CN1301307A

CN1301307A - 在丝状真菌突变细胞中生产多肽的方法

Info

Publication number: CN1301307A
Application number: CN 99806230
Authority: CN
Inventors: J·瓦勒斯尼尔; T·克瑞斯特森
Original assignee: Novo Nordisk AS; Novo Nordisk Biotech Inc
Current assignee: Novo Nordisk AS; Novozymes Inc
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-14
Publication date: 2001-06-27
Also published as: EP1078080A1; WO1999060136A1; JP2002515252A; AU4188099A

Abstract

本发明涉及一种以提高的量生产多肽的方法,它包括:(a)在适合生产该多肽的营养培养基中培养亲代丝状真菌细胞的突变体,其中,(i)该突变细胞包含一条编码该多肽的第一种核酸序列和编码DDC2和/或DDC3多肽的一条或多条第二种核酸序列的修饰,或其同源物,以及(ii)当在相同条件下培养时,该突变细胞比亲代细胞生产更多的多肽;以及(b)从该突变细胞的营养培养基回收所述多肽。本发明还涉及所述第二种核酸序列,由该第二种核酸序列编码的多肽,以及包含该序列的核酸构建物、重组表达载体和宿主细胞。本发明进一步涉及丝状真菌细胞的突变体和获得该突变细胞的方法。

Description

在丝状真菌突变细胞中生产多肽的方法

本发明涉及在丝状真菌细胞的突变体，丝状真菌细胞的突变体中生产多肽的方法，以及获得该突变体的方法。

已应用数种方法改进通过对细胞诱变处理而生产多肽的方法。例如，通过典型性诱变生产突变细胞而改变了蛋白质的生产，所述典型性诱变涉及用化学作用剂、物理作用剂和生物作用剂作为诱变(诱发突变)剂处理细胞而增大突变事件的频率。

一种增大多肽产量的广泛应用的方法是扩增而产生编码该多肽的基因的许多拷贝。例如，美国专利No.5,578,461公开了：借助于与一种基因串联的一种可扩增选择性标记基因的同源重组，其中，可通过在适当选择剂的存在下培养细胞而选择包含选择性标记的扩增拷贝板的细胞。

此外，通过用不同的启动子替换一种启动子或者用另一种信号肽编码区替换一种信号肽编码区增大了多肽的产量。参见例如美国专利No.5,641,670。还通过分泌型蛋白质的超量生产(Ruohonen等，1997,酵母(yeast),13:337～351)和产生分泌过多的细胞(美国专利No.5,312,735)改善了多肽的分泌。

还通过破坏编码能在生产多肽的条件下水解该多肽的蛋白酶的DNA序列而增大了多肽的产量。

本发明的一个目的是提供增大突变型丝状真菌菌株中多肽产量的改进方法，从而在工业上生产大量多肽。

本发明涉及生产多肽的方法，它包括：

(A)在有助于生产该多肽的条件下培养亲代丝状真菌细胞的突变细胞，其中，当在相同条件下培养时，所述突变细胞比亲代细胞生产更多的多肽，其中，所述突变细胞包含一条编码该多肽的第一种核酸序列以及一条或多条选自下组的第二种核酸序列的修饰：

(ⅰ)编码具有一种氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少50％与序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；

(ⅱ)具有至少50％与序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性的核酸序列；

(ⅲ)一条核酸序列，它在低严格性条件下与如下物质杂交：(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100个核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互补链；

(ⅳ)一条编码多肽的变体的核酸序列，所述多肽具有一条序列2或序列5的氨基酸序列，所述变体包括一个或多个氨基酸的替代、缺失和/或插入；

(ⅴ)(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的等位变体；以及

(ⅵ)(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)或(ⅴ)的子序列，其中，该子序列编码具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段；以及

(B)从所述突变细胞的培养基回收所述多肽。

本发明还涉及丝状真菌细胞的突变体和获得该突变细胞的方法。

本发明还涉及：编码DDC2或DDC3多肽的分离的第二种核酸序列，由该第二种核酸序列编码的、分离的DDC2或DDC3多肽，以及包含该第二种核酸序列的核酸构建物、重组表达载体和宿主细胞。

图1A和1B示出了DDC2的基因组核酸序列和推断的氨基酸序列(分别为序列1和2)。

图2A和2B示出了DDC2的基因组核酸序列和推断的氨基酸序列(分别为序列4和5)。

图3示出了pToC391的限制图。

图4示出了pToC401的限制图。

本发明涉及以提高的量生产多肽的方法，它包括：在有助于生产该多肽的条件下培养亲代丝状真菌细胞的突变细胞，再从所述突变细胞的培养基分离所述多肽，其中，所述突变细胞包含一条编码该多肽的第一种核酸序列以及一条或多条第二种核酸序列(该序列是亲代细胞的内源性序列)的一个修饰(例如破坏或缺失)，其中，当在相同条件下培养时，所述修饰提高了突变细胞的多肽产量(与亲代细胞相比)。

在本发明的方法中，所述一条或多条第二种核酸序列具有：

(ⅴ)(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的等位变体；以及

(ⅵ)(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)或(ⅴ)的子序列，其中，该子序列编码具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段。

DDC2和/或DDC3多肽活性在本文被定义为这样的一种或多种活性：当减小(更优选消除)时，它增大或提高多肽的产量。

在第一个实施方案中，第二种核酸序列编码具有一条氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、进一步优选至少约90％、最优选至少约95％、进一步最优选至少约97％与序列2的氨基酸19～64(即成熟多肽)的同一性程度，该多肽具有DCC2多肽活性(下文“DCC2同源多肽”或“DCC2多肽”)，或者至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、进一步优选至少约90％、最优选至少约95％、进一步最优选至少约97％与序列5的氨基酸21～83(即成熟多肽)的同一性程度，所述多肽具有DCC3多肽活性(下文“DCC3同源多肽”或“DCC3多肽”)。在一个优选的实施方案中，所述同源多肽具有的氨基酸序列有五个氨基酸、优选有四个氨基酸、更优选有三个氨基酸、进一步优选有两个氨基酸、最优选有一个氨基酸不同于序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83。对本发明来说，两种氨基酸序列之间的同一性程度是通过Clustal法(Higgins,1989,CABIOS 5:151～153)测定的，即：应用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)，采用同一性表和下列序列多重对比参数：间隙罚分(gap penalty)为10并且间隙长度罚分(gap length penalty)为10。成对对比参数为：Ktuple=1，间隙罚分=3，窗(windows)=5，以及斜列(diagonals)=5。

优选地，所述第二种核酸序列编码这样的多肽，即，该多肽包含序列2的氨基酸序列或其等位变体；或其具有DCC2多肽活性的片段。在一个更优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码DCC2多肽，该多肽包含序列2的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽包含序列2的氨基酸19～64，或其等位变体；或其具有DCC2多肽活性的片段。在又一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽包含序列2的氨基酸19～64。在又一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽由序列2的氨基酸序列或其等位变体；或其具有DCC2多肽活性的片段构成。在又一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽由序列2的氨基酸序列构成。在又一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽由序列2的氨基酸19～64或其等位变体；或其具有DDC2多肽活性的片段构成。在又一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽由序列2的氨基酸19～64构成。

优选地，所述第二种核酸序列编码这样的多肽，即，该多肽包含序列5的氨基酸序列或其等位变体；或其具有DCC3多肽活性的片段。在一个更优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码DCC3多肽，该多肽包含序列5的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽包含序列5的氨基酸21～83，或其等位变体；或其具有DCC3多肽活性的片段。在又一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽包含序列5的氨基酸21～83。在又一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽由序列5的氨基酸序列或其等位变体；或其具有DCC3多肽活性的片段构成。在又一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽由序列2的氨基酸序列构成。在又一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽由序列5的氨基酸21～83，或其等位变体；或其具有DDC3多肽活性的片段构成。在又一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽由序列5的氨基酸19～64构成。

所述第二种核酸序列还包含这样的核酸序列，即，它们编码一种具有序列2或序列5的氨基酸序列的多肽，它们由于遗传密码的简并性而分别不同于序列1或序列4。本发明还涉及序列1的子序列(它们编码具有DDC2多肽活性的序列2的片段)和序列4的子序列(它们编码具有DDC3多肽活性的序列5的片段)。

序列1或序列4的子序列分别是序列1或序列4所包含的核酸序列，不同的是从5′和/或3′端开始的一个或多个核苷酸缺失了。优选地，序列1的子序列包含至少114个核苷酸，更优选至少138个核苷酸，最优选至少162个核苷酸。优选地，序列4的子序列包含至少159个核苷酸，更优选至少189个核苷酸，最优选至少219个核苷酸。

序列2或序列5的片段是一种多肽，该多肽有一个或多个氨基酸从该氨基酸序列的氨基端和/或羧基端缺失了。优选地，序列2的片段包含至少38个氨基酸残基，更优选至少46个氨基酸残基，最优选至少54个氨基酸残基。优选地，序列5的片段包含至少53个氨基酸残基，更优选至少63个氨基酸残基，最优选至少73个氨基酸残基。

等位变体表示占据同一个染色体基因座的任何两种或多种基因备选形式。等位变异是通过突变自然地引起的，可能导致群体中的多形性。基因突变可能是沉默的(在编码的多肽中没有变化)或者可能编码具有改变了的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。

在第二个实施方案中，所述第二种核酸序列具有至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、进一步优选至少约90％、最优选至少约95％、进一步最优选至少约97％与序列1的成熟多肽编码序列(即核苷酸1014～1151)的同源性程度，它们编码活性DDC2多肽；或者序列1的等位变体和子序列(它们编码具有DDC2多肽活性的多肽片段)，或者具有至少约50％、优选至少约60％、优选至少约70％、更优选至少约80％、进一步优选至少约90％、更进一步优选至少约95％、最优选至少约97％与序列4的成熟多肽编码序列(即核苷酸1041～1229)的同源性程度，它们编码活性DDC3多肽；或者序列4的等位变体和子序列(它们编码具有DDC3多肽活性的多肽片段)。对本发明来说，两种核酸序列之间的同源性程度是通过Wilbur-Lipman法(Wilbur和Lipman,1983，美国国家科学院院报(Proceedings of theNational Academy of Science USA)80:726～730)测定的，即：应用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)，采用同一性表和下列序列多重对比参数：间隙罚分为10，并且间隙长度罚分为10。成对对比参数：Ktuple=1，间隙罚分=3，以及窗=20。

在第三个实施方案中，所述第二种核酸序列在很低严格性条件、优选低严格性条件、更优选中度严格性条件、更优选中-高严格性条件、进一步优选高严格性条件、最优选很高严格性的条件下与一种核酸探针杂交，该核酸探针在相同条件下与下列物质杂交：(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100个核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatus,1989，“分子克隆，实验手册”(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor,New York)。序列1或序列4的子序列可能是至少100个核苷酸或者优选至少200个核苷酸。此外，该子序列可以编码具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段。

序列1或序列4的核酸序列或其子序列，以及序列2或序列5的氨基酸序列或其片段可被用于设计核酸探针从而按本领域熟知的方法从不同属或种的菌株鉴定和克隆编码具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽的DNA。具体地说，这样的探针可被用于按标准的DNA印迹法操作与感兴趣的属或种的基因组的或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中相应的基因。这样的探针可能比全长序列短得多，但长度应是至少15个、优选至少25个、更优选至少35个核苷酸。还可应用更长的探针。可应用DNA探针和RNA探针这两种。通常对探针作标记以检测相应的基因(例如，以32P、3H、35S、生物素或抗生物素蛋白标记)。本发明包括这样的探针。

因此，从这样的其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库可用于DNA筛选，该DNA与上述探针杂交并且编码具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽。得自这样的其它生物的基因组DNA或其它DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，或者通过其它分离技术分离。得自所述文库的DNA或分离的DNA可被转移到或固定在硝化纤维素或其它合适的载体上。为了鉴定与序列1或序列4或其子序列同源的克隆或DNA，在DNA印迹法中应用所述载体材料。对本发明来说，“杂交”表示某核酸序列与标记的核酸探针(相应于序列1或序列5中所示的核酸序列、它的互补链或其子序列)在很低严格性到很高严格性条件下杂交。应用X光片检测在这些条件下核酸探针与之杂交的分子。

在一个优选的实施方案中，所述核酸探针是序列1。在另一个优选的实施方案中，所述核酸探针是编码序列2或其子序列的多肽的核酸序列。在又一个优选的实施方案中，所述核酸探针是序列1的核苷酸1014～1151，它编码具有DDC2多肽活性的成熟多肽。在又一个优选的实施方案中，所述核酸探针是含于粘粒18H7[它被包含于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)DSM 12060中]中的核酸序列，其中，该核酸序列编码具有DDC2多肽活性的多肽。在又一个优选的实施方案中，所述核酸探针是含于粘粒18H7(它被包含于大肠埃希氏菌DSM12060中)中的成熟DDC2多肽编码区。

在一个优选的实施方案中，所述核酸探针是序列4。在另一个优选的实施方案中，所述核酸探针是编码序列5或其子序列的多肽的核酸序列。在又一个优选的实施方案中，所述核酸探针是序列4的核苷酸1041～1229，它编码具有DDC3多肽活性的成熟多肽。在又一个优选的实施方案中，所述核酸探针是含于粘粒34G12(它被包含于大肠埃希氏菌DSM11924中)中的核酸序列，其中，该核酸序列编码具有DDC3多肽活性的多肽。在又一个优选的实施方案中，所述核酸探针是含于粘粒34G12(它被包含于大肠埃希氏菌DSM11924中)中的成熟DDC3多肽编码区。

就长度至少为100个核苷酸的长探针来说，“很低严格性到很高严格性条件”被定义为在42℃下，在5X SSPE,0.3％SDS,200μg/ml剪切并变性的鲑精DNA，以及或者25％甲酰胺(对很低严格性和低严格性条件来说)，35％甲酰胺(对中度严格性和中-高严格性条件来说)，或者50％甲酰胺(对高严格性和很高严格性条件来说)中，按标准DNA印迹法操作的预杂交和杂交。

就长度至少为100个核苷酸的长探针来说，最后应用2X SSC,0.2％SDS优选至少在45℃(很低严格性)，更优选至少在50℃(低严格性)，更优选至少在55℃(中度严格性)，更优选至少在60℃(中-高严格性)，进一步更优选至少在65℃(高严格性)，最优选至少在70℃(很高严格性)下将所述载体材料洗涤三次，每次15分钟。

就长度为约15个核苷酸～约70个核苷酸的短探针来说，“严格性条件”被定义为按标准DNA印迹法操作预杂交、杂交和杂交后洗涤，即，在低于[应用Bolton和McCarthy的计算法(1962，美国国家科学院院报48:1390)]计算的Tm约5℃～约10℃下，在0.9M NaCl,0.09MTris-HCl(pH7.6),6mM EDTA,0.5％NP-40,1X Denhardt溶液，1mM焦磷酸钠，1mM磷酸二氢钠，0.1mM ATP，和0.2mg酵母RNA/ml中洗涤。

就长度为约15个核苷酸～约70个核苷酸的短探针来说，将所述载体材料用6X SCC加0.1％SDS洗涤一次(达15分钟)和应用6X SSC在低于计算的Tm约5℃～约10℃下洗涤两次(每次15分钟)。

所述第二种核酸序列是这样获得的：(a)在很低严格性、低严格性、中度严格性、中-高严格性、高严格性或很高严格性的条件下，将DNA与下列物质杂交：(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151,(ⅱ)(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互补链；或者(ⅰ)序列4的核苷酸1041～1229,(ⅱ)(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互补链；以及(b)分离该核酸序列。所述子序列优选是至少100个核苷酸的序列，例如，编码具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段的序列。

在第四个实施方案中，所述第二种核酸序列编码具有序列2或序列5的氨基酸序列的多肽的变体(包括一个或多个氨基酸的替换、缺失和/或插入)。

所述变异的多肽的氨基酸序列可能因一个或多个氨基酸残基的插入或缺失和/或由不同的氨基酸残基替代一个或多个氨基酸残基而不同于序列2或序列5的氨基酸序列或其成熟多肽。优选地，氨基酸改变是微小性的改变，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸替代；少量缺失(通常1个～约30个氨基酸)；小的氨基端或羧基端延伸(例如一个氨基端甲硫氨酸残基)；至多约20～25个残基的小接头肽；或者有助于通过改变静电荷或另一功能而纯化的小的延伸(例如多组氨酸序列段、抗原表位或结合域)。

保守替代的实例是在下列氨基酸范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)，疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。一般不改变比活性的氨基酸替代是本领域中已知的，例如，由H.Neurath和R.L.Hill(1979)描述于“蛋白质”(The Proteins),Academic Press,New York中。最常出现的交换有：Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly，反之亦然。

变异的序列可在作为序列1或序列4的多肽编码部分(例如，其子序列)给出的核酸序列基础上被构建，和/或通过引入核苷酸替代(该替代不产生由核酸序列编码的多肽的另一氨基酸序列，但相当于生产多肽所预期的宿主生物的密码子选择)而构建，或者通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸替代而构建。至于核苷酸替代的一般描述，可参见例如：Ford等，1991，蛋白质表达和纯化(Protein Expression andPurification)2:95～107。

本领域技术人员显而易见的是，这样的替代可在对分子的功能起关键作用的区之外进行，并且仍产生活性多肽。对于被所述第二种核酸序列编码的多肽活性起关键作用的氨基酸残基(因而优选不经历替代)可按本领域已知的方法鉴定，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(参见例如，Cunningham和Wells，科学(Science)244:1081～1085)。在后一种技术中，在分子中的每个正电荷残基上引起突变，再测定生成的突变分子的DDC2或DDC3多肽活性从而鉴定对该分子的活性起关键作用的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点还可通过三维结构的分析测定，三维结构可通过例如核磁共振分析、晶体学或光亲和性标记测定(参见例如，de Vos等，1992，科学255:306～312；Smith等，1992，分子生物学杂志(Journal of Molecular Biolegy)224:899～904；Wlodaver等，1992,FEBS通讯(FEBS Letters)309:59～64)。

在一个优选的实施方案中，修饰了编码DDC2和DDC3多肽的两条第二种核酸序列。在一个更优选的实施方案中，修饰了分别含于序列1和序列4中的DCC2和DDC3核酸序列。

所述第二种核酸序列可从任意属的微生物获得。就本发明来说，本文应用的术语“得自”与给定的源联系将表示：由核酸序列编码的多肽是由该源生产的或者是由一种细胞(其中，插入了该源的核酸序列)生产的。在一个优选的实施方案中，由所述第二种核酸序列编码的多肽是胞外分泌的。

所述第二种核酸序列可得自真菌源，更优选得自酵母菌株，例如，假丝酵母(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、或Yarrowia菌株；或者更优选得自丝状真菌菌株，例如支顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、Neocallimastix、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮霉菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)菌株。

在一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列得自卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或Saccharomyces oviformis菌株。

在另一个优选的实施方案中，所述第二种核酸序列得自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusariumculmorum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusariumvenenatum、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉(Trichoderma viride)菌株。

在一个更优选的实施方案中，编码DCC2多肽的第二种核酸序列得自米曲霉菌株，最优选得自米曲霉IFO4177或其突变株(例如具有序列2的氨基酸序列的多肽)。在另一个更优选的实施方案中，所述核酸序列是含于粘粒18H7(它含于大肠埃希氏菌DSM12060中)中的序列。在另一个优选的实施方案中，所述核酸序列是序列1的核苷酸1014～1151。

在另一个更优选的实施方案中，编码DDC3多肽的第二种核酸序列得自米曲霉菌株，最优选得自米曲霉IFO4177或其突变株(例如具有序列2的氨基酸序列的多肽)。在另一个更优选的实施方案中，所述核酸序列是含于粘粒34G12(它含于大肠埃希氏菌DSM11924中)中的序列。在另一个优选的实施方案中，所述核酸序列是序列4的核苷酸1041～1229。

应懂得，对于上述菌种来说，本发明既包括完全阶段，又包括不完全阶段，以及其它分类的等值种(例如无性型)，不管它们的种名是什么。本领域技术人员应容易识别合适的等值种的个性。例如，所述多肽可得自Raper,K.D.和Fennel,D.I.(1965)在“曲霉属”(The GenusAspergillus)(the Wilkins Company,Baitimore)中定义的曲霉属的分类的等值种微生物，不管它们的种名是什么。曲霉属是有丝分裂孢子类真菌，其特征在于这样一种曲霉(aspergillum)：它包含分生孢子柄，在泡囊中没有已知的有性型状态终止，泡囊本身又带有一层或两层同步形成的特化细胞(分别被称为小梗或瓶梗)，以及无性形成的孢子(被称为分生孢子)。曲霉属的已知有性型包括散囊菌属(Eurotium)、Neosartorya和Emericella。曲霉属及其有性型的菌株公众能在一些菌种保藏单位得到，例如：美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)和农业研究机构专利菌种保藏中心(NRRL)。此外，这样的核酸序列可应用上述探针从其它源[包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物]鉴定和获得。从自然生境分离微生物的技术是本领域熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物的基因组文库或cDNA文库获得核酸序列。一旦用探针检测了编码多肽的核酸序列，就可通过应用本领域普通技术人员已知的技术(参见例如Sambrook等，1989，上文)分离或克隆该序列。

所述第二种核酸序列可以是突变型核酸序列，它包含：至少一个在序列1的成熟多肽编码序列中的突变(其中，该突变型核酸序列编码由序列2的氨基酸19～64构成的多肽)，或者至少一个在序列4的成熟多肽编码序列中的突变(其中，该突变型核酸序列编码由序列5的氨基酸21～83构成的多肽)。

用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域已知的，它们包括：从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。从这样的基因组DNA克隆本发明的核酸序列可这样进行：例如，通过应用熟知的聚合酶链反应(PCR)或表达文库的抗体筛选检测具有共享结构特征的克隆化DNA片段。参见例如，Innis等，1990,“PCR：方法和应用指南”(PCR:A Guide to Methods and Application),Academic Press,NewYork。可应用其它核酸扩增方法，例如，连接酶链反应(LCR)，连接活化的转录(LAT)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。所述第二种核酸序列可从曲霉属或者别的或相关的微生物菌株克隆，所以，例如所述第二种核酸序列可以是核酸序列的多肽编码区的等位变体或变种。

突变型丝状真菌细胞可通过应用本领域熟知的方法(例如，插入、破坏、替代或缺失)减少或消除本文所述的一条或多条第二种核酸序列的表达而构建。待修饰的或灭活的所述第二种核酸序列可以是，例如，对活性来说必需的编码区或其部分，或者表达该编码区所需的调节元件或控制元件。一个这种调节序列或控制序列的实例可以是启动子序列或其功能部分(即，足以影响该核酸序列的表达的部分)。可能修饰的其它控制序列包括但不限于：前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号序列、转录终止子和转录激活因子。

所述第二种核酸序列的修饰或灭活可这样进行：使亲代细胞经历诱变，再选择突变细胞(其中，所述第二种核酸序列的表达已被减少或消除了)。所述诱变(它可以是专一的或随机的)可这样进行：例如，通过应用合适的物理诱变剂或化学诱变剂，应用合适的寡核苷酸，或者使DNA序列经历PCR产生的诱变。此外，还可应用这些诱变方法的任意组合进行诱变。

适合本目的的物理诱变剂或化学诱变剂的实例包括：紫外线(UV)照射、羟胺、N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当应用这样的作用剂时，通常是这样进行诱变的：将需要诱变处理的亲代细胞在选定的诱变剂存在下和在合适的条件下保温，再选择表现为减少了或没有所述第二种核酸序列的表达的突变细胞。

所述第二种核酸序列的修饰或灭活还可通过引入、替代或除去其转录或翻译所需的序列或调节元件中的一个或多个核苷酸来完成。例如，可插入或除去核苷酸从而导致终止密码子的引入、起始密码子的除去或开放读框的改变。这样的修饰或灭活可通过按本领域已知的方法的定点诱变或PCR产生的诱变而完成。不过，一般说来，可在体内进行修饰，即，直接在表达待修饰的所述第二种核酸序列的细胞上进行，优选按下文说明的那样进行体外修饰。

一个减少或消除由选定的丝状真菌细胞表达所述第二种核酸序列的简便方法的实例基于基因替代、基因缺失或基因破坏的技术。例如，在基因破坏方法中，在体外诱变相应于感兴趣的内源性基因或基因片段的核酸序列而产生缺损核酸序列，再将它转化入亲代细胞而产生缺损基因。通过同源重组，该缺损核酸序列替代内源性基因或基因片段。可能希望所述缺损基因或基因片段还编码可被用于选择转化体(其中，核酸序列已被修饰了或破坏了)的标记。

也可通过既定的反义技术应用与该基因的核酸序列互补的核苷酸序列进行所述第二种核酸序列的修饰或灭活。更具体地说，可这样减少或消除通过丝状真菌细胞的基因的表达，即，通过引入与所述第二种核酸序列互补的核苷酸序列，该序列可在所述细胞中被转录并且能与细胞中生产的mRNA杂交。在使互补反义核苷酸序列可与该mRNA杂交的条件下，于是，减少或消除了翻译的蛋白质的量。

与序列1或序列4的第二种核酸序列同源或互补的核酸序列可得自下述任意微生物源。核酸序列源的选择将依赖于丝状真菌细胞，但优选的源是真菌源(例如酵母和丝状真菌)。优选的丝状真菌源包括但不限于：支顶孢属、曲霉属、镰孢属、腐质霉属、毁丝霉属、毛霉属、脉孢菌属、青霉属、Phanerochaete、梭孢壳属、Tolypocladium和木霉属。优选的酵母源包括但不限于：假丝酵母、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)和Yarrowia。此外，该核酸序列可以是所述丝状真菌细胞的天然序列。

应懂得，本发明的方法不限于获得突变丝状真菌细胞的具体顺序。可在构建生产多肽的细胞时的任意步骤将本文所述的第二种核酸序列的修饰引入亲代细胞。优选的是，在引入编码异源多肽的第一种核酸序列之前已修饰了突变丝状真菌细胞的第二种核酸序列。

在本发明的方法中，所述丝状真菌细胞可以是野生型细胞或其突变体。优选地，该丝状真菌细胞是支顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球酵母属、Filibasidium、镰孢属、赤霉属、腐质霉属、Magnaporthe、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属(Myrothecium)、Neocallimastix、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、Piromyces、裂褶菌属、篮霉菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、Tolypocladium或木霉属细胞。

在一个优选的实施方案中，所述丝状真菌细胞是棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。

在另一个优选的实施方案中，所述丝状真菌细胞是杆孢状镰孢、Fusarium crookwellense(Fusarium cerealis的异名)、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、腐皮镰孢(Fusarium solani)、拟分枝孢镰孢、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusariumtrichothecioides或Fusarium venenatum细胞。

在又一个优选的实施方案中，所述丝状真菌细胞是Gibberellapulicaris、Gibberella zeae、Humicola insolens、Humicolalanuginosa、米黑毛霉、Myceliophthora thermophila、Myrotheciumroridin、粗糙脉孢菌或产紫青霉细胞。

在又一个优选的实施方案中，所述丝状真菌细胞是Trichodermaharzianum、康宁木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichodermareesei或绿色木霉细胞。

所述突变丝状真菌细胞是应用本领域已知的方法在适合生产由所述第一种核酸序列编码的多肽的营养培养基中培养的。例如，所述细胞可通过摇瓶培养法培养，通过在合适的培养基中和使所述异源多肽能被表达和/或分离的条件下进行的、在实验室用发酵罐或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续发酵、间歇发酵、补料分批发酵或固态发酵)培养。该培养是应用本领域已知的方法在合适的营养培养基(包含碳源和氮源和无机盐)中进行的。合适的培养基可从供应商获得或者可按公开的组成(例如美国典型培养物保藏中心的产品目录)制备。可直接从培养基回收多肽(如果分泌的话)。

所述多肽可应用本领域已知的方法(该多肽专一性的方法)检测。这些检测方法可包括：特异性抗体的应用、酶产品的生成、酶底物的消失、SDS-PAGE或本领域已知的任何其它方法。例如，可应用酶验定法测定所述多肽的活性。对很多酶来说，测定酶活性的方法是本领域已知的。

生成的多肽可通过本领域已知的方法分离。例如，可通过包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀的常规方法从营养培养基分离所述多肽。然后，可通过本领域已知的各种方法进一步纯化分离的多肽，这些方法包括但不限于：层析法(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)，电泳法(例如制备型等电聚焦)，差示溶解(例如硫酸铵沉淀)，或者提取[参见例如，“蛋白质纯化”(Protein Purification),J.C.Janson和Lars Ryden编辑，VCHPublishers,New York,1989]。

由所述第一种核酸序列编码的多肽可以是对突变丝状真菌细胞来说天然的或外源的任意多肽。术语“多肽”在本文并不意味着表示特定长度的编码产品，所以，它包括肽、寡肽和蛋白质。术语“异源多肽”在本文被定义为对所述丝状真菌细胞来说不是天然的多肽。突变丝状真菌细胞可能包含一个或多个编码异源多肽的核酸序列的拷贝。

在一个优选的实施方案中，所述多肽是激素、激素变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或者报道分子。在一个更优选的实施方案中，所述多肽是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在一个更进一步优选的实施方案中，所述多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶(mutanase)、氧化酶、果胶溶解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

编码感兴趣的多肽的所述第一种核酸序列可得自任何原核生物源、真核生物源或其它源。

在本发明的方法中，突变丝状真菌细胞还可被用于重组生产该细胞天然的多肽。该天然的多肽可这样重组生产：例如，使编码该多肽的基因受不同的启动子控制而增强多肽的表达，通过应用信号序列加速感兴趣的天然多肽输出细胞，以及增大编码(通常由细胞生产的)多肽的基因拷贝数。本发明在术语“异源多肽”的范围内还包括这种重组生产所述丝状真菌细胞天然的内源性多肽至这样的程度以致这种表达涉及所述细胞非天然遗传因子的应用，或者被操作而以宿主细胞中一般不出现的方式起作用的天然因子的应用。

本文描述了用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术。编码所述多肽的核酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成源的或其任意组合。

在本发明的方法中，所述多肽还可以是多肽的改造变体。

在本发明的方法中，所述多肽可进一步包括融合的或杂合的多肽，其中，另一种多肽被融合在该多肽或其片段的N端或C端。融合多肽是通过将编码一种多肽的核酸序列(或其一部分)融合到编码另一种多肽的核酸序列(或其一部分)而生产的。生产融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括：连接编码所述多肽的编码序列使它们处于读框中，于是，融合多肽的表达受相同的启动子和终止子的控制。杂合多肽可包括：得自至少两种不同多肽(其中，一种或多种可以是突变丝状真菌细胞的异源性多肽)的部分或全部多肽序列的组合。

可按多种方法操作编码感兴趣多肽的、分离的第一种核酸序列供多肽的表达。“表达”应被理解为包括在多肽生产中涉及的任意步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。在其插入载体之前操作核酸序列可能是希望的或必要的，这取决于表达载体。利用克隆方法修饰核酸序列的技术是本领域熟知的。

“核酸构建物”在本文被定义为一种核酸分子(单链或双链的)，它是从天然基因分离的或者已被修饰而包含核酸的节段(该节段以自然界不存在的方式被组合和并列)。当该核酸构建物包含表达编码序列所需的全部控制序列时，“核酸构建物”这个术语就与术语“表达盒”同义。术语“编码序列”在本文被定义为被转录成mRNA和被翻译成多肽的序列。编码序列的边界一般是通过ATG起始密码子(它恰好位于mRNA的5′端处开放读框的上游)和转录终止子序列(它恰好位于mRNA的3′端处开放读框的下游)测定的。编码序列可能包括但不限于：基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成的、重组的或其任意组合。

术语“控制序列”在本文被定义为包含对于异源多肽的表达来说必要的或有益的全部组分。每种控制序列可以是编码多肽的核酸序列的天然的或外源的序列。这样的控制序列包括但不限于：前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子以及转录终止信号和翻译终止信号。控制序列可与接头一起提供，为的是引入特异性限制位点从而促进该控制序列与编码异源多肽的核酸序列编码区连接。术语“可操作地连接的”在本文被定义为一种构型，其中，一条控制序列被适当地置于相对于DNA序列的编码序列的位置以致该控制序列指导异源多肽的生产。

控制序列可以是合适的启动子序列、核酸序列(它被表达该核酸序列的丝状真菌细胞识别)。启动子序列包含介导异源多肽的表达的转录控制序列。所述启动子可以是在丝状真菌细胞中显示转录活性的任何核酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，可得自编码该细胞同源的或异源的、胞外或胞内的多肽的基因。

在本发明的方法中，指导核酸构建物的转录的合适启动子实例有得自编码下列酶的基因的启动子：米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根粘菌(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根粘菌脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉乙酰胺酶(amdS)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(美国专利4,288,627),及其突变的、截短的和杂合的启动子。特别优选的启动子是NA2-tpi启动子(一种得自编码黑曲霉中性α淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因的启动子杂合体)、葡糖淀粉酶启动子和TAKA淀粉酶启动子。

所述控制序列还可以是合适的转录终止子序列，即，一种被丝状真菌细胞识别而终止转录的序列。该转录终止子序列被可操作地连接到编码异源多肽的核酸序列的3′端。在所述丝状真菌细胞中起作用的任意终止子都可被应用于本发明。

优选的终止子得自编码下列酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

所述控制序列还可以是合适的前导序列，即mRNA的未翻译区(它对于通过丝状真菌细胞的翻译来说是重要的)。该前导序列被可操作地连接到编码异源多肽的核酸序列的5′端。在丝状真菌细胞中起作用的任何前导序列都可用于本发明。

优选的前导序列得自编码米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因。

所述控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，即一种这样的序列：被可操作地连接到所述核酸序列的3′端，并且当转录时，它被丝状真菌细胞作为一个信号识别而添加聚腺苷残基到转录的mRNA。在丝状真菌细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本发明。

优选的聚腺苷酸化序列得自编码下列酶的基因：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶和黑曲霉α葡糖苷酶。

所述控制序列还可以是信号肽编码区，它编码与所述异源多肽的氨基端连接的氨基酸序列并指导编码多肽进入细胞的分泌途径。所述核酸序列的编码序列的5′端可能本来包含一个(在翻译读框中与编码分泌型多肽的编码区节段自然连接的)信号肽编码区。所述编码序列的5′端也可能包含该编码序列的外源信号肽编码区。如果所述编码序列通常不含信号肽编码区，所述外源信号肽编码区可能是所需的。该外源信号肽编码区也可能仅仅替代天然信号肽编码区以便达到多肽的增强分泌作用。然而，指导表达的异源多肽进入丝状真菌细胞的分泌途径的任何信号肽编码区都可应用于本发明。

对丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是得自下列酶的基因的信号肽编码区：米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米黑根粘菌天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶。

所述控制序列还可能是一个前肽编码区，它编码位于多肽的氨基端的氨基酸序列。生成的多肽被称为“酶原”(proenzyme)或“多肽原”[或在某些情况下被称为“酶原”(zymogen)]。多肽原一般是惰性的，可通过前肽的催化分裂或自动催化分裂而从该多肽原转化为成熟的活性多肽。前肽编码区可得自米黑根粘菌天冬氨酸蛋白酶基因或Myceliophthora thermophila漆酶基因(WO95/33836)。

如果信号肽区和前肽区二者都存在于多肽的氨基端，那么，前肽区位于邻近多肽的氨基端，信号肽区则位于邻近前肽区的氨基端。

所述核酸构建物还可能包括一条或多条核酸序列，该核酸序列编码一个或多个对于指导异源多肽的表达有益的因子，例如，转录激活因子(诸如反式作用因子)、陪伴分子和加工蛋白酶。在丝状真菌细胞中起作用的任意因子都可应用于本发明。编码一个或多个这些因子的核酸不必与编码异源多肽的核酸序列串联。

还可能希望添加调节序列，该调节序列能调节与丝状真菌细胞的生长相关的异源多肽的表达。调节系统的实例有那些，即，它们引起基因的表达响应化学刺激物或物理刺激物(包括调节化合物的存在)而开启或关闭。TAKAα淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可被用作调节序列。调节序列的其它实例有能使基因扩增的那些，例如，用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码异源多肽的核酸序列将可操作地与该调节序列连接。

上述各种核酸序列和控制序列可被连接在一起而产生可能包含一个或多个合适的限制位点的重组表达载体，所述限制位点可供在这样的位点插入或替代编码异源多肽的核酸序列。编码异源多肽的核酸序列也可通过将该序列或包含该序列的核酸构建物插入用于表达的合适载体中来表达。在产生表达载体时，编码序列处于该载体中，于是，该编码序列与用于表达和可能分泌的合适的控制序列可操作地连接。

所述重组表达载体可以是任何载体(例如质粒或病毒)，该载体可以方便地经历DNA重组操作而且能引起编码异源多肽的核酸序列的表达。该载体的选择一般将取决于该载体与该载体被引入的丝状真菌细胞的相容性。该载体可以是线形质粒或闭合环状质粒。该载体可以是自主复制型载体，即，一种作为染色体外的实体存在的载体，它的复制与染色体复制无关，例如质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体。所述载体可包含保障自复制的任意作用剂。该载体也可以是这样的载体：当引入丝状真菌细胞时，它被整合入基因组并与染色体(它已被整合入该染色体)一起被复制。所述载体系统可以是单一的载体或质粒或者是两种或多种载体或质粒(它们共同包含将被引入丝状真菌细胞的基因组的全部DNA)，或者是一种转座子。

所述载体优选包含一种或多种允许容易地选择转化的丝状真菌细胞的选择性标记。一种选择性标记是一种基因，它的产物可提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷体的原养型等。用于丝状真菌宿主细胞中的选择性标记可选自包括但不限于下组的物质：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5 ′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酸转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及得自其它种的等同物。应用于丝状真菌细胞的优选的选择性标记是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

所述载体优选包含这样的因子，即，该因子允许所述载体稳定整合入丝状真菌细胞基因组或所述载体在该细胞中与该细胞的基因组无关的自主复制。

“引入”表示将包含核酸序列的载体引入丝状真菌细胞以致该载体作为染色体整合体或者作为自我复制的染色体外载体保持。通常认为整合是有益的，因为核酸序列更可能被稳定保持在细胞中。载体整合入染色体是通过同源重组、非同源重组或转座发生的。

将表达载体引入丝状真菌细胞可能涉及一种方法，该方法包括：按本来已知的方式的原生质体形成、原生质体的转化以及细胞壁再生。转化曲霉属宿主细胞的合适操作被描述于EP238 023和Yelton等，1984年，美国国家科学院院报(Proceedings of the National Academyof Sciences USA)81:1470～1474。一种转化链孢属的合适方法由Malardier等(1989)描述于：基因(Gene)78:147～156和WO96/00787。

就整合入丝状真菌细胞的基因组来说，所述载体可能依靠编码异源多肽的核酸序列或者该载体的任何其它(通过同源重组或非同源重组将该载体稳定整合入基因组的)因子。该载体也可能包含用于指导通过同源重组整合入丝状真菌细胞基因组的另外的核酸序列。该另外的核酸序列能使载体整合入染色体的准确位置上的基因组。为了增大准确位置上整合的可能性，整合因子应优选包含足够量的核酸，例如100～1,500个碱基对，优选400～1,500个碱基对，最优选800～1,500个碱基对，它们与相应的靶序列是高度同源的，从而提高同源重组的可能性。整合因子可以是与丝状真菌细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合因子还可以是非编码的或编码的核酸序列。另一方面，所述载体可通过非同源重组被整合入细胞的基因组。

就自主复制来说，所述载体可进一步包含一种复制源，它能使该载体在所述丝状真菌细胞中自主复制。

用于连接本文描述的因子而构建重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatus,1989，“分子克隆，实验手册”，第2版，Cold Spring Harbor,New York)。

在本发明的另一方面，所述突变丝状真菌细胞可能另外包含一条或多条第三种核酸序列的修饰，所述核酸序列编码可能对感兴趣的多肽的生产、回收和/或应用有害的蛋白质。所述修饰减少或消除了一条或多条第三种核酸序列的表达，导致这样的突变细胞：当在相同条件下培养时，该突变细胞可能比没有修饰第三种核酸序列的突变细胞生产更多的多肽。

第三种核酸序列可能编码任何蛋白质或酶。例如，该酶可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶溶解酶、过氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。第三种核酸序列优选编码蛋白酶，例如，氨肽酶、羧肽酶或蛋白酶。

本发明还涉及生产突变丝状真菌细胞的方法，该方法包括：

(A)修饰一条或多条亲代丝状真菌细胞的核酸序列，该细胞具有下列序列：

(ⅴ)(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的等位变体；以及

(B)从步骤(A)鉴定包括所述修饰的核酸序列的突变体。

本发明还涉及用于生产多肽的突变丝状真菌细胞，该突变丝状真菌细胞包含编码该多肽的一条第一种核酸序列以及一条或多条下组的第二种核酸序列的修饰：

(a)编码具有一种氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少50％与序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；

(b)具有至少50％与序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性的核酸序列；

(c)一条核酸序列，它在低严格性条件下与如下物质杂交：(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(ⅱ)至少100个核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互补链；

(d)一条编码多肽的变体的核酸序列，所述多肽具有一条序列2或序列5的氨基酸序列，所述变体包括一个或多个氨基酸的替代、缺失和/或插入；

(e)(a)、(b)或(c)的等位变体；以及

(f)(a)、(b)、(c)或(e)的子序列，其中，该子序列编码具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段。

本发明还涉及分离的DDC2和DDC3多肽，及其由本文描述的核酸序列编码的片段、等位变体和变体。所述分离的多肽选自下组物质：

(a)具有一种氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列具有至少50％与序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性；

(b)由一种核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在低严格性条件下与如下物质杂交：(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(ⅱ)至少100个核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的互补链；

(c)具有一条序列2或序列5的氨基酸序列的多肽的变体，它包括一个或多个氨基酸的替代、缺失和/或插入；

(d)(a)或(b)的等位变体；以及

(e)(a)、(b)或(d)的片段，其中，该片段具有DDC2或DDC3多肽活性。

本发明分离的DDC2和DDC3多肽具有至少20％、优选至少40％、更优选至少60％、进一步优选至少80％、更进一步优选至少90％、最优选至少100％序列2或序列5的多肽活性。

DDC2和DDC3多肽可得自真菌源，更优选得自酵母菌株，例如假丝酵母、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或Yarrowia菌株；或者丝状真菌菌株，例如支顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球酵母属、Filibasidium、镰孢属、赤霉属、腐质霉属、Magnaporthe、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、Neocallimastix、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、Piromyces、裂褶菌属、篮霉菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、Tolypocladium或木霉属菌株。

在一个更优选的实施方案中，本发明的DDC2多肽得自米曲霉菌株，最优选得自米曲霉IFO4177或其突变株，例如，具有序列2的氨基酸序列的多肽。

在另一个更优选的实施方案中，本发明的DDC3多肽得自米曲霉菌株，最优选得自米曲霉IFO4177或其突变株，例如，具有序列2的氨基酸序列的多肽。

应懂得，如前所述，对于上述菌种来说，本发明既包括完全阶段，又包括不完全阶段，以及其它分类的等值种(例如无性型)，不管它们的种名是什么。

DDC2和DDC3多肽可应用本文描述的技术分离。本文定义的“分离的”多肽是这样一种多肽：它大致不含其它多肽，例如，通过SDS-PAGE测定，至少约20％纯的，优选至少约40％纯的，更优选约60％纯的，进一步优选约80％纯的，更进一步优选约90％纯的，最优选约95％纯的。

本发明还涉及分离的核酸序列，该核酸序列编码DDC2和DDC3多肽及其片段(如本文所述那样)。

在一个优选的实施方案中，所述核酸序列如序列1所示。在另一个优选的实施方案中，该核酸序列是含于粘粒18H7(它含于大肠埃希氏菌DSM12060中)中的序列。在又一个优选的实施方案中，该核酸序列是序列1的多肽编码区。在又一个优选的实施方案中，该核酸序列是含于粘粒18H7(它含于大肠埃希氏菌DSM12060中)中的多肽编码区。

在另一个优选的实施方案中，所述核酸序列如序列4所示。在又一个优选的实施方案中，该核酸序列是序列4的多肽编码区。在又一个优选的实施方案中，该核酸序列是含于粘粒34G12(它含于大肠埃希氏菌DSM11924中)中的序列。在又一个优选的实施方案中，该核酸序列是含于粘粒34G12(它含于大肠埃希氏菌DSM11924中)中的多肽编码区。

本发明还涉及分离的突变核酸序列，它包括在序列1或序列4的多肽编码序列中至少一次突变，其中，该突变核酸序列编码分别由序列2或序列5构成的多肽。

用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的技术是本领域已知的并且在本文被描述了。

本文应用的术语“分离的核酸序列”表示这样的核酸序列：它大致不含其它核酸序列，例如，通过琼脂糖电泳测定，至少约20％纯的，优选至少约40％纯的，更优选至少约60％纯的，进一步优选至少约80％纯的，最优选至少约90％纯的。例如，分离的核酸序列可通过标准克隆方法获得，标准克隆方法在遗传工程中被用于将核酸序列从它的自然位置再定位到它将被再生产的位点。克隆方法可能包括：所需的核酸片段(它包含编码多肽的核酸序列)的切除和分离，将该片段插入载体分子，以及将重组载体结合入宿主细胞(将在这里复制所述核酸序列的许多拷贝或克隆)。所述核酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成源的或其任意组合。

编码本发明的DDC2或DDC3多肽的核酸序列的修饰对于大致与DDC2或DDC3多肽类似的多肽的合成来说可能是必要的。关于DDC2或DDC3多肽的术语“大致类似的”表示所述多肽的非天然形式。这些多肽在某些工程化方式中与从它的天然源分离的DDC2或DDC3多肽不同，例如，在比活性、热稳定性、最佳pH等方面不同的变体。变异的多肽可按前文描述的那样构建。

本发明还涉及通过如下方法生产的、分离的核酸序列，即，(a)在很低严格性、低严格性、中度严格性、中-高严格性、高严格性、很高严格性的条件下将一种DNA与下列物质杂交：(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151,(ⅱ)(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互补链；或者与下列物质杂交：(ⅰ)序列4的核苷酸1041～1229,(ⅱ)(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互补链；以及(b)将核酸序列与所述DNA分离。所述子序列优选是至少100个核苷酸的序列，例如，编码具有DDC2或DDC3多肽活性的多肽片段的序列。

本发明进一步涉及生产突变核酸序列的方法，该方法包括：在序列1或序列4的多肽编码序列或其子序列中引入至少一个突变，其中，所述突变核酸序列编码分别由序列2或序列5构成的多肽，或其具有DDC2或DDC3多肽活性的片段。

在核酸序列中引入突变而将一种核苷酸换成另一种核苷酸可应用本领域已知的任意方法通过定点诱变来进行。特别适用的是这种方法：它应用具有感兴趣的插入片段的超螺旋的、双链DNA载体和两种包含所需突变的合成引物。该寡核苷酸引物(各自与载体的相反链互补)在温度循环过程中通过pfu DNA聚合酶伸展。在掺入所述引物时，产生了包含交错切口的突变质粒。在温度循环后，用DpnI(它是甲基化和半甲基化DNA特异性的)处理产物而消化亲代DNA模板并选择用于含突变的合成的DNA。还可应用本领域已知的其它方法。

本发明还涉及核酸构建物、用于序列的表达的重组表达载体和宿主细胞，它们包含如本文所述的序列1或序列4的核酸序列，其子序列或同源物。所述构建物和载体可按本文描述的方法构建。所述宿主细胞可以是适合核酸序列的表达的任意细胞，优选是真菌细胞，更优选是选自本文描述的组的丝状真菌细胞。术语“宿主细胞”包括亲代细胞的任意子代，它与亲代细胞不相同，这是由于复制过程中出现的突变。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码多肽的基因及其来源。

本发明还涉及生产DDC2或DDC3多肽的方法，该方法包括：(a)在有助于生产DDC2或DDC3多肽的条件下培养一种菌株(它的野生型能生产该多肽)；以及(b)从培养基回收该多肽。优选地，所述菌株是曲霉属，更优选是米曲霉的菌株。

本发明还涉及生产本发明的DDC2或DDC3多肽的方法，该方法包括：(a)在有助于生产DDC2或DDC3多肽的条件下培养一种宿主细胞；以及(b)从培养基回收该DDC2或DDC3多肽。

在本发明的生产方法中，应用如本文所述的、本领域已知的方法在适合生产DDC2或DDC3多肽的营养培养基中培养细胞。生成的DDC2或DDC3多肽可通过如本文所述的、本领域已知的方法回收和纯化。信号肽

本发明还涉及包含编码一种蛋白质的基因的核酸构建物，所述蛋白质与一种核酸序列可操作地连接，该核酸序列由编码由序列2的氨基酸1～18构成的信号肽的序列1的核苷酸960～1013构成或者由编码由序列5的氨基酸1～20构成的信号肽的序列4的核苷酸981～1040构成，其中，所述基因对所述核酸序列而言是外源的。

本发明还涉及包含这样的核酸构建物的重组表达载体和重组宿主细胞。

本发明还涉及生产蛋白质的方法，该方法包括：(a)在适合生产该蛋白质的条件下培养这种重组宿主细胞；以及(b)回收该蛋白质。

所述核酸序列可被可操作地与其它控制序列一起与外源基因连接。这样的其它控制序列在上文被描述了。

所述蛋白质可能是宿主细胞的天然的或异源的蛋白质。术语“蛋白质”在本文并不意味着表示特定长度的编码产物，所以，它包括肽、寡肽和蛋白质。术语“蛋白质”还包括合并而形成编码产品的两个或多个多肽。该蛋白质还包括杂合多肽，该杂合多肽包括得自至少两种不同蛋白质(其中，一种或多种可能是所述宿主细胞异源的或天然的蛋白质)的部分的或完全的多肽序列的组合。蛋白质进一步包括上述蛋白质和杂合蛋白质的天然等位变异和人工改造变异。

优选地，该蛋白质是激素、激素变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或者报道分子。在更优选的实施方案中，该蛋白质是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在进一步优选的实施方案中，该蛋白质是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶溶解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

所述基因可得自任何原核生物源、真核生物源或其它源。

通过如下实施例(不能将它们认作限制本发明的范围)进一步描述了本发明。实施例原料

用作缓冲剂和底物的化学药品都是至少试剂级的商品。实施例1：通过米曲霉菌株HC4.01和27生产CAREZYME^TM

按WO91/17243中描述的那样构建了生产胞外β-1,4-内切葡聚糖酶(CAREZYME^TM)的米曲霉菌株。CAREZYME^TM是由Novo NordiskA/S,Bagsvd,Denmark生产的Trichoderma harzianum纤维素酶。选择米曲霉A1560-T40中的pSX320的转化体no.27(WO91/17243)用于诱变以便生产优异的菌株。通过NTG诱变处理转化体No.27，分离具有改变了的平板形态学的菌株。在摇瓶发酵和罐发酵中显示这些被称为HC4.01的菌株之一的CAREZYME^TM产率增大了。在试图进一步表征米曲霉菌株HC4.01和no.27之间的差异时，通过示差显示法(differential display method)比较了得自这两种菌株的mRNA制品。

在34℃、pH7、800～1100rpm的2升补料分批发酵物中并排生长米曲霉菌株HC4.01和27达5天，所述发酵物由Nutriose、酵母抽提物、MgSO₄·7H₂O、柠檬酸、K₂SO₄、KH₂PO₄、脲、三甲基甘氨酸和痕量金属溶液组成。

以pH7时1％CMC溶液的粘度变化(减小)测定了CAREZYME^TM活性(与得自Novo Nordisk A/S,Bagsvd,Denmark的纯化CAREZYME^TM标准物比较)。

在48小时，通过这两种菌株生产的CAREZYME^TM水平开始不同了。

实施例2：示差显示

通过示差mRNA显示分析了米曲霉菌株HC4.01和27的表型差异的遗传基础。在这些试验中应用的引物列于表1中。这些引物在5′端含4个核苷酸，接着是HindⅢ限制酶位点。应用oligo(dT₁₂N₂)这组引物，所述两种细胞系的mRNA群在48小时分裂成12个亚群并且生产了cDNA。然后应用同样的那组oligo(dT₁₂N₂)引物和一组随机引物通过PCR扩增进一步分裂了该cDNA。再通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离得自这些反应的扩增子。通过泳道之一中条带的缺乏(当并排比较足迹时)鉴定了这两种细胞系之间示差表达的基因。

按Wahleithner等(1996)在现代遗传学(CurrentGenetics)29:395～403中描述的方法在48小时从每种细胞系的冷冻菌丝体制备了RNA。应用MessageClean Kit(GenHunterCorp.,Nashville,TN)按生产商的指示通过DNA酶处理除去了基因组DNA片段。

对于每种锚式dT₁₂N₂引物，在两个独立的反应中，将3.75μg得自米曲霉菌株HC4.01和27的总RNA与下列物质混合：1.0μM引物、15μl5x第一链合成缓冲剂(Life Technologies,Gaithersburg,MD)、10μM二硫苏糖醇和20μM dNTP(总体积为75μl)。在65℃下将该溶液保温5分钟，在冰上快速冷却，添加500单位SuperScriptⅡ^TM逆转录酶(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)。在37℃下保温1小时后，通过在95℃下热处理5分钟停止反应，在-20℃贮存第一链样品。表1.用于示差显示反应的引物oligo(dT₁₂N₂)引物：A GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTCT(序列7)B GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTCC(序列8)C GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTCG(序列9)D GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTGT(序列10)E GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTGG(序列11)F GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTGA(序列12)G GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTAT(序列13)H GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTAC(序列14)I GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTAG(序列15)K GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTAA(序列16)L GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTCA(序列17)M GCGCAAGCTTTTTTTTTTTTGC(序列18)随机引物：01 CGGGAAGCTTATCGACTCCAAG(序列19)02 CGGGAAGCTTTAGCTAGCATGG(序列20)03 CGGGAAGCTTGCTAAGACTAGC(序列21)04 CGGGAAGCTTTGCAGTGTGTGA(序列22)05 CGGGAAGCTTGTGACCATTGCA(序列23)06 CGGGAAGCTTGTCTGCTAGGTA(序列24)07 CGGGAAGCTTGCATGGTAGTCT(序列25)08 CGGGAAGCTTGTGTTGCACCAT(序列26)09 CGGGAAGCTTAGACGCTAGTGT(序列27)10 CGGGAAGCTTTAGCTAGCAGAC(序列28)11 CGGGAAGCTTCATGATGCTACC(序列29)12 CGGGAAGCTTACTCCATGACTC(序列30)13 CGGGAAGCTTATTACAACGAGG(序列31)14 CGGGAAGCTTATTGGATTGGTC(序列32)15 CGGGAAGCTTATCTTTCTACCC(序列33)16 CGGGAAGCTTATTTTTGGCTCC(序列34)17 CGGGAAGCTTATCGATACAGG(序列35)18 CGGGAAGCTTTATGGTAAAGGG(序列36)19 CGGGAAGCTTTATCGGTCATAG(序列37)20 CGGGAAGCTTTAGGTACTAAGG(序列38)

应用每个引物对(240个不同的引物对)关于对比RNAs和突变RNAs一式三份引起了PCR扩增反应。扩增物由下列物质组成：1.0μl cDNA反应物，2.0μl 10x PCR缓冲剂[500mM KCl；100mM Tris-HCl(pH9.0)；15mM MgCl₂；1％(w/v)明胶；1％(v/v)Triton X-100],1.5μl 25mM dNTP,2.5μl 10mM 5′任意引物，1.25μl 1OmM富含T的引物，0.15μl³²P-dATP(2000 Ci/mM,New England Nuclear-DuPont,Boston,MA)，以及2.5单位Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Corp.,Brahchburg,NJ)，用H₂O调节体积至20μl。应用热循环仪按下列程序进行了反应：98℃一次循环10秒；四次循环，每次在94℃30秒、42℃60秒和72℃30秒；以及25次循环，每次在94℃30秒、60℃60秒和72℃30秒。

将3.5μl各PCR反应的等分液在甲酰胺测序染料溶液中变性，在6％聚丙烯酰胺、7M脲测序凝胶上分离。呈相邻的行(为了比较条带带型)电泳处理三份对比PCR反应物和得自一个引物对的突变PCR反应物。在Whatman 3M纸上干燥凝胶，用荧光规尺带(fluorescent rulertape)对取向进行标记，暴露于一张医用X光片一夜。将示差显示反应的未利用部分在-20℃下冷冻用于片段筛选。

应用所述荧光规尺的痕迹校准所述胶片和凝胶。标记示差显示的条带并用解剖刀从凝胶切除。将该凝胶切片(包括Whatman滤纸)在室温下浸泡10分钟，然后在1.5ml Eppendorf微量离心管内在95℃的0.1ml水中保温15分钟。应用10μl 3M乙酸钠、5μl 10mg/ml糖原和0.45μl 100％乙醇的溶液沉淀洗脱的DNA。将该DNA片重悬浮于10μl水中，应用初始用于扩增的相同引物对和在上述相同的条件下(但应用60℃退火温度)重扩增40轮PCR。

将PCR扩增的条带连接入pCR2.1(Invitrogen,La Jolla,CA)，该pCR 2.1已按Hadjeb和Berkowitz(1996)在生物技术(Biotechniques)20:20～22中描述的方案用EcoRV线性化并TA-加尾。将连接物转化入感受态大肠埃希氏菌DH5α细胞，通过包含X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的琼脂糖板上蓝色/白色选择来筛选生成的集落。对于每种示差显示的片段，挑选六个集落供进一步分析。实施例3：示差显示的片段的筛选

使实施例2中描述的六组集落的每一组在补加了100μg氨苄西林/ml的3ml Luria培养液(1％胰酶解胨-0.5％酵母抽提物-0.5％氯化钠)中生长。通过离心收集细胞。将细胞片重悬浮于0.3ml含l00μg RNA酶A/ml的10mM EDTA-50mM Tris-HCl缓冲剂(pH8.0)中，通过接着添加0.3ml 1％ SDS-200mM NaOH溶解。在室温下保温5分钟后，添加0.3ml 2.0M乙酸钾(pH5.5)。通过在15,0000xg(4℃)下离心10分钟澄清溶胞产物。将上清液转至微量离心管，然后添加0.7ml异丙醇使DNA沉淀。通过在15,000xg(4℃)下离心15分钟收集该DNA。将离心片重悬浮于0.1ml的1mM EDTA-10mM Tris-HCl(pH8.0)中，在-20℃下贮存样品。

初步筛选克隆片段用于通过再杂交返回它们的起始PCR反应(在-20℃下贮存的所述反应物的未利用部分)的示差表达。用H₂O以1∶20稀释从每个集落制备的DNA，然后应用狭线印迹装置涂到双层尼龙膜上。每个双层膜携带得自应用四种独立的引物对鉴定的那些片段的克隆(即，从包含得自oligo E以及引物01、03、06和08的扩增子的泳道切除的片段)。在80℃的真空干燥箱中将膜烘1～2小时，然后在高严格性条件(50％甲酰胺，6xSSC,42℃)下杂交。用于一个滤器的杂交探针包含变性的产物，该产物得自应用来自突变株的cDNA和四种相应于被筛选的集落的引物对扩增的三重反应；就另一个滤器来说，cDNA是从对比菌株合成的。如果集落得自应用oligo D与引物01、03、06和08以及米曲霉HC4.01 cDNA生产的片段，就将那些PCR反应物加到杂交混合物中。在65℃下的0.5xSSC、0.1％SDS中将膜洗涤一次(达15分钟)，在Phosphor Imager(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)上分析。如果片段是从米曲霉HC4.01 cDNA而不是米曲霉27 cDNA扩增的，就只将克隆杂交返回米曲霉HC4.01 PCR反应。将符合原始示差显示、只与所述两种探针之一杂交的克隆贮存，它们的插入片段被用作Northern分析中的探针。

RNA印迹分析是按Maniatis等(1982，“分子克隆，实验手册”，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,New York)关于甲醛凝胶电泳的方法进行的。将包含分别得自米曲霉菌株27和HC4.01的总RNA的滤器在高严格性条件(50％甲酰胺，6xSSC,42℃)下与放射性标记的琼脂糖凝胶纯化的DNA杂交，该DNA得自那些在初步狭线印迹筛选后呈阳性的克隆。该DNA是应用α[32P]dCTP(Amersham,Arlington Heights,IL)通过切口平移(Maniatis，上文)放射性标记的，并且以大约1×10⁶cpm/ml缓冲剂的活度被加到杂交缓冲剂中。

两种不同的插入片段显示示差杂交，其中，它们与米曲霉27 RNA而不与米曲霉HC4.01 RNA杂交。这些质粒被称为pToC367(插入片段被称为DDC2)和pToC370(插入片段被称为DDC3)。实施例4：DDC2和DDC3的cDNA克隆的分离和表征

在ABI自动DNA测序仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)上按生产商的指示对得自pToC367的DDC2插入片段(大约250bp)测序而获得一部分cDNA序列，它包含一段腺苷残基(即，位于一端的所谓的“polyA尾”，指示该基因的转录方向)。

按下列方案合成了双链cDNA。为了产生第一链cDNA，在1.0μg得自米曲霉27(第2天)的总的RNA中添加总体积为5μl的1mMCapSwitch^TM寡核苷酸(Clontech,Palo Alto,CA)和1mM(CDS/3′PCR引物[Oligo(dT)₃₀N₁N，而且N₁=A、C或G](Clontech,Palo Alto,CA),在72℃下保温2分钟，然后在冰上急冷2分钟。在微型离心机(microfuge)中将反应物离心30秒，然后添加下列物质：2.0μl 5x第一链合成缓冲转录酶(Life Technologies,Gaithersburg,MD),1.0μl 20mM二硫苏糖醇，1.0μl 10mM dNTP和200单位SuperScript^TMⅡ逆转录酶(Life Technologies,Gaithersburg,MD)。在42℃下保温1小时后，在-20℃下贮存该cDNA。第二链cDNA是通过PCR扩增制备的，其中，将2μl第一链反应物与下列物质混合：10μl 10x PCR缓冲剂，2μl 10mM dNTP,2μl 5′PCR引物，2μl CDS/3′PCR引物和2μl 50x Advantage KlenTaq聚合酶混合物(Clontech,PaloAlto,CA)。在热循环仪中按下列程序进行了扩增：95℃一次循环1分钟；20次循环，每次在95℃15秒和68℃5分钟。

基于得自pToC367的插入片段的序列信息，合成了一种DDC2特异性的寡核苷酸用于分离cDNA克隆。所述引物以与基因的转录相反的方向取向。该引物具有下列序列：26186:CATCTCATTATCAGCCATTCC(序列39)

基于得自pToC370的插入片段的序列信息，合成了一种DDC3特异性的寡核苷酸用于分离cDNA克隆。所述引物以与基因的转录相反的方向取向。该引物具有下列序列：26183:CCCAACATACCCGGAAATCG(序列40)26184:GCGGGTGGTTCGGGAACACC(序列41)

用引物26186(DDC2)和得自CAP Finder Kit(Clontech,PaloAlto,CA)的5′引物对米曲霉no.27 cDNA进行了PCR反应。操作了三十个PCR循环(退火温度为60℃)。5′引物是CAP Finder Kit的一部分，它将与该试剂盒产生的cDNA的5′端杂交。获得了大约400bp的片段。

为了获得DDC3 PCR产物，进行了嵌套式聚合酶链反应。用引物26183和得自CAP Finder Kit(Clontech,Palo Alto,CA)的5′引物操作了第一个PCR反应达30个循环(退火温度为60℃)。5′引物是Clontech CAP Finder Kit的一部分，它将与该试剂盒产生的cDNA的5′端杂交。将一份该PCR反应的等分样用作与引物26184和5′CAPFinder引物的新反应的模板。再次操作该反应达30个循环(退火温度为60℃)。在第二个PCR反应中，获得了大约400bp的片段。

将这些片段独自地克隆入pCRⅡ载体(Invitrogen,San Diego CA)并在ABI自动DNA测序仪上按生产商的指示测序。获得的DDC2全长cDNA序列和推断的氨基酸序列分别示于序列3和序列2。获得的DDC3全长cDNA序列和推断的氨基酸序列分别示于序列6和序列5。

通过Testcode和Codonpreference(Genetics ComputerGroup,Inc.,Madison,WI)的编码区计算机分析和对DDC2的cDNA的翻译启示了编码64个氨基酸的多肽(序列2)的可读框以及对DDC3的cDNA的翻译启示了编码83个氨基酸的多肽(序列5)的可读框。程序Sigcleave(Genetics Computer Group,Inc.,Madison,WI)预示了关于DCC2多肽存在18个氨基酸的分泌信号和关于DCC3多肽存在20个氨基酸的分泌信号，这启示所述多肽被分泌了。

DDC3多肽包含三次重复的18个氨基酸的如下序列：DDGAIRIPVKGVPEPEKR(序列5)。第三次重复表明在C端的偏差，其中，该重复中的最后两个氨基酸是Lys和Arg。已知该二碱基位点(dibasicsite)是酵母和真菌中分泌性蛋白质的成熟中涉及的kex2蛋白酶的分裂位点。基因结构启示，DDC3编码一种蛋白质，该蛋白质被分泌和被加工成可能3个小的肽。DDC3的基因结构类似酿酒酵母的α因子基因(Kurjan等，1982，细胞(Cell)30:933～943)的结构。

将DDC2和DDC3多肽的推断的氨基酸序列(分别为序列2和5)通过各种检索规则系统(search algorithms)与Genebank中的序列作了比较，所述检索规则系统例如：Fasta(Lipman和Pearson,1988，美国国家科学院院报，85:2444)和Blast(Altschul等，1990，分子生物学杂志215:403)。未发现同源物。实施例5:DDC2和DDC3基因组克隆的分离

应用α[32P]dCTP(Amersham,Arlington Heights,IL)通过切口平移(Sambrook等，上文)放射性标记DDC2的cDNA克隆，以大约1×10⁶cpm/ml缓冲剂的活度加到杂交缓冲剂中，用作对米曲霉IFO4177的粘粒文库的探针。该粘粒文库是应用SuperCosl Cosmid VectorKit(Stratagene,La Jolla,CA)按生产商的指示构建的。

通过标准方法(Christensen等，1988，生物工程(Biotechnology)6:1419～1422)从原生质体制备了米曲霉IFO4177的基因组DNA。将该原生质体分离后，通过在LabofugeT(Heto,Denmark)中、在2500rpm下离心5分钟使它们成片状。然后将离心片悬浮于10mM NaCl,20mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA,100μg/ml蛋白酶K和0.5％SDS(如SuperCosl Kit的说明书中所述)。按该试剂盒所附的生产商指示进行该DNA制备的其余步骤。应用CHEF-凝胶装置(BioRad Laboratories,Hercules,CA)通过电泳分析该基因组DNA的尺寸。在200伏时以10～50秒的脉冲走1％琼脂糖凝胶达20小时。用溴化乙锭将该凝胶染色并照相。发现该DNA尺寸从约50到大于100kb。用Sau3A部分地消化该DNA。通过上述相同类型的CHEF-凝胶分析法测定获得的消化DNA的尺寸是20～50kb。按生产商的指示制备了CsCl梯度带状SuperCosl粘粒。按生产商的指示同样进行了连接和包装。在该文库的滴定后，将得自一次连接和包装的全部包装混合物转染入大肠埃希氏菌XL1-Blue MR(Stratagene,La Jolla,CA)并铺在补加了50μg氨苄西林/ml的LB板上。获得了大约3800个集落。

得自十个集落的粘粒制品表明全部具有预期尺寸的插入片段。逐个挑选这些集落，接种入含有100μl补加了100μg氨苄西林/ml的Luria Broth培养基的微量滴定板孔中，在37℃下培养一夜。往每孔中添加100μl 50％甘油，在-80℃下冷冻全部文库。贮存了共3822个集落。这表示大约4.4倍扩增米曲霉基因组。

将全部文库以高密度点到尼龙膜(GenomeSystems,Inc.,St.Louis,MO)上。在高严格性条件(2×SSC,65℃)下将³²P标记的DDC2 cDNA与粘粒18H7杂交。在高严格性条件(2×SSC,65℃)下将³²P标记的DDC3 cDNA杂交并且粘粒34G12显示强杂交信号。

从粘粒18H7制备了质粒DNA，在ABI自动DNA测序仪上应用下列引物(这两种引物都含于cDNA序列中)按生产商的指示测序：30982:TGCAGATCTCCTGGTTTGCC(序列42)30983:CTCCCTAAGGAATGCAAATGG(序列43)

还从粘粒34G12制备了质粒DNA，在ABI自动DNA测序仪上应用从cDNA序列制备的下列引物按生产商的指示测序： 30984:CCATGAAGCTCTTCTCTACC(序列44)30985:CTATTTCTCAGCGGGTGGTTCG(序列45)合成了新引物以便获得进一步的上游和下游序列。

关于DDC2和DCC3的生成的基因组核酸序列和推断的氨基酸序列分别示于图1(分别为序列1和2)和图2(分别为序列4和5)。实施例6：关于DDC2的缺失质粒的构建

为米曲霉中DDC2基因的缺失设计的质粒是这样构建的：通过将起始密码子的上游的1kb序列和终止密码子的下游的1kb序列克隆入通过米曲霉pyrG基因分开的载体。

应用粘粒18H7为模板利用下列引物通过PCR获得了5′片段：102012:GAAGATCTTGGGGGCAGTCAGTGACGGG(序列46)102013:TCCCCCGGGTATGATTTGATTAGGATG(序列47)

应用粘粒18H7为模板利用下列引物在上述相同的条件下通过PCR获得了3′片段：102014:TCCCCCGGGAGTGTTATTAATAAGGAGG(序列48)102015:TGCACTGCAGGTATCTGTATCCCAGTCAGC(序列49)

用限制酶SmaⅠ和BglⅡ切割5′PCR片段，再从琼脂糖凝胶纯化切割的片段。用SmaⅠ和PstⅠ切割3′PCR片段，再从琼脂糖凝胶纯化限制酶切片段。将该5′片段和3′片段克隆入用BglⅡ和PstⅠ限制酶切的pICl9H(Marsh等，1984，基因32:481～485)。用SmaⅠ切割生成的质粒，再用碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)去磷酸化。将包含米曲霉pyrG基因的3.5kb HindⅢ片段与pJaL335(PCT/DK 96/00528)分离，通过与DNA聚合酶的Klenow片段(Promega,Madison,WI)和dNTP保温变成平端。将这两个片段连接而生成如图3所示的质粒pToC391。pToC391可被PvuⅠ线性化后用于转化米曲霉pyrG^-菌株而生产转化体(其中，DDC2基因被pyrG基因替代了)。这样的DDC2突变株可以例如通过Southern分析或者通过PCR法发现。该DDC2突变株可用作任何异源蛋白的表达宿主。这样分离的DDC2突变株可通过选择对氟乳清酸(fluororonic acid)的抗性而变成pyrG^-(是由于在pJaL335上的400bp重复侧翼pyrG基因)。实施例7：关于DDC3的缺失质粒的构建

为米曲霉中DDC3的缺失设计的质粒是这样构建的：将起始密码子上游的大约1kb的序列和终止密码子下游的大约1kb的序列克隆入载体(其中，两个插入片段被米曲霉pyrG基因分开了)。

粘粒34G12不含能构建缺失质粒的足够的上游序列。为了克隆更多的上游序列，应用了反向聚合酶链反应。用³²P标记的DDC3探针对得自米曲霉IFO4177(米曲霉A1560-T40的亲代菌株)的基因组DNA的Southern分析揭示了大约2.5kb NsiⅠ片段。用NsiⅠ消化基因组DNA，连接，然后用作应用下列引物的反向聚合酶链反应的模板：30985:CTATTTCTCAGCGGGTGGTTCG(序列45)101449:CTCTATGTAACCAACTCCTGC(序列50)

获得了预期尺寸(2.3kb)的片段，将它克隆入载体pCRⅡ(Invitrogen,San Diego CA)。在ABI自动DNA测序仪上对该片段测序。

序列信息被用于设计构建所述缺失质粒的引物。用于获得5′片段的引物如下：116497:CGAAAGCTTACTCTCTGGAACAGG(序列51)118141:CATGGAGCTCGATGGCCAAATGACTGATTCC(序列52)用于获得3′片段的引物如下：116494:GACACTCGAGTAAGATATGCTGCAGAC(序列53)116495:CATAAGCTTTCGAGTGATAATGTCTTGG(序列54)

应用IFO4177基因组DNA(作为模板)和引物对116497/118141或者引物对116494/116495进行了两个PCR反应。用限制酶SacⅠ和HindⅢ切割5′片段，用限制酶HindⅢ和XhoⅠ切割3′片段，从琼脂糖凝胶纯化这两个切割片段。将该片段克隆入用SacⅠ和XhoⅠ限制酶切的载体pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA)。用HindⅢ切割生成的质粒，再用碱性磷酸酶(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)去磷酸化，然后与得自包含pyrG基因的pJaL335(PCT/DK 96/00528)的3.5kb HindⅢ片段连接。这两个片段连接而生成质粒pToC401(如图4所示)。PToC401可被SacⅠ线性化而用于转化米曲霉(pyrG^-)菌株而生产转化体(其中，DDC3基因被pyrG基因替代了)。这样的突变株可以例如通过Southern分析或者通过PCR法发现。该DDC3突变株可用作任何异源蛋白的表达宿主。通过该方法分离的DDC3突变菌株可通过选择对氟乳清酸的抗性而轻易变成pyrG^-(是由于在pJaL335上的400bp重复侧翼pyrG基因)。

生物材料的保藏

下列生物材料已按布达佩斯条约的条款保藏在德意志微生物保藏中心，Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig,Germany，被给予如下登记号：保藏物登记号保藏日期大肠埃希氏菌DH5α+粘粒18H7 DSM12060 1998年3月3日大肠埃希氏菌DH5α+粘粒34G12 DSM11924 1998年1月19日

该菌株已保藏，但必须确保在该专利申请未定期间由专利和商标局官员(他按37C.F.R.ξ1.14和35 U.S.C.ξ122有资格)确定的人能获得该培养物。该保藏物是该保藏菌株的基本上纯的培养物。当外国专利法(在其中该主题申请或其子申请的对应申请被提交的国家)要求时，可获得该保藏物。但应理解，可以获得一个保藏物并不构成对实施该主题发明的许可而废除政府行为授的的专利权。

本文描述的和要求保护的本发明不限于本文公开的具体实施方案的范围，因为这些实施方案是作为对本发明数个方面的阐述。任何相当的实施方案都应属于本发明的范围。实际上，从前面描述可知，除了本文示出的和描述的之外对本发明的各种修改对本领域技术人员而言都是显而易见的。这样的修改也应属于附后的权利要求书的范围。在冲突的情况下，本公开包括的定义将起支配作用。

本文引用了各种参考文献，它们以其整个公开内容并入本文作参考。

序列表

<110>Jill Wahleithner

Tove Christensen

<120>在丝状真菌突变细胞中生产多肽的方法

<130>5187.404-WO

<140>To Be Assigned

<141>1999-05-14

<160>54

<170>FastSEQ for Windows Version 3.0

<210>l

<211>2011

<212>DNA

<213>米曲霉

<220>

<223>n=a,c,g，或t

<400>1atgttcggaa atggtagttg ggggcagtca gtgacggggc aacggcgaga agaggtggca 60gaaataaacg gagacatgat atcgacgaag caaagctttc ttatagtcat tgtagattca 120tggcagttga agtagaaccc gatcttttaa gactgcatac ctgcgataat cacgaccaaa 180atataagaga tcatggagcg gaagataaat gggtaggaag atagctgcag cgcacattat 240cacaggtgaa caaatcctgg cagaaggttc aatcctccac ttcaattcct aggtgtttgc 300acatggcgtc caatcctgtt tgtgattggc atagttggag gtgtctcagc ccatatccaa 360taatcgaatg gggcttacgc aagcttctca ttgtcgagta acacagaagg atatccttgg 420ttgaaatttg gccctgtacg acaagccttt gaagcgtaag cctaaattga ggtcgagatc 480aaccctaata aacccttcgg agcttaccca accactcaag ctgatcacac ggggatcaaa 540gatagtaacg tgtgatacaa catagctact cagaagcttg gtcgaagagg taattgaggc 600aattggacac aggccatcgg ggcaaggtta ctccagggaa aagttgacat ggctgcctag 660agcactaccg ggcgtgcgga gaaagaatgg gaaacggagg aaaaacaaca aagactgaca 720gtgaaattca gggtccaggg gaaagggaat ggttgaagtc atcagtgagt gcataaatac 780tcctcgtctt cccctctcct gctggtcaca caggagaatc atcagtcccc atccctcatt 840tttatcttca ggctcgtcca catcttcatt tcctatctct accatcgttt caactatcaa 900cgcgaaggcc ttctctattc tgaacatcct aatcaaatca tacccaacct tcattaaaca 960tgcagatctc ctggtttgcc gtcatggcag ttctgttcac tgccgtcgca gccaaatcga 1020gcgcaaccac tacgactagt gctgctacta cttcggccaa agaaagctct acttcggctt 1080ctactaagcc aactaagaat gcagctgctg gaaatgccct gaacaatcca tttgcattcc 1140ttagggagtt gtaagatgat ctggtcaggt acgtcaaagg tcgatatggc ttgactgtac 1200caaggccact gacattccta gagtacaacg aggcattgat gacaaggagt gttattaata 1260aggaggaaga agaggggaat ggctgataat gagatgaggg acagcccact gttccaatac 1320cctggatctg gcataccctg atcgtttccc agatcccagt atttcaggca gggcgaggct 1380tgtcagatga cggggcaatg cctttctttg gactcgagta atgtattgta cggaggaagg 1440ggtagtccag ttaatcttca gttttgcttt tcctatgaac attgtcagtg tgattgtagt 1500ctaagcctan aagccatggc cttccttgta acgatctgat gcggcatgtt ataatacttt 1560ctcttgcttg gtgatccact cttcttgtcc attggggata tccnnttgcc tttttgagct 1620cacgggacat accgtccgga tcatggtagt attcaggcgt tggtactgag agaaggtcca 1680agaatcaaga gacgagaatt cagttgtaga agtgtcacaa agaggctgaa atcccgactt 1740aacaatacaa agatggcaag agagacaaag atgaacgtcc agtacaaggg atccaacaat 1800cctacagaca tcctcccact ttcacataca agtcaactgc tctttaatga accacatcta 1860agcatacaat ggagcagaag aaacaattaa caagaccaac aaagtccact taacaatcag 1920aatagatcaa gaaggcgata ctanaaccaa gataaatata aaatagaaac tccttaatac 1980ccgaaaagat aaataatcaa tgtgcaggcc t 2011

<210>2

<211>64

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<213>米曲霉

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<213>米曲霉

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<213>米曲霉

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Claims

1．一种生产多肽的方法，它包括：

(ⅲ)一条核酸序列，它在低严格性条件下与如下物质杂交：(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100个核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(ⅰ)或(ⅱ)的互补链；

(ⅴ)(ⅰ)、(ⅱ)或(ⅲ)的等位变体；以及

(B)从所述突变细胞的培养基回收所述多肽。

2．权利要求1的方法，其中，所述第一种核酸序列编码真菌细胞的天然多肽。

3．权利要求1的方法，其中，所述第一种核酸序列编码真菌细胞的异源多肽。

4．权利要求1～3任一项的方法，其中，所述多肽是激素、激素变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分或者报道分子。

5．权利要求4的方法，其中，所述酶是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。

6．权利要求5的方法，其中，所述酶是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶溶解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。

7．权利要求1～6任一项的方法，其中，所述丝状真菌细胞是支顶孢属、曲霉属、短梗霉属、隐球酵母属、Filibasidium、镰孢属、赤霉属、腐质霉属、Magnaporthe、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、Neocallimastix、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、Piromyces、裂褶菌属、篮霉菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、Tolypocladium或木霉属细胞。

8．权利要求7的方法，其中，所述丝状真菌细胞是曲霉属细胞。

9．权利要求8的方法，其中，所述曲霉属细胞是米曲霉细胞。

10．权利要求8的方法，其中，所述曲霉属细胞是黑曲霉细胞。

11．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列是编码具有一种氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少50％与序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。

12．权利要求11的方法，其中，所述第二种核酸序列是编码具有一种氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少60％与序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。

13．权利要求12的方法，其中，所述第二种核酸序列是编码具有一种氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少70％与序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。

14．权利要求13的方法，其中，所述第二种核酸序列是编码具有一种氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少80％与序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。

15．权利要求14的方法，其中，所述第二种核酸序列是编码具有一种氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少90％与序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。

16．权利要求15的方法，其中，所述第二种核酸序列是编码具有一种氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列具有至少95％与序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。

17．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列编码包含序列2或序列5的氨基酸序列的多肽。

18．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽由序列2或序列5的氨基酸序列；或其具有DDC2或DDC3多肽活性的片段构成。

19．权利要求18的方法，其中，所述第二种核酸序列编码由序列2或序列5的氨基酸序列构成的多肽。

20．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列编码一种多肽，该多肽由序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83构成。

21．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它具有至少50％与序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。

22．权利要求21的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它具有至少60％与序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。

23．权利要求22的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它具有至少70％与序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。

24．权利要求23的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它具有至少80％与序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。

25．权利要求24的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它具有至少90％与序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。

26．权利要求25的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它具有至少95％与序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的同源性。

27．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列是序列1或序列4的核酸序列。

28．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列包含序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229的核酸序列。

29．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它在低严格性条件下与如下物质杂交：(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100个核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互补链。

30．权利要求29的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它在低严格性条件下与如下物质杂交：(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，或者(b)(a)的互补链。

31．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它在中度严格性条件下与如下物质杂交：(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100个核苷酸的(a)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互补链。

32．权利要求31的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它在中度严格性条件下与如下物质杂交：(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，或者(b)(a)的互补链。

33．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它在高严格性条件下与如下物质杂交：(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(b)至少100个核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(c)(a)或(b)的互补链。

34．权利要求33的方法，其中，所述第二种核酸序列是这样一种核酸序列：它在高严格性条件下与如下物质杂交：(a)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，或者(b)(a)的互补链。

35．权利要求1～10任一项的方法，它编码多肽的变体，所述多肽具有一条序列2或序列5的氨基酸序列，所述变体包括一个或多个氨基酸的替代、缺失和/或插入。

36．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列是含于粘粒34G12中的核酸序列，该粘粒含于大肠埃希氏菌DSM11924中。

37．权利要求1～10任一项的方法，其中，所述第二种核酸序列是含于粘粒18H7中的核酸序列，该粘粒含于大肠埃希氏菌DSM12060中。

38．权利要求1～37任一项的方法，其中，所述突变细胞进一步包括一条或多条第三种核酸序列的一个或多个修饰，其中，该修饰减少或消除了一条或多条第三种核酸序列的表达。

39．权利要求38的方法，其中，所述第三种核酸序列编码一种酶，该酶选自：氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶溶解酶、过氧化物酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。

40．一种用于生产多肽的突变丝状真菌细胞，该突变丝状真菌细胞包含编码该多肽的一条第一种核酸序列以及选自下组的第二种核酸序列的修饰：

(e)(a)、(b)或(c)的等位变体；以及

41．权利要求40的突变细胞，它进一步包括一条或多条第三种核酸序列的一个或多个修饰，其中，该修饰减少或消除了一条或多条第三种核酸序列的表达。

42．权利要求41的突变细胞，其中，所述第三种核酸序列编码一种酶，该酶选自：氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、齿斑葡聚糖酶、氧化酶、果胶溶解酶、过氧化物酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和木聚糖酶。

43．一种生产权利要求40～42任一项的突变细胞的方法，它包括修饰亲代丝状真菌细胞的一条或多条第二种核酸序列，该序列选自：

(e)(a)、(b)或(c)的等位变体；以及

44．一种分离的多肽，它选自：

(b)由一种核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在低严格性条件下与如下物质杂交：(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(ⅱ)至少100个核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互补链；

(d)(a)或(b)的等位变体；以及

45．权利要求44的多肽，它包含一种氨基酸序列，该氨基酸序列具有至少50％与序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83的同一性。

46．权利要求44的多肽，它由序列2或序列5的氨基酸序列；或其具有DDC2或DDC3多肽活性的片段构成。

47．权利要求46的多肽，它由序列2或序列5的氨基酸序列构成。

48．权利要求46的多肽，它由序列2的氨基酸19～64或序列5的氨基酸21～83构成。

49．权利要求44的多肽，它由一种核酸序列编码，所述核酸序列在低严格性条件下与如下物质杂交：(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，(ⅱ)至少100个核苷酸的(ⅰ)的子序列，或者(ⅲ)(ⅰ)或(ⅱ)的互补链。

50．权利要求44的多肽，它由一种核酸序列编码，所述核酸序列在低严格性条件下与如下物质杂交：(ⅰ)序列1的核苷酸1014～1151或序列4的核苷酸1041～1229，或者(ⅱ)(ⅰ)的互补链。

51．权利要求44的多肽，它是具有一条序列2或序列5的氨基酸序列的多肽的变体，该变体包括一个或多个氨基酸的替代、缺失和/或插入。

52．权利要求44的多肽，它由含于粘粒34G12中的核酸序列编码，所述粘粒含于大肠埃希氏菌DSM11924中。

53．权利要求44的多肽，它由含于粘粒18H7中的核酸序列编码，所述粘粒含于大肠埃希氏菌DSM12060中。

54．一种分离的核酸序列，它编码权利要求44的多肽。

55．一种核酸构建物，它包含可操作地与一条或多条控制序列连接的、权利要求54的核酸序列，所述控制序列指导多肽在合适的表达宿主中的表达。

56．一种重组表达载体，它包含权利要求55的核酸构建物。

57．一种重组宿主细胞，它包含权利要求55的核酸构建物。

58．一种生产权利要求44的多肽的方法，它包括：(a)在有助于生产该多肽的条件下培养一种菌株；以及(b)从培养基回收该多肽。

59．一种生产多肽的方法，它包括：(a)在有助于生产该多肽的条件下培养权利要求57的宿主细胞；以及(b)从培养基回收该多肽。

60．一种核酸构建物，它包含编码一种蛋白质的基因，该基因可操作地与编码一种信号肽的核酸序列连接，所述核酸序列由序列1的核苷酸960～1013或序列4的核苷酸981～1040构成，其中，所述基因是该核酸序列的外源基因。

61．一种重组表达载体，它包含权利要求60的核酸构建物。

62．一种重组宿主细胞，它包含权利要求60的核酸构建物。

63．一种生产蛋白质的方法，它包括：(a)在适合生产该蛋白质的条件下培养权利要求62的重组宿主细胞；以及(b)回收该蛋白质。