CN1663573A - 一种稳定安全的微生态制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定和安全的微生态制剂，它是由一种或一种以上益生菌发酵上清液或发酵上清液的浓缩物和/或一种或一种以上益生元组成，其中益生菌是指双歧杆菌、乳酸杆菌、酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌中的一种或多种；发酵上清液是指益生菌发酵液经除去菌体后的液体或其浓缩物。本发明制剂可根据需要制成液体、固体、半固体供口服或外用的剂型，用于治疗或预防腹泻、便秘等肠道疾病和/或细菌性阴道病、感染性阴道炎等阴道疾病。其特点是安全、稳定，克服了活菌制剂质量不稳定、潜在不安全性的缺点。

Description

一种稳定安全的微生态制剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种稳定安全的微生态制剂及其制备方法和用途。

发明背景

微生态学研究表明，以双歧杆菌为代表的益生菌对机体有重要的生理功能，包括抑制肠道致病菌的生长、降低血清中胆固醇含量、激活免疫系统及抗癌等作用。用益生菌制成的微生态制剂，具有调整人体微生态失调，保持生态平衡的作用，以达到防病治病的目的。微生态制剂在20世纪70年代兴起时，被认为只有活的微生物才能起到微生态的平衡作用，因此认定微生态制剂是活菌制剂，甚至有一段时间，把微生态制剂就称为“活菌制剂”。然而据报道体外来的有益菌很难在人体内定植，解决这个问题的方法，就是不断补充活菌。但活菌制剂也有许多缺陷：1、目前市场上销售的非芽孢性活菌制剂质量极不稳定，采用2～8℃低温储存。但低温储存条件却限制了产品的储运及市场销售。2、活菌制剂口服时菌容易被胃酸和胆汁灭活，在到达肠道之前活菌数会大幅度地下降。大多数乳杆菌和双歧杆菌制品口服后只有1.5％左右被摄取的菌到达回肠，从而影响活菌制剂的治疗效果。3、活菌制剂不能与抗生素合用，口服合用易被氨苄西林等抗生素杀灭。4、传递耐药性。例如从蜡样芽孢杆菌分离出的质粒能被转移到枯草芽孢杆菌并保留。5、潜在致病的可能。曾有报道乳杆菌可以引起心内膜炎、肺炎和脓毒血症。

随着科学研究的深入，微生态制剂的不断发展，大量资料证明，死菌体、菌体成份、代谢产物也具有调整微生态失调的功效。例如佳木斯医学院将小鼠用抗生素脱污染后，分别给服双歧杆菌活菌、灭活死菌、细菌培养上清液，结果服用三组成分双歧杆菌恢复都显著比自然恢复组高，且三组无明显差异，看来双歧杆菌发酵上清液同样具有促进体内益生菌生长的作用。

发酵上清液是益生菌培养后除去菌体的培养液，内含细菌生长繁殖过程丰富的代谢产物及一部分菌体碎片(成分)，其作用如下：1、益生菌培养液中含有粘附素物质可以促使体内有益菌的粘附；2、益生菌分泌的酸性物质及细菌素等对有害菌有拮抗、杀灭作用，促进体内微生态平衡；3、益生菌分解营养物质后的氨基酸，以及合成的维生素都在培养液内，还包括细菌分泌的对人体有用的酶；4、细菌培养液中的某些组份对人体也有免疫促进作用。总之细菌培养液中的代谢产物对人体的功效是显著的。国内外有关益生菌代谢产物的研究已经进行了很多，也申请了相关专利：日本专利JP2247127从乳酸菌的混悬液中提取一种血管紧张素转化酶用于治疗高血压；JP8198724从乳酸菌培养上清液中得到透明质酸及其盐用于皮肤美容；JP7010740用双歧杆菌培养液高速膜过滤浸液用于抑制黑色素生成；JP2002191387用乳杆菌发酵上清液作为皮肤治疗用成分；WO9835014从唾液乳杆菌分离的一种可以被蛋白酶K和链霉蛋白酶破坏的抗菌物质；EP0577903EP1000625用乳酸菌上清液杀灭幽门螺旋杆菌；US5578302用约氏乳杆菌发酵上清液或发酵液治疗胃溃疡。中国专利有：CN00814779.5用乳酸菌和双歧杆菌上清液治疗肠道贾第鞭毛虫疾病。CN95111991.5系一种微生态活菌饮料，用乳杆菌和双歧杆菌上清液加益生元作为液体部分，以两种菌体冻干粉为固体组分，然后将两种成分混合服用。

以上所有专利都是利用了一种益生菌发酵上清液的成分作为有效物质，或者以发酵上清液加上活菌和益生元作为一个制剂组合，用于皮肤病或胃病或寄生虫治疗或保健的，而不是以益生菌发酵上清液加益生元作为有效成分，用于腹泻、便秘等肠道疾病和/或细菌性阴道病、感染性阴道炎等阴道疾病的治疗。我们分别用双歧杆菌、乳杆菌等益生菌的发酵上清液、活菌、活菌加发酵上清液进行了体外抑菌试验和动物药效试验，均证明发酵上清液效果和活菌组差不多。由此研制了以益生菌发酵上清液或益生菌发酵上清液加益生元组合成各种制剂，用于治疗腹泻、便秘等肠道疾病和/或细菌性阴道病、感染性阴道炎等阴道疾病，本方法制成的制剂安全可靠，并具有创新性。由此完成了本发明。

