PT726778E - Sistema de administracao oral de proteinas g-csf modificadas quimicamente - Google Patents

Description

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DESCRICÃO "Sistema de administração oral de proteínas G-CSF modificadas quimicamente"

Campo do invento O presente invento refere-se a novas composições para a administração oral de proteínas modificadas quimicamente. (O termo "proteína" é aqui utilizado indistintamente do termo "polipéptido" a não ser em caso de indicação contrária). Além disso, o presente invento refere-se a novas composições e métodos para a administração oral de proteínas tratadas com PEG. Noutro aspecto, o presente invento refere-se a novas composições e métodos para a administração oral de factor estimulante de colónias de granulócitos (G-CSF) modificado quimicamente, e ainda, noutro aspecto, particularmente, à administração oral de G-CSF tratado com PEG .

Antecedentes

Actualmente, a injecção é a forma típica de administrar uma proteína biologicamente activa à corrente sanguínea. Contudo, a injecção é indesejável em muitas condições. O receptor pode, evidentemente, sofrer desconforto ou dor, e ter a necessidade de se deslocar a um enfermeiro para receber a sua injecção. Por estas e outras razões podem existir problemas de aceitação pelo paciente de receber uma injecção como modo de administração. Uma alternativa à injecção é a administração oral de proteínas biologicamente activas. A administração oral tem-se revelado problemática, contudo, por várias razões. Uma das maiores preocupações é a degradação da proteína biologicamente activa no aparelho digestivo. Foram propostos inibidores de proteases. Também houve várias preparações farmacêuticas de formas de dosagem oral para várias proteínas, que protegem contra a degradação proteica, e.g., EP 0 459 795, intitulada "Oral dosage form of biologically active proteins" (ver também a patente americana US-A-559756, intitulada "Oral dosage form of a biologically active proteins"). A patente n° US 4 925 673 (Steiner et al.), intitulada "Delivery Systems for Pharmacological Agents Encapsulated with Proteinoids" relata a entrega oral de insulina, heparina e fisostigmina, encapsuladas em certas microesferas que têm predominantemente menos do que cerca de 10 micra de diâmetro. Estes proteinóides são feitos de uma 2 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ proteína ácida que é relatada como estável na presença das enzimas e ácidos do estômago, mas que libertam o agente microencapsulado junto da corrente sanguínea neutra. Também houve um relato da utilização desta microesfera para entrega oral de um anticorpo monoclonal.

Outros grupos tentaram aumentar a assimilação oral de fármacos através da sua incorporação em nanopartículas e micropartículas de látex de poliestireno . Assim, a droga é, não apenas protegida do ambiente hostil, como também estas partículas são depois captadas da via entérica para a circulação sistémica através das placas de Peyer. Veja Jani et a/., J. Pharm. Pharmacol. 42: 821-826 (1990), veja também, Jani et al., Intl J. Pharm. 86: 239-246 (1992).

Usando uma abordagem semelhante Tanto para a protecção como para o aumento da assimilação do péptido ou proteína, foram reivindicadas microemulsões para a entrega oral de fármacos como a insulina, a calcitonina e a somatotrofina ou factores de crescimento. Publicação PCT N° WO 90/03164. Adicionalmente, foi investigada a entrega oral de fármacos usando lipossomas, veja Aramaki et al., Pharm. Res. 10 : 1228-1231 (1993). Os lipossomas eram compostos por diestearoilfosfatidilcolina, fosfatidilserina e colesterol ou dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilserina e colesterol, que são estáveis no aparelho digestivo e parecem ser assimilados pelas placas de Peyers no baixo íleo. Até agora, apesar dos relatórios anteriores, as formas de dosagem oral de proteínas biologicamente activas não são amplamente usadas clinicamente.

Isto pode ser atribuído às barreiras técnicas envolvidas na tentativa de entrega de uma proteína terapêutica na circulação sistémica a partir da via oral. Resumidamente, o processo digestivo é, por definição, hostil a qualquer proteína ingerida. O tracto gastrointestinal é um órgão desenvolvido para degradar, tanto física como quimicamente, os nutrientes ingeridos e é responsável pela sua assimilação pelo corpo e pela eliminação de detritos. Os alimentos ingeridos são imediatamente degradados no estômago por combinação de baixo pH, tipicamente 1-3 (Dotevall, G., et al. Acta Med. Scand., 170. 59. 1961) e fortes contracções peristálticas que mantêm os nutrientes no estômago, enquanto continuam a degradar fisicamente os alimentos. Para além disso a protease pepsina é segregada no lúmen do estômago a partir das células pépticas gástricas. O resultado deste ambiente

86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ extremamente hostil é que os alimentos são eventualmente libertados no intestino delgado, especificamente no duodeno, através do piloro, na forma de pequenas partículas de ~1mm ou menos (Mayer, E.A., et al. Gasteroenterology, 87. 1264-1271, 1984). O pH do conteúdo do estômago que entra no duodeno é rapidamente elevado para pH 5-7 pelo bicarbonato na bílis e nas secreções pancreáticas. Adicionalmente, as endoproteases tripsina, quimiotripsina e elastase são libertadas no lúmen duodenal juntamente com muitas enzimas para a digestão de polissacáridos e lípidos. Os produtos destas proteases são geralmente pequenos péptidos e estes, por sua vez, são hidrolisados em aminoácidos antes da absorção por exopeptidases na camada externa de vilosidades do forro de enterócitos do intestino (para revisões veja Kenny, A.J. e Fulcher, I.S., In: Brush Border Membranes, editado por R. Porter and G.M. Collins, pp 12- 33, 1983 e Tobey, N., et al. Gasteroenterology, 88: 913-926 (1985). A proteólise, e mais em geral a digestão dos alimentos, tem lugar em todo o intestino delgado, i.e., o duodeno, o jejuno e o íleo, como o é a assimilação dos produtos da digestão. As funções do intestino grosso, que consiste no cego e no cólon, são a extracção água e de electrólito do lúmen para o corpo, e a armazenagem e eventual eliminação de detritos.

Os produtos da digestão são geralmente absorvidos através de processos activos de assimilação para aminoácidos e para monossacáridos, enquanto outros, especificamente lípidos, são absorvidos através de um processo mais passivo de difusão para o forro de enterócitos do intestino. Sabe-se também existirem processos activos de assimilação para algumas vitaminas, e outros factores nutritivos, maiores mas essenciais, que são incapazes de serem absorvidos passivamente. Contudo, para a maioria das grandes moléculas, o forro de enterócitos do lúmen do intestino é uma barreira impenetrável que não pode ser ultrapassada.

Em todo o intestino, o forro de enterócitos do intestino absorve produtos de digestão. Não se conhece que grandes moléculas, como as de P.M. superior a cerca de 500-1000 Da, sejam passivamente absorvidas pelo intestino.

Portanto, a arte ensina contra o aumento da dimensão duma proteína biologicamente activa para administração oral. Por exemplo, pensa-se que o polietilenoglicol sozinho atravessa o tracto intestinal com pouca ou nenhuma 4 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ absorção. Ma et ai, Gasteroenterology 98: 39-46 (1990); Sundquist et aL, Gut 21: 208-214 (1980).

Uma tal proteína biologicamente activa, que é o objecto dos exemplos adiante, é o factor estimulante de colónias de granulócitos, "G-CSF". O G-CSF promove a formação, a partir de células de medula óssea, de glóbulos brancos que combatem certas bactérias, denominados granulócitos neutrofílicos ou "neutrófilos". Uma vez libertados no sangue circulante, os granulócitos neutrofílicos permitem que o sistema imunitário humano se defenda contra a infecção bacteriana. 0 G-CSF induz a rápida proliferação e libertação de granulócitos neutrofílicos na corrente sanguínea. O G-CSF humano pode ser obtido e purificado a partir de várias fontes. O G-CSF humano natural (nhG-CSF) pode ser isolado de sobrenadantes de culturas linhas de células de tumores. A produção de recombinante de G-CSF permitiu quantidades suficientes de G-CSF com qualidades terapêuticas desejadas (a produção recombinante está descrita na Patente N° U.S. 4 810 643 (Souza). O G-CSF humano recombinante (rhG-CSF) foi utilizado clinicamente com sucesso para o restabelecimento da função imunitária após quimioterapia e radioterapia, e em casos crónicos, como a neutropenia crónica grave. Presentemente, o G-CSF recombinante (nome genérico, Filqastrim) é vendido comercialmente nos Estados Unidos sob o nome comercial Neupogen®, e é administrado por injecção ou por infusão.

As proteínas podem ser protegidas contra proteólise através da fixação de porções químicas. Tal fixação pode bloquear eficazmente a enzima proteolítica do contacto físico com o próprio esqueleto da proteína, e assim evitar a degradação. 0 polietilenoglicol é uma destas porções químicas que se mostrou proteger contra a proteólise. Sada, et al., J. Fermentation Bioengineering TV. 137-139 (1991).

Em adição à protecção contra a clivagem proteolítica, verificou-se que a modificação química de proteínas biologicamente activas proporciona vantagens adicionais sob certas circunstâncias, tais como um aumento da estabilidade e do tempo de circulação da proteína terapêutica e uma diminuição da imunogenicidade. Veja a Patente N° U.S. 4 179 337, Davis et aL concedida em 18 de Dezembro, 1979. Para uma revisão, veja Abuchowski et al., in Enzymes 5 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ as Drugs. (J.S. Holceberg and J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981)). Um artigo de revisão descrevendo a proteína de modificação e proteínas de fusão é Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (Maio 1992) (publicado por Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, London N20, OLD, RU). Por exemplo, veja EP 0 401 384, intitulada, "Chemically modified Granulocyte Colony Stimu/ating Factor", que descreve materiais e métodos para preparar G-CSF ao qual estão ligadas moléculas de polietilenoglicol. A adição de polietilenoglicol aumenta a estabilidade do G-CSF a pH fisiológico em comparação com G-CSF não tratado com PEG (tal G-CSF modificado é aqui referido como "G-CSF tratado com PEG" ou "PEG-G-CSF"). A proteína tratada com PEG é também estabilizada em relação a sais. Os efeitos benéficos do "tratamento com PEG" na estabilização das enzimas em solventes orgânicos foram também relatados, veja Inada, Y., et a!., Tibtech 190-194 (1986). Este último ponto pode ter implicações práticas na formulação de comprimidos das moléculas de GSCF. O G-CSF e seus análogos foram também alegadamente modificados. Em EP 0 473 268, "Continuous Release Pharmaceutical Compositions Comprising a Polypeptide Covalently Conjugated To A Water Soluble Polymer", descreve-se alegadamente a utilização de vários G-CSF e derivados covalentemente conjugados com um polímero em partículas solúvel em água, tal como polietilenoglicol. Evidentemente, com porções químicas adicionais ligadas, a molécula biologicamente activa é aumentada. A Patente US-A-5985265 revela composições de proteínas quimicamente modificadas no terminal N e métodos, que incluem a modificação de G-CSF e a modificação química de outra proteína, o interferão de consenso. Como será discutido com maior detalhe abaixo, o interferão de consenso quimicamente modificado demonstrou actividade biológica , tal como actividade antiviral. Uma formulação de dosagem oral do interferão de consenso quimicamente modificado, o objecto de outro exemplo de trabalho descrito adiante, seria também desejável.

