CN86107885A

CN86107885A - 酵母生产乙型肝炎表面抗原

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Publication number: CN86107885A
Application number: CN198686107885A
Authority: CN
Inventors: 米格·弗里德里克·斯少普; 迈克尔·米勒·哈波尔德; 詹姆斯·迈克尔·克里格; 理查德·格登·布克霍茨
Original assignee: Phillips Petroleum Co
Current assignee: Phillips Petroleum Co
Priority date: 1985-11-26
Filing date: 1986-11-24
Publication date: 1987-09-23
Also published as: FI95929B; YU201386A; IL80754A0; KR920004050B1; IL80754A; PH25539A; PT83819B; KR870005099A; PH25941A; ATE92527T1; FI95929C; ZA868601B; IE863021L; FI864791A; DD252614A5; NO176025C; YU46031B; CS864186A3; PL262598A1; PT83819A

Abstract

揭示了包括调节区和编码乙型肝炎抗原(H Bs Ag)的结构编码的新DNA建造。所用调节区对甲醇，非分解代谢产物抑制性碳源以及分解代谢产物抑制性碳源并后接缺乏碳源有反应。该新建造被掺入到各种线形和环状质粒中。这样的质粒用于转化适宜的宿主并最终用于高水平地生产和分离出乙型肝炎表面抗原。

Description

本发明涉及用重组DNA技术生产乙型肝炎表面抗原。一方面，本发明涉及用酵母生产乙型肝炎表面抗原，另一方面，本发明涉及编码乙型肝炎表面抗原的新DNA构建，在又一方面，本发明还涉及用上述DNA构建转化的新生物。

随着重组DNA技术在近来的发展，用微生物控制生产各种有用的多肽类已成为可能。许多真核多肽，例如人生长激素，白细胞干扰素，人胰岛素和人胰岛素原早已可用微生物生产了。继续使用现有的技术已被期望在将来能用微生物生产其他有用的肽类产物。这种有用的肽类产物之一就是乙型肝炎表面抗原。

乙型肝炎（血清肝炎）病毒在人类中传播，并且证明它是慢性致虚弱疾病，该病逐渐导致严重的肝损伤，早期癌，而最后至死亡。在大多数情况下，可以期望从乙型肝炎病中完全恢复。但是，在人类中的一大部分，特别是在许多非洲和亚洲国家的人群中，很多人都是慢性携带者，具有传播传染病的潜在危险。

有效地预防乙型肝炎，要施用乙型肝炎病毒疫苗，而疫苗通常是高度纯化的乙型肝炎表面抗原。这类乙型肝炎病毒疫苗对防止病毒的传染是有效的。特别危险的是需要输血或透析治疗的人们。从事这些工作的医务人员等待。此外，这类疫苗对防止产生新的带病者也是有效的，而且它还可以进而从地球上彻底消灭乙型肝炎病毒。

乙型肝炎病毒还不能在细胞培养中传播，因而只能从人类或高级灵长类中获得。因此，还没有可以获得和保持充足的乙型肝炎病毒用以生产免疫乙型肝炎病毒的抗原。

乙型肝炎病毒的疫苗通常是从乙型肝炎病毒携带者的血浆中分离或提纯乙型肝炎表面抗原而制备。由于在被提纯的血浆中只有很少量的所需抗原，所以就要求这种提纯方法是非常高效的。因此，迄今为止，以工业规模生产所需的乙型肝炎病毒疫苗是很困难的。

本发明的目的之一是乙型肝炎表面抗原的高产方法。

本发明的又一目的是制备能以高水平表达乙型肝炎表面抗原的新DNA构建。

本发明的这些目的及其他目的在本发明的说明书和权项中将会清楚地表明。

根据本发明，已经发现了用培养酵母细胞来高水平的生产乙型肝炎表面抗原的方法，酵母细胞用包括乙型肝炎表面抗原编码序列的DNA构建所转化，该序列受与甲醇，非分解代谢产物抑制性碳源和碳源缺乏起反应的调节区控制。

图1是毕赤（Pichia）二羟丙酮合成酶基因（DAS）调节区的限制图谱。

图2是初级毕赤醇氧化酶（AOX1）调节区的限制性图谱。

图3是毕赤p40基因调节区的限制图谱。

图4是质粒pAOP2的限制性图谱。

图5是质粒pBSAG5和pBSAG5Ⅰ的构建图。

图6是质粒pHBS-5的限制性图谱。

图7是质粒pAOT-1的限制性图谱。

图8是质粒pYJ33的限制性图谱。

图9表示由质粒pSAOH5和pTHBS3建造质粒pYM39。

图10表示由质粒pYM39和pPG3.2建造质粒pYMⅠ6。

图11表示由质粒pYMⅠ6和pBSAG5Ⅰ建造质粒pBSAGⅠ5Ⅰ。

图12表示将质粒pBSAGI5Ⅰ的一部分插入到毕赤染色体的初级醇氧化酶（AOX1）位置。

图13是质粒pTHBS3的建造过程。

以下的缩写是用在附图中代表所用的限制性酶。

缩写限制性酶

As AsuⅡ

B BamHⅠ

B₂BglⅡ

Bc BclⅠ

C ClaⅠ

H₂HincⅡ

H₃HindⅢ

K KpnⅡ

Nd₁NdeⅠ

Nr NruⅠ

Ps PstⅠ

Pv₁PvuⅠ

Pv₂PvuⅠⅡ

R₁EcoRⅠ

R₅EcoRV

S SalⅠ

Sp SphⅠ

Ss SstⅠ

St StuⅠ

Xb XbaⅠ

Xh XhoⅠ

在附图中，对用于操作DNA片段但在连接时被去掉的限制性位点，用将缩写符号包围在括号中的形式来指明去掉的位点。

本发明提供了一种新的DNA片段，该片段包括一个调节区和一个多肽编码区，其中的多肽编码区编码乙型肝炎表面抗原或其一部分，而调节区一旦处于多肽编码基因的5′末端时，它就能控制信使RNA的转录。调节区，乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）基因，以及转录终止片段的组合，在此后被作为一种表达盒或表达单位。本发明中所用的调节区是对至少一种以下条件有反应的调节区，这些条件是：

培养基中存在着甲醇，而且含有表达盒的生物与培养基相接触，

培养基中存在着非分解代谢产物的抑制性碳源而不是甲醇，含有表达盒的生物与该培养基相接触。

培养基中缺乏碳怨，含有表达盒的宿主生物在经分解代谢产物抑制性碳源和能量的条件下生长之后，再与缺乏碳源的培养基相接触。

根据本发明，还提供了新的含有上述表达盒的线形或环形的质粒。

根据本发明，还提供了用上述线形或环形质粒转化的酵母菌株的基本纯净的培养物。

根据本发明的另一实施方案，还描述了制备乙型肝炎表面抗原的方法，该方法包括，将用上述质粒转化了的酵母菌株在能表达所需蛋白产物的条件下进行培养。

本发明实践中所用的调节区的特征在于与以下培养基的反应能力，这些培养基含有：

（1）甲醇，

（2）非分解代谢产物抑制碳源，例如甘油，半乳糖，乙酸盐等，

（3）分解代谢产物抑制碳源，如葡萄糖，乙醇，果糖等，然后接碳源缺乏。

满足上述条件的示范性调节区由图1，2，3中的限制性图谱描绘出。图1中所给出的调节区是由巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）二羟丙酮合成酶（DAS）基因中衍生出来的。图2中阁出的调节区是从巴斯德毕赤酵母初级醇氧化酶（AOX1）基因中衍生出来的（Pichia有两个醇氧化酶基因，在此称作AOX1和AOX2）。图3中给出的调节区是从巴斯德毕赤酵母的p40基因衍生出来的。本专业领域的技术人员会知道，具有上述性质的其它调节区可以从甲基营养酵母如巴斯德毕赤酵母中分离出来。这些具有与上述调节区相似性质的调节区均属于本发明的范围之内。

乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）基因已经被分离出（Valenzuela etal.[1979]Nature280，815），而且用适宜的限制性内切酶处理载体就可获得，这些载体举例有pHBS-5（见图6和Valenzuela etal，[1982]，Nature298，347），pHBV-T-1A（Genetech，EPA 73657），pHBS-56（ATCC accession No40047;见EPT 12055）等。

乙型肝炎表面抗原基因用Bal31核酸外切酶处理，从该基因的5′末端去除病毒性非编码序列而被修饰。HBs Ag基因的3′末端用核酸内切酶酶解并加入连接子去除病毒性非编码序列而得到修饰。乙型肝炎表面抗原基因经进一步修饰，以掺入易于操作DNA片段的限制性位点，所获的DNA片段是EcoRⅠ-StuⅠ插入体，并具有以下的核苷序列：

5′-GAATTCATGG AGAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCC

TGCTCGTGTT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAAT

CCTCACAATA CCGCAGAGTC TAGACTCGTG GTGGACTTCT

CTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAA

ATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATCACTCAC CAACCTCCTG

TCCTCCAATT TGTCCTGGTT ATCGCTGGAT GTGTCTGCGG

CGTTTTATCA TATTCCTCTT CATCCTGCTG CTATGCCTCA

TCTTCTTATT GGTTCTTCTG GATTATCAAG GTATGTTGCC

CGTTTGTCCT CTAATTCCAG GATCAACAAC AACCAGTACG

GGACCATGCA AAACCTGCAC GACTCCTGCT CAAGGCAACT

CTATGTTTCC CTCATGTTGC TGTACAAAAC CTACGGATGG

AAATTGCACC TGTATTCCCA TCCCATCGTC CTGGGCTTTC

GCAAAATACC TATGGGAGTG GGCCTCAGTC CGTTTCTCTT

GGCTCAGTTT ACTAGTGCCA TTTGTTCAGT GGTTCGTAGG

GCTTTCCCCC ACTGTTTGGC TTTCAGCTAT ATGGATGATG

TGGTATTGGG GGCCAAGTCT GTACAGCATC GTGAGTCCCT

TTATACCGCT GTTACCAATT TTCTTTTGTC TCTGGGTATA

CATTTAAGGC CT-3′

本发明的调节区-结构基因构建可以提供给生物并以各种方式进行放大，再生产和表达。对在酵母中自动复制，自动复制序列（ARS）成分是有用的。例如从巴斯德毕赤酵母中衍生出来的PARS1和PARS2（参见copending U.S.Application SN 666577，Gregginventor and assigned to Phillips Petroleum Co.）。当需要整合性转化宿主的时候，则就不用ARS成份。获得整合性转化的优选方法已经在序列号791013，发明人为Cregg，转让给菲利浦石油公司的共悬未决申请中描述了，并且包括使用定向整合载体的位点，其包括

第一个可插入DNA片段，

可选择的识别基因，

第二个可插入DNA片段。

第一和第二可插入的DNA片段各自至少长为200个核苷酸，并且具有与毕赤属各种类的基因组DNA的某部分同源的核苷酸序列。整合性载体的各成份顺序排列形成线性DNA片段，这样，表达盒和可选择识别基因就位于第一可插入DNA片段的3′端与第二可插入DNA片段的5′端之间。第一和第二可插入DNA片段相互按顺序排列为线性片段，其定向与在毕赤基因组中相同。

在用于转化宿主菌株的DNA中必须包括至少一种可选择性识别基因。这就能在生物中选择和分离出哪个生物已经掺入了转化性DNA。识别基因给被转化的宿主一种它原来不具有的表型特征，例如恢复生产某特殊氨基酸的能力，而未转化的宿主缺乏该特殊氨基酸的生物合成途径。

本专业领域的技术人员知道，其他的DNA序列也可以掺入到本发明所用的载体中去，例如细菌性质粒DNA，噬菌体DNA等待。这些序列可以在细菌宿主中放大和保持这些载体。

本发明的上述质粒具有在可被转化的酵母株中的实用性。用本发明的新DNA片段对在酵母中基因表达的调节可以通过将转化的生物放在缺乏碳源的条件下来达到。在经过分解代谢产物抑制性和非分解代谢产物抑制性碳源的生长后的碳源缺乏，诱导维持在本发明调节区控制之下的表达基因产物。另一种获得在适宜的转化酵母中表达所需基因产物的方法是让转化的酵母在有甲醇的条件下生长。而又一种诱导表达所需要基因产物的方法是让转化的酵母在含有非分解代谢产物抑制性碳源的培养基中生长。

本发明的调节区对在各种酵母中的表达是有用的，因为该调节区已经表现出可在各种条件下被诱导。因此，能在甲醇或在非分解代谢产物抑制性碳源中生长的酵母可被引起直接生产外源，即异源多肽;而能在分解代谢产物抑制性碳源中生长的酵母，可通过将这样生长的酵母放在缺乏碳源的条件下而引起生产外源多肽。

本发明方法中优选的转化酵母株包括以下各属：

假丝酵母 Candida

克勒克酵母 Kloeckera

酿酒酵母 Saccharomyces

裂殖酵母 Schizosaccharomyces

红酵母 Rhodotorula

汉逊酵母 Hansenula

球拟酵母 Torulopis

毕赤酵母 Pichia

克鲁维酵母 Kluyveromyces

优选这些属的酵母是因为它们的操作安全性，生长条件等已经建立，并且是本专业领域的技术人员所熟知的。

在本发明的一种实施方案中所特别优选的酵母，是那些能以甲醇为碳源和能源而生长的酵母，已知的这类酵母属于以下各属：

假丝酵母 Candida

克勒克酵母 Kloeckera

酿酒酵母 Saccharomyces

红酵母 Rhodotorula

汉逊酵母 Hansenula

球拟酵母 Torulopis

毕赤酵母 Pichia

由于本发明的调节区还可通过在非分解代谢产物抑制性碳源以及碳源缺乏条件下的生长来诱导，所以，能在这类非甲醇性底物，如

葡萄糖

乙酸盐

甘油

乙醇

乳糖

半乳糖

果糖

蔗糖

以及类似的底物和它们其中的任意两种或两种以上的混合物中生长的酵母，在本发明的实践中也是有用的。通过将宿主生物在适宜的可抑制性非代谢分解产物，非甲醇性碳源，如甘油或半乳糖上生长，或通过将宿主生物在可抑制性分解代谢产物碳源如乙醇，葡萄糖和果糖中的生长，然后将宿主生物放在缺乏碳源的条件下，就可获得本发明调节区控制下的基因产物的表达。