发明概述

本发明的目的是提供一种稳定安全的微生态制剂。

本发明的另外一个目的是提供该微生态制剂的制备方法。

本发明的又一个目的是该微生态制剂的新用途。

本发明所述的稳定安全的微生态制剂是由一种或一种以上益生菌发酵上清液或益生菌发酵上清液的浓缩物和/或一种或一种以上益生元组成，其中益生菌是指双歧杆菌、乳杆菌、凝结芽孢杆菌、酪酸梭菌中的一种或多种；发酵上清液是指益生菌发酵液经除去菌体后的液体或其浓缩物。上述制剂可根据需要制成液体、固体、半固体供口服或外用的剂型，用于治疗或预防腹泻、便秘等肠道疾病和/或细菌性阴道病、感染性阴道炎等阴道疾病。其特点是安全、稳定，克服了活菌制剂质量不稳定、不易控制的缺点。

本文中所用术语“益生菌发酵上清液”指的是：益生菌发酵培养后用离心或过滤的方法除去菌体得到的上清液体或该上清液体的浓缩物。

本文所用术语“益生元(prebiotics)”指的是：益生元是通过选择性地刺激一种或几种已经在结肠内常住菌的活性或生长繁殖，达到改善宿主健康，且不被宿主消化的实物成分或制剂，它包括寡糖类、多糖类和天然植物及中草药的提取物。

本文中所用术语“剂型”是指药物均应制成一定的剂型，以制剂的形式应用于治疗、预防或诊断疾病。而制剂的有效性、安全性、合理性和精密性等则反映了医药的水平，决定了用药的效果。

本文中使所用的所有百分比或比例均按重量或重量/容量或容量/容量计，除非另有说明，而且，本文中所有的测量均是在25℃进行，除非另有说明。

发明内容

本发明人针对目前益生菌活菌制剂所存在的缺点，如质量不稳定，存在潜在的不安全性。采用了益生菌发酵上清液或益生菌发酵上清液加益生元组合作为有效成分制成制剂，用于治疗或预防腹泻、便秘等肠道疾病和/或细菌性阴道病、感染性阴道炎等阴道疾病。其特点是安全、稳定，克服了活菌制剂质量不稳定、存在潜在的不安全性等缺点。以下是对本发明的详细描述。

适用于本发明的双歧杆菌属为多形态杆菌，菌体形状呈Y字、V字、弯曲状、球拍状、棍棒状、球状甚至球杆状。革兰氏染色阳性，无芽孢、荚膜及鞭毛，无运动性，该菌初代分离时为专性厌氧，继代培养后虽在含有半胱氨酸等还原物质的培养基生长，但不能变成完全需氧。与其他革兰氏阳性菌比较，它对营养的要求并不严格，最适pH6.5-7.0，最适生长温度37-42℃。该菌触酶、硝酸盐还原、靛基质产生、明胶液化及精氨酸水解均阴性。1mol的葡萄糖经果糖-6-磷酸途径发酵生成1.5mol的醋酸和1.0mol的乳酸，不生成CO₂、丁酸及丙酸。最适生长温度为36～38℃。DNA的G+C含量摩尔分数为57～68％。

双歧杆菌属是人类和动物(包括昆虫)正常肠内微生物群的主要成员之一。双歧杆菌菌属在益生菌中应用最多，作为当今国内外最热门的益生菌制剂，各先进国家几乎都有工业化生产，并有多种剂型。该菌为厌氧菌，不耐胆汁和胃酸，抗逆能力差，存活时间短，制剂保存困难。本发明中涉及的种类有：青春型双歧杆菌(B.adolescentis)，两歧双歧杆菌(B.bifidum)，婴儿双歧杆菌(B.infantis)，长双歧杆菌(B.longum)，短双歧杆菌(B.breve)，小链双歧杆菌(B.catenulatum)和假小链双歧杆菌(B.pseudo catenulatum)等，用于本发明制剂最优选的菌种是婴儿双歧杆菌，短双歧杆菌和小链双歧杆菌。

适用于本发明的乳杆菌细胞形态多样，从细长杆状到弯曲形及短杆，也常有棒形、球杆状，一般形成链；通常不运动，运动者则具有周生鞭毛；无芽孢；革兰氏染色阳性。乳杆菌微好氧。在固体培养基上培养时，通常厌氧条件或减少氧压和充有体积分数为5～10％的二氧化碳可增加表面生长物。乳杆菌专性地分解糖，终产物中至少一半是乳酸盐；通常不发酵乳酸盐，副产物可能是乙酸、乙醇、二氧化碳、甲酸盐或琥珀酸盐。乳杆菌不产生多于2个碳原子的挥发性酸；极少见硝酸盐还原的反应，只有pH值最终平衡在6.0以上时才能还原硝酸盐。乳杆菌不液化明胶，不分解酪素，但大多数菌株能产生少量的可溶性氮，不产吲哚和硫化氢。其不产生接触酶，无细胞色素；极少数菌株以假接触酶分解过氧化物；联苯胺反应阴性；产色素者罕见，如有色素则是黄或橙色到锈红或砖红色。乳杆菌营养要求复杂，需要氨基酸、肽、盐类、脂肪酸或脂类和可发酵的碳水化物。其最适生长温度是30～40℃；耐酸，最适pH通常为5.5～6.2，一般在pH为5或更低的情况下可生长；在中性或初始碱性pH条件下，通常会降低其生长速率。

