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CN107446943A - 重组牛生长激素的表达方法 - Google Patents

重组牛生长激素的表达方法 Download PDF

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CN107446943A
CN107446943A CN201710817096.4A CN201710817096A CN107446943A CN 107446943 A CN107446943 A CN 107446943A CN 201710817096 A CN201710817096 A CN 201710817096A CN 107446943 A CN107446943 A CN 107446943A
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CN
China
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expression
growth hormone
bovine growth
sumo
host
Prior art date
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Application number
CN201710817096.4A
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戴彬彬
周正兵
倪燕红
黄嘉华
唐自军
石峰
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Zhejiang Hua Jun Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Zhejiang Hua Jun Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Zhejiang Hua Jun Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Zhejiang Hua Jun Pharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201710817096.4A priority Critical patent/CN107446943A/zh
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

本发明涉及基因工程领域，特别涉及重组牛生长激素的表达方法。本发明提供了一种重组载体，包括SUMO肽的基因和牛生长激素基因Bgh。本发明将SUMO肽的基因和牛生长激素的基因连接，既可促进重组牛生长激素的表达量，又利于后期的纯化。经生物软件分析，本发明制备的重组牛生长激素融合蛋白表达量至少为50％。

Description

重组牛生长激素的表达方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别涉及重组牛生长激素的表达方法。
背景技术
牛奶是最古老的天然饮料之一，被誉为"白色血液"，对人体的重要性可想而知。牛奶的营养价值很高，牛奶中的矿物质种类也非常丰富，除了我们所熟知的钙以外，磷、铁、锌、铜、锰、钼的含量都很多。最难得的是，牛奶是人体钙的最佳来源，而且钙磷比例非常适当，利于钙的吸收。种类复杂，至少有100多种，主要成份有水、脂肪、磷脂、蛋白质、乳糖、无机盐等。
牛奶具有补肺养胃、生津润肠之功效，对人体具有镇静安神作用，对糖尿病久病、口渴便秘、体虚、气血不足、脾胃不和者有益；喝牛奶能促进睡眠安稳，泡牛奶浴可以治失眠；牛奶中的碘、锌和卵磷脂能大大提高大脑的工作效率；牛奶中的镁元素会促进心脏和神经系统的耐疲劳性；牛奶能润泽肌肤，经常饮用可使皮肤白皙、光滑，增加弹性；基于酵素的作用，牛奶还有消炎、消肿及缓和皮肤紧张的功效；儿童常喝鲜奶有助于身体的发育，因为钙能促进骨骼发育；老人喝牛奶可补足钙质需求量，减少骨骼萎缩，降低骨质疏松症的发生概率，使身体柔韧度增加。
影响母牛产奶性能的因素有很多，如牛的品种、个体、饲养管理、年龄与胎次、米如期、干奶期、产犊季节、挤奶及健康情况等。
牛生长激素：bovine somatotropin或bovine growth hormone，缩写bST、BST或BGH)是牛脑垂体分泌的一种肽类激素，用于调节代谢过程、促进动物生长。研究发现将BST注入母牛体内可以增加其产奶量。
