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DE69612205T2 - Verfahren zur Kupplung von Polysacchariden und Proteinen - Google Patents

Verfahren zur Kupplung von Polysacchariden und Proteinen

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Publication number
DE69612205T2
DE69612205T2 DE69612205T DE69612205T DE69612205T2 DE 69612205 T2 DE69612205 T2 DE 69612205T2 DE 69612205 T DE69612205 T DE 69612205T DE 69612205 T DE69612205 T DE 69612205T DE 69612205 T2 DE69612205 T2 DE 69612205T2
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DE
Germany
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hydrogen
formula
polysaccharide
chr1
chr
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DE69612205T
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Peter Hoogerhout
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Nederlanden Staat
Nederlanden Welzijn Volksgezondheid en Cultuur Minister van
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Nederlanden Staat
Nederlanden Welzijn Volksgezondheid en Cultuur Minister van
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Aminothiol-Verbindungen als Linker beim Herstellen von Konjugat-Impfstoffen.
  • Es ist bewiesen worden, daß kovalente Bindung eines Polysaccharids oder anderen Haptens an ein immunogenes Protein oder Peptid oder anderen bioorganischen Moleküls ein geeignetes Verfahten zur Herstellung wirksamer Impfstoffe, zum Beispiel gegen pathogene Organismen, wie Haemophilus influenzae Typ b (Hirnhautentzündung, Mittelohrentzündung), Bordetella pertussis (Keuchhusten), Clostridium tetani (Tetanus), Meriingokokken (Neisseria meningitidis, Hirnhautentzündung, Mittelohrentzündung) und · Pneumokokken (Streptococcus pneumoniae, Lungenentzündung, Hirnhautentzündung, Mittelohrentzündung), ist. Solche Konjugat-Impfstöffe sind z. B. in US-A-4 762 713 beschrieben worden. Nach diesem US-Patent wird die Bindung zwischen dem Polysaccharid und dem Trägerprotein durch reduktive Aminierung von Aldehyd- oder Hemiacetalfunktionen der Polysaccharide mit Aminoresten im Protein vollbracht. Ein anderes geeignetes Verfahren zur kovalenten Bindung eines Polysaccharids an ein proteinartiges Material ist die Aktivierung von Hydroxylfunktionen, um eine Seitenkette zu erzeugen, die eine. Funktion enthält, die an ein Protein gekoppelt werden kann. Folglich kann das Polysaccharid aktiviert und dann an einen thioltragenden Rest, wie Cysteamin, gekoppelt werden, welcher an eine aktivierte Aminosäure im Protein gekoppelt werden kann. Die Verwendung von Cysteamin zum Koppeln von Oligosacchariden an Proteine ist von Verheul et al. (Infect. Immun. 59 (1991) 843-851) beschrieben worden. Diese Verwendung umfaßt die Aktivierung des Saccharids durch Umwandlung eines Carboxylrestes in einen N-Succinimidylester (NSu) gemäß des folgenden Schemas:
  • Ps-COOH + XONSu → Ps-CO-ONSu + HOX (1)
  • Ps-CO-ONSu + H&sub2; N-CH&sub2;-CH&sub2;-S-S-CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2; → → Ps-CO-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-S-S-CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2; + HONSu (2)
  • Ps-CO-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-S-S-CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2; + DTT-rd → Ps-CO-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-SH + HS-CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2; + DTT-ox (3)
  • Ps-CO-NH-CH&sub2;-CHz-SH + Br-CH&sub2;-CO-NH-Pr → → Ps-CO-NH-CH&sub2;-CH&sub2;-S-CH&sub2;-CO-NH-Pr + HBr (4)
  • wobei Ps ein Polysaccharid darstellt, Pr ein Protein oder Peptid darstellt und DTT-rd Dithiothreitol in seiner reduzierten (Dithiol-) Form und DTT-ox in seiner oxidierten (1,2-Dithian-) Form darstellt. Dieser Versuch erfordert jedoch das Vorhandensein von Carboxylresten im Polysaccharid, während viele biologisch interessante Polysaccharide keinen Carboxylrest enthalten.
  • Es wurde gefunden, daß Polysaccharide durch Cyanbtomid- Aktivierung gemäß des folgenden Schemas wirksam an Cysteaminähnliche Linker gebunden werden können, ohne daß eine andere Funktionalität als Hydroxylreste vorhanden sein müssen:
  • Ps-OH + Br-CN -4 Ps-O-CN + HBr (5)
  • Ps-O-CN + HhN-CH&sub2;-CH&sub2;-S-S-CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2; → → Ps-O-C ( = NH) -HN-CH&sub2;-CH&sub2;-S-S-CH&sub2; =CH&sub2;-NH&sub2; (6)
  • Reaktion (5) ist gefolgt von Nebenreaktionen, einschließlich einer Reaktion mit einem zweiten Hydroxylrest, die ein cyclisches Iminocarbonat erzeugt, welches auch Kopplung mit einem Aminorest zur Folge hat, wie in Reaktion (6).
