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CN85101561A - 用于表达牛生长激素衍生物的载体 - Google Patents

用于表达牛生长激素衍生物的载体 Download PDF

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Publication number
CN85101561A
CN85101561A CN198585101561A CN85101561A CN85101561A CN 85101561 A CN85101561 A CN 85101561A CN 198585101561 A CN198585101561 A CN 198585101561A CN 85101561 A CN85101561 A CN 85101561A CN 85101561 A CN85101561 A CN 85101561A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plasmid
tac
atg
dna
cga
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN198585101561A
Other languages
English (en)
Inventor
H·M·苏格
R·G·舒纳
B·E·舒纳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Eli Lilly and Co filed Critical Eli Lilly and Co
Publication of CN85101561A publication Critical patent/CN85101561A/zh
Pending legal-status Critical Current

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Abstract

本发明涉及新的能选择的并且自主地复制重组 DNA的表达载体,该载体编号牛生长激素衍生物。 本发明进一步包括前面所说到的载体的新的转化株 及新的制造蛋白质颗粒的方法及应用方法。

Description

本发明涉及一个新的能选择的并且自主地复制重组DNA的表达载体,它包括1)在具有生物活性的牛生长激素(bGH)衍生物编码基因的译读码上的一个转录机翻译活性核苷酸序列,以及2)在诱导条件下,失去复制数控制的一个复制子。本发明进一步涉及到前面所说载体的新转化株、牛生长激素衍生物以及使用方法。
生产bGH的重组DNA技术的发展和开发由于基因表达问题而严重地受到阻碍。其中的一些问题,在欧洲专利公开说明书0075444中已详述了,包括在功能上欠佳的mRNA的转录。这样的mRNA具有干扰与正常核糖体连接的链和环的二次构形,于是它严重地降低或者甚至阻碍了bGH的表达。本发明通过提供对bGH衍生物有高水平表达能力的载体而防止了这个问题的发生。
就在此公开和提出权利要求的本发明而言,对以下的术语规定如下:
重组DNA的无性繁殖载体-任何一个自主地复制的载体,它包括但不只限于质粒,含有一个能够加入或已被加入了一个或多个另外的DNA片段的DNA分子。
重组DNA表达载体-任何一个已经参入了一个或多个转录和翻译活化序列的重组DNA无性繁殖载体。
转录活化序列-任何一个操纵或保证DNA转录到mRNA转录本中的DNA序列。
翻译活化序列-任何一个操纵或保证mRNA转录本翻译成为肽或多肽的DNA序列。
翻译启动信号-任何一个具有翻译起动密码子密码的DNA三联体。
翻译终止信号-任何一个具有翻译终止密码子密码的DNA三联体。
转化-把DNA引入到改变基因类型的受体宿主细胞中。
转化株-一个已经经受了转化的受体宿主细胞。
限制片段-任何一个由一个或多个限制酶作用而产生的直线状DNA序列。
复制子-任何一个控制重组DNA无性繁殖和表达载体的复制的DNA序列。
失控复制子-一个缺少或可被诱导失去复制数控制的复制子,这种失去造成不受控制的复制,并引起参入了这样的复制子的DNA复制数目的极度增加。
功能多肽-一种可回收的有生物活性的异源多肽或前体,一种可回收的由一个异源多肽和部份或全部的同源多肽组成的有生物活性的多肽,或一种可回收的由一个异源多肽和一个无生物活性的,可被特定切开的多肽组成的融合多肽。
融合基因产物-一种可回收的由部份或全部同源多肽组成的异源多肽。
附图说明
图1-4:pNM575质粒结构的示意说明。
图5-8:pNM789B质粒的示意说明。
图9:pCZ1920和pJR1质粒的限制位点。
图10:pCZ112质粒的限制位点图。
图11:α1胸腺素合成基因。
图12:核苷酸片段T15的合成图。
图13:PThα1质粒的限制位点图。
图14:胰岛素原合成基因。
图15:PHI7△4△1质粒的结构图。
图16:PHI104质粒的结构图。
发明的详细说明
本发明提供了一个可选择的并且自主地复制重组DNA表达载体,这种表达载体包含有
a)一种失控复制子,以及
b)在具有生物活性的牛生长激素衍生物编码基因的译读码上的一个转录和翻译活化核苷酸序列,所说的基因是:
(1)5'    ATG    AAA    GGG    AAT    TCT    ATG    GCC    TTC
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAC    TTT    CCC    TTA    AGA    TAC    CGG    AAG
CCA    GCC    ATG    TCC    TTG    TCC    GGC    3'
''' ''' ''' ''' ''' ''' '''-R-R1
GGT    CGG    TAC    AGG    AAC    AGG    CCG    5',
(2)5'    ATG    GAT    GAT    AAG    TTT    CCG    GCT    ATG
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAC    CTA    CTA    TTC    AAA    GGC    CGA    TAC
TCT    CTG    TCC    GGC    3'
'''    '''    '''    '''-R-R'
AGA    GAC    AGG    CCG    5',
(3)5'    ATG    TTT    CCA    GCC    ATG    GCT    CTA
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAC    AAA    GGT    CGG    TAC    CGA    GAT
TCT    GGT    3'
''' '''-R-R1
AGA    CCA    5',
(4)5'    ATG    TTC    CCA    GCT    ATG    TCT    CTA
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAC    AAG    GGT    CGA    TAC    AGA    GAT
TCT    GGT    3'
''' '''-R-R1
AGA    CCA    5',
(5)5'    ATG    GAT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAC    CTA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA
CTG    TCC    GGC    3'
''' ''' '''-R-R1
GAC    AGG    CCG    5',
(6)5'    ATG    TTT    CCA    GCT    ATG    TCT    CTA
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAC    AAA    GGT    CGA    TAC    AGA    GAT
TCT    GGT    3'
''' '''-R-R1
AGA    CCA    5',
(7)5'    ATG    GTT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAC    CAA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA
CTG    TCC    GGC    3'
''' ''' '''-R-R1
GAC    AGG    CCG    5'
(8)5'    ATG    GCT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAC    CGA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA
CTG    TCC    GTC    3'
''' ''' '''-R-R1
GAC    AGG    CAG    5'
其中的A是脱氧腺嘌呤,
G是脱氧鸟嘌呤,
C是脱氧胞嘧啶,
T是胸腺嘧啶,
R是具有牛生长激素的第9氨基酸(亮氨酸)到第191氨基酸(苯丙氨酸)密码的DNA序列,以及
R1是具有翻译终止信号密码的DNA序列,这些序列是:
5'    TAA    3'    5'    TAG    3'
'''    '''
3'    ATT    5'    3'    ATC    5'    或者
5'    TGA    3'
'''
3'    TCT    5'
本发明进一步还涉及到前述的载体的转化株、化合物、小颗粒以及使用方法。
本发明可以单独地由把下面这些XbaI-HgiAI    DNA联结子序列连接到PCZ101质粒的~10.2Kb    BamHI-XbaI以及~0.6Kb    BamHI-HgiAI片段上而构成。这些联结子序列是:
a)5'    CTAGAGGGTATTAATA    ATG    AAA    GGG    AAT
''''''''''''    '''    '''    '''    '''
TCCCATAATTAT    TAC    TTT    CCC    TTA
TCT    ATG    GCC    TTC    CCA    GCC    ATG    TCC
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
AGA    TAC    CGG    AAG    GGT    CGG    TAC    AGG
TTG    TCC    GGC    CTG    TTT    GCC    AAC    GCT
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
AAC    AGG    CCG    GAC    AAA    CGG    TTG    CGA
GTGCT    3'
'
C    5'
b)5'    CTAGAGGGTATTAATA    ATG    TTT    CCA    GCC
''''''''''''    '''    '''    '''    '''
3'    TCCCATAATTAT    TAC    AAA    GGT    CGG
ATG    GCT    CTA    TCT    GGT    CTG    TTT    GCC
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
TAC    CGA    GAT    AGA    CCA    GAC    AAA    CGG
AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '
TTG    CGA    C    5'
c)5'    CTAGAGGGTATTAATA    ATG    TTT    CCA    GCT
''''''''''''    '''    '''    '''    '''
3'    TCCCATAATTAT    TAC    AAA    GGT    CGA
ATG    TCT    CTA    TCT    GGT    CTG    TTT    GCC    AAC
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
TAC    AGA    GAT    AGA    CCA    GAC    AAA    CGG    TTG
GCT    GTGCT    3'
'''    '
CGA    C    5'
结果产生的质粒,分别被表示为PCZ1920,pJR1和pAT2,它们含有1)在一个有生物活性的牛生长激素衍生物的密码序列的译读码中的大肠杆菌脂蛋白基因转录和翻译活性序列,(Nakamura和Inouye,1979,细胞18:1109);2)一个被适当地安置的翻译终止信号;和3)一个失控复制子。由pCZ1920,pJR1和pAT2质粒转化了的细胞分别表达了MET-LYS-GLY-ASPN-SER-MET-ALA-bGH,MET-pHE-pRO-ALA-MET-ALA-R2和MET-bGH,其中的MET是蛋氨酸,
LYS是赖氨酸,
GLY是甘氨酸,
ASPN是门冬氨酸,
SER是丝氨酸,
ALA是丙氨酸,
PHE是苯丙氨酸,
PRO是脯氨酸,
bGH是以N-末端(第一)苯丙氨酸为始的牛生长激素的天然氨基酸序列,
R2是从N-未端起第六氨基酸(亮氨酸)开始的牛生长激素的天然氨基酸序列。
pCZ1920和pJR1质粒的限制位点图表示在附图9中。
也包括在本发明之中的其它质粒可以通过把下面这些TagI-HgiAI    DNA联结子序列连接到pCZ101质粒的~10Kb    ECORI-BamHI和~0.6Kb    BamHI-HgiAI片段以及pNM608质粒的~0.29Kb    EcoRI-ClaI片段上来构成。联结子序列是:
a)5'    CGACC    ATG    GAT    GAT    AAG    TTT    CCG    GCT
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TGG    TAC    CTA    CTA    TTC    AAA    GGC    CGA
ATG    TCT    CTG    TCC    GGC    CTG    TTT    GCC
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
TAC    AGA    GAC    AGG    CCG    GAC    AAA    CGG
AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '
TTG    CGA    C    5'
b)5'    CGACA    ATG    TTC    CCA    GCT    ATG    TCT    CTA    TCT
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TGT    TAC    AAG    GGT    CGA    TAC    AGA    GAT    AGA
GGT    CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '
CCA    GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
c)5'    CGACC    ATG    GAT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT    CTG
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TGG    TAC    CTA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA    GAC
TCC    GGC    CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '
AGG    CCG    GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
d)5'    CGATC    ATG    GAT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT    CTG
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAG    TAC    CTA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA    GAC
TCC    GGC    CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '
AGG    CCG    GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
e)5'    CGACC    ATG    GTT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT    CTG
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TGG    TAC    CAA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA    GAC
TCC    GGC    CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '
AGG    CCG    GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
f)5'    CGACC    ATG    GCT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT    CTG
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TGG    TAC    CGA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA    GAC
TCC    GTC    CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '
AGG    CAG    GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
g)5'    CGATA    ATG    GAT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT    CTG
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAT    TAC    CTA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA    GAC
TCC    GGC    CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '
AGG    CCG    GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
其中白    A    是脱氧腺嘌呤
G    是脱氧鸟嘌呤
C    是脱氧胞嘧啶
T    是胸嘧啶
结果产生的质粒分别被表示为pCZ112,pAT1,pASP1,pASP2,pCZ154,pCZ155和pCZ156,它们含有1)在一个有生物活性的牛生长激素衍生物的密码序列的译读码中的大肠杆菌色氨酸基因转录和翻译活性序列(Hallewell和Emtage,1980,基因9:27);2)一个被适当地安置的翻译终止信号;和3)一个失控复制子。由pCZ112,pAT1,pASP1,pASP2,pCZ154,pCZ155和pCZ156转化了的细胞分别表达了MET-ASP-ASP-LYS-bGH,MET-bGH,MET-ASP-bGH,MET-ASP-bGH,MET-VAL-bGH,MET-ALA-PHE-PRO-ALA-MET-SER-LEU-SER-VAL-b′GH和MET-ASP-bGH,其中
MET    是蛋氨酸,
ASP    是门冬氨酸,
LEU    是亮氨酸,
SER    是丝氨酸,
PRO    是脯氨酸,
PHE    是苯丙氨酸,
LYS    是赖氨酸,
VAL    是缬氨酸,
ALA    是丙氨酸,
b′GH是以第9氨基酸,亮氨酸为起始的牛生长激素的天然氨基酸序列,以及
bGH是以N-未端(第一)苯丙氨酸为起始的牛生长激素的天然氨基酸序列。pCZ112质粒的限制位点图说明表示在图10中。
pCZ101质粒起始物是~10.8Kb并通过把pNM789B质粒的0.6Kb    XbaI-BamHI片段连接到相类似的pIM-I′-A3水解的质粒上而构成,这后一种含有大肠杆菌脂蛋白基因的转录和翻译活性序列和一个失控复制子的质粒,可以从大肠杆菌K12    RV308/pIM-I′-A3,一个寄存了的,并成为伊利诺斯州peoria北方地区研究实验室(NRRL),永久贮存的培养收集物一部分的菌种来得到,作为质粒最佳来源和贮存库,可以寄存号NRRL    B-15733获得该菌种。质粒pNM789B起始物是按照图1-8所描述和图示的步骤以及下列实施例1由质粒pKEN111得出。质粒pKEN111可以由大肠杆菌K12CC620/pKEN111,一个寄存了的并成为伊利诺斯洲peoria北方地区研究实验室(NRRL)永久贮存的培养收集物一部份的菌种来得到。作为质粒的最佳来源和贮存库,该菌种可以寄存号NRRL    B-15011来获得。
质粒pNM789B也包含大肠杆菌脂蛋白基因的转录和翻译活性序列。此外还包含一个由bGH和在bGH的N-未端的九元多肽组成的融合蛋白的密码序列,它包括一个适当定位了的翻译终止信号。把包含在XbaI-BamHI片段中的融合蛋白密码序列连接到适当地被切开的pIM-1′-A3质粒上去,结果形成前面所说的pCZ101质粒起始物。
pNM608质粒起始物是4.6Kb并通过把pHI7△4△1的EcoRI-ClaI片段连接到pBR322质粒的水解的EcoRI-ClaI上而构成。pHI7△4△1质粒可以按照以下实施例5的方法构成。由于pHI7△4△1质粒中TagI限制位点的多重性,因此所需要的EcoRI-TagI片段可以通过半无性繁殖pHI7△4△1的EcoRI-HpaI和HpaI-TagI片段最好地生产。pNM608质粒包含有大肠杆菌色氨酸转录活化序列,所以对于构成本发明是有用的。
在本技术领域中的专业人员会认识到,上面所描述的各种DNA联结子是本发明的重要部份。这些序列可以利用被充份保护了的二脱氧核糖核苷酸结构单位通过修改的磷三脂法按常规合成。这样的合成方法在该技术领域中是已知的,并可以基本上按照Itakura等人,1977,科学,198:1058和Crea等人,1978,Proc.Nat.Acad.Sci.USA    75:5765中的步骤来完成。除此以外,在Hsing等人,1983,核酸研究,11:3227和Narang等人,1980,酶学中的方法,68:90中公开了一个特别可取的方法。联结子具有一个翻译活性序列和由前面所说的bGH衍生物化合物的第一部份(N-未端区域)组成的氨基酸编码。bGH密码序列的其余部分(包括一个适当地定位的翻译终止信号)和一个翻译活性序列可以通过连接pCZ101质粒的适当的片段而得到。这样的连接结果产生了本发明所说明的牛生长激素衍生物表达质粒。
缺失pCZ101质粒~900碱基对的BstEII限制片段,并且然后环接,产生pCZ103质粒。BstEII缺失不影响pCZ101质粒中的bGH编码区域。用pCZ103质粒代替上述构造中的pCZ101质粒由此产生相似的,但小于900碱基对的质粒。由这些pCZ103导生质粒表达的bGH衍生物因而与由它们的pCZ101导生付本表达的衍生物是一样的。
于是,在上述的pJRI和pATZ质粒构造中,用pCZ103质粒的~9.3Kb    BamHI-XbaI和~0.6Kb    BamHI-HgiA限制片段代替pCZ101质粒的~10.2Kb    BamHI-XbaI和0.6Kb    BamHI-HgiAl限制片段分别得到pJR1.3和pAT2.3质粒。在上述的质粒pAT1,pASP1,pASP2,pCZ154,pCZ155和pCZ156构造中,用pCZ103质粒的~9.3Kb    BamHI-EeoRI和~0.6Kb    BamHI-HgiAl限制片段代替PCZ101质粒的~10.2Kb    BamHI-EcoRI和~0.6Kb    BamHI-HgiAl限制质粒,结果分别产生pAT1.3,pASP2.3,pCZ154.3,pCZ155.3,和pCZ156.3导生质粒。
本发明决不限于使用特定的转录活性序列,因为选取一个具体的序列对于本发明的工作不是关键的。
可以代替前面例举中的脂蛋白和色氨酸活性序列的转录活性序列,包括,但不只限于大肠杆菌乳糖(lac),噬菌体λpLOL和噬菌体λpROR的转录活性序列,此外,一个或几个转录活性序列,或他们的一部份可以相互联合地使用。例如,色氨酸与乳糖或tac的转录活性序列。所有上面所说的序列先前已经作了叙述并可以或者通过合成,或者由已知的质粒来构建。
在此描述的具体实施方案中,质粒的复制是通过可由热诱导的失控复制子解决的,这在英国专利公开说明书1,557,774和Uhlin等人,1979,基因6:91中已作了说明。在低于30℃的温度下,特别在25℃时,复制子维持一个相对低的,每个细胞大约10-15个复制品的复制数。当温度上升到37℃时,失去了复制数的控制,并且包含有这种复制子的质粒扩充到每个细胞复制1000-2000个。在此作为特定的失控复制子的实例被包含在前面描写的pIM-I′-A3质粒的起始物中。普通的专业人员会理解,本发明并不是限于任何一个特定的失控复制子或复制数突变株。其他可诱导的失控的或高复制数的复制子可以通过适当的选择获得,或者可以按照在国际公开说明书WO82/02901所说明的步骤来构建。这样的复制子可用于构建表达载体,这也是在本发明的范围之内。
进入到含有失控复制子载体中的外来基因的无性繁殖,在诱导并失去复制数的控制后,导致蛋白合成的速率大大增加,并形成一种至今还不知道的和未识别的细胞内蛋白质颗粒。进一步构成本发明的这种颗粒。它们的蛋白质组成是高度均一的,并且在已知高分子量聚集物包涵物中是可以区别的,这种聚集物和包涵物有时出现在含有重组DNA的宿主细胞中,后面这种包涵物是不均一的,通常含有各种细胞成份如核酸、碳水化合物,脂类和肽,并且仅含有10-20%特定蛋白质产品。本发明的颗粒是高度均一的,所需要的蛋白质产品至少构成该颗粒的50%,常常超过80%。
这种新的颗粒可以很容易地从细胞溶胞产物中被分离,并在低浓度的脲或清洗剂中洗涤,清洗除去未特定地连结到颗粒上的蛋白质。产生高的特殊活性物质的分离构成了提纯外来蛋白质中有用的第一步骤,提纯的所有随后的各步因此而被简化。细胞壁成份可以容易地从小粒中被分离,这是一个特别有好处的事实。
可以相信,本发明颗粒的形成隔绝了外来蛋白以至于不会出现正常细胞代谢的中断和未成熟细胞的死亡。一些蛋白质,例如人胰岛素原,在大肠杆菌中很快地降解并且不会累积,可是当这样的蛋白质在含有失控复制子的载体中被编码时,胰岛素前体的蛋白质形成不溶解的颗粒。这些颗粒保护了通常是不稳定的蛋白质,避免蛋白水解的降解。因此这种颗粒形式不仅对于累积不稳定蛋白质是有用的,而且对于简化分离和提纯基因产品的步骤也是有用的。
因此本发明进一步包括了一个生产细胞内高度均一的异种蛋白质颗粒的方法。所说的方法包括:
1)用一个能选择和自由地复制重组DNA表达载体转化一个适当的细胞,该表达载体包含
a)一个失控复制子和
b)一个在具有功能多肽密码的核苷酸译读码上的转录和翻译活性序列,所说的功能多肽密码序列包含了一个紧紧地与所说的功能肽的羧基未端密码的核苷酸三联子并在其下方的翻译停止信号。
2)在适合于基因表达和活化或诱导所说的失控复制子的条件下培养转化细胞。
任何一个失控复制子和转录翻译活性序列,正如前文已描述过的,而且实际上任何一个具有功能肽和融合基因产品编码的核苷酸序列都可以用于用上述方法构成载体。这些密码序列包括,但不仅限于具有牛生长激素(bGH),人生长激素(hGH),前一人生长激素(pre-hGH)猪生长激素(GGH),哺乳动物生长激素,鸟生长激素,生长激素释放因子,人胰岛素A链,人胰岛素B链,前一人胰岛素,前一人胰岛素原,人体和非人体干扰素,尿激酶,组织血纤维蛋白溶酶原激活剂,内白血球素Ⅱ,任何一种多肽激素,任何一种多肽酶和任何一种有研究和商业价值的生物活性多肽的密码序列。
在按照上面规定的方法培养后作为这类颗粒产品例证的转化细胞包括,但不仅只限于大肠杆菌K12    RV308/pCZ1920,大肠杆菌K12    RV308/pJR1,大肠杆菌K12    RV308/pASP1,大肠杆菌K12    RV308/pCZ112,大肠杆菌K12    RV308/pASP2,大肠杆菌K12    RV308/pAT1,大肠杆菌K12    RV308/pAT2,大肠杆菌K12    RV308/pCZ154,大肠杆菌K12    RV308/pCZ156,大肠杆菌K12    RV308/pJR1.3,大肠杆菌K12    RV308/pASP1.3,大肠杆菌K12    RV308/pASP2.3,大肠杆菌K12    RV308/pAT1.3,大肠杆菌K12    RV308/pAT2.3,大肠杆菌K12    RV308/pCZ154.3,和大肠杆菌K12    RV308/pCZ156.3。
现在这种生产高度均一颗粒的方法并不限于使用上述具有牛生长激素编码的质粒,人类胰岛素颗粒也可以按照前述的方法,通过培养含有人类胰岛素密码序列载体的细胞产生。这样的载体可以像图15所描述的那样通过把含有trpLE′-前胰岛素融合序列的EcoRI-BamHI片段连结到pCZ101质粒大的EcoRI-BamHI片段中,所产生的质粒被命名为pCZ201质粒,可以按照普通的转化方法,转化如K12RV308这样的大肠杆菌。在37℃下培养大肠杆菌K12    RV308/pCZ201就能够产生所说的颗粒,在这种情况下,它包含了人胰岛素。
所列举的这些DNA序列和质粒可以有许多改进和变异。例如,遗传密码的简并性允许替代遍及多肽密码各区域的核苷酸,以及允许用
Figure 85101561_IMG4
翻译终止信号代替作为特定例子的
Figure 85101561_IMG5
翻译停止信号。于是R,如前面所定义的,可以是具有bGH第9氨基酸(亮氨酸)到第191氨基酸(苯丙氨酸)编码的任何一个可能的DNA序列。这样的序列可以从bGH已知的氨基酸序列导出,并可通过常规合成步骤来构成。然而,核苷酸三联体应按照已知的原则和在Zuker和Stiegler,1981,核酸研究9(1):133中审查过的推断来选取。从而避免产生mRNA中的互补碱基。在这二个互补的碱基之间的氢键合(配对)引起降低翻译效率的直键和环的构型和折叠。普通专业人员会理解,上面公开的所有改进和变异,可以大致按照前面列举的合成方法来合成,因此,本发明决不限于作为特例的那些DNA序列和质粒。
本发明的表达载体和方法可被应用到很宽范围的宿主有机体,例如,革兰氏阴性前核细胞有机体,如大肠杆菌,K12大肠杆菌,K12    RV308大肠杆菌,K12    HB101大肠杆菌,K12    C600大肠杆菌,K12    C    600    RK-MK-,大肠杆菌,K12    RR1大肠杆菌,K12    MM294大肠杆菌等等。虽然,本发明所有的具体实施例都是有用的,但一些载体和转化株更为可取,最佳的载体有pCZ1920,pJR1,pJR1.3,pCZ112,pAT1,pAT1.3,pAT2,pAT2.3,pASP1,pASP1.3,pCZ154,pCZ154.3,pCZ156,pAT2.3,pASP1,pASP1.3,pCZ154,pCZ154.3,pCZ156,pCZ156.3,pASP2.3,和pASP2;最佳的转化株有大肠杆菌K12RV308/pCZ1920,大肠杆菌K12RV308/pJR1,大肠杆菌K12RV308/pJR1.3,大肠杆菌K12RV308/pCZ112,大肠杆菌K12RV308/pAT1,大肠杆菌K12RV308/pAT1.3,大肠杆菌K12RV308/pAT2,大肠杆菌K12RV308/pAT2.3,大肠杆菌K12RV308/pASP1,大肠杆菌K12RV308/pASP1.3,大肠杆菌K12RV308/pCZ154,大肠杆菌K12RV308/pCZ154.3,大肠杆菌K12RV308/pCZ156,大肠杆菌K12RV308/pCZ156.3,大肠杆菌K12RV308/pASP2.3,和大肠杆菌K12RV308/pASP2,在这些最佳组中,质粒pCZ112.pCZ154.pCZ154.3.pCZ156.pCZ156.3,pASP2.3和pASP2以及转化株大肠杆菌K12RV308/pCZ112,大肠杆菌K12RV308/pCZ154,大肠杆菌K12RV308/pCZ154.3,大肠杆菌K12RV308/pCZ156,大肠杆菌K12RV308/pCZ156.3,大肠杆菌K12RV308/pASP2.3和大肠杆菌K12RV308/pASP2更优。
本技术中的普遍专业人员会认识到,本发明的表达载体被用于转化适当的宿主有机体,使得牛生长激素衍生物产品能用标准的发酵条件被表达。这种以高度均一颗粒被表达的并由常规方法从产生的细胞溶胶产物中分离出来的产品对增加牛奶产量和一般地刺激牛的生长是有用的。应用方式,服用和用于牛的适当剂量是已知的,并被公开在欧洲专利局公开说明书0085036第7-9页上,通过参考引用被併入这里。以下的例子进一步说明在此公开的发明,适合于对发明进行解释和说明发明的实际步骤。
实施例1
质粒PNM789B的构建
A.质粒PKEN021的构建和XbaI-BamHI片段
由质粒PKEN021(图3,106)的XbaI-BamHI分裂产生的~5.1仟碱基片段,质粒PKEN021是PKEN111的衍生物(图1,101在1981年,细菌杂志146:861-866页Lee等人和1981年细菌杂志145:654-656页Zwiebel等人进一步做了描述)以大肠杆菌cc620进行贮存(NRRL寄存号15011),具有~2.8仟碱基片段,该片段含有大肠杆菌的脂蛋白基因。在1979年细胞18:1109-1117页Nakamura和Inouye对这种片段做了描述。在PKEN021中,PBR322的单一EcoRI和SalI限制位点之间的650碱基对序列已由大肠杆菌的脂蛋白基因所产生的序列所代替。这种脂蛋白基因序列(Nakamura和Inouye,1979年)包括一个462碱基对AluI片段,来自脂蛋白基因的第一个三联体(蛋氨酸)上面位置包括启动区,5′未翻译区和核糖结合位点。在翻译起始信号蛋氨酸之前,单一XbaI限制位于核糖体结合位点16碱基对之中,位于来自结构基因翻译末端编码子的上面位置105碱基对的PvuII限制位点,由添加合成DNA联结子(5′CCGGATCCGG3′,由合作研究获得)而改变成BamHI限制位点,脂蛋白最后35个氨基酸的编码序列,翻译末端信号和相应于信号使RNA的3′未翻译区的序列遵从BamHI位点。质粒PKEN021也包括大约850个与脂蛋白基因无关的,位于大肠杆菌染色体中蛋白基因下面位置的外界序列碱基对。这些序列包括方法的结果和在基因原始分离中所用的限制酶位点。