现在主要是利用基因表达的技术生产重组牛生长激素，但表达产物量低。一般大肠杆菌工程中，重组蛋白的表达量占总蛋白的20％左右，部分重组蛋白可达到总蛋白的40％左右，重组牛生长激素有报道其表达量在20％左右。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种重组牛生长激素的表达方法。本发明将SUMO肽的基因和牛生长激素的基因连接，既可促进重组牛生长激素的表达量，又利于后期的纯化，SUMO肽可被切割不会引入末端氨基酸。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种重组载体，包括SUMO肽的基因和牛生长激素基因Bgh。
本发明还提供了一种宿主，包括所述的重组载体。
在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主为大肠杆菌。大肠杆菌表达系统具有生长快、遗传背景清晰、表达水平高、产物易纯化、稳定性好、抗污染能力强、适用范围广以及成本低的特点，是理想的外源蛋白表达系统，故本发明选用原核表达系统表达目的重组牛生长激素(SUMO-BGH)融合蛋白。
在本发明的一些具体实施方案中，所述宿主为大肠杆菌BL21。
本发明还提供了一种重组牛生长激素的表达方法，包括如下步骤：
步骤1：获得牛生长激素基因Bgh，在其两端引入酶切位点BamHⅠ、XhoⅠ；
步骤2：扩增获得目的基因，连接到载体，转化宿主，经过BamHⅠ、XhoⅠ双酶切获取目的基因牛生长激素基因Bgh；
步骤3：获得Pet-32a-Sumo表达载体；
步骤4：取步骤2获得的牛生长激素基因Bgh与Pet-32a-Sumo表达载体连接获得重组载体，转化宿主，表达，纯化。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤2所述载体为T载体，所述宿主为E.coliTG1。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3具体为取Pet-32a-Sumo TG1，经过BamHⅠ、XhoⅠ双酶切获得Pet-32a-Sumo表达载体。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4中所述宿主为大肠杆菌BL21。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4中所述纯化包括用UIP酶切割SUMO肽和过镍柱纯化。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤4中所述表达的产物为包涵体；在所述表达之后、所述纯化之前，还包括复性的步骤。
本发明提供了一种重组载体，包括SUMO肽的基因和牛生长激素基因Bgh。本发明将SUMO肽的基因和牛生长激素的基因连接，既可促进重组牛生长激素的表达量，又利于后期的纯化，更不会带入多余的氨基酸。参照图10中的蛋白图谱，经凝胶成像系统分析分析，本发明制备的重组牛生长激素融合蛋白表达量至少为50％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示PMD-18T-Bgh质粒图；其中，Lane1：质粒条带；Lane2：质粒条带；Lane3：质粒条带；Lane4：质粒条带；
图2示PMD-18T-Bgh质粒BamHⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定图；Lane1：TAKARA DL2,000DNAMarker；Lane2：质粒BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，小分子带目的基因，大分子带T载体；Lane3：质粒BamHⅠ/XhoⅠ双酶切；
图3示pET-32a-Sumo双酶切图；Lane1：BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后pET-32a-Sumo载体；Lane2：BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后pET-32a-Sumo载体；LaneM：TAKARA DL5,000DNA Marker；
图4示表达菌种pET-32a-Sumo-Bgh图；其中，Lane1：质粒；Lane2：质粒；Lane3：质粒；Lane4：质粒；Lane5：质粒；Lane6：质粒；
图5示表达菌种pET-32a-Sumo-Bgh PCR图；其中，Lane1：TAKARA DL2,000DNAMarker；Lane2：菌液PCR鉴定；Lane3：菌液PCR鉴定；Lane4：菌液PCR鉴定；Lane5：菌液PCR鉴定；Lane6：菌液PCR鉴定；