Sumário Do Invento 0 presente invento é dirigido à administração oral de uma proteína quimicamente modificada e à entrega da proteína na corrente sanguínea para efeito terapêutico. De forma importante e surpreendentemente, verificou-se que

86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ 6 as proteínas biologicamente activas quimicamente modificadas podem sobreviver no intestino (com ou sem formulação adicional), e passam através do torro do intestino para a corrente sanguínea. Surpreendentemente, como demonstrado com o G-CSF tratado com PEG, não só a proteína sobreviveu como produzia efeitos biológicos observáveis.

Os exemplos adiante ilustram isto. Num sistema de mamífero, o G-CSF tratado com PEG é administrado directamente ao intestino. Os animais testados exibiram uniformemente contagens de glóbulos brancos totais mais elevadas do que animais tratados com G-CSF não tratado com PEG ou veículo. Embora os mecanismos precisos não estejam definidos, as observações iniciais indicam que a modificação química impede a proteólise da proteína, e diminui a taxa de depuração da proteína a partir da circulação sistémica. O mecanismo através do qual o forro do intestino permite a assimilação do G-CSF tratado com PEG para a corrente sanguínea não é , contudo, compreendido.

Portanto, um aspecto do presente invento refere-se a composições para a administração oral de um G-CSF modificado quimicamente. Outro aspecto do presente invento refere-se a G-CSF tratado com PEG numa formulação de dosagem oral farmaceuticamente aceitável.

Em geral, o G-CSF útil na prática deste invento pode ser uma forma isolada de organismos mamíferos ou, alternativamente, um produto de procedimentos químicos sintéticos, ou de expressão em hospedeiros procariotas ou eucariotas, de sequências de ADN exógeno obtido por clonagem genómica ou de ADNc ou por síntese de ADN. Os hospedeiros procariotas adequados incluem várias bactérias (e.g. E. coli); os hospedeiros eucariotas apropriados incluem leveduras (e.g. S. cerevisiae) e células de mamífero (e.g. células de ovário de hamster chinês, células de macaco). Dependendo do hospedeiro usado, o produto G-CSF de expressão pode ser glicosilado com hidratos de carbono de mamífero ou de outros eucariotas, ou pode não ser glicosilado. O produto de expressão G-CSF pode também incluir um resíduo de aminoácido metionina inicial (na posição -1). 0 presente invento, contempla a utilização de toda e qualquer de tais formas de G-CSF, embora o G-CSF recombinante, especialmente o derivado de E. coli. é preferido, entre outras coisas, por uma questão de maior capacidade comercial.

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Certos análogos de G-CSF foram relatados como sendo biologicamente funcionais, e estes podem ser quimicamente modificados, através de, por exemplo, a adição de uma ou mais moléculas de polietilenoglicol. Exemplos de análogos de G-CSF que foram relatados como tendo actividade biológica são os apresentados em EP 0 473 268 e EP 0 272 423, embora nenhuma representação seja feita em relação à actividade de cada um dos análogos alegadamente revelados. A modificação química contemplada é a ligação de pelo menos uma porção à própria molécula de G-CSF, em que a referida porção permite (a) a inibição de proteólise; e (b) a assimilação pela corrente sanguínea a partir do intestino. É também desejado o aumento da estabilidade global da proteína e o aumento do tempo de circulação no corpo. Os exemplos de tais porções incluem: polietilenoglicol, copolímeros de etilenoglicol e propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, (álcool vinílico), polivinilpirrolidona e poliprolina. Abuchowski e Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts. !n\ "Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-lnterscience, New York, NY (1981), pág. 367-383; Newmark, et a!., J. Appl. Biochem. 4: 185-189 (1982). Outros polímeros que podem ser usados são poli-1,3-dioxolano e poli-1,3,6,-tioxocano. A porção química preferida é o polietilenoglicol. As moléculas de polietilenoglicol preferidas são as que actuam para aumentar a semivida da proteína in vivo, tipicamente as moléculas de PEG com um peso molecular de cerca de 6 000. A expressão "cerca de" é utilizada para reflectir o peso molecular médio aproximado de uma preparação de polietilenoglicol, reconhecendo que algumas moléculas na preparação pesarão mais, outras menos. O PEG usado nos exemplos de trabalho descritos adiante tinha um peso molecular de cerca de 6 000.

As moléculas de polietilenoglicol (ou outras porções químicas) devem ser ligadas à proteína tendo em consideração os efeitos sobre os domínios funcional ou antigénico. O método para a ligação das moléculas de polietilenoglicol pode variar, e existem vários métodos disponíveis aos peritos na arte. E.g. EP 0 401 384 (acoplamento de PEG a G-CSF), veia também Malik_ef al., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (descreve o "tratamento com PEG" de GM-CSF usando cloreto de tresilo). Por exemplo, o polietilenoglicol pode ser ligado covalentemente através de resíduos de aminoácido por via de um grupo 8 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ reactivo, tal como, um grupo amino ou um grupo carboxilo livres. Os grupos reactivos são aqueles a que uma molécula de polietilenoglicol activada se pode ligar. Os resíduos de aminoácidos possuindo um grupo amino livre podem incluir resíduos lisina e os resíduos de aminoácido do terminal N; os que possuem um grupo carboxilo livre podem incluir resíduos ácido aspártico, resíduos ácido glutâmico e resíduo de aminoácido do terminal C. Os grupos sulfidrilo podem também ser usados como um grupo reactivo para a fixação da(s) molécula(s) de polietilenoglicol. É preferida para propósitos terapêuticos a fixação num grupo amino, tal como a fixação no terminal N ou num grupo lisina. A fixação em resíduos importantes para a ligação ao receptor de G-CSF deve ser evitada. Prefere-se a fixação em resíduos encontrados nas voltas externas que ligam as hélices alfa, ou no terminal N. Veia. Osslund et ai, PNAS-USA 90: 5167-5171 (1993) (descreve a conformação tridimensional do G-CSF recombinante humano). 0 número de moléculas de polietilenoglicol assim fixadas pode variar, e um perito na arte será capaz de verificar o efeito na função. Como se nota com maior detalhe adiante, o G-CSF tratado com PEG aqui preferido é predominantemente o que tem fixado três ou quatro PEG, de PEG 6000, i.e.. uma população de moléculas de G-CSF que têm três ou quatro moléculas de PEG 6000 ligadas, com a minoria de moléculas que têm mais ou menos moléculas de polietilenoglicol ligadas.

Estão aqui contempladas para utilização as formas de dosagem sólida oral, que são descritas genericamente em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. 1990 (Mack Publishing Co. Easton PA 18042) no Capítulo 89. As formas da dosagem sólida incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, trociscos ou pastilhas, cápsulas lenticulares ou peletes. Também pode ser utilizada a encapsulação lipossómica ou proteinóide para formular as presentes composições (como por exemplo, microesferas proteinóides relatadas na Patente N° US 4 925 673). Pode ser utilizada encapsulação lipossómica e os lipossomas podem ser derivatizados com vários polímeros (E.g., Patente N° US 5 013 556). Uma descrição de possíveis formas de dosagem sólida para a terapêutica é dada por Marshall, K. In: Modern Pharmaceutics Edited by G.S. Banker and C. T. Rhodes, Capítulo 10, 1979. Em geral, a formulação incluirá a proteína quimicamente modificada e ingredientes inertes que permitem a 9 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ protecção contra ο ambiente do estômago, e a libertação do material biologicamente activo no intestino.

Uma composição preferida é PEG-G-CSF associado a um lípido aniónico. Como descrito mais completamente no Exemplo 6 adiante, o PEG-G-CSF associado a um lípido aniónico demonstrou efeitos biológicos melhorados quando entregue no aparelho digestivo. Preferencialmente, utiliza-se dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG) como lípido aniónico, embora possam ser utilizados outros lípidos aniónicos. As vesículas lipídicas úteis nas composições do presente invento são os lipossomas negativamente carregados capazes de interagir com PEG-G-CSF. Os lípidos particulares contemplados para uso incluem: dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), fosfatidilglicerol de ovo, dioleoilfosfatidildietanolamina (DOPE), fosfatidildietanolamina de ovo, ácido dioleoilfosfatídico (DOPA), ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA), ácido dipalmitoilfosfatídico (DPPA), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dimiristoilfosfatidilserina (DMPS), dipalmitoilfosfatidilserina (DPPS), fosfatidilserina de ovo, lisofosfatidilglicerol, lisofosfatidiletanolamina e lisofosfatidilserina. Dependendo do lípido particular utilizado, a quantidade de lípido pode variar, e pode ser usada em diferentes combinações. Outros materiais e métodos relacionados com a utilização de lípidos aniónicos são descritos na patente US-A-5874075 intitulada, "Stable Proteins: Phopholipid Compositions and Methods, aqui incorporada por referência, e Collins et a!., intitulada "Enhanced stability of granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) after insertion into lipid membranes", J. Biochem. (em revisão). A localização preferida para libertação é o duodeno, como será demonstrado adiante. Embora a libertação no duodeno seja preferível para o efeito biológico óptimo para uma dada dose, a libertação em todo o aparelho digestivo resulta na assimilação do PEG-G-CSF como demonstrado adiante. Um perito na arte tem disponíveis formulações que não se dissolvem no estômago, e libertam o material no duodeno ou algures no intestino.

Para assegurar uma completa resistência gástrica é essencial um revestimento impermeável a, pelo menos, pH 5,0. Exemplos dos ingredientes 10 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ inertes mais comuns que são usados como revestimentos entéricos são o trimelitato de acetato de celulose (CAT), ftalato de hidroxipropilmetilcelulose (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, ftalato de poli(acetato de vinilo) (PVAP), Eudragit®L30D, Aquateric® ftalato de acetato de celulose (CAP), Eudragit® L, Eudragit® S e Shellac. Estes revestimentos podem usados como filmes mistos.

Podem também ser utilizados um revestimento ou uma mistura de revestimentos em comprimidos, que não se pretendem para protecção contra o estômago. Estes podem incluir revestimentos de açúcar, ou revestimentos que tornem os comprimidos mais fáceis de deglutir. As cápsulas podem consistir numa cobertura dura (tal como gelatina) para entrega do agente terapêutico seco, i.e. pó; para formas líquidas pode ser utilizada uma cobertura de gelatina mole. O material das coberturas de cápsulas lenticulares pode ser amido espesso ou outro papel comestível. Para pílulas, pastilhas, comprimidos moldados ou triturados de comprimidos, podem ser utilizadas técnicas de amassagem em húmido. 0 agente terapêutico pode ser incluído na formulação na forma de multiparticulados finos na forma de grânulos ou peletes com um tamanho de partícula de cerca de 1 mm. A formulação do material para a administração de cápsulas pode também estar na forma de pó, bujões ligeiramente prensados ou mesmo comprimidos. O agente terapêutico pode ser preparado por compressão.

Podem também ser incluídos agentes corantes e saborizantes.

Pode-se diluir ou aumentar o volume do agente terapêutico com um material inerte. Estes diluentes podem incluir hidratos de carbono, especialmente manitol, α-lactose, lactose anidra, celulose, sacarose, dextranos modificados e amido. Certos sais inorgânicos podem também ser usados como enchimentos incluindo o trifosfato de cálcio, o carbonato de magnésio e o cloreto de sódio. Alguns diluentes comercialmente disponíveis são o Fast-Flo®, Emdex®, STA-Rx® 1500, Emcompress® e Avicell®.

Os desintegrantes podem ser incluídos na formulação do agente terapêutico numa forma de dosagem sólida. Os materiais utilizados como desintegrantes incluem, mas não estão limitados a, amido, incluindo o desintegrante comercial à base de amido, Explotab®. O glicolato sódico de 11 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ amido, a Amberlite®, a carboximetilcelulose de sódio, a ultramilopectina, o alginato de sódio, a gelatina, a casca de laranja, a carboximetilcelulose ácida, a esponja natural e a bentonite, podem todos ser usados. Outra forma para os desintegrantes são as resinas de troca permuta catiónica insolúveis. Podem ser utilizadas gomas em pó como desintegrantes e como aglutinantes, e estas podem incluir gomas em pó tais como ágar, Karaya e adragante. O ácido algínico e o seu sal de sódio são também úteis como desintegrantes.

Podem ser utilizados aglutinantes para manter o agente terapêutico para formar um comprimido rígido e estes incluem materiais de produtos naturais tais como goma arábica, goma adragante, amido e gelatina. Outros incluem metilcelulose (MC), etilcelulose (EC) e carboximetilcelulose (CMC). A polivinilpirrolidona (PVP) e a hidroxipropilmetilcelulose (HPMC) podem ambas ser utilizadas em soluções alcoólicas para granular o agente terapêutico.

Pode ser incluído na formulação do agente terapêutico um agente anti-atrito para impedir a aderência durante o processo de formulação. Podem ser utilizados lubrificantes na forma de uma camada entre o agente terapêutico e a parede da matriz, e estes podem incluir, mas não lhes estão limitados, ácido esteárico incluindo os seus sais de magnésio e de cálcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafina liquida, óleos vegetais e ceras. Podem também ser utilizados lubrificantes solúveis como laurilsulfato sódico, laurilsulfato de magnésio, polietilenoglicol de vários pesos moleculares, Carbowax 4000 e 6000.

Os deslizantes que possam melhorar as propriedades de escoamento da droga durante a formulação e ajudar ao rearranjo durante a compressão, podem ser adicionados. Os deslizantes podem incluir amido, talco, sílica pirogénica e silicoaluminato hidratado.

Para ajudar a dissolução do agente terapêutico no ambiente aquoso pode-se adicionar um tensioactivo como agente molhante. Os tensioactivos podem incluir detergentes aniónicos como laurilsulfato de sódio, sulfossuccinato sódico de dioctilo e sulfonato sódico de dioctilo. Podem ser utilizados detergentes catiónicos e estes podem incluir cloreto de benzalcónio ou cloreto de benzetómio. A lista de potenciais detergentes não iónicos que podem ser incluídos na formulação como tensioactivos são lauromacrogol 400, estearato de polioxol 40, óleo de rícino hidrogenado com polioxietileno, 10, 50 e 60, 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ 12 monoestearato de glicerol, polisorbato 40, 60, 65 e 80, éster de ácidos gordos e sacarose, metilcelulose e carboximetilcelulose. Estes tensioactivos podem estar presentes na formulação do PEG-G-CSF sozinhos ou como uma mistura em diferentes proporções.

Os aditivos que potencialmente aumentam a assimilação da citóquina são, por exemplo, os ácidos gordos ácido oleico, ácido linoleico e ácido linolénico. A formulação de libertação controlada pode ser desejável. A droga pode ser incorporada numa matriz inerte que permita a libertação, por mecanismos de difusão ou lixiviação, i.e. gomas. Matrizes com degeneração lenta podem também ser incorporadas na formulação. Outra fora de uma libertação controlada deste agentes terapêutico é um método baseado no sistema terapêutico Oros (Alza Corp.), i.e. a droga é encerrada numa membrana semipermeável que permite à água entrar empurrar a droga para fora através de uma única pequena abertura devido a efeitos osmóticos. Alguns revestimentos entéricos também têm um efeito de libertação retardada.

Podem ser usados outros revestimentos para a formulação. Estes incluem uma variedade de açúcares que podem ser aplicados numa tina de revestimento. 0 agente terapêutico pode também ser dado num comprimido revestido com um filme e os materiais usados neste caso dividem-se em 2 grupos. O primeiro consiste nos materiais não entéricos e inclui metilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, metil-hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose sódica, providona e os polietilenoglicóis. O segundo grupo consiste nos materiais entéricos já descritos e que são habitualmente ésteres do ácido ftálico.

Pode ser usada uma mistura de materiais para proporcionar o revestimento com filme óptimo. 0 revestimento com filme pode ser efectuado numa tina da revestimento, ou num leito fluidizado ou por revestimento de compressão. A formulação preferida para a entrega oral de G-CSF é G-CSF humano recombinante (produzido num hospedeiro bacteriano por conveniência prática comercial), tal como Neupogen®, disponível de Amgen Inc., Thousand Oaks, 13 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ

Califórnia 91320-1789, com di-tri-tetra-ligação a PEG como descrito com maior detalhe adiante, e formulado de modo a entregar o G-CSF tratado com PEG no intestino delgado. Como será demonstrado adiante, o intestino delgado, mais particularmente, o duodeno, é o local preferencial para a libertação do G-CSF tratado com PEG a partir dos materiais inertes.

Estão também aqui contemplados processos para preparar as formas de dosagem oral designadas anteriores, bem como métodos de tratamento de um mamífero com necessidade disso por administração oral de uma formulação oral de uma proteína quimicamente modificada. Prefere-se um processo para a preparação de uma formulação de dosagem oral de G-CSF compreendendo: (a) a modificação química do referido G-CSF; e (b) a formulação desse G-CSF quimicamente modificado com um transportador farmaceuticamente aceitável para administração oral.

Outro aspecto do presente invento inclui a utilização do G-CSF quimicamente modificado para o fabrico de um medicamento útil para o tratamento, num mamífero, de uma condição caracterizada por uma diminuição na função hematopoiética, que compreende a administração oral de G-CSF quimicamente modificado, que pode incluir uma formulação oral farmaceuticamente aceitável.

As formulações específicas de certas indicações podem incluir outros agentes que não são inertes, tais como antibióticos, tais como ceftriaxona, para o tratamento concomitante de infecção. Outros agentes não inertes incluem os agentes de quimioterapia.

As condições aliviadas ou moduladas pela administração oral de G-CSF quimicamente modificado (ou análogos) são tipicamente aquelas que são caracterizadas por uma função hematopoiética ou imunitária reduzidas, e, mais especificamente, uma contagem de neutrófilos reduzida. Tais condições podem ser induzidas no decorrer de terapia para outros fins, como a quimioterapia ou a terapia de radiação. Tais condições podem resultar de uma doença infecciosa, tal como bacteriana, virai, fúngica ou outras doenças infecciosas. Por exemplo, a sépsia resulta de infecção bacteriana. Ou, tais condições podem ser hereditárias ou causadas pelo ambiente, como a neutropenia crónica grave ou leucemias. A idade pode também ser um factor, como na cena geriátrica, os 14 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ pacientes podem ter contagens de neutrófilos reduzidas ou mobilização de neutrófilos reduzida. Algumas destas condições são revistas em Filgastim (r-met Hu G-CSF) em Clinicai Practice, Mortyn, G. and T. M. Dexter, ed. Mareei Dekker, Inc., N.Y. (1993), pag. 351. Outras condições menos estudadas que podem ser aliviadas ou moduladas por administração oral podem incluir uma redução de lípidos (ou colesterol) na corrente sanguínea, e certas condições cardiovasculares, uma vez que o G-CSF pode induzir a produção de activadores de plasminogénio. O modo de acção do G-CSF (ou análogos) nestes cenários não é presentemente bem compreendido. A administração pode ser em combinação com outros agentes tais como antibióticos, outros factores hematopoiéticos, tais como interleucinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11 e IL-12), factores de actuação precoce tais como o Factor de Hemocitoblastos ou FLT3-L, eritropoietina, GM-CSF, IGF (tais como I e II), M-CSF, interferões (tais como, mas não se lhes limitando, alfa, beta, gama e de consenso), LIF, e CSF-1. Os peritos na arte reconhecerão quando a eficácia terapêutica requer a co-administração de um membro do grupo anterior, seja em simultâneo seja em sequência. A co-administração pode ser por uma via diferente (e.g. injecção ou infusão), ou pode ser oral, nasal ou pulmonar conforme o reconhecerá um médico especialista. À medida que são conduzidos mais estudos, vai emergindo informação relativa aos níveis de dosagem apropriados para o tratamento de várias condições em vários pacientes, e o trabalhador, considerando o contexto terapêutico, a idade e a saúde geral do receptor, será capaz de determinar a dosagem correcta. Em geral, a dosagem estará entre 0,01 pg/kg de peso corporal, (calculando a massa apenas do G-CSF sozinho, sem modificação química) e 100 pg/kg (baseado no mesmo).

Os exemplos que se seguem ilustram o trabalho do presente invento. O Exemplo 1 detalha os métodos de preparação de G-CSF humano recombinante e seu tratamento com PEG.

86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ 15 Ο Exemplo 2 descreve uma demonstração jn vitro de que uma proteína quimicamente modificada (G-CSF tratado com PEG) resiste à proteólise pela tripsina, que se encontra no intestino. O Exemplo 3 descreve o modelo m vivo usado para demonstrar a administração oral de uma proteína quimicamente modificada. Em ratos, o G-CSF tratado com PEG foi administrado directamente no duodeno, seja por via de uma bomba de infusão ou pela administração de um bolus. Deixou-se os animais recuperar, e recolheu-se sangue a intervalos variáveis para verificar dois parâmetros, a contagem total de glóbulos brancos, e os níveis no soro de G-CSF (através de detecção com anticorpos). Foi determinada a bioequivalência intraduodenal em comparação com a injecção intravenosa. Os resultados demonstram que (1) os animais com G-CSF tratado com PEG assim administrado demonstram um aumento nas contagens de glóbulos brancos sobre os controlos (com G-CSF não tratado com PEG ou apenas veículo); e (2) os animais com G-CSF tratado com PEG administrado demonstraram níveis de G-CSF no soro aumentados sobre os controlos (com G-CSF não tratado com PEG ou veículo apenas). Isto mostra que o G-CSF tratado com PEG, biologicamente activo, não apenas sobreviveu às condições no duodeno, como também permeou o forro intestinal para chegar à corrente sanguínea em níveis suficientes para estimular uma resposta terapêutica. O Exemplo 4 apresenta dados adicionais para os níveis de G-CSF no soro usando PEG-G-CSF iodado, que proporciona uma maior sensibilidade do que a detecção com anticorpos. Utilizando o ensaio mais sensível, demonstram-se os níveis da proteína no soro em estado estacionário ao longo do período de infusão intraduodenal. O Exemplo 5 descreve um protocolo jn vivo para a determinação da localização óptima no aparelho digestivo para libertação do G-CSF tratado com PEG, biologicamente activo. Esta informação é instrutiva para determinar a formulação de dosagem oral precisa, que um perito na arte pode preparar paro libertar nesta localização alvo. Em geral, num modelo de rato, isolaram-se fisicamente porções do aparelho digestivo por laqueação cirúrgica e corte das secções (no duodeno, jejuno, íleo ou cólon). O G-CSF tratado com PEG foi administrado na secção intestinal isolada, e monitorizaram-se amostras de sangue quanto aos níveis de rhG-CSF no soro por ELISA. Embora houvessem 16 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ níveis detectáveis do PEG-G-CSF no soro de todas as porções do aparelho digestivo, os resultados indicam que o PEG-G-CSF administrado ao duodeno e ao íleo é óptimo (os maiores níveis séricos). O Exemplo 6 demonstra que o PEG-G-CSF associado a um transportador lipídico melhora a resposta terapêutica eliciada pelo PEG-G-CSF entregue no duodeno. O PEG-G-CSF foi formulado usando um lípido aniónico, e entregue intraduodenalmente. Os resultados mostram uma contagem de glóbulos brancos mais elevada quando comparada com o PEG-G-CSF sozinho.

Breve Descricão Das Figuras A FIGURA 1 ilustra o tracto gastrointestinal do roedor, e apresenta um diagrama do modelo in vivo da entrega intraduodenal aqui utilizada. A FIGURA 2 ilustra a resistência G-CSF de tratado com PEG à proteólise pela tripsina num ensaio in vitro. A FIGURA 3 ilustra a resposta total de glóbulos brancos a PEG-G-CSF dado por infusão intraduodenal, comparado com PEG-G-CSF administrado por i.v., e rhG-CSF não tratado com PEG e um veículo administrado por infusão intraduodenal. A FIGURA 4 ilustra os níveis de rhG-CSF no soro após administração intravenosa e intraduodenal de PEG-G-CSF por infusão. A FIGURA 5 ilustra a resposta total de glóbulos brancos a PEG-G-CSF administrado por bolus intraduodenal e intravenoso e G-CSF não tratado com PEG dado unicamente por bolus intraduodenal. A FIGURA 6 ilustra os níveis de rhG-CSF no soro em resposta a administração intraduodenal e intravenosa de bolus de PEG-G-CSF. Também é mostrado o nível de rhG-CSF no soro em resposta a administração intraduodenal de bolus de rhG-CSF não tratado com PEG. A FIGURA 7 (a) ilustra uma comparação de infusão com bomba intravenosa e intraduodenal, dos níveis de PEG-G-CSF marcado com 125l no 17 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ soro. A FIGURA 7 (b) ilustra uma comparação da AUC para cada rato após administração intravenosa e intraduodenal de 125I-PEG-G-CSF. A FIGURA 8 (a) e (b) ilustram os níveis de rhG-CSF no soro após administração de PEG-G-CSF a diferentes secções do aparelho digestivo do rato. A FIGURA 9 é um gráfico de barras ilustrando a AUC média simples dos níveis de rhG-CSF no soro após administração de PEG-G-CSF a diferentes secções do aparelho digestivo do rato. A FIGURA 10 (a) é um gráfico que ilustra o efeito de DOPG na resposta total de GB à infusão intraduodenal de rhG-CSF. A FIGURA 10 (b) é um gráfico ilustrando esta resposta usando PEG-G-CSF. A FIGURA 11 é um gráfico ilustrando o efeito de DOPG nos níveis de PEG-G-CSF no soro após infusão com bomba intraduodenal.

Descrição Detalhada Do Invento

Exemplo 1: Preparação de G-CSF tratado com PEG A. Preparação de met-G-CSF Humano Recombinante

Preparou-se met-G-CSF humano recombinante como foi descrito acima de acordo com os métodos na patente de Souza, Pat. US N° 4,810,643. O rhG-CSF empregue era um produto de expressão recombinante derivado de E. coli possuindo a sequência de aminoácidos (codificada pela sequência de ADN) apresentada abaixo (Seq. ID NO. 1 e 2). (Segue Sequência) 18 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ

Swr ÀAVJ ACT CCA TTA GGT CCT GCT AGC TCT CTG CCG CAA AGC CTG M p L G p A S s 2 p a S 5* T *a CTG AAA TGT CTG GAA CAG GTT CGT AAA ATC CAG GGT GAC GGT GCT - K C L Ξ Q V R K Q G D G A GCA CTG CAA GAA AAA CTG TGC GCT ACT TAC AAA CTG TGw CAT A L Q 2 X ia C A V X L C a ? GAA GAG CTG GTA CTG CTG GGT CAT GGG ATC CCG TGG GCT 2 - T ia V Tj u G a S ia υ : p W A CCS CTG TCT TGT CCA rfl^m CAA CAG CTG GCT GCT TGT p L s s C p s Q A ia Q T *a A G c CTG «*<***· λ W — CAA CTG CAT TCT GGT CTG TTC CTG CAG GGT CTT CTG T ΛΛ s Q L H s G L γ a G L II CAA GCT CTG GAA GGT ATC TCT CCG GAA CTG GGT CCG ACT CTG GAC Q A ia Q G I s p E Λα G ? T O ACT CTG CAG CTA GAT GTA GCT GAC TTT GCT ACT ACT ATT TGG CAA T u Q L D V A D A T m a 2 W a CAG ATG GAA GAG CTC GGT ATG GCA CCA GCT CTG CAA CCG ACT CAA Q M 2 2 G M A P A Λα Q p A Q GGT GCT ATG CCG GCA "*TC GCT GCA TTC CAG CGT CGT GCA GGA G A M P A P* A S A y a R R A G GGT GTA CTG GTT GCT TCT CAT CTG CAA • w- TTC CTG GAA GTA TCT G V T, V A s H I, Q s 2 V 3 TAC C3T GTT CTG CGT CAT CTG GCT CAG CCG TAA TAG V A V A A H L A Q p * (Esta foi também a composição sem tratamento com PEG usada para os animais controlo). Alternativamente, pode-se utilizar o Neupogen® comprado para os seguintes procedimentos de tratamento com PEG (a bula da embalagem dos E.U.A é aqui incorporada por referência). O material humano recombinante foi aqui utilizado para os estudos em roedores. É evidente que, se for desejado, quando se tratam mamíferos que não humanos, podem-se utilizar G-CSF recombinantes não humanos, tal como recombinante murino, bovino, canino, etc. Veja, por exemplo, PCT WO 9105798 e PCT WO 8910932. B. Preparação de G-CSF Quimicamente Modificado

Utilizou-se met-G-CSF humano recombinante com predominantemente duas, três ou quatro moléculas de polietilenoglicol ligadas, nos exemplos que utilizaram G-CSF tratado com PEG. A ligação foi efectuada através dos grupos amino reactivos. O peso molecular médio do G-CSF tratado com PEG era entre cerca de 36 500 Dalton e cerca de 42 500 Dalton, sendo o peso molecular das cadeias de polietilenoglicol de cerca de 6 000 Dalton cada uma. (0 peso molecular médio para este material estava entre cerca de 29kDa e cerca de 90kDA, como determinado por SDS PAGE). Como indicado acima, a molécula 19 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ de polietilenoglicol empregue pode ter vários tamanhos, contudo, estudos anteriores (dados não mostrados) indicaram que usando G-CSF tratado com PEG com predominância de duas a três moléculas de PEG-2000 resultou numa rápida depuração, e portanto, sem circulação sustentada (o que pode ser indesejável para entrega oral). O nível de derivatização com polietilenoglicol foi determinado como sendo: 3,4% de mono-ligação a PEG; 31,9% de di-ligação a PEG; 49,3% de tri-ligação a PEG e 15,4% de tetra-ligação a PEG. A actividade biológica jn vitro (como determinada por ensaios de assimilação de H3-timidina) foi determinada como sendo de 9% em comparação com o metG-CSF recombinante não tratado com PEG. A actividade biológica in vivo foi determinada como sendo de 268% de metG-CSF recombinante não tratado com PEG.

Utilizou-se o seguinte método para preparar o G-CSF tratado com PEG utilizado nos estudos aqui descritos. O polietilenoglicol foi preparado em três passos: Primeiro, realizou-se a síntese de éster etílico de a-carboximetil-ro-metoxipolietilenoglicol (CM-MPEG). Dissolveram-se 8,3 mmol de monometoxipolietilenoglicol (MPEG) da Union Carbide, (PM = 6 000) em 300 ml de t-butanol a 50°C sob azoto. Adicionaram-se então 84 mmol de bromoacetato de etilo e incubou-se outra vez O/N a 50°C. Após filtração através de um funil de vidro sintetizado e a adição de 200 ml de cloreto de metileno, o filtrado foi concentrado 5 vezes sob vácuo. O éster etílico de CM-MPEG foi então precipitado por adição de 1 volume do filtrado concentrado a 5-10 volumes de éter dietílico a 4°C, e foi recolhido num funil de vidro sintetizado e foi seco.

Em seguida, foi realizada a síntese de a-carboximetil-ω- metoxipolietilenoglicol (CM-MPEG). Dissolveram-se 50 g de éster etílico de CM-MPEG em 200 ml de NaOHO,1 M. Após incubação O/N à temperatura ambiente sob azoto, a solução foi arrefecida a 4°C e o pH foi ajustado a 3 com HCI 2 N. Juntou 3e NaCI até à saturação antes da extracção (3x) com iguais volumes de cloreto de metileno. A fase orgânica combinada foi seca sobre sulfato de magnésio anidro, filtrado e concentrado até um volume final de 100 ml. O CM-MPEG foi precipitado por adição a 500 ml de éter dietílico a 4°C, foi recolhido, e dissolveram-se novamente 50 g em 150 ml de NaOH 0,1 Μ, o 20 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ CM-MPEG foi novamente precipitado por adição de 500 ml de éter dietílico a 4°C, recolhido e seco.

Em seguida completou-se a síntese de éster N-hidroxisuccinimidilo de carboximetilmetoxipolietilenoglicol (SCM-MPEG). Com 120 ml de cloreto de metileno anidro combinaram-se 5 mmol do CM-MPEG, 10mmol de N-hidroxissuccinimida (NHS) e 10 mmol de diciclo-hexicarbodiimida (DCC). Após incubação durante 8 horas à temperatura ambiente, a diciclo-hexilureia precipitada foi removida por filtração e o filtrado foi concentrado para 50 ml antes da adição a 600 ml de éter dietílico a 4°C. O SMC-MPEG precipitado foi recolhido por filtração num funil de vidro sintetizado e redissolvido em cloreto de metileno anidro. Após uma segunda precipitação com éter dietílico, o SCM-MPEG foi recolhido e seco. O SCM-MPEG foi caracterizado por análise espectroscópica e HPLC antes da conjugação a rhG-CSF. A 100 ml de uma solução de rhG-CSF a 10 mg/ml, em Bicina 100 mM, pH 8,0, adicionou-se um excesso molar de 15 vezes do éster N-hidroxissuccinimidilo de carboximetilmetoxipolietilenoglicol (SCM-MPEG, preparado como acima). A reacção durou 1 hora à temperatura ambiente antes da diluição (x5) com água destilada para um volume total de 500 ml. O pH foi ajustado a 4,0 com HCI ImM. O PEG-G-CSF foi purificado por FPLC usando uma coluna Toyopearl SP 550C (5 x 17 cm) (Pharmacia), pré-lavada com 700 ml de NaOH 0,2N, e pré-equilibrada com 1,3 I de tampão da coluna, tampão acetato de sódio 20 mM, pH 4,0. A mistura reaccional foi carregada na coluna a um caudal de 8 ml/minuto, e a coluna foi então lavada com 1 I de tampão da coluna. Bombearam-se 1,3 I de tampão de eluição, tampão da coluna contendo NaCI 1 M, para a coluna, na forma de um gradiente em passos, e o PEG-G-CSF foi aluído a NaCI 350 mM.

As fracções contendo o PEG-G-CSF foram reunidas, concentradas para aproximadamente 100ml numa célula Amicon agitada usando uma membrana de ultrafiltração Diaflo com 76 mm de diâmetro, YM10 (Amicon). Trocou-se 21 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ então ο tampão do PEG-G-CSF usando 600 ml de tampão de formulação, acetato de sódio 10 mM, pH 4,0 e manitol a 5% e Tween 80 a 0,004%. A A280 foi determinada e a proteína foi diluída para 1 mg/ml com tampão de formulação, foi esterilizada por filtração e enfrascada. A actividade biológica in vitro G-CSF do tratado com PEG foi determinada por medição da assimilação estimulada de 3H-timidina pelas células de medula óssea de ratinho antes da utilização nos estudos que se seguem. A actividade biológica in vivo e foi também determinada antes da utilização, por injecção subcutânea de hamsters (com 20 ou 100 pg/kg de PEG-G-CSF) e medição da contagem total de glóbulos brancos. A bioactividade comparada com o G-CSF não tratado com PEG foi calculada como a área sob a curva de glóbulos brancos/tempo após subtracção da curva de controlo do veículo. A bioactividade relativa do PEG-G-CSF foi expressa como a percentagem de bioactividade comparada com G-CSF não modificado (AUCtest/AUCG_CSF x 100).

Exemplo 2: Proteccão In Vitro Contra Proteases que se Encontram No Intestino

Este estudo demonstra que in vitro. o G-CSF tratado com PEG é extremamente resistente (sem outra formulação protectora) à proteólise pela enzima tripsina que se encontra no intestino. Embora não conclusivo, este modelo é indicativo de condições in vivo no intestino porque foram usadas aproximadamente as mesmas proporções de enzimas e as mesmas condições fisiológicas (pH, temperatura, salinidade).

Genericamente, o G-CSF tratado com PEG (preparado como acima) foi incubado com tripsina, e a reacção foi terminada após vários intervalos de tempo ao longo de 4 horas de incubação. Amostras recolhidas nestes tempos foram testadas quanto à degradação, por SDS-PAGE e por transferência de Western utilizando anticorpos contra G-CSF, detectados usando proteína A iodada. Os resultados, como apresentados no gráfico da FIGURA 2 demonstram os efeitos protectores do tratamento com PEG: após 30 minutos, mais de 90% do material tratado com PEG estava intacto, enquanto que aproximadamente 55% do material não tratado com PEG estava intacto; após 240 minutos, pelo menos 90% do material tratado com PEG permanecia enquanto que o material não tratado com PEG tinha caído para menos de 30%. in vivo, haverá outras enzimas, e factores adicionais que afectam a taxa de degradação. 22 r~ 86 996

EP 0 726 778/PT

Os métodos foram como se segue: rhG-CSF ou PEG-GCSF preparados como acima, a 100 μ/ml, num volume total de 5 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) foram incubados a 37°C com tripsina (1 pg/ml, Sigma St. Louis, MO). Para os tempos indicados a 37°C. Nos pontos temporais apropriados, retiraram-se 200 μΙ de amostra que se adicionaram a um tubo de Eppendorf a 4°C contendo 9 μΙ de uma mistura inibidora de proteases, consistindo em N-tosil-L-lisina-clorometilcetona (TLCK), 20 pg; (4-amidinofenil)metanossulfonilfluoreto (APMSF), 16 pg; e alfa-2-macroglobulina, 1 UI, (todos da Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Após agitação minuciosa, 5μΙ da amostra (5 pg de G-CSF) foram diluídos para 5 pg/ml em PBS. Fizeram-se então correr 50 ng da proteína, sob condições redutoras, como descrito por Laemmli (Nature 227: 680-685 (1970) em SDS-PAGE (Integrated Separations Systems or ISS, Natich, MA). Após transferência, a proteína foi detectada por incubação com um anticorpo policlonal para rhG-CSF. O anticorpo anti-G-CSF ligado foi então detectado por· incubação das manchas com proteína A marcada com 125l (Amersham, Arlington Heights, IL) e autorradiografia. A quantificação da proteína intacta remanescente e dos produtos de degradação foi efectuada por corte e contagem do Immobilon utilizando a autorradiografia como molde.

Exemplo 3: A administração Duodenal In Vivo De G-CSF tratado com PEG Resulta Em Efeitos Biológicos O modelo de rato ]n vivo, ao qual o PEG-G-CSF é administrado directamente no duodeno, é indicativo de administração oral porque, como é realçado acima, existem formulações para a entrega de agentes terapêuticos no intestino, para lá do ambiente hostil da boca, esófago e estômago. Os animais com G-CSF tratado com PEG assim administrado demonstraram uma contagem de glóbulos brancos aumentada sobre os controlos (apenas com veículo). Isto mostra que o G-CSF tratado com PEG, biologicamente activo, não só sobreviveu às condições no duodeno, como também passou através do forro intestinal para a corrente sanguínea.

Análise adicional comparou os efeitos de administração intraduodenal com a administração intravenosa. Esta análise de bioequivalência demonstrou que quando comparada com a administração intravenosa, o PEG-G-CSF administrado intraduodenalmente (1) tinha 4-5% da eficácia biológica (como 23 86 996 EP 0 726 778/PT determinado pela contagem de glóbulos brancos totais após 90 horas), e (2) tinha aproximadamente 2% do nível sérico (como determinado por ELISA após 90 horas). O modo de dosagem foi também comparado i.e. administração crónica vs. aguda, comparando as resposta para administração de PEG-GCSF por infusão e bolus.

Materiais e Métodos A. Animais. Foram usados ratos machos SPF Sprague -Dawley, pesando entre 250-350 gramas, tratados de acordo com todas as leis e regulamentos aplicáveis. Para cada um dos grupos abaixo, utilizaram-se quatro ou cinco animais. B. Cirurgia. Os animais foram anestesiados com 50mg/kg de Nembutol intraperitoneal. Em cada animal, o duodeno foi exposto e foi feita uma pequena incisão na parede do duodeno. Um cateter (usado para a entrega da droga) [10 cm de tubo silástico de tipo médico, 0,02x 0,037 in., Baxter, Irvine, CA] foi inserido no extremo distai do duodeno (aproximadamente 8 cm) de tal maneira que o PEG-G-CSF não poderia entrar na corrente sanguínea através da incisão cirúrgica (tendo deste modo um efeito de um artefacto). Para além disso, a libertação da droga no extremo distai do duodeno (a parte próxima do jejuno) proporciona algumas indicações do efeito de uma formulação concebida para libertar composto activo no duodeno {i.e. a libertação típica pode ser imediatamente acima da fronteira duodeno/jejuno). A libertação no extremo distai impede o influxo de bílis que contém proteases. Após administração de PEG-G-CSF, a incisão foi fechada com uma sutura em cordão de bolsa, e os animais foram mantidos como é habitual. C. Administração. A administração do G-CSF tratado com PEG foi efectuada de duas maneiras, (1) por administração directa de bolus através do cateter e (2) através de implante de bomba de infusão (para administração contínua ao longo de um período de 24 horas). Para cada tipo de administração, foi usado um grupo de controlo com G-CSF não tratado com PEG, bem como controlos com veículo.

Para a administração intraduodenal de bolus, o PEG-G-CSF (preparado como acima) foi colocado numa seringa de 1cc com um tubo adaptador, e então foi injectada directamente no duodeno através de um cateter. As 24 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ proteínas foram injectadas no duodeno nas doses indicadas, em 200 μΙ de tampão de formulação, acetato de sódio 10 mM, pH 4,0 e Tween 80 a 0,004%. O cateter foi retirado, e a sutura foi firmemente fechada. Deixou-se o animal recuperar.

Para administração intravenosa de bolus (usada como controlo) administraram-se 200 μΙ de tampão de formulação contendo a dose necessária de proteína, através da veia peniana.

Para a infusão intraduodenal com bomba, colocou-se uma bomba osmótica [Alzet, mini-bomba osmótica, modelo 2001D (Alza) Paio Alto, CA] na ponta do cateter localizado na cavidade peritoneal (Veja a FIGURA 1). Antes de tal colocação, a bomba foi previamente cheia com G-CSF tratado com PEG (preparado como acima) ou controlos, na dose indicada, em 221 μΙ de tampão de formulação, e a bomba foi activada através de meios osmóticos (absorvendo de água do animal para fazer sair a droga) para entregar 8-9 μΙ/h durante 24 horas. Em todos os casos, o valor dado para a dose refere-se à dose total ao longo de 24 horas. A incisão foi fechada, e deixou-se o animal recuperar.

Para a infusão por bomba intravenosa das proteínas, foi feita uma incisão (3-4 cm) sob o pescoço do rato. Expôs-se a veia jugular esquerda, e o cateter silástico com 10 cm foi introduzido 2 cm na veia. A bomba Alzet contendo as proteínas foi fixada ao cateter, e implantada na nuca entre as omoplatas. D. Dosagem. Para a infusão intraduodenal, administraram-se aos animais as proteínas, tanto PEG-GCSF como GCSF não tratado com PEG, em doses superiores a 750 pg/kg ao longo de 24 horas (para as verdadeiras quantidades veja as Figuras). Para as infusões intravenosas as doses das proteínas foram inferiores a 50 pg/kg ao longo de 24 horas. Aos animais que receberam as proteínas por administração intraduodenal de bolus foram dadas doses de 500 μ9^ enquanto que a dose do bolus intravenoso foi ”5 pg/kg. E. Monitorização. Para os estudos de infusão intraduodenal, recolheram-se amostras de sangue (500 μΙ) da veia da cauda em cada grupo de teste e de controlo, em intervalos de doze horas durante 96 horas. Para os estudos de injecção de bolus recolheram-se quer por via intraduodenal quer 25 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ intravenosa, amostras de sangue (500 μΙ) através de uma cânula residente colocada na veia jugular direita. As cânulas foram implantadas 2 dias antes da administração das drogas para permitir que os animais recuperassem, e foram mantidas desobstruídas por lavagem com jacto, duas vezes ao dia, com 100 μΙ de solução salina contendo 20 U/ml de heparina.

As contagens de glóbulos brancos totais foram determinadas usando um contador de microcélulas F-800, Sysmex (Baxter, Irvine, CA). O soro foi preparado por centrifugação das amostra de sangue numa centrífuga Eppendorf a 12000 rpm, 11750 x g, durante 15 minutos. O soro foi removido e armazenado a -80°C até poder ser efectuado um ELISA para o rhG-CSF.

Os níveis no soro, de PEG-G-CSF e de G-CSF não tratado com PEG, foram determinados por ELISA, contendo um anticorpo monoclonal específico para o G-CSF, (Quantikine, obtido de R&D Systems, Indianapolis, Indiana, US), de acordo com as instruções, que é aqui incorporado para referência. Estabeleceram-se curvas padrão de 5000 pg/ml a 78 pg/ml da mesma exacta proteína que foi administrada aos animais. Os níveis das proteínas no soro foram então determinados a partir da curva relevante.

Resultados 1. Infusão intraduodenal (FIGURAS 3 e 4). Como se pode observar na Figura 3, o grupo que recebeu PEG-GCSF intraduodenalmente tinha contagens de glóbulos brancos totais às 12 horas ("36 000/1) muito superiores às que tinham os controlos intraduodenais sem tratamento com PEG (16 000/μΙ). Também se observar que este último grupo não subiu para além da linha de base (T = 0) da contagem de glóbulos brancos, como também é o caso do grupo de veículo i.d. (veja FIGURE 3). Um ponto interessante a notar é que o PEG-G-CSF dado intraduodenalmente estimula um aumento mais precoce de glóbulos brancos do que a administração intravenosa. Contudo, as doses para as administrações intraduodenal e intravenosa são muito diferentes (visto que a comparação destas respostas foi para a determinação de bioequivaiências, veja a Tabela 2). Este aumento mais precoce de glóbulos brancos pode ser um resultado das diferentes doses ou vias de administração na medida em que (a) pode haver uma diferença na taxa de produção de glóbulos brancos ou (b) pode haver uma diferença na activação de neutrófilos e portanto marginação, ou (c) uma combinação de ambos. Outra observação é que nenhum dos grupos, com 26 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ G-CSF não tratado com PEG ou com veículo, apresentou contagens de glóbulos brancos elevados antes de 48 horas (depois da resposta ao PEG-G-CSF começar a decrescer), e isto pode ser devido a rejeição da bomba osmótica ou outro artefacto imunitário.

Os níveis séricos para a mesma experiência são apresentados na Figura 4. Não são apresentados valores para o grupo de controlo do CSF não tratado com PEG, já que o ensaio ELISA não mostrou níveis detectáveis de rhG-CSF no soro (i.e. menor que 50 pg/ml). Os níveis séricos atingidos por infusão intraduodenal e intravenosa de PEG-G-CSF não são directamente comparáveis devido à diferença na dose. Em seu lugar, foram usados para a determinação da biodisponibilidade e são apresentados na Tabela 2. Pode ver-se no entanto que os níveis séricos de PEG-G-CSF estão muito elevados para a proteína após infusão intraduodenal, quando comparada com os níveis não detectáveis após administração, pela mesma via, de GCSF não tratado com PEG. 2. Administração de bolus (FIGURAS 5 e 6) . Como se pode observar na FIGURA 5, os GB totais para o grupo de teste às 5 horas eram aproximadamente 21 500/μΙ, enquanto que para o grupo de controlo G-CSF, o nível às 5 horas era muito menor (aproximadamente 16 000 μΙ) que não aumentou significativamente acima da linha de base (T = 0). Como também se pode observar nesta FIGURA, o G-CSF sozinho produziu algum efeito a curto prazo, indicando que o forro intestinal permitiu a travessia tanto pelas moléculas maiores, ligadas a PEG, como pelas moléculas menores, não alteradas. Os níveis sustentados de GB para o produto tratado com PEG indicam que há protecção do ambiente duodenal, assim como um aumento do tempo de circulação no soro quando comparado com GCSF não tratado com PEG. A mesma subida rápida de GB é observada com a administração i.d. comparada com a i.v. A FIGURA 6 ilustra os níveis séricos determinados por ELISA, de PEG-G-CSF administrado quer pela via i.d. quer i.v., e material não tratado com PEG administrado por via i.d. Para o grupo com tratamento com PEG, os níveis séricos permaneceram relativamente constantes durante as primeiras seis horas, e decresceram gradualmente depois disso, sendo o decréscimo paralelo ao do material administrado i.v.. Como se pode observar, os níveis séricos para o G-CSF não tratado com PEG eram metade dos valores do grupo com PEG-G-CSF e eram extremamente variáveis (alguns animais tinham quantidades não detectáveis), e abaixo do nível de detecção em todo o grupo após 6 horas. 27 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ 3. Análise de bioequivalência. Foi executada uma análise para comparar a administração intraduodenal das proteínas com a administração intravenosa. Os resultados mostram que a administração intraduodenal pelo método da infusão tem entre 4% e 5% de eficácia biológica ("bioequivalência") de G-CSF tratado com PEG administrado por via intravenosa, como determinado por contagem dos glóbulos brancos. Estes dados de contagem de GB são apresentados na Tabela 1, abaixo. A biodisponibilidade, como determinada pelos níveis séricos (1,8%) é algo inferior à que é determinada pelos GB (4,6%). Os dados dos níveis séricos são apresentados na Tabela 2 abaixo.

Em geral, a % de bioequivalência é determinada por medição da área sob a curva ("AUC") de contagem de glóbulos brancos para material administrado intraduodenalmente ("i.d.") (corrigido para o veículo), e dividindo esse número pela AUC para material administrado por via intravenosa ("i.v.") (mais uma vez corrigido para o veículo). Este número é multiplicado pela dosagem recíproca. O produto é multiplicado por 100 para obter a percentagem. Para a biodisponibilidade em termos de soro, o cálculo é o mesmo. A equação pode ser representada como: % Bioequivalência = AUCid x Dose iv x 100 AUCiv Dose id

Nas tabelas abaixo, e notação "ND" significa não detectável.

Tabela 1

Bioequivalência do PEG-G-CSFid vs. PEG-G-CSFiv Como determinada utilizando contagens de glóbulos brancos

Proteína Administração Dose AUC média simples % Bio (Pfl/ Kfl) (horas/AUC) eauiv. rhG-CSF 24 horas de infusão iv 25 90 h/1488 100 rhG-CSF 24 horas de infusão id 755 90 h/ ND 0 PEG-G-CSF 24 horas de infusão iv 50 90h/1136 100 PEG-G-CSF 24 horas de infusão id 823 90h/852,42 4,6 28 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ rhG-CSF bolus iv 50 24h/216 100 rhG-CSF bolus id 500 24h/40,2 1,86 PEG-G-CSF bolus iv 5,96 24h/234 100 PEG-G-CSF bolus id 500 24h/1 56 0,84 TABELA 2

Biodisponibilidade do PEG-G-CSFjd vs. PEG-G-CSFiv Como Determinado Usando Níveis no Soro

Proteína Administração Dose (ma/ka) AUC Média simoles (horas/AUC) Bioeauivalência (%) rhG-CSF 24 horas de infusão iv 25 90horas/2,0x 105 100 rhG-CSF 24 horas de infusão id 755 90horas/ND 0 PEG-G-CSF 24horas de infusão iv 50 90 horas/2,1 7x106 100 PEG-G-CSF 24horas de infusão id 823 90 horas/6,3x105 1,8 rhG-CSF bolus iv 50 24horas/7,23x107 100 rhG-CSF bolus id 500 24horas/1,8x 103 0,00025 PEG-G-CSF bolus iv 5,96 24horas/2,7 x105 100 PEG-G-CSF bolus id 500 24horas/1,1x104 0,05

Assim, de forma importante, a Tabela 1 mostra que após 24 horas de infusão i.d. de PEG-G-CSF, o material entrou na corrente sanguínea e tem uma resposta biológica mensurável, que é muito maior (4,6%) que para o rhG-CSF nativo (0%). De facto, o rhG-CSF não tratado com PEG não estimula qualquer resposta de glóbulos brancos quando administrado por infusão i.d., nem são detectáveis níveis de proteína no soro.

Em contraste, a administração de bolus de PEG-G-CSF e de rhG-CSF não resultou em diferenças tão grandes entre as duas proteínas. A razão as respostas quase equivalentes de glóbulos brancos para o PEG-G-CSF e para o G-CSF nativo assenta provavelmente no facto de os pontos no tempo não terem sido recolhidos para além de 24 horas, e por isso não foi medida a maior parte da resposta ao PEG-G-CSF i.e. glóbulos brancos elevados prolongados. Uma comparação dos níveis séricos de PEG-G-CSF e rhG-CSF ao longo do 86 996

EP 0 726 778/PT período de exactamente 24 horas mostra muito maior biodisponibilidade da proteína tratada com PEG, sendo a AUC 10 vezes maior. Pode-se contudo observar que os níveis séricos que se seguem à administração de bolus de PEG-G-CSF são muito menores do que seguindo o método da infusão, 0,05% de biodisponibilidade em comparação com 1,8%. Parece assim que o método da infusão para a administração da proteína produz as melhores biodisponibilidade e respostas terapêuticas e que seria preferível uma formulação em comprimido que produz uma exposição prolongada e sustentada do sistema digestivo ao PEG-G-CSF.

Estes dados são adicionalmente ilustrados na FIGURA 3. Como pode ser observado, o PEG-G-CSF por administração intraduodenal tem um efeito mais precoce sobre a contagem de glóbulos brancos do que o PEG-G-CSF administrado por via intravenosa. Também são mostrados o veículo e os controlos de G-CSF não tratado com PEG, que não apresentam este aumento na contagem de glóbulos brancos. 0 aumento mostrado às 48 horas para o veículo pode ser devido a rejeição da bomba osmótica ou outro artefacto imunitário. t

A FIGURA 4 ilustra ainda a administração intravenosa e intraduodenal de PEG-G-CSF. Embora as doses administradas sejam muito diferentes, a FIGURA 4 mostra que a taxa de depuração do PEG-GCSF administrado i.d. é semelhante à do material administrado por via intravenosa. Novamente, como mostrado pelos dados da Tabela 1, os níveis séricos de G-CSF não tratado com PEG não foram mensuráveis.

Em resumo, os estudos in vivo demonstram aqui a disponibilidade de uma proteína quimicamente modificada para assimilação pelo intestino e, muito importante, a actividade terapêutica de tal proteína. Mais particularmente, os estudos demonstram que o G-CSF o tratado com PEG entregue no intestino está presente na corrente sanguínea e causa um aumento nos glóbulos brancos, e que a formulação oral de tal composição será um agente terapêutico útil. EXEMPLO 4: Confirmação dos Níveis de Soro

Uma observação interessante utilizando o ensaio ELISA foi que, para o sistema de infusão, os níveis séricos de PEG-GCSF desceram enquanto a bomba estava em operação. Para além disso, a biodisponibilidade da proteína dada pelos valores séricos foi consistentemente menor que os valores de 30 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ bioequivalência, i.e.. a resposta, e isto foi especialmente verdadeiro para dados de administração de bolus. Para confirmar estes dados utilizou-se um ensaio mais sensível. Os dados foram confirmados (veja a Tabela 3, abaixo). Uma explicação para esta ocorrência é que a resposta inicial a PEG-G-CSF causa um rápido aumento do nível de neutrófilos. Criando este rápido aumento também há um aumento da aparente depuração da proteína, possivelmente devido a um aumento do número de receptores de G-CSF nos neutrófilos. À medida que a contagem de neutrófilos aumenta, os níveis séricos da proteína parecem diminuir (porque está ligada aos neutrófilos e portanto não aparece no soro e assim não há acumulação de PEG-G-CSF no soro). Isto é consistente com os resultados publicados em outras publicações. G. Morstyn et ai, TIPS 10: 154-159 (1989); Layton et a/., Blood 74 : 1303-1307 (1989).

Para este ensaio foi utilizado PEG-G-CSF marcado com 125l, tal como o foram os métodos i.v. e i.d. como descritos acima. A diferença é a dosagem, foi aqui utilizada 1/1000 da dose relativamente aos estudos anteriores: 661 nanogramas/kg para administração intravenosa, e 728 nanogramas/kg para administração intraduodenal (enquanto que anteriormente foram utilizadas quantidades de microgramas). Os níveis sanguíneos totais de marcador 125l precipitável com TCA foram determinados num contador gama Cobra 5000 (Packard, Downers Grove IL), e os dados foram convertidos em picogramas por ml.

Os resultados de ambas as administrações, intravenosa e intraduodenal, de PEG-G-CSF marcado com 125l são apresentadas na FIGURA 7a. Como se pode observar, administrando doses baixas, não terapêuticas das proteínas, e assim não estimulando a elevação de neutrófilos, conseguiram-se atingir níveis estacionários do PEG-G-CSF por ambas as vias. Quando as bombas terminaram às 24 horas, os níveis da proteína caíram no sangue em paralelo com o que se esperaria. Mesmo com a maior sensibilidade de detecção deste método, os níveis sanguíneos não são detectáveis abaixo de 20 pg/ml (veja administração i.d.). 0 cálculo da AUC individual para cada animal no grupo é mostrado na FIGURA 7b e sem a mudança na depuração da proteína, é uma medição mais precisa da biodisponibilidade real. Os resultados estão resumidos abaixo na Tabela 3. 31 80 990 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ

Tabela 3

Biodisponibilidade de PEG-G-CSFid marcado com ,23l vs PEG-G-CSFjv marcado com 125l, determinada usando níveis sanguíneos totais.

Proteína Administração Doses (nq/kq) Média simples AUC (h/AUC) Biodispo- nibilidade% 125I-PEG-G-CSF 24 horas infusão i.v. 0,661 48hrs/ 71,986 + 8769 100 125I-PEG-G-CSF 24 horas infusão i.d. 0,728 48hrs/ 2,732+192 3,5

Os dados para a AUC dão um valor para a biodisponibilidade de 3,5% em comparação com a administração intravenosa, que é mais próximo do número da bioequivalência de 4,6% apresentado na Tabela 1.

Exemplo 5: Localização Do Alvo Da Entrega No Intestino Delgado

Como descrito acima, estão disponíveis na arte uma variedade de formulações de dosagem oral, e um aspecto é a formulação de tal forma que o comprimido (ou cápsula, etc.) se dissolva numa localização desejada no sistema digestivo. Este estudo in situ foi concebido para encontrar a localização no intestino delgado que origina a biodisponibilidade óptima (neste caso, máxima) conforme determinada pelos níveis séricos da proteína. Os resultados mostram que a entrega no duodeno e no íleo produzem os maiores níveis séricos da proteína.

Materiais e Métodos O modelo animal em ciclo fechado in situ aqui usado foi uma versão modificada da que foi descrita por Schilling e Mitra, Pharma. Res. 9: 1003-1009 (1992).

Animais. Ratos machos Sprague-Dawley pesando entre 200-250 g estiveram em jejum 16-20 h antes da experiência. A água foi deixada ad libiíum. Os animais foram anestesiados por uma injecção intraperitoneal da 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ uma mistura de 90 mg/kg de cetamina e de 10 mg/kg de xilazina. De um terço a metade da dose original, foi depois administrada a cada 45-60 min para manter a anestesia/analgesia. A temperatura corporal interna foi mantida a 37UC colocando o corpo do animal numa almofada de aquecimento.

Cateterizacão IV. A canulação da veia jugular externa direita foi realizada por inserção de um peça de tubagem silástica de 10cm (Baxter, Irvine, CA). Um colar feito de uma peça de 1 cm de tubo de polietileno de PE 200 foi fixado no extremo externo da tubagem silástica. Antes da inserção, a cânula foi cheia com solução salina contendo 10 U/ml de heparina. Uma agulha de calibre 23 foi inserida na cânula e foi utilizada com uma seringa de 1 ml heparinizada para a remoção das amostras de sangue. 9

Cateterizacão do Canal Biliar. A canulação do canal biliar foi necessária para impedir o excesso de acumulação de bílis no sistema digestivo não ligado durante as 4 horas da experiência. Foi feita uma incisão abdominal na linha média, e o duodeno e uma pequena parte do intestino foram puxados para fora e colocados sobre uma almofada com gaze humedecida com solução salina fisiológica para expor o canal biliar. Fizeram-se duas ligaduras, uma fortemente apertada imediatamente em frente ao tecido pancreático para impedir o escoamento de bílis, a segunda ligadura parcialmente apertada a 5 mm da primeira ligadura e perto do fígado. Um tubo de polietileno (0,28 mm de d.i. e 0,61 mm d.e.) com um dos extremos cortado em oblíquo, foi introduzido no canal da bílis, na direcção do fígado, através duma pequena incisão. O cateter foi avançado após a segunda ligadura, que foi então firmemente apertada para segurar o cateter no canal biliar. Os extremos livres da primeira ligadura são então apertados.

Administração ID . Em seguida, os segmentos intestinais foram medidos com um fio. Foram levadas a cabo experiências em animais individuais para testar a absorção de PEG-G-CSF pelo duodeno (11 cm do piloro), a absorção pelo jejuno proximal (20 cm do piloro), pelo íleo distai (6 cm acima do cego) e pelo cólon (10 cm acima de cego). O segmento desejado foi aberto em cada extremo e inseriu-se uma peça de tubagem Tygon (4 mm de d.e. de VWR Scientific, Cerritos, CA) na abertura proximal. Foi empregue uma bomba peristáltica para perfusar 30 ml de solução salina fisiológica (Abbott Laboratories, Chicago, IL) a 37°C e a 2 ml/min no sistema digestivo para 33 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ remover qualquer conteúdo residual do sistema digestivo. Cada um dos segmentos (10 cm) foi ligado acima e abaixo das incisões para evitar qualquer perda de fluidos, e foi bombeado ar através do segmento para remover qualquer solução salina residual. A solução de PEG-G-CSF em 500 I de tampão de formulação, acetato de sódio 10 mM, pH 4,0, manitol a 5% e Tween 80 a 0,004%, numa dose de 750 pg/kg, foi injectada na porção média do segmento usando uma agulha de calibre 27 e de meia polegada. O segmento foi cuidadosamente devolvido à sua posição original dentro da cavidade peritoneal e a cavidade abdominal foi fechada com agrafos cirúrgicos. Obtiveram-se amostras de sangue (250 μΙ) a 0, 2, 5, 10, 15, 30, 60, 120, 180 e 240 minutos após a administração para a determinação das concentrações de rhG-CSF no plasma. Os volumes das amostras de sangue de toda a experiência devolvidos ao animal, com o mesmo volume de solução salina fisiológica.

Administração Intravenosa. Para determinar a biodisponibiljdade de PEG-G-CSF absorvido entericamente, a citóquina tratada com PEG foi administrada através da veia peniana (50 pg/kg em 100 pl de tampão de formulação) de um rato em jejum cânulado i.v. e no canal biliar. As amostras de sangue foram obtidas como para a administração i.d.

Análise. O plasma foi separado recolhendo primeiro o sangue para tubos de Eppendorf revestidos com EDTA, mantidos em gelo, e depois centrifugando a 10 000 rpm durante 15 min. Congelaram-se as amostras de soro e armazenaram-se a -80°C até à análise ao rhG-CSF por ELISA R&D Systems.

Os resultados estão apresentados na FIGURA 8. Os dados são os valores médios de 3 experiências separadas. O grau de erro, como é mostrado pelas barras de erro, pode ser devido, em parte, ao facto de os 3 animais do grupo terem sido estudados em dias separados. Isto aumentaria as diferenças em cada estudo, embora tivessem sido feitas correcções para certas alterações, i.e. peso dos ratos, etc. A FIGURA 8 ilustra, contudo, que as regiões mais elevadas do sistema digestivo i.e. o duodeno e o íleo, são preferíveis em termos da absorção de PEG-G-CSF em relação às regiões mais baixas, como o cólon.

Este facto é enfatizado pela análise de AUC para os níveis séricos da proteína que se apresentam na FIGURA 9. Surpreendentemente, os dados mostram claramente que o intestino delgado é o local preferido entrega de 34 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ formulação oral de PEG-G-CSF em oposição ao intestino grosso que não é preferível. 0 cólon é geralmente considerado a zona menos vedada do sistema digestivo e, aparte da flora bacteriana presente, menos hostil às proteínas do que as regiões de proteases mais activas do duodeno, jejuno e íleo.

Estudos adicionais podem proporcionar mais informação tendo em conta a dosagem e a extrapolação da formulação óptima de espécie para espécie.

Exemplo 6: Formulação de PEG-G-CSF com Dioleoilfosfatidilalicerol O G-CSF humano recombinante é capaz de interagir intimamente com um lípido negativamente carregado, que aumenta a estabilidade da proteína G-CSF. O PEG-G-CSF também forma esta interacção íntima, com efeitos protectores. Este Exemplo demonstra que os efeitos protectores têm um impacto positivo na biodisponibilidade intraduodenal do PEG-GCSF após a formulação da proteína com um lípido negativamente carregado. O exemplo presente refere-se ao lípido negativamente carregado dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG). Outras formulações usando lípidos carregados negativamente em associação com proteínas, capazes de formar o estado globular em fusão, estão descritas no pedido copendente, propriedade comum, U.S.S.N. 08/132,413, "Stable Proteins: Phospholipid Composition and Methods" que é aqui incorporado por referência. O uso de tais lípidos carregados negativamente como aglutinantes em formulações de dosagem oral foi anteriormente demonstrado, e pode ser útil para as formas de dosagem oral aqui descritas. Métodos. DOPG de Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster Alabama, foi dissolvido em clorofórmio anidro a uma concentração final de 100 mg/ml. Secaram-se 100 pmol do lípido (797 μΙ) sob vácuo e então adicionou-se 1ml de água mili Q para preparar uma solução 100 mM do lípido. Esta solução foi submetida a ultra-sons durante 5 minutos aparelho de ultra-sons em banho de água (Modelo G 112SP1T de Laboratories Supply Inc., Hicksville, NY) ou até a solução lipídica ficar límpida. Adicionaram-se 9 pmol da solução de DOPG (90 μΙ) a 90 nmol de rhG-CSF ou PEG-G-CSF, preparados como descrito atrás, em HCI 1 mM. A solução foi agitada com vórtex e levada a um volume final de 2ml com HCI 1 mM, antes do carregamento nas bombas osmóticas Alzet e *

V 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ implantação nos animais como previamente descrito. As dosagens são mostradas na FIGURA 10.

Resultados. Os resultados estão ilustrados nas FIGURAS 10, que apresentam o efeito na contagem de glóbulos brancos, e 11, que apresenta os níveis séricos. Para a contagem de glóbulos brancos totais, o uso de PEG-G-CSF eliciou uma resposta maior mesmo quando comparada com G-CSF não tratado com PEG + DOPG (compare a FIGURA 10(a) e a FIGURA 10(b)). A comparação de PEG-G-CSF sem DOPG e PEG-G-CSF + DOPG, FIGURA 10(b) ilustra que o DOPG aumenta o efeito biológico, em termos do aumento da contagem de glóbulos brancos totais, do PEG-G-CSF entregue no sistema digestivo. 0 aumento do PEG-G-CSF + DOPG foi quase duas vezes maior do que o do PEG-G-CSF sozinho.

Estes resultados são confirmados pelos níveis séricos da proteína, como se mostra na FIGURA 11. Como ilustrado, a infusão entérica de PEG-G-CSF + DOPG resulta em pelo menos um aumento de duas vezes nos níveis do soro da proteína sobre o PEG-G-CSF sozinho. A farmacocinética das proteínas derivatizadas é, contudo, imutável.

Estes resultados demonstram que a utilização de um lípido aniónico tal como DOPG numa formulação oral de PEG-G-CSF aumenta a resposta terapêutica eliciada pela proteína derivatizada. A resposta aumentada parece ser um resultado de uma maior biodisponibilidade do PEG-G-CSF.

Tabela 12

Efeito do Tratamento com PEG na Biodisponibilidade Entérica da Citóquina.

Local da dose Proteína Dose (pg/kg) AUC Biodisponibilidade (%) IV G-CSF 25 200 000 100 ID G-CSF 755 0 0 ID PEG-G-CSF 823 630 000 9,45 O PEG-G-CSF usado atrás era uma população de moléculas na qual a maioria continha ligadas pelo menos três moléculas de polietilenoglicol (veia 36 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ infra). Deste modo, ο nível de derivatização era semelhante ao mais altamente derivatizado PEG-IFN-Con, (F1). Os resultados na Tabela 12 mostram que estas duas proteínas derivatizadas têm biodisponibilidade semelhante na via entérica quando comparados com a proteína não modificada administrada por infusão intravenosa. Portanto, uma forma preferível de uma citóquina tratada com PEG para entrega entérica e portanto oral, é um derivado altamente ligado a PEG.

Em geral, para o G-CSF tratado com PEG é apresentada uma muito maior biodisponibilidade entérica em comparação com a citóquina não tratada com PEG administrada por infusão entérica. Embora a razão precisa não seja totalmente compreendida, o aumento na biodisponibilidade pode ser devido à resistência a proteases da forma ligada a PEG, ao mais longo tempo de circulação da proteína derivatizada que permite a sua acumulação no corpo, a um efeito na permeação da proteína através da barreira entérica, ou a uma combinação destes factores. 37 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Amgen Inc. (ii) TÍTULO DO INVENTO: Entrega Oral de Proteínas Quimicamente Modificadas (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS :2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Amgen Inc. (B) RUA: 1840 Dehavilland Drive (C) CIDADE: Thousand Oaks (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 91320-1789 (v) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE·. Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/194 187 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 02-FEV-1994 (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A)NOME: Pessin, Karol M. (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/ REGISTO: A-285 38 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (vii) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIAS: (A) COMPRIMENTO: 531 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (viii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1: ATGACTCCAT 7AGG7CC7GC 7AGC7C7C7G CwovAAÂGC? TTCTGC7GAA A7G7C7GGAA '·' 60 CAGGTTCGTA AAA7CCAGGG 7GACGG7GC7 GCAC7GCAAG AAAAACTGTG CGCTACT7AC ‘ 120 AAACTG7GCC A7CC3GAAGA GCTGG7AC7G C7GGGTCA77 CTCTTGGGAT CCCGTGGGC7 180 CCSCTG7C77 CTTGTCCATC 7CAAGC7CTT CAGC7GGC7G GTTGTC7G7C 7CAACTGCAT 240 7CTGG7C7G7 TCC7G7ATCA GGGTCTTCTG CAAGCTC7GG AAGGTA7C7C TCC3GAACTG 300 GGTCCGACTC TGGACACTCT GCAGCTAGAT G7AGC7GAC7 77SC7ACTAC 7A77TGGCAA 360 CAGA7GGAAG AGCTCGGTAT GGCACCAGC? C7GCAACCGA C7CAAGGTGC TATGCCGGCA 420 ttcgcttctg s^ATTwCAGCG TCGTGGAGGA GG7G7AC7GG 77GCTTCTCA 7CTGCAATCT 480 TATCTTACCS 7GTTCTGCGT wA. s« . ^UV,. ^ v AGC C 37AATA 3 531 39 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO:1 75 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii)TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Met Thr ?ro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu 1 e 10 -- Lvs Cys Leu Glu Gin Vai Arg Lys Zie Gin C-iy Asp Gly Ala Ala Leu 20 25 30 Gin Glu Lys Leu Cys Ala Thr Lys Leu Cys His ?ro Glu Glu Leu 16 40 45 Vai Leu Leu Glv His Ser Leu Gly lie Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 50 55 60 Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His 65 70 75 30 Ser Gly Leu Phe Leu Tv^t Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Gin Glv lie 35 90 95* Ser ?ro Glu Leu Gly Pro Thr Leu ASO Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala 100 105 11*0 Asp Phe Ala Thr Thr lie Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala 115 120 125 ?ro A-Lâ Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala ?he Ala Ser Ala 130 135 140 Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Vai Leu Vai Ala Ser His Leu 31a Ser 145 15 Ô 155 160 Phe IíÔU Glu Vai Ser Tyr Arg Vai Leu Arg ais Leu Ala Gin Pro 165 170 175 Lisboa, átx > n 2001

Por AMGEN INC. - O AGENTE OFICIAL-

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERRE1RA Ag. 0|. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.®1200-195 LISBOA

Claims (11)

1. 86 996 ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica oral para entrega no sistema digestivo, em particular no intestino delgado, compreendendo uma população de moléculas de G-CSF modificadas com polietilenoglicol, possuindo a maioria da referida população, por molécula de G-CSF, predominantemente três e quatro porções polietilenoglicol possuindo um peso molecular médio de cerca de 6000.
2. 2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, na qual as moléculas de polietilenoglicol estão ligadas a um grupo amino do G-CSF.
3. 3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, na qual as moléculas de polietilenoglicol estão ligadas a um grupo carboxilo do G-CSF.
4. 4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, na qual as moléculas de polietilenoglicol estão ligadas a um grupo sulfidrilo do G-CSF.
5. 5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, na qual as moléculas de polietilenoglicol estão ligadas ao terminal N do G-CSF.
6. 6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, na qual as moléculas de polietilenoglicol estão ligadas a um grupo lisina do G-CSF.
7. 7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, na qual as moléculas de polietilenoglicol estão ligadas a resíduos que encontram nas voltas externas que unem as hélices alfa do G-CSF.
8. 8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, na qual G-CSF o tratado com PEG está associado a um lípido aniónico.
9. 9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, na qual o lípido aniónico é dioleoilfosfatidilglicerol.
10. 10. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, na qual o G-CSF é G-CSF humano recombinante. 8G 99G ΕΡ Ο 726 778/ΡΤ 2/2
11. 11. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 compreendendo um revestimento entérico farmaceuticamente aceitável para resistência aos sucos gástricos, impermeável a pelo menos pH 5,0. Lisboa, 25. SEI 2631. Por AMGEN, INC. - O AGENTE OFICIAL - Eng." ANTÓNIO JO&O DA CUNHA FERREIRA Ag. 0|. Pr. Ind. Rua dao Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA