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CN1068501A - A-c-b胰岛素原，其生产方法和应用，以及胰岛素生产中的中间体 - Google Patents

A-c-b胰岛素原，其生产方法和应用，以及胰岛素生产中的中间体 Download PDF

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CN1068501A
CN1068501A CN92105143A CN92105143A CN1068501A CN 1068501 A CN1068501 A CN 1068501A CN 92105143 A CN92105143 A CN 92105143A CN 92105143 A CN92105143 A CN 92105143A CN 1068501 A CN1068501 A CN 1068501A
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CN
China
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insulin
dna
peptide
plasmid
acb
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Pending
Application number
CN92105143A
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R·M·贝拉加治
R·D·迪马奇
小·W·F·希思
H·B·朗
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Eli Lilly and Co
Original Assignee
Eli Lilly and Co
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Abstract

本发明提供一种新的分子，它是用重组体DNA 方法由胰岛素原成分衍生的。本发明提供化学式为 A—C—B的分子，其中A是胰岛素类的A链，B是胰 岛素类的B链，C是一种连接肽。这些分子具有类胰 岛素活性，可用于治疗糖尿病症，特别是非—胰岛素 依赖的糖尿病症。这些分子也可用于生产胰岛素，并 构成重组体生产胰岛素的新途径。本发明提供了以 本发明化合物作中间物而生产胰岛素的方法。本发 明还提供编码本发明化合物的重组体DNA化合 物。

Description

对糖尿病的广泛研究，已使胰岛素成为所有蛋白质分子中最熟悉的一种。因此，在探测高级蛋白质结构和功能的初级结构变化的影响时，胰岛素已成为优选基质。重组体DNA技术有助于产生SAR类似物的新胰岛素以及治疗应用。这些变化的归类结果有希望揭示控制初级和高级蛋白质结构之间关系的规则。然而，初级结构的这种变化很少涉及天然顺序。而且，天然顺序的这种有限转换对存在的更多途径几乎没有什么了解。
生物化学研究目的是要合成具有选定功能的分子，而不是希望发现具有所要性能的天然存在的化合物。尽管有明显的进步，但现有技术基本上没有得到初级结构与天然存在对应物明显不同的合成类似物实例。本发明使用了很有特征的胰岛素分子以着手研制合成胰岛素原类似物，该胰岛素原的结构和物理性质与天然存在的胰岛素原分子和公知的胰岛素原类似物明显不同。
胰岛素是一种含有二个亚单位多肽的蛋白质，该多肽通常被认为A-链和B-链通过二硫化物键共价交叉连接。人的胰岛素（一种胰岛素结构的典型例子）简图如图29所示。现有技术中生产胰岛素的生化途径是众所周知的，在本文一般参考文献中均可知道（参阅如，Stryer，L.，Biochemistry，2nd.Ed.，1981，W.H.Freeman&  co.，San  Francisco，pp.847-848）.体内天然存在的产生胰岛素的生化途径是通过前胰岛素原和胰岛素原中间体。
胰岛素是通过胰岛素原的表达，然后通过酶处理而重组产生的。胰岛素原，胰岛素的直接前身，是一种单链蛋白。双链胰岛素分子是通过切除胰岛素原内区，通常指C-区或C-肽而产生的。形成链内和链间二硫化物交叉键合后，内在的多肽顺序（C-肽）通过胰蛋白酶和羧肽B酶的作用而切除，生成功能性胰岛素分子。
胰岛素原基因转译顺序为B-链/C-肽/A-链氨基酸。由于重组体胰岛素生产是由胰岛素原开始而不是由前胰岛素原分子开始的，重组体胰岛素原分子在其氨基末端特征地具有一个蛋氨酸残基。因此，由胰岛素原N-末端衍生的这种Met是携带通过并留在胰岛素B-链的氨基末端。该蛋氨酸残基本质上不能被细菌宿主细胞所去除。因此，必须在体外用化学或酶促法除去这种N-末端蛋氨酸以得到天然胰岛素原或胰岛素分子。
蛋氨酰氨基态酶（MAP）（一种自然的大肠杆菌（E.Coli）蛋白）的作用可除去N-末端脱甲酰的蛋氨酸，而所提供的第二残基不是精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸或蛋氨酸。胰岛素分子（图29所示的人胰岛素是一个典型例子）的初级结构检测结果表明相当于天然胰岛素原的N-末端残基的B链的N-端残基是苯丙氨酸。这种转录和转译顺序可阻止通过MAP除去产生胰岛素原分子的重组大肠杆菌的N-末端蛋氨酸。可是，A-链的N-端氨基酸是甘氨酸，甘氨酸的存在不会抑止MAP的作用。因此，若人们能将转译顺序由B-链/C-肽/A-链变成A-链/C-肽/B-链，则MAP的固有作用可除去N-端蛋氨酸。这必然可排除后转译去除N一端Met的必要，从而具有明显的工业和工艺优点。
本发明提供一种功能性胰岛素分子或胰岛素类似物的生产方法，它包括新的原料和中间体。这种新途径是通过将胰岛素原的编码顺序从B-链/C-肽/A-链变为A-链/C-肽/B-链而形成的一种胰岛素前身而进行的。形成的新型胰岛素前身消除了后转译化学或酶除去重组体胰岛素分子的N一端蛋氨酸的必要性。本发明还提供了新型的胰岛素前身中间体，在产生胰岛素的人体工程生物合成途径中它构成主要成份。这些新型的胰岛素前身具有：（a）比天然存在的胰岛素原更大的类胰岛素活性，（b）相对于天然胰岛素原的胰岛素特性来说在体内有更长的半寿命，（c）与天然胰岛素原相比，表明有更强的与IGF-I受体结合能力。本发明还揭示了从这种新分子的研究和设计中所看到的局限性，特别是对C-肽来说，它对类胰岛素原和胰岛素分子的设计是有益的。
附图中所示的限制性位点和功能图是本文所讨论的重组体DNA载体的近似代表。限制性位点的资料不完全;因此在载体中特定类型的限制性位点比图中所示的更多。
图1-质粒pKC283的限制性位点和功能图。
图2-质粒pKC283PX的限制性位点和功能图。
图3-质粒pKC283-L限制性位点和功能图。
图4-质粒pKC283-LB的限制性位点和功能图。
图5-质粒pKC283-PRS的限制性位点和功能图。
图6-质粒pL32的限制性位点和功能图。
图7-质粒pNM789的限制性位点和功能图。
图8-质粒120构建的示意图。
图9-质粒pL47的限制性位点和功能图。
图10-质粒pPR12的限制性位点和功能图。
图11-质粒pPR12AR1的限制性位点和功能图。
图12-质粒pL110的限制性位点和功能图。
图13-质粒pL110C的构建示意图。
图14-质粒pCZR126S的限制性位点和功能图。
图15-是说明BCA和ACB胰岛素原分子的A-链、B-链和C-肽取向基本不同的示意图。
图16-由合适的较短的合成DNA顺序的复合物所衍生的ACB-PI编码顺序构建方法的示意图。
图17-表示包含在用ACB-PI基因设计的人ACB-PI基因的一种类似物构件中的特定DNA顺序。
图18-说明设计成人ACB-PI编码顺序类似物的限制性核酸内切酶的切点位置的实施例，该顺序易于整合成本文所举例的特殊克隆载体。
图19-质粒pRB181的限制性位点和功能图。
图20-质粒pRB182的限制性位点和功能图。
图21-Met-ACB胰岛素原和ACB-胰岛素原的反相HPLC分析。色谱分析条件在实施例中已提及。
图22-胰蛋白酶/胃蛋白酶消化后，ACB-胰岛素原的肽图。色谱表明，所得到的肽与三种可能的二硫化物异构体肽的淋洗位置在一起。
图23-人胎盘胰岛素受体结合测试结果。该图表示将125I胰岛素结合到胰岛素受体时人胰岛素、人胰岛素原、ACB-胰岛素原、Met-ACB-胰岛素原的竞争。
图24-人胎盘IGF-I受体的结合。该图表示用125I IGF-I结合到IGF-I受体时，人IGF-I、Met-ACB-胰岛素原、ACB-胰岛素原、人胰岛素和人胰岛素原的竞争。
图25-ACB-胰岛素原蛋白水解转化为胰岛素的HPLC分析。所显示的色谱图是（a）24小时后的反应，（b）生物合成的人胰岛素，和（c）生物合成的人胰岛素原。色谱分析条件在实施例中提及。
图26-胰岛素原转化反应的制备HPLC色谱分析图。
图27-来自转化反应的胰岛素的肽图。
图28-人胎盘胰岛素受体的结合。人胰岛素和由ACB-胰岛素原制备的人胰岛素对于用125I胰岛素结合到人胰岛素受体的竞争。
图29-说明天然存在的（BCA）人胰岛素原和新转化的（ACB）人胰岛素原分子之间初级结构的差别。
对本文所公开和所要求的本发明目的而言，下列术语的限定如下：
ACB-hPI-人ACB-胰岛素原的缩写。
ACB-PI-ACB-胰岛素原的缩写。
ACB-胰岛素原-是一种多肽分子，它含有（a）相当于胰岛素A-链的氨基酸顺序或其按顺序结合的功能性类似物，（b）一种连接肽，它将胰岛素A-链的羧基端氨基酸连接到胰岛素B-链的氨基端氨基酸，所述连接肽至少含有8个氨基酸，它按顺序结合到（c）相当于胰岛素B-链或其功能性类似物的氨基酸顺序。
A-链-胰岛素的A-链或其功能性类似物，它形成胰岛素分子的二个亚单位之一个。
Ala-氨基酸丙氨酸。
类似物-一种结构上与另一种类似的化合物。当用于多肽时，则它是指伯、仲、叔结构。
Arg-氨基酸精氨酸。
Asn-氨基酸天冬酰胺。
Asp-氨基酸天冬氨酸。
B-链-胰岛素的β-链或其功能性类似物相当于双链胰岛素蛋白的较大亚单位。
碱基对（bp）-是指DNA或RNA。缩写A、C、G和T分别对应于核苷酸（脱氧）腺嘌呤、（脱氧）胞苷、（脱氧）鸟嘌呤和（脱氧）胸苷（当它们存在在DNA分子中时）的5′-单磷酸酯形式。缩写U、C、G和T分别对应于核苷尿嘧啶、胞苷、鸟嘌呤和胸腺嘧啶（当它们存在在RNA分子中时）的5′-单磷酸酯形式。在双链DNA中，碱对可指A与T或C与G的配偶体。在DNA/RNA异源双链核酸分子中，碱对可指T与U或C与G的配偶体。
BCA胰岛素原-天然存在的胰岛素原或其功能性类似物。它是用于区别本文所述的ACB-胰岛素原分子的术语，其中胰岛素亚单位的转译顺序已换向。
C-肽-至少8个氨基酸的多肽顺序，这种多肽放置在胰岛素A-链氨基酸顺序（或胰岛素A-链的功能性类似物的氨基酸顺序）和胰岛素B-链氨基酸顺序（或胰岛素B-链类似物的氨基酸顺序）之间，具有足够的构象排列，能适当形成胰岛素前身分子的链内和链间二硫化物桥。
Cys-氨基酸半胱氨酸或胱氨酸残基的一半，它通过二硫化物桥共价连接到胱氨酸残基的另一半上。
DNA-脱氧核糖核酸。
EDTA-乙二胺四乙酸的缩写。
ED50-半极大值的缩写。
FAB-MS-快原子轰击质谱分析的缩写。
功能性类似物一是指相对于天然存在的那种分子或化合物形式来说，具有相似的功能性性质但结构改变的一种分子或化合物。
Gln-氨基酸谷氨酰胺。
Glu-氨基酸谷氨酸。
Gly-氨基酸甘氨酸。
His-氨基酸组氨酸。
hPI-人胰岛素原的缩写。
胰岛素-一种蛋白质激素或其功能性类似物，它可降低血糖浓度，促进葡糖的利用并阻断糖原分解。胰岛素遍于哺乳动物王国的胰。
胰岛素前身-一种单链多肽，当内氨基酸顺序切除时，则它成为双链胰岛素分子或胰岛素类似物。
Ile-氨基酸异亮氨酸。
Leu-氨基酸亮氨酸。
Lys-氨基酸赖氨酸。
Met-氨基酸蛋氨酸或其脱甲酰类似物。
Met-ACB-PI-甲硫氨酰ACB胰岛素原的缩写。
Met-ACB-hPI-甲硫氨酰ACB人胰岛素原的缩与。
Met-ACB-胰岛素原-一种ACB-胰岛素原分子，它带有一个共价连接到ACB-胰岛素原分子的氨基端的蛋氨酸残基。
mRNA-信使RNA。
MWCO-分子量切断的缩写。
NIDDM-一种非胰岛素依赖糖尿病的缩写。
Nle-正亮氨酸。
Nva-正缬氨酸。
orn-鸟氨酸。
Phe-氨基酸苯丙氨酸。
质粒-一种染色体外的自复制基因要素。
PMSF-苯基甲基磺酰基氟化物的缩写。
Pro-氨基酸脯氨酸。
解读密码-通过tRNA转译仪在三联体中转译产生“阅读”的核苷酸顺序和核蛋白体和联合因子，各三联体相当于特定的氨基酸。因为各种三联体是截然不同的，编码顺序长度相同的必定是三重的，碱对插入或中间缺失（称为移码突变）可导致同样顺序编码的二种不同的蛋白质。为确保阻止这种现象，相当于所要多肽的三联体密码子必须从起始密码子三重排列，即，要保持正确的“解读密码”。
重组体DNA克隆载体一任何自发复制剂包括（但不限于）质粒和噬菌体，含有一个DNA分子，在其上能够或已加入一个或多个另外的DNA片段。
重组体DNA表达载体-已掺入启动子的任何重组体DNA克隆载体。
复制子-一种DNA顺序，它控制并可自发复制质粒或其它载体。
RNA-核糖核酸。
RP-HPLC-反相高效液相色谱的缩写。
Ser-氨基酸丝氨酸。
Thr-氨基酸苏氨酸。
转录-将DNA核苷酸顺序中所包含的信息转移到互补RNA顺序的过程。
转译-将信使RNA的遗传信息用于确定并直接合成多肽链的过程。
Tris-三（羟甲基）氨基甲烷的缩写。
Trp-氨基酸色氨酸。
Tyr-氨基酸酪氨酸。
Val-氨基酸缬氨酸。
载体-在基因操作中用于细胞转换的一种复制子，它载有相当于合适蛋白质分子的多核苷酸顺序，当该蛋白质分子与合适的控制顺序结合时，具有待转换的宿主细胞中的特定性能。质粒、病毒和噬菌体是合适的载体，因为它们按其特有的权利是复制子。人造载体是通过使用限制性酶和连接酶切割和加入来自不同源的DNA分子而构建的。载体包括重组体DNA克隆载体和重组体DNA表达载体。
x-gal-5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳糖苷的缩写。
本发明提供了化学式如下的多肽化合物：
其中：
Met＝氨基酸蛋氨酸，
x＝0或1，
A＝胰岛素的A链或其功能性衍生物，
B＝胰岛素的B链或其功能性衍生物，
C＝胰岛素的C肽或分子式如下的肽：
其中：
X1、X2、X3和X4是碱性氨基酸，
X1、X2、X3和X4是相同或不同的，
p是4至约35个氨基酸的肽，它不含半胱氨酸残基。
分子式1的化合物具有二种不同的作用：
（1）作为重组体生产胰岛素的前身，
（2）独立的治疗化合物。
这些化合物用作胰岛素前身的用途如下所述。
分子式1的化合物构建新型的“胰岛素原”蛋白质或胰岛素前身，下文称为“ACB-胰岛素原”，除如下所述的胰岛素新途径中是中间体以外，它具有独立的有利性能。在本文例举的本发明优选实施例中，所述的化学式1的化合物含有如下的氨基酸顺序：（顺序ID  NO.1）
Gly  Ile  Val  Glu  Gln  Cys  Cys  Thr  Ser
Ile  Cys  Ser  Leu  Tyr  Gln  Leu  Glu  Asn
Tyr  Cys  Asn  Arg  Arg  Glu  Ala  Glu  Asp
Leu  Gln  Val  Gly  Gln  Val  Glu  Leu  Gly
Gly  Gly  Pro  Gly  Ala  Gly  Ser  Leu  Gln
Pro  Leu  Ala  Leu  Glu  Gly  Ser  Leu  Gln
Lys  Arg  Phe  Val  Asn  Gln  His  Leu  Cys
Gly  Ser  His  Leu  Val  Glu  Ala  Leu  Tyr
Leu  Val  Cys  Gly  Glu  Arg  Gly  Phe  Phe
Tyr  Thr  Pro  Lys  Thr
图15和29的图解法分析结果说明天然“BCA”胰岛素原和新的、倒置的、“ACB”-胰岛素原之间总的结构变化。天然胰岛素原（指本文和图15中的BCA-胰岛素原，它不同于新的倒置的ACB-胰岛素原）和ACB-胰岛素原之间的结构变化是极大的。
在现有技术中众所周知，在蛋白质结构中的某些变更足以抑止或完全阻止仲、叔结构的适当形成，从而得到非功能性蛋白质。在依赖于适当形成活性二硫化物交叉键如胰岛素原和胰岛素的分子中这是特别理想的。完全出乎意料和令人惊奇的是ACB-胰岛素原和BCA-胰岛素原之间明显的构象区别导致分子（a）比天然胰岛素原具有更大的明显类胰岛素活性，（b）当切除c-肽时，形成有适当产生的所有二硫化物交叉键的功能性胰岛素分子而在A-链上没有N-端蛋氨酸残基。
现已证明，固定在Arg65-Gly66键上的胰岛素原形式，比天然形式的胰岛素原具有更大的类胰岛素活性，可能由于释放A-链的氨基端残基仍保持胰岛素原的大小和整个结构的结果（Peavy，D.E.，etal.，（1985）J.Biol.chem.，vol.260，13989-13394）。ACB-胰岛素原分子具有A-链的游离氨基末端，但它表明c-肽被固定在两端而增加的活性具有更稳定的构象。
胰岛素和胰岛素原的初级结构已有很大改进。这些变化使胰岛素和胰岛素原分子具有用于治疗各种形式糖尿病的各种所要的特性，以便于工业（特别是重组体）生产，和/或提供更理想的药物制剂。典型的但不完全的这些变化列于下表Ⅰ中。本发提供了掺入初级结构变化的ACB-胰岛素原分子，其典型的说明如表Ⅰ所示。本发明方法还提供了掺入初级结构变化的胰岛素类似物的制备方法，典型的说明如表I所示。
表1
胰岛素类似物和胰岛素原素类似物
5
A.  单个氨基酸变化
Gly A21Glu A21hSer A21Thr B10Asp B25
10 Ser A21Leu A21Gly A22Asp B10His B25
Ala A21Met A21Ala A22Arg B10Glu B26
His A21Tyr A21Asp B9Ile B12Glu B27
Asp A21Val A21Asn B9His B16Asp B28
Thr A21Ile A21His B9Gln B17Ala B30
15 Gln A21Trp A21Glu B10Gln B20des-B30
Thr30-NH2Ala30-NH2
20  B.  二个氨基酸变化
Gly A21and Asp B10His A21and Lys B27