图6示表达菌种pET-32a-Sumo-Bgh双酶切图；Lane1：TAKARA DL5,000DNA Marker；Lane2：TAKARA DL2,000DNA Marker；Lane3：pET-32a-Sumo-Bgh质粒BamHⅠ/XhoⅠ双酶切，大片段为表达载体，小片段为目的基因；
图7示重组蛋白表达图谱；其中，Lane1：IPTG诱导；Lane2：未诱导；Lane3：pet-32a-Sumo菌；Lane4：小分子蛋白marker；
图8示牛生长激素纯化；其中，Lane1：小分子蛋白marker；Lane2：包涵体洗涤液Ⅰ上清；Lane3：包涵体洗涤液Ⅰ沉淀；Lane4：包涵体洗涤液Ⅱ上清1遍；Lane5：包涵体洗涤液Ⅱ沉淀1遍；Lane6：包涵体洗涤液Ⅱ上清2遍；Lane7：包涵体洗涤液Ⅱ沉淀2遍；Lane8：包涵体溶解液上清；
图9示溶解的重组蛋白过镍柱纯化；Lane1：包涵体溶解液上清；Lane2：咪唑洗涤1；Lane3：咪唑洗涤2；Lane4：咪唑洗涤3；Lane5：咪唑洗涤4；
图10示小量重组蛋白表达；Lane1：重组蛋白诱导表达；Lane2：小分子蛋白marker；
图11示UIP酶切割重组蛋白BGH-SUMO；其中，Lane1：UIP酶切图；Lane2：UIP酶切图；Lane3：UIP酶切图；Lane4：BGH(切割后过镍柱纯化)；Lane5：小分子蛋白marker；Lane6：重组蛋白BGH-SUMO。
具体实施方式
本发明公开了一种重组牛生长激素的表达方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明通过以下步骤在大肠杆菌中高效表达牛生长激素：
1.从NCBI上获取牛生长激素基因Bgh，在两端引入酶切位点BamHⅠ、XhoⅠ。
2.通过PCR的方法扩增目的基因，并连接到T载体上。转化E.coliTG1中扩增目的基因，经过BamHⅠ、XhoⅠ双酶切获取目的基因牛生长激素。
3.Pet-32a-Sumo TG1中，经过BamHⅠ、XhoⅠ双酶切获取表达载体。
4.牛生长激素基因Bgh和Pet-32a-Sumo连接并转化表达菌种BL21。
5.工程菌发酵表达。
6.大量表达产物重组牛生长激素，表达产物以包涵体的形式存在，进行复性。
7.重组牛生长激素过镍柱纯化。
8.用sumo肽酶UIP对重组牛生长激素进行切割，再过一次镍柱吸附杂蛋白sumo肽，得到较纯的牛生长激素。
本发明提供了一种重组载体，包括SUMO肽的基因和牛生长激素基因Bgh。本发明将SUMO肽的基因和牛生长激素的基因连接，既可促进重组牛生长激素的表达量，又利于后期的纯化。经生物软件分析，本发明制备的重组牛生长激素融合蛋白表达量至少为50％。
本发明提供的重组牛生长激素的表达方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 PCR扩增牛生长激素基因Bgh(序列如SEQ ID No.1所示)
CDS：
ATGATGGCTGCAGGCCCCCGGACCTCCCTGCTCCTGGCTTTCGCCCTGCTCTGCCTGCCCTGGACTCAGGTGGTGGGCGCCTTCCCAGCCATGTCCTTGTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCATCAGCTGGCTGCTGACACCTTCAAAGAGTTTGAGCGCACCTACATCCCGGAGGGACAGAGATACTCCATCCAGAACACCCAGGTTGCCTTCTGCTTCTCTGAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAGGCCCAGCAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTCGCATCTCACTGCTCCTCATCCAGTCGTGGCTTGGGCCCCTGCAGTTCCTCAGCAGAGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCGGACCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCTGGCCCTGATGCGGGAGCTGGAAGATGGCACCCCCCGGGCTGGGCAGATCCTCAAGCAGACCTATGACAAATTTGACACAAACATGCGCAGTGACGACGCGCTGCTCAAGAACTACGGTCTGCTCTCCTGCTTCCGGAAGGACCTGCATAAGACGGAGACGTACCTGAGGGTCATGAAGTGCCGCCGCTTCGGGGAGGCCAGCTGTGCCTTCTAG
PCR扩增
以合成的基因bgh为模板，用所设计的引物P1和P2扩增目的片段。
引物P1为CGGGATCCATGATGGCTGCAGGCC(序列如SEQ ID No.2所示)；
引物p2为CCCTCGAGCTAGAAGGCACAGGC(序列如SEQ ID No.3所示)。
PCR反应体系为：
PCR的反应程序为：
最后保存于4℃。
凝胶回收、纯化PCR产物
在制胶槽中用大孔梳铺制1％琼脂糖凝胶；
取PCR产物50μL上样电泳，在长波紫外灯下用刀切下含有目的片段的凝胶条条带，切去多余部分，装入预先称重的1.5mL离心管中；
称重计算凝胶重量，按照100mg：300μL加入相应体积的Extraction Buffer；
在55℃水浴箱中温育10min，其间晃动离心管2-3次以加速溶解；
加入凝胶一倍体积(100mg：100μL)的异丙醇，混匀；
将溶液转移至Spin Column，6000rpm离心1min，倒掉滤过的液体；
加入500μL Extration Buffer，6000rpm离心1min，倒掉滤过的液体；
加入650μL Wash Buffer，离心1min，倒掉滤过的液体；
重复上一步；
12000rpm再离心1min，彻底除去未离心尽的液体，将Spin Column转移到一个新的灭菌离心管中；
向Spin Column中加入50μLElution Buffer，室温静置1min；
12000rpm离心1min，所得溶液中即包含目的基因片断，可直接用于下一步实验，贮存于-20℃。
实施例2 Bgh连接到PMD-18T载体上
在无菌的Eppendorf管中，依次加：
14℃温育过夜，放置4℃冰箱备用。
实施例3 E.coli TG1和BL21感受态细胞的制备(CaCl2法)
从LB平板上挑取新活化的E.coli TG1单菌落和BL21单菌落，分别接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，将该菌悬液以1:100的比例接种于5mL LB液体培养基中，37℃剧烈振荡培养1-2h至OD600≈0.3；
将培养液转入1.5mL离心管中，冰上放置10min，然后于4℃，5000rpm离心10min；
弃上清，用预冷的100mmol/L CaCl2溶液750μL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min，然后于4℃，3000rpm离心10min；
弃上清，加入200μL预冷的100mmol/L CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置过夜，即成感受态细胞悬液。或在CaCl2溶液悬浮的细胞液中加15-20％的无菌甘油，-80℃保存备用。
实施例4连接产物的转化
取连接产物5μL，加到200μL E.coli TG1感受态细胞悬液中，轻轻混匀，冰上放置30min；
42℃水浴热击90sec，迅速取出置冰上冷却3-5min；
加入1mL 37℃预热的LB液体培养基，混匀后37℃水浴1h，使细菌恢复正常生长状态；
4000rpm离心10min，弃1mL上清，沉淀重悬后取约200μL均匀涂布于含Amp的LB平板上，37℃正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养10-16h。
挑斑；
用无菌牙签从转化平板上挑取8个生长状态良好的白色单菌落，分别接种于5mL含50μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养8-10h。
实施例5质粒的小量制备
参照《分子克隆实验指南》第三版,SDS碱裂解法小量提取质粒，分别提取PMD-18T-Bgh和实验室构建的Pet-32a-Sumo的质粒。方法如下：
分别取1.5mL培养液倒入1.5mL Eppendorf管中，4℃，12000rpm离心10sec；
弃尽上清，菌体沉淀悬于预冷的100μL溶液Ⅰ中，涡旋振荡混匀，冰浴10min；
加入新鲜配制的溶液Ⅱ200μL，温和地颠倒Eppendorf管5次，冰浴5min，使溶液变澄清；
加入150μL预冷的溶液Ⅲ，振荡30sec，冰浴5min，4℃，12000rpm离心10min；
小心吸出上清液转入干净Eppendorf管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心5min；
将上清液移入干净Eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.2)，颠倒混匀后室温放置5min；
4℃，12000rpm离心10min；
弃上清，加入1mL预冷的70％乙醇洗沉淀一次，真空干燥5min或室温干燥；
将沉淀溶于50μL无菌ddH2O，加RNase A(20μg/mL)，37℃水浴45min，分别取少量用1％琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒的纯度，其它于-20℃保存。
实施例6 PCR鉴定
以提取的质粒作为模板，进行PCR鉴定。
PCR反应体系为：
PCR的反应程序为：
最后保存于4℃。
双酶切获取目的基因Bgh和表达载体pet-32a-Sumo。
BGH目的基因获得：
在无菌的Eppendorf管中，依次加入：
表达载体pet-32a-Sumo获得：
在无菌的Eppendorf管中，依次加入：
37℃温育3-4h后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切，割胶回收，得到目的基因和表达载体。
实施例7 pet-32a-Sumo-Bgh工程菌构建
Bgh连接到pet-32a-Sumo表达载体上
在无菌的Eppendorf管中，依次加入：
于14℃连接过夜，临用前放于4℃保存。
连接产物转化：
取连接产物5μL，加到200μL BL21感受态细胞悬液中，轻轻混匀，冰上放置30min；
42℃水浴热击90sec，迅速取出置冰上冷却3-5min；
加入1mL 37℃预热的LB液体培养基，混匀后37℃水浴1h，使细菌恢复正常生长状态；
4000rpm离心10min，弃1mL上清，沉淀重悬后取约200μL均匀涂布于含Amp的LB平板上，37℃正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养10-16h。
挑斑：
用无菌牙签从转化平板上挑取8个生长状态良好的白色单菌落，分别接种于5mL含50μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养8-10h。
挑斑，菌种PCR和双酶切鉴定(参考实施例1～6)。
实施例8 Pet-32a-Sumo-Bgh工程菌发酵产物检测
LB液体培养基配制：
胰酪蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
氯化钠 10g
ddH2O定容于1000ml，115℃灭菌15min。
在5ml的LB液体培养基中加入pet-32a-Sumo-Bgh工程菌50ul，30℃，摇床220rpm发酵，在A600值为0.6左右，加入IPTG诱导表达，4小时后收集菌液。
发酵产物重组牛生长激素BGH的检测。
SDS-PAGE分析：
制胶：
分离胶迅速混匀后倒入两块玻璃板之间，高度距板上缘2cm，加少量异丁醇覆盖，静置让其聚合30-60min，直至出现一条明显的分界线，说明已经聚合好，除去异丁醇层，并用滤纸吸干多余的异丁醇和未聚合的丙烯酰胺；浓缩胶混匀后倒在已聚合的分离胶上，并插入样品梳聚合30min，注意不要产生气泡。聚合后，取出样品梳，用水洗涤样品孔，并用滤纸吸去多余的水。
样品处理：
在用PBS溶解后的样片中加等体积的2×样品缓冲液，混匀后100℃煮10min，12000rpm离心10min后上样。
加样品：
将制备好的凝胶板装进电泳槽并注满缓冲液，取处理好的样品10μL加入样品槽，另在一空白孔加入低分子量标准蛋白溶液5μL。
电泳：
按指示接好电源，以100V的电压进行电泳，直至溴酚蓝离凝胶底部约1cm处，停止电泳。
染色与脱色：
电泳结束后，取出凝胶板，小心地取出胶，将其浸入染色液中，置脱色摇床振荡染色3-5h，然后取出胶，放入脱色液中振荡脱色，并根据情况实时更换脱色液，直至脱去底色为止。
实施例9融合蛋白的纯化
BGH大量表达及纯化
配制1L LB培养基，灭菌后备用。在培养基中加入Amp使终浓度达到50μg/mL，以1％的接种量接入BL21-pET-32a-Sumo-Bgh菌液，37℃振荡培养至OD600≈1；加入IPTG至终浓度1mM，220rpm，30℃诱导过夜，次日收集菌液。
将诱导菌于4℃以8 000rpm离心15min，收集菌体；用ddH2O洗两次，8000rpm除去洗涤液；
称重，取5g(湿重)诱导的菌，加入50mLPBS缓冲液。
将PBS重溶的菌液超声破碎(开1s，停2s)30min。超声后菌液在4℃下6000rpm离心30min，收集沉淀去除上清液。
包涵体洗涤液Ⅰ：
EDTA 5mM
Tris 20mM
Triton-X-100 1％(V/V)
溶于1L的ddH2O中，pH调至8.0，定容，121℃灭菌20min。
包涵体洗涤液Ⅱ：
EDTA 5mM
Tris 201mM
尿素 4M
溶于1L的ddH2O中，pH调至8.0，定容，121℃灭菌20min。
包涵体溶解液：
溶于1L的ddH2O中，pH调至8.0，定容，121℃灭菌20min。
收集超声后的沉淀，用pH 7.5的PBS重悬，在4℃下搅拌30min，再用6000rpm离心10min，取沉淀。
收集的沉淀用包涵体洗涤液Ⅰ重悬，在4℃下搅拌15min。6 000rpm离心10min，取沉淀。
收集的沉淀用包涵体洗涤液Ⅱ重悬，在4℃下搅拌60min，6 000rpm离心10min，取沉淀，重复1遍。
收集沉淀用包涵体溶解液重悬，在4℃下搅拌30min。冰箱4℃放过夜，次日6000rpm离心20min，取上清，上清用0.22μm的膜过滤。
重组牛生长激素复性：
收集的上清液，加入0.2M Tris Hcl缓冲液pH为9.5，调整溶液液中的尿素浓度为3.5M，冰箱放置24h。
次日，溶液放入分子量为8000的透析袋中进行透析，缓冲溶液用pH为8.5的0.01MTris Hcl缓冲液pH为8.5进行透析，透析4次，去除里面的尿素。
透析液在4℃下，6000rpm离心半小时，取上清。SDS-PAGE分析，检测纯度。
重组牛生长激素过镍柱纯化：
1.复性后的蛋白溶解加入到镍柱里，静置30min；
2.从低到高用不同浓度的咪唑去洗涤，浓度为从10mM，20mM，50mM，100mM，200mM；
3.再用高浓度咪唑500mM进行洗杂；
4.镍柱再生；
5.收集每一部分，进行SDS-PAGE。
实施例10用SUMO酶对重组牛生长激素进行切割获得单体牛生长激素
用20mM，pH为9.0的Tris-Hcl缓冲盐，将重组牛生长激素稀释到约5mg/ml。
取10ml加入20ul SUMO酶进行切割，在30℃，反应30min。进行SDS-PAGE检测。将酶解液过镍柱，去除UIP酶，SDS-PAGE分析。
实施例11小量融合蛋白的纯化表达
配制2L LB培养基，灭菌后备用。在培养基中加入Amp使终浓度达到50μg/mL，以1％的接种量接入BL21-pET-32a-Sumo-Bgh菌液，37℃振荡培养至OD600≈1；加入IPTG至终浓度1mM，220rpm，30℃诱导过夜，次日收集菌液。
将诱导菌于4℃以8 000rpm离心15min，收集菌体；用ddH2O洗两次，8000rpm除去洗涤液；
称重得约25g湿重，加入250mLPBS缓冲液。
将PBS重溶的菌液超声破碎(开1s，停2s)30min。超声后菌液在4℃下6000rpm离心30min，收集沉淀去除上清液，共得湿重约11g。
收集超声后的沉淀，用pH7.5的PBS重悬，在4℃下搅拌30min，再用6 000rpm离心10min，得湿重约10g。
收集的沉淀用包涵体洗涤液Ⅰ重悬，在4℃下搅拌15min。6 000rpm离心10min，得湿重9g。
收集的沉淀用包涵体洗涤液Ⅱ重悬，在4℃下搅拌60min，6 000rpm离心10min，取沉淀，重复1遍。后得湿重约6g。
收集沉淀用包涵体溶解液重悬，在4℃下搅拌30min。冰箱4℃放过夜，次日6000rpm离心20min，取上清，上清用0.22μm的膜过滤。
重组牛生长激素复性：
收集的上清液，加入0.2MTris Hcl缓冲液pH为9.5，调整溶液液中的尿素浓度为3.5M，冰箱放置24h。
次日，溶液放入分子量为8000的透析袋中进行透析，缓冲溶液用pH为8.5的0.01MTris Hcl缓冲液pH为8.5进行透析，透析4次，去除里面的尿素。
透析液在4℃下，6000rpm离心半小时，取上清，经测得蛋白质总含量为950mg。SDS-PAGE分析，检测纯度。
重组牛生长激素过镍柱纯化后，用UIP酶对重组牛生长激素进行切割获得单体牛生长激素，再经镍柱纯化回收UIP酶后，测得牛生长激素蛋白总含量650mg。本发明制备的重组牛生长激素融合蛋白表达量至少为50％。
对比例 现有基因工程技术纯化表达
目前利用基因工程提取牛生长激素的方法是直接将牛生长激素基因重组到表达载体上，不同的表达载体其表达量不一样。目前有将重组牛生长素基因构建在Pet-30a，pBLMFV，Pet-28a，pEGFP-N1等表达载体上，其中pBLMFV上的表达量约37％。表达产物均在包涵体中，经过包涵体纯化步骤后，其纯度可达到80％，对包涵体进行复性，复性成功即得到牛生长激素。
实施例13
对照组：对比例；
实验组：实施例1～11；
比较对照组与实验组重组牛生长激素的表达量，结果见表1。
表1
组别 对照组 实验组
重组牛生长激素的表达量 37％ 50％#
纯度 80％ 95％#
安全性 有末端氨基酸 不引入末端氨基酸
生产成本(元/g) 40 38*
注：*示与对照组相比，具有显著差异(P＜0.05)；#示与对照组相比，具有极显著差异(P＜0.01)；