乳杆菌DNA的G+G含量的摩尔分数为32～53％。

乳杆菌与人类的生活关系密切，国内外把乳杆菌用作功能食品和药物、动物的饲料添加剂及植物的生物肥料。本发明中涉及的种类为嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、干酪乳杆菌(L.casei)、鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、德氏乳杆菌(L.dellrueckii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、短乳杆菌(L.brevis)、詹氏乳杆菌(L.jensenii)。此外还有有孢子性乳杆菌(B.coagulans)和酪酸梭菌(Clostridium butyricum)等。用于本发明制剂的最优选的菌种是干酪乳杆菌、德氏乳杆菌、格氏乳杆菌和卷曲乳杆菌。上述的任何菌种可从市场上购得，也可以通过实验室培养而获得。

本发明中适用于双歧杆菌群体的培养基为PTY_G培养基，培养后最终活菌数计数应达到浓度为10⁸～10¹⁰cfu/ml，适用于乳酸杆菌群体的培养基为MRS培养基，培养后最终活菌计数应达到浓度为10⁸～10¹⁰cfu/ml。这是因为在这个浓度范围内，菌体生长旺盛，其代谢产物也被充分释放，发酵液中活性成分增多。这些活性成分为细菌在代谢过程中的产物，如发酵中产生的短链脂肪酸-醋酸、乳酸等，这些酸能使肠道pH值降低，造成酸性环境，不利于致病菌的生长繁殖；细菌素(多肽或蛋白质)是细菌合成的蛋白质类型的杀细菌物质，它们虽只具有狭谱的抑菌活性，即抑制相同或紧密相关菌种的菌株活性，但似乎能够导致取代或抑制其他细菌的生长；肽聚糖能激活巨噬细胞和β淋巴细胞，产生白细胞介素、r-干扰素等，有调节免疫作用；某些乳杆菌如德氏乳杆菌、干酪乳杆菌等还能产生过氧化氢以抑制各种有害细菌的增殖。此外由细菌合成的维生素、氨基酸，某些有益酶也存在于发酵上清液中。

使用上述菌种制得的发酵上清液，可以是双歧杆菌和/或乳酸杆菌混合的发酵上清液，本发明中双歧杆菌和乳杆菌发酵上清液的制备方法是将益生菌培养到相应时间后，取出发酵液，通过离心(8000r/min)和/或微孔薄膜(0.2um)过滤除去菌体得到发酵上清液(经细菌培养验证无活菌生长)，直接制成液体制剂或经真空冷冻干燥成为干粉，加入适宜的益生元制成固体制剂，以供临床应用。

本发明中涉及的多种益生元，目前只有不被宿主消化的低聚糖(oligosaccharides)可以作为益生元，它是由2～10个单糖以直链或分支结构形成。由于低聚糖是一种不被消化性糖类，只能被人体内少数几种细菌利用(如双歧杆菌或乳酸杆菌)，可以起到与益生菌同样的效果。

近年来世界各国，特别是日本研制出种种低聚糖制品。低聚糖广泛存在于各种天然食物中，如水果、蔬菜、牛奶、蜂蜜等。在过去十几年里，低聚糖作为低热值甜味剂被广泛应用，尤其在日本、欧洲应用较普遍。1991年日本政府为“特殊健康用途的食品(FOSHU)”立法，低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖和帕拉金糖被列为其中，同年有450种产品使用了低聚糖。到1996年FOSHU又批准了58种食品，有34种低聚糖被列为功能性食品添加剂，有乳酮糖、乳果糖、低聚木糖、异麦芽糖。低聚糖使肠道内双歧杆菌增殖，保持良好的肠道环境，同时是一种膳食纤维。美国FDA已认可果寡糖是安全的食品成分，是作为临床鼻饲料营养液的主要成分之一。研究证实寡糖可促进钙的吸收，治疗骨质疏松，增加骨密度。日本食品专家指出，低聚糖是功能性食品中最有发展前途的产品。日本是生产低聚糖最主要的国家，而低聚糖的使用则遍布世界各地。目前国内外作为益生元应用的低聚糖已有数十种。本发明中所选用的低聚糖有如下几种：低聚果糖(Fructo-oligosaccharide)、低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharide)、大豆低聚糖(Soybean oligosaccharide)、低聚木糖(Xylo-oligosaccharide)、低聚乳果糖(Lactosucrose)、乳果糖(Lactulose)、低聚异麦芽糖(Isomalto-oligosaccharide)、水苏糖(Stachyose)、棉籽糖(Rafinose)、海藻糖(Trehalose)。多糖有淀粉(Starch)、灰树花多糖(Grifolan)、黄芪多糖(Astraglan)、茯苓多糖(Pachymose)。

低聚果糖(Fructo-oligosaccharide)

果糖和葡萄糖通过β-2，1糖苷键连接，平均果糖基4.8个。含有低聚果糖成分的食品有大蒜、洋葱、牛蒡等。低聚果糖生产的第一种方法是采用微生物酶法生产，以蔗糖做底物，工业上利用黑曲酶产生的β-呋喃果糖苷酶转果糖基作用，在蔗糖分子上以β(1→2)糖苷键上与1～3个果糖分子结合，形成的蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)、蔗果五糖(GF4)属于果糖和蔗糖构成的直链低聚糖，在形成的产物中还有果糖、葡萄糖和未反应完全的底物-蔗糖，采用色谱法除去单糖和双糖制得高纯度的低聚果糖。生产低聚果糖的第二种方法是从菊苣中提取的菊粉，以菊粉做底物水解。低聚果糖不被任何哺乳动物所消化。体内实验证明每天服用15克低聚果糖，2周后双歧杆菌数量由6％升到22％，类杆菌由25％降到0.4％，肠内腐败物质明显减少。

低聚半乳糖(Galacto-oligosaccharide)

由几个半乳糖基与一个葡萄基经β-1，6键连接。由乳糖为原料经曲霉产生的β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)酶法生产。低聚半乳糖是难消化的碳水化合物，几乎所有人体双歧杆菌和乳酸菌都利用它为碳源，而不被绝大多数肠道有害菌利用。是一种很好的双歧杆菌增殖因子。每日摄取10克，一周后粪便中双歧杆菌大大提高，而肠道腐败细菌和由腐败细菌产生的致癌因子次胆汁酸减少，葡萄糖醛酸酶和硝基还原酶的活性也明显下降。

大豆低聚糖(Soybean oligosaccharide)

大豆低聚糖是存在于大豆中的可溶性糖分的总称，由大豆脱脂上清液提取液构成，主要成分是水苏糖和棉子糖。水苏糖和棉子糖都是由半乳糖、葡萄糖和果糖所组成的支链杂低聚糖，是在蔗糖分子的葡萄糖残基一侧以C(-1，6)键接上一个或两个半乳糖而成。这两种糖都是难消化糖。双歧杆菌能有效发酵大豆低聚糖，效果超过低聚果糖，而产气荚膜梭状芽孢杆菌、艰难梭菌、腐败杆菌、大肠菌、埃希氏菌不发酵此糖。成人每日食取糖浆10克(内含水苏糖、棉子糖3克)。3周后肠内双歧杆菌明显增加，而有害菌大大减少。大豆低聚糖广泛用于各种食品和饮料的生产。

低聚木糖(Xylo-oligosaccharide)

由2～6个木糖经β-1，4链结合形成直链糖。工业上一般是以富含木聚糖(Xylan)的植物资源如玉米芯、甘蔗渣、棉籽壳、稻、麦、竹和麸皮等为原料，通过黑曲霉(Astergillus niger)或球毛壳酶(Chaetomium globosum)产生的内切型木聚糖酶endo-1.4-β木聚糖酶(EC3.2.1.8)进行酶解，然后，经分离、提纯制得低聚木糖。低聚木糖很难为人体消化酶系统所分解，分别用唾液、胃液、胰液和小肠液对低聚木糖进行试验，结果表明，几乎所有消化液都不能分解低聚木糖。低聚木糖是一种高效双歧因子，除双歧杆菌外，大多数肠道细菌对低聚木糖的利用都较差。人体每天食用0.7克低聚木糖，17天后，双歧杆菌所占比例由8.5％提高到17.9％，21天后，双歧杆菌所占比例提高到26.2％。低聚木糖还具有防止便秘的功能和促进钙的消化吸收作用。

低聚乳果糖(Lactosucrose)

低聚乳果糖是以乳糖和蔗糖(1∶1)为原料，在节杆菌(Arthrobacter)产生的β-呋喃果糖苷酶(EC3.2.1.26)催化作用下，将蔗糖分解产生的果糖基转移至乳糖还原性末端的C1位羟基上，生成半乳糖基蔗糖(三糖)即低聚乳果糖。商业化生产的低聚糖产品包含37％低聚乳果糖、28％蔗糖、13％乳糖、17％的葡萄糖及果糖和5％其他糖，甜度约为蔗糖的70％。在日本，这种产品已于1991年推向市场。低聚乳果糖几乎不被人体消化吸收，摄入后不会引起体内血糖水平和血液胰岛素水平的波动，可供糖尿病人食用。该糖也是双歧杆菌增殖因子，每天摄入5克，一周后粪便中双歧杆菌数比摄入前从10.5％提高到32.6％。若以身体条件较好的成年男子为试验对象，则双歧杆菌增加至少占50％以上。与同是双歧杆菌增殖因子的低聚半乳糖、低聚异麦芽糖等相比，低聚乳果糖的双歧杆菌增殖活性更高，甜味特性也更接近于蔗糖。该糖在日本经急性毒理试验和致突试验等证实安全无毒。

乳果糖(Lactulose)

也称乳酮糖、半乳糖苷果糖、异构化乳糖。在所有的低聚糖中乳果糖的产量最大，与低聚半乳糖一样，乳果糖也是以乳糖为原料。乳糖经碱石灰处理后得乳果糖，乳糖是由半乳糖和葡萄糖组成的，而乳果糖则是有半乳糖与果糖以β(1→4)糖甙键结合形成的双糖。乳果糖在小肠内不被消化吸收，到达大肠被双歧杆菌利用。母乳喂养儿与人工喂养儿的一个突出差别在于前者粪便中的双歧杆菌数要比后者多得多，但若给人工喂养婴儿同时喂食适量乳果糖，则情况有所不同，可观察到双歧杆菌的增殖速率大为提高甚至达到母乳喂养儿的水平，其粪便中双歧杆菌数增加而其他腐败菌减少。试验表明摄入乳果糖后人体血浆中葡萄糖无升高现象。另外，乳果糖被列为低热甜味剂和功能性食品添加剂。乳果糖除用做食品添加剂外，还在医药上用于治疗便秘和门静脉系统的脑病。Slvay(德国)是世界上最大的乳果糖制造厂，每年约生产10,000吨乳果糖，其产品的90％用于药品。

低聚异麦芽糖(Isomalto-oligosaccharide)

低聚异麦芽糖是α-D-葡萄糖基以α(1→6)键苷键结合。在低聚异麦芽糖的混合物中既含有葡萄糖基以α(1→6)糖苷键结合的低聚糖，又含有葡萄基以a(1→4)糖苷键结合的低聚糖，如潘糖。低聚异麦芽糖的酶法合成反应分两步，第一步是α-淀粉酶(EC3.2.1.1)将淀粉液化，第二步由β淀粉酶(EC3.2.1.2)将液化的淀粉水解成麦芽糖，α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)再将其转化为低聚异麦芽糖。肠内发酵实验除两歧双歧杆菌外，大多数人体双歧杆菌都可利用低聚异麦芽糖为碳源，大肠埃希菌不利用此糖，脆弱类杆菌、粪肠球菌及部分梭菌利用此糖。人体与试验证明服用低聚异麦芽糖浆(15克/天)，对肠道菌群有明显调节作用。

水苏糖(Stachyose)

是由葡萄糖、半乳糖、半乳糖、果糖四个单糖聚合而成。它对双歧杆菌、嗜酸乳酸杆菌、保加利亚乳酸杆菌有促进作用，对大肠埃希菌稍有促进作用，它不被人体利用，能选择性促进肠道生理性细菌的生长。水苏糖主要从大豆经酶发酵后提取。

棉籽糖(Rafinose)

采用色层分离法从甜菜糖蜜中提取及精制而得。甜度20％以上，含98％的低聚糖，是低聚糖中惟一不会吸湿的结晶低聚糖。对热和酸都很稳定，主要用于糖果、糕点粉末或片状健康食品中。

海藻糖(Trehalose)

海藻糖是葡萄糖以Q、Q-1，1键结合成的非还原性双糖，广泛存在于动植物和微生物细胞；过去从酵母(含量10～20％)中提取，现在可利用低聚麦芽基海藻糖合成酶和低聚麦芽基海藻糖水解酶作用于淀粉水解物可得到82％收率的海藻糖。海藻糖是一种功能性低聚糖，具有低热值、防龋齿等作用，但不是双歧因子。海藻糖是可消化的低聚糖，甜度为蔗糖的50％，海藻糖在冷、热下稳定；它的特殊生理功能是提高动植物细胞抵抗干燥、抗高温和寒冷等不良环境的能力。微生物冷冻干燥保存时，若适量添加海藻糖可减少死亡，作为微生物的冻干保护剂，已经被广为利用。

用于本发明制剂中最优选的寡糖为大豆低聚糖、低聚异麦芽糖、低聚乳果糖，在制剂的组合中可以任意一种或多种混合。

多糖

本发明中下述几种多糖可根据制剂的组合任意选用一种或几种混合。

淀粉(Starch)

淀粉系自禾本科植物玉蜀黍ZeamaysL.的颖果或大威科植物木薯Manihotutilissima Pohl的块根中制得多糖。常用作固体药物制造的辅料。

灰树花多糖(Grifolan)

香菇多糖系自伞菌科菇属香菇Lentnus edodcs(Berk)S.Ito.et Imai的热水提取液中制得，由β-(1-3)为主链，β-(1→3)为侧链的高分子葡萄糖为免疫增强剂，有肮肿瘤和加速受损伤的肝组织修复起保肝作用。

黄芪多糖(Astraglan)

黄芪多糖来自于豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fish)Bge.Var.morgholicus(Beg)Hsiao。根的提取物为葡聚糖，主要是α-(1→4)-D-葡萄糖的缩合键连接而成，系杂多糖，具有免疫促进和调节血糖作用。

茯苓多糖(Pachymose)

茯苓多糖来自于多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(schn)holf的干燥菌核提取物，为茯苓中的主成分，含量占84.2％。为β-(1→6)吡喃葡萄糖为支链的β(1→3)葡萄糖聚糖。具有免疫调节，保肝降酶，诱生干扰素和抗肿瘤作用。

本发明中上述寡糖和多糖主要是从市场上购买。

此外，本发明可以制成含有经冷冻干燥或低温干燥制剂的片剂中。冷冻干燥或低温干燥可以通过将干燥的制剂形成开放性基质网络结构而有助于制剂的崩解。在大多数情况中，这样可造成液体介质的快速浸润，促进产品的及时释药传递。全盘的冷冻干燥方法是本领域熟知而且常用的。任何合适的常规冷冻干燥方法均可使用。较好的方法之一是快速冷冻制剂然后干燥至最终含水量为约3％至约5％。合适的冷冻干燥和生产方法可参见在此参考的1987年2月17日Dacies的美国专利4642903，1990年8月7日Blank等的美国专利4946684，1981年12月15日和1983年2月1日Gregory等的美国专利4303502和4371516，和1993年2月23日Hes等的美国专利5188825。