Ser A21and Asp B10Asp A21and Lys B27
Thr A21and Asp B10Gly A21and Arg B27
25 Ala A21and Asp B10Ser A21and Arg B27
His A21and Asp B10Thr A21and Arg B27
Asp A21and Asp B10Ala A21and Arg B27
Gly A21and Thr B10Glu B27and Glu B16
Ser A21and Thr B10Asp B5and Asn B10
30 Thr A21and Thr B10Glu B12and Gln B13
Ala A21and Thr B10Ser B14and Asp B17
His A21and Thr B10Lys B28and Pro B29
Asp A21and Thr B10His A21and Arg B27
Gly A21and Arg B10Asp A21and Arg B27
表1(续)
Ser A21and Arg B10Glu B12and des B30
5 Thr A21and Arg B10Asp B10and Ser B2
Ala A21and Arg B10Asp B10and Asp B28
His A21and Arg B10Glu B10and Glu A13
Asp A21and Arg B10Glu B27and Ser A13
Asp B10and des-B30Glu B27and Asp A21
10 Thr B10and des-B30Glu B27and Glu B1
Arg B10and des-B30Glu B27and Asp B9
Gly A21and Lys B27Gly A21and Ala B30
Ser A21and Lys B27Ser A21and Ala B30
Thr A21and Lys B27Thr A21and Ala B30
15 Ala A21and Lys B27Ala A21and Ala B30
des B29and des B30hSer A21and Ala B30
20  C.  三个氨基酸变化
A21Gly+Lys B27+Gln A17
A21Ser+Lys B27+Gln A17
A21Thr+Lys B27+Gln A17
25 A21Ala+Lys B27+Gln A17
A21His+Lys B27+Gln A17
A21Asp+Lys B27+Gln A17
Gly A21+Lys B27+Gln B13
Ser A21+Lys B27+Gln B13
30 Thr A21+Lys B27+Gln B13
Ala A21+Lys B27+Gln B13
His A21+Lys B27+Gln B13
Asp A21+Lys B27+Gln B13
Gly A21+Arg B27+Gln A17
表1(续)
Ser A21+Arg B27+Gln A17
Thr A21+Arg B27+Gln A17
Ala A21+Arg B27+Gln A17
His A21+Arg B27+Gln A17
Asp A21+Arg B27+Gln A17
Gly A21+Arg B27+Gln B13
Ser A21+Arg B27+Gln B13
Thr A21+Arg B27+Gln B13
Ala A21+Arg B27+Gln B13
His A21+Arg B27+Gln B13
Asp A21+Arg B27+Gln B13
Asp B10+His A8+His B25
Glu B10+Glu A3+Glu B22
Glu B27+Ser B5+Asp B5
Glu B27+His A8+Asp B9
Glu B27+Asp A21+Asp B9
des B28+des B29+des B30
Gly A21+Asp B10+Ala B30
Ser A21+Asp B10+Ala B30
Thr A21+Asp B10+Ala B30
Ala A21+Asp B10+Ala B30
His A21+Asp B10+Ala B30
Asp A21+Asp B10+Ala B30
Gly A21+Thr B10+Ala B30
Ser A21+Thr B10+Ala B30
Thr A21+Thr B10+Ala B30
Ala A21+Thr B10+Ala B30
His A21+Thr B10+Ala B30
Asp A21+Thr B10+Ala B30
Gly A21+Arg B10+Ala B30
Ser A21+Arg B10+Ala B30
表1(续)
Thr A21+Arg B10+Ala B30
Ala A21+Arg B10+Ala B30
His A21+Arg B10+Ala B30
Asp A21+Arg B10+Ala B30
Gly A21+Asp B10+des B30
Ser A21+Asp B10+des B30
Thr A21+Asp B10+des B30
Ala A21+Asp B10+des B30
His A21+Asp B10+des B30
Asp A21+Asp B10+des B30
Gly A21+Thr B10+des B30
Ser A21+Thr B10+des B30
Thr A21+Thr B10+des B30
Ala A21+Thr B10+des B30
His A21+Thr B10+des B30
Asp A21+Thr B10+des B30
Gly A21+Arg B10+des B30
Ser A21+Arg B10+des B30
Thr A21+Arg B10+des B30
Ala A21+Arg B10+des B30
His A21+Arg B10+des B30
Asp A21+Arg B10+des B30
Thr B10+Glu B28+Pro B29
Arg B10+Glu B28+Pro B29
Asp B10+Lys B28+Pro B29
Thr B10+Lys B28+Pro B29
Arg B10+Lys B28+Pro B29
Gly A21+Glu B28+Pro B29
Ser A21+Glu B28+Pro B29
Thr A21+Glu B28+Pro B29
Ala A21+Lys B28+Pro B29
His A21+Lys B28+Pro B29
表1(续)
Asp A21+Lys B28+Pro B29
Glu B28+Pro B29+Ala B30
Glu B28+Pro B29+des B30
Lys B28+Pro B29+Ala B30
Lys B28+Pro B29+des B30
Arg B27+Gly A21+ThrB30-NH2
D.  四个氨基酸变化
Gly A21+Lys B27+Gln A17+Gln B13
Ser A21+Lys B27+Gln A17+Gln B13
Thr A21+Lys B27+Gln A17+Gln B13
Ala A21+Lys B27+Gln A17+Gln B13
Asp A21+Lys B27+Gln A17+Gln B13
His A21+Lys B27+Gln A17+Gln B13
Gly A21+Arg B27+Gln A17+Gln B13
Ser A21+Arg B27+Gln A17+Gln B13
Thr A21+Arg B27+Gln A17+Gln B13
Ala A21+Arg B27+Gln A17+Gln B13
Asp A21+Arg B27+Gln A17+Gln B13
His A21+Arg B27+Gln A17+Gln B13
Glu B10+His A8+His B4+His B27
des B27+des B28+des B29+des B30
Gly A21+Asp B10+Glu B28+Pro B29
Ser A21+Asp B10+Glu B28+Pro B29
Thr A21+Asp B10+Glu B28+Pro B29
Ala A21+Asp B10+Glu B28+Pro B29
His A21+Asp B10+Glu B28+Pro B29
Asp A21+Asp B10+Glu B28+Pro B29
Gly A21+Thr B10+Glu B28+Pro B29
Ser A21+Thr B10+Glu B28+Pro B29
表1(续)
Thr A21+Thr B10+Glu B28+Pro B29
Ala A21+Thr B10+Glu B28+Pro B29
His A21+Thr B10+Glu B28+Pro B29
Asp A21+Thr B10+Glu B28+Pro B29
Gly A21+Arg B10+Glu B28+Pro B29
Ser A21+Arg B10+Glu B28+Pro B29
Thr A21+Arg B10+Glu B28+Pro B29
Ala A21+Arg B10+Glu B28+Pro B29
His A21+Arg B10+Glu B28+Pro B29
Asp A21+Arg B10+Glu B28+Pro B29
Gly A21+Asp B10+Lys B28+Pro B29
Ser A21+Asp B10+Lys B28+Pro B29
Thr A21+Asp B10+Lys B28+Pro B29
Ala A21+Asp B10+Lys B28+Pro B29
His A21+Asp B10+Lys B28+Pro B29
Asp A21+Asp B10+Lys B28+Pro B29
Gly A21+Thr B10+Lys B28+Pro B29
Ser A21+Thr B10+Lys B28+Pro B29
Thr A21+Thr B10+Lys B28+Pro B29
Ala A21+Thr B10+Lys B28+Pro B29
His A21+Thr B10+Lys B28+Pro B29
Asp A21+Thr B10+Lys B28+Pro B29
Gly A21+Arg B10+Lys B28+Pro B29
Ser A21+Arg B10+Lys B28+Pro B29
Thr A21+Arg B10+Lys B28+Pro B29
Ala A21+Arg B10+Lys B28+Pro B29
His A21+Arg B10+Lys B28+Pro B29
Asp A21+Arg B10+Lys B28+Pro B29
Gly A21+Glu B28+Pro B29+Ala B30
Ser A21+Glu B28+Pro B29+Ala B30
Thr A21+Glu B28+Pro B29+Ala B30
Ala A21+Glu B28+Pro B29+Ala B30
表1(续)
His A21+Glu B28+Pro B29+Ala B30
Asp A21+Glu B28+Pro B29+Ala B30
Gly A21+Lys B28+Pro B29+Ala B30
Ser A21+Lys B28+Pro B29+Ala B30
Thr A21+Lys B28+Pro B29+Ala B30
Ala A21+Lys B28+Pro B29+Ala B30
His A21+Lys B28+Pro B29+Ala B30
Asp A21+Lys B28+Pro B29+Ala B30
Gly A21+Glu B28+Pro B29+des B30
Ser A21+Glu B28+Pro B29+des B30
Thr A21+Glu B28+Pro B29+des B30
Ala A21+Glu B28+Pro B29+des B30
His A21+Glu B28+Pro B29+des B30
Asp A21+Glu B28+Pro B29+des B30
Gly A21+Lys B28+Pro B29+des B30
Ser A21+Lys B28+Pro B29+des B30
Thr A21+Lys B28+Pro B29+des B30
Ala A21+Lys B28+Pro B29+des B30
His A21+Lys B28+Pro B29+des B30
Asp A21+Lys B28+Pro B29+des B30
Asp B10+Glu B28+Pro B29+Ala B30
Thr B10+Glu B28+Pro B29+Ala B30
Arg B10+Glu B28+Pro B29+Ala B30
Asp B10+Lys B28+Pro B29+Ala B30
Thr B10+Lys B28+Pro B29+Ala B30
Arg B10+Lys B28+Pro B29+Ala B30
Asp B10+Glu B28+Pro B29+des B30
Thr B10+Glu B28+Pro B29+des B30
Arg B10+Glu B28+Pro B29+des B30
Asp B10+Lys B28+Pro B29+des B30
表1(续)
Thr B10+Lys B28+Pro B29+des B30
Arg B10+Lys B28+Pro B29+des B30
des B27+des B28+des B29+des B30
E.  五个氨基酸变化
des B26+des B27+des B28+des B29+des B30
虽然最好使用上述天然存在的C-肽顺序，该肽长度和氨基酸顺序的变化是容许的，但结果生成功能性ACB-PI分子。分子模拟研究表明，上述ACB-PIS的C肽区可短至8个氨基酸。这些研究还表明，该C-肽比其天然长度（在人胰岛素原中为35氨基酸）更长，并且仍可适当形成成熟胰岛素分子的仲、叔和季结构。唯一要求是：（1）它们要有足够长度以便在ACB-胰岛素原分子中形成合适的二硫化物键，和（2）它们可由ACB-PI分子分裂并伴随胰岛素的形成。
本发明的其它实施方案包括：兔、猴、马、鼠Ⅰ、鼠Ⅱ、猪、牛仔、狗、豚鼠、灰鼠、或鸭的ACB-胰岛素原分子。最好这些变种的ACB-胰岛素原分子的氨基酸顺序是A-链的天然存在的氨基酸顺序，然后是C-肽的天然存在的顺序，然后是B-链的天然存在的顺序。本发明的其它实施方案可为上述种类衍生的胰岛素原分子的功能性类似物。
ACB-胰岛素原构建含有化学式如下的C-肽：x1-x2-（4-8氨基酸）-x3-x4
x1-x2-（9-13氨基酸）-x3-x4
x1-x2-（14-19氨基酸）-x3-x4
x1-x2-（20-24氨基酸）-x3-x4
x1-x2-（25-31氨基酸）-x3-x4
其中X1、x2、x3和x4是碱性氨基酸，x1、x2、x3和x4是相同或不相同的，而且其中插入的氨基酸顺序不含有半胱氨酸残基，也可用于实施本发明。在本发明的优选实施例中，x1、x2、x3和x4选自含有Arg、Lys和Orn的基团。
长度比35个氨基酸更长的插入肽也能用于实施本发明。但是当C-肽长度增加时，具有这种延伸C-肽的ACB-胰岛素原分子的构象自由度也同时增加。这种构象自由度增加通常会导致折叠效果降低的分子。因此，在本发明的优选实施例中，该C-肽长度约少于35氨基酸。
除了由这些中间体表明的新型蛋白质结构以外，这些新化合物也已被证实具有治疗重要性。虽然胰岛素原的大部分生物活性保留在A和B链中，胰岛素原生物活性方面C-肽键合换向的潜在作用是未知的。通过使甘氨酸A-1的氨基末端基团游离，发明人已制成一种胰岛素类似物，它具有比天然BCA-胰岛素原更大的类胰岛素活性，但在体内保留更长的天然胰岛素原半寿命性能。ACB-胰岛素原由于能与IGF-I受体结合，它还具有在平滑肌细胞中促进DNA合成的能力。
两种转化的胰岛素原的生物活性都具有许多体内和体外测试特性。在许多情况下，转化的胰岛素原表明在胰岛素和胰岛素原之间吸收中间物活性葡糖。当用125I胰岛素测试其与胎盘膜胰岛素受体结合的竞争能力时，与胰岛素（0.45nM）和胰岛素原（20.4nM）相比，Met-ACB-胰岛素原和ACB-胰岛素原的ED50值分别为5.5和3.1nM，如图23和表Ⅱ所示。
表Ⅱ
转化的胰岛素原类似物的体外生物活性
ED50(nM)
胰岛素  IGF-I  葡糖
类似物  受体  受体  输送
胰岛素  0.45  328  0.043
IGF-I  未测  0.45  未测
胰岛素原  20.4  10000  未测
ACB-胰岛素原  3.1  520  0.83
Met-ACB-胰岛素原  5.5  940  2.5
还测定了ACB-胰岛素原促进通过脂肪细胞吸收葡糖的能力，与胰岛素相比，对这两种蛋白质的潜力给出相似的值，如表Ⅱ所示。与其在胰岛素受体上的作用相反，这两种分子在人平滑肌细胞中促进DNA合成的能力与胰岛素原相比更类似于胰岛素。
转化的胰岛素原在体内比体外活性大得多，如表Ⅲ所示，具有相同的延长作用时间。
本文所列试验结果表明，在结合胰岛素受体方面，人ACB-胰岛素原的效力约为胰岛素的10%，但结合到IGF-I受体方面其效力为胰岛素的65%。而且，人ACB-胰岛素原分子在体内具有约30%的天然人胰岛素的胰岛素活性。在本研究中，所比较的化合物是胰岛素、胰岛素原、ACB-胰岛素原和Met-ACB-胰岛素原。与天然胰岛素原相比，转化的胰岛素原、ACB-胰岛素原和Met-ACB-胰岛素原对胰岛素和IGF-I受体的活性表明明显增加。在甘氨酸A-1残基上加一个蛋氨酸对Met-ACB-PI的体外活性有明显影响，但对其在体内的活性只有极小的影响。
表Ⅲ所列数据是在禁食的、雄性、瘦的Sprague-Dawley鼠中进行试验而得到的（Charles  River  Laboratories）。
表Ⅲ
胰岛素类似物在体内降血糖的效果
最大降血糖效果ED50(nM)2对胰岛素的
物质 (%)11小时,2小时 相对生物作用
Figure 921051433_IMG1
 1  最大降血糖效果以相同试样中对控制基团的校正时间为0时的%变化表示的。
2 ED50值表示蛋白质的浓度，它是在皮下给药1或2小时后给出的半最大降血糖活性。
上表中的值是平均值±S.E.M，用人胰岛素分别进行三次测定，对各胰岛素原分别进行二次测定。
人胰岛素在皮下给药1小时后产生极大的降血糖反应，3-4小时后血液葡糖量回到基线。人胰岛素原和ACB-胰岛素原在皮下给药2小时后产生最大的降血糖效果，在留下的3-4小时期间继续提供较大的生物反应，其大小取决于给药剂量。此外，发现转化的胰岛素原比胰岛素原的效力约高二倍，体内用ACB-胰岛素原比Met-ACB-胰岛素原化合物更有效，如表Ⅲ所示。