特别优选的宿主酵母株是突变体巴斯得毕赤酵母GS115，它是缺失生产组氨酸能力的突变体。由于具有突变基团his4，即影响组氨醇脱氢酶-编码基因的组氨酸途径缺失的结果而被称为GS115。GS115是从巴斯得毕赤酵母NRRL Y-11430衍生来的，而且已储存于美国研究培养物收集中心（Peoria，Illinois），储存号为NRRL Y-15851。这种特殊宿主的有用性在于它是在组氨酸途径中缺失的营养突变体。这种宿主与含有编码HIS4基因功能的序列（包括其它DNA序列）的载体的转化，可以很容易地选择出被转化的宿主。

本发明实践中优选的另一酵母株是突变体巴斯得毕赤酵母GS190，这是一种缺失影响精氨琥珀酸裂解酶编码基因的精氨酸途径的突变体。GS190是由巴斯得毕赤酵母NRRL Y-11430中衍生出来的，并且已储存在美国研究培养物收集中心（Peoria Illinois），储存号为NRRLY-18014。

另外一种优选的宿主酵母是双营养突变体PPF1，它是组氨酸和精氨酸途径都缺失的突变体。PPF1在影响组氨醇脱氢酶编码基因的组氨酸途径和影响精氨琥珀酸裂解酶编码基因的精氨酸途径中双炔失。PPF1已经储存在美国研究培养物收集中心（Peoria Illinois），储存号为NRRL Y-18017。

大肠杆菌（Eschenichia coli）也是本发明质粒的适宜宿主。本专液领域中的技术人员知道，许多大肠杆菌菌株都是适宜的宿主。本发明中所用的几种大肠杆菌菌株总结于下：

菌株名称储存号

MC1061 未知

LE392 ATCC33572

MM294 ATCC33626

巴斯得毕赤酵母的转化过程

转化巴斯得毕赤酵母的实验过程前面已经描述了，而且以后（在实施例1中）将更为详细地给以描述。

巴斯得毕赤酵母的转化，可通过酶解细胞壁给出原生质球，然后将原生质球与转化DNA混合，在有钙离子和聚乙二醇存在下温育，再于缺乏组氨酸的选择性生长培养基中再生而完成。转化DNA包括宿主菌株缺乏的HIS4基因，因而，在所用的选择性生长培养基中只有转化了的细胞存活。

提取乙型肝炎表面抗原

本专业领域中的技术人员知道有很多方法可以从单细胞转化宿主中提取出异源蛋白质。本专业领域人员所知道的任何细胞破裂和蛋白质浓缩和（或）从破裂细胞中提取的技术都适用于回收本发明生产的HBs Ag。

乙型肝炎表面抗原的测定

按如上所述，转化的细胞在适宜的条件下生长以进行表达。然后，破裂细胞，测定可溶性组份和不溶性组份中的HBs Ag。对可溶性组份用市售“AUSRIA

Ⅱ”分析药盒（Abbott Laboratories）分析22纳米的颗粒。对可溶性和不溶性组份都用吸印方法（Western blotting）分析单体，该方法使用抗单体形式HBs Ag的抗血清和¹²⁵碘标记的蛋白质A。

以下参照非限定性实施例对本发明给以更为详细的描述。

以下的缩写用在实施例中，其含义如下：

SDS 十二烷磺酸钠

EDTA 乙二胺四乙酸

TEMED 四甲基乙二胺

DTT 二硫苏糖醇

BSA 牛血清球蛋白

Et Br 溴乙烷

PMSF

Ci 居里

酶60000 来源：Miles Laboratories

以下实施例中所用的缓冲液和溶液的组份如下：

1M Tris缓冲液 121.1克Tris碱于800毫升水中;

加浓度为35%的HCl水液将PH值

调节到所期望的数值;在最后调定

PH值之前让溶液冷却至室温，稀释

溶液至终体积为1升。

TE缓冲液 1.0毫摩尔EDTA于0.01摩尔

（PH7.4）Tris缓冲液中

PBS（磷酸盐缓冲盐水） 10毫摩尔磷酸钠（PH7.0）

0.15摩尔NaCl

SDS凝胶装柱缓冲液 62.5毫摩尔Tris-HCl（PH6.8）

2% SDS

10%甘油

100毫摩尔二硫苏糖醇

0.001%溴酚兰

YPD培养基 1%细菌-酵母膏

2%细菌-胨

2%右旋糖

SD培养基 6.75克不含氨基酸的酵母氮碱

（DIECO）

2%右旋糖

于1升水中

SED 1摩尔山梨醇

25毫摩尔EDTA

50毫摩尔DTT

SCE缓冲液 9.1克山梨醇

1.47克柠檬酸钠

0.168克EDTA

50毫升HO

用HCl调PH至5.8

CaS 1摩尔山梨醇

10毫摩尔CaCl₂

消毒过滤

PEG溶液 20%聚乙二醇-3350

10毫摩尔CaCl₂

10毫摩尔Tris-HCl（PH7.4）

消毒过滤

SOS 1摩尔山梨醇

0.3xYPD培养基

10毫摩尔CaCl₂

基础盐份（用于转化的毕赤酵母的发酵生长）

基础盐每升含量

H₃PO₄，85% 4.2毫升

CaSO₄·2H₂O 0.18克

K₂SO₄2.86克

MgSO₄·7H₂O 2.34克

KOH 0.65克

毕赤酵母饲养培养基（用于GS115/p BSAG5的发酵生长）

克/升水

H₃PO₄（85%） 3.5毫升

CaSO₄·2H₂O 0.15

K₂SO₄2.38

Mg SO₄·7H₂O 1.95

KOH 0.65

FeSO₄·7H₂O 0.065

CuSO₄·5H₂O 0.006

ZnSO₄·7H₂O 0.020

MnSO₄·H₂O 0.003

生物素 0.000041

碳源 20-100克

微量盐溶液[用于GS115（pBSAGI5Ⅰ）的生长]

