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CN1671400A - 透明质酸组合物以及使用方法 - Google Patents

透明质酸组合物以及使用方法 Download PDF

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CN1671400A
CN1671400A CNA038177811A CN03817781A CN1671400A CN 1671400 A CN1671400 A CN 1671400A CN A038177811 A CNA038177811 A CN A038177811A CN 03817781 A CN03817781 A CN 03817781A CN 1671400 A CN1671400 A CN 1671400A
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hyaluronic acid
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link molecule
poly
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Y·斯维肯
R·帕萨
D·津格曼
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Pericor Science Inc
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Abstract

本发明提供了一种用于治疗特征为干燥的病症的组合物，所说的病症包括干眼和口干燥。该组合物通常包含透明质酸和聚赖氨酸的轭合物。用转谷氨酰胺酶，优选内源性转谷氨酰胺酶将这些轭合物连接到受影响的机体组织或表面上。

Description

透明质酸组合物以及使用方法
                       技术领域
本发明涉及用于缓解与可以由使用透明质酸获益的病症有关的症状的组合物和方法，所说的症状非限制性地包括干眼和口干燥。
                       背景技术
干眼是一种眼睛持续干燥的情况，包括角膜和结膜持续干燥。其是由眼泪形成异常或不足、以及粘蛋白分泌不足导致的(即，干性角膜结膜炎)。可能由于损害分泌眼泪的(即产生眼泪的)腺体的基础性病症如自身免疫性病症而出现干眼症状，所说的病症如类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、系统性红斑狼疮、和系统性硬化症以及肉样瘤病。可能在眼睛手术，如LasikTM手术后诱发干眼。估计在美国，一千三百万以上的人口受到干眼的影响。
不管基础的病理学是什么，干眼通常涉及眼睛前的泪膜迅速分解，从而使得暴露的外表面脱水。需要正常形成眼泪以使角膜和结膜保持湿润，这反过来又有助于防止角膜和结膜的溃疡和维持角膜的透明度。此外，眼泪有助于眼睑在眼睛表面上的活动(例如，眨眼)和从眼睛上除去异物。眼泪通常还包含有助于防止眼睛感染的溶菌酶。
干眼可能伴有轻度至严重的眼睛疼痛。当其长期发生时，其可造成视力模糊、沙砾感和/或灼烧感、以及瘙痒。如果不进行治疗地使该情况持续下去，其将进一步导致角膜溃疡和/或瘢痕化。
迄今为止，干眼最常见的治疗形式是使用人工泪液。可以通过商业途径获得的人工泪液产品包括Bion Tears(Alcon)、Lacriset(Merck)、Tears Naturale(Alcon)和Tears Naturale II(Alcon)。但是，使用人工泪液的一个缺点是需要频繁使用，尤其是因为人工泪液制剂提供的缓解通常不能持久而更需要频繁使用。
口干燥(也被称为口部干燥)是一种特征为唾液产生不足的情况。其可能是一种由压力(例如，恐惧)、分泌唾液的(即，产生唾液的)腺体的感染、或者使用某些药物如抗胆碱能药、利尿剂、抗组胺药、可乐定、左旋多巴、甲基多巴、和三环抗抑郁剂造成的临时情况。其还可能是一种病因学未知的持久情况。斯耶格伦综合征和系统性硬化症、以及嘴、颈和头的放疗(例如在口腔癌的治疗中)也可能伴有口干燥。口干燥通常还会导致吞咽、讲话的困难和痛苦，并且其可能会干扰味觉。在一些情况中，其还可能会造成牙齿腐蚀。
口干燥目前是通过口腔清洗、局部敷用、唾液替代品、或唾液分泌刺激剂如无糖的糖果来进行治疗的。目前可以通过商业途径获得的唾液刺激剂包括胆碱能激动剂如EvoxacTM(西维美林HCl，DaiichiPharmaceutical Corp.)和Salagen(皮罗卡品HCl，MGIPharma，Inc.)。可以通过商业途径获得的唾液替代品包括Moi-Stir、Orex和Salivart。缓解口干燥的大多数普通治疗是用人工唾液喷洒在口腔中。但是，与人工泪液一样，人工唾液需要频繁应用，其对于受影响的个体而言是一种累赘。
以前已经报道过透明质酸可用于治疗干眼。但是，该类报道都将注意力放在使用游离透明质酸上，与上面所讨论的人工泪液治疗相似，其必需频繁应用。
                        本发明的概述
因为可以克服连续和频繁应用的需要，所以希望对干眼和口干燥以及将从使用透明质酸受益的其它情况进行长期有效治疗。
本发明提供了用于治疗干眼、口干燥、和与干燥有关的其它情况的作为连续和频繁应用的供替代的选择的治疗剂。本发明部分是以将透明质酸共价连接到受影响的机体表面或组织可以增强透明质酸缓解干眼和口干燥的功效的发现为基础的。因为，透明质酸在眨眼或吞咽的过程中比较不易被清洗掉，所以该类连接减少了重复和频繁使用干眼或口干燥物质的需要。根据本发明，透明质酸通过一种是转谷氨酰胺酶底物的连接分子被连接到受影响的机体表面上。该连接分子可包括是转谷氨酰胺酶底物的氨基和/或甲酰胺基团。所说的转谷氨酰胺酶优选地是内源性转谷氨酰胺酶，但其也可以是外源性转谷氨酰胺酶。
但是，这里所提供的组合物并不仅仅限于应用于干眼和口干燥中。而是其还可用于特征为其它组织干燥的其它病症，所说的其它组织包括其它粘膜组织如阴道、直肠、和鼻(包括其它组织)、以及外部表面如皮肤、头发、指甲、和嘴唇。此外，发现该组合物还可用于其它机体组织如内皮(尤其是主动脉内皮)、和骨关节软骨。当用于血管内皮时，该透明质酸组合物提供了长期持续的以前报道所给出的透明质酸可以抑制血小板凝固的预防和/或治疗益处。以前还报道了透明质酸可以降低关节结合点疼痛，从而将透明质酸附着在骨关节软骨上将提供长期缓解关节炎的作用。当用于由于皮肤干燥而造成的皱纹中时，透明质酸将被局部应用，并且将减少非连接性透明质酸制剂频繁应用的需要。本发明打算包括为上述各种情况所量身定做的透明质酸-连接分子轭合物制剂。
因此，本发明一方面提供了一种包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶的底物的连接分子、以及游离透明质酸的组合物，其中所说的游离透明质酸和轭合物是以至少2的摩尔比存在的。
本发明的各种实施方案平等地适用于这里所公开的各个方面。因此，虽然这些实施方案仅叙述一次，但是应当清楚的是，正如本发明说明书和权利要求所教导的那样，其可应用于各种方面。
在一个实施方案中，该连接分子具有至少两个相连的脂族胺、至少三个相连的脂族胺、至少四个相连的脂族胺、至少五个脂族胺、或至少六个脂族胺。在另一个实施方案中，所说的连接分子是天然的聚赖氨酸。在另一个实施方案中，聚赖氨酸选自聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、和聚-DL-赖氨酸。在另一个实施方案中，所说的连接分子是聚赖氨酸的衍生物。
在一个实施方案中，该连接分子具有至少两个相连的甲酰胺、至少三个相连的甲酰胺、至少四个相连的甲酰胺、至少五个甲酰胺、或至少六个甲酰胺。在另一个实施方案中，所说的连接分子是天然的聚谷氨酰胺。在另一个实施方案中，所说的连接分子选自聚-L-谷氨酰胺、聚-D-谷氨酰胺、和聚-DL-谷氨酰胺。还是在另一个实施方案中，所说的连接分子是聚谷氨酰胺的衍生物。
在一个实施方案中，该透明质酸是天然的透明质酸。在另一个实施方案中，该透明质酸是选自透明质酸可药用的盐、透明质酸酯、和硫酸化的透明质酸的透明质酸衍生物。
该摩尔比可选自至少2.0和至少4.0。
在另一个实施方案中，该组合物是以选自滴眼管、隐形眼镜溶液、眼用软膏、眼睛填塞物、和隐形眼镜的形式被提供的。在另一个实施方案中，该组合物是以选自舌下片、漱口剂、牙膏、糖果、和口部凝胶的形式被提供的。
在一个实施方案中，透明质酸具有至少100,000的分子量。在一些重要的实施方案中，该轭合物具有高于1.0的负电荷：正电荷比。
在另一个实施方案中，该组合物还包含可药用的载体。在一些重要的实施方案中，所说的可药用的载体具有至少280mOsm的重量渗克分子浓度。在其它实施方案中，该可药用的载体具有至少6.5的pH。
该可药用的载体可包含眼用防腐剂。在一些实施方案中，所说的眼用防腐剂选自有机汞制剂、季铵化合物、对羟基苯甲酸酯、被取代的醇和苯酚类物质。在一个相关的实施方案中，所说的有机汞制剂选自硝酸苯汞、醋酸苯汞、硼酸苯汞、和硫柳汞。在另一个相关的实施方案中，所说的季铵化合物选自苯扎氯铵、苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓、和聚季鎓-1(polyquaternium-1)(POLYQUAD)。
还是在另一个实施方案中，所说的被取代的醇和苯酚选自氯丁醇、和氯丁醇/苯乙醇。该眼用防腐剂可以是抗生素。
还是在另一个实施方案中，该组合物还可以包含选自矫味剂、着色剂和香料的物质。在另一个实施方案中，该组合物还包含精氨酸或氟化物。
在一个实施方案中，该轭合物具有选自至少90％、至少95％、和至少99％的重量比。在另一个实施方案中，所说的连接分子是非络合的。
在另一方面，本发明提供了一种包含被共价连接到一种是转谷氨酰胺酶的底物的连接分子上的透明质酸的药物组合物，其中所说的连接分子是非络合的。在一个实施方案中，该组合物包含游离透明质酸。在另一个实施方案中，该组合物是以选自滴眼管、隐形眼镜溶液、眼用软膏、眼睛填塞物、和隐形眼镜的形式被提供的。还是在另一个实施方案中，该组合物是以选自舌下片、漱口剂、牙膏、糖果、和口部凝胶的形式被提供的。
还是在另一方面，本发明提供了一种位于滴眼管瓶中的包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物的组合物。在一个实施方案中，该组合物还包含可药用的载体。在另一个实施方案中，提供了使用说明，其任选地位于所说滴眼管瓶的外表面上。在一个重要的实施方案中，该组合物还包含游离透明质酸。在其它实施方案中，该可药用的载体具有至少280mOsm的重量渗克分子浓度和/或至少6.5的pH。在另一个实施方案中，该可药用的载体包含精氨酸或溶菌酶。在一个重要的实施方案中，所说的连接分子是非络合的。
另一方面，本发明提供了一种包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物、和选自矫味剂、着色剂和香料的物质的组合物。
在一个实施方案中，所说的矫味剂选自甘露醇、糖精钠、magnasweet、薄荷提取物、叶粉或油；留兰香提取物、叶粉或油；冬青油；香草提取物；欧芹；牛至油；月桂叶油；丁香油；鼠尾草油；黄樟油；柠檬油；橙油；茴香油；苯甲醛；杏仁油；樟脑；雪松叶油；马郁兰油；cintronellaoil；熏衣草油；芥子油；松油；松针油；迷迭香油；百里香油；肉桂叶油；薄荷醇；香芹酮；茴香脑；丁香酚；水杨酸甲酯；柠檬烯；繖花烃；正-癸醇；香茅醇；α-松油醇；乙酸甲酯；醋酸香茅酯；甲基丁香酚；桉树脑；芫荽醇；eyktl linalool；香草醛；百里酚；pellira oil；冬绿油；桉树油；咖啡因、酒石酸氢钾、乳酸、苹果酸、谷氨酸单钠、亚硝酸盐、山梨醇、阿司帕坦、乙酰舒泛、葡萄糖、果糖、环己基氨基磺酸钠、斯替维苷、新橙皮苷(neo-hesperidyl)双氢查耳酮、甘草甜素、紫苏糖、索马汀、天冬氨酰基苯基丙氨酸甲酯、和对-甲氧基肉桂醛。
在另一个实施方案中，所说的着色剂选自FD&C蓝#1、FD&C黄#5，FD&C黄#10、FD&C红#3、FD&C红#40；焦糖色或粉末(#05439)、巧克力色光(#05349)、绿色淀掺合物(#09236)、kowet二氧化钛(#03970)、黄色液体色(#00403)、和亚硝酸盐。
还是在另一个实施方案中，所说的香料选自草花提取物、草药提取物、树花提取物、植物提取物、和人造香料组成的组。
在一些重要的实施方案中，该组合物被制备成用于口部或眼睛给药的组合物。该组合物可以被制备成舌下片、漱口剂、牙膏、口部凝胶、和糖果形式。该组合物还可以包含精氨酸或氟化物。
该组合物还可以包含任选地具有至少6.5的pH和/或高于280mOsm的重量渗克分子浓度的可药用载体。
本发明另一方面提供了一种在包含氟化物的载体中包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物的组合物。在一个实施方案中，该载体是可药用的载体。
在另一个实施方案中，该可药用的载体具有至少6.5的pH、和/或高于280mOsm的重量渗克分子浓度。在一个实施方案中，该轭合物是以选自舌下片、漱口剂、牙膏、糖果、和口部凝胶的形式被提供的。
本发明另一方面还提供了一种舌下片形式的包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物的组合物。在一个相关的实施方案中，该舌下形式还包含选自糖精、阿司帕坦、山梨醇、乙酰舒泛、葡萄糖、果糖、环己基氨基磺酸钠、斯替维苷、新橙皮苷双氢查耳酮、甘草甜素、紫苏糖、索马汀、天冬氨酰基苯基丙氨酸甲酯、和对-甲氧基肉桂醛的甜味剂。在另一个实施方案中，该舌下形式包含维生素或氟化物。
本发明另一方面还提供了一种包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物、以及有效量游离透明质酸的药物组合物，其中所说的游离透明质酸和轭合物是以至少2的摩尔比存在的。
本发明还提供了治疗或预防特征为干燥的病症的方法，其包括给需要其的个体使用有效量的任何一种前述组合物。
在一个实施方案中，所说的病症是干眼。在一个相关的实施方案中，该干眼病症伴有选自非进行性结膜瘢痕形成(斯-约二氏综合征)、斯耶格伦综合征、沙眼、和疤痕性类天疱疮的病症。在另一个实施方案中，所说的病症是口干燥。在另一个病症中，个体已经经受或将经受可能可诱导干眼症状的手术操作如眼睛矫正手术(例如，LasikTM手术)。
本发明另一方面提供了一种对个体进行治疗的方法，其包括向眼睛干燥或者有出现眼睛干燥风险的个体的眼睛使用有效量的透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物。在一个实施方案中，该轭合物是以选自滴眼管、隐形眼镜溶液、眼用软膏、眼睛填塞物、和隐形眼镜的形式被提供的。
本发明另一方面提供了一种对个体进行治疗的方法，其包括给口部干燥或者有口部干燥风险的个体的口部使用有效量的透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物。在一个实施方案中，该轭合物是以选自舌下片、漱口剂、牙膏、糖果、和口部凝胶的形式被提供的。
本发明另一方面提供了一种对个体进行治疗的方法，其包括给关节不适或有关节不适风险的个体的关节使用有效量的透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物。
本发明另一方面提供了一种对个体进行的方法，其包括给凝血过度或有凝血过度的风险、或者血凝风险升高的个体的血管使用有效量的透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物。
本发明另一方面还提供了一种对个体治疗的方法，其包括给有皱纹或者有出现皱纹风险的个体的皮肤使用有效量的透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物。
上述组合物和轭合物适于这里所提供的方法。
下面的实施方案可相等地用于上述方法。在一个实施方案中，所说的有效量每天小于0.05μg/kg。
在这里将对这些方面和其它方面以及实施方案进行更详细的描述。
                   附录和附图简要说明
附录1是列出了可用于本发明轭合物的各种联结子的表。
图1A是以滴眼剂的形式将FITC-标记的聚赖氨酸最后一次给药后1小时兔角膜横截面荧光显微镜检查的照片。
图1B是以滴眼剂的形式将FITC-标记的聚赖氨酸最后一次给药后36小时兔角膜横截面荧光显微镜检查的照片。
图1C是以滴眼剂的形式将PCS-101(轭合到透明质酸上的FITC-标记的聚赖氨酸、游离透明质酸、和缓冲剂)最后一次给药后1小时兔角膜横截面荧光显微镜检查的照片。
图1D是以滴眼剂的形式将PCS-101(轭合到透明质酸上的FITC-标记的聚赖氨酸、游离透明质酸、和缓冲剂)最后一次给药后36小时兔角膜横截面荧光显微镜检查的照片。
图1E是以滴眼剂的形式将对照载体单独最后一次给药后1小时兔角膜横截面荧光显微镜检查的照片。
图1F是以滴眼剂的形式将对照载体单独最后一次给药后36小时兔角膜横截面荧光显微镜检查的照片。
图2是应用到人手指上的轭合物的体内时间过程。
图3是表示在不存在外源性加入的转谷氨酰胺酶的情况下重复向兔角膜上应用后PCS-10-FITC的吸收的照片汇编。