本发明提供了一种糖尿病的治疗方法。本发明提供了一种非胰岛素依赖性糖尿病的治疗方法。该方法包括对生物给药ACB-胰岛素原，其剂量约为10-1000μg/kg。优选剂量约为10-100μg/kg活性化合物。对成人而言，通常日剂量约为0.5-100mg。
在实施本发明方法时，化学式Ⅰ的化合物可以按每天一次日剂量或每天多次剂量给药。按规定治疗期间必须给药。每次给药的剂量或给药的总剂量取决于如疾病性质和严重程度，病人的年龄和一般健康状况及病人对化合物的忍耐程度诸因素。
实施该治疗方法的一种方便方法是通过静脉输注给药化学式1的化合物。在该方法中，将合适的可溶性化合物盐的消毒制剂加入生理液体如5%葡萄糖溶液中，将得到的溶液慢慢注入Ⅳ。另一种方法也能用Ⅳ注入的背上方法（Piggy-back  method）。
化学式1的化合物，即ACB-胰岛素原可用作长效主要胰岛素替代物。ACB-胰岛素原及其类似物对于治疗相当重要，特别是对非胰岛素依赖的糖尿病（NIDDM）病人而言，它能调节葡萄糖的新陈代谢。
本发明还提供了含有化学式1化合物的药物制剂。该化合物，最好呈药物可接受盐的形式，能配制成口服或非肠道给药方式，以治疗或预防性治疗糖尿病和/或非-胰岛素依赖糖尿病（NIDDM）。
例如，化学式1的化合物可与普通的药物载体和赋形剂混合，以片剂、胶囊、清药酒、悬浮液、糖浆、包药干糊片等形式使用。含有ACB-胰岛素原化合物的组合物约含有0.1-90%重量的活性化合物，更一般约含10-30%。该组合物可含有普通载体和赋形剂，如玉米淀粉或明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和藻酸。
在本发明制剂中常用的分解剂包括croscarmellose、微晶纤维素、玉米淀粉、淀粉钠、甘醇酸酯和藻酸。
可以包括的片剂粘合剂是阿拉伯胶，甲基纤维素、羧甲基纤维素钠盐、聚乙烯基吡咯烷酮（Povidone）、羟丙基甲基纤维素、蔗糖、淀粉和乙基纤维素。
可以使用的润滑剂包括硬脂酸镁或其它金属的硬脂酸盐、硬脂酸、硅酮液体、滑石、蜡、油和胶态二氧化硅。
增香剂如薄荷、冬青油、樱桃香料或类似物也能用。
最好加入一种着色剂，以使配料外形更吸引人或有助于鉴别产品。
对于静脉内（Ⅳ）使用时，化学式1的化合物水溶性形式可溶于一种常用的静脉注射液体中，并通过注射给药。可用的该液体，如生理盐水、林格氏溶液，或5%葡糖溶液。
对于肌内用制剂，可将化学式Ⅰ化合物的合适水溶性盐形式的消毒制剂，如盐酸盐溶解，并以药物稀释剂，如无热原水（蒸馏水）、生理盐水或5%葡糖溶液给药。可制备该化合物的合适的不溶性形式，并以水基悬浮液或药物可接受的油基如长链脂肪酸的酯如油酸乙酯的悬浮液而给药。
对于口服使用时，将ACB-胰岛素的合适盐形式的消毒制剂，如盐酸盐，配制在稀释剂，如蒸馏水或去离子水中是特别有用的。
或者，该化合物的单位剂量形式可为该化合物（最好以其盐的形式）溶于在消毒的气密安瓿中的合适稀释剂中的溶液。单位剂量的化合物浓度可以改变，如约1%-50%，这取决于该化合物的特定形式及其溶解度和医生所要求的剂量。
本发明还提供一种重组体产ACB-PI蛋白蛋质或Met-ACB-PI蛋白质的方法，该方法包括如下步骤：
1、形成一种合成基因，所述基因含有编码化学式Ⅰ的ACB-PI肽化合物的DNA顺序，
2、将该基因加入一种含有在宿主细胞功能性启动子一操纵基因区的合适载体中，
3、使该基因在所述载体中定位以达到转录和转译该合成基因，而且，该基因在所述启动子一操纵基因区的转录控制下，
4、用所述载体转化所述宿主细胞，
5、在适当条件下培养该转化的宿主细胞，以诱导该基因的转录和转译，和
6、回收和纯化该肽化合物。
用现有技术中众所周知的方法可构建合成基因，它在体外或在体内转录和转译结果产生化学式为1的化合物。由于基因编码的自然退化，技术人员认识到可构建编码化学式1化合物的适当大小但确定量的DNA顺序。
在本文例举的本发明优选实施例中，用含有DNA顺序（顺序、IDNO2）的合成基因可得到重组体生产化学式1的化合物。
这种编码化学式1化合物的DNA顺序含有氨基酸顺序：（顺序、IDNO.1）
Gly  Ile  Val  Glu  Gln  Cys  Cys  Thr  Ser
Ile  Cys  Ser  Leu  Tyr  Gln  Leu  Glu  Asn
Tyr  Cys  Asn  Arg  Arg  Glu  Ala  Glu  Asp
Leu  Gln  Val  Gly  Gln  Val  Glu  Leu  Gly
Gly  Gly  Pro  Gly  Ala  Gly  Ser  Leu  Gln
Pro  Leu  Ala  Leu  Glu  Gly  Ser  Leu  Gln
Lys  Arg  Phe  Val  Asn  Gln  His  Leu  Cys
Gly  Ser  His  Leu  Val  Glu  Ala  Leu  Tyr
Leu  Val  Cys  Gly  Glu  Arg  Gly  Phe  Phe
Tyr  Thr  Pro  Lys  Thr
通过合成方法论可形成编码ACB-胰岛素原分子的基因。这种合成基因结构的方法论在现有技术中是众所周知的。Brown，E.L.，Belagaje，R.，Ryan，M.J.，和Khorana，H.G.（1979）in  Methods  in  Enzymology.Academic  Press，N.Y.，vol.68，Pgs.109-151，全部报导均已列入本文参考文献中。用普通的DNA合成装置，如Applied  Biosystems  Model  380A或380B  DNA合成器（从Applied  Biosystems，Inc.，850  Lincoln  Center  Drive，Foster  City，CA  94404可买到）可生成相当于所关心的胰岛素原基因的DNA片段。可将合成的ACB-PI基因设计成在转录的任一端具有限制性核酸内切酶分裂位点以便于分离和整合成表达和放大质粒。限制性位点的选择要用控制顺序适当定位ACB-PI编码顺序以达到ACB-PI分子适当的码组解读和表达。可加入许多另外的这种分裂位点，这取决于所用的特定质粒结构，可用现有技术中众所周知的方法生产。该方法的示意图如图16所示。
278碱基对人ACB-PI分子结构的特定复合顺序说明如图17所示。用ACB-PI编码顺序的本发明优选实施例如图18所示，它说明对ECORI、HindIII、NdeI和BamHI的工程限制性核酸内切酶分裂位点的位置。图18所示的顺序相当于本文例举的人ACB-PI的优选ACB-胰岛素原编码顺序。
如本文举例说明的ACB-hPI基因由两半形成，如图16所示。该基因的一半是通过混合和连接寡核苷酸1、2、5和6而形成的。而该基因的另一半是通过混合和连接寡核苷酸3、4、7和8而形成的，如图16所示。二半该基因片段通过15%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。从凝胶中电泳回收DNA，将相当于半个ACB-PI基因的凝胶区切出，将该切片进行电泳。然后将电泳法分离的DNA片段在Sephadex  G-50柱上或其等同物上进行脱盐。然后将半个ACB-PI基因连结在一起而形成ACB-PI基因，接着将该基因整合入合适的载体以放大DNA。
可将编码化学式1化合物的合成基因加入载体中以用于克隆目的。为此目的易于得到各种质粒，而且整合、放大和选择方法在现有技术中是众所周知的。Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual，2nd  Ed.，vol.1，Cold  Spring  Harbor  Press，（1989）.DNA顺序也可用聚合酶链反应进行放大，如Current  Protocols  in  Molecular  Biology（1988和，Supplements）wiley-Interscience，N.Y.中所述。
在本发明的优选实施例中，将pUC18质粒（从Boehringer-Mannheim  Biochemicals，P.O.Box50414，Indianapolis，Indiana46250可买到）用于DNA放大相。选择pUC18质粒与pUC18多克隆位点中存在BamHⅠ和HindⅢ限制性核酸内切酶分裂点有关。选择放大质粒将决定限制性核酸内切酶分裂点，它设计成ACB-PI编码顺序的最末端位置。质粒的选择和合成ACB-PI基因的设计密切联系，因为放大质粒将决定待设计成ACB-PI顺序的限制性顺序，相应地可用寡核苷酸顺序构建合成的ACB-PI基因。
在本发明的一个实施例中，将约5μg的pUC18质粒悬浮在10ml缓冲液中，该缓冲液适于设计成ACB-PI合成基因的一个特定限制性酶位点。在本文举例说明的优选实施例中。这限制性酶是HindⅢ。将PUC18质粒相应地悬浮在10ml HindⅢ缓冲液（1MNacl、50mM Mgcl2，100mMtris-Hcl，pH＝8.0，10mM 2-巯基乙醇）中。在该溶液中加入等量的20单位合适的限制性酶。在本发明优选实施例中，这相当于2μlHindⅢ，它得自Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis，IN46250。用85ml水稀释该溶液，慢慢混合，并在37℃保温2小时。中止反应，用三体积的乙醇（0.3M NaOAC）溶液沉淀DNA。离心沉淀并干燥。
然后将粒状沉淀悬浮在10μl适于ACB-PI基因的其它末端选择限制性酶位点的限制性酶缓冲液中。在本文举例说明的本发明优选实施例中，BamHI是这种其它限制性酶位点。因此，将该沉淀再悬 浮在10μl BamHⅠ缓冲液中（1M NaCl、50mM MgCl2、100mMtris-HCl、pH＝8.0，10mM2-巯基乙醇）。在该溶液中加入等量的20单位合适的限制性核酸内切酶，优选为BamHI。BamHI HindⅢ、和各种可用于该方案的其它限制性核酸内切酶均可从供应处如Boehringer-Mannheim Biochemicals，P.O.Box 50414，Indianapolis，IN46250买到。然后，加入88μl水，慢慢混合该溶液，并在37℃保温2小时。再中止反应，用三体积乙醇，0.3M NaoAC溶液沉淀DNA。将上述消化的DNA在1%低熔琼脂糖凝胶上进行电泳。从该凝胶上切下相当于线性化载体DNA的较大限制性片段。将该凝胶切片基本上按制造者的说明通过Elutip-d
Figure 921051433_IMG2
柱（从Schlicher & Schuell，Keene，NH，USA买到）以回收载体DNA。然后按上述方法沉淀DNA并干燥。将该DNA贮存在30μl 10mM tris-HCl，pH＝8.0溶液中。
将约5μl载体DNA与相当于二半ACB-PI合成基因的10微微摩尔合成DNA片段混合，该合成DNA片段在50μl连接缓冲液（50mMtris-HCl，pH7.6，100mM MgCl2，10mMDTT（二硫苏糖醇），800mMATP和3.5单位T4DNA连接酶（从BoehringerMannheim Biochemicals，Indianapolis，IN46250买到）中。然后使反应物在4℃保温过夜，再用现有技术中众所周知的方法和诸如上述Sambrook，J.，等人在标准实验室手册中所述方法转化成冷冻的合适的E.coli DH5α细胞（从Bethesda Research Laboratories，Inc.，P.O.Box6009，Gaithersburg，MD20877买到）。将本发明优选实施例的转化体在含有100μg/ml氨苄青霉素的x-galTY琼脂板上在37℃生长过夜。抗菌素和培养基的选择取决于所用的放大载体和细胞系。
通过兰/白菌落的选择来选择含有矫正插入的克隆。lacz基因的功能性损失是由转化体引起的，因为PUC18克隆区的插入点在lacz编码顺序内。含有合适顺序的克隆的选择是按制造者提供的说明用Sequenase
Figure 921051433_IMG3
kit（从united states Biochemical corp.，P.O.Box22400，Cleveland，oH44122买到）通过ds-DNA顺序确定的。本发明优选实施例所得到的质粒含有人ACB-PI顺序，称为pRB181。
然后将带有放大质粒的所研制菌株在37℃在含有100mg/ml氨苄青霉素的TY培养基中生长过夜，并将含有合成ACB-hPI编码顺序的质粒按Maniatis，T.Fritsch，E.F.，and Sambrook，J.，Molecular cloning：A Laboratory Manual，cold spring Harbor Laboratory，New York（1982），pgs 89-94所述方法进行分离。通常，将按上述方法分离的约20μg质粒DNA悬浮在20μl缓冲液中，该缓冲液适于一个“内部”制成的限制性位点。这些“内部”限制性位点的选择是涉及表达载体控制区的待用表达载体的选择功能。在本文举例说明的本发明优选实施例中，选择的限制性酶是NdeⅠ。在上述溶液中加约40单位的限制性酶，175μl水，慢慢混合，并在37℃保温1小时。然后加约40单位的其它“内部”限制性核酸内切酶（在本文举例说明的优选实施例中，BamHI），再在37℃保温2小时。然后中止反应，用三体积乙醇，0.3M NaoAC沉淀DNA。然后将该溶液在1.2%低熔琼脂糖凝胶中进行电泳。然后从该凝胶中切下相当于约265bp ACB-hPI编码顺序的片段。按实施例2所述方法通过一个Elutip-d 柱回收ACB-hPI DNA。沉淀后，在真空条件下干燥，将DNA贮存在25μl10mMtris-Hcl，pH8.0的溶液中。
要使用的表达质粒可选自许多变换物，它具有一种合适的控制区和合适的限制性位点，该位点便于对控制区实用的ACB-PI编码顺序的整合，用于转化原核细胞和转染真核细胞的许多表达载体在现有技术中是众所周知的。所述表达载体的例子包括pTrc 99A、pKK223-3、pKK223-2、pDR540 tac启动子载体、pDR trp启动子载体、pCZ20、pLEBBGH2，和pL110C。在本文举例说明的本发明最优选实施例中，当宿主细胞是大肠杆菌K12细胞时，该表达载体是pCZR126S。这种质粒可按本文实施例3的方法制备。
为得到有效转录的合成基因，该基因必须实用地与启动子操纵基因区有关。在大肠杆菌宿主细胞中各种启动子操纵基因区功能在现有技术中是众所周知的。在本文举例说明的本发明优选实施例中，该启动子一操纵基因区是λpL启动子操纵基因区。
在本发明优选实施例中，当启动子操纵基因根据该基因的ATG一起始密码子（它是由该基因衍生的）而占有时，编码化学式1化合物的合成基因的启动子操纵基因区根据合成基因的ATG起始密码子放在同一顺序定位。已形成合成或改性的启动子操纵基因区，在现有技术中是众所周知的。当使用这种合成的或改性的启动子一操纵基因区时，它们应根据ACB-PI基因的ATG一起始密码子（按其生产者的指示）进行定位。
在本文提供的本发明优选实施例中，将15μg选择的表达质粒（pCZR126S）悬浮在20μl缓冲液中，该缓冲液相当于ACB-PI编码顺序的两个“内部”限制性位点的第一个（在本文例举的情况下是NdeⅠ限制性位点）。在其中加入约40单位的限制性酶（如NdeⅠ），175μl的水，并在37℃保温2小时。保温后，按上述方法用三体积的乙醇，0.3MNaoAC沉淀DNA，干燥并再悬浮在20μl限制性酶缓冲液中，该缓冲液相当于第二个“内部”限制性位点（在本文例举的情况下是BamHI限制性位点）。在该溶液中加入约25单位的第二限制性酶（如BamHI）和～178μl水，慢慢混合，在37℃下再保温2小时。再中止反应，用三体积的乙醇，0.3MNaOAC沉淀DNA。然后将如此分离的pCZR126S载体DNA在1%低熔琼脂凝胶上进行电泳。然后从该凝胶中切下相当于载体DNA的较大片段，并通过一个Elutip-d
Figure 921051433_IMG5
柱而分离载体DNA。沉淀并干燥后，将载体DNA贮存在35μl 10mM tris-Hcl，pH8.0溶液中。
然后将约2.5ml上述载体DNA溶液与上述制备的约12μl纯ACB-PI片段的溶液相混合。在该溶液中加入4μl 10mM ATP，0.5μl 1M二硫苏糖醇，5ml 10x连接酶缓冲液（500mM tris-Hcl，pH7.6，100mM MgCl2），26μl水和0.5μl（3.5单位）T4DNA连接酶（从pharmacia，Inc.，800Centennial Avenue，Piscataway，N.J.08854买到）。然后将反应物在4℃下保温16小时。
如本文举例说明的，用50μl 10mM tris-Hcl（pH7.6）和3μl CaCl2稀释连接混合物，接着按本文实施例3A提供的方法用于直接转化合适的E、coliK12 RV308细胞。在本发明优选实施例中，用E.Coli k12 RV308细胞作宿主细胞，但也可用许多其它细胞系，例如（但不限于），E.Coli k12 L201，L687，L693，L507，L640，L641，L695，L814，（E.Coli B）。然后在相当于对抗存在于表达质粒上基因的抗菌素选择压力下将转化的宿主细胞放在合适的培养基上。然后将该培养物保温一段时间，其温度适于所用的宿主细胞系。
用上述载体转化细胞的方法在现有技术中是众所周知的，并可在下列的一般参考文献中找到，如Maniatis等人（1988）Molecular  cloning：A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harbor  Press，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  spring  Harbor，New  York  or  Current  Protocols  in  Molecular  Biology（1989）and  Supplements。本发明最优选实施例中所用的E、Coli细胞系转化方法论可参考本文实施例部分得到。转化的E.Coli细胞培养的确切条件取决于所用的E.Coli宿主细胞系和表达或克隆载体的性质。例如，加入热诱导启动子-操纵基因区的载体，如C1857热诱导λ-噬菌体启动子-操纵基因区，在培养条件下需要温度位移以诱导蛋白质合成。
