vedlejší řetězec, jako je např. fenylalan, je nahrazen (nebo se užije k nahrazení) zbytkem, který nemá takový vedlejší řetězec, např. glycinem. Vynález také zahrnuje izolované molekuly, které jsou alelickými variantami, přirozenými mutantami, indukovanými mutantami nebo proteiny, které jsou kódovány DNA hybridizující za podmínek vysoké či nízké stringence s nukleovými kyselinami kódujícími polypeptid se sekvencemi id.

č. 2, 4, 6 nebo 8.

Původci připravili další mutanty interferonu-beta-la, které jsou dalšími variantami části interferonu-beta-la v proteinu podle vynálezu. Tyto interferon-beta-la části • · · · · ·

mohou být zvláště užitečné, pokud projevují nové vlastnosti, které nemá interferon-beta-la divokého typu (viz příklad 1). Stručně shrnuto, byla provedena mutační analýza lidského interferonu-beta-la s cílem mapovat aminokyselinové zbytky nutné pro aktivitu a vazbu receptoru. Dostupnost trojrozměrné krystalové struktury lidského interferonu-beta-la (viz Karpusas et al. , 1997, Proč. Nati. Acad. Sci. 94: 1181311818) umožnila identifikovat, pro alaninové (nebo serinové) substituce zbytky, které jsou vystaveny rozpouštědlu a jsou dostupné pro interakce s receptorem interferonu-beta, a přitom zachovat aminokyselinové zbytky podílející se na vytváření intramolekulárních vazeb. Byl připraven panel 15 alaninových skenovacích mutant, kde bylo nahrazeno 2 až 8 zbytků v určitých oblastech šroubovic (A, B, C, D, E) a smyček (AB1, AB2, AB3, CD1, CD2, DE1, DE2) interferonu-betala (viz příklad 1).

Amino-koncová histidinová značka (his tag) byla vložena pro afinitní purifikaci mutant exprimovaných v savčích buňkách (sekvence id. č. 2, obr. 1). Funkční důsledky těchto mutací byly vyhodnoceny pomocí antivirových a antiproliferačních testů. Byl také vyvinut neradioaktivní vazebný test pro analýzu schopnosti mutant vázat se na receptor interferonu-beta na povrchu buněk (buněčný povrchový receptor IFNAR1/2). Navíc byl užit test založený na ELISAtestu užívající fúzní protein ektodoméma IFNAR2/FC k navázání interferonu pro mapování povrchových interakcí mezi interferonem-beta-la a IFNAR2 (viz příklad 2) . Tyto mutační analýzy ukázaly, že N- a C-konce leží v části molekuly interferonu-beta, která není důležitá pro vazbu receptoru nebo pro biologickou funkci.

Byly identifikovány tři druhy účinků, které byly způsobeny cílenou mutagenezí. Tyto účinky mohou být za • · • · · · určitých okolností výhodné při vývoji interferonových léčiv. Tyto tři účinky byly následující: (a) mutanty s vyšší antivirovou aktivitou než interferon-beta-la divokého typu s his-značkou (např. mutanta Cl), (b) mutanty aktivní jak v antivirovém tak antiproliferačním testu, ale jejich antiproliferační aktivita byla neúměrně nízká ve srovnání s antivirovou aktivitou, vzhledem k interferonu-beta-la divokého typu s his-značkou (např. mutanty Cl, D a DEl),a (c) funkčně antagonistické mutanty (např. Al, B2, CD2 a DE1), které vykazují antivirovou i antiproliferační aktivitu, která byla neúměrně nízká ve srovnání s vazebnou aktivitou k receptorů, vzhledem k interferonu-beta-la divokého typu.

Kromě toho i spojení mezi interferonovou částí (X) a druhou částí (Z) , která je odlišná od interferonu-beta-la (např. Fc fragment imunoglobulinu) může být způsobeno chemickou reakcí, která bude vázat obě molekuly tak dlouho, dokud si imunoglobulin a interferon-beta-la zachovají své aktivity. K takovým chemickým spojením patří např. kovalentní vazba, afinitní vazba, interkalace, koordinační vazba a vytvoření komplexu. Příkladem spojovacích činidel (tj .

linkeru Y v generickém vzorci), která vytvoří kovalenmtní vazby mezí interferonovou a imunoglobulinovou částí patří organické sloučeniny jako např.

thioestery, karbodi imidy, sukcinimidestery, di i sokyanáty j ako j e tolylen-2,6 diisokyanát, glutaraldehydy, diazobenzeny a hexamethylendiaminy jako je např. bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylendiamin, bifunkční deriváty imidoesterů jako je dimethyladipimidát, a biaktivní sloučeniny fluoru jako je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen. Tento výčet není samozřejmě vyčerpávajícím seznamem různých tříd chemických vazebných činidel v oboru známých. Mnohá z nich jsou také komerčně dostupná jako např.

N-sukcinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionát (SPDP),

hydrochlorid l-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)karbodiimidu (EDC); 4-sukcinimidyloxykarbonyl-alfa-methyl-alfa-(2-pyridyldithio)-toluen (SMPT: Pierce Chem. Co., katalog. Č. 21558G).

IV. Využití vynálezu

Fúzní proteiny podle vynálezu se mohou využít ve farmaceutických přípravcích tam, kde je potřeba užit léčení interferonem. Tyto molekuly mají výhody fúzních proteinů, zejména fúzních proteinů s Ig, jde zejména o změněnou farmakokinetiku a farmakodynamiku, která vede k prodlouženému biologickému poločasu a prodloužené době setrvání v cévním systému. Kromě toho zvláště výhodné proteiny glykosylovaného interferonu-beta-la, ačkoliv jsou strukturně podobné interferonu-beta-lb, mají mnohonásobně vyšší biologickou aktivitu než neglykosylováný interferon-beta-lb (viz Runkel et al., 1998, Pharm. Res. 15: 641-649).

Produkty podle vynálezu byly shledány užitečnými pro udržení biologického poločasu terapeutického interferonubeta-la, a mohou být pro terapeutické podávání upraveny např. rozpuštěním ve vodě nebo v jiném vhodném kapalném médiu. Podávání se provádí parenterálním nebo perorálním způsobem nebo ve formě aerosolu. Pro perorální podávání mohou být připraveny jemné koloidní suspenze pro dosažení depotního účinku při parenterálním podávání, nebo při perorálním podávání, zatímco aerosolové přípravky jsou povahou kapalné přípravky nebo ve formě suchého prášku. Fúze interferonubeta-la podle předkládaného vynálezu by měly mít dobrou stabilitu při skladování v suchém lyofilizovaném stavu nebo jako kapalné přípravky.

Terapeutické proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být užity k profylaxi nebo k léčení jakékoliv nemoci pro které je účinnou složkou interferon-beta> fúzni proteiny podle vynálezu se mohou užít složek, stavů nebo nebo poruchy, ] la. kromě toho pro diagnózu systémech nebo v jiných než

Při nemocí v biologických předpokládá nebo j e takové léčení, jako pro diagnostiku předkládaný která vzorcích, stejně tak fyziologických systémech, terapeutickém využití využití k léčení zvířete, latentně náchylné k onemocnění které spočívá v tom, že účinné množství fúzního proteinu podle účinné pro danou které budou léčeny zvířata a především se vynález buďto již trpí vyžaduje tudíž zvířeti podává vynálezu, které je nemoc fúzními člověk.

nebo poruchu. proteiny podle V závislosti na terapeuticky

K subjektům, vynálezu patří nemoci nebo stavu, které mají být léčeny, zvířeti se podává fúzni protein interferonu-beta-la podle vynálezu v jakékoliv terapeuticky účinné a bezpečné dávce, kterou odborník snadno stanoví bez nutnosti nadměrného experimentování. Vzhledem k mezidruhové bariéře pro interferony typu I je nebytné připravit fúzni proteiny interferonu-beta-la podle vynálezu vždy s interferony z odpovídajícího biologického druhu.

Antiproliferační buněčná aktivita interferonu-beta-la j e dobře známa.

Konkrétně některé fúze interferonu-beta-la popsané v předkládané přihlášce jsou užitečné k léčení nádorových a rakovinných onemocnění, jako je např.

osteogenní sarkom, lymfom, akutní lymfocytární leukémie, karcinom prsu, melanom a nasofaryngeální karcinom, a také autoimunitních onemocnění jako je např. fibróza, lupus a roztroušená skleróza mozkomíšní. Také se dá očekávat, že antivirová aktivita, kterou projevují fúzni proteiny podle vynálezu, se využije k léčení virových onemocnění, jak je např. infekce ECM, chřipka a další infekce respiračního traktu, hepatitida a rabies. Také se dá očekávat, že

imunomodulační aktivita, kterou projevují fúzní proteiny podle vynálezu, se využije k léčení autoimunitních a zánětlivých onemocnění jako je např. fibróza a roztroušená skleróza mozkomíšní. Schopnost interferonu-beta-la inhibovat vytváření nových krevních cév (tj . inhibovat angiogenezi a neovaskularizaci) předurčuje fúzní proteiny podle vynálezu k použití při léčení angiogenních nemocí jako je např. diabetická retinopatie, retinopatie předčasně narozených, makulární degenerace, odvržení štěpu rohovky, neovaskulární glaukom, retrolentální fibroplázie, rubeóza a Osler-Weberův syndrom. Kromě toho antiendoteliální aktivita interferonu je již nějakou dobu známa a jeden z možných mechanismů působení interferonu může být narušení aktivity endotelových buněk tím, že inhibuje produkci nebo aktivitu angiogenních faktorů produkovaných nádorovými buňkami. Některé cévní nádory, jako např. hemangiomy, jsou zvláště citlivé k léčení interferonem. Léčení interferonem alfa je zatím jediným doloženým způsobem léčení této nemoci. Lze očekávat, že léčení fúzními proteiny interferonu-beta-la podle vynálezu poskytne značný farmaceutický prospěch ve smyslu zlepšené farmakokinetiky a farmakodynamiky, neboú konjugáty zůstávají v cévách po delší dobu než nekonjugované interferony, což umožňuje mnohem účinnější terapii při použití konjugátů jako antiangiogenního léčiva (viz příklad 9).

Fúze polymer-interferon-beta-la podle vynálezu mohou být podávány jako takové a nebo ve formě farmaceuticky přijatelných esterů, solí nebo jiných fyziologicky aktivních derivátů. V těchto farmaceutických přípravcích je interferonbeta- la výhodně užíván společně s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, a volitelně jakýmikoliv dalšími terapeutickými složkami. Nosič musí být farmaceuticky přijatelný v tom smyslu, že musí být kompatibilní s ostatními • · * ·

složkami v přípravku a nesmí být nadměrně škodlivý pro příjemce. Přípravek interferonu-beta-la se podává v množství účinném pro dosažení požadovaného farmakologického účinku, jak již bylo popsáno výše, a v takových dílčích množstvích, aby bylo dosaženo požadované denní dávky.

K vhodným lékovým formám patří formy pro parenterální i jiné podávání, k vhodným specifickým způsobům podávání patří např. podávání perorální, rektální, bukální, topické, nazální, oftalmické, subkutánní, intramuskulární, intravenózní, transdermální, intrathekální, intraartikulární, intraarteriální, subarachnoidální, bronchiální, lymfatické, vaginální a intrauterinní. Výhodné jsou lékové formy pro perorální, nazální a parenterální podávání.

Pokud je interferon-beta-la užit v přípravku, který obsahuje tekutý roztok, přípravek se výhodně podává perorálně nebo parenterálně. Pokud je interferon-beta-la užit v přípravku, který je ve formě tekuté suspenze nebo suchého prášku formulován společně s biologicky kompatibilním nosičem, pak se může výhodně podávat perorálně, rektálně nebo bronchiálně.

Pokud je interferon-beta-la užit v přípravku přímo jako tuhá látka ve formě prášku, výhodně se může podávat perorálně. Alternativně se může podávat nazálně nebo bronchiálně, pomocí nebulizace prášku v nosičovém plynu, kdy se vytváří disperze prášku v plynu, kterou pacient vdechuje, a sice užitím vhodného nebulizačního zařízení.

Přípravky obsahující fúzní proteiny podle předkládaného vynálezu se výhodně formulují do jednotkových lékových forem, a sice jakýmikoliv metodami, které jsou odborníkům ve farmacii známy. Tyto metody obecně obsahují krok, kdy se účinná složka smísí s nosičem a případně dalšími pomocnými složkami. Typicky se přípravky připravují uniformním a

dokonalým smísením účinné složky (či více účinných složek) s kapalným nosičem, jemně rozmělněným tuhým nosičem nebo oběma, a pak se produkt podle potřeby formuluje do požadovaných lékových forem.

Přípravky podle vynálezu vhodné pro perorálni podávání jsou v podobě diskrétních jednotek jako jsou např. tobolky, oplatky, tablety nebo pastilky, kdy každá taková forma obsahuje předem stanovené množství účinné složky v podobě prášku nebo granulátu, nebo v tekuté formě, vodné nebo bezvodé, jako je např. sirup, elixír, emulze nebo pěna.

Tablety se připravují lisováním nebo odléváním, případě s jednou nebo více pomocnými složkami. Lisované tablety se připravují lisováním na vhodných zařízeních, kde se užívá účinná složka ve volně sypké formě jako je prášek nebo granulát, která se případně mísí s pojidly, rozvolňujícími činidla, lubrikanty a inertními ředidly, povrchově aktivními činidly a uvolňovacími činidly, odlévané tablety obsahují směs práškového polymerového konjugátu s vhodným nosičem a připravují se odléváním pomocí vhodného zařízení.

Sirup se připraví přidáním účinné látky do koncentrovaného vodného roztoku cukru, např. sacharózy, ke kterému se přidají ještě další pomocné přísady. K takovým přísadám patří příchutě, konzervační činidla, činidla zpomalující krystalizaci cukru a činidla zvyšující rozpustnost ostatních složek jako jsou např. polyhydroxyalkoholy, jako je glycerol nebo sorbitol.

Lékové formy vhodné pro parenterální podávání výhodně obsahují sterilní vodné přípravky aktivního proteinu, které jsou výhodně isotonické s krví příjemce (např. fyziologický solný roztok). Takové přípravky obsahují také suspendující činidla a zahuščovadla nebo jiné mikročásticové systémy, které jsou určeny k zacílení sloučeniny na krevní složky nebo •·ΦΦ ·· ···· ·· • · · · · · · • φφφ · · φ φφφφ φφφ • φφφ φ · φ φφφ φφφ do jednoho či více orgánů. Přípravky jsou buďto v jednodávkové nebo vícedávkové lékové formě.

Přípravky ve formě nosního spreje obsahují purifikované vodné roztoky aktivního konjugátu s konzervačními a isotonickými činidly. Tyto přípravky mají obvykle pH a tonicitu upravené tak, aby kompatibilní s nosní sliznici.

Lékové formy pro rektální podávání jsou obvykle čípky, kde vhodným nosičem je kakaové máslo, hydrogenované tuky nebo hydrogenované mastné karboxylové kyseliny.

Oftalmické přípravky jako např. oční kapky jsou připraveny podobně jako nosní spreje, s tím rozdílem že pH a tonicita jsou nastaveny kompatibilně pro oko.

Topické přípravky obsahují konjugáty podle vynálezu rozpuštěné nebo suspendované v jednom nebo více médiích, jako je např. minerální olej, vazelína, polyhydroxyalkoholy nebo jiná farmaceutická báze pro topické přípravky.