同样，本发明制剂也可以真空干燥，合适的真空干燥方法可参见在此参考的1994年3月29日Pebley等的美国专利5298261。

本发明制剂还可以包含制药行业熟知的其他可选组份，各自的相应含量也是公知的，这类组份例如用于使最终成品可口和美观的天然或人造甜味剂，调味剂、色素、香精、缓冲剂等，用于延长保存期的如丁羟基茴香醚抗氧化剂和如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯、山梨酸钾或苯甲酸钠等防腐剂。

本领域一般技术人员通过常规实验将很快认识到或确定其他合适的组份、稀释剂和剂型。而且，各种制剂的给药可以通过本领域一般技术人员熟知的标准方法进行。

本发明制剂还可以包含包衣材料，适用于本发明制剂的包衣材料可以是水溶性的和非水溶性的。

适用于本发明制剂的水溶性包衣包括糖或有机物包衣。用于本发明制剂的糖包衣可以是糖浆，其中含有单糖或两种以上糖单元的聚合物。有机物包衣也可以用于本发明制剂。可使用的有机聚合物或共聚物包括具有多个羧酸或酯基团的那些。这些基团主要负责与活性成分发生物理或化学相互作用而得到有效的遮味性能。较好的聚合物或共聚物含有乙烯基和丙烯酸和/或酯基团，或者羧酸和/或酯基团，例如乙基纤维素、纤维素乙酸酯、纤维素乙酸邻苯二甲酸酯、乙酸和/或邻苯二甲酸乙基乙烯酸、聚乙酸和/或邻苯二甲酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙酯和/或甲酯、酯类和共聚物、羟基烷基纤维素乙酸酯和/或邻苯二甲酸酯之类的合成和半合成物质，也可以使用糖和有机物包衣物质的混合物。

本发明的糖和/或有机物包衣可以利用常规方法来实施，其中包括机械方法，例如衣锅包衣法、空气悬浮技术、多孔离心技术和喷雾干燥技术，以及理化方法，例如凝聚-相分离。在本文参考的《实用药物制剂技术》125-169中对包衣过程有更为详细的论述。

本发明制剂中还可以含有缓冲剂，对于口用制剂，可以将pH缓冲至酸性来改善口味。对于用于阴道的产品，适合用作本发明制剂中的缓冲剂是能够维护约3.0至约5.5的生殖系统pH值的那些。任何温和的药学上可接受的酸，合适的酸包括硼酸，或有机酸，例如丙酸、苹果酸、山梨酸、苯甲酸、乳酸、维生素C、柠檬酸或乙酸，并与其相应的钠盐或其它药学上可接受的盐组合(直至达到所需的pH)。在使用缓冲剂时，本发明制剂最好缓冲至pH约3.5至约5.0，约3.7至约4.7更好，而且最好使用乳酸与乳酸钠，或者乳酸/乳酸钠和苯甲酸的组合，或者乳酸/乳酸钠与丙酸的组合。

本发明制剂可以加到许多不同的载体中，载体主要取决于制剂的最终用途。这些载体是药学上可接受的，包括口服的和局部使用的制剂。它们可以是完全惰性的，或者包含或就是其它活性成分，但是载体必需与在此公开的制剂相容。“相容性”在此指，载体组份可以与本发明组份以及载体组份彼此之间相互混合，要以不发生会在一般使用情况下明显降低制剂的活性或生命活力的相互作用的方式混合。当然，载体物质必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，使得它们适合用于被接受治疗的人。本发明组合可以使用一种或多种载体物质。

口用剂型为本发明的载体，这些剂型中含有适合给人口用的相容性固体或液态填料稀释剂。

口用液态剂型可包含将本发明制剂溶解或悬浮在可饮用的液体中，例如无菌水或洁净水中。合适的形式包括溶液、悬浮液、糖浆，其中含有本领域常用的惰性稀释剂，例如纯水、糖、多糖、明胶或醇。这些惰性稀释剂不积极参与本发明的治疗性作用。这类制剂还可以含有润湿剂、乳化剂、悬浮剂和其它治疗性活性成分。有关液体和液体样剂型的更为详细的说明可参见在此参考的《实用药物制剂技术》第1版，人民卫生出版社(1999)，第1519-1544页。

固体剂型包括片剂和胶囊，片剂可以是压制片、模制片、咀嚼片、口含片、肠衣片、糖衣片、膜衣片或多层片，其中含有合适的粘合剂、润滑剂、稀释剂、崩解剂和引流剂。

也可以使用硬性明胶胶囊，如普通胶囊和肠溶胶囊。较好的是，明胶外壳基本上是透明的，这样可以改善胶囊的外观。硬性明胶胶囊通常含有明胶、增塑剂和水。

制造固体口服剂型的技术和配方可参见在此参考的“片剂和胶囊剂”《实用药物制剂技术》，第1版，人民卫生出版社，第1-30页(1999)。

适合本发明制剂局部使用的载体包括阴道片剂或胶囊、阴道栓剂、肛门栓剂、灌洗用溶液、气雾剂。它们是利用制备半固体制剂的常规方法制备的，使用的赋形剂例如凡士林、石蜡、凡士林油、植物油、动物油、固体和液体的合成甘油酯、蜡、羊毛脂、羊毛醇(lanolin alcohols)、山梨酯、脂肪醇、液体/固体聚乙二醇、丙二醇、聚乙烯、淀粉、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、纤维素和羧基乙烯基聚合物的衍生物。

阴道栓剂、一般栓剂、阴道胶囊或片剂和泡腾片也可以用在本发明的局部预防使用中。阴道栓剂与一般栓剂类似，呈卵形，主要使用的赋形剂是半合成的甘油酯和聚乙二醇，还有可选性的乳化剂和表面活性剂，用于阴道的片剂或胶囊含有作为主要赋形剂的乳糖、淀粉、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素衍生物、硬脂酸镁、乙二醇。泡腾片含有为了发生泡腾而产生二氧化碳所必需的化学组份(即碳酸氢钠加柠檬酸或酒石酸)。

以下实施例进一步说明本发明范围内的实施方式。这些实施例仅以说明为目的，而不应被理解成是对本发明的限定，因为可能有许多改变也是在以上所述的本发明的精神和范围之内。

实施例1婴儿双歧杆菌发酵上清液的制备

配制灭菌PTY_G培养基300ml，用斜面菌种接种婴儿双歧杆菌(CGMCC313-2)，37℃厌氧静止培养48小时，测定发酵液中活菌数应达到10⁸～10¹⁰cfu/ml。发酵液离心(8000r/min)去菌体，再经薄膜(0.2μm)过滤除菌得到发酵上清液，用于制造本发明的制剂。

实施例2干酪乳杆菌发酵上清液的制备

配制灭菌MRS培养基300ml，用斜面菌种接种干酪乳杆菌(YL13-1)，37℃厌氧静止培养24小时，测定发酵液中活菌数浓度应为10⁸～10¹⁰cfu/ml。发酵液离心(8000r/min)去菌体，再经薄膜(0.2μm)过滤除菌得到发酵上清液，用于制造本发明的制剂。

实施例3婴儿双歧杆菌、干酪乳杆菌发酵上清液的抑菌作用

配制营养肉汤琼脂培养基，用湿热蒸汽灭菌，冷却到50℃后，按照比例，加入一定量致病菌，最终浓度为2-4×10⁷cfu/ml，摇匀后倾倒平板，用9毫米打孔器打孔若干个。在每个琼脂孔分别加入发酵上清液，活菌液、活菌+发酵上清液各50ul，30℃培养24小时后观察抑菌直径(mm)。

结果在表1表示，婴儿双歧杆菌和干酪乳杆菌的发酵上清液均有与活菌液相近似的抑菌作用。

表1婴儿双歧杆菌、干酪乳杆菌发酵上清液的抑菌作用

实施例4婴儿双歧杆菌、干酪乳杆菌发酵上清液对氨苄西林钠诱发小鼠(BALB/C)腹泻的预防作用

将禁食12小时后的各组小鼠，前一晚分别用发酵上清液、活菌液(10⁸cfu/ml)、活菌+发酵上清液和生理盐水灌胃0.5ml/只/次，第2天上午再重复灌胃1次，1小时后用氨苄西林钠灌胃0.2g/0.5ml/只/次，隔6小时再给氨苄西林钠0.15g/只/次。然后观察小鼠的腹泻情况。

结果在表2表示，婴儿双歧杆菌发酵上清液在40小时后有和活菌一样的预防小鼠的腹泻作用，小鼠由排稀软便转为正常粒状便；干酪乳杆菌发酵上清液在11小时小鼠全部排粒状便。

表2婴儿双歧杆菌、干酪乳杆菌发酵上清液对氨苄西林钠诱发小鼠腹泻的预防作用

实施例5婴儿双歧杆菌、干酪乳杆菌发酵上清液对氨苄西林钠诱发小鼠(BALB/C)腹泻的治疗作用

将禁食12小时后的各组小鼠用氨苄西林钠0.2g/0.5ml/只/次灌胃，隔6小时再给氨苄西林钠0.15g/0.5ml/只，造成小鼠腹泻，然后经发酵上清液、活菌液(10⁸cfu/ml)、活菌+发酵上清液和生理盐水灌胃，每天1次，连续3天，观察小鼠的腹泻情况。

结果在表3表示，婴儿双歧杆菌发酵上清液在72小时内有与活菌液相同的治疗腹泻效果；干酪乳杆菌发酵上清液在48小时内使腹泻小鼠全部排正常粒状便。

表3婴儿双歧杆菌、干酪乳杆菌发酵上清液对氨苄西林钠诱发小鼠腹泻的治疗作用

实施例6婴儿双歧杆菌、干酪乳杆菌发酵上清液口服液的制备

利用常规口服液(合剂)的制备技术将以下组份制备本发明的口服液(合剂)

成分                           ％(容量)

婴儿双歧杆菌发酵上清液         20.00％

干酪乳杆菌发酵上清液           20.00％

大豆低聚糖溶液                 22.00％

异麦芽低聚糖溶液               22.00％

香菇多糖溶液                   10.00％

山梨酸钾溶液                   5.00％

桔子香精                       1.00％

将上述各组份搅拌均匀，利用常规口服液制备技术，按单位剂量灌装，制成口服液。

实施例7多种益生菌发酵上清液片剂的制备

利用常规制片技术混合以下组份制成本发明的片剂

成分                             ％(容量)

婴儿双歧杆菌发酵上清液冻干粉     15.00％

干酪乳杆菌发酵上清液冻干粉       15.00％

大豆低聚糖                       50.00％

香菇多糖                         5.00％

淀粉                             11.00％

滑石粉                           3.40％

硬酯酸镁                         0.60％

将上述组份中1-5组份搅拌均匀，再用乙醇溶液制成颗粒，过12目筛，在70～75℃干燥，干燥后的颗粒过20目筛，将颗粒与滑石粉和硬酯酸镁混匀，然后利用常规压片技术按单位剂量压成片剂。