图4是表示在不存在外源性加入的转谷氨酰胺酶的情况下重复向兔角膜(横截面)上应用后PCS-10-FITC的吸收的照片汇编。
图5是结合到猪腭上的PCS-201的照片汇编。
图6是结合到猪舌上皮的下表面上的PCS-201的照片汇编。
图7是结合到猪龈上皮上的PCS-201的照片汇编。
图8是结合到猪龈上皮和猪舌上皮上的PCS-201的照片汇编。
图9是结合到猪腭、猪龈上皮和猪舌上皮上的PCS-201的照片汇编。
图10是结合到猪口腔上皮上的PCS-201的照片汇编。
图11是猪主动脉内层上的交联的PCS-201和聚赖氨酸(二者都用FITC进行了标记)的照片汇编。
图12表示了NaCl浓度对透明质酸聚赖氨酸FITC在不存在外源性加入的转谷氨酰胺酶情况下向兔角膜的角化层上的偶合的影响。
图13表示了PCS-101和游离HA对兔角膜浅层的结合的比较。
图14是对兔角膜模型中与PLL-TRITC轭合的HA-FITC和HA-FITC以及未进行处理的细胞的进行了校正的平均荧光强度进行比较的柱状图。
这些图并不是实现要求保护的本发明所必需要求的。
                     本发明的详细描述
本发明提供了一些用于治疗将从存在的透明质酸受益的病症的新颖组合物和方法，所说的病症包括特征为干燥的病症。特征为干燥的病症包括干眼和口干燥，其可能分别是由于眼泪和唾液产生不足而导致的。在一些实施方案中，本发明利用其能吸引和保留水分子的能力用透明质酸作为能润湿受影响的粘膜或外部组织的活性物质。正如这里更详细讨论的那样，据报道，已经成功地用透明质酸来润湿经历干眼的个体的角膜和结膜。
本发明部分地是以可以用转谷氨酰胺酶-介导的反应将透明质酸连接到受影响的表面如粘膜(例如，角膜或口腔)、内皮、或外部(例如，头发或指甲)表面上的发现为基础的。转谷氨酰胺酶是介导特定的肽结合的γ-谷氨酰基残基和作为胺供体底物的肽结合的赖氨酸或聚胺的各种伯氨基之间的共价交联反应的钙-依赖性酶族的酶(Davies等人，Adv.Exp.Med.Biol.250，391-401，1988)。在哺乳动物中已经确定、克隆和测序了至少五种酶活性的转谷氨酰胺酶。本发明包括使用能影响例如谷氨酰胺的甲酰胺基团和例如赖氨酸的氨基之间的共价结合的任何和所有转谷氨酰胺酶以及其酶衍生物。在优选的实施方案中，影响该轭合物与机体组织的结合的该转谷氨酰胺酶是一种内源性转谷氨酰胺酶，但是在一些实施方案中也可以使用外源性转谷氨酰胺酶。
透明质酸不是转谷氨酰胺酶的固有底物，这是因为其不包含与转谷氨酰胺酶反应的氨基或甲酰胺基团。但是，根据本发明可以对其进行修饰以使其易于被转谷氨酰胺酶作用。例如，可以通过向透明质酸的适宜反应基团上加上甲酰胺或氨基侧基来实现这一点(即，“改性的”透明质酸)。这一点还可以通过将谷氨酰胺、赖氨酸或谷氨酸和赖氨酸两者与透明质酸共价偶合从而形成一种是转谷氨酰胺酶底物的轭合物来实现。最优选的方法是将一种连接分子，如聚谷氨酰胺、聚赖氨酸、外皮蛋白(一种天然的转谷氨酰胺酶底物)、或外皮蛋白片断偶合到透明质酸上从而形成一种适宜的轭合物。然后，存在于上皮组织如角膜上皮或口腔上皮中的内源性转谷氨酰胺酶能够催化连接分子(具有连接到其上的透明质酸)与眼睛或口腔中的氨基或甲酰胺底物共价连接。
天然的透明质酸一种D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基D-葡萄糖胺的二糖重复单体所组成的线形聚合物。除非特别说明，否则这里所用的术语“透明质酸”指的是包括天然的透明质酸以及其衍生物(即，类似物)，非限制性地包括盐和酯。透明质酸的盐包括可药用的盐如钠盐和季铵盐。透明质酸衍生物包括已经用其它化学反应如酯化作用改性的透明质酸，因此包括透明质酸酯以及硫酸化透明质酸(如US 6,339,074B1所述)。透明质酸衍生物的一个实例是hylan。透明质酸衍生物还包括合成或半合成的变型如US 4,851,521；4,965,353；和5,202,431中所述的透明质酸和脂族、芳脂族、杂环、和环脂族醇的酯(例如，透明质酸的苄酯或乙酯)。
本发明的组合物除共轭形式的透明质酸外还包括游离形式的透明质酸。以前已经有使用游离透明质酸的报道。现在已经发现可以通过转谷氨酰胺-介导的键合将透明质酸连接到眼睛或其它受影响的表面上。该类连接延长了透明质酸在眼睛(或其它受影响表面)上的存在时间，从而降低或完全消除了向该类表面上重复应用透明质酸的需要。因此，应当清楚的是，该组合物的治疗益处主要是得自所存在的轭合的透明质酸，其一旦被应用到机体组织上，就会立即变得共价连附在该组织上。存在于组合物中的游离透明质酸不会出现这种情况，这是因为之前已经证明了游离透明质酸仅具有有限的治疗益处。
这里所用的术语“轭合物”既包括该连接分子直接连接到透明质酸上又包括该连接分子间接连接到透明质酸上。间接连接一般指的是在连接分子和透明质酸之间存在一种间隔物(即，联结子)。在这里对适宜的间隔物进行了描述。
虽然不希望受到任何特定理论或机理的束缚，但透明质酸是用于治疗特征为干燥的病症(非限制性地如干眼、口干燥和阴道干燥)的，这是因为其能作为增湿剂和/或湿润剂。这里所用的增湿剂是一种可以形成膜从而可以捕获水分子并防止或限制其蒸发程度的物质。这里所用的湿润剂是一种可以增加组织、表面或其它区域的水含量的物质。透明质酸在中性pH下通常荷负电，并且具有能吸引和保留水分子的亲水性羟基。透明质酸既可以形成膜又可以吸引和保留水分子。因此，其既可以作为增湿剂，又可以作为湿润剂。
还已经报道了透明质酸可以抑制血小板聚集，其这种机理被用在本发明血管给药制剂的实施方案中。
透明质酸可以通过商业途径获得，并且其在以各种商标名进行销售，包括Healon、Hyalastine、Hyalectin、Hyloran(透明质酸钠)、和Hyaloftil(高分子量的透明质酸)。或者，如US3,396,081；3,862,003；4,141,973；4,517,296；5,316,926；6,090,596等等中所述的那样，可以通过合成或通过由动物来源纯化(如公鸡冠，以Hyalform的形式商业销售)或体外发酵(如细菌发酵，以Restylane的形式商业销售)来获得透明质酸。
所用透明质酸的长度对本发明而言并不关键，只要其长度足以将受影响的机体表面或组织水化即可。为此，在一些实施方案中，与较短的透明质酸链(即，具有低于2000的分子量)相比，更优选更长的透明质酸链(即，具有高于100,000的分子量)，除非有一些该类较短的链被连接到连接分子上。在其中轭合物仅包含一个连接分子和一个透明质酸链的情况中，至少为了将可以被保留的水分子数目最大化，优选更长的透明质酸链。生产或分离低和高分子量透明质酸的方法是已知的并且已经在US4,141,973(MW至少750,000)；5,079,236(MW50,000至200,000)；5,316,926(MW1,100,000至4,000,000)；5,925,626(MW在50,000至100,000之间；和在500,000至730,000之间)；6,090,596(MW高于6,000,000)；和6,194,392(MW在150,000至750,000之间)中进行了报道。
透明质酸链的长度将被称为二糖单元的数目(各单元具有约401道尔顿的分子量)或该链的分子量。例如，分子量为200,000的透明质酸链由498个二糖单体单元组成。在一些重要的实施方案中，该透明质酸链具有高于50,000、高于60,000、高于75,000、高于100,000、高于150,000、和高于200,000的分子量。在另一些实施方案中，该透明质酸可以具有高于300,000、高于400,000、高于500,000、高于600,000、高于700,000、高于800,000、高于900,000、和高于1,000,000的更高分子量。在一些优选的实施方案中，该透明质酸是至少200,000、至少210,000、至少220,000、至少230,000、至少240,000、或至少250,000。
在一些实施方案中，将本发明的轭合物与游离透明质酸一起提供给个体。这里所用的“游离”透明质酸没有与连接分子轭合。本发明并不依赖于透明质酸与其特定受体(例如，CD44)的结合来获得治疗结果。而是一般通过直接给药和转谷氨酰胺酶界介导的键合来控制透明质酸向受影响部位的定位。本发明的方法并不需要透明质酸与其受体的结合。存在的游离透明质酸并不成问题，这是因为其不会与轭合透明质酸竞争结合同源受体，所以其不会降低所说轭合物的功效。此外，只要其包含足够水平的内源性转谷氨酰胺酶和转谷氨酰胺酶底物，不管其是否还表达透明质酸受体，本发明的轭合物都可以连接到任何表面或组织上。
在一些实施方案中，使用以低于天然透明质酸与透明质酸受体亲合力的亲合力结合到透明质酸受体上的透明质酸衍生物(游离形式和/或轭合形式)。在一些实施方案中，其亲合力比天然透明质酸的结合亲合力低2-倍、低5-倍、低10-倍、低20-倍、低50-倍、或低100-倍。
在一些实施方案中，组合物中游离透明质酸与轭合透明质酸的摩尔比为至少10、至少5、至少4、至少3.5、至少3、至少2.5、至少2、至少1.5、至少1.2、至少1、至少0.9、至少0.8、至少0.7、至少0.6、至少0.5、至少0.4、至少0.3、至少0.2、或至少0.1。在一些特定的实施方案中，游离透明质酸与轭合透明质酸的摩尔比高于1，优选地高于1.5，并且更优选地高于2。如这里所用的这样，游离透明质酸与轭合透明质酸的摩尔比是未与连接分子轭合的透明质酸(包括所有MW变型)的摩尔数和与连接分子轭合的透明质酸(相同或不同MW的透明质酸)的摩尔数的比例。因此，在一些实施方案中，游离透明质酸的数量足以与轭合透明质酸竞争与透明质酸受体的结合。
本发明的连接分子是转谷氨酰胺酶的底物。因此，其具有脂族胺或甲酰胺，但是优选地不会同时具有脂族胺或甲酰胺。优选的连接分子是带有多个是转谷氨酰胺底物的反应性甲酰胺和/或脂族胺的聚合物。是转谷氨酰胺酶的底物的包含甲酰胺的化合物是众所周知的并且包括谷氨酰胺。是转谷氨酰胺酶的底物的脂族胺也是众所周知的，并且在例如US 5,490,980给出了其实例，该专利文件的内容在这里被引入作为参考。但是，与描述了单脂族胺部分的该′980专利不同，本发明在一方面包括使用多个脂族胺。该脂族胺(或多个脂族胺)可以是相连的，或者其可以以一定的离散间隔被间隔开，优选地沿着分支或无分支聚合物的长度被间隔开。在一些实施方案中，反应部分的间距对于将该轭合物连接到特定的机体组织上而言是很重要的。
一个实施方案包括是具有多个单元的聚合物的连接分子，各单元带有是转谷氨酰胺酶的底物的脂族胺。该聚合物可以是均聚物或杂聚物。正如这里在涉及连接分子时所述的那样，转谷氨酰胺酶的聚脂族胺底物是一种具有至少三个沿着连接分子的骨架以离散间隔彼此间隔开的脂族胺的连接分子，所说的脂族胺被一个或多个骨架原子分离开。这是最易于想象的，例如，富含赖氨酸的聚合物，而聚合物的离散单元带有脂族胺，其各自独立地是转谷氨酰胺酶的底物。该连接分子本身可以是相连的赖氨酸的聚合物，优选地是至少2、至少3、至少4、和至少5个或更多个该类相连赖氨酸的聚合物。优选各自带有脂族胺的相连单元的聚合物。在一些实施方案中，该连接分子可以具有少至两个相连的赖氨基酸残基，并且这些残基优选地位于该连接分子的任何一个末端上。
同样地，其它重要的连接分子是具有多个单元的聚合物，各单元带有转谷氨酰胺酶反应性甲酰胺基团。该聚合物可以是均聚物或杂聚物。转谷氨酰胺酶的聚甲酰胺底物是一种具有至少两个沿着连接分子的骨架以离散间隔彼此间隔开的甲酰胺的连接分子，所说的甲酰胺被一个或多个骨架原子分离开。该类连接分子可以是相连甲酰胺的聚合物，优选地是至少2、至少3、至少4、或至少5个或更多个相连甲酰胺的聚合物。在一些重要的实施方案中，该相连的甲酰胺位于所说连接分子的任何一个末端上。
最优选的连接分子是富含甲酰胺部分或脂族胺部分的聚合物，如谷氨酰胺或赖氨酸、或谷氨酰胺和赖氨酸。富含甲酰胺的聚合物是一种其中其单元的至少20％是携带甲酰胺的单元的聚合物。富含脂族胺的聚合物是一种其中其单元的至少20％是携带脂族胺的单元的聚合物。因此，这些聚合物还包括这些具有至少30％、至少40％、至少50％、或更多其所定义的单元的物质。富含谷氨酰胺或赖氨酸的聚合物是一种其单元的至少20％为谷氨酰胺或赖氨酸、或谷氨酰胺和赖氨酸的聚合物。富含甲酰胺或脂族胺的聚合物还可以是一种包括至少3，优选4，并最优选5或更多个独立件并被规则距离的甲酰胺或脂族胺离散地间隔开的聚合物，如存在邻接的连接到一起的谷氨酰胺或赖氨酸。但是，应当清楚地是，可以将少至两个谷氨酰胺或赖氨酸连接或束缚到透明质酸上以使其成为转谷氨酰胺酶的底物。在优选的实施方案中，该连接分子和包含其的轭合物是内源性转谷氨酰胺酶的底物(即，其具有被内源性转谷氨酰胺酶作用的足够的转谷氨酰胺酶反应性基团)。
其它优选的连接分子是聚赖氨酸。聚赖氨酸包括聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、和聚-DL-赖氨酸。另一种重要的连接分子是聚-谷氨酰胺。聚-谷氨酰胺包括聚-L-谷氨酰胺、聚-D-谷氨酰胺、和聚-DL-谷氨酰胺。
因此，该连接分子包括天然或衍生物形式的聚赖氨酸和聚谷氨酰胺。聚赖氨酸的一种天然形式是赖氨酸单体的聚合物。聚赖氨酸的衍生物形式是其中一种或多种单体可以被改性(化学改性或其它改性)的赖氨酸单体的聚合物。
在一些实施方案中，该排列分子是不能被蛋白酶水解的分子。这些后面所说的肽衍生物可包括不可水解的骨架变型。
所说连接分子的长度通常不受限制，本发明既可以使用短链连接分子又可以使用长链连接分子。因此，可以有效使用短至三个残基(三个赖氨酸或三个谷氨酰胺)的连接分子。所说连接分子的分子量范围为小于200Da至高于100,000Da，相应残基的数目取决于连接分子的组成。根据实施方案，该连接分子可以具有至少500、至少1000、至少5000、至少10,000、至少25,000、至少50,000、至少75,000、至少100,000或更高的分子量。本领域技术人员将能根据连接分子的分子量以及其组成来确定所说连接分子单体单位的数目。实施例所用的连接分子具有181个赖氨酸残基的平均长度，因此，其具有约23,000的平均分子量。
在一些重要的实施方案中，所说的连接分子是非络合的，如果其是聚赖氨酸的话尤其如此。“非络合的”连接分子指的是未与本发明的透明质酸外的化合物、和/或盐或载体溶液的氨基酸进行连接的那些。在一些重要的实施方案中，非络合的连接分子例如没有与治疗剂如药物或核酸复合。已经报道了聚赖氨酸能与核酸结合形成一种离子复合物。因为聚赖氨酸在中性pH下荷正电荷，所以其倾向于与荷负电的物质如核酸发生离子相互作用。但是，在本发明的一些方面，不打算用该轭合物来传递核酸，因此该类轭合物的连接分子是非络合的。
连接分子如聚赖氨酸可以被维持在非络合形式，例如可以通过控制盐浓度和pH以消除聚赖氨酸和荷负电物质(例如治疗剂如药物或核酸)之间的离子相互作用来将其维持为非络合形式。例如，可以增加阴离子浓度以与荷负电物质竞争与聚赖氨酸进行的离子结合。在其它实施方案中，该轭合物可以以略微高渗的溶液的形式被提供，如其重量渗克分子浓度高于280mOsm。在其它实施方案中，该制剂的重量渗克分子浓度高于290mOsm、高于300mOsm、高于310mOsm、高于320mOsm、高于330mOsm、高于340mOsm、高于350mOsm、或更高。可以用任何盐(包括单价和二价盐)、氨基酸或缓冲剂来调节该溶液的重量渗克分子浓度。
该连接分子还可以以包括其它物质(非限制性地如精氨酸)的非络合形式被提供。在一些实施方案中，这些物质与赖氨酸单体单位竞争与透明质酸的结合，从而防止了该轭合物的透明质酸和聚赖氨酸组分之间形成离子复合物。因此，在一些重要的实施方案中，透明质酸和聚赖氨酸组分彼此之间不是离子络合，而是彼此仅仅在共轭点相接触(例如，其之间为共价键或二者都连接到一种间隔物分子上)。
在另一些实施方案中，因为该轭合物不携带核酸分子，在该制剂中可以包括核酸酶如DNA酶和RNA酶。
重要的是必需有足够数目的转谷氨酰胺酶反应性基团(即，脂族胺或甲酰胺)来通过转谷氨酰胺酶的作用与组织进行反应。因此，不能将所有的转谷氨酰胺酶反应性基团都络合，但是在一些情况中，少至2-3个转谷氨酰胺酶反应性基团就足以进行转谷氨酰胺酶-介导的反应。在一些实施方案中，所说的转谷氨酰胺酶反应性基团可以存在于该聚合物的末端，而在一些其它情况中其可以位于内部。
该轭合物的结构可以根据透明质酸和连接分子而变化，前提是其具有足够数目可获得的氨基或甲酰胺反应性基团(以使其可以作为转谷氨酰胺酶的底物)，和透明质酸可以湿润受影响的表面或组织。
就其最简单的形式而言，该轭合物是透明质酸和连接分子1∶1的轭合物。即，该轭合物将包含彼此直接或间接连接的一条透明质酸链和一条连接分子。
就更复杂的形式而言，该轭合物包含连接到单一连接分子上的数个透明质酸链。透明质酸可以在沿着该连接分子长度的相连部位上被连接到连接分子上，或者其可以以固定或随机长度的分隔间隔被连接。在后一种实施方案中，该轭合物将是一种具有作为其骨架的连接分子和具有作为其接枝物的透明质酸链的接枝共聚物。该连接分子骨架上的透明质酸侧链的长度、数目、和位置将影响需要被给药以赋予治疗益处的轭合物的数量。在一些实施方案中，可以将透明质酸侧链接枝到连接分子中几乎每一个可获得的反应性基团上，前提是必需可以获得足够的转谷氨酰胺酶反应性基团以将该轭合物连接到受影响的机体组织或表面上。
用于将该轭合物连接到受影响的表面上的位于连接分子上的转谷氨酰胺酶反应性基团可以位于所说连接分子的末端，但是不是仅限于位于其末端。因此，在一个实施方案中，该反应性基团可以位于连接分子的中间，透明质酸链在一个或两个侧面连接到其上。
还可以用透明质酸接枝到连接分子上的程度来对该轭合物的结构进行描述。这里所用的接枝比率是表示透明质酸二糖单体的数目与连接分子单体数目的比例。作为实例，分子量为220,000(并包含约549个透明质酸的二糖单位)的透明质酸链的一个链与分子量为23,000(并包含约181个赖氨酸残基)的聚赖氨酸连接分子的轭合相当于约3的接枝比(即，549/181)。可以根据被接枝到连接分子上的透明质酸的数目和长度以及连接分子本身的长度来改变该接枝比。因此，根据该实施方案，接枝比可以从低于0.001到高于10000的范围内变化。在一些重要的实施方案中，该接枝比率为至少0.001、至少0.005、至少0.01、至少0.1、至少0.5、至少1、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少95、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少2500、至少5000、至少7500、和至少10000。应当注意到接枝比率本身不是透明质酸和连接分子之间键合数的指示。在一些优选的实施方案中，透明质酸二糖单位的数目高于连接分子亚单位(例如，赖氨酸残基)的数目，因此，该比例高于1。
同样可以用表达为百分比的每轭合物总重量的透明质酸总重量比例(即透明质酸和连接分子的重量)来对轭合物进行结构性描述。这种重量比同样在低于0.001至99.9％的范围内。在一些重要的实施方案中，该重量比为至少0.005％、至少0.01％、至少0.1％、至少0.5％、至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、和至少99％。在其中透明质酸二糖单体的数目比连接分子单体(例如，赖氨酸残基)的数目多的优选实施方案中，该重量比优选地高于90％。因此，在优选的实施方案中，该重量比高于90％、高于91％、高于92％、高于93％、高于94％、高于95％、高于96％、高于97％、高于98％、高于99％、高于99.5％、和高于99.9％。因此，在一些重要的实施方案中，轭合物中连接分子的重量一般为10％或更低。
该轭合物的分子量还可以根据该轭合物的复合材料而变化。一种具有一个分子量为220,000的透明质酸链和分子量为23,000的连接分子的实例性轭合物具有243,000的分子量。该轭合物的分子量可以在约50,000至高于10,000,000之间变化，优选的范围为75,000至1,000,000，更优选的范围为100,000至500,000，并且更优选的范围为100,000至300,000。
在另一种情况中，可以用透明质酸(重量)与聚赖氨酸(重量)的比例(表示为百分比)来对该轭合物进行描述。
还可以用其电荷比例(即，负电荷与正电荷比)来对该轭合物进行描述。小于1的电荷比表明总体荷正电，而高于1的电荷比表明总体荷负电。在一些重要的实施方案中，该电荷比可以从高于1至高于10的范围内变化。在一些实施方案中，该电荷比可高于1、高于2、高于3、高于4、高于5、高于6、高于7、高于8、高于9、高于10、高于12、或更高。在其它实施方案中，该电荷比的范围为1至10，优选地为2至8，更优选地为3至7，并且更优选地为4至6。在优选的实施方案中，该轭合物在6.5至8的pH范围内总体荷负电。pH高于6.5时，透明质酸将荷负电。在pH高于约8时，赖氨酸残基变为电荷中性，但是整个轭合物将荷负电。对于包含聚-谷氨酰胺的轭合物而言，该轭合物在pH高于6.5时将总是荷负电，这是因为谷氨酰胺残基为中性电荷。
这里所用的轭合物指的是彼此通过任何化学或物理化学方法稳定连接到一起的实体。重要的是该连接的性质应当是其基本不会损害透明质酸的效力或连接分子的底物活性的该类连接。在记住这些参数的情况下，可以使用本领域技术人员公知的任何连接，包括共价或非共价键。优选共价键。该类手段和方法对于本领域普通技术人员而言是众所周知的。
在用聚赖氨酸作为连接分子的实施方案中，透明质酸和聚赖氨酸通过还原性胺化反应被轭合到一起。实施例提供了形成聚赖氨酸和HA轭合物的实验方案。一般而言，透明质酸的还原性末端与聚赖氨酸上的氨基残基偶合从而形成一种希夫氏碱，然后将其还原成亚氨基键。在一种实验性方案中，透明质酸和聚赖氨酸被溶解于一种溶剂如硼酸盐(pH8.5)或磷酸盐(pH8.3)缓冲剂中。向其中加入还原剂如氰基硼氢化钠(NaB3HCN)并使该反应在0至50℃的温度下进行1小时至5天。通过加入有机溶剂如二甲基甲酰胺或二甲基亚砜来对该反应进行控制。其可以通过防止透明质酸和聚赖氨酸之间的离子相互作用来得到增强。可以通过加入盐如氯化钠或氯化钾或者通过增加反应温度来减少该类离子相互作用。
在一些实施方案中，用于形成轭合物的起始材料的摩尔比为0.5∶1至5∶1的聚赖氨酸：透明质酸。在一个重要的实施方案中，聚赖氨酸：透明质酸的起始摩尔比为1.3∶1。这些试剂的摩尔比可给出每个聚赖氨酸轭合较少(例如一个或两个)透明质酸链的轭合物。
在合成反应结束时，可以将该溶液透析以除去未轭合的聚赖氨酸。但是，优选地不除去未轭合的透明质酸，因此，该分离是一种选择性除去未轭合的聚赖氨酸而不是未轭合的透明质酸的操作。例如，如果所说的分离技术是透析，则对透析管的孔径进行选择，从而使其可以允许进行聚赖氨酸(具有例如23,000的MW)的运转而不允许进行透明质酸(具有例如至少100,000的MW)的运转。
在构建轭合物时，其希望通过一种间隔物将该连接分子束缚到透明质酸上。这可以消除例如可能由空间位阻所导致的任何问题，在所说的空间位阻所导致的问题中，转谷氨酰胺酶接近所说连接分子反应性基团的过程受到阻碍。这些间隔物可以是各种分子中的任何分子，优选地是无活性的分子，如直链或甚至支链的饱和或不饱和的C1-C30碳链、磷脂、氨基酸(例如，甘氨酸)等等，其可以是天然存在或合成的。另外的间隔物包括烷基和链烯基碳酸酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、和脲。这些物质都相关并且可以为间隔物如上述C1-C30间隔物增加极性官能度。适宜的间隔物如附录A中所提供的这些物质，其可以通过商业途径获得，例如可得自Pierce Chemical Co。
这里所述的轭合或变型使用常规的化学过程，其是化学领域技术人员众所周知的，因此不够成本发明的一部分。在文献中也已经对使用保护基团和已知联结子如单-和异-双官能联结子进行了描述，在这里不再重复叙述。
因此，本发明的连接不一定是直接连接。可以为本发明的组合物的组分提供官能化基团以促进其连接和/或可以在这些组合物的组分之间插入联结子基团以促进其连接。此外，本发明组合物的组分可以在单一过程中被合成，从而使得这些组分可被看成一种和相同的实体。例如，可以将透明质酸合成为在一个用于通过转谷氨酰胺酶连接多肽的末端包括聚谷氨酰胺。
共价键的特定实例包括这些其中使用双官能交联剂分子的这些物质。这些交联剂分子可以是均-双官能或异-双官能的，其取决于被轭合分子的性质。均-双官能交联剂具有两个相同的反应性基团。异-双官能交联剂被定义为具有两个使得可以连续进行轭合反应的不同的反应性基团。可以通过商业途径获得的各种类型的交联剂与一个或多个下面的基团反应：伯胺、仲胺、巯基(sulphydryls)、羧基、羰基和碳水化合物。胺-特异性交联剂的实例有二(磺基琥珀酰亚氨基)辛二酸酯、二[2-(琥珀酰亚胺氧基羰氧基)乙基]砜、辛二酸二琥珀酰亚胺酯、酒石酸二琥珀酰亚胺酯、己二酸二甲酯-2HCl、di甲基pimelimidate-2 HCl、di甲基suberimidate-2 HCl、和乙二醇二-[琥珀酰亚氨基-[琥珀酸酯]]。与巯基反应的交联剂包括二马来酰亚氨基己烷、1，4-二-[3′-(2′-吡啶基二硫基)-丙酰氨基]]丁烷、1-[对-叠氮基水杨酰氨基]-4-[碘乙酰氨基]丁烷、和N-[4-(对-叠氮基水杨酰氨基)丁基]-3′-[2′-吡啶基二硫基]丙酰胺。优选地与碳水化合物反应的交联剂包括叠氮基苯甲酰基肼。优选地与羧基反应的交联剂包括4-[对-叠氮基水杨酰氨基]丁胺。与胺和巯基反应的异双官能交联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-[2-吡啶基二硫基]丙酸酯、琥珀酰亚氨基[4-碘乙酰基]氨基苯甲酸酯、琥珀酰亚氨基4-[N-马来酰亚氨基甲基]环己烷-1-甲酸酯、间-马来酰亚氨基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、磺基琥珀酰亚氨基6-[3-[2-吡啶基二硫基]丙酰氨基]己酸酯、和磺基琥珀酰亚氨基4-[N-马来酰亚氨基甲基]环己烷-1-甲酸酯。与羧基和胺反应的异双官能交联剂包括1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]-碳二亚胺盐酸盐。与碳水化合物和巯基反应的异双官能交联剂包括4-[N-马来酰亚氨基甲基]-环己烷-1-羧基酰肼·2HCl、4-(4-N-马来酰亚氨基苯基)丁酸酰肼·2HCl、和3-[2-吡啶基二硫基]丙酰基酰肼。该交联剂是二-[β-4-叠氮基水杨酰氨基]乙基]二硫化物和戊二醛。可以在合成核酸的任何核苷酸上加上氨基或硫醇基团从而为双官能交联剂分子提供一种连接点。可以合成混入能共轭试剂的核酸，所说的试剂如Uni-Link氨基改性剂、3’-DMT-C6-胺-ON CPG、氨基改性剂II、N-TFA-C6-氨基改性剂、C6-硫醇改性剂、C6-二硫化物氨基磷酸酯和C6-二硫化物CPG(Clontech，Palo Alto，CA)。
用于将透明质酸轭合到本发明的转谷氨酰胺酶底物上的其它联结子包括US 5,342,770中所述的肽联结子。在US 6,303,555 B1(例如具有4-6个碳原子的羧酸、或乙氧基化的多羟基醇、或聚乙烯吡咯烷酮、或MW 6000-10,000的聚乙二醇)、US 5,952,454(用于将葡萄糖基供体轭合到包含胺的载体上的间隔物)、US 6,361,777B1(氨基硫醇联结子)、US 4,680,338(双官能联结子)、US 5,034,514等等中对其它化学联结子组合物进行了描述。
在一些实施方案中，希望用一种可以在正常生理学条件下裂解或在使用刺激物如光时被特定裂解的键将透明质酸连接到该连接分子上，从而使得该物质可以被释放。在某些实施方案中，透明质酸在其轭合形式下是无活性的，并且仅当其被释放时才有活性。在其它情况中，将从远离其与机体组织的连接点的地方释放透明质酸从而使其发挥活性。在另外一些情况中，将以缓释方式释放透明质酸，从而与应用到皮肤上但是不与其共价结合的透明质酸相比，可以延长透明质酸的释放。易于裂解的键包括易于水解的键，例如，酯键、酰胺键和希夫氏碱-型键。众所周知的是这些键可以被光裂解。在另一些实施方案中，可裂解的键可以是连接分子的单体单位之间的肽键本身。该类键可以被蛋白酶如胰蛋白酶裂解，根据受影响的组织，其可以在各种浓度的溶液中进行应用。
还可以使用非共价轭合的方法。非共价轭合包括疏水性相互作用、离子相互作用、高亲合力的相互作用如生物素-抗生物素蛋白和生物素-抗生物素蛋白链菌素络合作用和其它亲合力的相互作用。在一个实施方案中，将一种分子如抗生物素蛋白连接到连接分子如聚谷氨酰胺上。一旦根据本发明被连接到组织上，这种轭合物将变成用于被连接到生物素分子上的任何物质的通用连接部分。
该连接分子可以是微粒如微球或毫微球的一部分，并且透明质酸可以被包含在微粒中，可以被物理包埋在其中、共价结合到其上或者物理化学地连接到微球上。在优选的实施方案中，所说的微球或毫微球至少在其表面上携带着富含谷氨酰胺、赖氨酸、或谷氨酰胺和赖氨酸的聚合物。在文献中已经对制造微粒的方法进行了描述并且不构成本发明的基础。本发明仅仅在微粒结构本身的聚合物方面与现有技术不同，该聚合物包含或被衍生化成包含谷氨酰胺和/或赖氨酸、或者谷氨酰胺、赖氨酸的聚合物、或者谷氨酰胺和赖氨酸被包含在形成基质的聚合物混合物中，从而使得该类聚合物被包埋在微粒中和/或位于该微粒的表面上。在US 5,075,019、PCT WO9 5/24929、PCT WO94/23738和PCT/US96/11990中可以发现微球和毫微球以及其制造方法的实例，所公开内容引入作为参考。
在本发明的另一个方面，用具有任何数目联结子分子的透明质酸轭合物，包括这里所列举的和现有技术中公知的这些物质来将各种治疗剂传递到机体组织或表面上。在一些重要的实施方案中，所说的联结子是这里所列举的包含脂族胺和甲酰胺的联结子。在本发明的这一方面，用透明质酸作为治疗剂的载体分子，并且可以赋予透明质酸本身治疗益处或者可以不赋予其治疗益处。在US 6,267,957 B1中公开了其它的联结子分子。该专利的全部内容在这里都被引入作为参考。该专利还公开了可以通过透明质酸进行给药的各种治疗剂。可以使用的治疗剂的实例包括肾上腺素能药；肾上腺皮质类固醇；肾上腺皮质抑制剂；醇抑制剂；醛固酮拮抗剂；氨基酸；氨解毒剂；组织代谢剂；兴奋剂；止痛剂；雄激素；麻醉助剂；麻醉剂；减食欲物质；拮抗剂；垂体前叶抑制剂；驱虫药；抗痤疮药；抗肾上腺素能；抗变应性药；抗阿米巴虫药；抗雄激素物质；抗贫血药；抗心绞痛药；抗焦虑药；抗关节炎药；止喘药；抗动脉粥样硬化药；抗菌剂；anticholelithic；抗胆结石药；抗胆碱能药；抗凝剂；anticoccidal；抗惊厥药；抗抑郁剂；治疗糖尿病的药；止泻剂；制尿剂；解毒剂；止吐剂；抗癫痫剂；抗雌激素药；抗纤维蛋白溶解剂；杀真菌剂；治疗青光眼的物质；抗血友病药；抗出血药；抗组胺药；抗高血脂药；抗高脂蛋白血药；抗高血压药；抗低血压药；抗感染药；局部抗感染药；抗炎药；抗角质化剂；抗疟药；抗菌剂；抗偏头痛药；抗有丝分裂药；抗真菌药、止恶心药、抗肿瘤药、抗中性白细胞减少药、抗肥胖药(antiobessional agent)；抗寄生虫剂；抗震颤麻痹药；抗蠕动药、抗肺囊虫药；抗增殖剂；抗前列腺肥大药；抗原生动物剂；止痒剂；安定药；抗风湿剂；抗血吸虫剂；抗皮脂溢剂；抗分泌剂；解痉剂；抗血栓形成药；镇咳剂；抗溃疡药；抗尿石药；抗病毒药；食欲抑制剂；良性前列腺肥大治疗剂；血糖调节剂；骨吸收抑制剂；支气管扩张药；碳酸酐酶抑制剂；心脏抑制药；保心药；强心剂；心血管药；利胆剂；胆碱能药物；胆碱能激动剂；胆碱酯酶灭活剂；抗球虫药；认识助剂；认识增强剂；抑制剂；诊断辅助药；利尿剂；多巴胺能药；杀外寄生虫药；催吐药；酶抑制剂；雌激素；溶纤维蛋白药；荧光剂；氧自由基清除剂；胃肠蠕动效应器；糖皮质激素；促性腺物质；毛发生长刺激剂；止血剂；组胺H2受体拮抗剂；激素；胆固醇降低剂；降血糖药；降血脂药；低血压药；显像剂；免疫剂；免疫调节剂；免疫调节药；免疫促进剂；免疫抑制剂；性无能治疗辅助剂；抑制剂；溶角蛋白剂；LNRH激动剂；肝病治疗剂；黄体溶解素；记忆力佐剂；精神行为增强剂；情绪调节剂；粘液溶解药；粘膜保护剂；散瞳药；鼻粘膜减充血剂；神经肌肉阻滞剂；神经保护剂；NMDA拮抗剂；非激素甾醇衍生物；催产剂；纤维蛋白酶原激活剂；血小板活化因子拮抗剂；血小板聚集抑制剂；中风后和头部损伤后治疗；强化因子；孕激素；前列腺素；前列腺生长抑制剂；prothyrotropin；精神药物；肺面；放射性试剂；调节剂；松弛药；再分配剂；杀芥螨药；硬化剂；镇静剂；镇静剂-安眠剂；选择性腺苷Al拮抗剂；血清素拮抗剂；血清素抑制剂；血清素受体拮抗剂；类固醇；兴奋剂；抑制剂；症状性多发性硬化；增效剂；甲状腺激素；甲状腺抑制剂；拟甲状腺药；镇定药；肌萎缩性侧索硬化的治疗；脑局部出血的治疗；佩吉特氏病的治疗；不稳定的绞痛的治疗；排尿酸药；血管收缩药；血管舒张药；创伤药；伤口愈合药；黄嘌呤氧化酶抑制剂。
正如对本领域技术人员而言显而易见的那样，这些后面所说的其中用透明质酸作为其它治疗剂的载体的轭合物可用于对需要该类治疗的个体进行治疗或预防的方法中。确定将从使用该类物质获益的个体是医学从业者的领域。
本发明的方法可用于治疗这里所述的特定病症或症状或有出现这些病症或症状风险的个体的许多方法中。在患病时，患有该类病症的个体是由医学从业者诊断或患者自我诊断已经确诊的个体。该类诊断可以以个体所经历的症状为基础或者可以以实验室试验为基础。有患病风险的个体是由于环境、行为或基因因素而可能形成该病症的个体。对于患病个体的病症或情况进行治疗，而对有患病风险的个体进行预防。
该化合物可用于治疗或预防许多病症，包括那些特征为干燥的病症。特征为干燥的病症是一种其中个体经历组织或机体组织如眼睛或嘴缺乏水分或润滑的病症。应当清楚的是，特征为干燥的病症可以影响机体的任何区域，既可以是内部区域也可以是外部区域。可以用这里所提供的方法治疗的情况的实例包括干眼、口干燥、干性皮肤(例如，皱纹)、阴道腔干燥等等。该化合物可用于治疗和/或预防以前已经报道过的可以用透明质酸有益进行治疗或预防的任何病症。以前已经对该类病症进行过描述并且其对于一般医学从业者而言也是公知的
可以用这里所述的组合物治疗的皮肤病症包括褥疮、营养不良性溃疡、烧伤、无痛伤、创伤后溃疡、静脉曲张性溃疡和静脉炎后溃疡、放射后坏死、皮肤损害如由单纯疱疹病毒诱导的这些皮肤损害和皮肤移植物。在这些实施方案中，可以用纱布垫、乳膏、喷雾形式将该组合物给药并且其可以包括乳化剂。可包含在局部制剂中的其它物质包括甘露醇、聚乙二醇、油酸、甘油、山梨醇，对-羟甲基苯甲酸酯、石蜡凝胶、和甘氨酸。
可以用本发明的化合物治疗的其它病症包括呼吸病症如肺气肿、慢性支气管炎、哮喘、肺水肿、急性呼吸窘迫综合征、支气管肺发育不良、肺纤维化、和肺不张。对于这些病症而言，该组合物可以被气管内给药，包括通过气雾剂、喷雾器、或滴剂来进行给药。