Kromě výše uvedených složek mohou přípravky podle vynálezu ještě dále obsahovat jednu nebo více doplňkových složek jako jsou např. ředidla, pufry, příchutě, rozvolňující činidla, povrchově aktivní látky, zahušúovadla, lubrikanty, konzervační látky (včetně antioxidantů) a další.

Tudíž předkládaný vynález poskytuje fúzní proteiny vhodné pro in vitro stabilizaci interferonu-beta-la v roztoku, což je příklad výhodné, jiné než terapeutické aplikace vynálezu. Fúzní proteiny mohou být také využity ke zvýšení tepelné stability a odolnosti proti enzymatické degradaci interferonu-beta-la a poskytují tak způsob, jak zvýšit dobu skladovatelnosti, stabilitu při teplotě místnosti a trvanlivost reagencií a souprav užívaných pro výzkum.

Následující příklady slouží k ilustraci vynálezu a nijak jeho předmět neomezují. Je zřejmé, že zejména in vivo experimenty se zvířaty zde popsané mohou být provedeny ···· • · · · · · · • · <··· ··· • · · · · « · ··· φ ·· · ·· ♦ různými způsoby, takže jsou možné různé modifikace a variace základních metod zde popsaných. Tak např. v příkladu 7 může odborník užít jiný neopterinový test nebo může změnit druh či počet primátů v pokusu. Všechny takové modifikace a variace spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Studie struktury/aktivity lidského interferonu-beta-la s použitím substitučních mutací alanin/serin: analýza vazebných míst receptorů a funkčních domén

Přehled

Byla prováděna obsáhlá mutační analýza lidského interferonu-beta-la (IFN-beta-la) s cílem mapovat zbytky nutné pro aktivitu a vazbu receptorů. Dostupnost trojrozměrné (3-D) krystalové struktury lidského IFN-beta (Karpusas, M. et al., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94, 11813-11818) umožnila původcům identifikovat substituce alaninu (nebo šeřinu) zbytků vystavených rozpouštědlu dostupných pro receptořové interakce a ponechat aminokyseliny zapojené do intramolekulárních vazeb. Byl navržen panel 15 alaninových substitucí, které nahradily 2 až 8 zbytků v průběhu rozdílných oblastí každého helixu (A, B, C, D) a smyček (AB, CD2, DE) . Pro účely afinitní purifikace byla začleněna aminokoncová histidinová značka obsahující 6 histidinových zbytků, jakož i enterokinázová spojovací sekvence (linker) pro odstranění amino-koncové extenze. Výsledné interferony jsou • · · ·

nazývány jako „interferon(IFN)-beta se značkou his nebo „His-interferon-beta nebo „His₆-interferon-beta apod.

Byly konstruovány různé mutace expresních plazmidů IFN-beta se značkou his s použitím genového konstruktu s divokým typem IFN-beta jako templátu pro mutagenezi. Strategie mutageneze vyžadovala nejdříve vnesení štěpného místa jedinečného restrikčního enzymu prostřednictvím genu IFN-beta se značkou his, a pak nahrazení přesných sekvencí DNA mezi vybranými restrikčními místy syntetickými oligonukleotidovými duplexy, které kódovaly alaninové (nebo serinové) substituční mutace. Nakonec byly mutované geny IFB subklonovány do plazmidů, který řídil expresi savčích buněk v buněčné linii 293 z lidských ledvin.

Funkční následky těchto mutací byly hodnoceny antivirovými a antiproliferačními testy. Byl vyvinut neradioaktivní vazebný test pro IFN, který analyzoval vazbu těchto mutant k povrchovému receptoru („IFNAR1/2 komplex) buněk Daudi lidského Burkittova lymfomu. Navíc byl vyvinut test pro mapování povrchů při interakcích mezi mutanty hisIFN-beta a IFNAR2, který používal fúzní protein IFNAR2/Fc, složený z extracelulární domény proteinu IFNAR2 receptoru IFN fúzované ke kloubové doméně, doménám CH2 a CH3 lidského IgGl.

1. Vytvoření genu interferonu-beta jako templátu pro mutagenezi

Při strategii původců pro tvoření mutant

IFN-beta substituované alaninem (nebo serinem) nej dříve vznikl modifikovaný gen IFN-beta, který kódoval protein divokého typu, ale který nesl štěpná místa jedinečných restrikčních enzymů v genu. Jedinečná místa byla použita pro záměnu sekvencí divokého typu syntetickými oligonukleotidovými duplexy, které kódovaly mutované kodony. Aby se získala expresní kazeta lidského IFN-beta-la vhodná pro tvorbu mutovaných genů, byla cDNA IFN-beta (GenBank přístupové č. E00029) amplifikována pomocí PCR. Bylo nezbytné počáteční klonování genu IFN-beta do plazmidu pMJB107, derivátu pACYC184, (viz Rose, et. al. , 1988, Nucleic Acids Res., 16(1), 355), aby se mohla provádět místně cílená mutageneze genu v plazmidu, kterému chyběla specifická restrikční místa vytvářená během mutageneze.

Primery pro PCR použité pro subklonování kódujících sekvencí genu lidského IFN-beta také umožnily původcům zavést enterokinázovou spojovací sekvenci v protisměru a v rámci s genem IFN-beta:

' PCR primer:

5'-TTCTCCGGAGACGATGATGACAAGATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC-3' (sekvence id. č. 9: „BET-021), a

3' PCR primer:

5'-GCCGCTCGAGTTATCAGTTTCGGAGGTAACCTGTAAGTC-3' sekvence id. č. 10: „BET-022) a hraniční oblasti míst restrikčních enzymů (BspEI a Xhol) užitečné pro klonování do míst plazmidu pMJB107. Výsledná DNA byla nazvána PCR fragment A.

Výkonná signální sekvence z lidské adhezivní molekuly cévní buňky-1 (VCAM-1) a značka (tag) šesti histidinů byly vneseny do konečného konstruktu z druhého fragmentu DNA vytvořeného z pDSW247 (fragment B). Plazmid pDSW247 je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ze kterého byl odstraněn gen EBNA-1 a který nese signální sekvenci VCAM-1 (VCAMss) fúzovanou v protisměru a v rámci se značkou šesti histidinů. Primery PCR, které byly použity pro vytvoření kazetové skupiny VCAMss-l/histidinová značka, byly KID-369 (5 ¹ PCR primer) :

5' -AGCTTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCT-3' ·♦·· •· ···· • · • · · · · · · • 4 4 4 · 4·4· • Φ · · 4 Φ· •44 4 ΦΦ ·44 (sekvence id. č.: 11) a KID-421 (3^z PCR primer):

5¹-CCGGAGCTATGATGATGATGATGATGGCCCCCGGA-3' (sekvence id. č.:12) začleňující hraniční štěpná místa restrikčních enzymů (Notl a BspEI), která umožnila excizi fragmentu B DNA.

Pro vytvoření plazmidového vektoru, který nesl signální sekvenci VCAM-1, značku his a gen interferon-beta, prováděli původci trojcestnou ligaci s použitím DNA fragmentů purifikovaných přes gel z plazmidového vektoru pMJB107 (štěpeného Notl a Xhol), PCR fragmentu A (štěpeného BspEI a Xhol) a fragmentu B (štěpeného Notl a BspEI). Ligovaný plazmid byl použit pro transformaci buněk E. coli buď JA221 nebo XLl-Blue a byly vybírány kolonie rezistentní na ampicilin a testovány na výskyt inzertů analýzou restrikčních map. Byla izolována DNA pomocí Maxiprepu a sekvence inzertu byla ověřena sekvencováním DNA. Výsledný konstrukt byl nazván pCMG260.

2. Příprava mutant lidského interferonu-beta v pCMG260 substitucí alaninu

Plazmid pCMG260 byl použit jako templát pro několikrát opakovanou mutagenezi (U.S.E. Site Directed Mutagenesis Kit (Boehringer-Mannheim), která zavedla jedinečná restrikční štěpná místa do pozic v průběhu kódující sekvence proteinu IFN-beta, ale nezměnila výslednou sekvenci proteinu. Mutované plazmidy byly použity pro transformaci buď JA221 nebo XLl-Blue kmene E. coli a rekombinantni kolonie byly vybírány podle rezistence na chloramfenikol. Kolonie rezistentní na chloramfenikol byly dále testovány na výskyt požadovaného místa jedinečného restrikčního enzymu pomocí analýzy restrikčních map DNA. Výsledný plazmid IFN-beta, pCMG275.8, obsahoval úplnou sadu jedinečných štěpných míst restrikčních ·· ·♦··

enzymů a DNA sekvence genu byla ověřena. Kompletní sekvence DNA modifikovaného genu interferon-beta se značkou his, společně s kódující sekvencí proteinu divokého typu, jsou uvedeny na obrázku 1.

Kompletní soubor alaninových substitučních mutací je uveden v tabulce 1 (další stránka). Názvy mutant specifikují strukturální oblasti (helixy a smyčky), do kterých byly vneseny mutace. Panel veškerých mutací alaninových (serinových) substitucí má za následek mutace 65 až 165 aminokyselin lidského IFN-beta.

Panel mutant byl vytvořen z pCMG275.8 nahrazením segmentů DNA mezi jedinečnými restrikčními místy syntetickými oligonukleotidovými duplexy, které nesly genetickou kódující informaci uvedenou v tabulce 2 (viz níže). Aby se vytvořily plazmidy s různými alaninovými substitučními mutantami, byly spolu ligovány vektor pCMG275.8 purifíkovaný přes gel (štěpený příslušným restrikčním enzymem, jak uvedeno na seznamu dále v textu, pro každou strukturální oblast IFNbeta) a oligonukleotidové duplexy (kódující sekvence vláken jsou uvedeny v tabulce 2) . Ligační směsi byly použity pro transformaci JA221 kmene E. coli a rekombinantní kolonie byly vybírány podle rezistence na ampicilin. Kolonie rezistentní na ampicilin byly testovány na výskyt inzertů s mutacemi prostřednictvím screeningu na příslušná místa restrikčních enzymů. Pro dvě mutanty (A2 a CD2) strategie klonování vyžadovala použití dvou duplexů syntetických oligonukleotidů (uvedených v tabulce 2), které nesly komplementární přesahující konce, aby bylo možné ligovat je k sobě navzájem, a ke kostře vektoru IFN-beta v troj čestné ligaci. Následující seznam ukazuje místa, která byla použita ke klonování mutovaných oligonukleotidů z tabulky 2. Schéma klonování ·♦·· φ* 9«·· (pododdíl Β) ukazuje pozice těchto jedinečných míst v genu interferonu beta.

A helix	BspEI až MunI nebo BglII až Pstl
Smyčka AB	MunI až Pstl nebo MunI až BsaHI
B helix	BspHI až Bsal nebo BsaHI až Bsal
C helix	Bsal až Xbal
Smyčka CD2	Xbal až BspHI nebo Xbal až DralII
D helix	BspHI až DralII
Smyčka DE	BspHI až Pvul
E helix	Pvul až BstEII

Pozice alaninových substitučních mutací ^HUIFN-/3

0	«···	··		····	♦ ·
• 0 ·	•	•	•	• ·	• 0
4 0	•	0	»	0	•
• 0	•		0	0	0
00 0	•	0·		•	··	0·

Tabulka 1

10 20 30 40 50 • . . . . ».....« .. . .1......1 ......1 . . .

IFN-β MSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLICDRMNFDIPEEIKQIX2QFQKE

M -A-AA--A—A-----------------------------------------R2 --------------AA-AA—AA-----------------------------WB1 --------------------------AAA-AA-------------------MB2 ---------------.--------------------AA-A—A----------AB3 ----------------------------:----------------AAAAA-AAA

I________helix A__________||__________AB loop_____________|

70 00 90 100 • . '.....¹ . . .·......

IFN-β DAALTIYEMIXJNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLiLANVYHQINIILiKTVLEEKLEKE Bl --------r-A—AS----------------------------------------B2 -----------------AAA-----------------------------------Cl ---------------------------AS—AA—S-------------------C2 --------------------------------------A---A—AA--------CD1 ------------------------------------------------AA—AAA

I_________helix B__11________________________ | |_CD loop—

110 120 130 140 150 160

I.....I . I......I.

IFN-β DF^TRGALMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYRINRLTGYLRN

CD2 AA-A—A—A----------------------------------------------_D ------------------A-AA—A-------------------------------DE! --------------------------AA----------------------------DE2 -----------------------------AA-------------------------E --------------------------------------A A—A—A-------CD loop_| |_____helix D____| j helix E_------------1

K tab. 1: Řádek označený IFN-/J ukazuje divoký typ sekvence lidského IFN-/Í. Alaninové nebo serinové substituce zbytků IFN-β jsou ukázány pro každou mutantu a čárky, pod relevantními oblastmi, označují sekvence divokého typu. Struktury helixů a smyček jsou uvedeny jako plné čáry pod mutantami. Smyčka DE překlenuje mezeru mezi helixy D a E. Byly vytvořeny dvě další alaninové substituční mutanty (H93A, H97A a H121A) a byly analyzovány v antivirových testech pro stanovení účinku mutací těchto histidinů, které tvoří cheláty se zinkem v krystalové struktuře dimeru. Obě tyto mutanty si podržely plnou aktivitu divokého typu v antivirových testech, což svědčí pro to, že zinkem zprostředkovaná tvorba dimeru není důležitá pro aktivitu IFN-β.