实施例8多种益生菌发酵上清液胶囊制备

利用常规制胶囊技术混合以下组份制成本发明的胶囊

成分                            ％(容量)

婴儿双歧杆菌发酵上清液冻干粉    15.00％

干酪乳杆菌发酵上清液冻干粉      15.00％

大豆低聚糖                      40.00％

灰树花多糖                      10.00％

茯苓多糖                        5.00％

淀粉                            12.00％

滑石粉                          3.00％

将上述组份充分混合均匀，然后将按单位剂量形成的混合物装入大小合适的硬胶囊中。

Claims (18)

1.一种稳定和安全的微生态制剂，它是由一种或一种以上益生菌发酵上清液或发酵上清液的浓缩物和/或一种或一种以上益生元组成。

2.根据权利要求1所述的微生态制剂，其中的益生菌为一种或一种以上双歧杆菌群体、乳酸杆菌群体、有孢子性乳酸菌和酪酸梭菌。

3.根据权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于所述的发酵上清液是采用离心或过滤等方式获得，或将发酵上清液再采用低温减压浓缩、喷雾或冻干方式获得发酵上清液的浓缩物。

4.根据权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于益生元包括寡糖类、多糖类和天然植物及中草药的提取物。

5.根据权利要求2所述的微生态制剂，其特征在于双歧杆菌群体包括婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、小链双歧菌和假小链双歧杆菌等；所述的乳酸杆菌群体包括干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、唾液乳杆菌、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、德氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、詹氏乳杆菌，另外还包括有孢子性乳酸菌和酪酸梭菌。

6.根据权利要求4所述的微生态制剂，其特征在于寡糖类为低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖、低聚木糖、低聚乳果糖、乳果糖、低聚异麦芽糖、水苏糖、棉子糖、海藻糖；多糖类和天然植物及中草药的提取物为淀粉、灰树花多糖、香菇多糖、黄芪多糖、茯苓多糖。

7.根据权利要求1-6任何一项所述的微生态制剂，其特征在于它是液体形式或固体、半固体形式。

8.根据权利要求7所述的微生态制剂，其特征在于它是口服液、气雾剂、灌洗剂、胶囊、片剂、散剂、栓剂形式。

9.根据权利要求6所述的微生态制剂，其特征在于寡糖类可从天然原料中提取，或用酶生成法、酸碱转化法及化学合成法制得；多糖类淀粉、灰树花多糖、香菇多糖、黄芪多糖、茯苓多糖从天然植物及中草药、食用或药用真菌中提取。

10.权利要求2所述的制剂在制备治疗肠道疾病药物的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述的肠道疾病为急、慢性腹泻、便秘。

12.权利要求2所述的制剂在制备治疗阴道疾病药物的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述的阴道疾病为细菌性阴道病、感染性阴道炎。

14.权利要求1或2所述的制剂的制备方法，它包括下列步骤：

将益生菌培养，取出发酵液，通过离心和/或微孔薄膜除去菌体得到发酵上清液，经细菌培养验证无活菌生长，直接制成液体制剂或经真空冷冻干燥成为干粉，加入益生元制成制剂。

15.根据权利要求14所述的方法，其中用于双歧杆菌群体的培养基为PTYG培养基，培养后最终活菌数应达到浓度为10⁸～10¹⁰cfu/ml，适用于乳酸杆菌群体的培养基为MRS培养基，培养后最终活菌计数应达到浓度为10⁸～10¹⁰cfu/ml。

16.权利要求14所述的口服液的制备方法，它包括下列步骤：

婴儿双歧杆菌发酵上清液              20.00％

干酪乳杆菌发酵上清液                20.00％

大豆低聚糖溶液                      22.00％

异麦芽低聚糖溶液                    22.00％

香菇多糖溶液                        10.00％

山梨酸钾溶液                        5.00％

桔子香精                            1.00％

将上述各组份搅拌均匀，利用常规口服液制备技术，按单位剂量灌装，制成口服液。

17.权利要求14所述的片剂的制备方法，它包括下列步骤：

婴儿双歧杆菌发酵上清液冻干粉        15.00％

干酪乳杆菌发酵上清液冻干粉          15.00％

大豆低聚糖                         50.00％

香菇多糖                           5.00％

淀粉                               11.00％

滑石粉                             3.40％

硬酯酸镁                           0.60％

将上述组份中前五种组份搅拌均匀，再用乙醇溶液制成颗粒，过12目筛，在70～75℃干燥，干燥后的颗粒过20目筛，将颗粒与滑石粉和硬酯酸镁混匀，然后利用常规压片技术按单位剂量压成片剂。

18.权利要求14所述的胶囊的制备方法，它包括下列步骤：

婴儿双歧杆菌发酵上清液冻干粉       15.00％

干酪乳杆菌发酵上清液冻干粉         15.00％

大豆低聚糖                         40.00％

灰树花多糖                         10.00％

茯苓多糖                           5.00％

淀粉                               12.00％

滑石粉                             3.00％

将上述组份充分混合均匀，然后将按单位剂量形成的混合物装入大小合适的硬胶囊中。