  • Folglich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Kopplung. eines Polysaccharids an ein anderes Biopolymer, wobei das Polysaccharid mit Cyanhalogenid aktiviert wird und das aktivierte Polysaccharid mit einem Aminothiol-Linker mit der Formel 1
  • H&sub2; N- [(CH&sub2;)m-CHR1-CR²R³-A] q-CHR&sup4;- (CHR&sup5;)p-CHR&sup6;-S-R&sup7; 1
  • wobei A, iw, p, q, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R die im anhängenden Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben, umgesetzt wird, um ein thioliertes Polysaccharid mit der Formel 2
  • Ps-O-C(=NH)-NH-[(CH&sub2;)m-CHR1-CR²R³-A]q-CHR&sup4;-(CHR&sup5;)p-(CHR&sup5;)p-CHR&sup6;-SR&sup7; 2
  • zu erzeugen,
  • wobei Ps einen Polysaccharidrest darstellt und A, m, p, q, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; die vorstehend angegebene Bedeutung haben, gegebenenfalls gefolgt vom Entfernen der Schutzgruppe R&sup7; und Umsetzung des thiolierten Polysaccharids mit einem aktivierten Biopolymer. Die bevorzugten Linker haben die in den Ansprüchen 3-8 angegebene Bedeutung. Ein geeignetes Beispiel der Linker ist Cysteamin oder seine oxidierte Form Cystamin. Dieses Verfahren funktioniert für die Mehrheit von Polysacchariden, einschließlich der meisten bakteriellen Polysaccharide zufriedenstellend. Jedoch wird mit einigen Polysacchariden, wie dem ¹&sup9;F-Typ Pneumokokken-Kapselpolysaccharid, keine Kopplung in einem brauchbaren Ausmaß gefunden.
  • Obwohl die Erfinder wünschen, nicht an irgendeine spezielle Theorie gebunden zu werden, ist eine mögliche Erklärung für die. Unvollständigkeit oder das Versagen der. Cysteamin-Kopplung, daß das Cysteamin-Addukt, sobald es erzeugt ist, durch intramolekulare Umlagerung zu den Ausgangsmaterialien zurückkehren kann.
  • Es ist außerdem gefunden worden, daß jede unvollständige Kopplung durch Verwendung von Aminothiol-Linkern gelöst werden kann, die der Formel 3 ( = Formel 1 mit q = 1)
  • H&sub2; N-(CH&sub2;)m-CHR1-CR²R³-A-CHR&sup4;-(CHR&sup5;)p-CHR&sup6;-S-R&sup7; 3
  • entsprechen, wobei A, m, p, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;; R&sup6; und R&sup7; die im anhängenden Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben und bevorzugte Ausführungsformen in den anhängenden Ansprüchen definiert sind: Diese Linker haben wirksame Kopplung mit jedem Polysaccharid mit einer verbesserten Ausbeute an Cysteamin- Kopplung (Reaktionen (6) und (3)) zur Folge.
  • Die Aminothiol-Linker nach Formel 3 können gerade oder verzweigte α,ω-Aminothiol-Deriyäte mit wenigstens 4 Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls einem oder mehrereh Heteroatomen in der Kette, wie 4-Aminobutanthiol, 5-Aminopentanthiol, 2-(2- Aminoethylamino)ethanthiol und dergleichen, sein. Bevorzugte Verbindungen sind solche, in denen H&sub2; N-(CH&sub2;)m-CHR1-CR²R³- eine Aminosäure, wie Glycin, Alanin, (3-Alanin, Serin, Glutamin, γ- Aminobuttersäure, Lysin und ε-Aminocapronsäure, oder ein Oligopeptid, wie N-α-Glycyllysin und höhere Homologe von N-α- Peptidyl-α, ω-diaminosäuren, darstellt. Der Rest H&sub2; N- (CH&sub2;) m-CHR¹- CR²R³-A- kann auch ein lineares Oligopeptid, wie Glycylglycin darstellen.
  • In den Linke m beider Formeln 1 und 3 kann der Rest -A- CHR&sup4;-(CHR&sup5;)p-CHR&sup6;-S-R&sup7; z. B. von 2-Aminoethanthiol (Cysteamin), 2-Mercaptoethanol, 1, 2-Ethandithiol, 2-Amino-2-methylpröpanthiol, 3-Aminopropanthiol,~ 2-Hydroxy-3-aminopropanthiol, Monothio- und Dithiothreitol oder -erythritol, Cystein, Homocystein und ihren Estern und Amiden und dergleichen abgeleitet sein. Die am meisten bevorzugten Verbindungen nach Formel 3 sind N-Glycylcysteamin und seine Disulfidvorstufe N,N'-Diglycylcystamin.
  • Die meisten Verbindungen, die den Formeln 1 und 3 entsprechen, wie N,N'-Diglycylcystamin und N-Alanyl-S-acetylcysteamin, sind aus WO 85/00167 als Radioschutzmittel bekannt. Biopolymere, die durch das, vorliegende Verfahren konjugiert werden können, umfassen jede makromolekulare (MW > 1 kDa) natürliche oder naturähnliche Verbindung, die Hydroxyl-, Amino und/oder Mercaptoreste enthält. Insbesondere schließen solche Biopolymere natürliche oder modifizierte Polysaccharide, · natürliche, modifizierte oder synthetische Peptide und Proteine, Lipoproteine, Glycoproteine und Nucleinsäuren ein. Am meisten bevorzugt werden die vorliegenden Linker zur Konjugation einer oder mehrerer Polysaccharide an ein Protein oder Peptid verwendet.
  • Polysaccharide, die konjugiert werden können, schließen stärkeähnliche und Zellulosematerialien ein, aber das vorliegende Verfahren ist insbesondere zur Konjugation mikrobieller Polysaccharide, die Hapteile oder Immunogene sind, geeignet. Beispiele davon sind Pneumokokken-Kapselpolysaccharide der verschiedenen Typen, einschließlich z. B. Dänische Typen (Danish types) 1, 3, 4, 6A, 6B, 7S, 9 V, 14, 18C, 19F und 23F, Gruppe B Streptokokken-Polysaccharide, Kapselsaccharide von Klebstella pneumoniae, Haemophilus influenzae, einschließlich Typ b Polysaccharid, Neisseria meningitidis (Gruppen. A und C), Pseudomonas aeruginosa oder Escherichia coli. Es wird festgestellt, daß der Begriff "Polysaccharid", wie hierin verwendet, zuckerenthaltende Polymere und Oligomere umfaßt, sei es, daß sie nur glycosidische Bindungen oder auch Phosphodiester- oder andere % Bindungen enthalten. Sie können auch Nichtzuckereinheiten; wie Säurereste, Phosphatreste, Aminoreste, Zuckeralkohole und Aminosäuren enthalten und sie können depölymerisiert sein oder nicht. Um die Wiederholungseinheiten der Pneumokokken- Kapselpolysaccharide der Typen 6B, 14, 19F und 23 und des H. influenzae Typ b Kapselpolysaccharids zu veranschaulichen, sind sie nachstehend gegeben:
  • Pn 6B →2)-α-D-Galp-(1→3)-α-D-Glcp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→4)- D-Ribitol-5-(PO&sub4;-→
  • Pn 14 →4)-β-D-Glcp-(1→6)-β-D-Glcp*NAc-(1→3)-β-D-Galp-(1→ → eine β-D-Galp-(1→4)-Seitenkette tragend
  • Pn 19F →4) -β-D-ManpNAc- (1→4)-α-D-Glcp-(1→2)-α-L-Rhap-(1- PO&sub4;-→
  • Pn 23F →β-D-Glcp#-(1→4)-β-D-Galp&-(1→4)-β-L-Rhap-(1→ #: eine Phosphoglyceryl-(→3)-Seitenkette tragend &: eine α-L-Rhap-(1→2)-Seitenkette tragend → 3)-β-D-Ribf-(1→1)-D-Ribitol-5- (PO&sub4;-→ Eine Übersicht interessierender bakterieller Polysaccharide kann gefunden werden in: Lennart Kenne and Bengt Lindberg, "Bacterial polysaccharides" in The polysaccharides, Vol.. 2, Ed. G. O. Aspinall, 1983, Ac. Press, pp. 287-363.
  • Proteine und Peptide, die mit dem vorliegenden Verfahren konjugiert werden können, schließen immunogene und nichtimmunogene Proteine ein. Beispiele sind Serumalbumin und verschiedene Bakterientoxine und -toxoide, wie Diphthematoxin, Tetanustoxoid, Pneumolysin, Pneumolysöid, Toxine anderer Organismen, wie Pseudomonas, Staphylococcus, Bordetella pertussis, Escherichia coli, gegebenenfalls detoxifiziertes, sogenanntes· kreuzreagierendes Material (z. B. CRM 197) und Haemocyanine. Sie können auch Außenmembranptoteine von Organismen, wie Neisseria meningitidis öder Bordetella pertussis, sein. Die Proteine können auch Antikörper sein, die verwendet werden, um ein anderes Biomaterial zu einer gewünschten Stelle zu befördern. Die Proteine und Peptide können als selbständige Immunogene verwendet werden oder sie können verwendet werden, um das andere Material, wie Haptene, immunogener zu machen. Sie können nativ oder detoxifiziert oder mutiert sein. Die Begriffe Peptide und Proteine werden hierin willkürlich verwendet, auch wenn Proteine allgemein Materialien höheren Molekulargewichts bezeichnen als Peptide.
  • Die Linker von Formel 3 können durch an sich bekannte Verfahren, wie solche, die in EP-A-131500 beschrieben sind, hergestellt werden. Zum Beispiel kann die Linkerverbindung aus einem geeigneten Aminothiol, Dithiol oder Mercaptoalkohol, gemäß der Natur von Rest A, wie 2-Aminoethanthiol (Cysteamin), 3-Aminopropanthiol oder Cystein hergestellt werden, wobei die Thiolgruppe vorzugsweise,z. B. durch eine Acylgruppe oder als Disulfid geschützt wird. Wenn der Rest A eine Kette mit der Formel -(Z-CHR¹-CHR²R³)n- enthält, kann dies durch Umsetzung mit z. B. Ethylenimin, Propylenokid unter den geeigneten Bedingungen eingeführt werden, um ein Addukt mit dem gewünschten Wert von n zu erhalten. Wenn in einer anderen Ausführungsform -(Z-CHR¹- CHR²R³)n- eine Oligopeptidkette darstellt, kann dieser Rest durch herkömmliche Peptidsyntheseverfahren eingeführt werden, Der endständige Rest HZN- (CHz) m-CHR¹-CR²R³- kann durch Umsetzung der geeigneten aktivierten. Verbindung mit der Vorstufe HA-CHR&sup4;- (CHR&sup5;)p-CHR&sup6;-S-R&sup7; eingeführt werden. Wenn H&sub2; N-(CH&sub2;)m-CHR¹-CR²R³- einen Aminosäurerest, wie Glycin, Alanin oder Lysin darstellt, kann er erneut durch herkömmliche Verfahren gekoppelt werden.
  • Die Verwendung der Aminothiol-Linker umfaßt die Kopplung des Linkers, vorzugsweise mit einer Schutzgruppe an der Thiolfunktion, an ein erstes Biopolymer, insbesondere ein Polysaccharid, welches gegebenenfalls aktiviert wird.