• · • · · ·

Tabulka 2

Al	sekv. id. č.13 BET-053	CCGGAGACGATGATGACAAGATGGCTTACGCCGCTCTTGGAGCCCTACAA GCTTCTAGCAATTTTCAGTGTCAGAAGCTCCTGTGGC
A2	sekv. id. č. 14 BET-039	GATCTAGCAATGCTGCCTGTGCTGCCCTCCTGGCTGCCTTGAATGGGAGG CTTGAATACT
	sekv. id. č.15 BET-041	GCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGACATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTG CA
AB1	sekv. id. č.16 BET-080	AATTGAATGGGAGGGCTGCAGCTTGCGCTGCAGACAGGATGAACTTTGAC ATCCCTGAGGAGATTAAGCAGCTGCA
AB2	sekv. id. č.17 BET-082	AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGGCTGCATTTGCT ATCCCTGCAGAGATTAAGCAGCTGCA
AB3	sekv. id. č. 18 BET-084	AATTGAATGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAAGGACAGGATGAACTTTGAC A
	sekv. id. č.19 BET -086	TCCCTGAGGAGATTGCTGCAGCTGCAGCTTTCGCTGCAGCTGA
B1	sekv. id. č.20 BET-110	CGCCGCGTTGACCATCTATGAGATGCTCGCTAACATCGCTAGCATTTTCA GACAAGATTCATCTAGCACTGGCTGGAA
B2	sekv. id. č.21 BET-112	CGCCGCATTGACCATCTATGAGATGCTCCAGAACATCTTTGCTATTTTCG CTGCAGCTTCATCTAGCACTGGCTGGAA
Cl	sekv. id. Č.22 BET-114	GGAATGCTTCAATTGTTGCTGCACTCCTGAGCAATGTCTATCATCAGATA AACCATC TGAAGACAGTTCTAG
C2	sekv. id. č.23 BET-092	GGAATGAGACCATTGTTGAGAACCTCCTGGCTAATGTCGCTCATCAGATA GCACATCTGGCTGCAGTTCTAG
CD1	sekv. id. č.24 BET-094	CTAGCTGCAAAACTGGCTGCAGCTGATTTCACCAGGGGAAAACT

• · · ·

CD2	sekv. id. Č.25 BET-096	CTAGAAGAAAAACTGGAGAAAGAAGCAGCTACCGCTGGAAAAGCAATGA GCGCGCTGCACCTGAAAAGA
	sekv. id. č.26 BET-106	TATTATGGGAGGATTCTGCATTACCTGAAGGCCAAGGAGTACTCACAC TGT
Dl	sekv. id. č.27 BET-108	CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGGCAATTGCTGCATAC CTGGCAGCCAAGGAGTACTCACACTGT
DE1	sekv. id. č.28 BET-116	CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTA CCTGAAGGCCGCTGCATACTCACACTGTGCCTGGACGAT
DE2	sekv. id. č.29 BET-118	CATGAGCAGTCTGCACCTGAAAAGATATTATGGGAGGATTCTGCATTA CCTGAAGGCAAAGGAGTACGCTGCATGTGCCTGGACGAT
El	sekv. id. Č.30 BET-104	CGTCAGAGCTGAAA.TCCTAGCAAACTTTGCATTCATTGCAAGACTTACAG

B. konstrukce expresních plazmidů EBNA 293

Gen divokého typu a mutovaný gen IFN-beta, fúzované se signální sekvencí VCAM-1, značkou his a enterokinázovou spojovací sekvencí, byly purifikovány přes gel jako restrikční fragmenty Notl a BamHI o velikosti 761 párů bází. Purifikované geny byly subklonovány do plazmidového vektoru pDSW247, což je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), štěpeného Notl a BamHI, jak je ukázáno ve schématu. Plazmid pDSW247 je expresní vektor pro přechodnou expresi proteinu v buňkách EBNA 293 z lidských ledvin (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Obsahuje cytomegalovirovy promotor časného genu a EBV regulační prvky, které jsou nezbytné pro vysokou hladinu genové exprese v tomto systému, jakož i markéry selekce pro E. coli (rezistence na ampicilin) a pro buňky EBNA 293 (rezistence na hygromycin). Ligované plazmidy byly použity pro transformaci buď JA221 nebo XLl-Blue kmenů E. coli • · · · ····

a kolonie rezistentní na ampicilin byly vybírány a testovány na výskyt inzertů analýzou restrikčních map. Byla izolována DNA pomocí maxiprepu a sekvence inzertů byly ověřeny sekvencováním DNA. Pozitivní klony projevující požadované mutované sekvence byly použity pro transfekci buněk EBNA 293 lidských ledvin tak, jak je popsáno níže.

Obecné klonovací a expresní strategie jsou uvedeny na obrázku 12.

C. Exprese a substitučních mutant kvantifikace IFN-beta-la alaninových

EBNA 293 (Invitrogen, Carlsbad, CA, J. Virol. 63, 3016-3025) byly udržovány jako subkonfluentní kultury v Eagleho médiu modifikovaném dle fetálním bovinním sérem,

Lidské buňky

Chittenden, T. 1989,

Dulbecca doplněném 10% 2mM glutaminem a 250 Gaithersburg, MD) . transfekovány do g/ml

Expresní buněk EBNA 2 93 s lipofektaminem

Kondicionovaná média geneticinu (Life Technologies, plazmidy pDSW247 byly přechodně s použitím protokolu Technologies). po transfekci,

Lif e (Gibco/BRL, byla sklízena 3-4 dny odstraněna centrifugací a koncentrace buněčná debris byla his-IFN-beta byla kvantifikována testem ELISA.

ELISA byla prováděna s použitím polyklonálních králičích protilátek (metodou proteinu A purifikované IgG, protilátky byly pěstovány proti purifikovanému lidskému IFN-beta-la) pro navázání na biot inylovaná použita jako

6-j amkové forma téhož sekundární testy králičího

ELISA a

IgG byla umožnění detekce interferonu s destičky pro polyklonálního reagencie pro použitím křenové peroxidázy konjugované se (HRP: Jackson ImmunoResearch, W.

streptavidinem

Pro vytvoření řada ředění interferonu-beta-la. Kondicionovaná standardních křivek koncentrace

Grove, PA) .

byla použita média z EBNA • ·

transfektant obsahující his-IFN-beta byla naředěna tak, aby se získaly vzorky s koncentracemi v rozmezí od 10 ng/ml do 0,3 ng/ml v testu ELISA. Aby byly koncentrace IFN-beta v médiu zjištěné testem ELISA potvrzeny, byla provedena analýza westernovým přenosem. Redukované supernatanty z tkáňových kultur a standardy IFN-beta-la byly podrobeny SDA-PAGE na gelech s gradientem 10-20% (Novex, San Diego, CA) a přeneseny na membrány PDVF. Imunoreaktivní pásy byly detekovány králičím polyklonálním antisérem anti-IFN-beta-la (č.447, Biogen. Inc., druhé antisérum, které bylo pěstováno proti IFN-beta-la), a pak následovalo ošetření oslím protikráličím IgG konjugovaném s HRP (Jackson ImmunoResearch, W. Grove, PA).

D. Hodnocení mutant interferonu-beta na vazbu k receptoru

Vlastnost vázat receptor mutant interferonu-beta popsaných v části C byla hodnocena s použitím dvou odlišných vazebných testů. Jeden test měřil vazbu mutant interferonubeta k fúznímu proteinu, IFNAR2/Fc, zahrnujícímu extracelulární doménu lidského receptoru IFNAR2 fúzovanou k části konstantní oblasti lidského IgG. IFNAR2-Fc byl exprimován v buňkách ovarií čínského křečka (CHO) a purifikován prostřednictvím afinitní chromatografie s protein A Sepharose podle instrukcí výrobce (Pierce Chem. Co., Rockford, IL, kat. č. 20334). Vazba mutant interferonu-beta k IFNAR2-FC byla měřena v testu ELISA. Destičky pro test ELISA byly připraveny přes noc ve 4 °C navázáním 50 μΐ/jamku myší proti-lidské IgGl monoklonální protilátky (CDG5-AA9, Biogen, Inc.) v koncentraci 10 g/ml ve vazebném pufru (50mM NaHCO₃, 0,2mM MgCl₂, 0,2mM CaCl₂, pH 9,6) na 96-jamkové destičky s plochým dnem. Destičky byly dvakrát promyty s PBS obsahujícím 0.05% Tween-20, a blokovány s 0,5% netučným

sušeným mlékem v PBS 1 hodinu při teplotě místnosti. Po dvou dalších promytích bylo do každé jamky přidáno 50 μΐ 1 g/ml IFNAR2-FC v 0,5% mléce v PBS obsahujícím 0,05% Tween-20 a inkubováno 1 hodinu při teplotě místnosti a destičky pak byly ještě dvakrát promyty. Vazba mutant interferonu-beta k IFNAR2-FC byla měřena přidáním 50 μΐ/jamku mutanty interferonu-beta v kondicionovaném médiu, sériově ředěné Eagleho médiem modifikovaným dle Dulbecca (DMEM) doplněném 10% fetálním bovinním sérem, a inkubací 2 hodiny ve 4 °C. Ředění mutanty interferonu-beta se typicky pohybovalo od přibližně 1 M dolů k lOpM. Po promytí byl interferon-beta navázaný na destičky detekován přidáním 50 μΐ/jamku koktejlu skládajícího se z 1:1000 ředěné králičí polyklonální antiinterferonové protilátky (č.447) plus oslího proti-králičího IgG značeného křenovou peroxidázou (HRP) (Jackson ImmunoResearch) , a probíhala inkubace 15 minut ve 4 °C. Po dvou promytích byl přidán HRP substrát a destička byla inkubována ve 4 °C před odečtem na čtecím zařízení pro destičky ELISA při absorbanci 450 nm. Data byla vynesena jako absorbance proti koncentraci mutant interferonu-beta a afinita vazby mutanty interferonu-beta k IFNAR2-Fc byla určována vynesením dat do jednoduché hyperbolické vazebné rovnice. Výsledky z těchto analýz jsou ukázány na obrázku 3, na kterém je vazebná afinita každé mutanty, zjišťovaná alespoň ve třech nezávislých pokusech, vyjádřena jako procento afinity měřené pro His₆-divoký typ interferonu-betala. Druhý test vazby receptorů byl použit pro měření afinity, se kterou se mutanty interferonu-beta vážou na buňky Daudi exprimující oba receptorové řetězce, IFNAR 1 a IFNAR2, které dohromady obsahují receptor pro interferon-beta. Tento test založený na FACS používal blokující monoklonálni protilátku namířenou proti extracelulární doméně IFNAR1, EA12 neobsazeného (volného (Biogen, lne.) pro odlišení od receptorů, na

Daudi (20 μΐ při který

2,5 x jamkové destičky a inkubovány 1 hodinu ve pro byl

10⁷ test interferonu-beta (20 μΐ v PBS) . Žádoucí sériová receptorů navázán interferon-beta. Buňky buněk/ml) byly naneseny na 96ELISA se dnem ve tvaru V °C s různými koncentracemi mutanty v pufru FACS, ředění mutant

5% FBS, 0,1% NaN₃ interferonu-beta se pohybovala v rozmezí od 0,5 M do 0,5 pM. přidáno 100 ng biotinylované myší anti-IFNARl

Ke každé jamce bylo monoklonální protilátky EA12 (10 μΐ) a destičky byly inkubovány další dvě minuty při teplotě (4 °C) . Pak byly místnosti před dvojím promytím pufrem FACS buňky inkubovány 3 0 minut ve 4 °C s 50 μΐ/jamku 1:200 naředěného streptavidinu konjugovaného s R-fykoerythrinem (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) , dvakrát promyty pufrem FACS, resuspendovány ve 300 μΐ pufru

FACS obsahujícím 0,5% polystyrénových zkumavek analyzovány průtokovou (Becton Dickinson). Data paraformaldehyd a přeneseny do

12x75 (Falcon 2052). Pak byly vzorky cytometrií na intenzita fluorescence byla vynesena do kanálu (MFCI) přístroji FACScan grafu jako průměrná proti koncentraci mutanty interferonu-beta, vazebné afinity jako koncentrace mutanty interferonu-beta byly definovány poskytující 50% inhibici barvení protilátky. Každá mutanta byla testována několikanásobně.

Obrázek 2 ukazuje vazebnou afinitu k receptorů pro každou mutantu interferonu-beta, zj ištěnou touto met odou,

His_e-divoký typ vyjádřenou jako procento afinity interferonu-beta-la v každém pokusu.

měřené pro

E. Hodnocení funkce mutant interferonu-beta

Mutanty interferonu-beta byly také testovány na funkční aktivitu s použitím in vitro testů pro antivirovou aktivitu a • · · · • · · · na schopnost interferonu-beta inhibovat buněčnou proliferaci. Pro každou mutantu byly prováděny minimálně tři antivirové testy, každý v trojím opakování. His₆-divoký typ interferonubeta-la byl do každého pokusu zahrnut jako reference.

Antivirové testy byly prováděny ošetřením buněk A54 9 z lidského plicního karcinomu (ATCC CCL 185) přes noc dvoj kovým sériovým ředěním mutant interferonu-beta v koncentracích, které překlenovaly rozsah mezi plnou antivirovou ochranou a žádnou ochranou před usmrcením buněk virem. Následující den byly buňky stimulovány pod dobu dvou dnů virem encefalomyokarditidy (ECMV) v ředění, které mělo za následek úplnou smrt buněk při chybění interferonu. Destičky pak byly vyvíjeny s metabolickým barvivém MTT (2,3-bis[2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-fenyl]-2H-tetrazolium-5-karboxyanilid) (M-5655, Sigma, St. Louis, MO). Zásobní roztok MTT byl připraven v koncentraci 5 mg/ml v PBS a sterilizován filtrací a 50 μΐ tohoto roztoku bylo naředěno do tkáňových kultur (100 μΐ na jamku). Po inkubaci při teplotě místnosti po dobu 30-60 minut byl roztok MTT/médium odstraněn, buňky byly promyty se 100 μΐ PBS a nakonec byla metabolizovaná barva solubilizována ve 100 μΐ 1,2N kyseliny chlorovodíkové v 90% isopropanolu. Životaschopné buňky (jak prokázáno přítomností barviva) byly kvantifikovány při absorbanci ve 450 nm. Data byla analyzována vynesením do grafu absorbance proti koncentraci mutanty interferonu-beta a aktivita každé mutanty byla definována jako koncentrace, ve které bylo usmrceno 50 % buněk. Obrázek 5 ukazuje aktivitu každé mutanty vyjádřenou jako procento aktivity měřené pro divoký typ interferonu-beta-la se značkou his v každém pokusu.

U mutant interferonu-beta byla také hodnocena funkce v antiproliferačním testu. Buňky Daudi lidského Burkittova • · · ·

lymfomu (ATCC č. CCL 213) byly vysety v koncentraci 2 x 10⁵ buněk/ml in RPMI 1620 doplněném 10% definovaným fetálním telecím sérem (Hyclone, Logan, Utah), a 2mM L-glutaminem. Každá jamka také obsahovala danou koncentraci mutanty interferonu-beta v konečném celkovém objemu 100 μΐ média na jamku, použité koncentrace interferonu-beta byly vybrány tak, aby překlenuly rozsah od maximální inhibice proliferace Daudi buněk k žádné inhibici (tj . plná proliferace) . Každá koncentrace testované mutanty interferonu-beta byla použita v duplikátech a ve všech pokusech byla zařazena série neošetřených buněk v duplikátech. Buňky byly inkubovány dva dny ve 3 7 °C, v inkubátorech s 5% CO₂, a potom byl do každé jamky přidán 1 Ci thymidinu s tritiem ( (methyl-³H) thymidin, Amersham TRK758) v 50 μΐ média a inkubován další 4 hodiny. Buňky byly sklízeny s použitím přístroje LKB pro sklízení buněk z destiček a byla měřena inkorporace thymidinu s tritiem při použití čtecího zařízení pro destičky LKB beta. Duplikáty experimentálních hodnot byly zprůměrněny a určeny standardní odchylky. Data byla vynesena do grafu jako průměrné počty za minutu proti koncentraci mutanty interferonu-beta a aktivita každé mutanty byla definována jako koncentrace požadovaná poskytnout 50 % maximální pozorované inhibice růstu. Pro každou mutantu byly prováděny několikanásobné testy. Obrázek 6 ukazuje výsledky vyjádřené jako procento aktivity nalezené pro divoký typ interferonubeta- la se značkou his v každém pokusu.