与对照组相比，实验组极显著(P＜0.01)提高了重组牛生长激素的表达量，极显著(P＜0.05)提高了纯度，显著(P＜0.05)减少了生产成本。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江华军药业有限公司
<120> 重组牛生长激素的表达方法
<130> MP1713945
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 654
<212> DNA
<213> Bgh
<400> 1
atgatggctg caggcccccg gacctccctg ctcctggctt tcgccctgct ctgcctgccc 60
tggactcagg tggtgggcgc cttcccagcc atgtccttgt ccggcctgtt tgccaacgct 120
gtgctccggg ctcagcacct gcatcagctg gctgctgaca ccttcaaaga gtttgagcgc 180
acctacatcc cggagggaca gagatactcc atccagaaca cccaggttgc cttctgcttc 240
tctgaaacca tcccggcccc cacgggcaag aatgaggccc agcagaaatc agacttggag 300
ctgcttcgca tctcactgct cctcatccag tcgtggcttg ggcccctgca gttcctcagc 360
agagtcttca ccaacagctt ggtgtttggc acctcggacc gtgtctatga gaagctgaag 420
gacctggagg aaggcatcct ggccctgatg cgggagctgg aagatggcac cccccgggct 480
gggcagatcc tcaagcagac ctatgacaaa tttgacacaa acatgcgcag tgacgacgcg 540
ctgctcaaga actacggtct gctctcctgc ttccggaagg acctgcataa gacggagacg 600
tacctgaggg tcatgaagtg ccgccgcttc ggggaggcca gctgtgcctt ctag 654
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cgggatccat gatggctgca ggcc 24
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ccctcgagct agaaggcaca ggc 23

Claims (10)

1.一种重组载体，其特征在于，包括SUMO肽的基因和牛生长激素基因Bgh。
2.一种宿主，其特征在于，包括如权利要求1所述的重组载体。
3.根据权利要求2所述的宿主，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌。
4.根据权利要求2或3所述的宿主，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌BL21。
5.一种重组牛生长激素的表达方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：获得牛生长激素基因Bgh，在其两端引入酶切位点BamHⅠ、XhoⅠ；
步骤2：扩增获得目的基因，连接到载体，转化宿主，经过BamHⅠ、XhoⅠ双酶切获取目的基因牛生长激素基因Bgh；
步骤3：获得Pet-32a-Sumo表达载体；
步骤4：取步骤2获得的牛生长激素基因Bgh与Pet-32a-Sumo表达载体连接获得重组载体Pet-32a-Sumo-Bgh，转化宿主，表达，纯化。
6.根据权利要求5所述的表达方法，其特征在于，步骤2所述载体为T载体，所述宿主为E.coliTG1。
7.根据权利要求5或6所述的表达方法，其特征在于，步骤3具体为取Pet-32a-SumoTG1，经过BamHⅠ、XhoⅠ双酶切获得Pet-32a-Sumo表达载体。
8.根据权利要求5至7任一项所述的表达方法，其特征在于，步骤4中所述宿主为大肠杆菌BL21。
9.根据权利要求5至8任一项所述的表达方法，其特征在于，步骤4中所述纯化包括用UIP酶切割SUMO肽和过镍柱纯化。
10.根据权利要求5至9任一项所述的表达方法，其特征在于，步骤4中所述表达的产物为包涵体；
在所述表达之后、所述纯化之前，还包括复性的步骤。
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