间质性膀胱炎是可以用本发明的组合物治疗的另一种病症。患有间质性膀胱炎的个体具有诸如尿急和排尿频率增加、可以通过排尿缓解的耻骨弓上性疼痛、关节炎、痉挛性结肠和低度发热之类的症状。该组合物优选地被直接滴注到膀胱和/或相关的解剖学结构中，例如用导管来进行滴注。被滴注的体积可以为5ml至100ml，更优选地为20ml至70ml。还可以使用经腹壁给药。
该化合物还可用于经历关节不适的个体。经历关节不适的个体是关节如膝关节和臂关节出现不适或疼痛的个体。这种不适最常出现在需要进行关节弯曲的活动中，并且伴有该类关节的活动性不足。其常常是关节炎的表现。以这种方式进行治疗的个体包括这些患有关节病症或者有形成关节病症风险的个体，所说的关节病症如骨关节炎、急性或慢性滑膜炎(synoritis)、关节软骨的变性过程、和慢性绒毛性关节炎疾病。这些情况通常伴有的症状包括疼痛和关节功能受损。在这些实施方案中，所说的组合物可以以关节内注射的形式被给药。该类组合物可包含胶原、蛋白多糖、糖胺聚糖、糖蛋白、硫酸灰分、白蛋白、和防腐剂如苯甲酸钠、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯。可以向机体的任何关节进行注射，非限制性地包括心皮、球节、蹄槽、或胫骨关节、跗骨或跗趾骨关节、股胫关节的内侧囊、或股髌骨关节。治疗或预防关节病症的方法特别适用于动物如赛马。
所说的化合物还可用于患有过度凝血的患者或形成血块风险升高的个体、具有不利的心血管情况或有出现不利心血管情况风险的个体。这些个体之前存在血块或者由于环境、行为(例如饮食)或基因因素而倾向于形成血块。形成血块的风险升高是风险高于正常个体群体风险的情况。过度凝血是不适当地发生凝血，其比正常个体群体所经历的凝血更频繁或更严重。通常用静脉内或动脉内医学装置如斯滕特固定模或气囊血管成形术来给个体使用本发明的化合物。可以将所说的化合物涂布到医学装置上或者可以通过推注或连续注射来将其进行给药。因此，这里所提供的组合物可用于预防再狭窄。或者，将任选地与游离透明质酸一起使用的轭合物可用于导向通道、旁路、人工静脉、分流器、以及用于心血管系统的其它生物材料的制备。
在一些实施方案中，以具有另一种治疗剂的治疗制剂形式将组合物用于机体组织或表面上。已知透明质酸可透过组织，因此可用于增加机体组织对另外的制剂的接受性。所治疗的组织可以是正常灌注或由于病理学状态而灌注不足的这些组织。
这里所提供的组合物可用于治疗患有干眼或口干燥的个体，但是其应用不仅限于此。干眼可能是由许多基础情况导致的，所说的基础情况非限制性地包括损害分泌眼泪的(即产生眼泪的)腺体的自身免疫性病症，如类风湿性关节炎、斯耶格伦综合征、和系统性红斑狼疮、以及系统性硬化症和肉样瘤病。这些个体中的许多个体形成眼泪的能力下降。被诊断为患有眼睛(包括角膜和/或结膜)干燥的个体适于用这里所述的治疗方法进行治疗。这些个体通常陈述眼睛感到轻度不适或严重疼痛、视力模糊、沙砾感和/或灼烧感、和瘙痒，并且可能出现角膜溃疡和/或瘢痕化。
本发明还提供了治疗患有口干燥的个体的方法。口(即口腔)干燥可能是由压力、基础性情况(如斯耶格伦综合征和系统性硬化症、分泌唾液的(即产生唾液的)腺体的感染)、使用特定的药物(如抗胆碱能药、利尿剂、抗组胺药、可乐定、左旋多巴、甲基多巴、和三环抗抑郁剂)、或进行放疗所导致的。口干燥的个体通常抱怨吞咽和说话困难和痛苦、味觉受到干扰，并且在一些情况中会出现牙齿腐蚀。由于激素改变，干眼在绝经后的妇女中也很常见。
除缓解干眼和口干燥症状外，本发明的透明质酸轭合物还可用于其中需要在组织或表面上维持一定水平的湿度和水分的其它情况。实例包括眼内手术如白内障的切除、眼内晶状体植入和角膜成形术。
该组合物还可用于缓解其它粘膜组织(例如阴道、直肠、鼻、肛门等等)以及外部组织(例如头发、指甲、嘴唇等等)干燥的症状。
在另一些实施方案中，该轭合物被用于有血小板凝固异常风险的个体，这是因为已经报道了透明质酸可以抑制血小板聚集。该类个体可以是经历侵入性过程如放置斯滕特固定模或气囊血管成形术的这些个体，并且本发明的轭合物可以用这些装置进行给药，但是给药并不仅限于这种形式的给药。
应当清楚的是，所提供的组合物可用于治疗性方法以及预防性方法中。当用于治疗应用时，将用该轭合物来缓解个体已经存在的症状，因此，可以在患者提出出现症状后使用。当用于治疗应用时，将用该化合物来防止正在从事或将从事已知会造成该类症状的活动的个体出现症状或延迟症状的开始。这些活动在干眼的情况中包括例如过度阅读、过度使用计算机、并且甚至是可能长期使用隐形眼镜。
“个体”指的是人或脊椎动物，非限制性地包括狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、灵长目动物例如猴、鱼(水产养殖种类)例如鲑鱼、大鼠、和小鼠。
本发明的组合物以有效量来进行给药。术语“有效量”指的是必需或足以实现所需生理学作用的量。例如，如果对患者的该类症状进行治疗，包含透明质酸的轭合物的有效量是降低或消除干眼症状所必需的数量。如果被治疗的个体是患有或怀疑患有口干燥的个体，则有效量是降低或消除口干燥症状所必需的量。这里所用的术语“治疗”指的是降低或完全消除症状，非限制性地如与干眼或口干燥有关的这些症状。作为实例，如果在治疗后干眼症状的严重程度降低或频率减少或者被完全消除，则在治疗前出现干眼症状的个体将被“治疗”。在这里对与干眼或口干燥有关的症状进行了描述。
结合这里所提供的教导，通过对各种轭合物结构和权重因子如功效、相对生物利用度、患者体重、不利副作用的严重程度和优选的给药模式、以及计划进行的基本不会造成毒性或刺激性的有效的预防或治疗性处理方案进行选择，可以彻底有效地对特定的个体进行治疗。
用于任何特定应用的有效剂量可以根据诸如被治疗的疾病或情况或被缓解的症状、被给药的特定轭合物、个体的大小、或疾病、情况或症状的严重程度之类的因素来进行变化。本领域普通技术人员可以在不必进行试验的情况下根据经验来确定特定轭合物的有效量。
轭合物的有效量还将取决于轭合物的准确性质，非限制性地包括透明质酸与连接分子的比例、以及透明质酸和连接分子的长度或分子量。当以游离形式应用时，已经以0.1％溶液(w/v)(即，1mg/ml)的形式将透明质酸钠给药到眼睛上。但是，考虑到本发明的透明质酸可以通过连接分子被连接到眼睛表面上的能力，其认为本发明制剂中需要较低数量的透明质酸。该剂型每个剂量优选地将效力与0.1％透明质酸溶液相当的轭合物数量进行给药。通常建议该轭合物应被制备为如果应用到眼睛上时每次给药可以传递至少50μg透明质酸，并且如果用于口腔时每次给药可以传递至少1mg透明质酸。用于口部给药的制剂应当比用于眼睛上的这些制剂的浓度更高，这是因为口腔中被治疗的面积更大。
这里所述化合物的个体剂量一般为约0.001mg/天至16,000mg/天，更典型地为约0.05mg/天至8000mg/天，并且最典型地为约0.1mg/天至4000mg/天。在用个体体重进行表述时(假定平均体重为80kg)，典型的剂量范围为约0.00001至200mg/kg/天，更典型地为约0.0006至100mg/kg/天，并且最典型地为约0.001至50mg/kg/天。
同样，被传递轭合物的体积将根据给药部位而变化。如果被传递到眼睛中，则该体积优选地小于2ml、小于1ml、小于0.5ml、小于0.25ml、小于0.1ml、小于0.05ml、小于0.025ml、或更低。如果被传递到口腔中，则该体积可以更大，特别是如果该轭合物是在大体积制剂如漱口剂中被传递时更是如此。或者，如果该轭合物以喷雾剂的形式被传递到口腔中，则该体积将可以是眼睛给药体积的规模。
可以以任何方式将该轭合物给药于个体，但是，优选的方式与被治疗的情况和症状有关。例如，当用于治疗干眼症状时，该轭合物被给药于眼睛。当用来治疗口干燥症状时，该轭合物被给药到口腔中。当被口给药时，该轭合物将被直接传递到口腔中(在一些情况中包括咽喉区域)而不是被传递到胃或胃肠道的其它区域中。其它给药途径非限制性地包括鼻内给药、气管内给药、吸入给药、阴道给药、直肠给药、局部给药、关节内给药、和静脉内给药。
根据病症和给药方式，该化合物将在不同的容器、基质或制剂中被提供。例如，并如这里更详细描述的那样，对用于口部应用而言，该化合物可以以舌下片、橡皮糖、漱口剂、牙膏、糖果、凝胶、薄膜等等形式被给药；对于眼睛应用而言，可以为滴眼管中的滴眼剂、眼睛软膏、眼睛凝胶、眼睛填塞物、隐形眼镜或眼内透镜上的涂层的形式、隐形眼镜储存中的溶液或清洗溶液等等形式；对于局部应用而言，可以为洗剂、软膏、凝胶、乳膏、喷雾、薄织物、药签、擦拭物等等形式；对于关节内给药而言，可以为关节内传递的可注射溶液等等形式；对于血管应用而言，可以为位于医学装置上的涂层、可注射溶液等等形式；对于阴道或直肠应用而言，可以为软膏、塞子、栓剂、粘膜粘着制剂等等形式。
本发明的轭合物可以以各种适于眼睛给药的组合物和物理形式给药于患有干眼的个体。用于眼睛给药的组合物必需可以与眼睛的环境相容，至少在pH、盐组分和浓度方面与之相容。这些组合物不应当刺激眼睛。
可以以各种物理形式给药于眼睛的组合物非限制性地包括液体溶液、眼用软膏或凝胶、或眼睛填塞物如棉拭子。液体溶液方便地在滴眼管的帮助下被给药并且可以在滴眼管瓶中被提供。
滴眼管瓶是一种包括用于从容器中取出液体的滴眼管的容器。其可以是玻璃或塑料的，并且其大小可以根据液体体积以及其保存期的不同而不同。不包含防腐剂如眼用防腐剂的溶液的保存期一般较短，因此，通常被制备成较小体积。因此，在一些重要的实施方案中，该组合物是在包含最多0.5ml体积或5.0ml体积的滴眼管小瓶中被提供的。后面的这些实施方案相当于单次应用或单周应用单位，并且其任选地不包含眼用防腐剂。可以在试剂盒中提供多个该类体积的瓶(例如，用吹-填-封方法制备的小瓶)，所说的试剂盒可任选地包含一种外壳如盒或袋、或衬垫如薄板纸或塑料衬垫。如这里所述的这样，所说的试剂盒可以包含用于说明组合物的应用的使用说明，如此处所概括。
该组合物还可以在常用于眼睛护理并且可以通过商业途径获得的溶液中被提供。例如，可以将该组合物与隐形眼镜溶液，如隐形眼镜清洁液、隐形眼镜储存液、或用于隐形眼镜佩戴者的滴眼剂混合在一起。隐形眼镜溶液在现有技术中是已知的并且通常指的是用于储存或清洁隐形眼镜的溶液、或隐形眼镜佩戴者所用的溶液如滴眼剂或人工泪液制剂。当一起被提供给隐形眼镜佩戴者时，该组合物可以降低角膜和隐形眼镜之间的摩擦。该组合物还可以以薄膜的形式被提供，并且该类膜可以被涂布到隐形眼镜上，例如，可以由隐形眼镜制造商将其涂布到隐形眼镜上，以在没有干眼或眼睛刺激的情况下延长隐形眼镜的使用。同样，该组合物可以被包含在隐形眼镜被商品化地提供在其中的溶液中。
该组合物同样可以被制备成眼用凝胶或软膏的形式，如现有技术中公知的这些形式。
用于眼睛给药的组合物可以包含在眼用溶液、凝胶等等中已经描述过或者已知存在于眼泪中的其它物质。一个实例是已知存在于眼泪中的溶菌酶。
在一些涉及眼睛给药的实施方案中，可以对该组合物进行处理以消除颜色(从而使得该溶液澄清无色)。或者，希望为该组合物增加颜色或改变其颜色，特别是如果用颜色来确认该组合物是传递到眼睛的组合物时更是如此。
在一些实施方案中，眼用组合物不包含防腐剂，而是过滤灭菌(例如，用0.22μm滤器过滤)并将其以单次应用量进行包装。因此，在一些情况中，本发明的组合物可以被制备和/或包装成使用量的单位。使用量的单位是一次给药或一天给药、一周给药、一个月给药或一段更长时间给药所需的数量。使用数量的单位优选地是一次给药或最多几天给药(但是小于一周)所需的数量。用单位使用包装来防止溶液的污染，这是因为其减少了个体必需接触溶液的次数。
本发明的轭合物同样可以以用于口部和颊给药的各种组合物和物理形式被给药于患有口干燥的个体。术语“口部”和“颊”在这里可以互换使用，指的是口部，包括嘴唇、牙齿、口腔、舌头、腭、和咽喉上部区域。用于口部或颊给药的组合物必需与口腔的环境相容。与用于传递到眼睛的制剂相比，对口部或颊传递制剂的要求通常较低。但是，味道和气味方面的考虑对于口或颊制剂而言很重要，而且对于眼用制剂而言可能是最不重要的。
在优选的实施方案中，不管其物理形式如何，该组合物被传递和保留在口腔中。因此，该组合物优选地以可以留在口中不被摄取到胃肠道中的形式如锭剂、喷雾、橡皮糖、舌下片、漱口剂、口部凝胶、牙膏、粘膜粘附贴剂等等的形式被提供。
当口部传递时，该轭合物与口部粘膜(包括舌下粘膜)进行接触。“粘膜”指的是粘液性膜。这里所用的“口部粘膜”指的是嘴和上咽喉区域的粘膜。“舌下”指的是舌头下面的口腔区域。
一种适宜的口用形式是舌下片。舌下片将轭合物传递到舌下粘膜上。这里所用的“片剂”指的是通过压缩或模塑制备的药物剂型。舌下片是用于放置在舌下的扁平小片，并被设计成可以迅速，几乎瞬时崩解并将轭合物释放到舌下粘膜上。术语“崩解”指的是破碎开。本发明的舌下片优选地在5分钟内，并且更优选地在2分钟的时间内崩解释放轭合物。然后所释放的轭合物可以通过口腔中存在的内源性转谷氨酰胺酶的作用结合到口部粘膜上。
口部传递制剂的其它形式包括锭剂、橡皮糖和可溶解的薄膜。
口用制剂还可以以液体形式存在。该液体可以以喷雾或滴剂的形式被给药到包括所选择的区域如舌下区域的整个口腔内。可以用适于口给药或舌下给药的标准喷雾瓶或滴瓶将本发明的喷雾剂和滴剂进行给药。该液体制剂优选地被盛放在喷雾瓶、细雾化瓶、或气雾剂容器中以使得易于进行口腔给药。可以将液体制剂盛放在被定刻度的滴瓶或喷雾瓶中以将预定数量的组合物传递到口腔中。具有定刻度的喷雾器或滴瓶在现有技术中是已知的。
本发明的轭合物还可以被制备成口部凝胶。作为一个实例，该轭合物可以在在一种粘膜粘附的非水溶性凝胶中被给药。该凝胶是由至少一种水不溶性的烷基纤维素或羟基烷基纤维素、挥发性非水性溶剂、和轭合物制得的。虽然可以加入生物粘附性聚合物，但其并不是必需的。一旦该凝胶与粘膜表面相接触，主要由于挥发性或非水性溶剂的蒸发而形成一种粘性膜。该凝胶保留在粘膜表面上的能力与其薄膜稠度和所存在的不溶性组分有关。可以通过喷雾、浸渍、或用手指或药签直接敷用来将该凝胶应用到粘膜表面。
本发明的轭合物还可以被制备成漱口剂或牙膏形式。
在需要的情况中，传递制剂可以包含矫味剂、着色剂和/或香料。矫味剂、着色剂和/或香料有助于改善使用者对该组合物的接受性。
矫味剂是为一种没有味道的制剂提供味道的物质、增强之前存在味道但是味道较弱的制剂的味道的物质、或掩盖之前存在的令人不愉快的味道或将其变为更适口的味道的物质。矫味剂在现有技术中是已知的并且可以从许多供应商那里通过商业途径获得，所说的供应商如Warner-Jenkinson Company，Inc。矫味剂的实例包括薄荷提取物、叶粉或油；留兰香提取物、叶粉或油；冬青油；香草提取物；欧芹；牛至油；月桂叶油；丁香油；鼠尾草油；黄樟油；柠檬油；橙油；茴香油；苯甲醛；杏仁油；樟脑；雪松叶油；马郁兰油；cintronella oil；熏衣草油；芥子油；松油；松针油；迷迭香油；百里香油；肉桂叶油；薄荷醇；香芹酮；茴香脑；丁香酚；水杨酸甲酯；柠檬烯；繖花烃；正-癸醇；香茅醇；α-松油醇；乙酸甲酯；醋酸香茅酯；甲基丁香酚；桉树脑；芫荽醇；eyktl linalool；香草醛；百里酚；pellira oil；冬绿油；桉树油；咖啡因、酒石酸氢钾、乳酸、苹果酸、谷氨酸单钠、亚硝酸盐、山梨醇等等。在该制剂用于颊或口部给药的情况中，最希望使用矫味剂。矫味剂还包括甜味剂(即，增甜剂)如阿司帕坦、乙酰舒泛、糖精、葡萄糖、果糖、环己基氨基磺酸钠、斯替维苷、新橙皮苷双氢查耳酮、甘草甜素、紫苏糖、索马汀、天冬氨酰基苯基丙氨酸甲酯、对-甲氧基肉桂醛等等。
同样，着色剂是为没有颜色的制剂提供颜色的物质、增强之前存在颜色但是颜色较弱的制剂的颜色的物质、或掩盖或改变之前存在但是可能令人不愉快的颜色的物质。着色剂还包括可以将一种颜色的制剂转化成无色制剂的物质。着色剂在现有技术中是已知的并且可以购自矫味剂的供应商如上面所列的这些供应商。眼用以及口用制剂都希望使用着色剂。适宜着色剂的实例是二氧化钛。适宜的口用着色剂包括FD&C蓝#1、FD&C黄#5和#10、FD&C红#3和#40；焦糖色或粉末(#05439)、巧克力色光(#05349)、绿色淀混合物(#09236)、kowet二氧化钛(#03970)、黄色液体色(#00403)、和亚硝酸盐。
香料是为无嗅制剂提供气味(即，香味)的物质、增强之前存在香味但是香味弱的制剂的香味的物质、或掩盖之前存在但是可能令人不愉快的香味的制剂的香味的物质。香料还包括可以将有味的制剂转化成没有气味的制剂的物质。香料在现有技术中是已知的并且可以购自矫味剂供应商如上面所列的这些供应商那里。香料的实例包括天然香料如草花、草药、树花或植物提取物，和人造香料。眼用以及口用制剂都希望使用香料。
适宜舌下片的实例是根据下面的配方来进行制备的：透明质酸和聚赖氨酸轭合物(制备成为每片1mg轭合物)；甘露醇USP(DC级)31.5mg；微晶纤维素40.35mg；羟乙酸淀粉钠NF 2.6mg；糖精钠，USP 0.5mg；香料S.D.薄荷，FCC 0.75mg；magnasweet MM 188M 0.5mg；香草香料#8000.2mg；D&C黄#10，铝色淀0.2mg；硬脂酸镁，NF 0.5mg；aerosil 2000.4mg。
适宜舌下片的另一个实例是按照下面的配方制备的：透明质酸和聚赖氨酸轭合物(被制备成每片1mg轭合物)；甘露醇30.30mg；微晶纤维素(FMC)4.00 34.00mg；羟乙酸淀粉钠(EXPLS TABMendell)2.60；硬脂酸镁NF 0.50mg；糖精钠(Mallinckrodt)2.00mg；阿司帕坦(Neutrasweet)4.00mg；薄荷(Virginia Dare HF82 SD#517)0.40mg；香草(Virginia Dare800 NAT)0.30mg；MAFCO magnasweet 188M 0.25mg；prosweet #560(MM54)0.75mg；巧克力香料#682 2.00mg；D&C黄#10。