  • Aktivierung kann unter Verwendung bekannter Verfahten, wie Aktivierung eines Carboxylrestes am Polysaccharid (wenn vorhanden), z. B. mit einem Carbodiimid, oder durch Einführung eines Aldehydrestes, z. B. durch Oxidation, durchgeführt werden. Vorteilhafterweise wird die Kopplung durch Umsetzung mit Cyanbromid durchgeführt. Dies hat das Vorhandensein reaktiver Isocyanatreste zur Folge, welche leicht mit der Aminofunktion des Linkers reagieren, um eine. Isoharnstoffbindung zu erzeugen. Die CNBr-Aktivierung wird in solch einer Art und Weise durchgeführt, daß wenigstens 0,1 aktivierte Stellen pro Wiederholungseinheit (RU) eingeführt werden (in einem Polysaccharid; eine sich wiederholende Mono- oder Oligosaccharid-Einheit). Die Kopplung ergibt vorzugsweise 1 Aminofunktion pro 1-10 RU.
  • Die Thiolschutzgruppe, wenn vorhanden, wird dann z. B. durch Utnsetzung des schützenden Disülfids mit einem Reduktionsmittel, zum Beispiel einem Mercaptan, wie 2-Mercaptoethanöl oder Dithiothreitol, oder einem Trialkylphosphin, entfernt. Reduktion hat vorzugsweise 1 Thiolrest pro 5-15 RU zur Folge. Die Thiolfunktion kann dann mit einer aktiven Funktion eines zweiten Biopolymers, wie einem Bromäcylrest, einem. Iodacylrest, einem Pyridyldithiorest oder einem Maleimidalkyl-- (oder -aryl- oder -cycloalkyl-) Rest, die vorzugsweise an einem Lysinrest des Proteins gebunden ist, reagieren. Die aktivierte Funktion kann durch chemische Postmodifikation des Proteins, wie Umsetzung mit N- Succinimidylbromacetat oder N-(ω-Maleimidalkyloxy)succinimid, oder durch Peptidsysnthese unter Verweädung einer oder mehrerer Amininnsäurevorstufen, die die aktive. Funktion schon enthalten, eingeführt werden.
  • Die Zwischenprodukte und das Endkonjugat können, wenn erforderlich, unter Verwendung an sich bekanntet Verfahren, wie Chromatographie (Ionenaustausch, Hydrophobe Interaktion oder Affinität), Gelfiltration, Dialyse, Membranfiltration, selektive Präzipitation unter Verwendung von Ammoniumsulfat oder Alkohol, und dergleichen, gereinigt werden.
  • Die Konjugate können in einer auf dem Fachgebiet der Impfung bekannten Art und, Weise unter Verwendung geeigneter Adjuvantien, Verdünnungsmittel, Stabilisatoren, Puffer, usw. mit einer Impfstoffformulierung gemischt werden. Die Impfstoffe können zum Schütz von Menschen gegen Pathogene oder zum Schutz von Tieren verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform können die Konjugate geeigneter Biopolymere in der menschlichen oder veterinären Therapie oder als ein diagnostisches Mittel verwendet werden.
  • Eine andere vorteilhafte Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die Immobilisierung von Proteinen und Peptiden an ein Polysaccharid, wie Dextrane, Agarose, Sepharose, zum Zweck der Reinigung von Antigenen, Antikörpern und anderen biologisch relevanten Molekülen, z. B. durch Affinitätschromatographie, oder zur Verwendung in Immunoassays und dergleichen.
    • BEISPIELE
  • Die folgenden Abkürzungen werden in den Beispielen verwendet Boc tert-Butyloxycarbonyl
  • BrAc Bromacetat
  • DTE Dithioerythritol
  • EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
  • Gly Glycyl
  • GP(C) Gelpermeation(s-Chromatographie),
  • HPLC Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie
  • m.w. Molekulargewicht
  • NSu N.-Succinimidyl
  • ONSu N-Oxysuccinimidyl
  • PBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 10 mM Natriumphosphat in physiologischem Salz, pH 7,2.
  • Pn Pneumokokkus/Pneumokokken-
  • PS Polysaccharid
  • RP Reverse Phase
  • RU Wiederholungseinheit(en) des Polysaccharids
  • TNBS Trinitrobenzolsulfonsäure
  • TTd Tetanustoxoid
  • Beachte: es wird die dänsiche Nomenklatur für die Pneumokokkenserotypklassifikation verwendet; der amerikanische Typ wird in Klammern angeführt.
    • Beispiel 1 Herstellung eines Linkers
  • N-N'-Bis(tert-butyloxycarbonylglycyl)cystamin (N-N'-bis(Boc- Gly]cystamin)
  • N,N'-Dimethylacetamid (42 ml) und N,N'-Diisopropylethylamin (14; 6 ml, 83,8 mmol) wurden zu einem Gemisch von N'- Succinimidyl-N-(tert-butyloxycarbönyl) glycinat, Boc-Gly-ONSu, (11,4 g, 41,9 mmol) und Cystamindihydrochlorid (3,77 g, 16,7 mmol) hinzugefügt. Die Suspension wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt (Cystamindihydrochlorid löste sich nach und nach in wenigen Stunden). Die klare Lösung wurde mit Wasser (16,7 mh) verdünnt, welches Phasentrennung bewirkte. Nach 1stündigem Rühren wurde Diethylether (170 ml) hinzugefügt und das erhaltene Gemisch wurde mit Wasser (170 ml) gewaschen. Nach der Phasentrennung wurde die Wasserphase mit Diethylether (85 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, nacheinander mit 1 M NaHCO&sub3; (3 · 85 ml), Wasser (3 · 85 ml) und 1 M NaH&sub2;PO&sub4; (3 · 85 ml) gewaschen und mit MgSO&sub4; getrocknet. Das MgSO&sub4; wurde durch Filtration entfernt, und das Filtrat wurde im Vakuum konzentriert, um N-N'-Bis[Boc-Gly]cystamin (4,81 g, 62%) als einen farblosen Feststoff zu liefern. RP-HPLC zeigt einen einzigen scharfen Peak.