F. Vlastnosti mutant interferonu-beta

Bylo zjištěno, že divoký typ interferonu-beta-la s histidinovou značkou měl v antivirových a antiproliferačních testech aktivitu, která byla přibližně

3krát nižší než odpovídající aktivita nalezená u neznačeného v ·· · • · · · • ·

« · · · · · ., · · ..· . ·· · divokého typu interferonu-beta-la. Protože ze všech mutant interferonu-beta obsahovaly Al-E na svých N-koncích totožnou sekvenci značky his, byla účinky mutací na vlastnosti molekuly určovány srovnáním aktivit těchto mutant v antivirových, antiproliferačních a vazebných testech s aktivitou pozorovanou pro divoký typ interferonu-beta-la se značkou his. Při provádění tohoto srovnávání původci předpokládali, že odchylky aktivit mutant Al-E, ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la se značkou his, jsou kvalitativně a kvantitativně přibližně stejné, jako účinek, který by téže mutanty měly v nepřítomnosti N-koncové značky his. Odpovídající předpoklad pro značené nebo fúzni konstrukty jiných rozpustných cytokinů je obecně pokládán za platný odborníky pracující s technikou alaninové skenovací mutageneze (alanine scanning mutagenesis), zejména když in vitro funkční aktivita značeného nebo fúzního konstruktu je blízká aktivitě divokého typu cytokinů, jak je tomu v tomto případě (viz například Pearce, K.H. Jr, et al. , J. Biol. Chem., 272, 20595-20602, 1997, a Jones, J.T., et al. ,

J.Biol. Chem. 273, 11667-11674, 1998).

Data ukázaná na obrázcích 3-6 naznačují tři typy účinku, který byl vyvolán cílenou mutagenezí. Tento účinek může být výhodný pro vývoj interferonových léčiv za jistých okolností. Tyto tři typy účinku jsou: a) mutanty s vyšší antivirovou aktivitou než je aktivita divokého typu interferonu-beta-la (např. mutanta Cl), b) mutanty, které projevují aktivitu v obou testech, antivirovém a antiproliferačním, ale u kterých je antiproliferační aktivita disproporčně nízká vzhledem k antivirové aktivitě ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la (např. mutanty Cl, D a DE1), a c) funkční antagonisté (např. Al, B2, CD2 a DE1), které vykazují antivirovou a antiproliferační aktivitu, která je • · · · • ·

disproporčně nízká vzhledem k vazbě receptoru ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la. Je možné pozorovat, že některé mutanty spadají do více než jedné skupiny. Tyto skupiny jsou uvedeny v přehledu níže. I když původci charakterizovali tyto skupiny mutant vzhledem k těmto příkladům uvedeným v seznamu, je nutné si uvědomit, že další mutace v těchto oblastech mohou mít za následek podobný nebo dokonce zvýšený vliv na aktivitu:

a) Mutanta Cl má antivirovou aktivitu, která je přibližně 6 krát větší než aktivita divokého typu interferonu-beta-la se značkou his. Předpovídá se, že tato mutanta a další stejného typu jsou užitečné pro snížení množství interferonu-beta, které musí být podáváno pro dosažení daného stupně antivirového účinku. Očekává se, že snížení množství podávaného proteinu zredukuje imunogeničnost proteinu a může také snížit vedlejší účinky toxicity, která není založena na mechanismu účinku. Je předpovídáno, že mutace v této skupině jsou výhodné v situacích, kdy terapeutický prospěch podávání interferonu-beta vyplývá z jeho antivirových účinků a kdy antiproliferační účinky přispívají k toxicitě nebo nežádoucím vedlejším účinkům.

b) Relativní aktivity (% divokého typu) alaninových substitučních mutant v antivirovém a antiproliferačním testu jsou srovnány na obrázku 7. U většiny mutant (které jsou uvedeny na diagonální čáře) lze pozorovat koordinovaně změněné aktivity (tj. antivirové a antiproliferační aktivity, které se liší o stejný faktor od aktivit divokého typu interferonu-beta-la se značkou his). Ale několik mutant vykazuje větší odchylky v aktivitě v jednom testu relativně ke druhému, ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la se značkou his, jak je dokázáno posunem od diagonální linie. Tyto tři mutanty jsou uvedeny v tabulce níže. Mutanta Cl • ·· · ·· ··♦·

vykazuje antivirovou aktivitu, která je ~6 krát větší, než je aktivita divokého typu interferonu-beta-la se značkou his, ale jeho aktivita v antiproliferačním testu je podobná aktivitě divokého typu. Mutanta Cl má tudíž antivirovou aktivitu, která je zvýšena faktorem 5,2 proti jeho antiproliferační aktivitě, relativně k divokému typu interferonu-beta-la se značkou his. Podobně mutanta D projevuje 65 % aktivity divokého typu v antivirovém testu, ale pouze 20 % aktivity divokého typu v antiproliferačním testu, a tudíž má antivirovou aktivitu, která je zvýšena 3,4 krát proti jeho antiproliferační aktivitě ve srovnání s divokým typem. Mutanta DE1 projevuje 26 % aktivity divokého typu v antivirovém testu, ale pouze 8,5 % v antiproliferačním testu, a má tedy antivirovou aktivitu, která je zvýšena 3,0 krát proti jeho antiproliferační aktivitě ve srovnání s divokým typem interferonu-beta-la se značkou his. Když jsou podávány v koncentraci postačující pro dosažení požadovaného stupně antivirové aktivity, ukazují tyto mutanty proteinů podstatně nižší úroveň antiproliferační aktivity než protein divokého typu. Předpovídá se, že mutace v této skupině, jako ty ve skupině a) , jsou výhodné v situacích, kdy terapeutický prospěch podávání interferonu-beta vyplývá z jeho antivirových účinků a kdy antiproliferační účinky přispívají k toxicitě nebo nežádoucím vedlejším účinkům.

Mutanta	Antivirová (AV) aktivita (% divokého typu)	Antiproliferační aktivita (% divokého typu)	(AP)	AV/AP
Cl	571	109	5,2
D	65	19	3,4
DE1	26	8,5	3,0

·« ··♦·

c) Mutanty která je nízká s divokým typem tabulka níže).

antiproliferační

s antivirovou a antiproliferační aktivitou, vzhledem k vazbě receptorů, ve srovnání interferonu-beta-la se značkou his (viz

Mutanta Al proj evu j e antivirovou a aktivity, které jsou 2,0 krát a 1,8 krát větší než aktivity pozorované u divokého typu interferonubeta-la se značkou his, ale váže se na analogický receptor na buňkách Daudi s afinitou, která je 29 krát větší než u divokého typu. Vazba této mutanty na receptor IFN-beta je tudíž zvýšena přibližně 15 krát ve srovnání s antivirovou a antiproliferační aktivitou proteinu. Podobně mutanty B2, CD2 a DE1 vykazují zvýšení vazby proti antivirové aktivitě 4,6 krát, 4,6 krát a 18 krát, podle pořadí, a proti antiproliferační aktivitě 3,5 krát, 15 krát a 54 krát.

Předpovídá se, že tyto proteiny jsou užitečné jako funkční antagonisté aktivity endogenního IFN-beta, a možná dalších endogenních interferonů typu I, protože mají schopnost vázat a obsadit receptor a navíc vyvolat pouze malou část funkční odpovědi v cílových buňkách, jaká by byla pozorována u divokého typu IFN-beta.

Mutanta	Antivirová aktivita (AV) (% wt)	Antiproliferační aktivita (AP) (% wt)	Vazebná aktivita k buňkám (% hmot.)	Vazba/AV	Vazba/AP
Al	200	180	2900	15	16
B2	7,1	9,2	33	4,6	3,5
CD2	150	46	690	4,6	15
DE1	26	8,5	460	18	54

··♦♦ ··♦·

G. Vztah muteinu k trojrozměrné struktuře interferonu

Zatímco publikované krystalové struktury neglykosylováné formy myšího interferonu-beta (T. Senda, S. Saitoh a Y. Mitsui, Refined Crystal Structure of Recombinant Murine Interferon- at 2.15 Resolution, J. Mol. Biol., 253, 187207, 1995) a lidského interferonu alfa-2b (R. Radhakrishnan, L.J. Walter, A. Hrůza, P. Reichert, P.P. Trotta, T.L. Nagabhushan a M.R. Walter, Zinc Mediated Dimer of Human Interferon- 2b Revealed by X-ray Crystallography, Structure,

4, 1453-1463, 1996) poskytly modely pro polypeptidovou kostru lidského interferonu-beta, původci nedávno dořešili strukturu interferonu-beta-la v jeho glykosylovaném stavu (M. Karpusas, M. Nolte, C.B. Benton, W. Meier, W.N. Lipscomb, a S.E Goelz, The Crystal Structure of Human Interferon- at 2,2 Resolution, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94, 11813-11818,

1997) .

Výsledky mutačních analýz původců mohou být shrnuty vzhledem k trojrozměrné struktuře interferonu-beta-la (zde neuvedeno). Některé mutace vyvolaly snížení aktivity (2 až 5 krát snížení). Mutované oblasti odpovídaly substitucím uvedeným v tabulkách 1 a 2.

Mutace, které jsou nejvýznamnější, co se týče jejich účinku na funkci, měly za následek dramatické snížení jak aktivity, tak vazby buněčného povrchového receptoru. Mutace v této oblasti (A2 helix, AB a AB2 smyčky a E helix) odpovídají mutacím ve vazebném místu IFNAR2, protože žádná z těchto mutant nevázala v testech původců IFNAR/Fc.

I když tyto mutace, které byly důležité pro vazbu

IFNAR2, také ovlivnily buněčnou vazbu, vazebné vlastnosti buněčného povrchu jsou také ovlivněny zbytky v dalších oblastech molekuly (Bl helix, C2 helix). Na trojrozměrných modelech (zde neuvedených), které zobrazují působení ·· »···

slaninových substitučních mutant, je možné pozorovat, že N-koncová oblast, C-koncová oblast a glykosylovaná oblast C helixu molekuly IFN-beta-la neleží ve vazebném místě receptorů. Mutace v těchto oblastech nesnížily biologickou aktivitu nebo vazbu buněčného povrchového receptorů.

Příklad 2

Konstrukce plazmidů pro expresi fúzního proteinu interferonbeta-la (IFN-beta/Fc)

Pro vytvoření expresního plazmidů byla použita technologie PCR kódujícího DNA sekvenci lidského IFN-beta fúzovanou k Fc části molekuly těžkého řetězce myšího IgG2a. Plazmidový vektor pDSW247 (viz příklad 1) je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , ze kterého byl odstraněn gen EBNA-1. Tento plazmid byl použit pro konstrukci expresního vektoru použitelného pro přechodnou expresi proteinu v buňkách EBNA 293 z lidských ledvin (Invitrogen, Carlsbad, CA, Shen, E.S., et. al., 1995, Gene, 156, 235-239). Byl navržen tak, aby obsahoval signální sekvenci lidské adhezivní molekuly cévní buňky I (VCAM-1) v rámci a v protisměru od sekvence interferonu beta a sekvencí Ig.

Expresní kazeta fúzního proteinu byla sestavena z několika fragmentů DNA. Aby se získal fragment DNA kódující lidský gen IFN-beta, byl použit cDNA subklon lidského IFNbeta (GenBank přístupové č. E00029) jako templát pro PCR s použitím primerů:

5'-GGTGGTCTCACATGAGCTACAACTTGCTTGGATTCCTACAAAGAAGC (sekvence id. č. 31: BET-025) a ···· • · · • · • · · • · ·

5'-GCCCTCGAGTCGACCTTGTCATCATCGTCGTTTCGGAGGTAACCTGTAAG (sekvence id. č. 32: BET -026), které také obsahovaly štěpné místo restrikčního enzymu (Bsal) v protisměru od prvního kodonu IFN-beta. 3'

PCR primer (sekvence id. č.

eliminoval terminační kodon

IFN-beta a inkorporoval j ak do rámce enterokinázovou spojovací sekvenci (DDDDK) místo restrikčního enzymu (Xhol), použitelné do expresního vektoru. Místo Bsal zavedené tak terminální pro subklonování v protisměru od kódující sekvence IFN-beta umožnilo původcům sekvenci VCAM-1 ligovat signální do protisměru a v rámci s kódující sekvencí genu IFN-beta.

vytvářena pomocí

Tato signální sekvence VCAM-1 byla také

PCR s použitím páru primerů:

5'-CAAGCTTGCTAGCGGCCGCGG-3' (sekvence id. č. 33: BET-023 a

BET-024), které obsahovaly 5' štěpné místo restrikčního enzymu (Notl, pro ligaci do klonovacího místa Notl v pDSW247) restrikčního enzymu (Bsal, pro ligaci do 5' PCR fragmentu interferonu-beta-la). Templát pro PCR byla cDNA lidské adhezivní molekuly cévní přístupové číslo X53051).

a 3' štěpné místo buňky I (VCAM-1) (GenBank

Aby prováděny byl vytvořen fúzní následující postupy.

gen IFN-beta-la/Fc, byly myšího IgG2a byl

Fragment odstraněn z pEAG293 gelovou purifikací

DNA fragmentu po štěpení SalI+BamHI.

Plazmid pEAG293 je subklon kloubové domény, domén CH2 a

CH3 myšího IgG2a (GenBank přístupové číslo V00798) v Bluescript IISK+ (Stratagene, LaJolla

CA, katalog, č. 212205). Následující páry primerů pro PCR:

5'-AGGTSMARCTGCAGSAGTCW-3' (sekvence id. č.

nebo

G, M=A nebo C, R=A nebo G, W=A nebo T, a ' -CTGAGCTCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAA.GCTCTT-3 ' (sekvence id.

č. 36) vytvořily hraniční místa Sáli a

Notl na 5' a ···· ·· ··««

3' koncích kazety, v příslušném pořadí. Kazeta myší domény IgG2a Fc se liší od sekvence z GenBank v jedné bázi (kodon V369), vytvářející umlčenou mutaci. Z této IgG2a Fc kazety je tudíž exprimován divoký typ proteinu Fc.

DNA fragment obsahující signální sekvenci VCAM-1 fúzovanou ke genu huIFN-beta s C-koncovou enterokinázovou spojovací sekvencí byl vystřižen z pCMG258 štěpením s Notl až

BamHl a původním v ráme i

Místo Sáli se vyskytovalo na lokalizováno ihned po

IFN-beta.

směru a purifikován na gelu.

plazmidu pDSW247 a je kódující sekvencí připraven purifikací na gelu příklad 1) .

vektor kódující troj čestná ligace expresní plazmid sekvenci VCAM-1 ve fúzi s genem pro zralý lidský IFN-beta, byl

BamHl (viz pDSW247

Aby se sestavil fúzi IFN-beta-l/lgG2, s použitím výše uvedených byl nazván pCMG261 a obsahoval

Plazmidový fragmentu konečný expresní byla prováděna fragmentů. Tento signální vektor

Notl + enterokinázovou spojovací sekvenci a Fc doménu myšího IgG2a. Kompletní DNA (sekvence id. č. 1) a proteinová (sekvence id. č. 2) sekvence fúzního proteinu jsou uvedeny na obrázku 2.

Příklad 3

Produkce fúzního proteinu interferonu-beta-la v savčích buňkách

Expresní vektor rekombinantního IFN-beta/Fc, pCMG261, byl přechodně transfekován do buněk EBNA 293 z lidských ledvin, aby byla dosažena exprese fúzního proteinu IFN-betala podle vynálezu. Tento rekombinantní expresní plazmid byl transfekován podle lipofektaminového protokolu (katalog, č.

18324-020, Life Techonologies) do buněk EBNA 283 z lidských ·»·· «r ···· ledvin podle protokolu výrobce (Life Technologies, Gaithersburg, MD, Hawley-Nelson, P., Ciccarone, V., Gebeyehu, G. Jessee, J., Felgner, P.L., 1993, Focus 15.73) s použitím až 3 g plazmidové DNA pro lOOmm misky pro tkáňové kultury pro buňky EBNA 293. Den po lipofektaminové transfekci buněk byla média nahrazena růstovým médiem (Eagleho médium modifikované dle Dulbecca, 10% fetální bovinní sérum, 4mM glutamin, 250 g Gentecinu/ml (Life Technologies, Gaithersburg, MD)). Kondicionovaná média byla sklízena 3 až 4 dny později a byla určována koncentrace IFN-beta-l-Fc tak, jak je popsáno níže.