参照图1,2和3,质粒PKEN021以如下方式从PKEN111(图1,101)与25单位的HPaII限制酶,置于300微升含有20毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸PH7.4,10毫摩尔浓度MgCl2和6毫摩尔浓度的β-巯基乙醇的缓冲液中,在37℃下水解2小时。用300微升50∶50的酚∶氯仿混合液提取2次,然后再用2.5体积的乙醇和0.1体积的3摩尔浓度醋酸盐溶液沉淀,回收水相,将DNA片状沉淀物溶解在100微升电泳缓冲液内,并在5%的聚丙烯酰胺凝胶上分级(除非另有注释,丙烯酰胺与二丙烯酰胺的比率为29∶1),将该凝胶在含有0.5微克/毫升的溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溶液中着色,在长波长的紫外光下显现波带,分离950碱基对,并利用电洗提从凝胶中回收到渗析袋内。用酚/氯仿提取,乙醇沉淀后,将回收的DNA(约2.5微克)在25微升TEN〔10毫摩尔浓度NaCl,10毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液。盐酸PH7.4和1毫摩尔浓度EDTA(乙二胺四乙酸钠)PH8.0〕中溶解。
将2微克950碱基对HPaII片段与AluI限制酶置于200微升的含有50毫摩尔浓度Nacl,6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液。盐酸PH7.6,6毫摩尔浓度Mgcl2和6毫摩尔浓度β-巯基乙醇的缓冲液中,在37℃下水解2小时,在6%的聚丙酰胺凝胶上分级DNA,回收产生的462碱基对AluI片段,采用上述方法纯化。用10微升T4DNA连接酶缓冲液(66毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液。盐酸PH7.6,10毫摩尔浓度Mgcl2,10毫摩尔浓度二硫苏糖醇,0.4毫摩尔浓度ATP)溶解462碱基对AluI片段(约1微克)。该缓冲液有150皮摩尔的磷酸化EcoRI联结子(5′GGAATTCC3′,来自合作研究)和2单位T4DNA连接酶。在4℃下培育16小时,在65℃下将混合物加热10分钟,用EcoRI缓冲液(100毫摩尔浓度羟甲基氨基甲烷缓冲液。盐酸,PH7.2,50毫摩尔浓度Nacl,10毫摩尔浓度Mgcl2,6毫摩尔浓度β-巯基乙醇)和4单位EcoRI酶稀释到100微升,在37℃下水解2小时后,用酚/氯仿提取,并用乙醇沉淀。然后用20微升含有0.1单位T4DNA连接酶和0.1微克PBR322(图1,102)的T4DNA连接酶缓冲液溶解DNA,成为具有EcoRI的线性化,然后用碱性磷酸酶处理,在4℃下连接16小时。通常用产物DNA来转化大肠杆菌K12HB101,在含有12微克/毫升的四环素和利用快速碱性提取方法由抗性菌落中分离出来的质粒(Bi-ruboim和Doly在1979年核酸研究7:1513-1523中介绍的方法)的琼脂板上选择转化株。含有466碱基对XbaI-BamHI片段的质粒(图1,103)被选用来作为下面描述步骤中的起始材料。
将2微克的这种质粒(图2,103)与2单位的HindIII酶置于50微升HindIII缓冲液中(60毫摩尔浓度Nacl,10毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH7.4,10毫摩尔浓度Mgcl2和6毫摩尔浓度β-巯基乙醇),在37℃下水解1小时,用酚/氯仿提取和乙醇沉淀后,将DNA在200微升的含有300毫摩尔浓度Nacl,30毫摩尔浓度醋酸钠PH4.25,1毫摩尔浓度Zncl2和200单位的Sl核酸酶(Miles实验室)的缓冲液中溶解,在15℃下放置1小时,用酚/氯仿提取和乙醇沉淀终止反应。反应产物DNA在10微升的T4DNA连接酶缓冲液中溶解,该缓冲液含有20皮摩尔磷酸化BamHI联结子(5′CCGGATCCGG3′,来自合作研究)和2单位T4DNA连接酶,在4℃下放置16小时,将反应混合物在65℃下加热10分钟钝化连接酶。然后以100微升含有20单位BamHI酶的BamHI缓冲液(150毫摩尔浓度Nacl720毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液。盐酸PH8.0,10毫摩尔浓度Mgcl2,6毫摩尔浓度β-巯基乙醇)稀释。在37℃下放置2小时后,在1%琼脂糖凝胶上钝化该混合物,将凝胶着色,冰冻后,利用洗提回收较大的片段(~4.5仟碱基),然后用酚/氯仿提取,乙醇沉淀,并进行纯化。用BamHI粘性末端回收的片段在20微升的T4DNA连接酶缓冲液中溶解,该缓冲液含有0.1单位的T4DNA连接酶,在4℃下放16小时后,用DNA转化大肠杆菌HB101,利用对100微克/毫升氨苄青霉素(Apr)的抗性选择转化株,利用对10微克/毫升四环素(Ts c)的敏感性进行筛选。对由早期描述的Birnboim法从AprTs c菌落中制备的几种质粒进行检验HindIII位点的缺少和单一BamHI位点的存在。EcoRI,SalI接续水解产生466碱基对和305碱基对片段。选择具有这些特征的质粒(图2,104),进行改性,把位于lpp启动基因上面位置的EcoRI位点转变成HindIII限制位点。
把2微克质粒(图2,104)与0.2单位的EcoRI置于100微升EcoRI缓冲液中,在37℃下水解10分钟,在65℃加热10分钟终止反应。然后用酚/氯仿提取,乙醇沉淀DNA,以200微升Sl核糖酶缓冲液溶解,该缓冲液每毫升含1000单位Sl核糖酶。在12℃下反应1小时,用酚/氯仿提取,乙醇沉淀终止反应。产物DNA在10微升T4DNA连接酶缓冲液中再悬浮,该缓冲液含20皮摩尔磷酸化的HindIII联结子(5′CCAAGCTTGG3′,来自合作研究)和2单位的T4DNA连接酶。在4℃下放置16小时,在65℃下将混合物加热10分钟,以150微升的含有10单位HindIII酶的HindIII缓冲液稀释,37℃下培育2小时。然后在1%琼脂凝胶上分级。通常回收最大的波带(相当于一个切割片段),进行纯化,在20微升含有0.2单位T4连接酶的T4连接酶缓冲液中溶解,4℃下培育16小时。然后用于转化大肠杆菌HB101。用对氨苄青霉素的抗性选择转化株。通常靠分析限制酶来分析质粒分离。选择具有500碱基对的EcoRI-HindIII片段质粒,用来做为无性繁殖载体加到lpp基因的3′区。
大约2微克质粒(图3,105)与2单位SalI在50微升的SalI限制缓冲液中(150毫摩尔浓度Nacl,6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH7.9,6毫摩尔浓度Mgcl2,6毫摩尔浓度β-巯基乙醇),在37℃下水解1小时,然后用含2单位BamHI的BamHI缓冲液稀释到150微升,在37℃下放置1小时,加入2.5单位碱性磷酸酶,然后继续在65℃下培育1小时,以酚/氯仿提取,乙醇沉淀,在TEN中溶解,被用来作为lpp3′片段的无性繁殖载体。
为获得含lpp3′区的片段,将10微克PKENIII(图3,101)与10单位的HpaI一起置于200微升的HpaI缓冲液中(20毫摩尔浓度KCl,10毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH7.4,10毫摩尔浓度Mgcl2和6毫摩尔浓度β-巯基乙醇),在37℃下水解2小时,用酚/氯仿提取,乙醇沉淀后,将DNA在10微升T4DNA连接酶缓冲液中溶解,该缓冲液含20皮摩尔磷酸化的SalI联结子(5′GGTCGACC3′,来自合作研究)和2单位T4DNA连接酶。然后在4℃下培育16小时,65℃下加热10分钟,使连接酶钝化得到的物质。用含10单位SalI的SalI缓冲液稀释到100微升,37℃下培育1小时,然后以含10单位PvuII限制酶的PvuII缓冲液(60毫摩尔浓度Nacl,6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH7.5,6毫摩尔浓度Mgcl2,6毫摩尔浓度β-巯基乙醇)稀释到300微升,37℃下放置1小时后,在5%的聚丙烯酰胺凝胶上分级DNA,回收大约0.5微克的950碱基对片段,进行纯化,用TEN溶解。将2/10微克片段稀释到20微升T4DNA连接酶缓冲液中,该缓冲液含有20皮摩尔的磷酸化BamHI联结子(5′CCGGATCCGG3′,来自合作研究)和2单位T4DNA连接酶,在4℃下培育16小时,用含20单位BamHI的BamHI缓冲液稀释到100微升,37℃下培育2小时,然后在5%的聚丙烯酰胺凝胶上分级,去除过量的联结子分子。通常对具有BamHI和SalI粘性末端的950碱基对片段进行净化。用20微升T4DNA连接酶缓冲液溶解,该缓冲液含有0.2微克早期描述的无性繁殖载体和0.2单位T4DNA连接酶。在4℃下培育16小时。DNA被用于转化大肠杆菌K12HB101,从氨苄青霉素抗性转化株中制备质粒。通常对SalI-BamHI片段来分析质粒。所需要的质粒(~5.2仟碱基)被命名为PKEN021(图3,106)。
10微克PKEN021在37℃下,以200微升XbaI/BamHI缓冲液水解(150毫摩尔浓度Nacl,10毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH8,10毫摩尔浓度Mgcl2,6毫摩尔浓度β-巯基乙醇),利用10单位的BamHI缓冲液水解1小时,随后再用10单位的XbaI缓冲液在37℃下水解1小时,然后在65℃下用2.5单位碱性磷酸酶处理所需要的XbaI-BamHI-水解DNA1.5小时,用酚/氯仿提取,用乙醇沉淀收集,并溶解在50微升TEN中,以备后用(图3,107)。
B.质粒PNM575的构建
利用Martial等人在1979年,科学205:602-607页所描述的质粒PtrpED50ChGH800(图4,108)作为DNA片段源,该片段含有一部分人生长激素基因的编码序列,这种片段也可以合成(Itakura等人1977年和Crea等人1978年),或者利用识别方法论也能获得。1979年Goodman等人在酶学方法68:75-90页做了描述,从人的脑垂体中分离人生长激素的mRNA编码,人生长激素基因部分的质粒PtrpED50ChGH800含有一个唯一的来自基因翻译终止密码子下面位置的SmaI限制位点6碱基对。利用如下方法将这一位点改变成BamHI位点:6微克质粒与6单位SamI一起置于200微升SmaI限制缓冲液中,在37℃下水解(15毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH8.0,6毫摩尔浓度Mgcl2,15毫摩尔浓度Kcl和6毫摩尔浓度β-巯基乙醇)1.5小时,待水解完全后,进行酚/氯仿提取,用乙醇沉淀回收DNA,然后用24微升TEN溶解,将40皮摩尔的磷酸化BamHI接合体片段(合作研究)添加到含有0.5微克(0.2皮摩尔末端)上述水解质粒的16微升连接酶缓冲液中,该缓冲液含有2单位T4DNA连接酶,将此混合物在22℃下培育2小时,4℃下培育16小时,然后再在65℃下培育10分钟。通过与BamHI限制酶进行水解来产生BamHI粘性末端,这种酶分裂成联结子序列以及BamHI位点,该位点位于无性系的人生长激素CDNA序列的末端,这就产生了一种具有粘性BamHI末端的691碱基对片段。在6%的聚丙烯酰胺凝胶上分离,然后回收。回收的DNA片段与0.2微克水解的BamHI和碱性磷酸酶处理的PER322(图4,102)进行连接(在早期描述的条件下,利用含有0.2单位T4DNA连接酶的20微升缓冲液),在4℃下放置16小时,这种物质被用来转化大肠杆菌JA221(NRRL NO:B-15014),根据Wensink等人在1974年细胞3:315-325页中介绍的转化方法。在含有100微克/毫升氨苄青霉素的琼脂板上选择转化株,然后分离质粒,利用限制酶和凝胶的电泳分析进行鉴定,所要求的质粒被命名为PNM575(图4,109),含有大约700碱基对的BamHI片段,为以后应用进行放大。
C.质粒PNM702的构建
成人生长激素的DNA序列含有一个FnuDII位点,它来自第一核苷酸的47碱基对。将25微克PNM575与25单位的BamHI一起置于250微升BamHI缓冲液中,在37℃下水解1小时,用6%的聚丙烯酰胺凝胶分离具有BamHI粘性末端的691碱基对片段,片段纯化之后,将 1/3 的片段(相当于8微克质粒)与2.5单位的FnuDII一起置于100微升的FnuDII缓冲液中(6毫摩尔浓度Nacl,6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸PH7.4,6毫摩尔浓度Mgcl2,6毫摩尔浓度β-巯基乙醇),在37℃下水解1.5小时,在6%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳分析,利用标准回收方法分离538碱基对DNA片段,包含有基因的最后175个氨基酸的编码序列,随后是翻译终止信号。
利用磷酸三脂法把lpp启动子区与人生长激素编码区结合一起,合成双链DNA片段,双链DNA片段(图5,110)有如下序列:
XbaI
5'CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTT-
'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
3'    TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAA-
CCCAACCATTCCCTTATCCAGGCTTTTTGACAACGCTATGCTCCG-
'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
GGGTTGGTAAGGGAATAGGTCCGAAAAACTGTTGCGATACGAGGC-
3′FnuDII
5′
利用识别磷酸三脂方法论制备片段,根据本法制得如下片段:
1)CTAGAGGGTAT
2)TAATAATGTTCC
3)CATTGGATGAT
4)GATGATAAGTTCC
5)CAACCATTCCC
6)TTATCCAGGC
7)TTTTTGACAACG
8)CTATGCTCCG
9)CATTATTAATACCCT
10)ATGGGAA
11)CTTATCATCATCATCCA
12)GGTTGGGAA
13)GGATAAGGGAAT
14)GTCAAAAAGCCT
15)CGGAGCATAGCGTT
利用以上制备的片段,按照如下步骤进行T4连接酶的催化连接反应。
a)在5′-磷酸化片段9存在下,利用T4连接酶把5′-末磷化片段1和5′-磷酸化片段2连接形成DNA双螺旋1(1979年,酶学方法68:109-151页Brown等人),利用在15%聚丙烯酰胺上制备凝胶电泳来分离双螺旋。
b)在5′-磷酸化片段11存在下利用T4连接酶把5′-磷酸化的片段3和5′-磷酸化的片段4连接形成DNA双螺旋2,利用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。
c)在5′-磷酸化的片段12和13存在下,利用T4连接酶把5′-磷酸化片段5和5′-磷酸化片段6连接形成DNA双螺旋3,利用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
d)在5′-磷酸化片段14和5′-末磷酸化片段15存在下,利用T4连接酶把5′-磷酸化片段7和5′-磷酸化片段8连接形成DNA双螺旋4,利用15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
e)然后,利用T4连接酶把DNA双螺旋2,3和4连接在一起形成DNA双螺旋5,利用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
f)在T4连接酶存在下,把5′-磷酸化片段10和DNA双螺旋5,添加到DNA双螺旋1中,利用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化得到的DNA双螺旋(图5,110)然后利用T4多核苷酸激酶和〔r-32P〕-ATP酶催磷酸化这种DNA双螺旋。根据如下确立的方法。
在24微升连接缓冲液中,利用1.5单位的T4DNA连接酶把0.1皮摩尔(0.4微克)的质粒PKEN021(图5,107)的XbaI-Bam-HI片段,0.025皮摩尔的合成DNA片段(图5,110)和0.3皮摩尔(0.08微克)的538碱基对片段(从图5,109)酶催化连接构成表达的质粒PNM702,在4℃下培育16小时,利用此混合物转化大肠杆菌JA221。如早期所述,在含有100微克/毫升氨苄青霉素的琼脂板上选择转化株,并培养成所需表示质粒的最佳源。
利用标准放射免疫测定法检测人生长激素的表达(1974年临床化学20:389-391页,Twoney等人),并确定每个细胞至少有200万个分子。
D.质粒PNM789的构建
质粒PNM702(图6,111)人生长激素的表达质粒被用来做为质粒表达Met-Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-bGH构建的起始材料。
Miller等人在1980年生物化学杂志255:7521-7524页中所描述的质粒PBP348(图6,112)被用来做为2DNA片段源。该片段包含有部分牛生长激素基因的编码序列,质粒在PBR322的PStI限制位点含有831碱基对无性系牛生长激素编码序列可以合成(Itakura等人1977年和Crea等人1978年)或者利用Goodman等人1979年介绍的现在例行方法,也可以从牛垂体分离出来的信使RNA获得。
人生长激素和牛生长激素的编码序列是非常相似的,并显示出很同一性,在生长激素的表达质粒构建中特别有用是与限制酶PvuII水解产生片段,所产生片段的大小,人生长激素中为497碱基对,牛生长激素中为494碱基对相应的限制位点,在两个序列中会出现相同的读码。
将10微克的PNM702(图6,111)与1单位的PvuII一起置于200微升PvuII限制缓冲液中(60毫摩尔浓度Nacl,6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH7.5,6毫摩尔浓度Mgcl2,6毫摩尔浓度β-巯基乙醇),在37℃下部分水解10分钟,在65℃下加热10分钟,终止反应后,用碱性磷酸酶处理DNA;在1%琼脂糖凝胶上分离片段,大小相当于具有497碱基对的PvuII片段缺失的线性DNA片段(图6,113)(轻微地,比单切割质粒要快)通常要进行切除,进行纯化,用于构建中间质粒(图6,114)。
在含有10单位PvuII的200微升PvuII缓冲液中,37℃下水解10微克质粒,1小时,以此制备质粒PBP348的494碱基对PvuII片段。在6%的聚丙烯酰胺凝胶上分离片段,并显现所需要的494碱基对片段(图6,112),进行纯化。
将0.2微克质粒PNM702的PvuII片段与0.05微克的494碱基对片段,置于20微升的含有2单位T4DNA连接酶的T4DNA连接酶缓冲液中,在4℃下反应16小时,以此构建中间质粒(图6,114)。转化之后,利用对氨苄青霉素的抗性选择转化株。通常靠分析494碱基对PvuII片段的存在和固有定向来分析质粒。选择具有494碱基对PvuII片段和440碱基对XbaI-SmaI片段的质粒,用于进一步构建。
将10微克中间质粒(图7,114)与1单位PvuII置于200微升PvuII缓冲液中,在37℃下水解5分钟,在65℃下加热10分钟后,将混合物在1%琼脂糖凝胶上展开,切割每个分子,回收只具有单一PvuII的线性DNA,并进行纯化。这种回收物(大约3微克)与5单位的XbaI进行充分水解,并用碱性磷酸酶处理,在1%的琼脂糖凝胶上展开片段,通常回收最大片段(在人和牛生长激素中XbaI与第一PvuII位点之间的缺失109碱基对片段(图7,115)。
牛生长激素的第一23氨基酸(69碱基对)到第一PvuII位点的DNA序列含有2个HPaII限制位点。第一个是来自编码序列的第一核苷酸的23碱基对,利用磷酸三脂法合成63碱基对片段(图7,116),这种片段相当于来自lpp核蛋白体结合位点中XbaI点的19碱基对序列,通过ATG翻译起始信号,随后是Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(24碱基对)的编码序列和牛生长激素的编码序列的20个核苷酸(从Phe到第一HPaII位点)片段有如下序列:
XbaI
5'    CTAGAGGGTATTAATAATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAG-
'''''''''''''''''''''''''''''''''''''''
3'    TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTC-
TTCCCAGCCATGTCCTTGTC    3'    HpaII
''''''''''''''''''''
AAGGGTCGGTACAGGAACAGGC    5'
在生产63碱基对片段中,制备了如下9种片段:
1)CTAGAGGGTAT
2)TAATAATGTTCC
3)CATTGGATGAT
4)GATGATAAGTTCC
5)CAGCCATGTCCTTGTC
6)ATGGGAACATTATTAATACCCT
7)TTATCATCATCATCCA
8)ATGGCTGGGAAC
9)CGGACAAGGAC
利用以制备的片段,按照如下步骤进行T4连接酶的催化连接反应:
a)在5′-磷酸化片段6存在下,利用T4连接酶把5′-未磷酸化片段1与5′-磷酸化片段2结合起来形成DNA双螺旋1,利用15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行纯化。
b)在5′-磷酸化片段7、8和5′-未磷酸化片段9存在下,用T4连接酶把5′-磷酸化片段3、4和5结合形成DNA双螺旋2,用15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化。
c)利用T4连接酶把双螺旋1和2结合形成DNA双螺旋(图7,116),利用15%聚丙烯酰胺凝胶电泳法纯化,然后按如下方法,利用T4多核苷酸激酶和〔r-32P〕ATP对这种DNA双螺旋进行酶催磷酸化。
从上述HPaII位点到PvuII位点的46碱基对的DNA片段,可以用合成法构建,或者由原始的PBP348质粒获得。因此,将100微克的质粒PBP348与50单位的PvuII一起置于400微升PvuII缓冲液中,在37℃水解2小时,用酚提取和乙醇沉淀后,DNA与50单位的PstI一起置于400微升的PstI缓冲液(50毫摩尔浓度Nacl,6毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH7.4,6毫摩尔浓度β-巯基乙醇)在37℃下溶解2小时,将DNA片段在6%聚丙烯酰胺凝胶上展开,回收含有所需要的碱基对序列的135碱基对片段,采用标准方法纯化,将 1/3 的回收DNA(等于33微克)与1单位的HPaII限制酶置于100微升HPaII缓冲液中(20毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH7.4,7毫摩尔浓度Mgcl2,6毫摩尔浓度β-巯基乙醇),在37℃下限制水解40分钟。在65℃下加热10分钟后,在5%的丙烯酰胺凝胶上(丙烯酰胺∶二丙烯酰胺为19∶1),沿着适当尺寸的标记处理DNA片段,利用标准方法纯化。由HPaII部分水解135碱基对片段(图7,112)所产生的46碱基对片段。
2/10 微克的质粒载体(图7,115)XbaI-PvuII片段,3.2皮摩尔的合成63碱基对片段(图7,116)和0.5皮摩尔的46碱基对片段(图7,112)一起置于10微升具有2单位T4DNA连接酶的连接缓冲液中在4℃下培育16小时,这种连接混合物被用来转变大肠杆菌JA221,利用对氨苄青霉素的抗性选择含有所需质粒PNM789的转化株。通常利用筛选494碱基对PvuII和109碱基对XbaI-PvuII两种片段的存在来鉴定质粒PNM789(图7,117)。
E.质粒PNM789B的最终构建
为完全转化牛生长激素,质粒PNM789(图8,117)需要一个氨基酸编码改变,靠去除质粒PNM789的28碱基对PvuII到BamHI片段来完成这一编码改变,用具有如下序列(图8,118)的合成双链片段代替。
5' CTGTGCCTTCTAG3'
'''''''''''''
3' GACACGGAAGATCCTAG5'
将10微克质粒PNM789与1单位的PvuII一起置于200微升PvuII缓冲液中,在37℃下水解5分钟,在65℃下加热10分钟后,用BamHI缓冲液稀释到300微升,再与10单位的BamHI在37℃下完全水解1小时,用5单位的碱性磷酸酶处理,在65℃下培育1小时,在1%琼脂糖凝胶上分离DNA片段,纯化,只切割质粒PNM789大小的DNA片段(图8,119)。取2/10微克的这种片段,在20微升连接酶缓冲液中用2单位的T4连接酶,与5皮摩尔的合成片段连接,在4℃的夜间进行这种连接,随着转化,分离一些质粒并筛选合适的PvuII(494碱基对)和XbaI-BamHI(628碱基对)片段,用上述片段的质粒构建所需要的质粒PNM789B(图8,120)。
例2
质粒PCZ101和大肠杆菌K12RV308/PCZ101的构建
A.质粒PIM-I′-A3的分离
按常规微生物操作步骤在25℃下,于含50微克/毫升卡那霉素的TY肉汤(1%胰化胨,0.5%酵母提取物,0.5%氯化钠,PH7.4)培养大肠杆菌K12/PIM-I′-A3(NRRL    B-15733)。培养后以1∶10的比例稀释到新制备的肉汤里,并在37℃下培养37小时。把0.5毫升的营养液转移到一个1.5毫升的EPPendorf管离心15分钟。除另有指示外,所有操作都是在室温下进行的。用一带很细尖咀的抽吸器把所得到的上清液仔细地去除,再把细胞小球悬浮于约100微升新制备的2毫克/毫升溶菌酶溶液里(2毫克/毫升),该溶液还含有50毫摩尔浓度的葡萄糖,10毫摩尔浓度的EDTA(二胺基四乙酸盐)和25毫摩尔浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液·Hcl,PH8。加入大约200微升的碱性SDS(十二烷基磺酸钠)溶液(0.2当量浓度的NaoH,1%SDS),并把管子轻轻地来回颠倒混合,然后于0℃下保存直到细胞完全溶解(大约5分钟)。下一步把大约150微升的3摩尔浓度的醋酸钠加进去,并把管内的东西来回颠倒混合数秒钟。
将离心管在0℃下至少保持60分钟,然后离心15分钟以使产生一种几乎是清彻的上清液。把这上清液转移到第二根离心管里,往管里加3倍体积的冷100%的乙醇。离子管在干冰乙醇上保持5分钟后,离心法把得到的沉淀收集起来(离心5分钟),上清液用吸取器去除。收集的细胞小球溶解于100微升的TE(10毫摩尔浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,Hcl,PH8.0,1毫摩尔浓度的EDTA)就构建了所要的PIM-I′-A3质粒DNA。
B.质粒PNM789B的XbaI-BamHI水解以及~0.6仟碱基XbaI-BamHI片段的产生。
每一种BamHI和XbaI限制酶都用10个单位来培养50微升Hi缓冲液中的大约5微克质粒PNM789B DNA,温度37℃,约1小时。在加入5微升3摩尔浓度的醋酸钠PH7.0以后,用2倍体积的100%乙醇沉淀DNA。把所要的DNA水解物溶解于100微升的TE缓冲液里,并于0℃储存待用。
常规制备的Hi缓冲液组成如下:
100毫摩尔浓度Nacl
20毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·Hcl,PH8
10毫摩尔浓度Mgcl2
5毫摩尔浓度β-巯基乙醇
C.质粒PIM-I′-A3的XbaI-BamHI水解
所要的水解基本按照例2B的方法来完成,除了质粒是PIM-I′-A3,而不是PNM789B。把所要的DNA溶解于100微升的TE缓冲液里并于0℃储存待用。
D.连接和转化
约1微克质粒PIM-I′-A3水解物,1微克质粒PNM789BXbaI-BamHI水解物,40微升水,5微升(5毫摩尔浓度)三磷酸腺甙(ATP),5微升水解混合物和5个单位的T4DNA连接酶于20℃下培养大约2小时。再于56℃下培养2分钟继之在冰上冷却,把得到的水解混合物用于转化,转化技术基本按照Wensink,1974年,细胞3:315,大肠杆菌K12    RV308在含50微克/毫升卡那霉素的TY培养基(1%胰化胨,0.5%酵母提取物,0.5%氯化钠,1.5%琼脂,PH7.4)培养的方法。细菌株大肠杆菌K12    RV308已寄存并有部分为The    Northern    Rigional    Rcsearch    Laboratory    Peoria    Illinois收集做为永久性培养,而由此就可能以入藏登记号NRRL    B-15624公开。
如同通常琼脂糖凝胶电泳(Maniatis    et    al,1982)以及其它实验所证明的,一些所得到的转化株仅含所要的~10.8仟碱基的质粒。这样的一种转化株在此命名为大肠杆菌K12    RV308/PCZ101被选择出来,在含适当抗生素TY的琼脂培养基上培养,然后用常规微生物技术培养。得到的细胞用基本按照例2A的方法去分离质粒PCZ101。
制备的水解混合物具有下列成份:
500毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液·Hcl,PH7.8
200毫摩尔浓度二硫苏糖醇
100毫摩尔浓度Mgcl2
例3
质粒PCZ1920和大肠杆菌K12    RV308/PCZ1920的构建
A.质粒PCZ101的~10.2仟碱基BamHI-XbaI片段的构建
所要的片段基本按例2B技术构建,除了所用的是质粒PCZ101,而不是质粒PNM789B。所要的~10.2仟碱基BamHI-HgiAI限制片段通常要分离并用琼脂糖凝胶电泳(Maniatis    et    al,1982)离析,然后溶解于约100毫升的TE缓冲液里并于0℃储藏待用。
B.质粒PCZ101~0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段的构建
所要的片段基本按例2B技术构建,除了分别使用质粒PCZ101和HgiAI限制酶,而不是质粒PNM789B和XbaI限制酶。所要的~0.6仟碱基BamHI-HgiAI限制片段通常要分离并用琼脂糖凝胶电泳(Maniatis    et    al,1982)离析,然后溶解于大约100微升TE缓冲液并于0℃储藏备用。
C.DNA联结子顺序的构建
5'    CTAGAGGGTATTAATA    ATG    AAA    GGG    AAT    TCT    ATG    GCC
''''''''''''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TCCCATAATTAT    TAC    TTT    CCC    TTA    AGA    TAC    CGG
T
TTC    CCA    GCC    ATG    TCC    TTG    TCC    GGC    CTG    TTT    GCC
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
AAG    GGT    CGG    TAC    AGG    AAC    AGG    CCG    GAC    AAA    CGG
AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '
TTG    CGA    C    5'
所要的联结子顺序通常基本上按照Itakura等人,1977年和Crea等人,1978年的技术加以改良的三磷酸脂法合成的。前面提到合成法在例1中还特别加以说明。
D.连接和转化
大约20微微摩尔例3C的DNA联结子,1微克质粒PCZ101的~10.2仟碱基BamHI,XbaI片段和0.5微克质粒PCZ101的~0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段连接起来,而得到的质粒基本按照例2D的技术去转化大肠杆菌K12    RV308。
如常规琼脂糖凝胶电泳(Maniatis    et    al.,1982)和别的实验所证明的,一些得到的转化株仅含所要的~10.8仟碱基片段。这样的转化株在此命名为大肠杆菌K12    RV308/PCZ1920被选择出来,在适当抗生素的琼脂培养基上培养,然后用常规微生物技术培养。在高水平上表达了上面提到的MET-LYS-GLY-ASPN-SER-MET-ALA-bGH衍生物,得到的细胞可用SDS凝胶电泳、放射免疫测定(RIA)和其它实验来证明。因为质粒PCZ1920有一热诱导失控复制子,所要的bGH衍生物最高表达出现在约37℃的培养温度上。
例4
质粒PJR1和大肠杆菌K12    RV308/PJR1的构建
所要的构建基本按照例3的技术进行,除用DNA联结子顺序
5'    CTAGAGGGTATTAATA    ATG    TTT    CCA    GCC    ATG    GCT    CTA
''''''''''''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TCCCATAATTAT    TAC    AAA    GGT    CGG    TAC    CGA    GAT
TCT    GGT    CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '
AGA    CCA    GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
代替例3C联结子的顺序。上述指明的联结子顺序基本按照Itakura等人,1977年和Crea等人,1978年的常规方法构建的。前面提到的合成法在例1中还特别加以说明。
在此命名为大肠杆菌K12 RV308/PJR1的所要的转化株,在含适当抗生素的TY琼脂培养基上培养,然后为了质粒PJR1以后的生产和分离再按常规培养。在高水平上表达的上述的MET-PHE-PRO-ALA-MET-ALA-R2牛生长激素衍生物,用SDS凝胶电泳、RIA和其它实验同样可以证明转化株。因为质粒PJR1有一热诱导失控复制子,所要的bGH衍生物最高表达在培养温度为37℃左右。
例5
质粒PHI7△4△1的构建
部分质粒PHI7△4△1的构建图解列于附图15。
A.质粒PBRHtrp的构建
质粒pGM1有中间缺失的△LE1413(Mio22ari,et    al.,1978,J.Bacteriology,1457-1466)的大肠杆菌色氨酸操纵子,因而表达一种包括trp前面的6个氨基酸和接近trp    E多肽后边第三个氨基酸(下文把有关的归于LE′)以及整个trp    D多肽的合成蛋白质,全部在trp启动因子-操纵因子体系控制之下。大肠杆菌已为Ameriean    Type    Culture    Collection(ATCC    No.31622)寄存,并且如果在下述的程序中使用,通常要把pGM1从菌株中去除。
大约20微克质粒用于能在5个位点上分解质粒的限制酶PVuII水解。若EcoRI为后者无性繁殖出一个含EcoRI位点的质粒,基因片段就和EcoRI联结子(一种由顺序:PCATGAATTCATG的自身互补低核苷酸组成)连接。20微克从pGM1获得的DNA片段在200微微摩尔的5′-磷酸化的合成低核苷酸PCATGAATTCATG存在下处理,并在20微升T4DNA连接酶缓冲液中(20毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲液,PH7.6,0.5毫升浓度ATP,10毫摩尔浓度Mgcl2,5毫摩尔浓度二硫苏糖醇),由10个单位的T4DNA连接酶于4℃下过夜。当把溶液在70℃时保温10分钟时,反应就停止了。联结子由于EcoRI水解而分解,而此时带上EcoRI终端的片段可用5%聚丙烯酰胺凝胶电泳(下文“PAGE”)分离。首先用3、8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓着色,后用此外光找出片段的确定位置,再从凝胶上切下要切的部分。通过以上三个步骤把三个最大的片段从凝胶上分离下来。对应每一凝胶的片段和300微升的0.1X TBE一块放到一个渗析袋里,并在0.1X TBE缓冲液(TBE缓冲液含:1升水里有10.8克三羟甲基氨基甲烷缓冲液碱,5.5克硼酸,0.09克Na2EDTA),电压为100伏下电泳1小时。从渗析袋里水溶液收集起来,用萃酚萃取,氯仿萃取,并使氯化钠的浓度为0.2摩尔。用乙醇沉淀后回收水中的DNA。带EcoRI粘性终端并含有启动因子/操纵因子的片段通过插入一个对四环素敏感的质粒而加以鉴别,插入启动因子/操纵因子上就使质粒对四环素有抗性。本例下文所叙述的所有DNA片段分离都是用PAGE法继之用上面叙述过的电洗提来完成的。
B.在trp启动因子/操纵因子控制下表达抗四环素的质粒PBRHtrp的构建和在上述“A”中分离的含trp启动因子/操纵因子DNA片段的鉴定和放大
质粒pBRH1(Rodriguez,et    al.,1979,Nucleic    Acids    Reseach    6,3267-3287    and    ATCC    No.37070)表达了对氨苄青霉素的抗性和抗四环素的基因,然而这些与启动因子没连系,也不表达那种抗性。含有该质粒的细胞具有对四环素的敏感性。通过在EcoRI位点上引入一种启动因子/操纵因子体系,质粒就表达了对四环素的抗性。
用EcoRI水解质粒pBRHI,再用苯酚萃取继之氯仿萃取而把酶去除,然后用乙醇沉淀并把DNA悬浮于水中。在分离反应混合物中,所得到的DNA和上述例5A中所得到的三种DNA片段连接起来并用上述方法中的T4DNA连接酶连接。存在于反应混合物中的DNA用标准技术(Hershfield et al.,1974,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 71:3455-3459)转化有反应潜能的大肠杆菌K12 294(NRRL B-15625),然后细菌在含20微克/毫升氨苄青霉素和5微克/毫升四环素的LB培养基培养(Maniatis et al.,1982)。
选择一些抗四环素的菌落并分离质粒DNA和命名为pBRHtrp。通过限制酶的分析证实了所要的片段的存在。质粒pBRHtrp表达了β-内酰胺酶(β-lactamase),它给予氨苄青霉素抗性,还含有包括trp启动因子/操纵因子的DNA片段。DNA片段也可为第一个蛋白质编码(命名为LE′),它包括由trp前面6个氨基酸以及接近trp    E多肽后边第三个氨基酸连接成的合成物,第二个蛋白质(命名为D′),相应接近前半个trpD多肽,而第三个蛋白质为四环素抗性基因编码。
C.质粒pSOM7△2的构建
用EcoRI限制酶水解质粒pBRHtrp,而用PAGE法和电洗提法分离所得到的片段,该片段与EcoRI水解的质粒pSOM11连接(Itakura et al.,1977,SCi.198:1056,U.S.Patent No.4,366,246,G.B.Patent publication No.2,007,676A)。混合物用T4DNA连接酶水解并按前述的把得到的DNA转化成大肠杆菌K12 294。转化株细菌在含氨苄青霉素培养基上选择出来,而得到的抗氨苄青霉素菌落经菌落的杂化作用(Grueustein et al.,1975,proc.Nat.Acad.Sci.USA 72:3951-3965)而被筛选。从pBRHtrp分离然后用32p放射性标记含trp启动因子/操纵因子的片段当做上述方法的一个样品。选择经菌落杂化反应而呈现阳性的菌落。质粒DNA的分离和插入的质粒定位都用酶BglII和BamHI两次水解的限制分析来测定。含有带适当定位的trp启动因子/操纵因子片段的质粒菌落在10微克/毫升LB培养基上能繁殖。得到的质粒命名为pSOM7△2并用于下述的连续构建。
D.质粒ptrp24的构建
1、带BglII和EcoRI限制位点分别在密码链的5′和3′终端接近LE′多肽基因片段密码的构建
质粒pSOM7△2是HindIII水解继之在选择的条件下用入(lambda)核酸外切酶(一种5′到3′核酸外切酶)水解以便在LE′编码范围内不水解BglII限制位点。大约20微克的水解HindIII的pSOM7△2溶于缓冲液中(20毫摩尔浓度的甘氨酸缓冲液,PH9.6,1毫摩尔浓度的Mgcl2,1毫摩尔浓度的β-巯基乙醇)。得到的混合物用5个单位的入核酸外切酶于室温下处理60分钟。所获得的反应混合物用苯酚萃取,氯仿萃取,乙醇沉淀。
为了在LE′基因片段终端创建一个EcoRI残基,起始物32pCCTGTGCATGAT是用改良的三磷酸脂法(Crea et al.,1978)合成的并且把从入核酸外切酶水解得到的LE′基因片段的单链终端杂化。杂化的完成是经20微升水中溶有的20微克入核酸外切酶处理HindIII质粒pSOM7△2的水解产物与上述5′磷酸化的6微升溶浓中的80微微摩尔的低核苷酸相连。把合成片段LE′密码顺序的3′终端杂化而留下用dATp、dTTP、dGTP和dCTP的Klenow聚合酶I填满的LE′片段单链位置。Klenow聚合酶I是DNA聚合酶I水解蛋白分解得到的片段。它含有5′→3′聚合活化性,3′→5′外苷酸活化性,而母体酶没有5′→3′外核苷酸活化性(Kornberg,1974,W.H.Freeman and Co.,SFO,98)。
反应混合物加热到50℃并使其缓慢冷却到10℃,加4微升Klenow酶。室温下培养15分钟,继之37℃下培养30分钟。加0.25摩尔EDTA反应就终止。反应产物用苯酚萃取,氯仿萃取,再用乙醇沉淀。随后DNA用限制酶BglII分解而片段用pAGE法分离。表达了期望长度为470碱基对的32p标记片段的凝胶上得到一个放射自显影谱,片段是用电洗提法回收的。这个片段LE′(d)有一个BglII末端和与开始的起始物一致的钝化终端。
2、质粒pThα1的构建
通过把合成的基因插入胸腺素α1的质粒构建pThα1质粒。胸腺素α1的合成密码DNA包括合成法和后来的16种低核苷酸(T1-直到T16)的连接。这些已在附图11里用双箭头指出。在N-末端上插入一个符号要求的ATG并且被命名的5′终端用单链的粘性末端,以便连结用EcoR1和BamHI分解的质粒有利。当容易评价时,基因中心的BglII位点就可有助于分析重组的质粒。
低脱氧核糖核苷酸(Oligodeoxyribonucleotides)T1到T16用Itakura等人,1977年和Crea等人,1979年的改良三磷酸脂法合成的。各种低脱氧核糖核苷酸列于表1。
表1
合成胸腺素α1基因的低核苷酸
HPLC分析
化合物    顺序    长度    保留时间
(分)
T1    A-A-T-T-C-A-T-G-T-C    10    17.4
T2    T-G-A-T-G-C-T-G-C-T-G-T-T-G-A    15    24.3
T3    T-A-C-T-T-C-T-T-C-T-G-A    12    20.3
T4    G-A-T-T-A-C-T-A-C-T-A-A-A    13    22.0
T5    G-C-A-G-C-A-T-C-A-G-A-C-A-T-G    15    24.8
T6    G-A-A-G-T-A-T-C-A-A-C-A    12    20.1
T7    A-G-T-A-A-T-C-T-C-A-G-A-A    13    22.6
T8    A-A-G-A-T-C-T-T-T-A-G-T    12    20.2
T9    G-A-T-C-T-T-A-A-G-G-A-G    12    20.4
T10    A-A-G-A-A-G-G-A-A-G-T-T    12    21.1
T11    G-T-C-G-A-A-G-A-G-G-C-T    12    20.5
T12    G-A-G-A-A-C-T-A-A-T-A-G    12    20.4
T13    C-T-T-C-T-T-C-T-C-C-T-T    12    19.9
T14    T-T-C-G-A-C-A-A-C-T-T-C    12    20.5
T15    G-T-T-C-T-C-A-G-C-C-T-C    12    20.2
T16    G-A-T-C-C-T-A-T-T-A    10    17.2
室温
上述合成方法具有下列如概括在附图12中的T15片段的合成法的特征。图中用数字指出了用于合成T15的各种核苷酸片段。所用缩写如下:TPSTe,2,4,6-三异丙基苯磺酰四唑;BSA,苯磺酸;TLC,薄层分析法;HPLC,高效液相色谱法;DMP,4,4′-二甲氧基三苯甲基;CE,2-氰乙基;R,P-氯代苯基;BZ,苯甲酰基;An甲氧苯酰基;iBu,异丁基;Py,吡啶;AcoH,醋酸;Et2N,三乙胺。
通过用2%BSA的7∶3(体积比)氯仿/甲醇(各为10和20毫升)于0℃下处理10分钟就可使全保护的三脱氧核糖核苷酸4(85毫克,0.05毫摩尔)和2(180毫克,0.1毫摩尔)在5′羟基上解闭。反应在加饱和碳酸氢胺水溶液(2毫升)后就终止了。用氯仿萃取(25毫升)并用水(2×10毫升)洗涤。干燥有机相(硫酸镁),浓缩成很小的体积(大约5毫升)并加石油醚(35-60℃馏份)沉淀。用离心法收集无色的沉淀并在真空干燥器里干燥而分别得到6和8。每一种产物在薄层分析色谱上都显示出质量的纯净(Merck    60    F254,氯仿/甲醇,9∶1)。
采用三乙胺/吡啶/水(1∶3∶1,体积比,10毫升)在室温下处理25分钟就可把三聚体1和3(270毫克,0.15毫摩尔;145毫克,0.075毫摩尔)转化成它们的二磷酸脂(5和7)。试剂用旋转蒸发法去除而剩余物用无水吡啶(3×10毫升)反复蒸发而干燥。三聚体8(0.05毫摩尔)和7在无水吡啶(3毫升)中和TPSTe(50毫克,0.15毫摩尔)连接而反应混合物在室温真空条件下两小时就全部析出来了。薄层层析法分析证明有95%的三聚体已转换成六聚体(用10%硫酸水溶液喷雾并在60℃下保温可看得见检测的DMT基团)。水(1毫升)的加入可抑制反应并在减压下并发掉溶剂。用甲苯共蒸发法除去吡啶以后,如同上述对待三聚体4和2用2%BSA(8毫升)就可使六聚体在5′位点上解闭。产物(10)在一硅胶柱(Merck    60H,3.5×5Cm)用氯仿/甲醇(98∶2到95∶5,体积比)分段梯度淋洗产物(10)就可提纯。含产物10的馏份蒸发至干。同样,三聚体5偶联成6而全保护的产物可直接在硅胶上提纯。用三乙胺/吡啶/水如同上述得到片段4那样,就可使后面的化合物在3′终端上解闭。
最后,六聚体9和10在无水吡啶中(2毫升)用TPSTe(75毫克,0.225毫摩尔)做为缩合剂就可偶联。完成后(4小时,室温)旋转蒸发混合物而剩余物在硅胶上层析。用石油醚沉淀就可得到产物11(160毫克)并在能在薄层层析色谱上显示质纯。一部份化合物11(20毫克)在吡啶里(0.5毫升)用浓氨水(7毫升,8小时,60℃)处理就可完全解闭并且随后要在80%的醋酸里(15分钟,室温)处理。在醋酸蒸掉以后,把固体剩余物溶解在4%氢氧化胺的水溶液里(体积比,4毫升),用乙醚萃取(3×2毫升)。水相浓缩至1-2毫升并用高效液相色谱提纯一部分产物12。相应于主色谱峰的各馏份集中起来(Ca.2A254单位)并浓缩至5毫升左右。在生物-凝胶P-2(1.5×100厘米)柱上用20%含水乙醇洗脱最终产物12就可脱盐。还原至干并再悬浮于水中(200微升)以便能得到A254=10的溶液。12顺序可用两个-二维因次顺序分析确定。
用以前已详加叙述的生长激素抑制因子(Itakura et al.,1977),胰岛素(Goeddel et al.,1977),生长激素(Goeddel et al.,1979,Nature 281:544)的方法从16种合成低-核苷酸构成完整的胸腺素α1基因,微克量级的低核苷酸T2-直到T15在T4聚核苷酸致活酶(Goeddel et al.,1979)存在下,用〔r-P32〕-ATP(New Englaud Nuclear)可使磷酸化定量,得到接近1居里/毫摩尔的特殊活化性。用20%聚丙烯酰胺/7摩尔浓度脲的凝胶电泳提纯放射性标记的片段。而洗提片段的顺序是采用部分蛇毒液的水解液两个-二维因次电泳/同色谱法就可加以证实(Jay et al.,1974,Nucleic Acids Res.1:331)。为了使在以后的水解过程中把不希望的聚合反应降到最低限度,就省去了片段T1和T16的磷酸化。这些低核苷酸(每一种2微克)构建在四种片段的四种基因里(见附图13),用公开方法的(Goeddel et al.,1979)T4DNA连接酶。反应产物用凝胶电泳法在7摩尔浓度的脲(Maxam and Gilhert,1977,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 71:3455)15%聚丙烯酰胺凝胶上提纯。四种分离过的产物同时连接并用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳解析反应混合物。电洗提大小在胸腺素α1基因(90-105碱基对)范围内DNA。
用BamHI和EcoRI限制核酸内切酶处理质粒pBR322(0.5微克)并用聚丙烯酰胺凝胶电泳将片段分离。用电洗提法把大的片段回收并随后连接到构成的DNA(Goeddel    et    al.,Nature    281:544,1979)。这个混合物用于转化大肠杆菌K12    294。把5%的转化混合物在含20微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基上培养。由于插入四环素抗性基因,所以得到的四种抗氨苄青霉素菌落对四环素是敏感的。这四种菌落的质粒分析证明在每一种情况下,命名为pThα1质粒含有(a)pBR322本身没发现BglII位点,这样如图13就证明表达胸腺素α1基因是存在,(b)通过BamHI/EcoRI分解能产生接近105碱基对的片段。质粒pThα1的构建路线(没画比例)附图13有介绍并用黑点指出5′-磷酸脂基因。
3、处理过的pThα1和LE′(d)片段的反应
质粒pThα1含有确定的抗氨苄青霉素性的基因和确定在其5′编码链终端到EcoRI位点、3′终端到BamHI位点无性繁殖的胸腺素α1的构建基因。胸腺素基因同样含有BglII位点。为了创造一个质粒能接收上述制备的LE′(d)片段,pTHα1是EcoRI水解后继之dTTP和dATP与Klenow聚合酶反应钝化了EcoRI残基。得到的BglII水解创造了一个粘性BglII残基和一个钝化终端的线型DNA片段。为了形成质粒ptrp24,在T4连接酶存在下通过和含有一个BglII粘性终端和一钝化终端LE′(d)片段的反应,得到的产物能闭路循环。这样做,在粘性终端水解发生的位置上就能再创造一个EcoRI位点。
E.质粒pSoM7△2△4的构建
用BglII和EcoRI连续水解ptrp24,继之经pAGE法和电洗提法就得到了一种片段具有带一个BglII粘性终端和一个接近其3′编码未端的EcoRI粘性终端的LE′(d)多肽密码子。LE′(d)片段能被无性繁殖成质粒pSoM7△2的BglII位点,从而生成一种LE′多肽/生长激素释放抑制因子表达的合成蛋白质,它是在色氨酸启动因子/操纵因子的控制之下。为了这样做就需要(1)为了分解色氨酸启动因子/操纵因子EcoRI位点的终端,把pSoM7△2的部分EcoRI水解。(2)为了适当保存译读密码的密码子而要再创造一个EcoRI分解位点,要适当选择起始物顺序。
这样一来,把16微克的质粒pSoM7△2稀释到200微升含20毫摩尔浓度的三羟甲基氨基缓冲液,PH7.5,5毫摩尔浓度的Mgcl2,0.02%Np40洗涤剂,和100毫摩尔浓度的Nacl缓冲溶液里,并用0.5个单位的EcoRI处理。37℃15分钟后,反应混合物用苯酚萃取,氯仿萃取,乙醇沉淀,并继之用BglII水解。所得到的较大的片段可用pAGE法再用电洗提法分离。这种片段色含着LE′多肽邻近终端的密码子“LE′(P)”,即BglII位点以上的。为了生成质粒pSOM7△2△4,在T4连接酶的存在下把这种片段连接到上述的LE′(d)片段上。在转化成大肠杆菌K12 294时,有效地生成一种由完全重建在色氨酸启动因子/操纵因子控制下的多肽和生长激素释放抑制因子组成的合成蛋白质。
F.具有3′终端的pStI残基和结合一个确定抗四环素基因的5′终端BglII残基的线型DNA的构建
质粒pBR322是HindIII水解的并且用SI核酸酶水解掉突出的HindIII终端。SI核酸酶的水解包括10微克HindIII水解的pBR322在30微升SI缓冲液里(0.3摩尔浓度Nacl,1毫摩尔浓度的Zncl2,25毫摩尔浓度的醋酸钠,PH4.5),用300单位的SI核酸酶在15℃下处理30分钟。加入1微升30X核酸酶终止溶液(0.8摩尔浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液碱,50毫摩尔浓度的EDTA)反应就终止了。混合物用苯酚萃取,氯仿萃取,乙醇沉淀,然后如同前述的水解EcoRI。从pAGE法继之用电洗提法获得的片段有一个EcoRI粒性终端和一个钝化终端,这些终端的编码链以核苷酸的胸苷开始。以胸苷开始的SI水解的HindIII残基能和Klenow聚合酶I处理的BglII残基连接以致于在连接时重建BglII限制位点。
此外,用例5制备的质粒pSOM7△2是BglII水解的并用全部4个脱氧核苷酸三磷酸脂的Klenow聚合酶Ⅰ处理就能把得到的BglII粘性终端制成双链。得到的产物EcoRI分解,继之用pAGE法和电洗提小片段,就产生了一种含有色氨酸启动因子/操纵因子的线型DNA片段和从BglII位点(“LE′(P)”)向上LE′“近端”顺序的密码子。产物有一个EcoRI终端和一个由于填满BglII位点而得到的钝化终端。然而,通过把粘性终端连接到上述SI-水解的HindIII片段的粘性终端上而重建了BglII位点。这样,在T4DNA连接酶存在下把两个片段连接起来经有反应潜能的大肠杆菌K12 294细胞的转化而生成能繁殖的闭路循环的质粒pHKY10。选择连接着重新结合的质粒pHKY10的抗四环素细胞并萃取质粒DNA。用BglII和pstI水解,继之用pAGE法分离而大片段用电洗提法处理,产生了一种所要的具有pstI和BglII粘性终端的DNA线型片。这种DNA片段,因为是从PHKY10产生的,含有复制原点。此外,在质粒pHI7△4△1的构建中DNA片段是一个有用的组份,即为trp LE′多肽合成蛋白质编码,也为受trp启动因子/操纵因子控制的四环素抗性编码。
G.具有trp启动因子/操纵因子线型DNA的构建
用例5E制成的质粒pSOM7△2△4经部分EcoRI水解继之pstI水解。得到的片段含有trp启动因子/操纵因子在用pAGE法分离后用电洗提法离析。部分EcoRI水解对于获得一种片段能在邻近生长激素释放抑制因子基因的5′终端分解而不在氢苄青霉素抗性基因和trp启动因子/操纵因子之间存在的EcoRI位点分解是必要的。切下氨苄青霉素抗性基因的pstI能在用上述例5F所产生的最终pHKY10线型DNA衍生物连接时复位,氨苄青霉素抗性就失去了。
H.胰岛素原32N-未端氨基酸合成基因编码的制备
表2列出一系列18种低核苷酸制备的第一步在于构建胰岛素原前面32种氨基酸基因密码。最终构建的整个基因核苷酸顺序列于图14。
表2
合成人胰岛素原的低核苷酸
化合物    顺序
H1    AATTCATGTT
H2    CGTCAATCAGCA
H3    CCTTTGTGGTTC
H4    TCACCTCGTTGA
H5    TTGACGAACATG
H6    CAAAGGTGCTGA
H7    AGGTGAGAACCA
H8    AGCTTCAACG
B1    AGCTTTGTAC
B2    CTTGTTTGCGGT
B3    GAACGTGGTTTC
B4    TTCTACACTCCT
B5′    AAGACTCGCC
B6    AACAAGGTACAA
B7    ACGTTCACCGCA
B8    GTAGAAGAAACC
B9    AGTCTTAGGAGT
B10′    GATCCGGCG
已证明骨架间的合成核苷酸并在图14中该物下面划线。用常规方法(Crea    et    al.,1978,J.Biol.Chem.250:4592    and    Itakura    et    al.,1975,J.Am.Chem.Soc.97:7327)合成了这些低核苷酸。一些低核苷酸被用于以前Crea等人,1978年和Goeddel等人,1979年所说过的人胰岛素B链基因的构建。两种低核苷酸(B5′和B10′)连接HPaII和末端BamHI以及EcoRI限制位点。末端位点特别被用于无性繁殖上。
8种低核苷酸H1-H8以前用于构建左半边人胰岛素B链基因(Goeddel et al.,1979),它们含有B链基因1-13的氨基酸和别的N-末端蛋氨酸密码顺序。右半个B链基因是由低核苷酸B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9、和B10基本按照Goeddel等人,1979年的技术用T4DNA连接酶连接而成。得到的基因片段密码适于人胰岛素B链14-30个氨基酸单位和桥链第一个精氨酸。一个HPaII限制位点连接到用相同的译码基因片段并做为人胰岛素HPaII位点的位置。连接的基因片段用聚丙烯酰胺凝胶电泳法净化后和最大DNA带的洗提之后,就把片段插到HindIII-BamHI分解的质粒pBR322。命名为得到的质粒为PB3用转化法插到大肠杆菌K12 299。发现质粒具有对抗菌来氨苄青霉素和四环素抗性是因为它含有所要的核苷酸顺序。
两种片段,一种是pB3的58碱基对的HindIII-BamHI片段,一种是PBH1(Goeddel等人公开,1979)46碱基对的EcoRI-HindIII片段,连接起来产生了一种具有EcoRI末端的质粒。通常把这个片段连接到EcoRI和BamHI限制质粒pBR322上,而得到的质粒命名为pIB3无性繁殖成大肠杆菌K12    294。常规放大和分离后,质粒pIB3用EcoRI和HPaII水解产生了一种合成基因片段(片段1,图15),它对蛋氨酸前面的N-末端胰岛素原氨基酸编码。合成基因用常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。
I.50C-末端人胰岛素原氨基酸CDNA编码的分离
用于获得所要的CDNA图介列于附图16。照此,合成了DNA顺序PCCGGATCCGGTTT18T,它既含有一个BamHI识别顺序还含有一个接近20残基3′胸苷酸系统,合成了的DNA顺序用于CDNA合成的起始AMV反向转录酶。起始物的制备是用末端脱氧核苷酸转移酶(En20 Biochem,200个单位),它带有一个微摩尔BamHI+核苷酸在0.6毫升1.5×10-4微摩尔TTP反应物体积里。反应是在Chang等人,1978年,Nature 275:617的缓冲液体系中,37℃下,反应1小时。
人胰岛素瘤组织是由Institute für Diabetesforschung.Muenchen,West Germany提供的。该技术领域里对此熟练程度使人可以理解成人胰岛素瘤组织真能获得,并且也能从医药团体组织的多种渠道得到。一种人胰岛素瘤组织mRNA(2.5微克)基本是按照Ullrich等人,1977年,Sciencl 196:1313的方法分离然后基本按照Wickens等人,1978年,J.Biol.Chem.253:2483的技术转化成双链的CDNA。这样,80微升反应体积里含15毫摩尔浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液·Hcl,PH8.2,42℃),21毫摩尔浓度的Kcl,8毫摩尔浓度的Mgcl2,30毫摩尔浓度的β-巯基乙醇,2毫摩尔浓度的起始物dCCGGATCCGGTT18T,和1毫摩尔浓度的dNTPS在0℃下予培养。加入AMV反向转录酶以后,混合物在42℃下培养15分钟。生成物RNA/DNA用常规方法使其变性。
在含25毫摩尔浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液·Hcl,PH8.3,35毫摩尔浓度Kcl,4毫摩尔浓度的Mgcl2,15毫摩尔浓度的β-巯基乙醇,1毫摩尔浓度的dNTP3和9个单位的Klenow聚合酶I的150微升的反应体积里,合成了互补的CDNA链。混合物先在15℃下培养90分钟继之4℃下培养15小时。SI核酸酶水解基本按照Wickens等人,1978年的技术,用1000个单位的SI核酸酶(Miles    Laboratories,Elkhart.Indiana)于37℃下2小时完成。双链的CDNA(0.37微克)经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳而大于500碱基对DNA片段就被洗脱下来。基本按照Maizel,1971年,Meth.Virol.5:180的方法用未端脱氧核苷酸转移酶把低脱氧胞苷酸加到片段3′终端上。dc脱尾的CDNA片段接着要退火成pBR322,而pBR322首先要用PstI限制酶水解,然后用末端脱氧核苷酸转移酶的脱氧与氨酸接尾。得到的质粒用于转化大肠杆菌K12    294,并且将得到的细胞在LB和TET培养基上培养。分离对四环素有抗性而对氨苄青霉素敏感的菌落,还筛选出有3个PstI限制位点的质粒。这样的限制样品可代表胰岛素原(Sures等人,1980年,Sciencl    208:57)的基因。命名为pHI104的质粒含有1个600碱基对的插入物时,就能得到予期的PstI限制样品并能容纳在CDNA制备过程中引入3′聚合A体和聚合GC体之间的BamHI位点。一些插入物的核苷酸顺序列于图14。
J.人胰岛素原的基因编码的集合
附图中的图15表示了人胰岛素原的基因编码的集合图。
利用如上所述的限制核酸内切酶EcoRI和HpaII从50微克的质粒PIB3中回收胰岛素原的第31氨基酸的合成基因片段编码,图15中片段1,这种片段在前胰岛素原的“前序列”的空间处也含有蛋氨酸的ATG序列。
首先用BamHI,然后用HPaII限制酶处理,从40微克的质粒PHI104回收氨基酸32-86的cDNA基因片段编码,以及翻译终止信号和mRNA的3′未翻译区,利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离这两个片段,随后电洗提。在20微升连接酶缓冲液中,在4℃下用T4DNA连接酶处理24小时,使基因片段连接。用50微升水稀释这种混合物,通常用酚或氯仿提取,然后用乙醇沉淀。
用BamHI和EcoRI限制酶处所得到的DNA,以再生这些位点和去除基因多聚体。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离所集合起来的胰岛素原基因,并水解(用T4DNA连接酶)成质粒pBR322水解后的Eco-RI和BamHI,所产生的DNA被用来转化大肠杆菌K12 294。然后,筛选出对四环素有敏感性和对氨苄青霉素有抗性的菌落,从这些菌落中分离出来的质粒PHI3含有所需要的胰岛素基因,随后利用分析核苷酸的序列以确定它的特征。
K.含有人胰岛素原嵌合蛋白质的表达质粒的构建
完整的人胰岛素原基因,包括N-末端蛋氨酸密码的密码子,它是用ECORI和BamHI限制酶进行处理从质粒PHI3中回收。所要求的片段用凝胶电泳纯化,然后(用T4    DNA连接酶)连接到质粒PSOM7△2△4    PSTI-ECORI部分水解物(制备如例5G),和质粒PHKY10(制备如例5F)的较大的psTI-BglII片段上。因此,约1微克具有ECORI和BamHI末端的完整的人胰岛素基因,4微克的PSOM7△2△4(部分的)PSTI-ECDRI片段,和约1微克的PHKY10的PStI-BglII片段,在4℃下,用连结酶缓冲溶液,24小时,上述两种片段连接。这种连接的混合物用于转化大肠杆菌K12    294,选择生长在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上的菌落,发现含有所要求的质粒PH17△4△1,并表达了予期分子量的trp    LE′-人胰岛素原熔合的蛋白质,上述蛋白质表达的质粒PH17△4△1,其特征完全可以就其合并基因和载体的DNA序列和限止点来表示。质粒PH17△4△1在图15中做了描述,因为它对氨苄青霉素的修复和对四环素的抗性从而能容易地被选择。
实施例6
质粒PNM608和大肠杆菌K12    RV308/PNM608的构建:
A、质粒PH17△4△1的~253碱基对的EcoRI-HPaI的构建:
约5微克的质粒PH17△4△1DNA,10微升(10×)反应缓冲液,80微升水和5微升(5单位)的HPaI限制酶,在37℃下,培养约1小时,在70℃下培养5分钟终止反应,混合液在冰上冷却后,加入约12微升的1克分子浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH7.2,7微升水和1微升(10单位)的EcoRI限制酶,得到的混合物首先在37℃下培养,1小时,然后在70℃下培养5分钟,随后在冰上冷却,得到的DNA甲酚或氯仿∶异戊醇(24∶1)来提取,然后用乙醇沉淀,要求的~523碱基对ECORI-HPaI片段用常规的聚丙烯酰氨凝胶电泳分离,用电洗提回收,用ETOH沉淀,然后在约10微升的缓冲液中溶解,贮藏在零度,以备将来应用。
HPaI限制酶反应缓冲液(10×),其制备包括如下组成:
100毫摩尔浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液,盐酸,PH7。
100毫摩尔浓度的β-巯基乙醇。
200毫摩尔浓度的Kcl
b.质粒PH17△4△1的~34碱基对HPaI-TagI片段的构建:
约20微克的DNA质粒PHI7△4△1,用32微升(5×)ECORI反应缓冲液,124微升水和4微升ECORI限制酶(20单位)在37℃下培养约1小时,(在70℃)培养5分钟终止反应,得到的862碱基对ECORI片段用6%聚丙烯酰氨凝胶电泳分离,随后电洗提,并用乙醇沉淀,然后,将片段溶解到约100微升含有16单位HPaI限止酶的HPaI缓冲液中。在37℃放置1.5小时后,加入7.5单位的TagI限制酶,继续培养1.5小时,产生的片段用7 1/2 %的聚丙烯酰氨凝胶电泳分离,这种所要求的~34碱基对HPaI-TagI片段用电洗提回收,并用乙醇沉淀,然后,溶解在5微升的TE缓冲液中。
EcoI限制酶反应缓冲液(5×)制备具下列成分:
250毫摩尔浓度的Nacl
500毫摩尔浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH7.2
25毫摩尔浓度的Mgcl2
30毫摩尔浓度的β-巯基乙醇
C.质粒PBR322的EcoRI-ClaI水解物
约5微克的DNA质粒PBR322,10微升的ClaI反应混合物,77.5微升水和7.5微升(15单位)的ClaI限制酶在37℃培养1小时,在70℃培养5分钟反应终止,混合物在冰上冷却后,添加约12.5微升的1克分子三羟基甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH7.2,6.25微升1克分Nacl,2.5微升0.1克分子Mgcl2,和1微升(10单位)的ECORI限制酶,得到的混合物首先在37℃培养1小时,然后在70℃培养5分钟,随后在冰上冷却,得到的DNA用1%琼脂酶凝胶电泳分离,大的片段用洗提回收,用乙醇沉淀,然后,在约20微升的TE缓冲液中溶解,并在0℃贮存,以备将来使用。
ClaI限制酶混合反应物(10×),制备包括下列成分:
100毫摩尔浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸,PH7.4
100毫摩尔浓度的Mgcl2
60毫摩尔浓度的β-巯基乙醇
D.连接和转化:
约0.2μg(同例6A)的~253碱基对EcoRI-HPaI片段,0.5微克例6中的HPaI-TagI片段和0.1微克的例6C中的EcoRI-ClaI水解液进行连接,一般用于转化大肠杆菌K12    RV308,基本上根据例2D所指导的方法。
一些产生的转化株,用常规的琼脂酶凝胶电泳法(Maniatis等1982)和其它实验法证明只含有~4.6仟碱基质粒。这种转化株在这里被命名为大肠杆菌ECOli    K12    RV308/PNM608进行选择放在含有适量的生物抗性的琼脂培养基上,用常规的微生物技术培养,质粒PNM608包括质粒PH17△4△1的~28.7碱基对ECORI-ClaI(TagI)片段,并是最好的来源。
实施例7
质粒CPz112和大肠杆菌K12    RV308/PCZ112的构建:
A.质粒PNM608的ECORI-ClaI的水解和0.288仟碱基ECORI-TagI片段的产生。(和质粒PH17△4△1的~0.288仟碱基ECORI-TagI片段同相)。
约5微克的质粒PNM608DNA与10单位的ECORI或ClaI限制酶置于50微升盐缓冲液中,在37℃,培养约1小时,在添加5微升的3摩尔浓度的醋酸钠,PH7.4,然后用3体积的100%乙醇沉淀DNA将这种所要求的DNA水解液溶解在100微升的TE缓冲液中,贮藏在0℃,以备将来应用。
盐缓冲液的制备,包括下列成分:
50毫摩尔浓度Nacl
100毫摩尔浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液·盐酸。
6毫摩尔浓度的Mgcl2
2毫摩尔浓度的β-巯基乙醇
B.DNA联结子序列的构建:
5'    CGACC    ATG    GAT    GAT    AAG    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT    CTG
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TGG    TAC    CTA    CTA    TTC    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA    GAC
TCC    GGC    CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''''
AGG    CCG    GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
所要求的联结子序列通常用改良的磷酸三脂的方法合成,大体上根据Itakura等1977和Crea等1978的技术,上述合成方法在例1中也做了特别说明。
C.连接和转化:
将约20皮摩尔的例7B的DNA联结子,1微克例7A中的PNM608水解物,0.5微克的质粒CPZ101的~10.2仟碱基BamHI-ECORI片段(根据例2B的指导方法制备除了ECORI限制酶和适当缓冲液外,一般不用XbaI限制酶和缓冲液),和1微克例3B的质粒PCZ101的~0.6仟碱基BamHI-HgiAI片段连接,基本根据例2D中指导的方法得到的质粒,用于转化大肠杆菌K12    RV308。
一些产生的转化株,通常用琼脂酶凝胶电泳法(Maniatis等1982年)和其它实验来证明。仅含有所要求的~10.8仟碱基质粒1这样的转化株在这里被命名为大肠杆菌K12    RV308/PCZ112,放在含有适当抗生素的TY琼脂培养基上进行选择,用常规微生物技术进行培养,用SDS凝胶电泳法,放射免疫测定和其它实验证明了产生的细胞高水平地表达了上述MET-ASP-ASP-LYS-bGH的衍生物,因为质粒PCZ112含有一种用热诱导的失控复制子,所要求的bGH衍生物的最大表达发生在大约37℃的培养条件下。
实施例8
质粒PAT1和肠杆菌K12    RV308/-PAI1的构建:
所要求的结构基本上根据例7的指导构建,除了DNA联结子的序列用下列序列代替例7中联结子的序列外,
5'    CGACA    ATG    TTC    CCA    GCT    ATG    TCT    CTA    TCT    GGT
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TGT    TAC    AAG    GGT    CGA    TAC    AGA    GAT    AGA    CCA
CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '
GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
上述特殊的联结子的序列的构建,基本上根据Itakura等1977年和Crea    1978年描述的过程,上述这种合成方法在例1中也做了特别说明。
这种所要求的转化株在这里被命名为大肠杆菌K12    RV308/PAT1,置于含有适当的抗生素的TY琼脂培养基上,然后,产物再用常规法培养,分离质粒PAT1,用SDS凝胶电泳法,放射免疫测定和其它实验来证明转化株高水平地表达了上述MET-bGH衍生物,因为质粒PAT1含有热诱导失控复制子,所需要的bGH衍生物的最大表达发生在约37℃的培养条件下。
实施例9
质粒pASP1和大肠杆菌K12    RV308/PASP1的构建:
所要求的结构基本上根据例7指导构建,除了以下DNA序列代替了例7中联结子的序列外。
5'    CGACC    ATG    GAT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT    CTG    TCC    GGC
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
TGG    TAC    CTA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGC    GAC    AGG    CCG
CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '
GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
上述特殊的联结子的构建基本上根据常规的Itakura等1977年Crea等1978年描述的过程。上述的合成方法也在例1中做了特别说明。
所要求的转化株在这里命名为大肠杆菌K12    RV308/PASP1,置于含有适当的抗菌素的TY琼脂培养基上培养,分离质粒PASP1,用SDS凝胶电泳法,放射免疫测定,和其它实验证明了这种转化株高水平地表达了上述MET-ASP-bGH衍生物,因为质粒pASP含有一个热诱导失控复制子。所需要的bGH衍生物的最大表达发生在37℃的培养条件下。
例10
质粒pASP和大肠杆菌K12    RV308/PASP2的构建
要求的构建大致上按例7中的说明来制作,只是DNA序列
5'    CGATC    ATG    GAT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT    CTG    TCC    GGC
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAG    TAC    CTA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA    GAC    AGG    CCG
CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '
GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
代替了例7中的联结子序列。上述规定的联结子序列基本上可以按照1977年Itakura等人以及1978年Crea等人使用的常规程序来构建。上述的合成方法在例1中也有具体的说明。
所要求的转化株,在这里命名为大肠杆菌K12    RV308/PASP2,把该转化株涂敷在含有适量抗菌素的TY琼脂上,然后按照常规进行培养,以产生并分离质粒PASP1。
这种转化株被十二烷基磺酸钠凝胶电泳、放射免疫测定和其他试验证明了上述的MET-ASP-bGH衍生物是在高水平上表达出来的。因为质粒PASP2包含有温度诱导的失控复制子,所以要求的bGH衍生产物的最大表达是出现在培养温度大约为37℃。
例11
质粒PAT2和大肠杆菌K12    RV308/PAT2的构建
要求的构建大致上按例3中的说明来制作,只是DNA联结子序列
5'    CTAGAGGGTATTAATA    ATG    TTT    CCA    GCT    ATG    TCT    CTA
''''''''''''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
TCCCATAATTAT    TAC    AAA    GGT    CGA    TAC    AGA    GAT
TCT    GGT    CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '
AGA    CCA    GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
代替了例3C中的联结子序列。上述规定的联结子序列基本上可以按照1977年Itakura等人以及1978年Crea等人使用的常规程序来构建。上述的合成方法在例1中也有具体地说明。
要求的转化株,在这里命名为大肠杆菌K12    RV308/PAT2,把该转化株涂敷在含有适量抗菌素的TY琼脂上,然后按照常规进行培养,以产生并分离质粒PAT2。这种转化株也用十二烷基磺酸钠凝胶电泳、放射免疫测定和其他试验证明上述的MET-bGH衍生物是在高水平上表达出来的。因为质粒PAT2含有温度诱导的失控复制子,所以,要求的bGH衍生产物的最大表达是出现在培养温度大约为37℃。
例12
质粒PCZ154和大肠杆菌K12    RV308/PCZ154的构建。
要求的构建基本上按照例7中的说明来制作,只是DNA联结子序列
5'    CGACC    ATG    GTT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT    CTG    TCC    GGC
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TGG    TAC    CAA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA    GAC    AGG    CCG
CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '
GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
代替了例7中的联结子序列。上述规定的联结子序列基本上可以按照1977年Itakura等人以及1978年Crea等人使用的常规程序来构建。上述的合成方法在例1中也有具体的说明。
要求的转化株,在这里命名为大肠杆菌K12    RV308/PCZ154,把该转化株涂敷在含有适量抗菌素的TY琼脂上,然后按照常规进行培养,以产生并分离质粒PCZ154。
这种转化株也用十二烷基磺酸钠凝胶电泳、放射免疫测定和其他试验证明上述的MET-VAL-bGH衍生物是在高水平上表达出来的。因为质粒PCZ154含有温度诱导的失控复制子,所以要求的bGH衍生产物的最大表达是出现在培养温度大约为37℃。
例13
质粒PCZ155和大肠杆菌K12    RV308/PCZ155的构建。
要求的构建基本上按照例7中的说明来制作,只是DNA联结子序列
5'    CGACC    ATG    GCT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT    CTG    TCC    GTC
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TGG    TAC    CGA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA    GAC    AGG    CAG
CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '
GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
代替了例7中的联结子序列。上述规定的联结子序列基本上可以按照1977年Itakura等人以及1978年Crea等人使用的常规程序来构建。上述的合成方法在例1中也有具体的说明。
要求的转化株,在这里命名为大肠杆菌K12    RV308/PCZ155,把该转化株涂敷在含有适量抗菌素的TY琼脂上,然后按照常规进行培养以产生并分离质粒PCZ155。这种转化株也用十二烷基磺酸钠凝胶电泳、放射免疫测定和其他试验证明上述的MET-ALA-PHE-PRO-ALA-MET-SER-LEU-SER-VAL-bGH衍生物是在高水平上表达出来的。因为质粒PCZ155含有温度诱导的失控复制子,所以,要求的bGH衍生产物的最大表达是出现在培养温度大约为37℃。
例14
质粒PCZ156和大肠杆菌K12    RV308/PCZ156的构建
要求的构建基本上按例7中的说明来制作,只是DNA联结子序列
5'    CGATA    ATG    GAT    TTT    CCG    GCT    ATG    TCT    CTG    TCC    GGC
'''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''    '''
3'    TAT    TAC    CTA    AAA    GGC    CGA    TAC    AGA    GAC    AGG    CCG
CTG    TTT    GCC    AAC    GCT    GTGCT    3'
'''    '''    '''    '''    '''    '
GAC    AAA    CGG    TTG    CGA    C    5'
代替了例7中的联结子序列。上述规定的联结子序列基本上可以按照1977年Itakura等人以及1978年Crea等人使用的常规程度来构建。上述的合成方法在例1中也有具体的说明。
要求的转化株,在这里命名为大肠杆菌K12    RV308/PCZ156,把该转化株涂敷在含有适量抗菌素的TY琼脂上,然后按照常规进行培养,以产生并分离质粒PCZ156。这样转化株也被十二烷基磺酸钠凝胶电泳、放射免疫测定和其他试验证明上述的MET-ASP-bGH衍生物是在高水平上表达出来的。因为质粒PCZ156含有温度诱导的失控复制子。所以,要求的bGH衍生产物的最大表达是出现在培养温度大约为37℃。
例15
质粒PCZ103和大肠杆菌K12    RV308/PCZ103的构建。
把10微克质粒PCZ101溶解在10微升10×BstEII反应缓冲剂(1.5摩尔浓度Nacl;60毫摩尔浓度三羟甲基氨基甲烷缓冲剂-盐酸,PH=7.9;60毫摩尔浓度Mgcl2;60毫摩尔浓度2-巯基乙醇;和1毫克/毫升牛血清蛋白)、2微升(~20单位)限制性内切酶BstEII、和88微升水中,使反应在60℃保温2小时。在(苯)酚和氯仿提取之后,从0.25摩尔浓度NaOAC溶液中产生一些DNA的乙醇沉淀。
把大约0.1微克BstEII-水解的质粒PCZ101 DNA悬浮在100微升连接酶缓冲剂中。加入100单位的T4DNA连接酶并在16℃保温2小时之后,连接的DNA经常用于按常规转化大肠杆菌K12 RV308。大肠杆菌K12 RV308/RZ转化株选择放在含卡那霉素的培养基上,并且通过用它们的质粒DNA的限制性内切酶分析来进行鉴定。质粒PCZ103基本上使用与例2A相一致的程序从转化株中分离。
例16
表达牛生长素衍生物的质粒PCZ103-衍生载体的构建。
由于构成质粒PCZ103的BstEII缺失不影响bGH蛋白质-编码序列,所以本发明的质粒PCZ103-衍生质粒表达与它们的质粒PCZ101-衍生配对物相同的bGH衍生物。
由于本发明的PCZ103-衍生质粒的制作基本上与那些作为它们的PCZ101-衍生配对物的制作实例中所述是一致的,表3简短地概括出了PCZ103-衍生质粒的构成。表3中列举出了PCZ103-衍生质粒、有关PCZ101-衍生配对物的构建的相应实例以及包含在该构建中的仅有的各种DNA片段的大小。
表3
表达bGH衍生物的PCZ103-衍生载体的构建
PCZ103-衍生载体    相应的实例    使用的各种限制片段    注释
PJR1.3    4    使用的是PCZ103的    使用的其他
PAT2.3    11    ~9.3仟碱基的BamHI    DNA片段是
表3(续)
PCZ103-衍生载体    相应的实例    使用的各种限制片段    注释
-XbaI限制片段,    与在参考例中使
而不是使用质粒PCZ    用的一样。质粒
101的~10.2仟    PCZ101和质粒
碱基BamHI-    PCZ103的~
XbaI限制片段。    0.6仟碱基(的)
BamHI-HgiAI
限制片段是相同
的。
PAT1.3    8    使用的是质粒PCZ    使用的其他DNA
PASP1.3    9    103的~9.3仟    片段是与在参
PASP2.3    10    碱基的BamHI-    考例中使用的
PCA154.3    12    ECORI限制片段。    相同。
PCZ155.3    13    而不是(使用)
PCZ156.3    14    质粒PCZ101的
~10.2仟碱基
(的)BamHI-
ECORI限制片段。
PCZ103-衍生质粒经常用于按常规转化大肠杆菌K12    RV308。产生的转化株表达上述的bGH衍生物。因为PCZ103-衍生质粒含有温度诱导的失控的复制子,所以,最大的表达是出现在培养温度大约为37℃。

Claims (45)

1、制备一种选择性的自主复制重组DNA的表达载体的方法,这种方法包括连接:
a)一种失控复制子、及
b)转录和翻译活化序列,该序列位于为生物活性牛生长激素衍生物编码的基因的译读码上,该基因是:
Figure 85101561_IMG1
Figure 85101561_IMG2
在这里:
A是脱氧腺嘌呤
G是脱氧鸟嘌呤
C是脱氧胞嘧啶
T是胸腺嘧啶
R是一种为牛的生长激素以氨基酸9(亮氨酸)到191(苯丙氨酸)编码的DNA序列。
R1是一种为翻译终止信号编码的DNA序列,它是:
Figure 85101561_IMG3
2、如权项1的方法,其中的转录活化序列是大肠杆菌(E.Coli)乳糖,噬菌体PLOL,噬菌体PROR,tac,大肠杆菌脂蛋白或大肠杆菌色氨酸转录活化序列。
3、如权项1或2的方法,其中的载体是一种质粒。
4、如权项3的方法,其中的翻译活动序列是大肠杆菌脂蛋白的序列。
5、如权项4的制备质粒PCZ1920的方法,它包括连接质粒PCZ101的~10.2Kb(仟碱基)BamHI-XbaI的片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子:
5'  CTAGAGGGTATTAATA  ATG  AAA  GGG  AAT  TCT  ATG  GCC
''''''''''''''''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TCCCATAATTAT  TAC  TTT  CCC  TTA  AGA  TAC  CGG
TTC  CCA  GCC  ATG  TCC  TTG  TCC  GGC  CTG  TTT  GCC  AAC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
AAG  GGT  CGG  TAC  AGG  AAC  AGG  CCG  GAC  AAA  CGG  TTG
GCT  GTGCT  3'
'''  '
CGA  C  5'
和质粒PCZ的~0.6仟碱基BamHI-XbaI片段。
6、如权项4制备质粒PJRI的方法,它包括连接质粒PCZ101的~10.2仟碱基BamHI-XbaI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CTAGAGGGTATTAATA  ATG  TTT  CCA  GCC  ATG  GCT  CTA
''''''''''''''''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TCCCATAATTAT  TAC  AAA  GGT  CGG  TAC  CGA  GAT
TCT  GGT  CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '
AGA  CCA  GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒PCZ101的~0.6仟碱基BamHI-XbaI片段。
7、如权项4制备质粒的方法,它包括连接质粒PCZ101的~10.2仟碱基BamHI-XbaI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CTAGAGGGTATTAATA  ATG  TTT  CCA  GCT  ATG  TCT  CTA
''''''''''''''''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TCCCATAATTAT  TAC  AAA  GGT  CGA  TAC  AGA  GAT
TCT  GGT  CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '
AGA  CCA  GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒PCZ101的~0.6仟碱基BamHI-XbaI片段。
8、如权项4制备质粒PJR1.3的方法,它包括连接质粒PCZ103的~9.3仟碱基BamHI-XbaI片段、下列核苷酸序列的DNA联结子。
5'  CTAGAGGGTATTAATA  ATG  TTT  CCA  GCC  ATG  GCT  CTA
''''''''''''''''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TCCCATAATTAT  TAC  AAA  GGT  CGG  TAC  CGA  GAT
TCT  GGT  CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '
AGA  CCA  GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒PCZ101的~0.6仟碱基BamHI-XbaI片段。
9、如权项3的方法,其中的转录活化序列是大肠杆菌色氨酸的序列。
10、如权项9制备质粒PCZ112的方法,它包括连接质粒PCZ101的~10.2仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGACC  ATG  GAT  GAT  AAG  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT  CTG
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
TGG  TAC  CTA  CTA  TTC  AAA  GGC  CGA  TAC  AGA  GAC
TCC  GGC  CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '
AGG  CCG  GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒NM608的ECORI-ClaI水解物。
11、如权项9制备质粒PAT1的方法,它包括连接质粒PCZ101的~10.2仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGACA  ATG  TTC  CCA  GCT  ATG  TCT  CTA  TCT  GGT
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TGT  TAC  AAG  GGT  CGA  TAC  AGA  GAT  AGA  CCA
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒NM608的ECORI-ClaI的水解物。
12、如权项9制备质粒PASP1的方法,它包括连接质粒PCZ101的~10.2仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGACC  ATG  GAT  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT  CTG  TCC  GGC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TGG  TAC  CTA  AAA  GGC  CGA  TAC  AGC  GAC  AGG  CCG
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒NM608的ECORI-ClaI水解物。
13、如权项9制备质粒PASP2的方法,它包括连接质粒PCZ101的~10.2仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGATC  ATG  GAT  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT  CTG  TCC  GGC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TAG  TAC  CTA  AAA  GGC  CGA  TAC  AGA  GAC  AGG  CCG
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒NM的ECORI-ClaI水解物。
14、如权项9制备质粒PCZ154的方法,它包括连结质粒PCZ101的~10.2仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGACC  ATG  GTT  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT  CTG  TCC  GGC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
TGG  TAC  CAA  AAA  GGC  CGA  TAC  AGA  GAC  AGG  CCG
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒608的ECORI-ClaI水解物。
15、如权项9制备质粒PCZ155的方法,它包括连接质粒PCZ101的~10.2仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGACC  ATG  GCT  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT  CTG  TCC  GTC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TGG  TAC  CGA  AAA  GGC  CGA  TAC  AGA  GAC  AGG  CAG
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒NM608的ECORI-ClaI水解物。
16、如权项9制备质粒PCZ156的方法,它包括连接质粒PCZ101的~10.2仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGATA  ATG  GAT  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT  CTG  TCC  GGC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TAT  TAC  CTA  AAA  GGC  CGA  TAC  AGA  GAC  AGG  CCG
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒NM608的ECORI-ClaI水解物。
17、如权项9制备质粒PAT2.3的方法,它包括连接质粒PCZ101的~9.3仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CTAGAGGGTATTAATA  ATG  TTT  CCA  GCT  ATG  TCT  CTA
''''''''''''''''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TCCCATAATTAT  TAC  AAA  GGT  CGA  TAC  AGA  GAT
TCT  GGT  CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '
AGA  CCA  GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒PCZ101的~0.6仟碱基BamHI-XbaI水解物。
18、如权项9制备质粒PAI1.3的方法,它包括连接质粒PCZ103的~9.3仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGACA  ATG  TTC  CCA  GCT  ATG  TCT  CTA  TCT  GGT
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TGT  TAC  AAG  GGT  CGA  TAC  AGA  GAT  AGA  CCA
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒608的ECORI-ClaI水解物。
19、如权项9制备质粒PASP1.3的方法,它包括连接质粒PCZ103的~9.3仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGACC  ATG  GAT  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT  CTG  TCC  GGC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
TGG  TAC  CTA  AAA  GGC  CGA  TAC  AGC  GAC  AGG  CCG
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒NM608的ECORI-ClaI水解物。
20、如权项9制备质粒PASP2.3的方法,它包括连接质粒PCZ103的~9.3仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGATC  ATG  GAT  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT  CTG  TCC  GGC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
TAG  TAC  CTA  AAA  GGC  CGA  TAC  AGA  GAC  AGG  CCG
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒NM608的ECORI-ClaI水解物。
21、如权项9制备质粒PCZ154.3的方法,它包括连接质粒PCZ103的~0.3仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGACC  ATG  GTT  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT  CTG  TCC  GGC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
TGG  TAC  CAA  AAA  GGC  CGA  TAC  AGA  GAC  AGG  CCG
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒NM608的ECORI-ClaI水解物。
22、如权项9制备质粒PCZ155.3的方法,它包括连接质粒PCZ103的~9.3仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子,
5'  CGACC  ATG  GCT  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT  CTG  TCC  GTC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TGG  TAC  CGA  AAA  GGC  CGA  TAC  AGA  GAC  AGG  CAG
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒NM608的ECORI-ClaI水解物。
23、如权项9制备质粒PCZ156.3的方法,它包括连接质粒PCZ103的~9.3仟碱基BamHI-ECORI片段、有下列核苷酸序列的DNA联结子、
5'  CGATA  ATG  GAT  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT  CTG  TCC  GGC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TAT  TAC  CTA  AAA  GGC  CGA  TAC  AGA  GAC  AGG  CCG
CTG  TTT  GCC  AAC  GCT  GTGCT  3'
'''  '''  '''  '''  '''  '
GAC  AAA  CGG  TTG  CGA  C  5'
和质粒NM608  ECORI-ClaI水解物。
24、制备一种适合用于权项8和17-28中的质粒的任何一种方法,它包括使质粒PCZ101与BstEII限制酶一起进行处理,纯化由此而得的DNA,并连接纯化的DNA以产生质粒PCZ103。
25、一种与选择性的、自主复制的重组DNA表达载体一起转化的宿主细胞,它包括:
a)一种失控复制子,及
b)转录和翻译活化序列,该序列位于为生物活性牛生长激素衍生物编码的基因的译读码上,该基因是:
(1)5'  ATG  AAA  GGG  AAT  TCT  ATG  GCC  TTC
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TAC  TTT  CCC  TTA  AGA  TAC  CGG  AAG
CCA  GCC  ATG  TCC  TTG  TCC  GGC  3'
''' ''' ''' ''' ''' ''' '''-R-R1
GGT  CGG  TAC  AGG  AAC  AGG  CCG  5'
(2)5'  ATG  GAT  GAT  AAG  TTT  CCG  GCT  ATG
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TAC  CTA  CTA  TTC  AAA  GGC  CGA  TAC
TCT  CTG  TCC  GGC  3'
''' ''' ''' '''-R-R1
AGA  GAC  AGG  CCG  5'
(3)5'  ATG  TTT  CCA  GCC  ATG  GCT  CTA
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TAC  AAA  GGT  CGG  TAC  CGA  GAT
TCT  GGT  3'
''' ''' -R-R1
AGA  CCA  5'
(4)5'  ATG  TTC  CCA  GCT  ATG  TCT  CTA
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TAC  AAG  GGT  CGA  TAC  AGA  GAT
TCT  GGT  3'
''' '''-R-R1
AGA  CCA  5'
(5)5'  ATG  GAT  TTT  CCG  GCT  ATG  TCT
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TAC  CTA  AAA  GGC  CGA  TAC  AGA
CTG  TCC  GGC  3'
''' ''' '''-R-R1
GAC  AGG  CCG  5'
(6)5'  ATG  TTT  CCA  GCT  ATG  TCT  CTA
'''  '''  '''  '''  '''  '''  '''
3'  TAC  AAA  GGT  CGA  TAC  AGA  GAT
TCT  GGT  3'
''' '''-R-R1
AGA  CCA  5'
在这里:
A是:脱氧腺嘌呤
G是:脱氧鸟嘌呤
C是:脱氧胞嘧啶
T是:胸腺嘧啶
R是一种为牛的生长激素以氨基酸9(亮氨酸)到191(苯丙氨酸)编码的DNA序列。
R1是一种为翻译终止信号编码的DNA序列,它是:
5'  TAA  3'  5'  TAG  3'
'''  '''
3'  ATT  5'  3'  ATC  5'  or
5'  TGA  3'
'''
3'  ACT  5'  .
26、如权项25的宿主细胞,其中载体是一种质粒。
27、如权项25或26中宿主细胞,其中转录活化序列是大肠杆菌乳糖,噬菌体入PLOL、噬菌体入PROR,大肠杆菌脂蛋白或大肠杆菌色氨酸的转录活化序列。
28、如权项27的宿主细胞,其中转录活化序列是大肠杆菌色氨酸转录活化序列或大肠杆菌脂蛋白的转录活化序列。
29、如权项26和28中的宿主细胞,其中质粒是:
Which  the  plasmid  is  plasmid  pcz1920,pJR1,pCZ112  pAT1,pAT2,pASP1,pASP2,pCZ201,pJR1.3,pAT1.3,pAT2.3,pASP1.3,pASP2.3,pCZ154.3,pCZ155.3,or  pCZ156.3。
30、如权项25-30的任何一个宿主细胞,核细胞是原核生物细胞。
31、如权项30中的宿主细胞是大肠杆菌。
32、一种用于增加牛的奶产量的方法,包括给牛一种除了甲硫酰氨基牛生长激素以外的,由权项1-23中任何一种方法所产生的载体中的基团所编码的,其量足于提高该奶产量的牛生长激素衍生物。
33、如权项33的方法,其中每个动物每天的有效量为0.05-100.000微克。
34、如权项34的方法,其中每个动物每天的有效量为5-25000微克。
35、如权项35的方法,每个动物每天的有效量为500-5000微克。
36、生产一种细胞内高度均匀的蛋白质颗粒的方法,这种方法包括:
1)用一种选择性的,自主复制的表达重组DNA载体转化一种授体细胞,该载体包括:
a)一种失控复制子
b)转录和翻译的活化序列是在为功能多肽编码的译读核苷酸的密码序列中,所说的功能多肽的功能多肽的编码序列包括一种翻译的终止信号,它与功能多肽的羧基末端编码的核苷酸三联体的下端直接相连。
2)、在适合于基因表达,和失控复制子激活或诱发的生长条件下,培养这种转化细胞。
37、如权项37的方法,其中重组DNA表达载体是一种质粒。
38、权项37或38方法,其中的转录活化序列是大肠杆菌色氨酸的活化序列,大肠杆菌脂蛋白转录活化序列,大肠杆菌乳糖转录活化序列,噬菌体入PLOL转录活化序列或噬菌体入PROR转录活化序列。
39、如权项37、38或39的方法,其中的转录活化程序包括一个或多个大肠杆菌转录活化序列。
40、如权项39的方法,其中转录活化序列是大肠杆菌色氨酸的转化序列或大肠杆菌脂蛋白的转化活化序列。
41、权项37-41中的任何一个方法,其中的功能多肽的密码序列为下列物质编码序列:牛生长激素、人生长激素、人的前一生长激素、猪生长激素、哺乳动物生长激素、鸟生长激素、人胰岛素A链、人胰岛素B链、人胰岛素原、人的前-胰岛素原、干扰素、尿激酶、人体组织的血纤维蛋白溶酶原激活剂、生长激素释放因子、或内白细胞素(interleukin)。
42、如权项38-40中的任何一种方法,其中的质粒是:
Which  the  plasmid  is  plasmid  pCZ1920,pJR1,pCZ112  pAT1,pAT2,pASP1,pASP2,pCZ201,pJR1.3,pAT1.3,pAT2.3  pASP1.3,pASP2.3,pCZ154.3,pCZ155.3,or  pCZ156.3。
43、如权项37-43中的任何一个方法,其中转化宿主细胞是一种原核生物细胞。
44、如权项44的方法,其中的转化细胞是大肠杆菌。
45、如权项45的方法,其中的转化细胞是大肠杆菌K12RV308。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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