本领域技术人员将意识到易于对这些制剂进行变化。应当清楚地是，可以向本发明的制剂中加入其它组分，包括其本身对于个体而言具有治疗作用或是有益的组分。例如，本发明的口用制剂可以包含维生素或氟化物，并且如现有技术中公知的那样，眼用制剂可以包含治疗剂如治疗青光眼的药。
在上面的制剂中，甘露醇、糖精钠、薄荷、magnasweet和香草是能掩盖所说轭合物味道或者至少提供美好的味道的矫味剂。删除该矫味剂不会牺牲功效。但是，患者的顺从性可能会更差。可以改变矫味剂以适应个体需要和味觉。用D&C黄作为着色剂。可以容易地删除着色剂或代之以其它染料。硬脂酸镁和Aerosil-200是用于将片剂从压片设备中释放出来的润滑剂。根据制造过程，可以对这些成分进行替代或将其完全取消。微晶纤维素、甘露醇和羟乙酸淀粉钠提供了片核。纤维素和淀粉促进了核成分的结合并且促进了存在水分时片剂的崩解。可以改变这些成分的相对数量以调整片剂的崩解。
对所有组分数量进行称重，并将除甘露醇和Avicel之外的所有成分都用80目不锈钢筛筛分。将这些物质在大小适宜的聚乙烯袋中混合约5分钟，然后将其转移到适宜的混合器，如PK混合器中。将所需数量的甘露醇和Avicel用40目不锈钢筛筛分并将其加入到该具有其它成分的PK混合器中。将该混合物在该PK混合器中混合10分钟，然后将其卸载。对该混合物样品的效能和其它决定品质的标准进行检查。在叩击100次的基础上用堆密度装置在该混合物上测量堆密度。用指定的冲进行压片，将该混合物压缩成片重为80mg的片剂。
通过将一片片剂放置在舌下来将该片剂进行给药。使该片剂崩解并释放然后会附着在口部粘膜上的包含透明质酸的轭合物。
可以用蒸馏灭菌来制备口用溶液，其可以根据下面的配方来进行制备：透明质酸和聚赖氨酸轭合物(被制备成每次给药提供1mg/ml轭合物)；氯化钠0.9％；和苯扎氯铵0.1至0.2％。该制剂代表了可以通过滴剂、或以细烟雾形式被给药的口用溶液，但是其并不限于其该给药途径。本领域技术人员将容易地意识到易于对该制剂进行变化。
在上面的配方中，用氯化钠来使该溶液等渗。对于使用者而言，该类溶液更舒服；但是，如果需要的话，可以不使用氯化钠。还是在上面的配方中，用苯扎氯铵作为防腐剂。
但是，在某些实施方案中，优选地使用略微高渗例如高于280mOsm的配方，以使该轭合物本身或与其它荷电化合物一起保持非络合形式。在这里对这些实施方案进行了详细描述。
还可以用粘膜粘附装置或系统来完成口服给药。这种类型的优选系统是这些在应用后可以自然侵蚀的系统。适宜的可生物侵蚀的粘膜粘附装置或系统的一个实例是BEMATM，其可以被制备成凝胶、盘或薄膜并且可以被用于任何粘膜表面上。可生物侵蚀的粘膜粘附装置是使得可以将活性物质传递到粘膜表面如口或阴道粘膜上的以聚合物为基础的系统。可生物侵蚀的粘膜粘附装置一般包含一种可以采取许多形式的膜。在一个优选的实施方案中，该可生物侵蚀的粘膜粘附装置是一种半柔软的小盘形式。在形成后，可以将可生物侵蚀的粘膜粘附装置如BEMATM盘用轭合物浸渗。将这些装置粘附在粘膜表面，如嘴、阴道、直肠、或肛门的粘膜表面上。因为该膜是生物侵蚀性的，所以其中所包含的轭合物被释放出来并附着在邻近的粘膜上。因为该盘基本溶解于粘膜表面的水分中，所以不需要除去该盘。可生物侵蚀的粘膜粘附装置的一个优点是将释放到周围的组织或腔中而不粘附到粘膜上的轭合物最小化。一般而言，该膜(例如盘形式)仅有一侧粘附在粘膜表面上。对于应用到阴道或肛门的应用而言，其建议将该装置(例如盘)卷起，然后将其插入到所说的腔中，特别注意该装置粘性侧的位置。
可以特定地合成该可生物侵蚀的粘膜粘附装置以控制该装置中轭合物的保留时间、生物侵蚀动力学(并从而控制活性物质的释放时间和速率)、该装置的味道(特别适于口服给药的情况)、以及形状和盘的厚度。
可生物侵蚀的粘膜粘附系统和装置可以由AtrixLaboratories(Fort Collins，Colorado)，Epic Therapeutics，Inc.，Takeda Chemical Industries.Ltd.，ALZA Corp.，和Alkermes ControlTherapeutics，Inc.通过商业途径获得。可以参考US 5,650,173；5,656,297；5,679,377；5,800,832；5,888,533；5,955,097；5,962,006；6,103,266；6,110,503；6,156,331；6,159,498；6,261,584；6,265,389；6,267,981；6,268,053；6,275,728；和6,290,984等等。
该轭合物可为该装置的0.001至30重量％并且更优选地为0.005至20重量％之间。在该BEMATM盘中还可以存在其它组分，包括增塑剂、矫味剂(口服应用优选)、香料(例如香料)、着色剂、和防腐剂。这些后面的组分可以加入到该盘粘性层和非粘性层的任何一种中或者二者中都加入。
该盘可以采取各种形状或大小。该盘的厚度可以为0.05mm至1mm，或0.1mm至5mm，胶粘层或非胶粘层中的任何一种占总厚度的10至90％。如这里所述的这样，可以用任何数目的适宜溶剂或溶剂组合对该轭合物进行制备以将其装载到BEMATM盘上，所说的溶剂和溶剂组合非限制性地包括单独使用或组合使用的水、甲醇、乙醇、或低级烷基醇如异丙醇。
可以用任何数目公知的现有技术来完成盘的制备，所说的现有技术非限制性地包括膜浸渍、膜涂布、薄膜铸塑、自旋涂布(spin coating)、或喷雾干燥。该盘的两层可以一起形成或者可以分别形成然后使之彼此接触。该盘可以被成形成椭圆形、正方形、和矩形，但是并不仅限于这些形式。
本发明的组合物可以在可药用载体中被给药，所说的可药用载体通常包含可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、可相容的载体、助剂、和任选的其它治疗剂。术语“可药用的载体”指的是一种或多种适于给药于个体的可相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。术语“载体”表示天然或合成的有机和/或无机成分，其可结合活性成分以有助于个体应用。该药物组合物的组分还能以其中没有将会损害所需的药学功效的相互作用的方式与本发明的轭合物和组合物混合以及彼此混合。可药用的载体在现有技术中是已知的。
该载体的形式将随着给药部位的不同而不同。但是，该载体必需适用于转谷氨酰胺酶活性。虽然转谷氨酰胺酶倾向于在微碱性pH(例如6.5至9的pH)环境下发挥功效，但是特别是对于眼睛给药而言，这一点可能不合适。因此，必需通过增加盐浓度来抵销转谷氨酰胺酶的这种pH依赖性。还必需确保透明质酸和连接分子不会彼此离子复合至使得连接分子难以接近转谷氨酰胺酶和/或使透明质酸不能发挥增湿剂功效的程度。在最大转谷氨酰胺酶活性、透明质酸和连接分子之间的最小离子相互作用、以及受影响表面或组织最低刺激的基础上来确定pH和盐浓度。
与转谷氨酰胺酶活性相容的适宜防腐剂包括kathon和尼泊金甲酯。与转谷氨酰胺酶活性相容的适宜去污剂和/或表面活性剂包括hampeneled、吐温20、chemophor RH-40、和DC190。与转谷氨酰胺酶活性相容的适宜湿润剂包括丙二醇、丁二醇、和glucacam E-20。应当避免的防腐剂包括glydant、Dowicil 200、BTC 2125M、和碘代乙酰胺。应当避免的去污剂和/或表面活性剂包括Bioterge AS-40、CTAB、monomate CPA40、和SDS。
透明质酸以及其它被给药的化合物可以以本身的形式(净品)或其可药用盐的形式被给药。当用于药品时，该盐应当是可药用的，但是可以方便地用不可药用的盐来制备其可药用的盐。该类盐非限制性地包括这些由下面的酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、对-甲苯磺酸、酒石酸、枸橼酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸、和苯磺酸。该类盐还可以被制备成碱金属盐或碱土金属盐，如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。
适宜的缓冲剂包括：醋酸和盐(1-2％w/v)；枸橼酸和盐(1-3％w/v)；硼酸和盐(0.5-2.5％w/v)；以及磷酸和盐(0.8-2％w/v)。适宜的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)；氯丁醇(0.3-0.9％w/v)；尼泊金酯类(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。
该药物组合物还可以包含适宜的固体或胶化相载体或赋形剂。该类载体或赋形剂的实例非限制性地包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶、和聚合物如聚乙二醇。
适宜的液体或固态药物制剂形式有，例如，用于吸入的水溶液或生理盐水溶液、微囊化、encochleated、被涂布到极微小金颗粒上、被包含在脂质体中、被喷洒、气雾剂、用于植入到皮肤中的丸剂、或被干燥到尖锐的物体上以擦刻到皮肤中的物质。该药物组合物还包括颗粒、粉末、片剂、包衣片、(微)胶囊、栓剂、糖浆、乳剂、混悬液、乳膏、滴剂或具有活性化合物的拖延释放的制剂，在这些制剂中通常使用上述赋形剂和添加剂和/或辅助剂如崩解剂、粘合剂、包衣剂、膨胀剂、润滑剂、矫味剂、增甜剂或增溶剂。该药物组合物适用于各种药物传递系统。对于用于药物传递的本发明方法的综述可参见Langer，Science 249：1527-1533，1990，其在这里被引入作为参考。
该组合物可以方便地存在于单位剂型中并且可以用药学现有技术中任何众所周知的方法来进行制备。所有的方法都包括将化合物与组成一种或多种配合剂的载体放到一起的步骤。一般而言，该组合物可以通过将该化合物与液体载体、分割得很细的固体载体、或液体载体和分割得很细的固体载体均匀仔细进行混合，然后，如果需要的话将其成形成产品来进行制备。液体剂量单位有小瓶或安瓿。固体剂量单位有片剂、胶囊、膜和栓剂。
重要地是，该载体必需适用于其所接触的机体组织或表面。正如本领域普通技术人员公知的那样，适用于眼睛给药的载体需要对眼睛的刺激性极小，并且优选地对眼睛没有刺激性。眼睛或眼用制剂在药学现有技术中是公知的，并且本领域技术人员可以参考 Remington′s Pharmaceuticals来作为该类载体组成的指导。
眼用制剂可以采取液体形式，如溶液、乳剂、分散体形式，和半固体形式如凝胶和软膏。
眼用制剂可以包含或不包含眼用防腐剂。眼用防腐剂在现有技术中是已知的。因为细菌感染是给药于眼睛的物质的最常见的副作用，所以该类防腐剂一般是抗生素。眼用防腐剂的实例包括有机汞制剂(例如，硝酸苯汞、醋酸苯汞、硼酸苯汞、硫柳汞(Merthiolate，Lilly))；季铵化合物(例如，苯扎氯铵)、苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓、聚季鎓-1(POLYQUAD))；对羟基苯甲酸酯；和被取代的醇以及苯酚类物质(例如，氯丁醇、氯丁醇/苯乙醇)。其它适宜的防腐剂包括尼泊金甲酯和尼泊金丙酯。
如现有技术中公知的那样，还可以通过过滤或加热对这里所提供的制剂进行灭菌。
眼用制剂还可包含等渗剂、缓冲剂、防腐剂(如上所述)、稀释剂、稳定剂、螯合剂、增稠剂等等。等渗剂的实例包括氯化钠、硼酸、枸橼酸钠等等。缓冲剂的实例包括硼酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂等等。眼用制剂的pH应被维持在5-8的范围内。稀释剂的实例包括蒸馏水或无菌水或生理盐水(对于水性制剂而言)、和植物油、液体石蜡、矿物油、丙二醇、和对-辛基十二烷醇(对于非水性制剂而言)。稳定剂的实例包括亚硫酸钠和丙二醇。适宜螯合剂的一个实例是EDTA钠。增稠剂的实例包括甘油、羧甲基纤维素、和羧乙烯基聚合物。
可以包含在眼用制剂中的其它组分包括山梨酸、磷酸二氢钠、硼酸钠、氢氧化钠、氯化钾、氯化钙、甘油、溶菌酶等等。
对于口部给药而言，该类载体使得本发明的化合物可以被制备成舌下或颊吸收片、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、膜、糖浆、膏剂、混悬液等等。口部制剂还包括牙膏、粉末、液体牙膏、托牙洗剂、漱口剂、托牙洗剂、口香糖、糖果、和其它食品。用于口部应用的药物制剂可以以固体赋形剂的形式获得，任选地将所得的混合物进行研磨，如果需要的话，然后在加入适宜的助剂后对颗粒混合物进行加工，得到片剂或糖锭剂核。适宜的赋形剂特别是填充剂如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、或山梨醇；纤维素制剂，例如，玉米淀粉、小麦淀粉、稻谷淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要的话，可以加入崩解剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐如藻酸钠。该口部制剂还任选地在盐水或缓冲液中进行制备以中和内部的酸性情况，但是当组合物在口腔中被吸收时这一点的关键性没有当其在胃肠道时被吸收那么关键。可以为糖锭剂核提供适宜的包衣。为此，可以使用浓的糖溶液，所说的溶液可以任选地包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛、漆溶液、以及适宜的有机溶剂或溶剂混合物。可以向该片剂或糖锭剂包衣中加入染料或颜料以标明或描绘活性化合物剂量的不同组合。
口用的药物制剂包括由明胶制成的推入-配合的胶囊以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封的软胶囊。该推入-配合的胶囊可以包含与填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉、和/或润滑剂如滑石粉或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合在一起的活性成分。在软胶囊的情况中，可以将活性化合物溶解或混悬于适宜的液体，如脂肪油、液体石蜡、或液体聚乙二醇中。此外，还可以加入稳定剂。还可以使用制备成用于口部给药的微球。在现有技术中已经对该类微球进行了明确定义。用于口部给药的所有制剂都应是适于该类给药的剂量。对于颊给药而言，该组合物可以采取用常规方式制备的片剂或锭剂形式。
适用于口部制剂的防腐剂如抗菌剂包括百里酚、薄荷醇、tricrosan、4-己基间苯二酚、苯酚、桉树脑、苯甲酸、苯甲酰过氧化物、尼泊金丁酯、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、水杨酰胺等等。
用于口部制剂如牙膏等等的增稠剂包括羧基乙烯基聚合物、角叉菜胶、羟乙基纤维素、天然树胶如刺梧桐树胶、黄原胶、阿拉伯胶、黄蓍胶等等。
口部制剂还包含湿润剂，所说的润湿剂非限制性地如甘油、山梨醇、木糖醇、聚乙二醇、丙二醇等等。
如果所说的制剂是牙膏或牙齿清洁剂，则其还可包含摩擦剂如硅酸盐如干凝胶、水凝胶、气凝胶、碳酸钙或碳酸镁、磷酸钙、氧化铝及其水合物、硅酸铝盐、硅酸镁和锆等等。这些制剂还可以包含氟化物，和抗结石剂如锌盐、碱金属焦磷酸盐等等。
对于通过吸入给药的制剂而言，本发明所用的化合物可以方便地以气溶胶喷雾剂的形式在使用适宜的推进剂的情况下由加压包装或喷雾器进行给药，所说的推进剂例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体。在加压气雾剂的情况中，可以通过提供一种用于传递计量数量的阀来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的例如明胶胶囊和药筒可以被制备成包含化合物和适宜粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。被给药到鼻腔中的化合物还可以被制备成凝胶或滴鼻剂。
对于局部给药而言，该化合物可以以适于外表面的任何标准制剂的形式被提供。例如，如果希望将化合物应用于皮肤，则其可以以软膏、洗剂、喷雾、凝胶、薄织物、擦拭物(例如用于处理尿布疹)等等的形式被提供。对于应用到嘴唇的应用而言，该化合物可以以唇香脂或唇膏的形式被提供。作为另一个实例，如果该化合物用于头发，则其可以以喷雾、香波、头发固定剂如喷发剂、凝胶或摩丝等等的形式被提供。对于应用到指甲上的应用而言，该化合物可以以指甲抛光剂或其它指甲护理产品的形式被提供。
虽然并不优选，但是在一些情况中，如果制备的目的是为了进行全身给药，则该化合物可以被全身给药。可以通过推注或连续注射来进行胃肠外给药。注射用制剂可以以单位剂型，例如位于安瓿或具有所加入的防腐剂的多剂量容器中的形式存在。该组合物可以采取诸如位于油性或水性制剂中的混悬液、溶液或乳剂之类的形式，并且可以包含制备物质如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于胃肠外给药的药物制剂包括水溶性形式活性化合物的水溶液。此外，活性化合物的混悬液可以被制备为适宜的油性注射混悬液。适宜的亲脂性溶剂或基质包括脂肪油如芝麻油或合成的脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯、或脂质体。水性注射混悬液可包含能增加混悬液粘度的物质如羧甲基纤维素钠、山梨醇、或葡聚糖。该混悬液还可任选地包含适宜的稳定剂或可增加化合物的溶解度从而使得可以制备高浓度溶液的物质。或者，该活性化合物可以为在使用前用适宜基质如无菌无热源的水重组的粉末形式。
该化合物可以被制备为直肠或阴道组合物如栓剂(包括塞子)或保留灌肠剂，例如包含常规栓剂基质如可可豆脂或其它甘油酯的制剂。还可以使用阴道灌洗制剂。还可以用粘膜粘附膜如这里所详细描述的这些物质来进行粘膜给药。在一些涉及阴道给药的实施方案中，其希望提供位于可以暂时增加阴道环境pH的基质中的组合物，暂时增加阴道环境的pH是为了促进轭合物通过阴道转谷氨酰胺酶连接到阴道粘膜上的过程。这种pH的增加不需要长期持续，但是希望其仅长至足以将有效量的轭合物连接到所说的组织上。作为一个实例，可以通过使用可以提供6.5至9的局部pH的粘膜粘附盘、栓剂、或灌洗溶液来控制pH。
除之前所描述的制剂外，该化合物还可以被制备成储库制剂。可以用适宜的聚合物或疏水性物质(例如在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂来制备该类长期起作用的制剂，或者可以将其制备为微溶性衍生物例如微溶的盐的形式。
可以用缓释装置将本发明的组合物进行给药，所说的缓释装置例如可生物侵蚀的粘膜粘附系统，如这里所述的这些系统以及现有技术中众所周知的这些系统。
其它传递系统包括定时释放、延迟释放或缓释传递系统。该类系统可以避免化合物的重复给药、增加个体和医师的方便性。可以获得许多类型的释放传递系统，并且这些系统对于本领域普通技术人员而言是公知的。其包括以聚合物为基质的系统如聚(丙交酯-乙交酯)、草酸酯共聚物(copolyoxalates)、聚己内酯、聚酰胺酯(polyesteramides)、聚原酸酯、聚羟基丁酸、和聚酐类。
在例如US 5,075,109中对包含药物的上述聚合物的微囊进行了描述。传递系统还包括非聚合物系统，其有：包括甾醇如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或天然脂肪如单-、二-、和三-甘油酯的液体；水凝胶释放系统；sylastic系统；肽基础的系统；蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片；部分熔凝的植入物等等。特定的实例非限制性地包括：(a)侵蚀系统，本发明的形式以一种位于基质内的形式被包含在其中如US4,452,775、4,675,189、和5,736,152所述的这些形式，和(b)扩散系统，其中活性组分可以以控释速率从聚合物散布出来，如可参见US3,854,480、5,133,974和5,407,686的描述。此外，可以使用以泵为基础的硬体传递系统，其中的一些适于植入。
缓释组合物可以以例如凝胶、软膏、乳膏、或贴剂(例如经皮贴剂或粘膜贴剂，如BEMATM盘)的形式局部应用。作为一个实例，可以将可生物侵蚀的缓释颗粒单独应用到体表，或者可以将其在软膏、凝胶或乳膏中应用到体表。局部给药包括给药于皮肤表面和粘膜表面。可以通过唇膏、唇护理物例如唇香脂、唇疱疹软膏；防晒软膏；口部凝胶如用于口疮(例如辐射或化疗诱导的口疮)的那些凝胶；漱口剂；牙膏；吸入剂；表面贴剂等等形式来完成向粘膜表面的传递。
或者，其可以被植入。在优选的实施方案中，所说的缓释装置是可生物侵蚀的或可生物降解的。在其它优选的实施方案中，该缓释装置以本发明可生物侵蚀的粘膜粘附装置(例如BEMATM)的优选形式被粘附在其所应用的表面(例如，皮肤或粘膜)上。现有技术同样具有该类装置。
根据一些方面，本发明的组合物可以以试剂盒的形式被提供。正如这里所用的这样，当该组合物在试剂盒中被提供时，有意的将该组合物包装或包含在第一个容器(例如瓶)中，然后将该容器再包装在第二个容器(如箱、卡纸盒、或袋)中。在任何一种情况中，希望都包括该组合物的使用说明。该类说明可以被直接提供在第一个容器(即，直接收藏该组合物的容器)的外表面标签上，或可以位于第二个容器(即收藏第一个容器的容器)的外表面标签上。或者，该使用说明可以独立于任何一个容器地被提供，如例如可以在位于第二个容器中的独立的纸张上被提供。该使用说明将非限制性地包含诸如单剂量传递的数量、对于给定的间隔而言不能超过的最大数量(例如最大日剂量)、给药方法和给药部位、被治疗的个体以及不能用该制剂治疗的个体、禁忌症、以及该制剂的活性和无活性成分之类的信息。
下面的实施例是为了进行说明而不是要对本发明的范围进行限制。
                           实施例
实施例1：通过还原性胺化进行的聚(L-赖氨酸)与透明质酸的轭合：
简介：
聚赖氨酸(PLL)与透明质酸(HA)的共轭是以透明质酸末端糖残基的醛基与聚赖氨酸的氨基形成希夫氏碱的能力为基础的。所形成的希夫氏碱不稳定并且易于通过水解而被反转。可以用许多还原剂来将希夫氏碱转化成稳定的仲胺。氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydrate)可以最好地促进该还原反应，这是因为这种试剂对希夫氏碱的反应性高而对醛基的反应性低。
Figure A0381778100611
流程图1.通过还原性胺化进行的聚(L-赖氨酸)透明质酸轭合物的合成。
材料和方法：
钠盐形式的粘均分子量为220,000的透明质酸购自LifecoreBiomedical(Chaska，MN)。分子量为15,000-30,000和取代度为每摩尔赖氨酸单体0.003-0.01摩尔FITC的FITC标记的聚-L-赖氨酸(即，PLL-FITC)购自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。氰基硼氢化钠(NaBH3CN)得自Aldrich(Milwaukee，WI)。
如流程图1所示的那样，通过用NaBH3CN作为还原剂的还原性胺化将PLL与HA轭合。将HA(100mg)和PLL(10mg)溶解于15ml包含1MNaCl的硼酸钠缓冲剂中(0.1M，pH8.5)。HA的浓度为6mg/ml，而PLL的浓度在0.6至2.4mg/ml之间变化。以24mM的浓度(约高于HA还原性末端1000摩尔的数量)向该反应中加入氰基硼氢化钠。将反应混合物在恒定搅拌的情况下在40℃下进行培养，在将试剂混合3天和6天后，立即从该反应中取出等分试样。将这些等分试样用磷酸盐缓冲剂稀释至3mg/ml的HA浓度和0.3mg/ml的PLL浓度，并且用凝胶渗透色谱法(GPC)对其进行分析。阴性对照实验是在相同条件下进行的，只是不向该反应中加入氰基硼氢化钠。在反应6天(实验)和3天(对照)后采集终产物，用Spectra/Por 7膜(分子量筛截为50,000)，用0.5M NaCl进行透析以除去未反应的氰基硼氢化钠。对于在低pH下进行的实验而言，将样品用醋酸缓冲剂溶液(50mM醋酸，0.2M Na2SO4)稀释至pH3.5，将其储存一天，然后用凝胶渗透色谱法(GPC)对其进行分析。
GPC是用配有Waters 600控制器和717自动采样器的使用Ultrahydrogel线形柱(Waters Corporation，Milford，MA，US)的Waters泵系统以1.0ml/分钟的流速在25℃下进行的。用包含0.2M Na2SO4和5mM磷酸钠缓冲剂的水溶液(pH8.0)作为流动相。将500微升各样品注射到该柱中。用在208nm和490nm波长进行操作的Waters 996光二极管矩阵检测器和474扫描荧光检测器(具有490nm和530nm的激发波长)对洗脱液进行探测。对于低pH下的实验而言，运行和探测条件相同，只是洗脱缓冲剂的组成为50mM醋酸，0.2M Na2SO4，pH为3.5。
结果：
在5分钟、3天和6天时对反应混合物的UV吸收(在490nm和208nm下)和荧光(在490nm和530nm下)GPC性进行分析。最大保留时间为7分钟的峰是HA峰，而最大保留时间为9分钟的峰是PLL-FITC。该分配是以独立的HA和PLL-FITC化合物的GPC性为基础的。通过490nm下的UV吸收和530nm下的荧光发现，反应期间的变换可追溯至PLL-FITC的转化。在上述条件下，PLL-FITC具有最大吸收而HA没有吸收。在反应开始后，PLL-FITC的峰面积下降而HA的峰面积增加(在保留时间为7分钟时峰最大)。出现新峰(保留时间为7分钟)是由于PLL-FITC与HA共轭。其吸收增加可能是因为反应过程中PLL-FITC和HA之间的共轭增加。通过相应峰的积分来测定随着时间的进行而得到的共轭程度，并且其为2.4％(5分钟)、31.2％(3天)、37.5％(6天)。
阴性对照试验是在不存在NaBH3CN的情况下进行的，将其与存在还原剂的反应进行比较。对用490nm下的UV吸收和530nm下的荧光探测到的GPC曲线进行分析。对照实验中的共轭程度为大约10％，其比存在NaBH3CN情况下观察到的共轭程度小3倍。
在8.5的反应pH下，PLL-FITC荷正电而HA荷负电。虽然为了防止与试剂之间形成离子复合物，HA和PLL-FITC之间的共轭是在高盐浓度(1M NaCl)下进行的，但是仍然可能形成该类复合物。为了区别形成的离子和共价键，用醋酸将该反应混合物酸化至3.5的pH。在酸性条件下，HA被质子化，如果形成离子复合物，其将不稳定。相反，化学共价键在相同的条件下是稳定的。将阴性对照、和用NaBH3CN获得的试验反应混合物在3.5的pH下储存1天并用GPC对其进行分析(醋酸缓冲剂，50Mm，0.2M Na2SO4)。被指定为轭合物的峰部分与酸化之前相同：对照为10％，使用NaBH3CN的实验为34％。通过共价键形成的HA-PLL-FITC轭合物足够稳定，在3.5的pH下不会被破坏。
实施例2：HA-PLL-FITC在兔眼睛模型中的连接：
材料和方法：
用体内兔角膜模型对FITC-标记的聚赖氨酸和与透明质酸共轭的FITC-标记的聚赖氨酸连接的程度和持续时间进行试验。在这种随机双盲安慰剂对照的单中心对侧组的临床前研究中使用十只新西兰白兔。
将各兔的眼睛随机指定到四种治疗中的一种中：活性组1(基质加0.42％FITC-标记的PCS-101(与聚赖氨酸轭合的透明质酸，以大约1∶1的游离透明质酸：轭合物摩尔比包含游离透明质酸；HA的平均分子量为220,000Da，聚赖氨酸的分子量为15,000-30,000Da)(9只眼睛的样本量))；活性组2(基质加2％FITC-标记的聚赖氨酸)(4只眼睛的样本量))、基质(20mM硼酸钠，pH7.8加80mM NaCl)(5只眼睛的样本量)；和安慰剂(磷酸盐-缓冲的盐水(PBS)，pH7.4)(2只眼睛的样本量)。PCS-101溶液最初溶液中的荧光强度比聚-赖氨酸溶液中的荧光强度低175倍。
连续三天，每天以每次给药40μl的等体积一天两次地将该组合物给药到活兔的相应眼睛上，总的算来，每只眼睛一共使用六滴。在最后一次滴入给药后1小时、6小时、和36小时，将动物处死，取下角膜并将其冷冻在OTC介质中以用于十字分割。将这些部分用Spot RT数码相机(Diagnostic Instrument，Inc.)照相并在FITC和明视野照明下在40x放大率下进行组织学检查。所有的兔子都完成了该研究，并对所有变量进行评估。结果如图1A-1F所示，其表示了在最后一次应用后1小时和36小时，滴眼制剂中荧光性PCS-101和聚-赖氨酸在体内与兔角膜的交联。
结果：
图1A-1F是表示得自眼睛试验的荧光标记的TransLinkTM系统产品的特性的兔角膜横截面的照片。首行(图1A和1B)表示了在3天给药时进行六滴药物给药的最后一次给药后1小时和36小时被处死兔子角膜上具有荧光标记(无活性的物质)的聚赖氨酸TransLinkTM系统固位凹。其清楚地表明，Pericor聚赖氨酸固位凹在1小时后在死角膜上皮的顶层中维持了值得注意的持久性，并且在36小时后仍然存在。1小时和36小时时间点之间的信号降低最可能是由于表皮在24-36小时期间的天然脱落和用作标记物的荧光分子的粹灭而产生的。
图1C和1D表示了在1小时和36小时后透明质酸和聚赖氨酸轭合物向兔角膜的附着。轭合物中的聚赖氨酸同样是FITC-标记的。在附着前，FITC-标记的轭合物的储备液的荧光强度比FITC-标记的聚赖氨酸储备液的荧光强度低175倍。在1小时的时间点，包含透明质酸的轭合物坚牢地交联到角膜(和结膜/眼睑，数据没有表示出来)上皮细胞的顶层上。在最后一次应用后36小时，在角膜上仍然存在少量但是可以仍然可以检测数量的轭合物。
图1E表示了当仅用基质对角膜进行处理时背景荧光的水平。图1F表明了横截面上的角膜结构。
结论：
附着的程度和持续时间：
使用六滴FITC-轭合的聚赖氨酸使得在使用最后一滴后聚赖氨酸可以在兔角膜上牢固附着至少36小时。对进行了处理的眼睛进行的分析表明聚赖氨酸连接分子被连接到角膜和结膜以及眼睑的成熟表面上皮细胞上。因为正常兔眼睛的表面细胞具有一种天然的泪膜覆盖物，认为这种覆盖物将防止物质附着到其上，所以这些发现是十分令人吃惊的。聚赖氨酸的长期附着表明该类附着可以抵抗眼睛的天然环境并且不会受到眨眼的机械破坏。
使用六滴与透明质酸轭合的FITC-标记的聚赖氨酸同样可以使得聚赖氨酸在兔角膜上附着至少1小时。虽然在36小时时可测得的被标记的聚赖氨酸数量极低，但是这部分地可以由进行了荧光标记的轭合物的储备液的荧光强度降低来进行解释。与单独使用聚赖氨酸的结果相一致，该透明质酸轭合物坚牢地附着到眼睛表面上。重要的是，没有观察到眼睛刺激。
刺激：
活性组1仅仅在一个时间点——仅第一次使用后5分钟诱导的充血与基质相比在统计学上显著增加。但是，认为对于这种模型中获得的刺激反应而言，这种小于半级的改变在临床上没有显著意义。与基准相比，活性组2在四个时间点的充血在统计学上都显著增加。此外，与基准相比，活性组1没有诱导任何统计学显著的眼睛混合刺激增加，而活性组2在四个时间点的眼睛混合刺激与基准相比在统计学上显著增加。
在任何时间点，活性组1和安慰剂之间的充血和眼睛混合刺激在统计学上都没有显著差异。但是，在1-3天中，活性组1和活性组2之间有一些统计学显著差异，具体而言，对于充血而言在15个时间点有差异，对于混合刺激而言在8个时间点有差异。
在任何时间点，与基准或安慰剂组相比，活性组1都没有产生任何临床上有显著意义的改变。在除一个时间点外的所有时间点，该化合物在任何刺激得分方面也没有产生任何统计学上显著的改变。因此，表明活性组1在这种研究中不是刺激剂。
实施例3：HA-聚赖氨酸轭合物与人手指角质化层结合能力的体内试 验:
材料和方法：
反应溶液是位于0.1M甘氨酸缓冲剂0.15M NaCl，pH8中的0.34μg/μl HA-PLL-FITC轭合物(根据PLL-FITC含量来确定)，总反应体积为20μl。
用水对人的手指进行清洗，使其干燥，其后将反应溶液应用到其上。用不掉粉末的指套将该反应溶液在皮肤上摩擦10秒，然后使之在室温下干燥。然后将该手指用水洗涤和干燥。在洗涤后的各时间点(0、2.5、6、和24小时)，在FITC照度(放大率为2X)下用Spot RT数码相机(Diagnostic Instrument，Inc.)对该手指的顶端表面照相。
结果：
图2表明了在通过摩擦应用样品后随着时间的流逝，0.34μg/μlHA-PLL-FITC轭合物与人手指体内结合的数据。时间过程为0小时、2.5小时、6小时和24小时。还表明了未进行处理的组织(对照)的沾染水平。
在洗涤后观察到的明亮的荧光证明该HA-PLL轭合物被体内交联到人手指的角化层上(图2)。甚至在洗涤后24小时，仍然可以看到显著的荧光量，这表明了在24小时期间在体内被交联到人皮肤上的HA-PLL轭合物的耐久性。
实施例4：在不加入转谷氨酰胺酶的情况下在重复应用PCS-101后 的吸收：
材料和方法：
完全反应溶液包含10mg/ml的PCS-101(HA-PLL-FITC和游离HA)，其位于包含20mM硼酸钠，pH7.8加80mM NaCl的无菌缓冲剂中。总反应体积为50μl。
将完整的兔眼球用PBS缓冲剂进行清洗。用一种0.5cm2的圆筒将该反应溶液应用到各角膜的中心并将其在潮湿的室内在37℃下培养1分钟。在培养期后，除去反应溶液并将其在25℃下用PBS缓冲剂洗涤1分钟。然后，除去一只兔眼睛样品，同时给剩余的各样品再次使用该反应溶液，然后将其在37℃下进行再培养。重复这种方案直至将所有的样品用PCS-101一共应用1、2、4、6、8、10和12次来进行处理。在洗涤后，在FITC照明下在放大率为2X的情况下用Spot RT数码相机(Diagnostic Instrument，Inc.)给各角膜拍照。然后切除角膜并将其冷冻在OCT介质中。冷冻的组织切片是由各样品制备的并且在表荧光下用具有20X的目镜和适宜的滤光器的Spot RT数码相机(DiagnosticInstrument，Inc.)给这些切片拍照。
结果：
图3和4表明了在不加入转谷氨酰胺酶的情况下重复应用到兔角膜上后PCS-101的吸收。表明了应用次数，其范围为1x至12x。在第一次应用后观察到的荧光清楚地表明PCS-101-FITC被交联到兔角膜的角化层上。被兔角膜所保留的PCS-101-FITC的数量显然随着相继高至12次的PCS-101应用几乎线性增加(图3和4)。这种情况发生于在缓冲剂中不存在外源性加入的转谷氨酰胺酶和Ca++的情况下。
实施例5：在不加入转谷氨酰胺酶的情况下PCS 201(HA-PLL-FITC 轭合物)与猪腭、龈、和下层舌表皮的偶合和EDTA对其的抑制作用：
材料和方法：
完全反应溶液包含100mM甘氨酸(pH8.2)、150mM NaCl缓冲剂和1500μg HA-PLL-FITC轭合物。总反应体积为300μl。阴性对照在反应溶液中包含140mM EDTA。
用PBS缓冲剂对猪腭、龈、和下层舌样品简单进行洗涤并将其在37℃下在该反应溶液中培养1小时。然后在搅拌的情况下将该样品再用PBS缓冲剂洗涤1小时。制备冷冻的组织切片并将其用DAPI染色。在表-荧光照明下使用以绿色表示FITC和以蓝色表示DAPI的适宜滤光器对这些切片拍照。
结果：
图5证明在不存在外源性转谷氨酰胺酶的情况下荧光性PCS-201交联到猪腭上皮上并且其被EDTA抑制。图6证明在不存在外源性转谷氨酰胺酶的情况下荧光性PCS-201交联到猪舌下表面的上皮上并且其被EDTA抑制。图7证明在不存在外源性转谷氨酰胺酶的情况下荧光性PCS-201交联到猪龈上皮上并且其被EDTA抑制。图8证明在不存在外源性转谷氨酰胺酶的情况下荧光性PCS-201在使用30秒内交联到猪舌和龈上皮上。图9证明在不存在外源性转谷氨酰胺酶的情况下荧光性PCS-101在使用30秒内交联到猪腭、龈和舌上皮上。图10证明在不存在外源性转谷氨酰胺酶的情况下荧光性PCS-201在使用30秒内交联到猪嘴上皮上。内源性转谷氨酰胺酶将相当数量的HA-PLL-FITC轭合物交联到猪腭、龈和下部舌上皮的角质层上。EDTA抑制了HA-PLL-FITC轭合物与猪腭、龈和下部舌上皮的角质层的偶合(图5-10)。
实施例6：作为时间函数的在不加入转谷氨酰胺酶的情况下 PCS-201-FITC和聚赖氨酸与猪主动脉内层的偶合：
材料和方法：
该反应溶液包含1μg/μl PLL-FITC(MW＝241kD)(位于100mM甘氨酸，150mM NaCl(pH8.2)中)，和5μg/μl HA-PLL-FITC轭合物(位于100mM甘氨酸，150m MNaCl(pH8.2)中)(PCS-201-FITC)。就反应溶液的荧光强度而言，PCS-201溶液的荧光强度比PLL-FITC溶液低17倍。总反应体积为500μl。
将猪主动脉用PBS缓冲剂洗涤，并同时将其浸泡在该缓冲剂中以避免该组织变干，将其切成各自为0.5cm2的方形片。然后将各片主动脉在37℃下在该反应混合物中培养不同的时间(1、15、30和60分钟)。在用PBS清洗后，将该样品在搅拌的情况下用PBS洗涤1小时。然后将该主动脉样品包埋在OCT化合物中并将其冷冻。将这些样品切片并在荧光照明下对其拍照。
结果：
图11证明荧光PCS-201和PLL在不存在外源性转谷氨酰胺酶的情况下交联到猪主动脉内层上。就初始溶液中的荧光强度而言，PCS-201溶液中的荧光强度比PLL溶液中的低17倍。如荧光探测所表明的那样，在培养后1分钟，PLL-FITC和PCS-201结合到主动脉内层上。正如荧光强度以及其在组织学切片上的均匀性所表明的那样，PLL-FITC和PCS-201的结合随着培养时间延长而增加。与PLL-FITC相比主动脉保留的PCS-201荧光强度降低部分是因为PCS-201溶液中的反应溶液荧光强度比PLL-FITC溶液低17倍。
实施例7：在不同盐浓度下HA-聚赖氨酸轭合物与兔角膜角质化层的 结合：
材料和方法：
该轭合物原料是通过将冷冻干燥的轭合物重新混悬于0.1M甘氨酸中来进行制备的并用FITC的荧光对其进行定量(原料浓度＝0.1mg/ml)。反应组是具有浓度增加的盐(0、50、150、300、500mM NaCl)的0.1mg/ml HA-PLL-FITC(位于0.2M甘氨酸中)，和具有浓度增加的盐(0、50、150、300、500mM NaCl)的0.1mg/ml PLL-FITC(位于0.1M甘氨酸中)。总反应体积为70μl。
将兔子完整的眼球在PBS缓冲剂中进行清洗。用一种0.5cm2的克隆圆筒将该反应溶液应用到各角膜的中心并将其在37℃下培养1小时。在1小时后，在搅拌的情况下将眼球用30ml PBS缓冲剂洗涤1小时。在洗涤前和洗涤后在FITC照明下用Spot RT数码相机(DiagnosticInstrument，Inc.)给角膜拍照。然后切除角膜并将其冷冻在OCT介质中。在下面的条件下对FITC荧光进行定量：PLL 2X放大率，接触2秒，ND4滤光器；HA-PLL轭合物：2X放大率，接触2秒，没有滤光器。
结果：
表1.在洗涤后得自角膜局部视图的FITC荧光定量
    样品    盐浓度     最大强度
    HA-PLL     无     737
    50mM     760
    150mM     1394
    300mM     2605
    500mM     3112
    PLL     无     2818
    50mM     4095
    150mM     3656
    300mM     3236
    500mM     1664
图12表明了在不存在外源性转谷氨酰胺酶的情况下NaCl浓度对HA-PLL-FITC与兔角膜角化层的偶合的影响。盐的浓度范围为0至500mM。表1表明了使用PLL或HA-PLL轭合物时FITC与角膜组织的结合水平。HA-PLL轭合物与兔角膜角化层的结合随着NaCl浓度的增加稳步增加，这可能是由于任何HA和PLL离子复合物解离，从而给出作为转谷氨酰胺酶底物的PLL(图12)。单独使用PLL时的结合随着NaCl浓度的增加稳步降低，这可能是由于渗透流的改变或该盐对转谷氨酰胺酶的作用而导致的。
实施例8：体内研究：
简介：
进行人试验测定该HA-PLL轭合物对LasikTM后干眼患者的作用。该研究将HA-PLL对患有干眼的Lasik后患者的作用与正常患者和使用安慰剂的患者进行比较。
初步结果：
给第一名患者(患者#1)使用高分子量的HA，PCS-102(0.15％的聚L-810kd mw HA)。患者#1在9个月前由不同的外科医生进行了手术并且从此开始出现了极为痛苦的干眼。给第二名患者(患者#2)使用高浓度的当前分子量的PCS-101(0.4％的聚L-220kd mw HA)。患者#2在3周前进行了手术并在其治疗前在手术后已经过了整一周(以消除手术后使用的局部甾族化合物的任何作用)。两名患者都在经历干眼。
这里所用的指示性度量有：1)泪膜破裂时间(TFBUT)；2)SchirmerII试验(其用“石蕊型带”对角膜表面的水分量进行了测量)；和3)荧光(flourescence)标点的出现(典型的“染色”终点)。第二和第三项度量已经被FDA批准作为功效的可接受象征。独立地对两只眼睛都进行评估，RE＝右眼；LE＝左眼。
在治疗前测量各患者的基准TFBUT和Schirmer得分。正常人这两项度量的各得分大约都为10分。如所预期的那样，两名患者两种度量的平均得分都低于平均分并且报告有疼痛症状。
各患者开始都仅被给予1滴各自的HA-PLL轭合物，然后以15分钟的间隔对其进行测量，测量进行到高至90分钟(在患者#2的情况中)。
给各患者每天使用6滴使用2天，然后要求其停止。然后都以15分钟的间隔对其测量高至90分钟以查看该治疗是否改善了其TFBUT、Schirmer和荧光(flourescent)染色得分。
要求患者#2再继续治疗1周，每天仅使用三滴(QID)。此后，在10-12小时(一整夜)不进行任何滴加应用的时期后，对患者#2进行测量，然后再以15分钟的间隔测量高至90分钟。
对于患者#2而言，Schirmer试验得分显著跳跃，即使在其最后一次应用后13.5小时也是如此。TFBUT和染色得分同样表明获得了统计学上显著的改善。此外，患者报告了极大的缓解和希望不要停止使用该产品的愿望。
两名患者的数据如表2所示。
实施例9：在不加入转谷氨酰胺酶的情况下重复应用后 PCS-101(与PLL-TRITC轭合的HA-FITC)与兔角膜的交联与游离 HA(HA-FITC)的比较：
材料和方法：
首先用荧光素胺对一批游离HA的COOH基进行标记并对其进行纯化。用一部分进行了标记的HA(HA-FITC)作为对照而将其余的与之前已经用TRITC进行了标记并进行了纯化的聚赖氨酸轭合。在共轭后，对该进行了双重标记的PCS-101(与PLL-TRITC轭合的HA-FITC)进行纯化。
为了对其与兔角膜的交联进行评估，反应组为：
组I：10mg/ml PCS-101(与PLL-TRITC轭合的HA-FITC)，位于20mM硼酸盐，80mM NaCl中，pH7.8，和
组II：10mg/ml游离HA(HA-FITC)，位于20mM硼酸盐，80mM NaCl中，pH7.8。
总反应体积为50μl。PCS-101和游离HA应用溶液中HA的FITC荧光强度、粘度和分子量都相同。
将完整的兔眼球用PBS缓冲剂进行清洗。用0.5cm2的圆筒将该反应溶液应用到兔角膜的中心并将其在37℃下培养1分钟。然后将治疗区域用150μl 1x PBS在该圆筒内洗涤小于1分钟的时间。对各眼睛重复进行6次这种应用和洗涤过程。
然后，在FITC照明下用Spot RT数码相机(DiagnosticInstrument，Inc.)给角膜拍照。然后将角膜切割并冷冻在OCT介质中。制备组织学切片并在FITC照明下给其拍照以对荧光进行定量。结果：
结果：
表3.组织学切片上FITC荧光的定量
 FITC荧光强度的已校均值  差异倍数
HA-FITC-K-TRITC  256.6503  24
HA-FITC  10.9462
未进行治疗  0
图13表明在不存在外源性转谷氨酰胺酶的情况下将HA-PLL轭合物应用到兔角膜上时，FITC和TRITC的双重染色(第一组)。在每次应用具有1分钟的培养时间的情况下在重复应用六次后进行拍照。HA进一步与FITC轭合，同时PLL进一步与TRITC轭合。当仅使用HA-FITC时没有观察到染色(第二组)。PLL-TRITC标记的角膜(第三组)。未进行处理的组织仅表现出背景荧光(第四组)。这种染色方式表明用PCS-101所观察到的FITC荧光是因为PLL与角膜结合(如第三组照片所示)，而不是由HA-FITC的非特异结合产生的。
结论：
该数据表明PCS-101(HA-PLL轭合物)与兔角膜浅层的交联随着应用次数的增加而增加。相反，游离HA(HA-FITC)不会与兔角膜的浅层显著结合。组织切片上的荧光强度仍保留在背景水平上并且没有随着增加应用而增加的事实证明了这一点。在重复应用六次后，如其相对的已校FITC荧光强度均值所测量的那样，被兔角膜保留的PCS-101的数量比游离HA高24倍(见图14)。
                             等同
应当清楚的是，可以对这里所公开的实施方案进行各种变化。因此，上面的说明不应看成是对本发明的限制，其仅仅是优选实施方案的举例说明。本领域技术人员可预见到在这里所附权利要求范围内的其它变型。
这里所公开的所有参考资料、专利和专利申请都被全部引入作为参考。
                      附录A      可通过商业途径获得的交联剂的反应性
                   可以与之反应的            可被其裂解
双重物质交联剂首字母组合词 -NH2胺 SH-巯基 碳水化合物 非选择性(光-反应性) -COOH羧基 硫醇 碱 高碘酸盐 羟胺
ABH × ×
ANB-NOS × ×
APDP × × ×
APC ×
ASIB × ×
ASBA × ×
BASED × ×
BS3 ×
BMH ×
BSOCOES × ×
DFDNB ×
DMA ×
DMP ×
DMS ×
DPDPB × ×
DSC ×
DSP × ×
                                               附录A
                     可以与之反应的              可被其裂解
双重物质交联剂首字母组合词 -NH2胺 SH-巯基 碳水化合物 非选择性(光-反应性) -COOH羧基 硫醇 碱 高碘酸盐 羟胺
DSS ×
DST × ×
DTBP × ×
DTSSP × ×
EDC × ×
EGS × ×
GMBS × ×
HSAB × ×
LC-SPDP × ×
MBS × × ×
M2C2H × ×
HPBH × ×
NHS-ASA × ×
PDPH × × ×
PNP-DTP × ×
SADP × × ×
SAED × × ×
SAND
                                                    附录A
                      可以与之反应的              可被其裂解
双重物质交联剂首字母组合词 -NH2胺 -SH巯基 碳水化合物 非选择性(光-反应性) -COOH羧基 硫醇 碱 高碘酸盐 羟胺
SANPAH × ×
SASD × × ×
SDBP ×
SIAB × ×
SMCC × ×
SMBP × ×
SHPT × ×
SPDP × × ×
磺基-BSOCOES × ×
磺基-DST × ×
磺基-EGS × ×
磺基-GMBS × ×
磺基-HSAB × ×
磺基-LC-SPDP × × ×
磺基-MBS × ×
磺基-NHS-ASA × ×
磺基-NHS-LC-ASA × ×
磺基-SADP × × ×
                                              附录A
                      可以与之反应的             可被其裂解
双重物质交联剂首字母组合词 -NH2胺 -SH巯基 碳水化合物 非选择性(光-反应性) -COOH羧基 硫醇 碱 高碘酸盐 羟胺
磺基-SAMCA × ×
磺基-SANPAH × ×
磺基-SAPB × ×
磺基-SIAB × ×
磺基-SMCC × ×
磺基-SMBP × ×
磺基-LC-SMPT × ×
附录A

Claims (139)

1.一种包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物、以及游离透明质酸的组合物，其中所说的游离透明质酸和轭合物是以至少2的摩尔比存在的。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所说的连接分子具有至少两个相连的脂族胺、至少三个相连的脂族胺、至少四个相连的脂族胺、至少五个脂族胺、或至少六个脂族胺。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所说的连接分子是天然的聚赖氨酸。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所说的聚赖氨酸选自聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、和聚-DL-赖氨酸。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所说的连接分子是聚赖氨酸的衍生物。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所说的连接分子具有至少两个相连的甲酰胺、至少三个相连的甲酰胺、至少四个相连的甲酰胺、至少五个甲酰胺、或至少六个甲酰胺。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所说的连接分子是天然的聚谷氨酰胺。
8.如权利要求7所述的组合物，其中所说的连接分子选自聚-L-谷氨酰胺、聚-D-谷氨酰胺、和聚-DL-谷氨酰胺。
9.如权利要求1所述的组合物，其中所说的连接分子是聚谷氨酰胺的衍生物。
10.如权利要求1所述的组合物，其中所说的透明质酸是天然的透明质酸。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所说的透明质酸是选自透明质酸可药用的盐、透明质酸酯、和硫酸化的透明质酸的透明质酸衍生物。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所说的摩尔比选自至少2.0和至少4.0。
13.如权利要求1所述的组合物，其中所说的组合物是以选自滴眼剂、隐形眼镜溶液、眼用软膏、眼睛填塞物、和隐形眼镜的形式被提供的。
14.如权利要求1所述的组合物，其中该组合物是以选自舌下片、漱口剂、牙膏、糖果、和口部凝胶的形式被提供的。
15.如权利要求1所述的组合物，其中所说的透明质酸具有至少100,000的分子量。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所说的轭合物具有高于1.0的负电荷∶正电荷比。
17.如权利要求1所述的组合物，其还包含可药用的载体。
18.如权利要求17所述的组合物，其中所说的可药用的载体包括眼用防腐剂。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所说的眼用防腐剂选自有机汞制剂、季铵化合物、对羟基苯甲酸酯、被取代的醇和苯酚类物质。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所说的有机汞制剂选自硝酸苯汞、醋酸苯汞、硼酸苯汞、和硫柳汞。
21.如权利要求19所述的组合物，其中所说的季铵化合物选自苯扎氯铵、苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓、和聚季鎓-1(POLYQUAD)。
22.如权利要求19所述的组合物，其中所说的被取代的醇和苯酚选自氯丁醇、和氯丁醇/苯乙醇。
23.如权利要求18所述的组合物，其中所说的眼用防腐剂是抗生素。
24.如权利要求1所述的组合物，其还包含选自矫味剂、着色剂和香料的物质。
25.如权利要求1所述的组合物，其中所说的轭合物具有选自至少90％、至少95％、和至少99％的重量比。
26.如权利要求1所述的组合物，其还包含精氨酸或氟化物。
27.如权利要求1所述的组合物，其中所说的连接分子是非络合的。
28.一种包含共价连接到是转谷氨酰胺酶的底物的连接分子上的透明质酸的药物组合物，其中所说的连接分子是非络合的。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的连接分子具有至少两个相连的脂族胺、至少三个相连的脂族胺、至少四个相连的脂族胺、至少五个脂族胺、或至少六个脂族胺。
30.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的连接分子是天然的聚赖氨酸。
31.如权利要求30所述的药物组合物，其中所说的聚赖氨酸选自聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、和聚-DL-赖氨酸。
32.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的连接分子是聚赖氨酸的衍生物。
33.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的连接分子具有至少两个相连的甲酰胺、至少三个相连的甲酰胺、至少四个相连的甲酰胺、至少五个甲酰胺、或至少六个甲酰胺。
34.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的连接分子是天然的聚谷氨酰胺。
35.如权利要求34所述的药物组合物，其中所说的聚赖氨酸选自聚-L-谷氨酰胺、聚-D-谷氨酰胺、和聚-DL-谷氨酰胺。
36.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的连接分子是聚谷氨酰胺的衍生物。
37.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的透明质酸是天然的透明质酸。
38.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的透明质酸是选自透明质酸可药用的盐、透明质酸酯、和硫酸化透明质酸的透明质酸衍生物。
39.如权利要求28所述的药物组合物，其还包含游离透明质酸。
40.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的组合物是以选自滴眼剂、隐形眼镜溶液、眼用软膏、眼睛填塞物、和隐形眼镜的形式被提供的。
41.如权利要求28所述的药物组合物，其中该组合物是以选自舌下片、漱口剂、牙膏、糖果、和口部凝胶的形式被提供的。
42.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的透明质酸具有至少100,000的分子量。
43.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的轭合物具有高于1的负电荷∶正电荷比。
44.如权利要求28所述的药物组合物，其还包含可药用的载体。
45.如权利要求44所述的药物组合物，其中所说的可药用的载体包含眼用防腐剂。
46.如权利要求45所述的药物组合物，其中所说的眼用防腐剂选自有机汞制剂、季铵化合物、对羟基苯甲酸酯、被取代的醇和苯酚类物质。
47.如权利要求46所述的药物组合物，其中所说的有机汞制剂选自硝酸苯汞、醋酸苯汞、硼酸苯汞、和硫柳汞。
48.如权利要求46所述的药物组合物，其中所说的季铵化合物选自苯扎氯铵、苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓、和聚季鎓-1(POLYQUAD)。
49.如权利要求46所述的药物组合物，其中所说的被取代的醇和苯酚选自氯丁醇、和氯丁醇/苯乙醇。
50.如权利要求45所述的药物组合物，其中所说的眼用防腐剂是抗生素。
51.如权利要求44所述的药物组合物，其中所说的可药用的载体具有至少280mOsm的重量渗克分子浓度。
52.如权利要求4 4所述的药物组合物，其中所说的可药用的载体具有至少6.5的pH。
53.如权利要求44所述的药物组合物，其中所说的可药用的载体包含精氨酸或氟化物。
54.如权利要求28所述的药物组合物，其中所说的轭合物具有选自至少90％、至少95％、和至少99％的重量比。
55.一种在滴眼剂瓶中包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物的组合物。
56.如权利要求55所述的组合物，其还包含可药用的载体。
57.如权利要求55所述的组合物，其还包含使用说明。
58.如权利要求55所述的组合物，其中所说的连接分子具有至少两个相连的脂族胺、至少三个相连的脂族胺、至少四个相连的脂族胺、至少五个脂族胺、或至少六个脂族胺。
59.如权利要求55所述的组合物，其中所说的连接分子是天然的聚赖氨酸、或聚赖氨酸的衍生物。
60.如权利要求59所述的组合物，其中天然的聚赖氨酸选自聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、和聚-DL-赖氨酸。
61.如权利要求55所述的组合物，其中所说的连接分子具有至少两个相连的甲酰胺、至少三个相连的甲酰胺、至少四个相连的甲酰胺、至少五个甲酰胺、或至少六个甲酰胺。
62.如权利要求55所述的组合物，其中所说的连接分子是天然的聚谷氨酰胺、或聚谷氨酰胺的衍生物。
63.如权利要求62所述的组合物，其中天然的聚谷氨酰胺选自聚-L-谷氨酰胺、聚-D-谷氨酰胺、和聚-DL-谷氨酰胺。
64.如权利要求55所述的组合物，其中所说的透明质酸是天然的透明质酸。
65.如权利要求55所述的组合物，其中所说的透明质酸是选自透明质酸可药用的盐、透明质酸酯、和硫酸化的透明质酸的透明质酸衍生物。
66.如权利要求55所述的组合物，其还包含游离透明质酸。
67.如权利要求55所述的组合物，其中所说的透明质酸具有至少100,000的分子量。
68.如权利要求55所述的组合物，其中所说的轭合物具有高于1的负电荷∶正电荷比。
69.如权利要求56所述的组合物，其中所说的可药用的载体包含眼用防腐剂。
70.如权利要求69所述的组合物，其中所说的眼用防腐剂选自有机汞制剂、季铵化合物、对羟基苯甲酸酯、被取代的醇和苯酚类物质。
71.如权利要求70所述的组合物，其中所说的有机汞制剂选自硝酸苯汞、醋酸苯汞、硼酸苯汞、和硫柳汞。
72.如权利要求70所述的组合物，其中所说的季铵化合物选自苯扎氯铵、苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓、和聚季鎓-1(POLYQUAD)。
73.如权利要求70所述的组合物，其中所说的被取代的醇和苯酚选自氯丁醇、和氯丁醇/苯乙醇。
74.如权利要求69所述的组合物，其中所说的眼用防腐剂是抗生素。
75.如权利要求56所述的组合物，其中所说的可药用的载体具有至少280mOsm的重量渗克分子浓度。
76.如权利要求56所述的组合物，其中所说的可药用的载体具有至少6.5的pH。
77.如权利要求56所述的组合物，其中所说的可药用的载体包含精氨酸或溶菌酶。
78.如权利要求55所述的组合物，其中所说的轭合物具有选自至少90％、至少95％、和至少99％的重量比。
79.如权利要求55所述的组合物，其中所说的连接分子是非络合的。
80.一种包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物、和选自矫味剂、着色剂和香料组成的组的物质的组合物。
81.如权利要求80所述的组合物，其中所说的矫味剂选自甘露醇、糖精钠、magnasweet、薄荷提取物、叶粉或油；留兰香提取物、叶粉或油；冬青油；香草提取物；欧芹；牛至油；月桂叶油；丁香油；鼠尾草油；黄樟油；柠檬油；橙油；茴香油；苯甲醛；杏仁油；樟脑；雪松叶油；马郁兰油；cintronella oil；熏衣草油；芥子油；松油；松针油；迷迭香油；百里香油；肉桂叶油；薄荷醇；香芹酮；茴香脑；丁香酚；水杨酸甲酯；柠檬烯；繖花烃；正-癸醇；香茅醇；α-松油醇；乙酸甲酯；醋酸香茅酯；甲基丁香酚；桉树脑；芫荽醇；eyktl linalool；香草醛；百里酚；pellira oil；冬绿油；桉树油；咖啡因、酒石酸氢钾、乳酸、苹果酸、谷氨酸单钠、亚硝酸盐、山梨醇、阿司帕坦、乙酰舒泛、葡萄糖、果糖、环己基氨基磺酸钠、斯替维苷、新橙皮苷双氢查耳酮、甘草甜素、紫苏糖、索马汀、天冬氨酰基苯基丙氨酸甲酯、和对-甲氧基肉桂醛。
82.如权利要求80所述的组合物，其中所说的着色剂选自FD&C蓝#1、FD&C黄#5、FD&C黄#10、FD&C红#3、FD&C红#40；焦糖色或粉末(#05439)、巧克力色光(#05349)、绿色淀掺合物(#09236)、kowet二氧化钛(#03970)、黄色液体色(#00403)、和亚硝酸盐。
83.如权利要求80所述的组合物，其中所说的香料选自草花提取物、草药提取物、树花提取物、植物提取物、和人造香料组成的组。
84.如权利要求80所述的组合物，其中该组合物被制备成用于口服给药。
85.如权利要求84所述的组合物，其中该组合物被制备成舌下片、漱口剂、牙膏、口部凝胶、和糖果。
86.如权利要求80所述的组合物，其还包含精氨酸或氟化物。
87.如权利要求80所述的组合物，其还包含可药用的载体。
88.如权利要求87所述的组合物，其中所说的可药用的载体具有至少6.5的pH。
89.如权利要求80所述的组合物，其中所说的连接分子是非络合的。
90.如权利要求80所述的组合物，其中所说的轭合物具有选自至少90％、至少95％、和至少99％的重量比。
91.如权利要求87所述的组合物，其中所说的可药用的载体具有高于280mOsm的重量渗克分子浓度。
92.一种在包含氟化物的载体中包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物的组合物。
93.如权利要求92所述的组合物，其还包含可药用的载体。
94.如权利要求93所述的组合物，其中所说的可药用的载体具有至少6.5的pH。
95.如权利要求92所述的组合物，其中所说的连接分子是非络合的。
96.如权利要求92所述的组合物，其中所说的轭合物具有选自至少90％、至少95％、和至少99％的重量比。
97.如权利要求9 3所述的组合物，其中所说的可药用的载体具有高于280mOsm的重量渗克分子浓度。
98.如权利要求92所述的组合物，其中所说的轭合物是以选自舌下片、漱口剂、牙膏、糖果、和口用凝胶的形式被提供的。
99.一种包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物的舌下片形式的组合物。
100.如权利要求99所述的组合物，其还包含选自糖精、阿司帕坦、山梨醇、乙酰舒泛、葡萄糖、果糖、环己基氨基磺酸钠、斯替维苷、新橙皮苷双氢查耳酮、甘草甜素、紫苏糖、索马汀、天冬氨酰基苯基丙氨酸甲酯、和对-甲氧基肉桂醛的甜味剂。
101.如权利要求99所述的组合物，其还包含维生素。
102.如权利要求99所述的组合物，其还包含氟化物。
103.一种治疗特征为干燥的病症的方法，其包括给需要其的个体使用有效量的如权利要求1、28、55、80、92或99所述的组合物。
104.如权利要求103所述的方法，其中所说的病症是干眼。
105.如权利要求103所述的方法，其中干眼与选自非进行性结膜瘢痕形成(斯-约二氏综合征)、斯耶格伦综合症、沙眼、和疤痕性类天疱疮的病症有关。
106.如权利要求103所述的方法，其中所说的病症是口干燥。
107.一种包含透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物、以及有效量的游离透明质酸的药物组合物，其中所说的游离透明质酸和轭合物是以至少2的摩尔比存在的。
108.一种对个体进行治疗的方法，其包括给患有干眼或有干眼风险的个体的眼睛使用有效量的透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物。
109.如权利要求108所述的方法，其中所说的轭合物是以选自滴眼剂、隐形眼镜溶液、眼用软膏、眼睛填塞物、和隐形眼镜的形式被提供的。
110.一种对个体进行治疗的方法，其包括给患有口腔干燥或有口腔干燥风险的个体的口腔使用有效量的透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物。
111.如权利要求110所述的方法，其中所说的轭合物是以选自舌下片、漱口剂、牙膏、糖果、和口用凝胶的形式被提供的。
112.一种对个体进行治疗的方法，其包括给关节不适或有关节不适风险的个体的关节使用有效量的透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物。
113.一种对个体进行治疗的方法，其包括给过度凝血或有过度凝血风险或具有增高的凝血风险的个体的血管使用有效量的透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物。
114.一种对个体进行治疗的方法，其包括给有皱纹或有出现皱纹风险的个体的皮肤使用有效量的透明质酸和是转谷氨酰胺酶底物的连接分子的轭合物。
115.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的有效量小于每天0.05μg/kg。
116.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的连接分子具有至少两个相连的脂族胺、至少三个相连的脂族胺、至少四个相连的脂族胺、至少五个脂族胺、或至少六个脂族胺。
117.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的连接分子是天然的聚赖氨酸。
118.权利要求所述的方法，其中聚赖氨酸选自聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、或聚-DL-赖氨酸。
119.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的连接分子是聚赖氨酸的衍生物。
120.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的连接分子具有至少两个相连的甲酰胺、至少三个相连的甲酰胺、至少四个相连的甲酰胺、至少五个甲酰胺、或至少六个甲酰胺。
121.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的连接分子是天然的聚谷氨酰胺。
122.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中连接分子选自聚-L-谷氨酰胺、聚-D-谷氨酰胺、和聚-DL-谷氨酰胺。
123.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的连接分子是聚谷氨酰胺的衍生物。
124.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的透明质酸是天然的透明质酸。
125.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的透明质酸是选自透明质酸可药用的盐、透明质酸酯、和硫酸化的透明质酸的透明质酸衍生物。
126.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的透明质酸具有至少100,000的分子量。
127.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的轭合物具有高于1.0的负电荷∶正电荷比。
128.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的轭合物是在可药用的载体中被给药的。
129.如权利要求108所述的方法，其中所说的轭合物是在包含眼用防腐剂的可药用载体中被给药的。
130.如权利要求129所述的方法，其中所说的眼用防腐剂选自有机汞制剂、季铵化合物、对羟基苯甲酸酯、被取代的醇和苯酚类物质。
131.如权利要求129所述的方法，其中所说的有机汞制剂选自硝酸苯汞、醋酸苯汞、硼酸苯汞、和硫柳汞。
132.如权利要求129所述的方法，其中所说的季铵化合物选自苯扎氯铵、苄索氯铵、氯化十六烷基吡啶鎓、和聚季鎓-1(POLYQUAD)。
133.如权利要求129所述的方法，其中所说的被取代的醇和苯酚选自氯丁醇、和氯丁醇/苯乙醇。
134.如权利要求128所述的方法，其中所说的眼用防腐剂是抗生素。
135.如权利要求110所述的方法，其中所说的轭合物是在包含选自矫味剂、着色剂和香料的物质的可药用载体中被给药的。
136.如权利要求108、110、112、113或114所述的方法，其中所说的轭合物具有选自至少90％、至少95％、和至少99％的重量比。
137.如权利要求128所述的方法，其中所说的可药用的载体包含精氨酸。
138.如权利要求128所述的方法，其中所说的可药用的载体具有至少6.5的pH。
139.如权利要求128所述的方法，其中所说的可药用的载体具有至少280mOsm的重量渗克分子浓度。
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