  • N-N'-Bis(glycyl)cystamin(ditrifluaracetät)
  • N-N'-Bis[Boc-Gly]cystämin (4,81 g, 10,3 mmol), wie im vorherigen Schritt erhalten, wurde in Dichlormethan (16,7 ml) gelöst. Die Lösung wurde gerührt, und Trifluoressigsäure (16,7 ml) wurde hinzugefügt. Die Bildung von Isobuten und Kohlendioxid war etwa 5 min lang sichtbar. Nach einem Gesamtzeitraum von 30 min wurde das Reaktionsgemisch tropfenweise zu einem kräftig gerührten Gemisch von Diethylether (179 ml) und Pentan (170 ml) hinzugefügt. Das Rühren wurde beendet und das Präzipitat wurde 5 min lang absetzen gelassen. Diethylether/Pentan wurde durch Dekantieren entfernt und der Feststoff wurde mit einem Gemisch aus Diethylether (50 ml) und Pentan (50 ml) gewaschen. Erneut wurde Diethylether/Pentan durch Dekantieren entfernt. Der hygroskopische Feststoff wurde in Wasser (40 ml) gelöst. Spuren von Diethylether/Pentan wurden im Vakuum bei Raumtemperatur entfernt. Danach wurde die Lösung lyophilisiert, um N-N'-Bis[glycyl]cystamin(ditrifluoracetat). (4,93 g, 97%) zu liefern. Schließlich wurde die Verbindung in einer Konzentration von 1,0 M in Wasser gelöst und bei -20ºC gefroren gelagert. RP-HPLC zeigt einen einzigen scharfen Peak.
    • Beispiel 2 Herstellung von Pn PS 19F/TTd-Konjugat-Impfstoff unter Verwendung von N-N'-Bis[glycyl]cystamin
  • Teilweise Depolymerisation von Pn PS 19F
  • Zur teilweisen Depolymerisation von Pneumokokkenpolysaccharid wurde ein Ultraschallverfahren verwendet. Pneumokokkenpolysaccharidserotyp 1·9F (amerikanischer Typ 19, RIVM, Lotnr. 19FEXP2A/S13; 275 mg, Trockengewicht) wurde in 20 ml Wasser gelöst und für Perioden von ~15 min Dauer, für insgesamt 125 min mit einer 1/4"-Mikrospitze (Branson Sonifier 250, Ausgangspegel 7,50% Arbeitszyklus) beschallt. Das Molekulargewicht des PS wurde von 980 auf 49 kDa (von 1660 auf ~83 RU) verringert. Die Lösung wurde mit 94% Wiedergewinnung von PS (Anthronassay) durch eine 0,45 um Membran filtriert.
    • Modifizierung von Pn PS 19F (49 kDa) mit N-N'-Bis[glycyl]cystamin
  • Für die Modifizierung wurde 3,25 ml PS 19F Lösung in Wasser (6,15 mg/ml) mit einem. gleichen Volumen an 1 M Natriumcarbonat-Lösung (pH -12) gemischt. Das Gemisch wurde auf -2ºC gekühlt. Während des Rührens wurde 250 ul CNBr-Reagenz (100 mg/ml in Acetonitril) hinzugefügt. Nach 10 Minuten wurde die Lösung Gelfiltration an Sephadex G25M (Pharmacia) bei ~4ºC unterworfen (Elutionsmittel: 0,2 M Natriumcarbönat-Bicarbonat- Puffer pH 9,25): Die PSenthaltende Fraktion wurde mit 4,73 ml einer vorgekühltet Lösung aus 0,2 M Natriumcarbonat-Bicarbonat- Puffer pH 9,25/ 1,0 M N-N'-Bis[glycyl]cystamin(ditrifluoracetat), 1/1, v/v gemischt. Der pH fiel auf 6,5 und wurde mit 6 M Natriumhydroxid wieder auf 9,3 eingestellt. Im Verlauf von 1,5 h wurde der pH gelegentlich überprüft und - wenn erforderlich - wiedereingestellt. Danach wurde das Geräusch über Nacht bei ~4ºC gehalten. Schließlich wurde der Puffer der Probe gegen 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 8, der 5 mM EDTA enthielt, ausgetauscht und mit einem Centriprep-10-Konzentrator (Amicon) auf ein Volumen von 2 ml konzentriert. Analyse von primären Aminogruppen lieferte 1 NH&sub2;/4,2 RU (TNBS-Assay).
    • Reduktion von N-N'-Bis[glycyl]cystamin-modifiziertem Pn PS 19F
  • N-N'-Bis[glycyl]cystamin-modifiziertes Pn PS 19F (13 mg in 1,75 ml 0,1 M Nätriumphosphat-Puffer pH 8, der 5 mM EDTA enthielt) wurde durch Hinzüfügen eines 11fachen molaren Überschusses an, DTE (bezogen auf die Anzahl an in das PS eingeführten Aminogruppen) reduziert. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurde die Probe Gelfiltration an Sephadex G25M (Pharmacia) unter Verwendung von 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 7, der 5 mM EDTA enthielt, als das Elutionsmittel unterworfen und mit einem Centriprep-10 auf ein Volumen von 3, 5 ml konzentriert. Analyse auf Sulfhydrylgrupperi lieferte 1 SH/8,5 RU (Ellman-Assay).
    • Bromacetylierung von Tetanustoxoid
  • Der Puffer des Tetanustoxoids (RIVM) wurde durch Gelfiltration an Sephadex G25M (Elutionsmittel: 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 8, der 5 mM EDTA enthielt) ausgetauscht. Aminogruppen an Seitenketten von Lysin im Protein wurden durch Hinzufügen eines 6fachen Überschusses (bezogen auf die Anzah l an Lysinen innerhalb des TTd) an N-Succinimidylbromacetat modifiziert. Das Gemisch wurde 1,5 h lang bei Raumtemperatur inkubiert und auf eine Sephadex G25M-Säule geladen (Elutionsmittel: 0,1 M Natriumphösphat-Puffer pH 7, der 5 mM EDTA enthielt). Analyse der proteinenthaltenden Fraktion zeigte, daß 40% der Aminogruppen (Anfangsmenge: 33,5 NH&sub2; pro mol TTd) modifiziert worden waren (TNBS-Assay)
    • Konjugation von N-(Glycyl)cysteamin-modifiziertem Pn PS 19F und bromäcetyliertem Tetanustoxoid
  • Das N-[Glycyl]cysteamin-modifizierte Pn PS 19F (11,5 mg) wurde bei Raumtemperatur mit BrAc-TTd (5 mg) in einem molaren PS/TTd-Verhältnis von 7 : 1 gemischt. Die Konjugation wurde durch GP-HPLC-Analyse überwacht (Shodex OHpak KB-805 und 804 in Reihe, mit PBS als Elutionsmittel, 1 ml/min bei 35ºC). Nach 110 h wurden die verbleibenden Thiolgruppen am PS 6 h lang bei Raumtemperatur mit einem 10fachen molaren Überschuß an Bromacetamid (bezogen auf den Anfangsaminogruppengehalt, wie am PS vor der Reduktion gemessen) abgedeckt. Die verbleibenden Bromacetylgruppen am BrAc-TTd wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit einem 2,5fachen molaren Überschuß an 2- Amindethanthiol (bezogen auf die vorher hinzugefügte Menge an Bromacetamid) abgedeckt. Das Konjugat wurde bei Raumtemperatur durch Niederdruck-GPC auf einer Sephacryl S-400 HR-Säule (Pharmacia) (100 · 1,6 cm) unter Verwendung von PBS als Elutionsmittel bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,8 ml/min gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen (8 ml) wurden auf Kohlenhydrat- und Protein-Gehält analysiert (Anthron- und Lowry-Assays), steril filtriert und bei 4ºC gelagert.
    • Beispiel 3 Herstellung von Pn PS 6B/TTd-Konjugat-Impfstoff unter Verwendung von Cystamin
  • Teilweise Depolymerisation von Pn PS 6B
  • Pneumokokkenpolysaccharidserotyp 6B (amerikanischer Typ 26, ATCC, Lötnr. 2008862; 107 mg Trockengewicht) wurde in 17 ml Wasser gelöst und für Perioden von 15 min Dauer, für insgesamt 150 min mit einer 1/4"-Mikrospitze (Branson Sonifier 250, Ausgangspegel 6,50% Arbeitszyklus) beschallt. Das Molekulargewicht des PS würde von ~1350 auf 46 kDa (von 2000 auf -65 RU) verringert. Die Lösung, wurde mit 80% Wiedergewinnung von PS (Dubois-Assay) durch eine 0,45 um Membran filtriert.
    • Modifizierung von Pn PS 6B (46 kDa) mit Cystamin
  • Für die Modifizierung wurde 4 ml PS 6B Lösung mit einem gleichen Volumen an 1 M Natriumcarbonat-Lösung (pH ~12) gemischt. Das Gemisch wurde auf ~2ºC gekühlt. Während des Rührens wurde 170 ul CNBr-Reagenz (100 mg/ml in Acetonitril) hinzugefügt. Nach 10 Minuten Umsetzung wurde die Lösung Gelfiltration an Sephadex G25M bei ~4ºC unterworfen (Elutionsmittel: Q,2 M Carbonat-Bicarbonat-Puffer pH 9,25). Die PSenthaltende Fraktion wurde mit 3,25 ml vorgekühltem 0,5 M Cystamindihydrochlorid in 0,2 M Natriumcarbonat-Bicarbonat, pH 9,25, gemischt. Der pH fiel auf 8,7 und wurde reit 0,3 M Natriumhydroxid wieder auf 9,25 eingestellt. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden lang mit pH-Korrekturen, wenn erforderlich, bei pH 9,25 gehalten. Danach wurde die Probe über Nacht bei ~4ºC gehalten. Der Puffer der Probe wurde gegen 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 8, der 5 mM EDTA enthielt, ausgetauscht und dann mit, einem Centriprep-10-Konzentrator (Amicon) auf ein -Völumen·von 2,2 ml konzentriert. Analyse von primären Aminogtuppen lieferte 1 NH&sub2;/3 RU (TNBS-Assay).
    • Reduktion von Cystamin-modifiziertem Pn PS 6B
  • Cystamin-modifiziertes Pn PS GB (16 mg in 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 8, der 5 mM EDTA enthielt) wurde durch Hinzufügen eines 10fachen molaren Überschusses an DTE (bezogen auf die in PS gemessenen Aminogruppen) reduziert. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurde der Puffer der Probe gegen 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 7, der 5 mM EDTA enthielt, ausgetauscht uhd mit einem Centriptep-10 auf ein Volumen von 1,8 ml konzentriert. Analyse auf Sulfhydrylgruppen lieferte 1 SH/8 RU (Ellman-Assay):
    • Bromacetylierung von Tetanustoxoid
  • Der Puffer des Tetanustoxoids (RIVM) wurde durch Gelfiltration an SephadexG25M (Elutionsmittel: 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 8, der 5 mM EDTA enthielt) ausgetauscht. Aminogruppen an Seitenketten von Lysin im Protein wurden durch Hinzufügen eine s 6fachen Überschusses (bezogen auf die Anzahl an Lysinen innerhalb des TTd) an BrAc-ONSu modifiziert. Das Gemisch wurde 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert und auf eine Sephadex G25M-Säule geladen (Elutionsmittel: 0,1 M Natriumphosphat-Puffer pH 7, der 5 mM EDTA enthielt). Analyse der pröteinenthaltenden Fraktion zeigte, daß 55% aller NH&sub2;- Gruppen modifiziert worden waren (TNBS-Assay).
    • Konjugation von Cysteamin-modifiziertem Pn PS 68 und bromacetyliertem Tetanustoxoid
  • Das Cysteamin-modifizierte Pn PS 6B (12 mg) wurde bei Raumtemperatur mit BrAc-TTd. (5 mg) in einem molaren PS/TTd- Verhältnis von 7,5 : 1 gemischt. Die Konjugation wurde durch GP- HPLC-Analyse überwacht (Shodex OHpak KB-805 und 804 in Reihe, mit PBS als Elutionsmittel, 1 ml/min bei 35ºC). Nach 91 h wurden die verbleibenden Thiolgruppen am PS 6 h lang bei Raumtemperatur mit einem 10fachen molaren Überschuß an Bromacetamid (bezogen auf den Anfangsaminogruppengehalt, wie am PS vor der Reduktion gemessenh abgedeckt. Die verbleibenden Bromacetylgruppen am BrAc-TTd wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit einem 2,5fachen molaren Überschuß an 2- Aminoethanthiol (bezogen auf die vorher hinzugefügte Menge an Bromacetamid) abgedeckt. Das Konjugat wurde bei Raumtemperatur durch Niederdruck-GPC auf einer Sephacryl S-400 HR-Säule (Pharmacia) (100 · 1,6 cm) unter Verwendung von PBS als Elutionsmittel bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,8 ml/min gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen (8 ml) wurden auf Kohlenhydrat- und Protein-Gehalt analysiert (Dubois- und Lowry-Assays), steril filtriert und bei 4ºC gelagert.

Claims (12)

1. Verfahren zur kovalenten Kopplung eines Polysaccharids an ein Biopolymer, umfassend die Aktivierung des Polysaccharids mit Cyanbromid und nachfolgende Umsetzung des aktivierten Polysaccharids mit einem Aminothiol-Linker mit der Formel 1:
H&sub2; N-[(CH&sub2;)m-CHR¹-CR²R³-A]q-CHR&sup4;-(CHR&sup5;)p-CHR&sup6;-S-R&sup7; 1
wobei
A eine direkte Bindung oder ein Rest mit der Formel
-{Z-(CH&sub2;)m-CHR¹-CHR²R³} nZ-
ist;
m eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist;
n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist;
p eine ganze Zahl von 0 bis 1 ist;
q eine ganze Zahl von Q bis 1 ist;
R¹ Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub6;-Alkyl ist, gegebenenfalls substituiert durch Amino, Hydroxyl, Carboxyl, C&sub1;-C&sub4;- Alkoxycarbonyl, Carbamoyl, Mono- oder Di-C&sub1;-C&sub4;-Alkylcarbamoyl oder N-(α-Carboxylalkyl)carbamoyl, oder, wenn m + 0 ist, R¹ ist Hydroxyl, Amino oder Peptidylamino;
R² und R³ unabhängig voneinander Wasserstoff oder C&sub1;-C&sub4;- Alkyl sind oder zusammen einen Oxorest bilden;
R&sup4; Wasserstoff, C&sub1;-C&sub4;-Alkyl, Carboxyl, C&sub1;-C&sub4;-Alkoxycarbonyl, Carbamoyl, Mono- oder Di-C&sub1;-C&sub4;-Alkyl carbarnoyl oder N- (α-Carboxylalkyl)carbamoyl ist;
R&sup5; Wasserstoff oder Methyl ist;
R&sup6; Wasserstoff oder Methyl ist;
R&sup7; Wasserstoff oder eine Thiolschutzgruppe oder ein Rest mit der Formel
-S-CHR-S-CHR&sup6;-(CHR&sup5;)p-CHR&sup9;-[A-CR²R³=CHR¹-(CH&sub2;)m]qNH&sub2;
ist; und
Z Imino, Methylimino, Sauerstoff oder Schwefel ist, um ein thioliertes Polysaccharid mit der Formel 2
Ps-O-C(=NH)-NH-[(CH&sub2;)m-CHR¹-CR²R³-A]q-CHR&sup4;-(CHR&sup5;)p-CHR&sup6;-S-R&sup7; 2
zu erzeugen,
wobei Ps einen Polysaccharidrest darstellt und A, m, p, q, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; die vorstehend angegebene Bedeutung haben, gegebenenfalls gefolgt vom Entfernen der Schutzgruppe R&sup7; und Umsetzung des thiolierten Polysaccharids mit einem aktivierten Biopolymer.
2. Verfahren zur kovalenten Kopplung eines Polysaccharids an ein Biopolymer, umfassend die Verwendung eines Aminothiol- Linkers mit der Formel 3:
H&sub2; N-(CH&sub2;)mOHR¹-CR²R³-A-CHR&sup4;-(CHR&sup5;)p-CHR&sup6;S-R&sup7; 3
wobei A, m, p, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5;, R&sup6; und R&sup7; die in Anspruch 1 angegebene Bedeutung haben.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei R&sup7; ein Rest mit der Formel
-S-CHR&sup6;-(CHR)p-CHR&sup4;-[A-CR²R³-CHR¹-(CH&sub2;)m]q-NH&sub2; ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Thiolschutzgruppe R&sup7; ein Acyl-, Thioacyl- oder Iminoacylrest, wie -C(=O)-R, -C(=S)-R, -C(=NR)R, -C(=O)-SR, -C(=S)-NHR, -SO&sub2;-OR oder -P(=O)(OR)&sub2;, ist, wobei R Wasserstoff oder einen C&sub1;-C&sub7;- Kohlenwasserstoffrest, wie Methyl, Ethyl, Allyl, tert-Butyl, Phenyl, Benzyl, darstellt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei R¹ die Seitenkette einer α-Aminosäure, inbesondere Wasserstoff, C&sub1;-C&sub4;- Alkyl oder α-Hydroxy-C&sub1;-C&sub4;-Alkyl darstellt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei R und R³ zusammen einen Oxorest bilden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, wobei A ein Rest mit der Formel -(NH-CHR¹-CO)nNH- ist, wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 2 ist.
8. Verfähren nach einem der Ansprüche 1-7, wobei R&sup4; und R&sup5; Wasserstoff oder Methyl, vorzugsweise Wasserstoff, sind.
9. Konjugat aus zwei Biopolymeren, welche durch einen Rest mit der Formel
-C(=NH)-NH-[(CH&sub2;)m-CHR¹-CR²R³-A]q=CHR&sup9;-(CHR&sup5;)p-CHR&sup6;-S-
kovalent verbunden sind, wobei A, m, p, q, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; die in einem der Ansprüche 1-8 angegebene Bedeutung haben.
10. Konjugat aus zwei Biopolymeren, welche durch einen Rest mit der Formel
-NH-(CH&sub2;)m-CHR¹-CR²R³-A-CHR&sup4;-(CHR&sup5;)p-CHR&sup6;-S-
kovalent verbunden sind, wobei A, m, p, R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; die in einem der Ansprüche 1-8 angegebene Bedeutung haben.
11. Konjugat nach Anspruch 9 oder 10, wobei die beiden Biopolymere ein Polysaccharid und ein Peptid oder Protein sind.
12. Impfstoff, enthaltend ein Konjugat nach einem der Ansprüche 9-11.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6248334B1 (en) * 1997-01-08 2001-06-19 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Process for preparing conjugate vaccines including free protein and the conjugate vaccines, immunogens, and immunogenic reagents produced by this process
MXPA05000186A (es) * 2002-07-03 2005-08-17 Pericor Science Inc Composiciones de acido hialuronico y metodos de uso.
SI1701968T1 (sl) 2003-12-17 2015-08-31 Wyeth Llc Imunogeni konjugati peptidnih nosilcev in postopek izdelave istih
SG149039A1 (en) 2003-12-17 2009-01-29 Elan Pharm Inc Ass IMMUNOGENIC PEPTIDE CARRIER CONJUGATES AND METHODS OF PRODUCING SAME
EP2383035A4 (de) * 2008-12-03 2017-11-22 Kaneka Corporation Formylgruppenhaltiger poröser träger, adsorbens damit, herstellungsverfahren dafür und verfahren zur herstellung des adsorbens
CN104918962B (zh) * 2012-11-22 2017-12-19 株式会社糖锁工学研究所 糖链加成连接基团、含有糖链加成连接基团部分与生理活性物质部分的化合物或其盐、及其制造方法
CN104936613B (zh) * 2012-11-30 2018-05-22 株式会社糖锁工学研究所 糖链加成连接子、含有糖链加成连接子与生理活性物质的化合物或其盐、以及其制造方法
ES2701169T3 (es) * 2014-02-14 2019-02-21 Pfizer Conjugados glucoproteicos inmunogénicos
US9107906B1 (en) 2014-10-28 2015-08-18 Adma Biologics, Inc. Compositions and methods for the treatment of immunodeficiency
US10259865B2 (en) 2017-03-15 2019-04-16 Adma Biologics, Inc. Anti-pneumococcal hyperimmune globulin for the treatment and prevention of pneumococcal infection

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2549051B1 (fr) 1983-06-22 1986-05-16 Centre Nat Rech Scient Nouveaux agents radioprotecteurs ayant une structure amino-thioalkyle et procede pour leur preparation
US4762713A (en) 1983-07-05 1988-08-09 The University Of Rochester Boosting of immunogenic conjugate vaccinations by unconjugated bacterial capsular polymers
EP0326111A3 (de) * 1988-01-29 1989-12-27 New York Blood Center, Inc. Peptid-Derivate, immunogenisch gemacht bei Verabreichung zusammen mit Alaun als Zusatzmittel
US5738855A (en) * 1994-10-17 1998-04-14 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Synthesis of typhoid fever vaccine from a plant or fruit polysaccharide

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