克/升水

CuSO₄·5H₂O 0.06

KI 0.08

Mn SO₄·H₂O 0.3

Na₂MoO₄·2H₂O 0.2

H₃BO₃0.02

ZnSO₄·7H₂O 2.0

FeCl₃·6H₂O 4.8

H₂SO₄3-5毫升/升（用于去除cloudiness）

Ausria稀释缓冲液 4.3毫摩尔Na₂HPO₄

1.5毫摩尔KH₂PO₄

2.7毫摩尔KCl

0.15摩尔NaCl

1%牛血清白蛋白

0.02%迭氮化钠

最终PH7.4

溶解性缓冲液 10mM磷酸钠缓冲液（PH7.5）

0.5M NaCl

0.1% Triton X-100

2mM PMSF

除非另有说明，上述溶液代表所用的基本浓度（1倍）。在实施例中，如果使用的是不同的浓度，那么就以基本浓度（1倍）乘以其倍数而指出。

实施例1

巴斯德毕赤酵母转化过程

A.细胞生长

1.将巴斯德毕赤酵母GS115菌落（NRRL Y-15851）接种到约10mM YPD培养基中，在30℃下摇振培养12-20小时。

2.过了约12-20小时后，健细胞稀释到大约OD₆₀₀值为0.01-0.1，并在YPD培养基中以30℃保持细胞处于对数生长期约6-8小时。

3.约6-8小时后，对100ml YPD培养基接种OD₆₀₀为约0.1的0.5ml种子培养物（或相等量）。在30℃摇振12-20小时。

4.当OD₆₀₀达到约0.2-0.3（大约过16-20小时）后，以1500g离心5分钟收获培养物。

B.制备原生质球

1.以10ml无菌水洗细胞一次。（在1-5步中的所有离心均是以1500g离心5分钟）

2.以10ml新制备的SED洗细胞一次。

3.以10ml 1M无菌山梨醇洗细胞二次。

4.将细胞再悬浮于10ml SCE缓冲液中。

5.加入5-10微升4mg/ml酶60000（Miles Laboratories）≡30℃培养细胞约30-60分钟。

由于原生质球的制备是转化过程的关键性步骤，因此，应按下述监测原生质球的形成：在加入酶之前或刚刚加入之后以及在培养期间的不同时间，将100微升细胞等分试样加到900微升5% SDS和900微升1M山梨醇中。当细胞在SDS中溶胞而在山梨醇中没溶胞的时刻（通常为培养的30-60分钟）停止培养。

6.用1000g离心5-10分钟将原生质球在10ml 1M无菌山梨醇中洗两次。（离心时间和速度可以变化;离心到足以形成原省质球滤饼，但不能过份，以致使其受力而破裂。）

7.用10ml无菌Ca S洗细胞一次。

8.将细胞再悬浮于总量为0.6ml的Ca S中。

C.转化

1.加DNA样品（最多20微升）到12×75mm无菌聚丙烯管中。（DNA应处在水或TE缓冲液中;为了用少量DNA获得最大转化率，建议将1微升5mg/ml声破碎的大肠肝菌DNA加到每份样品中）。

2.加100微升原生质球到每份DNA样品中，并在室温条件下温育约20分钟。

3.加1毫升PEG溶液到每份样品中，并在室温条件下温育约15分钟。

4.以1000g离心样品5-10分钟，并倾析PEG溶液。

5.将样品重新悬浮于150微升SOS中，并在室温条件下温育20分钟。

6.加入850微升无菌1M山梨醇，并按如下所述将样品等分于平板上。

D.原生质球的再生

1.再生琼脂培养基的制法：

a.琼脂-KCl-9克细菌-琼脂，13.4克KCl，240毫升水，高压消毒。

b.10X葡萄糖-20克右旋糖，100毫升水，高压消毒。

c.10XSC-6.75克不含氨基酸的酵母氮碱，100毫升水，高压消毒。（在高压消毒之前或之后，加所需的氨基酸或核酸最多至200μg/ml的浓度。）

d.加30毫升10X葡萄糖和30毫升10XSC到300毫升融化的琼脂-KCl溶液中。加0.6毫升0.2mg/ml生物素和任何其它所需氨基酸或核酸至20μg.ml的浓度。将融化的再生琼脂保存于55～60℃。

2.平板培养转化的样品：

在转化样品备好前至少30分钟，每块平板用10毫升再生琼脂打底层。当转化样品处在SOS中的时期，将10毫升再生琼脂的等分试样分散到处于45-50℃水浴中的管中。将一定量的每种样品加到处于45-50℃的10毫升融化态再生琼脂等分试样中，并且将它们各自倾倒在含有以10毫升固态再生琼脂作底层琼脂的平板上。

3.测定原生质球制剂的质量：

取出一种样品10微升加入990微升1M山梨醇稀释100倍。取出稀释液10微升再加入990微升1M山梨醇稀释100倍。将两种稀释液各100微升分布在YPD琼脂培养基平板上，测定存留在该制剂中的尚未形成原生质球的全部细胞浓度。向补充有40微克/毫升组氨酸的10毫升再生琼脂加入每种稀释液各100微升以确定全部可再生的原生质球。转化实验的良好值是1-3×10⁷总可再生原生质球/毫升以及1×10³总细胞/毫升。

4.在30℃温育平板3-5天。

实施例2

载体pAOP2族的建造

1.质粒p PG2.5用BamHⅠ酶解（pPG2.5质粒是以pBR322为基础的一种质粒，它含有约2.5kbp的取自质粒p PG4.0的EcoRⅠ-SaLI片段，该质粒含有初级醇氧化酶基因（AOX1）和调节区，其可以自美国研究培养物收集中心NRRL-15868大肠杆菌宿主中获得）;

2.线性化的质粒用BAL31酶解;

3.所获DNA用Klenow片段处理以增加平整末端，并与EcoRⅠ连接子连接;

4.连接产物转化到大肠杆菌MM294品系中;

5.转化体用群落杂交技术筛选，该技术使用了具有以下序列

5′TTATTCGAAACGGGAATTCC

的合成性寡核苷酸。该寡核苷酸含有AOX1启动子直至（但不包括）ATG起始密码子的序列，将其与EcoRⅠ连接子序列相融合;

6.用Maxam-Gilbert技术对阳性菌落测定其顺序。全部三个阳性菌落均具有以下序列;

5′…TTATTCGAAACGAGGAATTCC…3′。

它们均保留有ATG中的“A”（在上边的序列中下边有横线者）。据认为，这个A不是有害性的;因此，所有的亚菌落都是从这些阳性菌落衍生出的。这些菌落分别定名为pAOP1，pAOP2和pAOP3。

7.用BAL31/连接子-酶联产物筛选而鉴定了另外两个菌落。它们具有如下的序列：

5′…TAATTATTCGGAATTCC…3′

pAOX1 EcoRⅠ

这些菌落被定名为pAOP5和pAOP6。

在上述方法的一个改型中，用AsuⅡ取代BamHⅠ来切开质粒pPG2.5，线性化的片段用Klenow片段处理（不需上述的BAL31处理），然后与EcoRⅠ连接子相连接。所获的质粒含有AOX1启动子序列，而没有ATG起始密码子。这样制备的质粒已被定名为pAOP4，它含有以下序列：

5′…TAATTATGGAATTC…3′

pAOX1 EcoRⅠ

AOX1启动子（pAOX1）对碳代谢抑制的反应是酶合成的严重中止。此外，AO启动子对碳缺乏起反应。在甲醇上的生长导致进一步诱导AOX1启动子。然而，正如Ellis，Brust，Kortz，Waters，Harpold和Gingeras在1985年5月的《分子和细胞生物学》第1111-1121页中所揭示，更广泛的研究已清楚地表明，本发明中所用的AOX1启动子片段所受的调控方式与染色体中AOX1启动子的相同。在本实施例中所述的被制备的和被分离的菌落显示出了如AOX1启动子本身那样的对代谢抑制，碳缺乏和甲醇诱导的反应。

AO终止子

用作AO终止子的StuⅠ-HindⅢ片段含有为了AOX1mRNA转录本聚腺苷化提供模板的序列。该序列包括有：

TATGTATAGGATTTTTTTTGTC-聚腺苷

当StuⅠ-HindⅢ片段位于质粒3′上与多肽编码区相接时，它就促进RNA终止。AOX1终止序列已经被分离出，而且可以从质粒pPG3.2中收回，该质粒是以质粒pBR322为基础的含有AOX1终止序列的质粒。该质粒转化到大肠杆菌宿主中，并已按专利申请程序储存于美国研究培养物收集中心，储存号为NRRL B-15999，从而向公众公开了。

实施例3

本实施例的主题是制备质粒，其中各步骤中所用的序列总结于附图5中。

pBSAG5和pBSAG5Ⅰ的建造

1.pCFL2的建造

载体pAOP2含有3′端缺失了ATG中的TG的AOX1启动子，用HincⅡ切该载体。含有启动子的DNA片段被分离出来，并将其连接到pBR322中，该pBR322已预先用HindⅢ酶切过并填补了Klenow片段。这一反应制造出了pCFL2载体。

2.pBSAOP2的建造

pBR322-BglⅡ是PvuⅡ位点被BglⅡ位点取代了的pBR322，用EcoRⅠ和ClaⅠ酶解之。在连接反应中，将该线性化的质粒与由pCFL2来的含有5′AOX1的ClaⅠ/EcoRⅠ片段相结合。所获的载体定名为pBSAOP2。

3.pBSAG22的建造

质粒pHBS-5（由Valenzuela等人在《Nature》298，347-350[1982]中揭示，参见图6）含有插入到pBR322中EcoRⅠ位点上的HBSAg基因，将其用ClaⅠ酶解。用Bal31核酸外切酶在两个方向上除去大约60个碱基对。剩下的DNA片段用BamHⅠ酶解并填补以Klenow片段。连接后，将大约200个转化体用NcoⅠ酶切。将这些线性化的质粒分离出来在连接。转化大肠杆菌后，大约有全部质粒（定名为pBSAG1）的10%具有新创造的NcoⅠ位点。pBSAG1用NcoⅠ酶解，填补以Klenow片段并用BamHⅠ酶解。该质粒片段与预先用EcoRⅠ酶解过的pBSAOP2相连接，填补以Klenow片段并用BamHⅠ酶解。所获的载体定名为pBSAG22。

4.pBSAG4，pBSAG5，pBSAG5Ⅰ的建造

质粒pAOT-1（它是以质粒pBR322为基础的，连接有质粒pPG3.2的1.6Kbp SalⅠ-HindⅢ片段的质粒，质粒pPG3.2存在于大肠杆菌宿主中，以储存号NRRL B-15999而可获得）进入一个用SalⅠ-HindⅢ切过的pBR322△EcoRⅠ中（即，去掉了EcoRⅠ位点的质粒pBR322，见图7），该质粒带有3′-AOX1转录终止片段，并被XbaⅠ和PstⅠ切过。含有终止子的片段与预先经XbaⅠ和PstⅠ切过的pBSAG22相连接，得到pXP-1。pBSAG22用DraⅠ酶解，然后加上StuⅠ连接子，最后，StuⅠ和EcoRⅠ用于进一步的酶解。将HBs Ag基因分离出来，并连接到预先经StuⅠ和EcoRⅠ切过的pXP-1中，得到pBSAG4。

从pBSAG4来的含有HBs Ag的ClaⅠ片段被连接到pYJ33的独特的ClaⅠ位点上（见图8），得到了pBSAG5和pBSAG5Ⅰ。质粒pBSAG5Ⅰ的酶解图见图11。质粒pBSAG5和pBSAG5Ⅰ的区别仅在于含有5′-AOX1/HBs Ag/3′-AOXI表达盒的ClaⅠ片段的定位方向不同。因此，在pBSAG5中，5′-AOXI片段与毕赤HIS4基因相接，而3′-AOX1片段则与自动单位PARS2相接。质粒pBSAG5转化到大肠杆菌宿主中，并已储存于美国研究培养物收集中心，为的是公众可以获得并保证本申请的合法性。大肠杆菌MC1061-pBSAG5的储存号是NRRL B-18028。

实施例4

巴斯德毕赤酵母HBSAg表达宿主GS115（pBSAGI5Ⅰ）的建造

本实施例描述了巴斯德毕赤酵母宿主的制备，该宿主中的初级醇氧化酶基因（AOX1）已被乙型肝炎表面抗原（HBs Ag）基因在毕赤染色体中所取代。

为了生产巴斯德毕赤酵母HBs Ag表达-AOX1^-变突宿主，按图9-11所述建造质粒pBSAGI5Ⅰ。建造的第一步是用限制性核酸内切酶HindⅢ酶解按如下所制备并总结于图13的AOXI启动子-LacZ基因表达载体pSAOH5和AOXI启动子-HBs Ag表达载体pTHBS3。为制备pTHBS3，质粒pAOT-1（见图7）用StuⅠ切，连接EcoRⅠ连接子，然后用PstⅠ酶解。分离出含有3′-AOX1片段的EcoRⅠ片段。含有5′-AOX1序列的载体pAOP3用EcoRⅠ和SstⅠ切;所获的5′-AOX1片段连接到已预先被EcoRⅠ和SstⅠ切过的大肠杆菌-酿酒酵母往复性载体pSEY101中（见Douglas et al[1984]Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，3983-3987）。pAOP3与pSEY101片段连接的结果是质粒pTAO20。质粒pTAO20含有URA3和氨苄青霉素基因，分别用于在酿酒酵母和细菌中进行选择，并含有在酿酒酵母中复制的2微米的环和5′-AOX1序列。

质粒pTAO20用PstⅠ部分酶切。分离出线性化的载体并用EcoRⅠ切。最大的片段（其含有2微米环状序列，URA3基因和5′-AOX1片段）与得自pAOT-1的3′-AOX1相连接，产生出载体pTHBS1。

含有HBs Ag的来自pHBS-5的EcoRⅠ片段被用EcoRⅠ酶解分离出来，然后与预先用EcoRⅠ酶解过并用细菌性碱性磷酸酶处理过的pTHBS1相连接。所获的载体定名为pTHBS2，它含有在3′-和5′-AOX1序列之间插入的HBs Ag基因。

质粒pYJ30（存在于大肠杆菌中，以储存号NRRL B-15890而可获得）用EcoRⅠ切，填补以Klenow片段，然后用PstⅠ切。分离出含有巴斯德毕赤酵母HIS4/PARS1的片段，并与来自载体pTHBS2（该载体含有侧展是AOX1序列的HBs Ag基因）的PstⅠ-SstⅠ片段相连接。该连接的结果是质粒pTHBS3。

经HindⅢ酶解从pTHBS3中获得的1.4Kbp片段（该片段含有HBs Ag基因，AOX1终止序列和部分的AOX1启动子序列）被回收，并被插入到来自pSAOH5的7.7Kbp片段中，该片段含有毕赤HIS4基因，大部分的AOX1启动子序列，以及来自pBR322的序列。然后，分离出一个9.1Kbp的重组质粒pYM39，它含有复原的AOX1启动子序列。

对于建造的第二步，质粒pPG3.2（存在于大肠杆菌宿主中，以NRRL B-15999可获得）用PvuⅠⅠ酶解，并且将含有紧挨AOX1基因3′端的序列的1.5Kbp片段插入到pYM39的单个NruⅠ位点上。分离得到10.6Kbp的重组质粒pYMⅠ6，它含有这样定向的PvuⅡ片段，即3′AOX1基因近端序列朝向载体的HIS4基因部分。质粒pYMⅠ6含有从毕赤宿主中缺失AOX1基因和在AOX1启动子控制下表达出HBs Ag所需的全部成分，但是，它不含pBSAG5的修剪过的HBs Ag基因片段。

因此，建造的最后一步是将所需的HBs Ag基因重组到缺失AOX1基因的载体中。为此，先对pYMⅠ6和pBSAG5Ⅰ（一种除了含有HBs Ag表达盒的ClaⅠ片段的以相反方向定位外，其余都与pBSAG5相同的质粒）用限制性酶PstⅠ和SphⅠ酶解。含有修剪过的HBs Ag基因表达盒和毕赤HIS4基因的来自pBSAG5Ⅰ的6.3Kbp片段，被插入到来自pYMⅠ6并含有3′AOXⅠ序列和大部分pBR322的4.6Kbp片段中，以生产出最终为10.9Kbp的质粒pBSAGⅠ5Ⅰ。质粒pBSAGⅠ5Ⅰ携带于大肠杆菌宿主中，已储存于美国研究培养物收集中心，储存号为NRRL B-18021。

为了转化巴斯得毕赤酵母his4突变系GS115（NRRLY-15851），首先用限制酶BglⅡ酶解pBSAGⅠ5Ⅰ，得到7.2Kbp的线性载体，它的一端含有来自AOX1基因5′端的0.85Kbp序列，而另一端含有来自于AOX1基因3′端的1.1Kbp序列（见图12）。将大约2微克经BglⅡ切过的pBSAGⅠ5Ⅰ用选择组氨酸原养型的方法转化到GS115中。转化产生大约5×10³His⁺克隆。

将pBSAGⅠ5Ⅰ作为线性分子插入到AOX1染色体位置的转化，结果是AOX1基因缺失。因此，发生了所需线性插入的His⁺-转化系可以根据它们在甲醇中生产非常缓慢而鉴定出来。巴斯德毕赤酵母具有第二个“较弱”醇氧化酶基因AOX2，该基因产生的醇氧化酶对在缺失初级醇氧化酶基因的品系中以低速率增长的甲醇是足够的。）

鉴定不能在甲醇中良好生长的His⁺转化体过程的第一步是回收处于选择性琼脂中的His⁺细胞。这一步回收是将琼脂转移到含有20毫升无菌水的50ml的管中，用Brin Kman搅匀器以30秒低速破碎琼脂。将混合物通过网纱过滤分开细胞和琼脂碎块，并用30ml无菌水洗涤琼脂。然后将酵母细胞稀释到光密度A600＝0.1，使用Branson声处理仪第4档进行声处理10秒种以打碎酵母细胞团，再用无菌水稀释100倍。将10微升和100微升的等分试样分布在琼脂平板上，该琼脂平板含有无氨基酸的酵母氮碱0.67%和葡萄糖0.1%。在30℃温育3天后，对平板上出现的菌落根据在甲醇上的生长能力而进行筛选，筛选方法是将这些菌落重复涂板于一下列的琼脂板上，这些琼脂板含有无氨基酸酵母氮碱0.67%以及下述碳源：1）无碳原，2）0.5%甲醇，3）2%葡萄糖。在2%葡萄糖上能生长的菌落中有32%不能在甲醇中生长良好。

为了证实pBSAGⅠ5Ⅰ序列如图12所示地被插入，从一种甲醇利用缺乏的巴斯德毕赤品系中提取出全部的DNA，用限制性核酸内切酶酶解，并用32磷标记的探针以Southern blot方法杂化。在一套Southern blot中，从AOX1^-品系-GS115（pBSAGⅠ5Ⅰ），和AOX1⁺品系-GS115中来的DNA，被用HindⅢ酶解，并与标记过的pPG4.0杂化，pPG4.0是一种包括AOX1基因和从大肠杆菌宿主中的pBS322质粒中来的序列，该宿主的储存号是NRRL B-15868。在含有GS115的DNA的带上可见到编码AOX1的2.3kbp片段。然而，在含有GS115（pBSAGⅠ5Ⅰ）DNA的带上，该2.3kbp片断却不存在，而且没有新的片段出现。这个结果证实，AOX1基因已从GS115（pBSAGⅠ5Ⅰ）品系中缺失了。

实施例5

用HBs Ag编码载体转化的毕赤酵母的生长

1.在发酵器中繁殖GS115（pBSAG5）

10%的种菌在30℃含有酵母氮碱（YNB）+2%葡萄糖的摇瓶中过夜培养。该种菌加到发酵器中的无菌基础盐中（调pH为4）。葡萄糖是以0.05-0.1/小时的稀释率加入的。当细菌密度达到稳定状态的水平并且葡萄糖的水平低于100ppm时，将加入的碳源换为甲醇或50%葡萄糖和50%甲醇的混合物来诱导HBs Ag的生产。

2.在发酵器中生产GS115（pBSAGⅠ5Ⅰ）（AOX1^-）

将AOX1生物在甘油并接着给以含甲醇的养料，以批量式生产的方式生长，已经得到了可溶性HBs Ag Ausria活性（3-4%可溶蛋白）的最佳表达。种菌可以在YNB+甘油上生长。基础盐加甘油（1%和4%甘油）和生物素可在发酵器中高压灭菌。冷却后，调pH至3.5～6，在接种前加入微量盐（2.5ml/L）。在甘油被消耗前和消耗后，可加入100%甲醇。高达2%的甲醇不影响HBs Ag的积聚，积聚时间可长达200小时。然而，发酵器中含5%的甲醇则将终止HBs Ag颗粒的积聚。

提高所加盐分的浓度可获得更高密度的细胞生产。当在甲醇上生长时，提高锌的水平对提高细胞密度尤为重要。当生长不受锌的限制时，就获得更高水平的可被提取的Ausria活性，然而，可被提取的蛋白也更高，结果是随可溶蛋白的百分比使净Ausria活性值降低。

3.摇瓶培养GS115（pBSAG5）和GS115（pBSAGⅠ5Ⅰ）的细胞培养物

挑出转化的均落并划线在SD平板上。将划线的细胞接种于250ml摇瓶中的50mlYNB肉汁（1x YNB，5μg/ml生物素）及5%葡萄糖，在空气摇振器上以每分钟250周于30℃摇振过夜。早晨的OD₆₀₀读数在2-3。从摇瓶中取出约100OD₆₀₀单位的细胞（约10⁹个细胞），放在室温下的IEC离心机中以2000Xg离心7分钟。细胞团重新悬浮于在2升摇瓶的500ml肉汁+2%甘油中（OD₆₀₀＝0.2）。该培养物在空气摇振器中以250rpm于30℃培养至OD₆₀₀达到2-3。如果是AOX1^-宿主，则从培养物中取出500OD₆₀₀单位的细胞。该细胞悬浮液在IEC离心机上以2000Xg离心7分钟。细胞团重新悬浮于500ml YNB肉汁+0.5%甲醇（1.0OD₆₀₀）。如果是AOX1⁺宿主，则取出170OD₆₀₀单位的培养物，以相同条件离心，重新悬浮于500ml YNB肉汁+0.5%甲醇（0.3OD₆₀₀）。这两种培养物都放在2升的摇瓶中以250rpm于30℃摇振。每当OD≥2时，用同样的培养基稀释两倍。定期取出100OD₆₀₀样品，以2000Xg离心7分钟。所获的细胞团可在-70℃冷冻储存1-2周。

实施例6

分析HBs Ag∶22nm颗粒和HBs Ag单体

1.提取物的制备和蛋白确定

以下的所有操作均在0-4℃进行。将冷冻细胞团融冻，然后用2ml冰冷溶解性缓冲液洗两次。将细胞（100OD₆₀₀单位）转移到玻璃处置管（13×100mm）中。向细胞团加入0.35ml溶解性缓冲液和0.5克酸洗过的玻璃珠（直径0.45mm）。将悬浮液放在冰上的涡旋混合器中，以最高档次摇振4次，每次一分钟，每次之间有一分钟间隔。移出全部细胞浆液，玻璃珠用0.35ml溶解性缓冲液洗。将洗过的缓冲液与细胞浆液合并，转移到Eppendorf管中。在Eppendorf离心机上离心15分钟获得提取物。将上清液（可溶性部分，0.7ml）与滤饼分开。为从滤饼中提取出HBs Ag蛋白，要将0.7ml2倍浓度的SDS溶解性缓冲液加到滤饼中，将该混合物在涡旋混合器上搅动并煮开15分钟。混合物离心15分钟，然后将上清（可溶性部分）与细胞破碎物分开。用TCA沉淀和Lowry方法对可溶部分和不溶部分的等分试样分析蛋白质。以BSA作为蛋白浓度标准。可溶部分与不溶部分通常具有的蛋白浓度范围是3-5mg/ml。

2.制备提取物方法的改型

本节所描述的是从被含有编码HBs Ag蛋白系列的载体转化了的巴斯德毕赤酵母培养物中提取单体性异源性HBs Ag蛋白或22nm颗粒蛋白复合物的条件。

巴斯德毕赤酵母培养物生长至细胞密度为每毫升10-100OD₆₀₀单位。将100OD₆₀₀单位的等分试样转移到13×100mm的硼化硅培养管中，并用20体积的溶解性缓冲液洗两次。

将细胞聚集在一起（使用IEC医用离心机），向聚集的细胞加入0.5克用酸洗过的玻璃珠（0.5mm），然后加入0.35ml溶解性缓冲液。以溶解性缓冲液中含有0.5MNa Cl和0.1%Triton X-100作为对照，或以含3M碘化钾或硫氰酸钾并有或没有0.1% Triton X-100作为对照。所有的溶液均以10m M磷酸钠在pH＝7.5缓冲。混合物用涡旋混合器以最大速度搅拌四次，每次离心1分钟。在间隔期间，混合物在冰上冷却不得少于1分钟。当溶胞完成后，移出破碎细胞溶液，用0.35ml溶解性缓冲液洗玻璃珠，合并两种溶液，以13000Xg离心15分钟。移出上清液并检测免疫反应性的HBs Ag颗粒（Ausria检测）和全部的三氯乙酸（TCA）可沉淀的蛋白（Lowry）。5次试验的结果列于表1。

表1

A B C

22nm颗粒总蛋白 22nm颗粒

HBs Ag HBs Ag

溶胞条件（μg/ml）（μg/ml）重量百分比

盐浓度

NaCl（0.5M）+Triton 203-249 8.6-11.2 2.1-3.2

KI（3M）+Triton 5.1-150 0.85-3.4 0.5-8.1

KI（3M）-Triton 71-136 2.5-4.3 2.3-7.2

KSCN（3M）+Triton 2.4-50 0.6-1.9 0.8-9.6

KSCN（3M）-Triton 80-125 1.6-4.3 3.8-16.7

含有碘化钾和硫氰酸钾的条件所获HBs Ag颗粒的结果均比使用氯化钠的结果低（A栏），很明显，碘化钾和硫氰酸钾抑制总蛋白的释放（B栏），从而将颗粒的特异活性提高了2-5倍（C栏）。

3.22nm颗粒检测（AUSRIA^TMⅡ药盒）

对可溶性部分用Ausria稀释缓冲液稀释1000至10000倍，对其25～100μl的等分试样按如下进行检测：

第一次培养

1.为建立标准曲线，将含有0.1ng至4ng的稀释对照系列向反应盘上的小孔底部各移液200微升（拌有4个负对照）。

对分析试样，将200微升每种稀释的可溶性部分移液到反应盘上的另外小孔底部。

2.小心地向含样品和对照的小孔中各加一粒小珠。另外，小珠可以在加入样品和对照之前先行放入。

3.给反应盘盖上密封盖，然后轻拍密封盖，使其盖住小珠并排除任何空气小泡。

4.然后在45℃反应温育2小时。

5.去掉密封盖。弃去液体，每个小珠用6ml蒸馏水或去离子水洗两次。

第二次培养

6.向每个有小珠的孔中移入200微升¹²⁵I标记的抗HBs。

7.盖上新的密封盖，轻拍反应盘使其盖住小珠并去除任何空气小泡。

8.将反应盘在45℃温育1小时。

9.去除密封盖。弃去液体，每个小珠按第5步洗4次。

10.立即将珠粒移到正确识别的计数管中。伽马（γ）闪烁计数器读数：

11.按1分钟确定计数率。

12.在最后洗过的24小时之内计数样品。

使用按步骤1制定的标准曲线来计算22nm颗粒的水平。

4.单体检测（Western检测）

等体积的25微克蛋白（溶解性或不溶性部分），通常约2-5微升，用水补充为10微升。加入10微升2倍浓度的SDS凝胶装载缓冲液（1倍缓冲液中有100mMDTT），并将样品煮开15分钟。将煮开的样品装于12%SDS丙烯酰胺凝胶上（Laemmli）。凝胶电泳后，将蛋白质转移到硝化纤维纸上（Towbin et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA76，4350-4354[1979]）。用HBs Ag抗血清（由抵抗血浆衍化的HBs Ag而产生）和¹²⁵I标记的蛋白质A来测定HBs Ag。硝化纤维纸在-70℃对Kodak XAR-5底片曝光过夜。用γ计数器计数硝化纤维纸上的放射性谱带而得出单体的量。以酿酒酵母（S.cerevisiae）产生的重组HBs Ag（100-500ng/道）作为标准。

实施例7

HBs Ag在巴斯德毕赤中的表达水平

由几种转化的巴斯德毕赤菌株生产的HBs Ag用实施例6中的分析方法，使用实施例6第一部分所述的溶解方案来检测。结果列于表2。

表2

转化菌株 GS115（pBSAGI5Ⅰ） GS115（pBSAG5）

表型 AOX1^-His⁺AOX1⁺His⁺

载体状态整合的自动的

HBs Ag水平^a（摇瓶）

细胞/升 10¹¹10¹¹

单体（%） 7 1.5

22nm颗粒（%） 2.5 0.2

单体（mg/l）^b8.4 1.8

22nm颗粒（mg/l）^b3 0.24

HBs Ag水平^a（发酵器生长）

细胞/升 3.5×10¹²8×10¹²

单体（%） 7 1

22nm颗粒（%） 2.9 0.1

单体（mg/l）^b294 96

22nm颗粒（mg/l）^b122 10

a：蛋白质检测;用Bradford方法测定。

b：每升培养基中HBs Ag含量;OD₆₀₀＝5×

细胞/ml＝0.14mg干重/ml＝0.06mg蛋白/ml。

以上的结果证实，当在从巴斯德毕赤酵母中来的初级醇氧化酶基因（AOX1）调节区的控制下，可以在巴斯德毕赤酵母中生产出高水平的HBs Ag。

所提供的实施例仅仅是为了说明本发明，而不应当被理解为是对本发明或权项的限制。不背离本发明实质和精神的变型和改型均在本发明所需要和所寻求的保护范围之内。

Claims

1、一种DNA片段，该片段包括：

(a)一种调节区，该调节区当位于多肽编码区的5′末端时能控制信息RNA的转录，其中所说的调节区对以下各条件中的至少一种有反应：

(1)在培养基中存在有甲醇，含有所述DNA片段的宿主生物与其相接触，

(2)培养基中存在有非分解代谢产物抑制性碳源而不是甲醇，含有所述DNA片段的宿主生物与其相接触，

(3)培养基中缺乏碳源，含有所述DNA片段的宿主生物在有分解代谢产物抑制性碳源和能源的条件下生长之后再与该培养基接触；

(b)一种多肽编码区，该编码区编码乙型肝炎表面抗原或其蛋白。

2、根据权项1所说的DNA片段，其中所说的调节区的特征如图2的限制性图谱所示。

3、根据权项1所说的DNA片段，其进一步包括位于多肽编码区下游方的DNA3′序列;其中所说的DNA3′序列能控制由所述多肽编码区编码之信息RNA的多腺苷化和其转录的终止。

4、根据权项1所说的DNA片段，其进一步包括一种或更多种另外的DNA序列，这些DNA序列来自下组：

细菌质粒DNA，

噬菌体DNA，

酵母质粒DNA，

和酵母染色体DNA。

5、根据权项4所说的DNA片段，其中所说的酵母染色体DNA包括自动复制DNA序列和识别基团。

6、根据权项3所说的DNA片段，其中所说的DNA片段进一步包括一个或更多个另外的DNA序列，这些DNA序列来自下组：

细菌质粒DNA，

噬菌体DNA，

酵母质粒DNA，

和酵母染色体DNA。

7、根据权项6所述的DNA片段，其中所述的酵母染色体DNA包括自动复制DNA序列和识别基团。

8、根据权项1所述的DNA片段，其进一步包括一系列排列的DNA，这些DNA包括：

第一可插入DNA片段，

选择识别基因，

第二可插入DNA片段;

其中所说的第一和第二可插入DNA片段各自长度至少为200个核苷酸并且具有与毕赤属基因组DNA的蛋白同源的核苷酸序列;其中所说的DNA片段和所说识别基因位于所述第一可插入DNA片段的3′末端与所述第二可插入DNA片段5′末端之间，其中所说第一和第二可插入DNA片段相互之间的定向与它们在毕赤基因组中的定向相同。

9、根据权项1所述的DNA片段，其中所说的多肽编码区基本上有700个碱基对的EcoRⅠ-StuⅠ片段组成，该片段如下：

5′-GAATTCATGG AGAACATCAC ATCAGGATTC CTAGGACCCC

TGCTCGTGTT ACAGGCGGGG TTTTTCTTGT TGACAAGAAT

CCTCACAATA CCGCAGAGTC TAGACTCGTG GTGGACTTCT

CTCAATTTTC TAGGGGGATC TCCCGTGTGT CTTGGCCAAA

ATTCGCAGTC CCCAACCTCC AATCACTCAC CAACCTCCTG

TCCTCCAATT TGTCCTGGTT ATCGCTGGAT GTGTCTGCGG

CGTTTTATCA TATTCCTCTT CATCCTGCTG CTATGCCTCA

TCTTCTTATT GGTTCTTCTG GATTATCAAG GTATGTTGCC

CGTTTGTCCT CTAATTCCAG GATCAACAAC AACCAGTACG

GGACCATGCA AAACCTGCAC GACTCCTGCT CAAGGCAACT

CTATGTTTCC CTCATGTTGC TGTACAAAAC CTACGGATGG

AAATTGCACC TGTATTCCCA TCCCATCGTC CTGGGCTTTC

GCAAAATACC TATGGGAGTG GGCCTCAGTC CGTTTCTCTT

GGCTCAGTTT ACTAGTGCCA TTTGTTCAGT GGTTCGTAGG

GCTTTCCCCC ACTGTTTGGC TTTCAGCTAT ATGGATGATG

TGGTATTGGG GGCCAAGTCT GTACAGCATC GTGAGTCCCT

TTATACCGCT GTTACCAATT TTCTTTTGTC TCTGGGTATA

CATTTAAGGC CT-3′

10、一种质粒，它包括：

权项1所述的DNA片段，

细菌质粒DNA，

选择性酵母识别基因，和

酵母自动复制序列。

11、根据权项10所说的质粒，其中所说的质粒是pBSAG5。

12、根据权项10所说的质粒，其中所说的质粒是pBSAG5Ⅰ，如图11所示。

13、根据权项10所说的质粒，其中所说的质粒是pBSAGI5Ⅰ，如图11所示。

14、一种基本纯净的毕赤属品系培养物，该品系被选自以下的质粒所转化：

pBSAG5，

pBSAG5Ⅰ，和

pBSAGI5Ⅰ。

15、一种基本纯净的被权项3所述DNA片段转化的毕赤属品系培养物。

16、一种制备乙型肝炎表面抗原的方法，该方法包括培养用权项10所述质粒转化的酵母，培养是在含有至少一种碳源子和能源的营养培养基中进行，碳源和能源选自：

甲醇，和

分解代谢产物非抑制性碳源。

17、根据权项16所说的方法，它进一步包括分离和提纯所述的乙型肝炎表面抗原。

18、一种制备乙型肝炎表面抗原的方法，它包括：

（a）在含有至少一种分解代谢产物抑制性碳源和能源的营养培养基中培养用权项10所述质粒转化的酵母，

（b）将（a）步的产物放在缺乏碳源的条件下。

19、根据权项18所述的方法，它进一步包括分离和提纯乙型肝炎表面抗原。

20、一种对建造表达载体有用的质粒，该表达载体用于在毕赤AOX1调节区控制下生产异源蛋白，其中所述的质粒是质粒pAOP2，如图4所示。