以高水平细菌表达系统表达的蛋白质特征地聚集在颗粒或包含体中，它含有高水平的过表达蛋白质（见Kreuger等人（1990）Protein  Folding，Gierasch  and  king，eds，Pgs  136-142，American  Association  for  the  advancement  of  Science  Publication  NO.89-18s，Washington，D.C）。这种蛋白质聚合体必须是能增溶的。以便进一步纯化并分离所要的蛋白质产品。Id，用强变性溶液如盐酸胍盐和/或弱变性溶液如二硫苏糖醇（DTT）的许多方法均可用于溶解蛋白质。在再交叉（refolding）溶液中慢慢除去变性剂（通常通过渗析）使变性蛋白质具有其天然构象。变性和再交叉的特定条件是通过特定的蛋白质表达系统和/或上述蛋白质测定的。
发酵后含有细菌的ACB-胰岛素原测定结果表明存在颗粒体。颗粒分离后，溶解并进行亚硫酸分解（Sulfitolysis），在阴离子交换柱上分离重组体蛋白质。亚硫酸分解过的蛋白质经MonoQ色谱分离后通过反相HPLC脱盐可得到二个ACB-胰岛素原溶液。溶液A（32mg）用FAB-MS有一个9878的质量峰，顺序化的氨基端有Gly-Ile-val顺序。溶液B（115mg）用FAB-MS有一个10009质量峰，并表明具有Met-Gly-Ile氨基端顺序。与氨基酸有关的分析数据，认为溶液A表示真正的ACB-胰岛素原S-磺酸盐，而溶液B含有ACB-胰岛素原S-磺酸盐，而溶液B含有ACB-胰岛素原S-磺酸盐分子加上相当于引发密码子的引发剂蛋氨酸残基。RP-HPLC，氨基酸分析和N-末端顺序化表明两个蛋白质溶液均沾污大量的另一个溶液的成分，此外还有几个其它的峰。
用高的pH和加入硫醇，基本上按Frank，B.H.，等人.，（1981）在Peptides.Synthesis.Structure  and  Function.Proceedings  of  the  Seventh  American  Peptide  Symposium（Rich，D.H.and  Gross，E.Eds）Pgs.729-738，Pierce  Chemical  co.，Rockford，IL，（整个报道已列入本文参考文献中）的报导使二种ACB-胰岛素原分子的S-磺酸盐转化成二硫化物成对的、交叉的ACB-胰岛素原分子。两分子交叉的收率良好（高于75%），并用反相HPLC纯化得到33mg  Meto-Glyl-ACB-胰岛素原（2-86）（Met-ACB-胰岛素原）和4mg  Glyl-ACB-胰岛素原（2-86）（ACB-胰岛素原）。各种类似物的收率低是由于纯化使转化的胰岛素原形式之间交叉沾污减至最小的收集部分的收集溶液必须保持切割所致。该蛋白的特征是用RP-HPLC（图21）纯化和鉴定，氨基端顺序化、氨基酸分析、和FAB-MS均具有预期的结果。此外，分析得到Glyl-ACB胰岛素原（2-86）分子的二硫化物键为成对花样。
本发明还提供一种重组体生产天然胰岛素蛋白质或胰岛素类似物的方法，该方法包括如下步骤：
1、形成一种合成基因，该基因含有编码化学式1化合物的DNA顺序，其中x＝1，
2、将该基因加到合适的载体中，该载体含有在大肠杆菌宿主细胞中功能性启动子-操纵基因区，
3、将该基因定位在所述载体中，以实现该合成基因的转录和转译，而且，该基因是在所述启动子-操纵基因区的转录控制下，
4、用该载体转化一种大肠杆菌宿主细胞，
5、在合适的条件下培养所述转化的大肠杆菌宿主细胞以便诱导该基因的转录和转译，
6、回收和纯化ACB-PI肽，
7、用合适的肽酶或化学试剂分裂该ACB-PI肽，以切除该C-肽。
本发明提供了用重组体DNA技术生产胰岛素的完全新的途径。本发明表明，用一种完全新的基因，mRNA和胰岛素原中间体以生产一种功能性人胰岛素分子，同时对胰岛素构成一种新的重组体生物合成途径。ACB-胰岛素原分子其结构明显不同于天然胰岛素原（为比较起见，下文称为BCA-胰岛素原）也可有效转化以产生功能性胰岛素分子。
制备胰岛素的这种新途径不同于目前进行的在各种有机物中的天然复制工艺。对胰岛素的这种改变途径由于消除用组织蛋白酶C（或其它方法除去重组体分子的N一端蛋氨酸的必要性，而依赖于大肠杆菌宿主细胞的蛋氨酰基氨基肽酶的内在作用除去N一端蛋氨酸，结果大大节省在重组体工业生产中所用的大量胰岛素。
由于ACB-PI的N一端蛋氨酸残基的去除取决于MAP的存在，选用的宿主细胞必须固有地生产MAP或已制成以生产MAP。对大肠杆菌细胞来说，MAP蛋白酶是天生的。因此，在MAP生产中各种大肠杆菌细胞系（它是不缺乏的）均可用于本发明方法的实施。可用于实施本发明的大肠杆菌宿主细胞的实例包括细胞系大肠杆菌K12L201、L687、L693、L507、L640、L641、L695、L814（大肠杆菌B）。在本发明优选的实施例中，所述的大肠杆菌宿主细胞是大肠杆菌K12RV308大肠杆菌细胞系。
单链ACB-PI分子转化为功能性天然胰岛素或胰岛素类似物必须切除内部的C-肽。这可通过酶促或化学方法如溴化氰分裂达到。当天然人胰岛素原A-链、B-链和C-肽氨基酸顺序用于ACB-hPI肽的结构时（如本文举例说明的），
则ACB-hpI肽的氨基酸顺序是：
Gly  Ile  Val  Glu  Gln  Cys  Cys  Thr  Ser  Ile
A1  A2  A3  A4  A5  A6  A7  A8  A9  A10
Cys  Ser  Leu  Tyr  Gln  Leu  Glu  Asn  Tyr  Cys
A11  A12  A13  A14  A15  A16  A17  A18  A19  A20
Asn  Arg  Arg  Glu  Ala  Glu  Asp  Leu  Gln  Val
A21  C1  C2  C3  C4  C5  C6  C7  C8  C9
Gly  Gln  Val  Glu  Leu  Gly  Gly  Gly  Pro  Gly
C10  C11  C12  C13  C14  C15  C16  C17  C18  C19
Ala  Gly  Ser  Leu  Gln  Pro  Leu  Ala  Leu  Glu
C20  C21  C22  C23  C24  C25  C26  C27  C28  C29
Gly  Ser  Leu  Gln  Lys  Arg  Phe  Val  Asn  Gln
C30  C31  C32  C33  C34  C35  B1  12  B3  B4
His  leu  Cys  Gly  Ser  His  Leu  Val  Glu  Ala
B5  B6  B7  B8  B9  B10  B11  B12  B13  B14
Leu  Tyr  Leu  Val  Cys  Gly  Glu  Arg  Gly  Phe
B15  B16  B17  B18  B19  B20  B21  B22  B23  B24
Phe  Tyr  Thr  Pro  Lys  Thr
B25  B26  B27  B28  B29  B30
下图将用于说明在ACB-PI变为胰岛素的转化中所用的ACB-PI胰蛋白酶酶处理图形。
胰蛋白酶  ↓  ↓  ↓  ↓
ACB-PI  Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Glu……Gln-Lys-Arg-Phe-Val-Ile
ACB-PI#  19  20  21  22  23  24  63  64  65  66  67  68
胰岛素 A19 A20  A21  C1  C2  C3  C42  C43  C44  B1  B2  B3
因为胰蛋白酶将在Arg21、Arg22、Lys64和Arg65的羧基侧分裂，由ACB-PI的胰蛋白酶消化可得到多种胰岛素蛋白质的混合物，这些混合物包括：
ArgA22，ArgA23，ArgB-1  胰岛素
ArgA22，ArgB-1  胰岛素
ArgA22，ArgA23  胰岛素
ArgA22  胰岛素
然后用羧基肽酶B消化上述各品种，以A-链的羧基端除去精氨酸残基，得到产生的下列品种
ArgB-1  胰岛素
天然  胰岛素
因此通过蛋白水解分裂ACB-hPI中间体，可生产天然成熟的人胰岛素。通过宿主细胞中蛋氨酰基氨基肽酶（MAP）的固有作用，可内在地除去ACB-PI分子的N一端蛋氨酸残基，其效率约为30%。
通过使用胰蛋白酶和羧基肽酶B，ACB-胰岛素原可转化成人胰岛素，这已用于正常的胰岛素原，如Kemmler，W.，等人（1971）J.Biol.chem.，vol.246，Pgs.6786-6791所公开的，全部报导已列入本文参考文献。ACB-胰岛素原转化为胰岛素比胰素原的相应转化实质上需要更剧烈的条件。如图25所示，反应在RP-HPLC上进行，这说明随着几个新蛋白质峰的出现，起始原料完全损失。酶消化后，用RP-HPLC使得到的肽混合物分成其组成部分，如图26所示，收集的各部分和分析结果如表Ⅳ所示。
表Ⅳ
由ACB-胰岛素原蛋白水解转化为胰岛素中肽的分析
分析方法
峰  鉴定  FAB/MS  AAAa  HPLC  酶解图谱
2+4  B22  30  ND  是  ND  ND
3+5  B22  29  ND  是  ND  ND
9  C-肽  3020.3  ND  是  ND
14  DOP-胰岛素C  4866.4  是  ND  ND
16  Arg-胰岛素  5964.8  是  ND  ND
17  胰岛素  5808.5  ND  是  是
17  des-Thr-胰岛素  5707.3  ND  ND  是
ND＝未测
a氨基酸分析
b V8蛋白酶肽图cdes-（B22-30-胰岛素
d des-ThrB30-胰岛素
图26的峰2+4和3+5确定为
GFFYTPK＝Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys（B23-29）和GFFYT
PKT＝Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr（B23-30），
可能胰蛋白酶分裂结果在胰岛素B-链的Arg-22上（表Ⅳ）有双线，由于在柱上必须进行二个分开样品注射。峰9（图26）确定为C-肽，这基于与C-肽标准共洗脱，以及通过FAB-MS的分子量测定（表Ⅳ）。峰14（图26）相当于des-8肽（B23-30）胰岛素，产生峰2和峰3的反应的其它产品。峰16确定为单一Arg-胰岛素，大概单一Arg（A22）-胰岛素基于FAB-MS和氨基酸分析（表Ⅳ）。从转化分离的主峰是馏份17（133μg）。用RP-HPLC使该蛋白质峰与真正的生物合成人胰岛素共洗脱，如图27所示。当用FAB-MS分析时，给出5808.5的分子量峰，如人胰岛素所予料的。此外，观察到分子量5707.3的小峰，它表示蛋白质总量为10-15%，鉴定为des-Thr（B30）胰岛素。在所用的RP-HPLC系统下Des-Thr（B30）胰岛素与人胰岛素混合色谱，因此从胰岛素中分离该物质遭到失败不是不可预料的。按chance，R.，E.，等人（1981）在Peptides.synthesis，structure，and Function.Proceedings of the Seventh American Peptide symposium，（Rich，D.H.and Gross，E.eds）pgs，721-728，Pierce chiemical company，Rockford，IL.（所有报导已列入本文参考文献）中的报导通过金黄色葡萄球菌（staphy lococcus aureus）V8蛋白酶肽图也分析了峰17，发现鉴定为生物合成人胰岛素，除了正常的（GFFYTPKT）Gly-phe-phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr峰以外还观察到一个小峰，它表示（GFFYTPK）Gly-phe-phe-Tyr-Thr-Pro-Lys（来自des-Thr（B30）胰岛素）（如图27所示）。如图30所示，通过ACB-胰岛素的蛋白水解转化产生的胰岛素在人胎盘胰岛素受体测试中是100%的生物活性。
为进一步测定本文例举的相当于天然人胰岛素的ACB-胰岛素原样品是否通过酶促消化产生蛋白质，将产生蛋白质的ACB-胰岛素原的胰蛋白酶+胃蛋白酶消化图与人胰岛素的胰蛋白酶+胃蛋白酶消化图进行比较。人胰岛素的整个胰蛋白酶+胃蛋白酶消化产生一种稳定的A1-13/B1-11片段+许多其它小片段，如Toren，P.，等人（1988）Anal.Boichem.，vol.169，pgs.287-299所述。含有单A和B链的12个可能的胰岛素二硫化物异构体中，当用胃蛋白酶消化时，只有3个能产生游离的和分开的A1-13/B-11片段，即，天然激素和二个化学合成的二硫化物异构体如早期在sieber，p.，等人（1978）Hoppe-seylor′sZ.Physiol.chem.，vol.359，pgs.113-123所公开。A1-13/B1-11片段由ACB-胰岛素原的胰蛋白酶/胃蛋白酶消化而得到，并将它与由这三个胰岛素异构体得到的A1-13/B1-11片段进行比较。完全的胃蛋白酶消化表明，HPLC主峰与来自天然胰岛素的A1-13/B1-11片段共洗脱，并且不含有任何适合来自二个硫化物异构体的A1-13/B1-11片段的峰，如图22所示。纯化主要的消化峰（53μg），发现它具有所预料的A1-13/B1-11氨基酸组成。
下列实施例是为了进一步说明本发明，而不是想限制本发明。
实施例1
合成ACB-胰岛素原基因的构建
在众所周知的人胰岛素原分子的氨基酸顺序的基础上设计编码人ACB-胰岛素原基因的一种278碱基对DNA片段，它包括下列顺序：（正链＝seq  ID  NO.2，负链＝Seq  ID  NO.3）
5'-AGCTTCATATGGGCATTGTGGAACAATGCTGTACCAGCATCTGCTCCCTG
3'-AGTATACCCGTAACACCTTGTTACGACATGGTCGTAGACGAGGGAC
TACCAGCTGGAGAACTACTGCAACCGCCGTGAGGCAGAGGACCTGCAGGTG
ATGGTCGACCTCTTGATGACGTTGGCGGCACTCCGTCTCCTGGACGTCCAC
GGTCAGGTGGAGCTGGGCGGTGGCCCGGGTGCAGGCAGCCTGCAGCCGCTG
CCAGTCCACCTCGACCCGCCACCGGGCCCACGTCCGTCGGACGTCGGCGAC
GCCCTGGAGGGTTCCCTGCAGAAGCGTTTTTTGAACCAACACCTGTGCGGC
CGGGACCTCCCAAGGGACGTCTTCGCAAAAAACTTGGTTGTGGACACGCCG
TCCCACCTGGTGGAAGCTCTGTACCTGGTGTGCGGTGAACGTGGCTTCTTC
AGGGTGGACCACCTTCGAGACATGGACCACACGCCACTTGCACCGAAGAAG
TACACCCCGAAGACCTAGGATCCG-3'
ATGTGGGGCTTCTGGATCCTAGGCTTAA-5'
通过加入碱基使核苷酸顺序在其5′和3′端改变以形成NdeⅠ和BamHⅠ限制性位点，该位点两侧为HindⅢ和ECORI位点，以将该基因克隆入pUC18质粒的多衔接物区。8个合成寡核苷酸（上图中区1-8），其长度从56碱基-74碱基变化（如上图所示）是用一种Applied Biosystems Model 380A或380B DNA合成器（从Applied Biosystems，850 Lincoln Center Drive，Foster City，CA 94404买到），按制造者推荐的方法生产的，并通过在15%聚丙烯酰胺凝胶上电泳而进行纯化。用[λ-p32]ATP和聚核苷酸激酶使这些寡核苷酸磷酸化，然后与T4DNA连接酶集合以生成2个，139碱基对长的DNA复式结构（按Brown，E.L.，Belagaje，R.，Ryan，M.J.，and khorana，H.G.（1979）in Methods in Enzymology.Academic Press，N.Y.，68.pgs.109-151的报导，所有报导已列入本文参考文献）。
该ACB-PI基因的第一半个是通过非磷酸化寡核苷酸1与磷酸化寡核苷酸2，5和6混合形成的，而该基因的第二半个是通过磷酸化的寡核苷酸3、4和7与非磷酸化寡核苷酸8混合形成的。该基因片段的二半在15%聚丙烯酰胺凝胶上进行纯化，用电泳方法从凝胶切片中回收DNA，然后在sephadex  G-50柱中脱盐。
实施例2
质粒pRB181的构建
将约5μg质粒pUC18（从Boehringer-Mannheim买到）悬浮在10μl 10x HindⅢ缓冲液（1M NaCl，50mM MgCl2，100mM tris-Hcl，pH＝8.0，10mM2-巯乙醇），2μlHindⅢ限制性核酸内切酶（Boehringer-Mannheim，20单位），85μl水中，慢慢混合，在37℃保温2小时。用三体积乙醇，0.3M NaoAC沉淀DNA。离心后在真空下干燥，将沉淀再溶解在10μl 10x BamHI缓冲液（1M NaCl，50mM MgCl2，100mMTris-Hcl，10mM2-巯乙醇，pH＝8.0），2μlBamHⅠ限制性酶（Boehringer-Mannhei，m20单位），88μl水中，慢慢混合，在37℃再保温2小时。再用3体积乙醇和0.3M NaoAC沉淀DNA，在1%低熔琼脂糖凝胶上进行电泳。从该凝胶中切下较大的HindⅢ/BamHⅠ限制性片段（265 bp），按卖商推荐的方法通过一个elutip-d柱（从schlicher & Schuell，keene，NH 03431买到）而回收DNA。沉淀并干燥后，将DNA贮存在4℃的30ml 10mM tris-Hcl中，pH＝8.0。
将约5μl该载体DNA与在50μl连接缓冲液（50mMtris-Hcl，10mM MgCl2，10mMDTT，800μMATP，和3.5单位T4DNA连接酶）中按上述方法制备的10微微摩尔二种合成DNA片段混合。使反应物在4℃保温过夜，然后转化进入冷冻的合适大肠杆菌DH5细胞（从Bethesda Research Laboratories，P.O.Box6009，Gaithersburg，MD20877买到）中。使该转化体在含有100μg/ml氨苄青霉素的x-galTY琼脂片上，在37℃生长过夜。通过兰/白菌落选择筛选失去功能性lacz基因以选择含有正确插入的克隆，并用顺序酶合（Sequenase Kit）（从United States Biochemical Corp买到）顺序化ds-DNA来确定。所得质粒称为pRB181。