Produkce fúzního proteinu IFN-beta/Fc v jiných savčích buňkách a expresních systémech pro prokaryotické buňky může být také prováděna po přenesení proteinové kódující oblasti pro fúzní protein do příslušných expresních vektorů pro tyto systémy. Alternativní expresní systémy zahrnují savčí buněčné jako jsou například buňky ovarií čínského křečka (CHO) (Barsoum, J. , 1995, Methods v Mol. Biol. 48, kapitola 18,

225-237) a myší buňky NS-0 (Rossman, C. et al., 1996, Protein Expression and Pur., 7, 335-342), a buňky ledvin opice COS7 (Ettinger, R. et. al. , 1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93:23, 13102-13107). Další eukaryotické expresní systémy, které by mohly být použitelné, jsou kvasinky Pichia pastoris (Eldin, P.E. et al. , 1997, I. Immun. Methods, 201, 67-75) a

Saccharomyces cerevisiae (Horwitz, A.H., 1988, Proč. Nati.

Acad. Sci. USA, 85, 8678-8682).

Kvantifikace stupně exprese proteinu IFN-beta-la-Fc ve tkáňových supernatantech z transfekovaných buněk EBNA 293 byla prováděna pomocí testu ELISA s použitím IgG frakce králičích polyklonálních protilátek anti-IFN-beta-la purifikované metodou proteinu A (antigen byl purifíkovaný IFN-beta-la, Biogen, lne.) pro navázání na 96-jamkové

· · • · ···· destičky. Protilátka detekuje standardy IFN-beta-la a tkáňové supernatanty v rozmezí koncentrace interferonu mezi 10 ng/ml a 0,3 ng/ml. Pro detekci navázaných interferonu byly použity biotinylovaný králičí polyklonální anti-IFN-beta-la (stejné protilátky jako uvedeny výše) a křenová peroxidáza konjugovaná se streptavidinem. Pro potvrzení hodnot získaných z testu ELISA byla prováděna analýza westernovým přenosem, kdy redukované tkáňové supernatanty a standardy IFN-beta-1 byly separovány na 5-20% Tris-glycinových gelech (Novex, San Diego, CA) , přeneseny na membrány PVDF (Amersham Life Science, lne., Cleveland, OH) a detekovány odlišným králičím polyklonálním sérem (pěstovaným proti IFN-beta-la), a pak následovaly oslí proti-králičí IgG protilátky konjugované s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)

Příklad 4

Antivirová aktivita fúzního proteinu IFN-beta-la/myší IgG2a

Buňky lidského plicního karcinomu (A549) byly předem ošetřovány 24 hodin s IFN-beta-la nebo IFN-beta-myší IgG2a (61, 41, 27, 18, 12, 8,2, 5,5, 3,7, 2,5, 1,6 pg/ml) před stimulací virem encefalomyokarditidy virus (EMCV). Po dvoudenní inkubaci s virem byly živé buňky barveny roztokem XTT:PMS (2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-2H-tetrazolium-5-karboxanilid, vnitřní sůl: fenazinmethosulfát, v koncentraci 333 g/ml a 2ng/ml, v daném pořadí, v pufrovaném solném roztoku) a detekovány spektroskopií v 450nM. Test byl prováděn ve trojím opakování pro každou koncentraci IFN.

• ···· · · · · · · ·· · • · · ·· · ···· • · · · · φ ·· • · · 9 · · ···· ·· · · · · · · ···· ·· 4 ·····

Na obrázku 8 jsou ukázány standardní odchylky jako svislé úsečky. Bylo zjištěno, že 50% cytopatický účinek pro IFN-beta-la byl přibližně 0,4 pM. Pro IFN-beta-myší IgG2a byl 50% cytopatický účinek 0,15 pM.

Příklad 5

Konstrukce a produkce fúzního proteinu lidský interferon beta-la/lidský IgGl Fc

A. Konstrukce fúzního proteinu lidský interferon betala/lidský IgGl Fc

PCR technologie byla použita pro vytvoření expresního plazmidu kódujícího DNA sekvenci lidského IFN beta fúzovanou s částí Fc (kloubová doména, domény CH2 a CH3) molekuly těžkého řetězce lidského IgGl.

EBNA konstrukt:

Plazmidový vektor pCH269 je derivát pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ze kterého byl odstraněn gen EBNA-1. Plazmid byl použit pro konstrukci expresního vektoru použitelného pro přechodnou expresi proteinu v buňkách EBNA 293 z lidských ledvin (Invitrogen, Carlsbad, CA, Shen, E.S., et. al. , 1995, Gene, 156, 235-239) .

Expresní kazeta fúzního proteinu byla sestavena ze tří fragmentů DNA: fragment Notl/Sall kódující signální sekvenci VCAM-1 v rámci a fúzovanou se sekvencí kódující lidský IFN beta, fragment Sall/Notl kódující kloubovou doménu, domény CH2 a CH3 lidského IgGl a fragment Notl EBNA expresního vektoru pCH269.

• · · · · · · · · · · « · ·· · ·· · ···

Dva nezávislé fragmenty Notl/Sall kódující zralou signální sekvenci VCAM-1 v rámci a fúzovanou ke genu lidského IFN beta byly vytvořeny technologií PCR. PCR templát byl plazmid pCMG258 (viz příklad 2 výše), který kóduje zralou signální sekvenci VCAM-1 v rámci a fúzovanou ke genu lidského IFN beta, který sám je také v rámci a fúzovaný k enterokinázové spojovací sekvenci. Byly použity dvě sady primerů pro PCR. Jedna sada primerů:

5'-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3' (sekvence id. č. 37) a 5'- ATACGCGTCGACGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3' (sekvence id. č. 38) vnesla změnu aminokyselin od G do C v pozici 162. Tento fragment byl nazván lidský IFN beta-C 162. Druhá sada primerů:

5'-AGCTTGCTAGCGGCCGCGGCCTCACTGGCTTCA-3¹( sekvence id. č. 39) a 5'-TACACGTCGACGCTGCCACCACCGCCGTTTCGGAGGTAACATGTAAGTCTG-3 (sekvence id. č. 40) také zavedla substituci aminokyselin G162 až C162 a změnila enterokinázovou spojovací sekvenci (DDDDK) na GGGGS spojovací sekvenci v rámci a fúzovanou k lidskému genu IFN beta. Tento fragment byl nazván lidský IFN beta-C162/G4S. Obě sady primerů obsahovaly 5' Notl místo pro umožnění ligace do pCH269, a 3' Sáli štěpné místo pro umožnění ligace s fragmentem Sáli/ Notl lidského IgGl.

Lidský fragment IgGl, který kóduje kloubovou doménu a domény CH2 a CH3 lidského IgGl, byl připraven pomocí štěpení restrikčními enzymy (Sáli/ Notl) plazmidu pEAG409, derivátu plazmidu SABI44 (popsaného v patentu Spojených Států č. 5 547 853). Fragment byl vyříznut a purifikován přes gel. EBNA expresní vektorový plazmid pCH269 byl štěpen Notl a purifikován přes gel.

Dva fúzní konstrukty lidského IFN beta-lidského IgGl Fc byly vytvořeny dvěma troj čestnými ligacemi. Jeden konstrukt, nazvaný ZL6206, obsahoval spojovací sekvenci G4S, druhý

ΊΟ konstrukt, nazvaný ZL5107, je přímá fúze. Kompletní sekvence DNA a proteinu otevřeného čtecího rámce přímé fúze (viz obrázek 10) jsou uvedeny v sekvenci id. č. 41 a v sekvenci id. č. 42, podle pořadí. Kompletní sekvence DNA a proteinu otevřeného čtecího rámce fúze spojovací sekvence (viz obrázek 11) jsou uvedeny v sekvenci id. č. 43 a v sekvenci id. č. 44, podle pořadí.

CHO konstrukt:

Byl vytvořen konstrukt v buňkách CHO s trvalou expresí fúze lidský IFN beta-lidský IgGl Fc, který obsahoval lidský IFN beta přímo spojený s lidským IgGl Fc. Fragment lidský IFN beta-lidský IgGl Fc byl vystřižen z plazmidu ZL5107 s Notl a purifikován přes gel, byl ligován do místa Notl v pEAG347 (expresní vektor obsahující tandem časného promotoru SV40 a hlavního pozdního adenovirového promotoru [pocházejícího z plazmidu pAD2beta], jedinečné klonovací místo Notl následované signály pro pozdní ukončení transkripce SV40 a polyA [pocházející z plazmidu pCMVbeta] . pEAG347 obsahuje plazmidovou kostru pocházející z pUC 19 a dhfr pro MTX selekci a amplifikaci v transfekovaných buňkách CHO).

B. produkce fúzního proteinu lidský interferon-beta-la/lidský IgGl Fc

Přechodná transfekce fúzních konstruktů lidského IFN beta do buněk EBNA293:

Rekombinantni expresní vektory IFN-beta/lidský IgGl Fc popsané výše byly přechodně transfekovány do buněk EBNA 293 z lidských ledvin pro dosažení exprese fúzního proteinu IFNbeta- la podle vynálezu. Tyto rekombinantni expresní plazmidy byly transfekovány podle lipofektaminového protokolu (katalog, č.18324-020, Life Technologies) do buněk z lidských ledvin EBNA 293 podle protokolu popsaného v příkladu 3 výše.

Stabilní transfekce dhfr- CHO buněk fúzním konstruktem lidský IFN-beta-la/lidský IgGl Fc (bez spojovací sekvence):

Expresní vektor dhfr obsahující rekombinantní IFNbeta/lidský IgGl Fc (bez spojovací sekvence) popsaný výše byl trvale transfekován do buněk, aby bylo dosaženo exprese fúzního proteinu IFN-beta-la podle vynálezu. Tento rekombinantní expresní plazmid byl transfekován elektroporací a selekce pozitivních klonů byla prováděna podle následujícího protokolu:

Plazmidová DNA (20 g) štěpena s BglII byla precipitována, resuspendována v 800 μΐ pufru HEPES a přidána k 10xl0⁷ buněk/ml CHO. Po elektroporací byly buňky pěstovány 2 dny v kompletním médiu DMEM. Pak byly buňky rozděleny na 20 až 40 lOcm misek s kompletním DMEM/dialyzovaným 10% FBS a pěstovány 5 dnů před přenesením buněk na selekční média se stoupající koncentrací (50-200 ng/ml) MTX v DMEM po dobu dvou týdnů. Na konci dvou týdnů byly selektovány jednotlivé kolonie buněk a namnoženy. Supernatanty pocházející z 22 klonů CHO byly testovány v antivirových testech.

Aktivita:

Antivirová aktivita fúzních proteinů byla zjištována v testech CPE, jak popsáno v příkladu 4. Na základě specifické aktivity 60 MU/mg standardu interferonu-beta-la použitého v tomto testu, byla aktivita přechodně (EBNA) exprimovaného fúzního proteinu lidský interferon-betala/lidský IgGl Fc se spojovací sekvencí 900 U/ml a aktivita bez spojovací sekvence byla 440 U/ml. Aktivita fúzního proteinu exp r linované ho v buňkách CHO lidský interf eron-betala/lidský IgGl Fc byla 50 U/ml.

Příklad 6

Měření antivirové aktivity interferonu-beta-la v plazmě myší ošetřených interferonem-beta-la a fúzním proteinem interferon-beta-la/myší IgG2a

Myším (C57/B16) byla podána do žíly v ocasu i.v. injekce 50 000 jednotek interferonu-beta-la (volného) nebo 5 000 jednotek fúzního proteinu interferon-beta-la-myší IgG2a. Jako kontrola byl podáván stejný objem fosfátového pufru.

Krev byla odebírána retroorbitálními krevními odběry v různým časových bodech (okamžitě, 0,25, 1, 4, 24 a 48 hodin) po injekci interferonu beta. V každém časovém bodě byly alespoň tři myši. Plná krev byla odebírána do zkumavek obsahujících antikoagulans, buňky byly odstraněny a zbylá plazma zmražena až do doby testování. Vzorky plazmy byly naředěny 1:10 médiem bez séra a ponechaly se protéci přes 0,2 m filtr ve stříkačce.

Naředěné vzorky pak byly titrovány do určených jamek na 96-jamkové destičce pro tkáňové kultury obsahující buňky A549. Na každé destičce byla testována ředění standardů interferonu-beta-la (10, 6,7, 4,4, 2,9, 1,3, 0,9 a 0,6 U/ml

AVONEX) a čtyři vzorky plazmy. Buňky byly předem ošetřeny se vzorky po 24 hodin před stimulací virem EMC. Po dvoudenní inkubaci s virem byly životaschopné buňky barveny roztokem MTT (5 mg/ml ve fosfátovém pufru) po dobu 1 hodiny, promyty fosfátovým pufrem a solubilizovány s 1,2N HC1 v isopropanolu. Jamky pak byly odečítány ve 450 nm. Pro každou destičku byly vytvořeny standardní křivky a použity pro určení množství aktivity interferonu-beta-la v každém testovaném vzorku. Aktivita ve vzorcích od různých myší byla vynesena do grafu proti časovým bodům na obrázku 9.

Pomalejší ztráta fúze interferonu-beta-la z krevního oběhu jako funkce času ukazuje, že biologický poločas vzorku fúzního proteinu je mnohem delší než poločas nemodifikovaného kontrolního interferonu-beta-la. Druhé velmi významné zjištění z této studie bylo to, že velmi málo fúzního proteinu bylo ztraceno v průběhu distribuční fáze, jak prokázáno podobnými vysokými hladinami aktivity v 15 a 60 minutách. Data ukazují, že na rozdíl od kontrol interferonubeta-la, je distribuce fúzního proteinu interferonu-beta-la převážně omezena na cévní zásobení.

Příklad 7

Srovnávací farmakokinetické a farmakodynamické studie na primátech

Komparativní studie byly prováděny s fúzí interferonubeta-la a nativním interferonem-beta-la (jako neformulovaný volný meziprodukt AVONEX® interferonu-beta-la ve lOOmM fosfátu sodném, 200mM NaCI, pH 7,2) pro zjištění jejich relativní stability a aktivity na primátech. V těchto studiích byla srovnávána farmakokinetika a farmakodynamika fúze interferonu-beta-la u primátů s nativním interferonembeta-la a racionální závěry mohou být rozšířeny na člověka.

Zvířata a metody

Návrh studie

Toto byla studie s paralelními skupinami a opakovanými dávkami pro vyhodnocení komparativní farmakokinetiky a farmakodynamiky fúzního proteinu interferonu-beta-la a nefúzovaného interferonu-beta-la.

Pro tuto studii byly použiti zdraví primáti (výhodně makak rhesus, Macaca mul lata) . Před podáváním dávek byly u při dvou testované hodin všech zvířat vyšetřeny příznaky nemocí veterinářem příležitostech během 14 dnů před prvním podáním sloučeniny, jedno vyšetření muselo být v průběhu před prvním podáním testované sloučeniny. Pouze zdravá zvířata dostala testovanou sloučeninu. Vyhodnocení zahrnovalo obecné fyzikální vyšetření a krevní odběry před podáním dávky pro vyšetření základních klinických patologických ukazatelů a výchozí hladiny protilátek proti interferonu-beta-la. Všechna zvířata byla zvážena a během 24 hodin před podáním testované sloučeniny byla zaznamenávána tělesná teplota.

Bylo zaregistrováno dvanáct zvířat a rozděleno do skupin po třech, které dostávaly 1 MU/kg interferonu-beta-la buď jako fúzovaný nebo nefúzovaný, interferon-beta-la. Podávání bylo intravenózně (IV) . Šest (SC) nebo ale jinak prováděno buď samců dostalo identický subkutánně testovanou

IV způsobem(3/ošetření) sloučeninu SC způsobem (3/ošetření). Všechna zvířata musela být nedotčena ošetřením interferonem-beta, čili tzv. naivní. Každému zvířeti byly podávány dávky ve dvou sloučeninu testovanou a dalších 6 samců dostalo dobách, dávky byly odděleny čtyřmi týdny, ml/kg.

Pro farmakokinetické testování byla

Obj em dávky byl 1,0 odebírána krev v 0,

0,083, 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2, 4, 6,

8, 12, 24, 48, 72 φ «φφφ · · φφφφ φφ φφ φ φφ φ φφφ • φ φφφ φ φ φ φ φφφφ ··· φ · φφφ · · φφφ» φφ · φφ φ a 96 hodin po každé injekci. V 0, 24, 48, 72, 96, 168, 336,

504 hodin po podávání studovaného léčiva byly také odebírány vzorky krve pro měření markéru biologické reakce indukované interferonem, sérového neopterinu.

Hodnocení během období studie zahrnují klinická vyšetřování známek toxicity prováděná 30 minut a 1 hodinu po podání dávky. Byla prováděna denní pozorování přes klec a byl zaznamenáván celkový vzhled, příznaky toxicity, neklid a změny chování. Během 21 dnů po podání dávky byla zaznamenávána tělesná hmotnost a tělesná teplota.

Testovací metody

Hladiny interferonu-beta v séru byly kvantifikovány s použitím testu na hodnocení cytopatického účinku (CPE). Test CPE měřil stupeň antivirové aktivity zprostředkované interferonem. Stupeň antivirové aktivity ve vzorku odráží počet molekul aktivního interferonu obsažených ve vzorku v okamžiku, kdy je odebírána krev. Tento přístup byl standardní metodou pro stanovení farmakokinetiky interferonubeta. Test CPE použitý v předkládané studii detekuje schopnost interferonu-beta chránit buňky lidského plicního karcinomu (A549, č. CCL-185, ATCC, Rockville, MD) před cytotoxicitou způsobenou virem encefalomyokarditidy (EMC). Buňky byly předem inkubovány 15 až 20 hodin se vzorky séra, aby se umožnila indukce a syntéza proteinů, které lze indukovat interferonem, a které pak zvyšují antivirovou reakci. Potom byl přidán virus EMC a inkubován dalších 30 hodin před tím, než se vyhodnotila cytotoxicita s použitím barvení krystalovou violetí. Na každé testované destičce byl současně se vzorky testován vnitřní standard interferonubeta, jakož i vnitřní standard interferonu-beta-Ig. Tento standard byl kalibrován proti referenčnímu standardu přirozeného interferonu lidských fibroblastů (WHO Second Internátional Standard for Interferon, Human Fibroblast, Gb23-902-53). Každá testovaná destička také zahrnovala jamky s kontrolou buněčného růstu, které neobsahovaly ani interferon-beta jakéhokoliv druhu, ani EMC, a jamky s virovou kontrolou, které obsahovaly buňky a EMC, ale neobsahovaly interferon-beta. Pro zjišťování účinku, byl-li jaký, vzorků na buněčný růst byly také připraveny kontrolní destičky obsahující standardy a vzorky. Tyto destičky byly obarveny bez přidání viru.

Vzorky a standardy byly testovány v duplikátech na každé ze dvou opakujících se testovacích destiček, poskytující čtyři údaje o vzorku. Byl uváděn geometrický průměr hodnot koncentrace ze čtyřech opakovaní. Limit detekce v tomto testu je 10 jednotek (U)/ml.

Sérové koncentrace neopterinu byly určovány na oddělení klinické farmakologie s použitím komerčně dostupných testů.

Farmakokinetické a statistické metody

Software RstripTM (MicroMath, lne., Salt Lake City, UT) byl použit pro prokládání (fitování) dat pomocí farmakokinetických modelů. Geometrické průměry hodnot koncentrace byly vyneseny do grafu proti času pro každou skupinu. Protože výsledky testu jsou vyjádřeny jako ředění, jsou geometrické průměry považovány za vhodnější, než aritmetické průměry. Hladiny sérového interferonu byly srovnány podle výchozích hodnot a nedekovatelné koncentrace v séru byly stanoveny na 5 U/ml, což představovalo jednu polovinu spodního limitu detekce.

Pro data z IV infúzí byl fitován IV infúzní model se dvěma kompartmenty pro detekovatelné koncentrace v séru pro • · · ·

každý subjekt a SC data byla fitována podle injekčního modelu se dvěma kompartmenty.

Byly vypočítány následující farmakokinetické parametry:

i) pozorovaná vrcholová koncentrace, C_max (U/ml) ii) oblast pod křivkou od 0 do 48 hodin, AUC se vypočetla pomocí lichoběžníkového pravidla, iii) poločas eliminace, a, z dat získaných při IV infúzi (když byl použit IV způsob podávání):

iv) poločas distribuce (hodiny, h),

v) clearance (ml/h), vi) zjevný distribuční objem, Vd (1).

Pro výpočet poločasu eliminace po SC a IM injekci byl použit software WinNonlin (verze 1.0, Scientific Consulting lne., Apex, NC).

Pro neopterin jsou uvedeny hodnoty aritmetického průměru v každé skupině. Byla vypočtena E_max, maximální hodnota změny proti základní hodnotě. C_max, AUC a E_max byla pak analyzovány jednosměrnou analýzou rozptylu pro srovnání skupin lišících se dávkami.

Hodnoty C_max a AUC byly logaritmicky transformovány před analýzou, jsou uváděny geometrické průměry.

Příklad 8

Antiangiogenní účinky fúze interferonu-beta-la: Hodnocení schopnosti fúze interferonu-beta-la inhibovat proliferaci endotelových buněk in vitro

Buňky z lidského cévního endotelu (Cell Systems, katalog, č. 2V0-P75) a buňky endotelu kožních kapilár (Cell • φφφφ φφ ···· «φ • φ · φ φ φ φφφ φ φ φφφφ φφφ φ φ φφφ φ φ φφφφ φφ φ φφ φ

Systems, katalog. Č. 2M1-C25) byly udržovány v kultuře s médiem ze soupravy CS-C Medium Kit (Cell Systems, katalog, č. 4Z0-500). Čtyřiadvacet hodin před pokusem byly buňky ošetřeny trypsinem, resuspendovány v testovacím médiu, 90% M199 a 10% fetální hovězí sérum (FBS), a upraveny na požadovanou hustotu. Pak byly buňky vysety na 24 nebo 96jamkové destičky potažené želatinou, s hustotou 12500 buněk/jamka nebo 2000 buněk/jamka.

Po inkubaci přes noc bylo testovací médium nahrazeno čerstvým médiem obsahujícím 20 ng/ml lidského rekombinantního bazického fibroblastového růstového faktoru bFGF (Becton Dickinson, katalog, č. 400600) a různé koncentrace fúzovaných nebo nefúzovaných proteinů interferonu-beta-la nebo pozitivní kontroly (jako pozitivní kontrola lze užít endostatin nebo protilátka k bFGF) . Celkový objem byl nastaven na 0,5 ml ve 24jamkové destičce nebo 0,2 ml v 96jamkové destičce.

Po dvaasedmdesáti hodinách byly buňky ošetřeny trypsinem pro počítání na Coulteru, zamraženy pro odečítání fluorescence CyQuant nebo značeny [³H] thymidinem.

Tento in vitro test sloužil k hodnocení molekul lidského interferonu-beta podle vynálezu z hlediska účinků na proliferaci endotelových buněk, která může být indikátorem antiangiogenních účinků in vivo. Viz např. O'Reilly, M.S., T. Boehm. , Y. Shing, N. Fukal, G. Vasios, W. Lané, E. Flynn, J. Birkhead, B. Olsen, J. Folkman, 1997, Endostatin: An Endogenous Inhibitor of Angiogenesis and Tumor Growth, Cell,

88, 277-285.

Příklad 9

In vivo model pro testování antiangiogenního a antineovaskularizačního účinku fúze interferonu-beta-la/lg

Pro testování antiangiogenních a antineovaskularizačních účinků molekul podle vynálezu byla vyvinuta celá řada modelů. Některé z těchto modelů byly popsány v patentech USA 5 733 876 (31. března 1998, Method of inhibiting angiogenesis) a 5 135 919 (4. srpen 1992, Method and pharmaceutical composition for the inhibition of angogenesis). K dalším testům patří např. test s chorioalantoidní membránou bez skořápky (CAM) podle S. Taylor a J. Folkman, Nátuře, 297, 307, 1982 a R. Crum, S. Szabo a J. Folkman, Science, 230, 1375, 1985, model angiogeneze se vzdušným dorzálním vakem u myší podle J. Folkman, et al., J. Exp. Med., 133, 275, 1971, a test s mikrokapsou rohovky podle Gimbrone, M.A.Jr. et al. , Nati. Cancer Inst. , 52, 413, 1974, kde je vaskularizace rohovky indukována u dospělých samců laboratorních potkanů kmene Sprague-Dawley (Charles River, Japonsko) implantací 500 ng basického FGF (hovězí, R and D systems, lne.) impregnovaného v EVA (kopolymer ethylen-vinylacetátu) peletech do každé rohovky.

K dalším metodám testování fúzí interferonu-beta/lg na antiangiogenní účinky na zvířecím modelu patří (i když výčet tím není omezen) screeningové testy nových potenciálních protirakovinných léčiv, jak byly popsány v původní publikaci Cancer Chemotherapy Reports, Part 3, Vol. 3, No. 2, září 1972 a v suplementu In Vivo Cancer Models, 1976-1982, NIH Publ. No. 84-2635, únor 1984. Vzhledem k mezidruhové bariéře pro interferony typu I, pro hodnocení antiangiogenní aktivity fúzí interferonu-beta na modelech hlodavců, byly připraveny přípravky fúzí interferonu-beta/lg hlodavců. Screeningové metody jsou ukázány na příkladu protokolu pro testování antiangiogenního účinku fúzí myšího interferonu-beta/lg na subkutánně implantovaný Lewisův plicní karcinom.

Původ nádorové linie

Vznikla spontánně v r. 1951 jako karcinom plic u myši C57BL/6.

Souhrn testovacích procedur

Fragment nádoru byl implantován do subkutánně do axilární oblasti myší B6D2F1. Testované činidlo (např. fúzní protein podle vynálezu) byl podáván v různých dávkách subkutánně (SC) nebo intraperitoneálně (IP) po několik dní po implantaci nádoru. Měřeným parametrem pak byl medián času přežití. Výsledky jsou uvedeny jako procenta času přežití kontroly.

Zvířata

Propagace nádoru: myši C57BL/6 Testovací zvířata: myši B6D2F1

Hmotnost: myši by měly mít hmotnost s rozpětím 3 g s minimální hmotností u samců 18 g a samic 17 g

Pohlaví: zvířata jednoho pohlaví jsou užita pro test i kontrolu v jednom pokusu

Zdroj: jeden zdroj, pokud je to možné, pro všechna zvířata v jednom pokusu

Rozsah experimentu zvířat v jedné testovací skupině ···· • · · · • · · · · · 9 · • · · ♦ · · · • 9 · · · · · ·· • · · · · ·· ···>· · · «· ·

Přenos nádoru

Propagace nádoru:

Fragment: připravit 2 až 4 mm fragment nádoru SC dárcovského nádoru

Doba: 13. až 15. den

Místo: fragment implantován SC do axilární oblasti vpichem v ingvinální oblasti

Testování:

Fragment: příprava fragmentu o velikosti 2-4 mm ze s.c.

dárcovského tumoru.

Doba: 13. až 15. den

Místo: implantace fragmentu s.c. do axilární oblasti vpichem v ingvinální oblasti.

Testovací schéma:

Den 0: implantace tumoru. Založení bakteriálních kultur.

Testování pozitivní kontrolní sloučeniny v každém experimentu s lichým číslem. Příprava materiálů. Denní záznam úmrtí.

Den 1: kontrola kultur. Odstranění kontaminovaného experimentu. Randomizace zvířat. Ošetřování dle instrukcí (v den 1 a následující dny).

Den 2: Opětná kontrola kultur. Odstranění kontaminovaného experimentu.

Den 5: Hodnocení dne 2 a den počátečního testu vyhodnocení toxicity přípravku.

Den 14: Kontrolní den časného úmrtí.

Den 48: Kontrolní den.

Den 60: Konec a vyhodnocení experimentu. Vyšetření tumoru plic pouhým okem.

toto·· ·· ·*·· ·· · · ♦ · · • · · · * * · * * ···· · · to • · · · · · · *··· ·· to ·· ·

Kontrola kvality:

Stanovení pozitivní kontrolní sloučeniny (NSC 26271 (Cytoxan v dávce 100 mg/kg/injekce) ) v každém experimentu s lichým číslem, jehož režim byl v den 1 pouze intraperitoneální. Spodní limit testu/kontroly pro pozitivní kontrolu je 140%. Přijatelný medián přežití u neošetřené kontroly byl 19 až 35,6 dnů.

Vyhodnocení:

Měřený parametr je medián přežití. Výpočet průměrné tělesné hmotnosti zvířat v den 1 a v den 5, výpočet poměru test/kontrola pro všechny testované skupiny. Jsou vypočítány průměrné tělesné hmotnosti zvířat ve dny odečítání a v den konečného vyhodnocení. Poměr test/kontrola je vypočítán pro všechny testované skupiny s > 65 % přeživších v den 5. Poměr test/kontrola < 86% indikuje toxicitu. Pro hodnocení toxicity může být také použit nepřiměřená změna tělesné hmotnosti (test minus kontrola).

Měřítka aktivity:

Výchozí poměr test/kontrola větší nebo rovný 140% je považován za nezbytný pro průkaz mírné aktivity. Reprodukovatelná hodnota poměru test/kontrola větší nebo rovná 150% je považována za významnou aktivitu.

SEZNAM SEKVENCÍ <140> PCT/US99/24200 <141> 1999-10-15 <150> 60/120,237 <151> 1999-02-16 <150> 60/104,491 <151> 1998-10-16 <160> 44 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 1197 <212> DNA <213> Myš <400> 1 atgagctaca acttgcttgg attcctacaa ctgtggcaat tgaatgggag gcttgaatac cctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc gagatgctcc agaacatctt tgctattttc gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat cacctgaaaa gatattatgg gaggattctg tgtgcctgga ccatagtcag agtggaaatc acaggttacc tccgaaacga cgatgatgac tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc aacaactaca agaccacgcc tcccgtgttg aagctcaccg tggacaagag caggtggcag catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag agaagcagca attttcagtg tcagaagctc 60 tgcctcaagg acaggatgaa ctttgacatcr120 cagaaggagg acgccgcatt.gaccatctat 180 agacaagatt catctagcac tggctggaat 240 gtctatcatc agataaacca tctgaagaca 300 ttcaccaggg gaaaactcat gagcagtctg 360 cattacctga aggccaagga gtacagtcac 420 ctaaggaact tttacttcat taacagactt 480 aaggtcgaca aaactcacac atgcccaccg 540 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 600 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 660 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 720 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 780 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 840 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 900 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 960 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1020 gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1080 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1140 aagagcctct ccctgtctcc cgggaaa 1197 a

• · « · <210> 2 <211> 399 <212> PRT <213> myš <400> 2

Met 1

Ser

Tyr Asn

Leu 5

Leu

Gly Phe

Leu Gin Arg 10

Ser

Ser

Asn Phe 15

Gin

Cys

Gin

Lys

Leu

Leu

Trp

Gin

Leu

Asn

Gly

Arg

Leu

Glu

Tyr

Cys

Leu

20

25

30

Lys

Asp

Arg

Met

Asn

Phe

Asp

Ile

Pro

Glu

Glu

Ile

Lys

Gin

Leu

Gin

35

40

45

Gin

Phe

Gin

Lys

Glu

Asp

Ala

Ala

Leu

Thr

Ile

Tyr

Glu

Met

Leu

Gin

50

55

60

Asn

Ile

Phe

Ala

Ile

Phe

Arg

Gin

Asp

Ser

Ser

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn

65

70

75

80

Glu

Thr

Ile

Val

Glu

Asn

Leu

Leu

Ala

Asn

Val

Tyr

His

Gin

Ile

Asn

85

90'

95

His

Leu

Lys

Thr

Val

Leu

Glu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Glu

Asp

Phe

Thr

100

105

110

Arg

Gly

Lys

Leu

Met

Ser

Ser

Leu

His

Leu

Lys

Arg

Tyr

Tyr

Gly

Arg

115

120

125

Ile

Leu

His

Tyr

Leu

Lys

Ala

Lys

Glu

Tyr

Ser

His

Cys

Ala

Trp

Thr

130

135

140

Ile

Val

Arg

Val

Glu

Ile

Leu

Arg

Asn

Phe

Tyr

Phe

Ile

Asn

Arg

Leu

145

150

155

160

-

Thr

Gly

Tyr

Leu

Arg

Asn

Asp

Asp

Asp

Asp

Lys

Val

Asp

Lys

Thr

His

165

170

175

*

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

180

185

190

•

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

195

200

205

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

210

215

220

-	• f , Val 225	Lys	Phe	Asn	Trp	Tyr 230	Val	Asp
	Thr	Lys	Pro	Arg	Glu 245	Glu	Gin	Tyr
	Val	Leu	Thr	Val 260	Leu	His	Gin	Asp
	Cys	Lys	Val 275	Ser	Asn	Lys	Ala	Leu 280
	Ser	Lys 290	Ala	Lys	Gly	Gin	Pro 295	Arg
a	Pro 305	Ser	Arg	Asp	Glu	Leu 310	Thr	Lys
	Val	Lys	Gly	Phe	Tyr 325	Pro	Ser	Asp
	Gly	Gin	Pro	Glu 340	Asn	Asn	Tyr	Lys
	Asp	Gly	Ser 355	Phe	Phe	Leu	Tyr	Ser 360
	Trp	Gin 370	Gin Gly	Asn	Val	Phe 375	Ser
	His 385	Asn	His	Tyr	Thr	Gin 390	Lys	Ser

• φ φ φ • ♦ φ φ

85 Gly Val Glu	Val	• His	fl Φ • • · Asn	• Φ · • Ala	Φ Φ φ φ Φ • φ · · φ Φ • · φ φ · ΦΦ 4 ·· ΦΦΦ Lys 240
	235
Asn	Ser 250	Thr	Tyr	Arg	Val	Val 255	Ser
Trp 265	Leu	Asn	Gly	Lys	Glu 270	Tyr	Lys
Pro	Ala	Pro	Ile	Glu 285	Lys	Thr	Ile
Glu	Pro	Gin	Val 300	Tyr	Thr	Leu	Pro
Asn	Gin	Val 315	Ser	Leu	Thr	Cys	Leu 320
Ile	Ala 330	Val	Glu	Trp	Glu	Ser 335	Asn
Thr 345	Thr	Pro	Pro	Val	Leu 350	Asp	Ser
Lys	Leu	Thr	Val	Asp 365	Lys	Ser	Arg
Cys	Ser	Val	Met 380	His	Glu	Ala	Leu
Leu	Ser	Leu 395	Ser	Pro	Gly Lys

<210> 3 <211> 549 <212> DNA <213> myš <400> 3 tcatcatagc aagaagcagc ctgcctcaag ccagaaggag cagacaagat tgtctatcat tttcaccagg gcattacctg atcatcatca gattcctaca ggcttgaata tgcagcagtt ttgctatttt tcctggctaa agaaagaaga ggaggattct tccgggggcc aacttgcttg ttgaatggga attaagcagc cagaacatct gttgagaacc gaaaaactgg agatattatg tccggagacg atgatgacaa gatgagctac 60 aattttcagt gtcagaagct cctgtggcaa 120 gacaggatga actttgacat ccctgaggag 180 gacgccgcat tgaccatcta tgagatgctc 240 tcatctagca ctggctggaa tgagactatt 300 cagataaacc atctgaagac agtcctggaa 360 ggaaaactca tgagcagtct gcacctgaaa 420 aaggccaagg agtacagtca ctgtgcctgg 480 ··«· ·· ···· ·· • · · 4 · 4 accatagtca gagtggaaat cctaaggaac ttttacttca ctccgaaac ttaacagact tacaggttac

540

549 ··

<210> 4

<211> 183

<212> PRT

<213> myš

<400> 4

Ser Gly

Gly

His

His

His

His

His

His

Ser

Ser

Gly

Asp

Asp

Asp

Asp

1

5

10

15

Lys Met

Ser

Tyr

Asn

Leu

Leu

Gly

Phe

Leu

Gin

Arg

Ser

Ser

Asn

Phe

20

25

30

Gin Cys

Gin

Lys

Leu

Leu

Trp

Gin

Leu

Asn

Gly

Arg

Leu

Glu

Tyr

Cys

35

40

45

Leu Lys

Asp

Arg

Met

Asn

Phe

Asp

Ile

Pro

Glu

Glu

Ile

Lys

Gin

Leu

50

55

60

Gin Gin

Phe

Gin

Lys

Glu

Asp

Ala

Ala

Leu

Thr

Ile

Tyr

Glu

Met

Leu

65

70

75

80

Gin Asn

Ile

Phe

Ala

Ile

Phe

Arg

Gin

Asp

Ser

Ser

Ser

Thr

Gly

Trp

85

90

95

Asn Glu

Thr

Ile

Val

Glu

Asn

Leu

Leu

Ala

Asn

Val

Tyr

His

Gin

Ile

100

105

110

Asn His

Leu

Lys

Thr

Val

Leu

Glu

Glu

Lys

Leu

Glu

Lys

Glu

Asp

Phe

115

120

125

Thr Arg

Gly

Lys

Leu

Met

Ser

Ser

Leu

His

Leu

Lys

Arg

Tyr

Tyr

Gly

130

135

140

Arg Ile

Leu

His

Tyr

Leu

Lys

Ala

Lys

Glu

Tyr

Ser

His

Cys

Ala

Trp

145

150

155

160

Thr Ile

Val

Arg

Val

Glu

Ile

Leu

Arg

Asn

Phe

Tyr

Phe

Ile

Asn

Arg

165

170

175

Leu Thr

Gly

Tyr

Leu

Arg

Asn

180 <210> 5 <211> 60

ΦΦΦΦ------«·......

Φ Φ Φ ♦ ··· φ

-	87	φφφ ♦	A Φ φ
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	5
gatctagcaa	tgctgcctgt	gctgccctcc	tggctgcctt	gaatgggagg	cttgaatact	60
<210>	6
<211>	51
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	6
tattatggga	ggattctgca	ttacctgaag	gccaaggagt	actcacactg	t	51
<210>	7
<211>	76
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	7
aattgaatgg	gagggctgca	gcttgcgctg	cagacaggat	gaactttgac	atccctgagg	60
agattaagca	gctgca					76
<210>	8
<211>	51
<212>	PRT
<213>	Homo	sapiens

Φ Φ ·« <400> 8

Ala

Ala

Thr

Thr

Gly

Ala

Ala

Thr

Gly

Gly

Gly

Ala

Gly

Gly

Cys

Thr

1

5

10

15

Thr

Gly

Ala

Ala

Thr

Ala

Cys

Thr

Gly

Cys

Cys

Thr

Cys

Ala

Ala

Gly

20

25

30

Gly

Ala

Cys

Ala

Gly

Gly

Ala

Thr

Gly

Ala

Ala

Cys

Thr

Thr

Thr

Gly

40 45

Ala Cys Ala <210> 9 <211> 60 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9

•	9999		9« 999*		9«
• 9	9	*	9 9	9	9 9
•	•	•	• 9	9	9
•	•		9 9	9 ·	9
•	9	•	9 9	•	9
• 9 ·	9		9 9 9		• 9 9

ttctccggag	acgatgatga	caagatgagc	tacaacttgc	ttggattcct acaaagaagc	60
<210>	10
<211>	50
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	10
cgtcagagct	gaaatcctag	caaactttgc	attcattgca	agacttacag	50
<210>	11
<211>	47
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	11
ggtggtctca	catgagctac	aacttgcttg	gattcctaca	aagaagc	47
<210>	12
<211>	50
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	12
gccctcgagt	cgaccttgtc	atcatcgtcg	tttcggaggt	aacctgtaag	50
<210>	13
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	13
caagcttgct	agcggccgcg	g			21
<210>	14
<211>	28
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	14
ggtggtctca	catggcttga	gaagctgc			28

<210>	15
<211>	20
<212>	DNA
<213>	Homo sapiens

<400> 15

•	····	·· ····
··	*	•	• ♦	Φ ·	• ·
•	9	•	• *	•	•	•
	•	Φ ·	• ·	• ·	♦	•
•	•	•	• ·	•	•	•
·# ·	•			··	···

aggtsmarct	gcagsagtcw
<210>	16
<211>	36
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	16
ctgagctcat	ttacccggag	tccgggagaa	getett
<210>	17
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	17
agcttgctag	cggccgcggc	ctcactggct	tea
<210>	18
<211>	37
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	18
atacgcgtcg	acgtttcgga	ggtaacatgt	aagtctg
<210>	19
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	19

agcttgctag cggccgcggc ctcactggct tea <210> 20 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tacacgtcga cgctgccacc accgccgttt cggaggtaac atgtaagtct g <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 • · gccgctcgag ttatcagttt cggaggtaac ctgtaagtc

<210>	22
<211>	72
<212>	DNA
<213>	Homo
<400>	22
ggaatgcttc
agacagttct
<210>	23
<211>	72
<212>	DNA
<213>	Homo
<400>	23
ggaatgagac
ctgcagttct
<210>	24
<211>	44
<212>	DNA
,<213>	Homo
<400>	24
ctagctgcaa
<210>	25
<211>	69
<212>	DNA
<213>	Homo
<400>	25
ctagaagaaa
ctgaaaaga
<210>	26
<211>	51
<212>	DNA
<213>	Homo
<400>	26
tattatggga
<210>	27
<211>	76
<212>	DNA

sapiens sapiens sapiens sapiens aactggagaa sapiens ggattctgca aactggctgc aattgttgct ag cattgttgag ag gcactcctga aacctcctgg agctgatttc agaagcagct gcaatgtcta ctaatgtcgc accaggggaa accgctggaa tcatcagata aaccatctga tcatcagata gcacatctgg aact aagcaatgag cgcgctgcac ttacctgaag gccaaggagt actcacactg t • · · · • · · ·

	91	•	9 · · • · · · • · · • · ··	• • • •
<213>	Homo	sapiens
<400>	27
catgagcagt	ctgcacctga	aaagatatta	tggggcaatt	gctgcatacc	tggcagccaa	60
ggagtactca	cactgt					76
<210>	28
<211>	87
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	28
catgagcagt	ctgcacctga	aaagatatta	tgggaggatt	ctgcattacc	tgaaggccgc	60
tgcatactca	cactgtgcct	ggacgat				87
<210>	29
<211>	87
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	29
catgagcagt	ctgcacctga	aaagatatta	tgggaggatt	ctgcattacc	tgaaggcaaa	60
ggagtacgct	gcatgtgcct	ggacgat				87
<210>	30
<211>	50
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	30
cgtcagagct	gaaatcctag	caaactttgc	attcattgca	agacttacag		50

<210> 31 <211> 47 <212> DNA

<213>	Homo	sapiens
<400>	31
ggtggtctca	catgagctac aacttgcttg gattcctaca aagaagc	47
<210>	32
<211>	50
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	32

gccctcgagt cgaccttgtc atcatcgtcg tttcggaggt aacctgtaag • ·· · • · • · • · ·>

<210>	33
<211>	21
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	33
caagcttgct	agcggccgcg
<210>	34
<211>	28
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	34
ggtggtctca	catggcttga
<210>	35
<211>	20
<212>	DNA
<213>	murine
<400>	35
aggtsmarct	gcagsagtcw
<210>	36
<211>	36
<212>	DNA
<213>	murine
<400>	36
ctgagctcat	ttacccggag
<210>	37
<211>	33
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	37
agettgetag	cggccgcggc
<210>	38
<211>	37
<212>	DNA
<213>	Homo	sapiens
<400>	38
atacgcgtcg	acgtttcgga

g gaagctgc tccgggagaa ctcactggct ggtaacatgt gctctt tea aagtctg • · · · • · · ·

	93	• · · · • · · · · ·	• •
<210> 39
<211> 33
<212> DNA
<213> Homo	sapiens
<400> 39
agcttgctag	cggccgcggc	ctcactggct	tea			33
<210> 40
<211> 51
<212> DNA
<213> Homo	sapiens
<400> 40
tacacgtcga	cgctgccacc	accgccgttt	cggaggtaac	atgtaagtct	g	51
<210> 41 /211> 1257
<212> DNA <213> Homo	sapiens
<400> 41
atgcctggga	agatggtcgt	gatccttgga	gcctcaaata	tactttggat	aatgtttgca	60
gcttctcaag	ccatgagcta	caacttgctt	ggattcctac	aaagaagcag	caattttcag	120
tgtcagaagc	tcctgtggca	attgaatggg	aggcttgaat	actgcctcaa	ggacaggatg	180
aactttgaca	tccctgagga	gattaagcag	ctgcagcagt	tccagaagga	ggacgccgca	240
ttgaccatct	atgagatgct	ccagaacatc	tttgctattt	tcagacaaga	ttcatctagc	300
actggctgga	atgagactat	tgttgagaac	ctcctggcta	atgtctatca	tcagataaac	360
catctgaaga	cagtcctgga	agaaaaactg	gagaaagaag	atttcaccag	gggaaaactc	420
atgagcagtc	tgcacctgaa	aagatattat	gggaggattc	tgcattacct	gaaggccaag	480
gagtacagtc	actgtgcctg	gaccatagtc	agagtggaaa	tcctaaggaa	cttttacttc	540
attaacagac	ttacatgtta	cctccgaaac	gtcgacaaaa	ctcacacatg	cccaccgtgc	600
ccagcacctg	aactcctggg	gggaccgtca	gtcttcctct	tccccccaaa	acccaaggac	660
accctcatga	tctcccggac	ccctgaggtc	acatgcgtgg	tggtggacgt	gagccacgaa	720
gaccctgagg	tcaagttcaa	ctggtacgtg	gacggcgtgg	aggtgcataa	tgccaagaca	780
aagccgcggg	aggagcagta	caacagcacg	taccgtgtgg	tcagcgtcct	caccgtcctg	840
caccaggact	ggctgaatgg	caaggagtac	aagtgcaagg	tctccaacaa	agccctccca	900
gcccccatcg	agaaaaccat	ctccaaagcc	aaagggcagc	cccgagaacc	acaggtgtac	960
accctgcccc	catcccggga	tgagctgacc	aagaaccagg	tcagcctgac	ctgcctggtc	1020
aaaggcttct	atcccagcga	catcgccgtg	gagtgggaga	gcaatgggca	gccggagaac	1080
aactacaaga	ccacgcctcc	cgtgttggac	tccgacggct	ccttcttcct	ctacagcaag	1140
ctcaccgtgg	acaagagcag	gtggcagcag	gggaacgtct	tctcatgctc	cgtgatgcat	1200
gaggctctgc	acaaccacta	cacgcagaag	agcctctccc	tgtctcccgg	gaaatga	1257

<210>

<211>

418 <212>

PRT <213>

Homo sapiens • · · · • · · ·

<400> 42

Met 1

Pro Gly Lys Met 5

Val

Val

Ile Leu Gly 10

Ala

Ser Asn

Ile

Leu 15

Trp

Ile

Met

Phe

Ala

Ala

Ser

Gin

Ala

Met

Ser

Tyr

Asn

Leu

Leu

Gly

Phe

20

25

30

Leu

Gin

Arg

Ser

Ser

Asn

Phe

Gin

Cys

Gin

Lys

Leu

Leu

Trp

Gin

Leu

35

40

45

Asn

Gly

Arg

Leu

Glu

Tyr

Cys

Leu

Lys

Asp

Arg

Met

Asn

Phe

Asp

Ile

50

55

60

Pro

Glu

Glu

Ile

Lys

Gin

Leu

Gin

Gin

Phe

Gin

Lys

Glu

Asp

Ala

Ala

65

70

75

80

Leu

Thr

Ile

Tyr

Glu

Met

Leu

Gin

Asn

Ile

Phe

Ala

Ile

Phe

Arg

Gin

85

90

95

Asp

Ser

Ser

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn

Glu

Thr

Ile

Val

Glu

Asn

Leu

Leu

100

105

110

Ala

Asn

Val

Tyr

His

Gin

Ile

Asn

His

Leu

Lys

Thr

Val

Leu

Glu

Glu

115

120

125

Lys

Leu

Glu

Lys

Glu

Asp

Phe

Thr

Arg

Gly

Lys

Leu

Met

Ser

Ser

Leu

130

135

140

His

Leu

Lys

Arg

Tyr

Tyr

Gly

Arg

Ile

Leu

His

Tyr

Leu

Lys

Ala

Lys

145

150

155

160

Glu

Tyr

Ser

His

Cys

Ala

Trp

Thr

Ile

Val

Arg

Val

Glu

Ile

Leu

Arg

165

170

175

Asn

Phe

Tyr

Phe

Ile

Asn

Arg

Leu

Thr

Cys

Tyr

Leu

Arg

Asn

Val

Asp

180

185

190

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

195

200

205

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

210

215

220

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

225

230

235

240

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His • · · ·

245

250

255

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

260

265

270

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

275

280

285

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

290

295

300

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

305

310

315

320

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

325

330

335

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

340

345

350

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

Thr

Thr

Pro

Pro

Val·

355

360

365

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

370

375

380

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

385

390

395

400

Glu

Ala

Leu

His

Asn

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Pro

405

410

415

Gly Lys <210> 43 <211> 1272 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 atgcctggga agatggtcgt gatccttgga gcctcaaata tactttggat aatgtttgca 60 gcttctcaag ccatgagcta caacttgctt ggattcctac aaagaagcag caattttcag 120 tgtcagaagc tcctgtggca attgaatggg aggcttgaat actgcctcaa ggacaggatg 180 aactttgaca tccctgagga gattaagcag ctgcagcagt tccagaagga ggacgccgca 240 ttgaccatct atgagatgct ccagaacatc tttgctattt tcagacaaga ttcatctagc 300 actggctgga atgagactat tgttgagaac ctcctggcta atgtctatca tcagataaac 360 • · · · • · gggaaaactc gaaggccaag cttttacttc catctgaaga atgagcagtc gagtacagtc attaacagac acatgcccac ccaaaaccca gacgtgagcc cataatgcca gtcctcaccg aacaaagccc gaaccacagg ctgacctgcc gggcagccgg ttcctctaca tgctccgtga cccgggaaat cagtcctgga tgcacctgaa actgtgcctg ttacatgtta cgtgcccagc aggacaccct acgaagaccc agacaaagcc tcctgcacca tcccagcccc tgtacaccct tggtcaaagg agaacaacta gcaagctcac tgcatgaggc ga agaaaaactg aagatattat gaccatagtc cctccgaaac acctgaactc catgatctcc tgaggtcaag gcgggaggag ggactggctg catcgagaaa gcccccatcc cttctatccc caagaccacg cgtggacaag tctgcacaac gagaaagaag gggaggattc agagtggaaa ggcggtggtg ctggggggac cggacccctg ttcaactggt cagtacaaca aatggcaagg accatctcca cgggatgagc agcgacatcg cctcccgtgt agcaggtggc cactacacgc atttcaccag tgcattacct tcctaaggaa gcagcgtcga cgtcagtctt aggtcacatg acgtggacgg gcacgtaccg agtacaagtg aagccaaagg tgaccaagaa ccgtggagtg tggactccga agcaggggaa agaagagcct caaaactcac cctcttcccc cgtggtggtg cgtggaggtg tgtggtcagc caaggtctcc gcagccccga ccaggtcagc ggagagcaat cggctccttc cgtcttctca ctccctgtct

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

L020

1080

1140

1200

1260

1272 <210> 44 <211> 423 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 44

Leu

Gly Ala 10

Ser Asn

Ile Leu Trp 15

Met 1

Pro

Gly

Lys Met 5

Val

Val

Ile

Ile

Met

Phe

Ala

Ala

Ser

Gin

Ala

Met

Ser

Tyr

Asn

Leu

Leu

Gly

Phe

20

25

30

Leu

Gin

Arg

Ser

Ser

Asn

Phe

Gin

Cys

Gin

Lys

Leu

Leu

Trp

Gin

Leu

35

40

45

Asn Gly

Arg

Leu

Glu

Tyr

Cys

Leu

Lys

Asp

Arg

Met

Asn

Phe

Asp

Ile

50

55

60

Pro

Glu

Glu

Ile

Lys

Gin

Leu

Gin

Gin

Phe

Gin

Lys

Glu

Asp

Ala

Ala

65

70

75

80

Leu

Thr

Ile

Tyr

Glu

Met

Leu

Gin

Asn

Ile

Phe

Ala

Ile

Phe

Arg

Gin

85

90

95

Asp

Ser

Ser

Ser

Thr

Gly

Trp

Asn

Glu

Thr

Ile

Val

Glu

Asn

Leu

Leu

100

105

110

Ala

Asn

Val

Tyr

His

Gin

Ile

Asn

His

Leu

Lys

Thr

Val

Leu

Glu

Glu

115

120

125

Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu ····

1

130

Arg

135

Arg

140

Leu Lys Ala Lys 160

His 145

Leu

Lys

Tyr Tyr 150

Gly

Ile

Leu His 155

Tyr

Glu

Tyr

Ser

His

Cys

Ala

Trp

Thr

Ile

Val

Arg

Val

Glu

Ile

Leu

Arg

165

170

175

•

Asn

Phe

Tyr

Phe

Ile

Asn

Arg

Leu

Thr

Cys

Tyr

Leu

Arg

Asn

Gly

Gly

180

185

190

*

Gly

Gly

Ser

Val

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

Pro

Pro

Cys

Pro

Ala

Pro

195

200

205

Glu

Leu

Leu

Gly

Gly

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

Phe

Pro

Pro

Lys

Pro

Lys

210

215

220

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

Val

Thr

Cys

Val

Val

Val

225

230

235

240

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

245

250

255

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg

Glu

Glu

Gin

Tyr

260

265

270

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Ser

Val

Leu

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

275

280

285

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

290

295

300

Pro

Ala

Pro

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

305

310

315

320

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

325

330

335

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

340

345

350

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

Pro

Glu

Asn

Asn

Tyr

Lys

355

360

365

Thr

Thr

Pro

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Phe

Leu

. Tyr

Ser

370

375

380

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser

9999 •9 99·9

385					390			395		400
Cys	Ser	Val	Met	His	Glu	Ala	Leu His Asn	His	Tyr Thr Gin Lys	Ser
				405			410		415
Leu	Ser	Leu	Ser	Pro	Gly	Lys
			420

·Φ··

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaný polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci

   X-Y-Z, kde

   X je polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci, nebo její část, obsahující aminokyselinovou sekvenci glykosylovaného interferonu-beta,

   Y je volitelná spojovací část, a

   Z je polypeptid obsahující alespoň část polypeptidu jiného než je glykosylovaný interferon-beta.
2. 2. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde X je interferonbeta-la.
3. 3. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde X je mutanta mající alespoň jednu z následujících vlastností: (a) mutanta má vyšší antivirovou aktivitu než interferonbeta-la divokého typu, když je antivirová aktivita měřena pomocí virem indukované lýzy buněk, (b) mutanta má, při srovnání s interferonem-beta-la divokého typu, antivirovou aktivitu vyšší než antiproliferační aktivitu, (c) mutanta váže interferonový receptor, ale při srovnání s interferonem-beta-la divokého typu má sníženou antivirovou aktivitu a sníženou antiproliferační aktivitu vzhledem k vazebné aktivitě pro receptor.
4. 4. Izolovaný polypeptid podle nároku 2, kde interferon-beta- la je derivátizovaný.
5. 5. Izolovaný polypeptid podle nároku 4, kde derivát je polyalkylglykolový polymer.

   • ΦΦΦ •φ φφφφ

   100
6. 6. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde Z je alespoň část konstantního úseku imunoglobulinu.
7. 7. Izolovaný polypeptid podle nároku 6, kde alespoň část konstantního úseku imunoglobulinu pochází z imunoglobulinu

   patřícího do třídy vybrané z tříd IgM, IgG, IgD, IgA a IgE. 8. Izolovaný polypeptid podle nároku 7, kde třída je IgG. 9. Izolovaný polypeptid podle nároku 6, kde alespoň část

   konstantního úseku obsahuje alespoň kloubovou oblast, doménu CH2 a doménu CH3.
8. 10.Fúzní protein mající amino-koncový úsek sestávající z aminokyselinové sekvence glykosylováného interferonubeta nebo jeho části a mající karboxy-koncový úsek sestávající z alespoň části proteinu jiného než je glykosylovaný interferon-beta.
9. 11.Izolovaný protein podle nároku 10, kde interferon-beta je interferon-beta-la.
10. 12.Izolovaný protein podle nároku 10, kde interferon-beta je mutanta mající alespoň jednu z následujících vlastností: (a) mutanta má vyšší antivirovou aktivitu než interferonbeta-la divokého typu, když je antivirová aktivita měřena pomocí virem indukované lýzy buněk, (b) mutanta má, při srovnání s interferonem-beta-la divokého typu, antivirovou aktivitu vyšší než antiproliferační aktivitu, (c) mutanta váže interferonový receptor, ale při srovnání s

    00 0 0 0 0 • 0 0 • Φ ♦

    * • ·· 0

    101 interferonem-beta-la divokého typu má sníženou aktivitu vzhledem antivirovou aktivitu k vazebné a sníženou antiproliferační aktivitě pro receptor.

    protein podle nároku 11, je derivatizovaný.
11. 13.Izolovaný kde interferon-beta-la
12. 14.Izolovaný protein polyalkylglykolový podle nároku polymer.

    13, kde derivát je
13. 15.Izolovaný protein proteinu jiného konstantního úseku podle nároku než interferon-beta imunoglobulinu.

    10, kde je alespoň alespoň část část
14. 16.Izolovaný protein konstantního úseku patřícího podle nároku 15, imunoglobulinu pochází z do třídy vybrané z tříd IgM, kde část
15. 17.Izolovaný protein podle nároku 16, kde
16. 18 . Izolovaný konstantního protein úseku podle nároku 15, obsahuje alespoň doménu CH2 a doménu alespoň imunoglobulinu

    IgG, IgD, IgA třída je IgG.

    kde alespoň část kloubovou oblast,
17. 19. Izolovaná sekvence DNA, která kóduje protein podle nároku

    1 a 10.
18. 20.Rekombinantní DNA, která obsahuje sekvenci podle nároku 19 a expresní kontrolní sekvenci, přičemž expresní kontrolní sekvence je operativně spojena se sekvencí DNA.

    e · · · · ·

    102
19. 21.Hostitelská buňka transformovaná sekvencí rekombinantni DNA podle nároku 20.
20. 22. Způsob přípravy rekombinantního polypeptidu vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se: (a) poskytne populace hostitelských buněk podle nároku 21, (b) kultivuje populace buněk v podmínkách, ve kterých je polypeptid kódovaný rekombinantni DNA exprimován, a (c) izoluje exprimovaný polypeptid.
21. 23. Fúzní protein interferonu-beta, který obsahuje glykosylovaný interferon-beta a další polypeptid, se kterým není v přírodě spojen, a sice v podstatě čisté formě.
22. 24. Fúzní protein podle nároku 23, kde interferon-beta je lidský interferon-beta-la.
23. 25. Fúzní protein podle nároku 24, kde fúze má antivirovou aktivitu vybranou ze skupiny obsahující: (a) vyšší antivirovou aktivitu než interferon-beta-la divokého typu, když je antivirová aktivita měřena pomocí virem indukované lýzy buněk, (b) antivirovou aktivitu vyšší než antiproliferační aktivitu, při srovnání s interferonembeta-la divokého typu, (c) aktivitu zahrnující vazebnou aktivitu pro interferonovy receptor, ale při srovnání s interferonem-beta-la divokého typu sníženou antivirovou aktivitu a sníženou antiproliferační aktivitu vzhledem k vazebné aktivitě pro receptor.

    • 4*4

    Μ ··<· ·

    103
24. 26.Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství fúzního proteinu interferonu-beta podle kteréhokoliv z nároků 1, 10 a 23.
25. 27.Způsob inhibice angiogeneze u pacienta, vyznačující se tím, že se pacientovi podává účinné množství přípravku podle nároku 26.
26. 28.Izolovaný polypeptid podle nároku 3, kde mutanta je derivát i zovaná.

    29.Izolovaný polypeptid podle polyalkylglykolový polymer. nároku 28, kde derivátem je 30.Izolovaný protein podle nároku 12, kde mutanta je derivátizovaná. 31.Izolovaný protein podle nároku 30, kde derivátem je polyalkylglykolový polymer.

    • · · ·