实施例3
重组体载体和宿主的构建
A.质粒pCZR126S的构建
1、质粒pKC283的分离
大肠杆菌K12  BE1201/pKC283的亲液物得自Northern  Regional  Research  Laboratory，Peoria，Illinois  61604，其登记号为NRRL  B-15830。将该亲液物倾析到含10ml  LB培养基的管中（该培养基每升含10g细菌胰蛋白胨，5g细菌-酵母提取物，和10g  NaCl;调节pH为7.5），并在32℃保温2小时，此时使该培养物含有50μg/ml氨苄青霉素，然后在32℃保温过夜。在32℃培养大肠杆菌K12  BE  1201/pKC283细胞，因为该细胞含有整合入细胞DNA的温度敏感的CI阻遏物基因。若将含野生型λ  pL阻遏基因或不含λ  pL启动子的细胞用于该质粒分离方法中（如本文下列实施例所述），保温温度为37℃。
将一小部分过夜培养物放在含有50mg/ml氨苄青霉素的LB-琼脂（含15g/l细菌-琼脂的LB培养基）板上，以便得到大肠杆菌K12  BE  1201/pKC283的单菌落分离物。将得到的单菌落接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的10mlLB培养基中，在剧烈振动下，在32℃保温过夜。将10ml过夜培养物接种到含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，在剧烈振动下在32℃下保温直到该培养物达到稳定期。
下列方法得自Maniatis等人，1982，Molecular  cloning（cold  spring  harbor  Laboratory）。在4℃离心4000g10分钟以收集细胞，弃去上清液。在100ml冰冷的STE缓冲液（0.1M  NaCl，10mM  Tris-Hcl，pH7.8;和1mMEDTA）中洗涤细胞沉淀。洗涤后，将该细胞沉淀再悬浮在含5mg/ml溶菌酶的10ml溶液1中（50mM葡萄糖，25mMtris-Hcl，pH8.0;和10mMEDTA），并在室温下放置10分钟。然后将20ml溶液2（0.2N  NaoH和1%SDS）加到经溶菌酶处理的细胞中，通过倒置慢慢混合该溶液。在冰中使该混合物保温10分钟。
将15ml冰冷的5M乙酸钾，pH4.8加到溶解的细胞混合物中，通过倒置混合溶液。将该溶液在冰中保温10分钟。将11.5ml冰乙酸加到28.5ml水和60ml  5M乙酸钾中可制成5M乙酸钾溶液;所得溶液相对于钾而言为3M，相对于乙酸盐为5M。
在4℃下在Beckman  sw27（或其等同物）中以20000转/分速率离心溶解的细胞混合物20分钟。细胞DNA和碎片在管底部形成沉淀。回收约36ml的上清液，加入0.6体积的异丙醇，混合，将得到的溶液在室温下静置15分钟。在室温下，离心12000g30分钟以收集质粒DNA。弃去上清液，在室温下用70%乙醇洗涤DNA沉淀。倒出乙醇洗涤液，在真空干燥器中干燥该沉淀。然后再将该沉淀悬浮在8mlTE缓冲液（10mM  Tris-Hcl，pH8.0和1mMEDTA）中。
将8克CsCl加到DNA溶液中。在每10mlCsCl-DNA溶液中加入约0.8ml  10mg/ml溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓水溶液。该溶液的最终密度约为1.55g/ml，溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓浓度约为600μg/ml。将该溶液转移到Beckman  50型的离心管中，用石蜡油加到顶部，密封，在20℃以45000转/分速率离心24小时。离心后，在普通光线下可看到DNA的二个带。从管中除去盖子后，用带有＃21皮下注射针的注射器，将针插入离心管的边缘，以移出较下面的DNA带。
用水-饱和的1-丁醇萃取几次以除去溴化3.8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓通过对TE缓冲液透析而除去CsCl。用缓冲的酚，然后用氯仿萃取后，沉淀DNA，用70%乙醇洗涤，并干燥。得到约1mg质粒pKC283，在4℃下贮存在TE缓冲液中，其浓度约为1μg/μl。质粒pCK283的限制性位点和功能图如附图1所示。
实施例3A.2
质粒pKC283PX的构建
将实施例1中制备的约10μl质粒pKC283DNA与20μl 10x培养基-盐限制性缓冲液（500mM NaCl;100mMtris-Hcl，pH7.5;100mM MgCl2;和10mMDTT），20μllmg/ml BSA，5μl限制性酶PVUⅡ（～50单位，由Bethesda Research Laboratories（BRL）所限定，本文所用的所有限制性酶均由该实验室得到）和145μl水相混合，将所得反应物在37℃下保温2小时。按常规用酚中止本文所述的限制性酶反应，然后用氯仿萃取，接着沉淀DNA，用乙醇洗涤，将DNA再悬浮在TE缓冲液中。如上所述，PVUⅡ消化中止后，将PVUⅡ消化的质粒pKC283DNA沉淀，然后再悬浮在5mlTE缓冲液中。
在含10μl5x激酶缓冲液（300mMTris-Hcl，pH7.8;50mM MgCl2;和25mMDTT），5μ l5mMATP，24μl H2O，0.5μl T4多核苷酸激酶（约2.5单位由P-L生物化学限定），5μl 1mg/mlBSA，和5μl 10mM亚精胺的混合物中，通过使该混合物在37℃保温30分钟，使约600微微摩尔（pM）xhoⅠ衔接物（5′-CCTCGAGG-3′）（顺序Id NO.4）进行激酶。
将约12.5μl激酶的xhoⅠ衔接物加到5μlpvuⅡ消化的质粒pKC283DNA中，然后将2.5μl 10x连接酶缓冲液（300mMTris-Hcl，pH7.6;100mM MgCl2;和50mM DTT），2.5μl 1mg/mlBSA，7μl 5mMATP，2.5μl（约2.5单位由P-L生物化学限定）T4DNA连接酶，2.5μl 10mM亚精胺和3ml水加到DNA中。将得到的连接反应物在4℃保温过夜。连接反应后，将反应混合物调至有高-盐缓冲液组成（0.1M NaCl;0.05MTris-Hcl，pH7.5;10.0mM MgCl2;和1mMDTT）。将约10μl（100单位）限制性酶xhoⅠ加到该混合物中，得到的反应物在37℃下保温2小时。
中止反应，按上述方法沉淀xhoⅠ消化的DNA，再悬浮和连接，不同的是在连接混合物中没有加入xhoⅠ衔接物。连接的DNA构建了所要的质粒pKC283PX。质粒pKC283PX的限制性位点和功能图如附图2所示。
实施例3A.3
大肠杆菌K12MO（λ±）/pKC283PX的构建
从Northern  Regional  Research  Laboratories可得到冻干形式的大肠杆菌K12MO（入+），其登记号为NRRLB-15993。大肠杆菌K12MO（入+）含有野生型λ pLCI阻遏物基因，因此，在大肠杆菌K12MO（入+）细胞中不存在本发明杂交pL-lpp启动子的转录。重新构建该冻干物，分离MO（入+）的单菌落，基本上按实施例29A1方法制备MO（入+）细胞的10ml过夜培养物，不同的是保温温度为37℃，生长培养基中未使用氨苄青霉素。
将50μl过夜培养物用于接种也含有10mM MgSO4和10mM MgCl2的5ml LB培养基。在剧烈振动下，在37℃使该培养物保温过夜。第二早上，用含10mM MgSO4和10mM MgCl2的LB培养基将该培养物稀释到200ml。在剧烈振动下，在37℃保温经稀释的培养物，直到在550nm（A550）处的吸光度约为0.5为止，这表明细胞密度约为1×108细胞/ml。将该培养物在冰-水浴中冷10分钟，然后在4℃ 4000g下离心10分钟以收集细胞。将细胞沉淀再悬浮在100ml冷的10mM MgSO4中，然后立即通过离心再制成沉淀。将该细泡沉淀再悬浮在100ml 30mM CaCl2中，在冰中保温20分钟。
通过离心再收集细胞，再悬浮在10ml 30mM CaCl中。将半ml一份的细胞加到实施例29A2制备的连接DNA中，该DNA已配成30mM的CaCL2溶液。将细胞-DNA混合物在冰中保温1小时。在42℃下热震荡90秒钟，再在冰中骤冷约2分钟。在125ml烧瓶中将细胞-DNA混合物稀释到10ml LB培养基中，在37℃保温1小时。按每份100μl铺在含氨苄青霉素的LB-琼脂板上，在37℃下保温直到出现菌落。
将该菌落分开单个培养，通过限制性酶分析和凝胶电泳测定单个菌落的质粒DNA。按实施例29A1的方法，在小规模内进行质粒DNA的分离，但取消CsCl梯度步骤，直到鉴定到所要的大肠杆菌K12MO（λ+）/pKC283PX转化体。质粒pKC283PX的限制性位点和功能图如附图2所示。
实施例3A.4
大肠杆菌K12MO（λ±）/pKC283-L的构建
将按实施例29A1的方法制备的10mg质粒pKC283PXDNA溶于20μl  10X高一盐缓冲液，20ml  1mg/ml  BSA，5μl（～50单位）限制性酶BglⅡ，5μl（～50单位）限制性酶xhoⅠ和150μl水中，所得反应物在37℃保温2小时，停止反应，沉淀BglⅡ-xhoⅠ消化的DNA后，再将DNA悬浮在5μl  TE缓冲液中。
合成并激酶具有单链DNA端的有BglⅡ和xhoⅠ限制性酶裂解特征的DNA衔接物。基本按实施例3A2的方法使该衔接物激酶。DNA衔接物的结构如下：
5'-GATCTATTAACTCAATCTAGAC-3'  (Seq.ID  No.5)
｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜
3'-ATAATTGAGTTAGATCTGAGCT-5'  (Seq.ID  NO.6)
上图中的衔接物是用现有技术中众所周知的方法由单链脱氧寡核苷酸合成的。单链脱氧寡核苷酸可用市售的设备，如380ADNA合成器（由Applied  Biosystems销售，850Lincoln  Centre  Drive，Foster  city，CA  94404），使用氨基磷酸酯化学进行合成。合成DNA的其它方法在现有技术中也是公知的。合成单链DNA的普通改性磷酸三酯方法如Itakural等人1977，Science  198：1056和在Crea等人1978，Proc.Nat.Acad.Sci.USA  75：576中所述。此外，合成DNA的特别优选方法如Hsiung等人1983  Nucleic  Acid  Research  11：3227和Narang等人，1980，Methods  in  Enzymology  68：90所述。
基本上按实施例3A2的方法连接衔接物和BglⅡ-xhoⅠ-消化的质粒pKC283PX。连接的DNA构建了所要的质粒pKC283-L。质粒pKC283-L的限制性位点和功能图如附图3所示。质粒pKC283-L
DNA用于转化大肠杆菌K12MO（入+），基本按实施例3A3的方法鉴定所得大肠杆菌K12  MO（入+）/pKC283-L转化体。
实施例3.A.5
大肠杆菌K12MO（入+）/pKC283-LB的构建
将约10μg质粒pKC283-L DNA（基本按实施例29A1的方法制备）溶于20μl 10x高盐缓冲液，20μl 1mg/ml BSA，5μl（～50单位）限制性酶xhoⅠ和155μ lH2O中，所得反应物在37℃保温2小时。通过加入3体积95%乙醇和1/10体积的3M乙酸钠从反应混合物中沉淀xhoⅠ消化的质粒pKC283-LDNA，在干冰-乙醇浴中保温5分钟，并离心。用70%乙醇洗涤所得DNA沉淀，干燥，再悬浮在2μl 10x切口转译（nick-translation）缓冲液（0.5M Tris-Hcl，pH7.2;0.1M MgSO4;和1mM DTT），1μl的2mM各种脱氧核苷酸三磷酸酯溶液，15ml H2O，1ml（～6单位由P-L生物化学限定）的Klenow（它是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的大片段）和1μl 1mg/ml BSA中。所得反应物在25℃下保温30分钟;在70℃下保温该溶液5分钟以使反应停止。
基本上按实施例3A2的方法，使BamHⅠ衔接物（5′-CGGGATCCCG-3′）（Seq.ID  NO.7）激酶并连接到xhoⅠ消化的，经Klenow处理的质粒pKC283-LDNA上。连接反应后，在37℃，在高一盐缓冲液中，用约100单位BamHI消化DNA约2小时。BamHI消化后，基本上按实施例3A2的方法连接制备DNA。
基本上按实施例3A2和3A3的方法通过连接使～5.9kbBamHI限制性片段成圆形，并转化入大肠杆菌K12MO（入+）。鉴定大肠杆菌K12MO（入+）/pKC283-LB转化体，然后基本上按实施例3A1的方法制备质粒pKC  283-LB  DNA。质粒pKC  283-LB的限制性位点和功能图如附图4所示。
实施例3.A.6
大肠杆菌K12MO（入+）/pL  32的构建
基本上按实施例3A5的方法（除用起始质粒、限制性酶和衔接物外），在高一盐缓冲液中，用限制性酶SalⅠ消化约10mg质粒pKC283PX，用Klenow处理，并连接到EcoRI衔接物（5′-GAGGAATTCCTC-3′）（Seq.ID  NO.8）。用导致切除～2.1kb  DNA的限制性酶ECORI消化后，使～4.0kb  EcoRI限制性片段通过连接成园以生成质粒pKC283PRS。基本上按实施例3A3的方法，将连接的DNA用于转化大肠杆菌K12MO（入+）。鉴定E.coliK12MO（入+）/pKC283PRS转化体后，基本上按实施例3A1的方法制备质粒pKC283PRS  DNA。质粒pKC283PRS的限制性位点和功能图如附图5所示。
在200μl高一盐缓冲液中，用约50单位限制性酶pstⅠ和sphⅠ消化约10μg的质粒pKC283PRS。在37℃使反应物保温约2小时以后，使反应混合物在0.6%低胶凝温度琼脂糖（FMC  Corporation，MarineColloids  Division，Rockland，Maine  04841）凝胶上，在～130V和～75mA，在Tris-乙酸盐缓冲液中进行电泳2-3小时。
该凝胶在溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓稀溶液中染色，从凝胶中将用长波紫外光看到的构成～0.85  kb  pstⅠ-sphⅠ限制性片段的DNA带切成小片。由该小片的重量和密度测定该小片的体积，在含有小片的管中加入等体积的10mM  Tris-Hcl，pH7.6。然后在72℃保温使该小片熔化。得到约1μg质粒pKC283PRS的0.85  kb  Pst-sphⅠ限制性片段，其体积约为100μl。用类似方法，用限制性酶PstⅠ和sphⅠ消化质粒pKC283-LB，所得～3.0kb限制性片段通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，并准备用以连接。
基本上按实施例3A2的方法，将质粒pKC283PRS的～0.85kb  pstⅠ-sphⅠ限制性片段连接到质粒pKC283-LB的～3.0kb  pstⅠ-sphⅠ限制性片段上。连接的DNA构建了所要的质粒pL32。质粒pL32的限制性位点和功能图如附图6所示。基本上按实施例3A3的方法，将质粒pL32转化成E.coli  k12  MO（入+）细胞。基本上按实施例3A1的方法，由E.coli  k12  MO（入+）/pL32转化体制备质粒pL32DNA。质粒pL32  DNA的分析结果表明，多于一个的EcoRI衔接物连接到Klenow处理的质粒pKC283PX的SalⅠ端。多于一个EcoRI衔接物的存在并不影响质粒pL32或质粒pL32的衔生物的效用，并由于xhoⅠ限制性位点的存在能进行检测，每当二个EcoRⅠ衔接物连接在一起时就产生该位点。或者，通过在质粒pKC283-LB上进行本实施例第一段的SalⅠ-EcoRⅠ切除和连接，而构建质粒pL32。
实施例3.A.7
E.coli  k12  Mo（入±）/pL47的构建
从Northern Regional Research Laboratories可得到冻干形式的E.Coli k12 RV308/pNM789，其登记号为NRRL B-18216。pNM789的限制性位点和功能图如附图7所示。基本上按实施例1的方法（除了保温温度为37℃以外），从培养物中提取质粒DNA。将10μg pNM789悬浮在200μlPVUⅡ缓冲液（50mM Tris-Hcl（pH7.5），60mM Nacl和6mM MgCl2）中。加入1单位PVUⅡ，将反应混合物在37℃下保温5分钟。在65℃加热10分钟使酶失活。接着加入30μl10×BamHⅠ缓冲液（200mM Tris-Hcl（pH8.0），1M NaCl和70mM MgCl2），70μlH2O和10单位BamHⅠ，反应物在37℃下保温1小时。接着加入5单位碱性磷酸酶，在65℃下保温1小时。在1%琼脂糖凝胶上分离DNA片段，纯化一个单切割片段大小的DNA片段（图8）。
基本上按实施例3A4的方法，合成具有一钝园端和-BamHⅠ端的DNA衔接物。该衔接物（如图8中118所示）具有如下结构：
5'-CTGTGCCTTCTAG-3'  (Seq.ID  NO.9)
｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜
3'-GACACGGAAGATCCTAG-5'  (Seq.ID  No.10)
基本上按实施例3A2的方法，使该衔接物激酶并连接到BamHⅠ-PVUⅡ消化的质粒pNM789中。将该连接混合物用于转化E.coli  k12  RV308细胞，基本上按实施例3A3的报导在这些转化体上进行质粒分离。选择几种含有适当大小PVUⅡ片段（494bp）和xbaⅠ-BamHⅠ片段（628bp）的质粒。至少其中二个顺序是通过BamHⅠ位点向唯一的SmaⅠ位点顺序化而测定的，用所要的顺序选择一个克隆。这种中间质粒称为质粒120。该方法的示意图和质粒120的限制性位点和功能图如附图8所示。
为分离Ek-BGH-编码DNA，在含限制性酶xbaI和BamHⅠ各约50单位的200μl高盐缓冲液中消化约10mg质粒120。消化产品通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，基本上按实施例29A6的方法分离编码EK-BGH的～0.6kb  xbaⅠ-BamHⅠ限制性片段，并准备连接。
也用限制性酶xbaⅠ和BamHⅠ消化质粒pL32，分离～3.9kb限制性片段并准备连接。基本上按实施例3A2的方法将质粒PL32的～3.9kb  xbaⅠ-BamHⅠ限制性片段连接到质粒120的～0.6kb  xbaⅠ-BamHⅠ限制性片段上以产生质粒pL47。质粒pL47的限制性位点和功能图如附图9所示。基本上按实施例3A3的方法，将质粒PL47转化成E.coli  k12MO（入+），并鉴定E.coli  k12MO（入+）/pL47转化体。基本上按实施例3A1的方法由该转化体制备质粒pL47DNA。
实施例3.A.8
E.coli k12 RV 308/pPR12AR1的构建
质粒pPR12含有温度一敏感pL阻遏物基因CI857和具有四环素抗性的质粒pBR322基因。质粒pPR12在US4436815（1984年3月13日批准）中公开并请求保护。质粒pPR12的限制性位点和功能图如附图10所示。
在200μl高一盐缓冲液中，在37℃，用约50单位的限制性酶EcoRI使约10μg质粒pPR12消化2小时。基本上按实施例3A5的方法，使EcoRI消化的质粒pPR12  DNA沉淀，并用klenow处理。klenow反应后，基本上按实施例3A2的方法，通过连接使EcoRI消化的经klenow处理的质粒pPR12  DNA再成圆。将构建所要质粒pPR12△R1的连接的DNA基本上按实施例3A3的方法用于转化E、coli  k12  RV308，除选择是基于四环素（5μg/ml）抗性，而不是氨苄青霉素抗性外。E.colik12  RV308可从NRRL得到，其登记号为NRRLB-15624。鉴定E.colik12  RV308/pPR12△R1转化体后，基本上按实例3A11的方法从该转化体中制备质粒pPR12△R1  DNA。
在200μl中等一盐缓冲液中，在37℃，用约50单位的限制性酶AvaⅠ使约10μg的质粒pPR12△R1消化2小时。基本上按实施例3A5的方法沉淀AvaⅠ消化的质粒pPR12△RI  DNA，并用klenow处理。klenow反应后，基本上按实施例3A2的方法，将AvaⅠ消化的，经klenow处理的质粒pPR12△R1DNA连接到EcoRI衔接物（5′-GAGGAATTCCTC-3′）上。衔接物连接后，沉淀DNA，然后再悬浮在约200μl含有约50单位限制性酶EcoRI的高一盐缓冲液中。所得反应物在37℃保温约2小时。EcoRI消化后，将反应混合物载于琼脂糖凝胶上，基本上按实施例3A6的方法，纯化～5.1  kbEcoRI限制性片段。基本上按实施例3A2的方法，通过连接，使～5.1kb  EcoRI限制性片段再成圆。连接的DNA构建了所要的质粒pPR12AR1。基本上按实施例3A3的方法（除选择是基于四环素抗性而不是氨苄青霉素抗性外）使质粒pPR12AR1DNA转化成E.colik12  RV308。鉴定E.coli  k12  RV308/pPR12ARI转化体后，基本上按实施例3A1的方法制备质粒pPR12ARI  DNA。质粒PPR12ARI的限制性位点和功能图如附图11所示。
实施例3.A.9
E.coli  k12  RV308/pL110的构建
将约10μg质粒PPR12ARI  DNA悬浮在含限制性酶pstⅠ和EcoRⅠ各约50单位的约200ml高-盐缓冲液中，使消化的反应物在37℃保温约2小时。然后将反应混合物载于琼脂糖凝胶上，基本上按实施例3A6的方法分离质粒pPR12ARI的～2.9kbpstⅠ-EcoRⅠ限制性片段并准备连接。
约10μg质粒pL47，用限制性酶pstI和BamHI在200μl高一盐缓冲液中在37℃消化2小时。将pstⅠ-BamHⅠ消化的DNA载于琼脂糖凝胶上，基本上按实施例3A6的方法，分离含有复制源和部分具有氨苄青霉素抗性基因的～2.7kb  pstⅠ-BamHⅠ限制性片段，并准备连接。在分离反应中，约10μg的质粒pL47DNA用限制性酶EcoRⅠ和BamHⅠ，在200μl高-盐缓冲液中，在37℃消化2小时，基本上按实施例3A6的方法，分离含有新的转录和转译活性顺序和编码DNA的EK-BGH的～1.03kb  EcoRⅠ-BamHⅠ限制性片段，并准备连接。得到的～2μg～1.03kbEcoRⅠ-BamHⅠ限制性片段用于构建质粒pL110。
将质粒pL47的～2.7kbpstⅠ-BamHI和～1.03kbEcoRⅠ-BamHⅠ限制性片段连接到质粒pPR12AR1的～2.9kbpstⅠ-EcoRⅠ限制性片段以上构建质粒pL110，基本上按实施例3A2和3A3的方法（除用于选择转化体的基础是四环素抗性而不是氨苄青霉素抗性外），将连接的DNA用于转化E.coli  k12RV308。
在EK-BGH编码区（附图中有的限制性位点和功能图没有画出）中有二个pstⅠ限制性酶识别位点。质粒pL110的限制性位点和功能图如附图12所示。
实施例3.A  10
E.cloi  k12  RV308/pL110c的构建
实施例3.A.10.a  E.coli  k12  RV308/pL110A的构建
将约1μg质粒pL110DNA用限制性酶NdeⅠ，在总体积为20μl含有2μl 10x高-盐缓冲液（1.0M NaCl;0.50M Tris-Hcl，pH＝7.5;0.10M MgCl2;和10mM二硫苏糖醇）和3单位NdeⅠ酶中，在37℃消化1小时。用酚/氯仿萃取反应混合物，用乙醇沉淀DNA。将NdeⅠ-消化的质粒pL110DNA溶于50μl 1x klenow缓冲液（40mM k3po4，pH＝7.5;6.6mM MgCl2;1.0mM2-巯乙醇;33μMdATP;33μMdcTP;33μMdGTP;和33μMTTP）中。将2μl（～10单位，New England Biolabs）E.coli DNA聚合酶Ⅰ的大片段，称为klenow加到DNA中，并与其混合，所得反应物在16℃下保温1小时。通过酚萃取中止反应，按常规纯化DNA。然后将NdeⅠ消化的，klenow-处理的DNA在4℃与T4DNA连接酶连接16小时。所得DNA用于常规转化E.coli k12菌株RV308（N-RRL-B-15624）。在含100mg/ml氨苄青霉素的L-琼脂板上选择转化体，用Birnboim和Doly所述的快速碱性萃取方法从抗性菌落中分离质粒。选择没有NedⅠ位点的质粒（pL110A，在图13中）。
实施例3.A.10.b通过位点一特定诱变构建
噬菌体pL110B
通过位点一特定诱变消除具有四环素抗性基因中的BamHⅠ位点的方案如附图13右边所示。
实施例3.A.10.b（i）噬菌体M13TC3的构建
将质粒pL110用作具有四环素抗性基因的源。将在50μlTE缓冲液中的约50μg质粒pL110加到25μl 10x HindⅢ缓冲液和170μlH2O中。将约5μl（～50单位）限制性酶HindⅢ加到质粒pL110 DNA的溶液中，所得反应物在37℃下保温2小时。将约13μl 2M Tris-Hcl，pH＝7.4，和5μl（～50单位）的限制性酶EcoRⅠ加到HindⅢ消化的质粒pL110DNA中，使反应物在37℃下保温2个多小时。用TE-饱和的酚萃取反应混合物以停止反应;用氯仿萃取除去酚。然后通过沉淀和离心收集EcoRI-HindⅢ消化的质粒pL110DNA，载于1%琼脂凝胶上，分离并纯化大的～4.3kb EcoRⅠ-HindⅢ限制性片段。
将约5μg噬菌体m13mp18（New  England  Biolabs）溶于50μl  Te缓冲液中，然后按上述方法用HindⅢ和EcoRⅠ消化。如用对pL110所述的方法，纯化HindⅢ-EcoRⅠ切除的噬菌体M13mp18  DNA，不同的是分离和纯化～7.25kb限制性片段。
将约100毫微克质粒pL110的～4.3kb HindⅢ-EcoRⅠ片段与约100毫微克噬菌体M13mp18的～7.25kb HindⅢ-EcoRⅠ片段，2μl 10x连接酶缓冲液，1μl（～100单位）T4DNA连接酶和14μl水混合。将连接反应物在15℃保温1.5小时;连接的DNA构建了所要噬菌体m13TC3DNA。噬菌体m13TC3的限制性位点和功能图如附图13所示。
将1mlE.coli k12 JM109（E.coli k12 JM101，从New England Biolabs买到，可用以代替E、coli k12 JM109）的过夜培养物用于接种50ml液体培养基，所得培养物在37℃通风条件下保温，直到O.D.660为0.3-0.4。将该细胞再悬浮在25ml10mM NaCl中，在冰上保温10分钟，通过离心进行收集。将该细胞再悬浮在1.25ml75mMCaCl2中，取200μl细胞的等分样品，加到上述制备的10μl连接DNA中，在冰上保温约40分钟。然后将细胞-DNA混合物在42℃保温2分钟，取不同的等份（1.10和100μl），加到3ml顶部琼脂（含有在45℃保持熔化的5%琼脂的液体培养基）中，它也含有50ml2%x-Gal，50μl100mMIPTG，200μl在对数生长期的E、coli  k12  JM109。然后将细胞-顶部琼脂混合物铺在含有40mg/mlx-Gal（5-溴代-4氯-3-吲哚基-β-D-硫代半乳糖苷）和0.1mMIPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的L-琼脂板上，将板在37℃保温过夜。
第二天早上，将若干清晰的、不同于兰色的噬菌斑分别用于接种2ml液体培养基，所得培养物在37℃通风条件下保温2小时。没有兰色表明产生所要的DNA插入物。然后，使培养物离心，将所得到的200μl上清液加到10ml在37℃在通风条件下生长的E.colik12 JM109的培养物（O.D.550＝0.5）中。将这些培养物在37℃再保温30分钟;然后通过离心沉淀该细胞，并用于制备它们所含的重组体噬菌体的复制形式。用按实施例1的所述的按比例缩小的方法从该细胞中分离双链，复制形式的噬菌体DNA。通过其噬菌体DNA的限制性酶分析鉴定含噬菌体m13TC3 DNA的转化体。
实施例3.A.10.b（ⅱ）单链噬菌体m13TC3  DNA  的制备
使1.5ml E.coli k12 JM109/m13Tc3的过夜培养物离心，将含噬菌体m13TC3的100μl上清液用于接种25ml O.D.660约为0.4-0.5的E.coliJM109的培养物。将该培养物在37℃在通风条件下保温6小时，此时离心培养物，将得到的上清液，约20ml移入新管中。将约2ml含有20%聚乙二醇（PEG）6000和14.6%NaCl的溶液加到上清液中，然后在冰上保温20分钟。
使该上清液以7000转/分速率离心25分钟，将所得沉淀（含有单链噬菌体ml3TC3  DNA）再悬浮在500μlTE缓冲液中。DNA溶液用TE饱和的酚萃取二次，用氯仿萃取二次。然后用NaoAc和乙醇沉淀单链DNA，并离心。用70%乙醇洗涤所得沉淀，干燥，然后，将沉淀溶于60μl水中。
实施例3.A.10.b（ⅲ）诱变
用于诱变的单链DNA片段是在自动DNA合成器中合成的。该片段具有下列顺序：
5′-CCCGTCCTGTGGATACTCTACGCCGA-3′（顺序.IDNO.11）并与质粒pBR322具有四环素抗性基因中BamHI位点（5′-GGATCC-3′）的周围区相类似，除质粒pBR322中的5′端第二个A残基（或3′端的第三个残基）是一个C以外。这种变化并不改变具有四环素抗性蛋白质的氨基酸组成，但消除了BamHⅠ位点。
将约10微微摩尔诱变引物和M13通用引物（Bethesda Laboratories（BRL），P.O.Box6009，Gaithersburg，MD20760）分别用在20μl 1×激酶缓冲液（60mM Tris-HCl，pH＝7.8;15mM 2-巯基乙醇;10mM MgCl2;和0.41μM ATP）的10单位（BRL）T4多核苷酸激酶，在37℃处理30分钟。将激酶处理的DNA用于下述诱变方法中。
将300毫微克（1.2μl）单链噬菌体M13Tc3，1微微摩尔（2μl）通用引物，1微微摩尔（2μl）诱变引物，2μl 10X退火缓冲液（100mM Tris-HCl，pH＝7.5;1mM EDTA;和500mM NaCl）和12.8μl H2O混合在一起，进行退火反应。将反应物在80℃保温2分钟，在50℃保温5分钟，然后使其冷至室温。
在退火的DNA混合物中加入5μl  10X伸展缓冲液（500mM  Tris-HCl，pH＝8;1mM EDTA;和120mM MgCl2）;5μl 2mM dATP;1μl dGTP、TTP、和dcTP各6mM的溶液;1μl（～2单位，pharmacia P-L Biochemicals，800 Centennial Avenue，Piscataway，NJ08854）Klenow酶;1μl（100单位）T4 DNA连接酶和17μ lH2O以进行伸展反应。将伸展反应物在室温下保温1小时，在37℃保温2.5小时，然后在4℃保温过夜。
用TE-饱和的酚萃取二次停止反应，然后用CHCl3萃取二次。用乙醇和NaOAc沉淀DNA。离心收集DNA，再悬浮在50μl H2O中，然后在DNA溶液中加入6μl 10X S1缓冲液。
将DNA溶液等分装入三个试管中。在2个试管中加入约200单位（Miles  Laboratories）S1核酸酶。一个S1反应物在室温下保温5分钟，另一个保温10分钟。用TE-饱和的酚萃取反应混合物二次以中止反应。酚萃取物然后用氯仿萃取二次;然后用NaOAc和乙醇从反应混合物中沉淀DNA。将未处理的DNA样品用作负对照。S1处理的样品在该方法的其余部分自始至终互相保持分开，但给出相类似结果。
将DNA沉淀再悬浮在20μl H2O中，按照在构建噬菌体m13TC3时所用的方法（除了在板上没有加IPTG或X-Gal外）将10μl所得溶液用于转化E.Coli K12 JM109（E.Coli K12 JM101也能用）。
按上述方法分离来自约48个噬菌斑的双链复制形式DNA，并筛选存在的Bam  HⅠ限制性位点。按上述方法，通过制备单一链DNA进一步筛选没有BamHⅠ位点的分离物。用二脱氧顺序化方法（J.H.Smith，1980，Methods  in  Enzymology  65：560-580）使单一链DNA顺序化。所要的分离物称为pL110B（图13）。
实施例3.A.10.C质粒pL110C的构建
将约50μg复制形式噬菌体pL110B  DNA在含有～50单位NheⅠ限制性酶的250μl 1X NheⅠ缓冲液（50mM NaCl;6mM Tris-HCl，pH＝7.5;6mM MgCl2;和6mM b-巯基乙醇）中，在37℃，消化2小时。然后将5μl 5M NaCl加到NheⅠ-消化的噬菌体pL110B DNA中，接着加入5μl（～50单位）的SalⅠ限制性酶。在37℃继续消化2小时。然后按众所周知的标准方法，从丙烯酰胺凝胶中分离所要的含有具有四环素抗性基因突变区的～422bp NheⅠ-SalⅠ片段。
在同样条件下（除用质粒pL110A代替噬菌体pL110B以外），用NheⅠ和SalⅠ消化质粒pL110A  DNA。从琼脂糖中纯化质粒pL110A的～6.1Kb  NheⅠ-SalⅠ限制性片段。
用常规方法，将pL110A（～6.1Kb）和pL110B（～422bp）的NheⅠ-SalⅠ片段各100毫微克连接在一起以构建所要的质粒pL110C。质粒pL110的限制性位点和功能图如附图13所示。所要的质粒pL110C对E·Coli中的10μg/ml四环素具有四环素抗性，但在具有四环素抗性的基因中没有BamHⅠ位点。
实施例3.A.11质粒pCZR111的构建
质粒pL110C含有单ClaⅠ限制性位点，它可通过进行如下反应而除去。基本上按实施例3A2的方法，用ClaⅠ消化约1μg的质粒pL110C，除用限制性酶CalⅠ和10X ClaⅠ缓冲液（500mM NaCl，100mM Tris-HCl（pH7.9）和100mM MgCl2）以外。然后基本上按实施例3A5的方法（除只加入dcTP而不是加入所有四个dNTP以外）用Klenow处理ClaⅠ消化的DNA。
然后沉淀DNA，再悬浮在50μl Mung Bean核酸酶缓冲液（50mM乙酸钠（pH5.0），30mM NaCl和1mM ZnSO4）中。加入1单位 Mung Bean核酸酶（从New England Biolabs买到），将反应物在30℃保温30分钟。然后将试管放在冰上，将NaCl加到0.2M，然后用酚/氯仿萃取该混合物，用乙醇沉淀，并再悬浮在10mM  Tris-HCl（pH8.0）中。基本上按实施例3A3和3A4的方法，将DNA自一连接，并转化入E·Coli细胞中。所得质粒称为质粒pCZR111。
实施例3.A.12质粒pCZR126S  的构建
用XbaⅠ消化约26μg的质粒pCZR111（如下所述）。10X XbaⅠ缓冲液含有600mM Tris-HCl，100mM MgCl2，1M NaCl，和10mM 2-巯基乙醇，pH7.5（在37℃）。将50μl 10X XbaⅠ缓冲液，15μlXbaⅠ（10U/μl），和185μl H2O加到250μl含有约25μg质粒pL110的水中。在37℃进行消化1小时。然后用酚萃取XbaⅠ消化的pL110，加入1/10体积的3M CH3COONa，加入3体积的乙醇;将混合物在干冰-乙醇浴中保温5分钟，然后离心。将沉淀的DNA再悬浮在50μlH2O中。
经XbaⅠ消化的质粒pCZR111用BamHⅠ消化如下。将0.2μl BamHI（10U/μl），10μl BamHⅠ缓冲液（100mM Tris-HCl，50mM MgCl2，1M NaCl，和10mM 2-巯基乙醇，pH8.0，在37℃）和90μl H2O加到用上述方法得到的50μl xbaⅠ消化的pL110中。在37℃进行消化5分钟。用酚萃取消化的pCZR111，加入1/10体积的CH3COONa，接着加入3体积的乙醇。将沉淀的DNA再悬浮在50μl 10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0的缓冲液中。
然后将xbaⅠ和BamHⅠ消化的pCZR111载在琼脂糖凝胶上，分离约5.8kb的DNA带。通过将pCZR111的～5.8kb片段连接到xbaⅠ-NdeⅠ的衔接物和编码EK-牛生长激素的合成基因上，从而生产质粒pCZR126S，其中生长激素在其5′端有NdeⅠ位点，在其3′端有一个BamHⅠ位点。用标准寡核苷酸顺序方法论可产生XbaⅠ-NdeⅠ顺序，它含有下列顺序：（正链＝Seq.ID  NO.12，负链＝Seq.ID  NO.13）
5'CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTTTAATAAGGAGGAATAATCA  3'
｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜
TCCCATAATTATTACATATAACTAAAATTATTCCTCCTTATTAGTAT  5'
上述顺序通过二链的化学合成，接着混合以杂交而构建。编码EK  bGH的基因是由单链DNA，长为71-83核苷酸的16个化学合成片，共同含有整个基因的两个互补链所构成的。用Applied  Biosystems（ABS）装置进行合成，并含有下列顺序：（Seq.ID  NOS.2和3）
Figure 921051433_IMG6
质粒pCZR126S构建是通过连接下列位点组成而完成的。用XbaⅠ完全消化和用BamHⅠ部分消化后由质粒pL110得到的～0.28μg 5.8Kb片段，其总体积为2μl，～0.18μg编码牛生长因素衍生物的合成基因，它具有相当于XbaⅠ位点的5′端，和相当于BamHⅠ位点的3′端，其总体积为2.5μl，8.75微微摩尔化学合成的XbaⅠ-NdeⅠ衔接物，其体积为1μl。将质粒组分加到6μl 5x连接缓冲液中：250mM Tris-HCl，50mM MgCl2，5mM ATP，5mM DTT，25% V/V聚乙二醇8000，pH7.6，2μl连接酶和16.5μl水。将连接混合物在16℃下保温过夜。然后，基本上按实施例3A3的方法，将成园的质粒pCZR126S用于转化E·Coli RV308细胞。质粒pCZR126S的限制性位点和功能图如附图14所示。
实施例4
质粒pRB182的构建
将约20μg按上面实施例2方法所制备的质粒pRB181悬浮在20μl10X  NdeⅠ缓冲液，5μl  NdeⅠ限制性酶（Boehringer-Mannheim  40单位），175μl水中，慢慢混合，在37℃保温1小时。然后在反应混合物中加入4微升BamHⅠ限制性酶（Boehringer-Mannheim  40单位），在37℃再继续保温2小时。用3体积乙醇和0.3M  NaOAc沉淀DNA，在1.2%低熔琼脂糖凝胶上进行电泳。从该凝胶上切下编码ACB-人胰岛素原基因的较小的（约265bp）  NdeI/BamHI限制性片段，按实施例2所述方法，通过Elutip-d柱以回收DNA。沉淀并干燥后，将DNA贮存在25μl  10mM  tris-HCl，pH＝8.0中。
将约15mg质粒pCZR126S（按上述实施例3的方法构建）悬浮在20μl  10X  NdeⅠ缓冲液，5ml  NdeⅠ限制性酶（40单位）和175μl水中，慢慢混合，在37℃保温2小时。保温后，按上述方法用3体积的乙醇沉淀DNA，干燥，然后再悬浮在20μl  10X  BamHⅠ缓冲液，2.5μl  BamHⅠ限制性酶（25单位）和178μl水中。慢慢混合后，反应混合物在37℃下保温2小时。再用3体积乙醇沉淀DNA，并在1%低熔琼脂糖凝胶上进行电泳。从该凝胶上切下相当于载体DNA的较大片段，按实施例2所述方法通过Elutip-d柱而回收DNA。沉淀并干燥后，将载体DNA贮存在4℃的35μl  10mM的tris-HCl，pH＝8.0中。
将约2.5μl载体DNA与12μl按上述方法制得的纯化ACB-胰岛素原基因片段、4μl 10mN ATP，0.5μl 1M二硫苏糖醇、5μl 10X连接酶缓冲液（500mM tris-HCl，pH＝7.6，100mM MgCl2），26μl水和0.5μl T4DNA连接酶（pharmacia，Inc.，800 Centennial Avenue，Piscataway，N.J.08854，3.5单位）相混合。将反应物在4℃保温16小时。用50ml 10mM tris-HCl（pH＝7.6）和3μl 1M CaCl2稀释连接混合物，接着按上述实施例3A3的方法，转化入E.Coli K12RV308中。将细胞铺在加有5μg/ml四环素的T4琼脂板上，在32℃保温过夜。
用Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual，（1982）由Maniatis，T.，Fritsch，E，F.，and  Sambrook，J.，Cold  Spring  Harbor  Publications，New  York编辑，Pgs 368-369（全部报导已列入本文参考文献）中所述的快速碱性萃取方法从四环素抗性菌落中分离3ml培养物中的质粒。按Birnboim，H.C.，Edoly，J.（1979）Nucleic  Acids，Res.1，1513-1523提及的小型筛选方法，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析XbaⅠ/BamHⅠ消化的片段可测定合适的人ACB-胰岛素原基因片段的存在。通过放大和纯化选择具有合适大小（约314bp）插入物的那些质粒。含有人ACB胰岛素原基因的表达质粒称为pRB182。质粒pRB182的限制性位点和功能图如附图20所示。
实施例5
发酵
用BioFlo半敞开发酵罐（从New  Brunswick  Scientific  CO.，Inc.，P.O.Box986，44  Talmadge  Road，Edison，NJ08817买到）进行用于萃取和纯化重组体ACB-胰岛素原的细胞的按比例扩大生产。将含有5μg/ml四环素（从Sigma  chemical  co.得到）和1.0ml消泡SAG5693（从Union  carbide，Specialty  chemical  Division，Danbury，CT  06817-0001买到）的5升2X  TY液体培养基用100ml含有pRB182质粒的E.Coli  K12  RV308细胞的细菌培养基进行接种，在30℃生长过夜。使细胞在32℃生长，直到指数生长期结束为止。接着，分别加入浓度为0.2%和0.1%的葡萄糖和酪（Case）一氨基酸，将温度调至42℃以诱发蛋白质合成。诱发后2小时，通过在4℃，500g下离心10分钟，从生长培养基中收集细胞。弃去上清液，用冰冷却的TE缓冲液（10mM  Tris-HCl，pH8.0，1mM  EDTA）洗涤沉淀一次。
基本上按Laemmli，U.k.（1970）Nature（London），227，680-685（全部报导已列入本文参考文献）中的报导，在10-20%聚丙烯酰胺多孔梯度凝胶中通过观测分离后总细胞蛋白质而测定ACB-PI的表达和积累。通过加入改性样品缓冲液（0.125M  Tris-HCl，PH＝6.8，2%SDS，30%甘油，1M2-巯基乙醇，6M尿素）使沉淀的细胞溶解，在装载前煮沸5分钟。通过考马斯兰染色和定量扫描而检测带。
基本上按Johnson，D.A.等人（1984）Gene  Anal.Techn  Vol.1，Pgs.3-8的报导，用识别C-肽的山羊抗-HPI通过Western印迹分析测定ACB-胰岛素原的特定鉴定物，然后基本上按卖主提供的说明加入生物素化的第二抗体（驴抗-羊IgG），并用Vectastain蛋白质检测合（从Vector  Laboratories，Inc.，30  Ingold  Rd.，Burlingam，CA94010买到）进行观测。
实施例6
r  DNAACB-胰岛素原的纯化和表征
将43.5g E·Coli细胞（湿重）悬浮在含有10mM EDTA，1mM PMSF，10%蔗糖和100μg/ml溶菌酶的400ml 20mM Tris-HCl pH＝7.6中。在室温下（约25℃）剧烈搅拌混合物1.5小时，在冰中急冷30分钟，通过超声处理使细胞破裂。在4℃ 2200g下离心1小时以收集颗粒。然后用20mM Tris-HCl，1M NaCl pH＝7.6洗涤颗粒。边搅拌边将该颗粒溶于200ml 20mM Tris-HCl，8M 胍-HCl，pH＝8.8的溶液中。然后加入7g Na2SO3和5g Na2S4O6，在室温下搅拌该溶液3小时。接着离心，上清液用1000 MWCO透析袋（从Spectrum Medical Industries，Inc.，Los Angeles，CA 90060买到）对三次变更的2升10mM乙酸铵，pH＝7.4的溶液进行透析。得到的沉淀是在40℃，在2200g下离心1小时而收集的。用6N HCl酸化上清液，使其pH为3.6。收集得到的沉淀，并加到来自透析液的沉淀中。
实施例7
ACB-胰岛素原S-磺酸酯的纯化
将实施例6方法中得到的含有ACB-胰岛素原S-磺酸酯的沉淀溶于20mM  Ttis-HCl，7.5M尿素，pH＝7.6的溶液中，并装于Mono  Q  HR  10/10柱（从pharmacia  LKB  Biotechnology，800  CentennialAve.，Piscataway.NJ 08854买到）中。用含有20mM Tris-HCl，pH为7.6，7.5M尿素的0.05-0.2M NaCl的760分钟梯度液以0.5ml/分速率洗脱该柱。用在0.1M（NH4）2HPO4，pH为7.0中的30-42% CH3CN梯度体系，以1.5ml/分速率，在一个45℃恒温的0.46×25cm Zorbax C8柱（从Dupont，Wilmington.DE 19898买到）上通过RP-HPLC对镏份进行分析。用Rainin HP反相HPLC仪（从Rainin Instruments，Woburn，MA 01801买到）进行RP-HPLC分离。基于通过RP-HPLC镏份含量的分析，从Mono Q 柱中收集相当于ACB-胰岛素原S-磺酸酯的二种蛋白质收集液，在zorbax C8柱上通过RP-HPLC用在0.1M NH4HCO3，pH＝8.0的10-35% CH3CN的梯度液进行脱盐，在液氮中冷冻并冷冻干燥。
实施例8
ACB-胰岛素原磺酸酯转化成ACB-胰岛素原
将上述实施例7中制备的ACB-胰岛素原磺酸酯的冷冻干燥物溶于50mM甘氨酸，pH＝10.5，温度为4℃，其浓度约为0.2mg/ml。在该溶液中加入2当量半胱氨酸-HCl。放置三天后，生成ACB-胰岛素原，其产率约为75%。
然后用CF3COOH酸化蛋白质溶液至pH为2.0，装在RP-HPLC 2.2×25cm Vydac C18柱（从The Separations Group，Hesperia，CA92345买到）中，用在H2O∶CH3CN（72∶28）中的0.1% CF3COOH的isocratic缓冲液，以1.5ml/分速率进行洗脱。通过分析RP-HPLC收集含所要物质的镏份，在液氮中冷冻并冷冻干燥。
实施例9
ACB-胰岛素原中二硫化物键对的测定
将250mg蛋白质溶于250ml 0.05M碳酸氢铵，pH为9.0中，加入25μl 0.1mg/ml的猪胰蛋白酶（从Signma chemical CO.，P.O.Box 14508，st.Louis，Mo63178买到）水溶液，在25℃使消化液保温2小时。通过加入280μl 0.1NHCl使释放B-链N-端的胰蛋白酶消化停止。然后加入25μl 0.1mg/ml胃蛋白酶（从Boehinger Mannheim Biochemical，P.O.Box50816，Indianapolis，In 46250买到）的0.01NHCl溶液。使消化液在25℃保温22小时，通过加入25μl的0.1mg/ml胃酶抑素（从Sigma chemical co买到）的10%乙酸溶液和900μl水而停止消化。然后将消化液装在恒温在45℃的4.6×450mm Zorbax C8柱中，该柱已用0.1M磷酸钠，pH为2.1，以1ml/分流速平衡，用在起始缓冲液中的15-30%CH3CN线性梯度液洗脱肽，收集25% CH3CN洗脱的主峰，用水稀释，在Sep-Pak药筒（从Waters买到）上脱盐，并冷冻干燥。然后在6300型氨基酸分析仪（从Beckman Instruments，Fullerton，CA 92634买到）通过氨基酸分析而分析收集的物质。
基本上按Toren，P.，等人（1988）Anal  Biochem.，Val.169，pgs.287-299的方法，通过胰蛋白酶/胃蛋白酶消化分子，接着通过HPLC分析而确定ACB-胰岛素原的合适二硫化物键的排列。
实施例10
ACB-胰岛素原转化为人-胰岛素
在23℃，用在2ml碳酸氢铵，pH＝8.8溶液中的1μg胰蛋白酶（Sigma chemical co.）和10μg羧基肽酶B（Lilly，由猪胰腺纯化的）处理1.03mg ACB-胰岛素原23小时。加入2.0ml 0.1NHCl以中止反应，将样品装在2个2ml注射在45℃恒温的用0.1% CF3COOH水溶液平衡过的4.6×150mm Vydac C18柱（从The Separations Group，Hesperia，CA92345买到）中，并用5分钟17%-26.25%，5分钟26.25-31.25%和35分钟31.25%-42.5% CH3CN的0.1% CF3COOH水溶液以1ml/分的速率梯度进行洗脱，收集洗脱的肽，并用FAB-MS分析，氨基酸分析，在含峰的胰岛素情况下进行生物学分析和肽映象。
实施例11
ACB-胰岛素原的生物学分析
基本上按Grappuso，P.A.，等人（1988）J.clin.Endocrinol.Metab.，Vol.67，pgs.194-197所述方法（全部报导已列入本文参考文献），除了在4℃进行保温18小时，膜收集在skatron  Cell  Harvester（从Skatron，Inc.，Sterling，VA买到）外，用人胎盘膜进行胰岛素和IGF-I受体结合的测试。基本上按kashwagi，M.，等人（1983）J.Clin.Invest.，Vol.72，pgs.1246-1254（全部报导已列入本文参考文献）的报导在鼠的脂细胞中进行葡糖迁移测试。
在禁食的鼠中测定ACB-胰岛素原的体内活性，使体重为190-210g，雄性瘦的Sprague-Dawley鼠（从Charles  River  Laboratories，Wilmington，MAO1887得到）禁食16小时。随机选择10只动物，并分成二组，每组为5只鼠。对照组接受皮下盐水注射（每100克体重0.1ml），而实验组接受含试验肽的盐水注射。在肽给药之前和肽给药之后30分钟，1、2、3和4小时，从每只鼠的尾部取血（0.1ml）以测定葡萄糖（Sigma  Diagnostics，glucose[Trinder]，address）。
计算对照组和处理组的鼠血中葡萄糖由0时间加或减S.E.M的平均百分变化，最终结果通过调节实验组中的变化用于对照组中的变化来表示。每种肽的5-7的不同剂量的影响是按常规测定的。
（1）综合资料  顺序一览表
(i)申请人:  Belagaje,Rama  M
Dimarchi,Richard  D
Heath,William  F
Long,Harlan  B
(ii)发明题目:A-C-B胰岛素原,其制备方法及应用,以及
在胰岛素生产中的中间体
(iii)顺序数:13
(iy)通讯处:
(A)收信人:Eli  Lilly  and  Company
(B)街:Lilly  Corporate  Center
(C)城市:Indianapolis
(D)州:Indiana
(E)国:USA
(F)ZIP:46285
(v)计算机可读形式:
(A)介质类型:Floppy  disk
(B)计算机:IBM  PC  compatible
(C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatentIn  Release  #1.0,  Version  #1.25
(vi)本申请数据:
(A)申请号:
(B)申请日:
(C)分类:
(viii)律师/代理人信息:
(A)姓名:Conrad,William  A
(B)登记号:32,089
(C)参考/摘要号:X-7866
(ix)联系信息:
(A)电话号:317-276-6013
(2)关于  SEQ  ID  NO:1的信息:
(i)顺序特征:
(A)长度:86氨基酸
(B)类型:氨基酸
(C)成链:单
(D)拓朴学:线性
(ii)分子类型:蛋白质
(xi)顺序种类:SEQ  ID  NO:1:
Figure 921051433_IMG7
(2)关于SEQ  ID  NO:2的信息:
(i)顺序特征:
(A)长度:278碱基对
(B)类型:核酸
(C)成链:单
(D)拓朴学:线性
(ii)分子类型:DNA(基因的)
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(D)拓朴学:线性
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Figure 921051433_IMG9
Figure 921051433_IMG10
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TATGATTATT  CCT CCTTATT  AAAATCAATA  TACATTATTA ATACCCT 47

Claims (5)

1、一种药物制剂的制备方法，该制剂含有作活性成分的化学式如下的多肽化合物：
其中：
Met=氨基酸蛋氨酸，
X=0或1，
A=胰岛素的A链或其功能性衍生物，
B=胰岛素的B链或其功能性衍生物，
C=胰岛素的C肽或一种化学式如下的肽：
其中：
X 1 、X 2 、X 3 和X 4 是碱性氨基酸，
X 1 、X 2 、X 3 和X 4 是相同或不同的，和
P=不含半胱氨酸残基的4-35个氨基酸的肽，
该方法将所说多肽化合物与一种或多种药物可接受的载体、赋形剂或其稀释剂相混合。
2、一种化学式如下的多肽化合物的重组体制备方法：
其中：
Met＝氨基酸蛋氨酸，
X＝0或1，
A＝胰岛素的A链或其功能性衍生物，
B＝胰岛素的B链或其功能性衍生物，
C＝胰岛素的C肽或化学式如下的肽：
其中：
X1、X2、X3和X4是碱性氨基酸，
X1、X2、X3和X4是相同或不同的，及
P＝不含半胱氨酸残基的4-35个氨基酸的肽。
所说方法包括如下步骤：
a、构建一种编码所说的一种多肽化合物的DNA顺序，
b、将所说DNA顺序加入一种合适的含有在宿主细胞中功能性的启动子-操纵基因区的载体中，
c、将所说DNA顺序定位在该载体中，以达到该DNA顺序的转录和转译，而且还使该DNA顺序在所说启动子-操纵基因区的转录控制下，
d、用该载体转化所说的宿主细胞，
e、在适合诱发该基因转录和转译的条件下培养所说的已转化的宿主细胞，和
f、回收和纯化通过所说DNA顺序编码的多肽产物。
3、一种化学式如下的多肽化合物的制备方法：
其中：
Met＝氨基酸蛋氨酸，
X＝0或1，
A＝胰岛素的A链或其功能性衍生物，
B＝胰岛素的B链或其功能性衍生物，
C＝胰岛素的C肽或化学式如下的肽：
其中：
X1、X2、X3和X4是碱性氨基酸，
X1、X2、X3和X4是相同或不同的，和
P＝不含半胱氨酸残基的4-35个氨基酸的肽，
该方法用固体一相肽合成。
4、一种制备胰岛素的方法，该方法包括如下步骤：
a、制备一种化学式如下的多肽化合物：
其中：
Met＝氨基酸蛋氨酸，
X＝0或1，
A＝胰岛素的A链或其功能性衍生物，
B＝胰岛素的B链或其功能性衍生物，
C＝胰岛素的C肽或化学式如下的肽：
其中：
X1、X2、X3和X4是碱性氨基酸，
X1、X2、X3和X4是相同或不同的，和
P＝不含半胱氨酸残基的4-35个氨基酸的肽，
b、用合适的肽酶或化学试剂分裂所说多肽以切下C-肽。
5、一种制备胰岛素的方法，该方法包括如下步骤：
a、构建一种编码化学式如下的多肽化合物的DNA顺序：
其中：
Met＝氨基酸蛋氨酸，
X＝0或1，
A＝胰岛素的A链，或其功能性衍生物，
B＝胰岛素的B链或其功能性衍生物，
C＝胰岛素的C肽或化学式如下的肽：
其中：
X1、X2、X3和X4是碱性氨基酸，
X1、X2、X3和X4是相同或不同的，和
P＝不含半胱氨酸残基的4-35个氨基酸的肽，
b、将所说DNA顺序加入一种合适的、含有在宿主细胞中功能性的启动子-操纵基因区的载体中，
c、将所述DNA顺序定位在所说载体中，以达到该DNA顺序的转录和转译，而且使该DNA顺序在所说启动子-操纵基因区的转录控制下，
d、用所说载体转化该宿主细胞，
e、在适合诱发所说基因转录和转译的条件下，培养所说转化的宿主细胞，和
f、回收和纯化用该DNA顺序编码的多肽产物，
g、用合适的肽酶或化学试制分裂通过所说基因编码的该多肽产物以切下C-肽。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110234339A (zh) * 2016-09-06 2019-09-13 佩特雷化学和生物制药学实验室有限公司 胰岛素原衍生物

Families Citing this family (53)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5378613A (en) * 1991-09-24 1995-01-03 Eli Lilly And Company Method for increased expression of low molecular weight recombinant polypeptides
US6348327B1 (en) * 1991-12-06 2002-02-19 Genentech, Inc. Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
DE69432704T2 (de) * 1993-06-21 2004-02-26 Genentech, Inc., South San Francisco Verfahren zur Herstellung von humanen Relaxin
US5646242A (en) 1994-11-17 1997-07-08 Eli Lilly And Company Selective acylation of epsilon-amino groups
US5665591A (en) * 1994-12-06 1997-09-09 Trustees Of Boston University Regulation of smooth muscle cell proliferation
KR0150565B1 (ko) * 1995-02-15 1998-08-17 김정재 유전자 조환에 의한 사람 인슐린 전구체의 제조 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법
US5576197A (en) * 1995-04-07 1996-11-19 Molecular Bio-Products Polymerase chain reaction container and methods of using the same
AU5724996A (en) * 1995-05-05 1996-11-21 Eli Lilly And Company Single chain insulin with high bioactivity
US5700904A (en) * 1995-06-07 1997-12-23 Eli Lilly And Company Preparation of an acylated protein powder
US5631347A (en) * 1995-06-07 1997-05-20 Eli Lilly And Company Reducing gelation of a fatty acid-acylated protein
GB9513967D0 (en) * 1995-07-08 1995-09-06 Univ Leicester Insulin
US5905140A (en) * 1996-07-11 1999-05-18 Novo Nordisk A/S, Novo Alle Selective acylation method
US7169889B1 (en) * 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
US7378390B2 (en) * 1999-12-29 2008-05-27 Novo Nordisk A/S Method for making insulin precursors and insulin precursor analogues having improved fermentation yield in yeast
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1274719A4 (en) 2000-04-12 2004-05-19 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSED PROTEINS
US7790690B2 (en) 2000-10-11 2010-09-07 U.S. Department Of Veterans Affairs Glucose sensitive regulator of insulin transcription
EP1346726A4 (en) * 2000-12-25 2004-09-15 Shiseido Co Ltd FRAGRANCE COMPOSITION STIMULATING THE SYMPATHETIC SYSTEM
US7060675B2 (en) * 2001-02-15 2006-06-13 Nobex Corporation Methods of treating diabetes mellitus
US6867183B2 (en) * 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7105314B2 (en) * 2001-04-02 2006-09-12 Novo Nordisk A/S Method for making human insulin precursors
US20030143191A1 (en) * 2001-05-25 2003-07-31 Adam Bell Chemokine beta-1 fusion proteins
US6828297B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6835802B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US7713932B2 (en) * 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6858580B2 (en) * 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828305B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6713452B2 (en) 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7312192B2 (en) * 2001-09-07 2007-12-25 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7166571B2 (en) * 2001-09-07 2007-01-23 Biocon Limited Insulin polypeptide-oligomer conjugates, proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US6913903B2 (en) 2001-09-07 2005-07-05 Nobex Corporation Methods of synthesizing insulin polypeptide-oligomer conjugates, and proinsulin polypeptide-oligomer conjugates and methods of synthesizing same
US7196059B2 (en) * 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
ES2545090T3 (es) * 2001-12-21 2015-09-08 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina y GCSF
AU2002364587A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2003105768A2 (en) * 2002-06-13 2003-12-24 Nobex Corporation Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus
US20050026826A1 (en) * 2003-01-17 2005-02-03 Margarethe Hoenig Feline proinsulin, insulin and constituent peptides
CA2513213C (en) 2003-01-22 2013-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
JP5697831B2 (ja) 2003-12-03 2015-04-08 ノヴォ ノルディスク アー／エス 単鎖インシュリン
PL2626368T3 (pl) 2004-07-19 2017-06-30 Biocon Limited Koniugaty insulina-oligomer, ich formulacje i zastosowania
US20090099095A1 (en) * 2007-05-16 2009-04-16 Peter Eriksson Novel neuroprotective peptide
WO2009050738A2 (en) * 2007-10-16 2009-04-23 Biocon Limited An orally administerable solid pharmaceutical composition and a process thereof
AU2012280474A1 (en) * 2011-07-01 2014-01-16 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
EP2925345B1 (en) 2012-12-03 2018-09-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Method for making o-glycosylated carboxy terminal portion (ctp) peptide-based insulin and insulin analogues
KR20160065930A (ko) 2013-10-04 2016-06-09 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 글루코스-반응성 인슐린 접합체
EP3660040A3 (en) 2014-11-21 2020-07-29 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists
WO2017040363A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Merck Sharp & Dohme Corp. A process for obtaining insulin with correctly formed disulfide bonds
EP3448417A4 (en) 2016-04-26 2019-12-11 Merck Sharp & Dohme Corp. SOUND CONJUGATES OF INSULIN-INCRETIN
WO2017205191A1 (en) 2016-05-24 2017-11-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists and glp-1 analogues
US10689430B2 (en) 2016-05-25 2020-06-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists
EP3272877A1 (en) 2016-07-18 2018-01-24 ETH Zurich B-cell-mimetic cells
BR112019000837A2 (pt) 2016-07-18 2019-10-01 Eth Zuerich células miméticas de célula b
US11041009B2 (en) 2017-03-23 2021-06-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Glucose responsive insulin comprising a tri-valent sugar cluster for treatment of diabetes

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666884A (en) * 1984-04-10 1987-05-19 New England Deaconess Hospital Method of inhibiting binding of von Willebrand factor to human platelets and inducing interaction of platelets with vessel walls
KR910700262A (ko) * 1988-12-23 1991-03-14 안네 제케르 사람 인슐린 유사체
NZ232375A (en) * 1989-02-09 1992-04-28 Lilly Co Eli Insulin analogues modified at b29
DK134189D0 (da) * 1989-03-20 1989-03-20 Nordisk Gentofte Insulinforbindelser

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110234339A (zh) * 2016-09-06 2019-09-13 佩特雷化学和生物制药学实验室有限公司 胰岛素原衍生物

Also Published As

Publication number Publication date
ES2116315T3 (es) 1998-07-16
ATE166106T1 (de) 1998-05-15
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CZ171492A3 (en) 1993-05-12
FI922645A (fi) 1992-12-12
DE69225432D1 (de) 1998-06-18
BR9202180A (pt) 1993-02-02
HU9201915D0 (en) 1992-08-28
KR930000536A (ko) 1993-01-15
EP0518587A3 (en) 1993-12-01
DK0518587T3 (da) 1998-10-19
IE921862A1 (en) 1992-12-16
HUT63193A (en) 1993-07-28
IL102107A0 (en) 1993-01-14
DE69225432T2 (de) 1998-10-01
ZA924080B (en) 1993-12-06
US5304473A (en) 1994-04-19
CA2070503A1 (en) 1992-12-12
EP0518587A2 (en) 1992-12-16
AU648670B2 (en) 1994-04-28

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SE01 Entry into force of request for substantive examination
C01 Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication